CN111366734A - 双指标筛选新冠病毒及预判重型肺炎的方法 - Google Patents

Abstract

检测试剂及试剂盒，试剂同时检测血液中的新型冠状病毒SARS‑CoV‑2 IgA抗体和检测涎液化糖链抗原KL‑6，用于作为筛选特别是早期筛选新型冠状病毒感染肺炎，并预判重型患者的检测试剂的用途。试剂盒，含有测试卡，测试卡由SARS‑CoV‑2 IgA测试条、KL‑6测试条和塑料盒组成。本发明的试剂及试剂盒，可用于更早期诊断新冠肺炎，并可判断新冠肺炎患者是否出现肺损伤。

Description

双指标筛选新冠病毒及预判重型肺炎的方法

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，特别是涉及一种同时检测血液中的新型冠 状病毒SARS-CoV-2 IgA抗体和涎液化糖链抗原KL-6，用于作为筛选特别是早 期筛选新型冠状病毒感染肺炎，并预判重型患者的检测试剂及试剂盒及其用途。

背景技术

新型冠状病毒感染肺炎(新冠肺炎)作为急性呼吸道传染病已纳入《中华人民共和国传 染病防治法》规定的乙类传染病，按甲类传染病管理。新冠肺炎一般感染SARS-CoV-2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2)后3-7天发病，症状以发热、干咳、乏力为 主，亦可伴随鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等。轻型患者无肺炎表现，重症患者多在发病 一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒性休克、 难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。值得注意的是重型、危重 型患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。因此能高效率检出新冠肺炎患者并预判出重型 肺炎患者很有意义。

最开始被采用的是病毒核酸检测试剂，用于新冠肺炎的确诊。因其检出率 低，许多企业开始研发SARS-CoV-2 IgG、IgM快速检测试剂盒，包括胶体金法、 化学发光免疫分析法。第七版新冠肺炎诊疗方案纳入IgM、IgG血清学检测作为 实验室诊断手段。目前已注册的产品有11个核酸检测产品，6个抗体检测产品， 后者包括：胶体金法新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测试剂盒、胶体金法新 型冠状病毒(2019-nCoV)IgM抗体检测试剂盒、磁微粒化学发光法新型冠状病 毒(2019-nCoV)IgM抗体检测试剂盒、磁微粒化学发光法新型冠状病毒 (2019-nCoV)IgG抗体检测试剂盒、学发光微粒子免疫检测法新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测试剂盒。

因为SARS-CoV-2感染下呼吸道，患者少咳痰，采用咽拭子有很大机率采 集样本失败。核酸检测试剂对新冠肺炎的检出率低，敏感性只有30-50％，不能 满足将所有患者筛选出来的需求。

测总抗体提高了敏感性但不能有效分辨患者处于病程哪个时期，是否还具传 染性。胶体金法检测简便快速，但准确性不够。化学发光法测IgM、IgG抗体敏 感性、特异性均高，但是两者的窗口期较长，IgM要发病3-5天后检出，IgG要 恢复期检测值升高4倍以上才能诊断。此外，由于新冠病毒的传播性极强，世 界不同国家并不都具备隔离条件，对于在家自己隔离的情况，目前的检测方法 不适用于在家检测，且用户不能准确判断什么时候转为重症需要及时入院治疗。

目前尚无关于IgA用于新冠肺炎筛选检测的报导，也没有IgA检测试剂盒研 发成功的报导，也没有IgA、KL-6联合用于新冠肺炎检测及预判重型患者的报 导。

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种能够检测血液中的 新型冠状病毒SARS-CoV-2 IgA抗体和检测涎液化糖链抗原KL-6，用于作为筛 序特别是早期筛选新型冠状病毒感染肺炎，并能够预判重型患者。

本发明的目的通过以下技术措施实现。

提供一种检测试剂，检测血液中的新型冠状病毒SARS-CoV-2 IgA抗体和检 测涎液化糖链抗原KL-6，用于作为筛选新型冠状病毒感染肺炎，并预判重型患 者的检测试剂的用途。

优选的，上述的检测试剂，用于作为早期筛选新型冠状病毒感染肺炎，并 预判重型患者的检测试剂盒的用途。

优选的，上述的检测试剂，重型患者为出现肺损伤或者纤维化的患者。

优选的，上述的检测试剂，检测血清、血浆和全血中的新型冠状病毒 SARS-CoV-2IgA抗体和涎液化糖链抗原KL-6。

优选的，上述的检测试剂，试剂盒含有测试卡，测试卡由SARS-CoV-2 IgA 测试条、KL-6测试条和塑料盒组成；

每个测试条均含有硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫、吸水纸和PVC板支持 物组成；

SARS-CoV-2 IgA测试条的硝酸纤维素膜包被有抗人-IgA抗体和抗鼠IgG多 克隆抗体，结合垫含有胶体金标记的SARS-CoV-2重组抗原；

KL-6测试条的硝酸纤维素膜包被有抗人-KL-6单克隆抗体和抗鼠IgG多克 隆抗体，结合垫含有胶体金标记的抗人KL-6抗体。

优选的，上述的检测试剂，SARS-CoV-2重组抗原是在悬浮培养的人胚肾细 胞株HEK293F中表达的刺突蛋白，简称S蛋白(Spike protein,S蛋白)，截取 RBD结构域Gln321-Ser591位氨基酸序列进行蛋白表达；蛋白表达过程是：将 SARS-CoV-2S蛋白RBD基因在C端通过一个TEV酶切位点序列连接人IgG1 Fc，然后将其克隆到哺乳动物表达载体pTT5并在翻译起始区加入了Kozak序列， 然后转染到悬浮培养细胞HEK293F中，使用干扰素α-1作为信号肽使HEK293F 细胞分泌RBD-TEV-Fc融合蛋白，再采用Protein A柱子和镍柱进行两次纯化； 第一次纯化为采用Protein A柱子从培养基上清中获得RBD-TEV-Fc融合蛋白； 第二次纯化为采用带有6His tag的TEV酶对融合蛋白进行酶切，将酶切产物依 次流过Protein A柱子和镍柱，除去Fc、TEV酶以及第一次纯化时结合Protein A 柱子的杂蛋白，最终在流穿中获得纯净的RBD蛋白；或者

SARS-CoV-2重组抗原是在悬浮培养的用细菌表达的核衣壳蛋白，简称N 蛋白，N蛋白是截取Met1-Ala419位氨基酸序列进行表达的；

蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2N蛋白的基因在N端连接6His tag并克 隆到原核表达载体pET28a中，再转化到大肠杆菌细胞BL21中进行N蛋白表达， 然后取破碎细菌在细菌裂解液中加入0.5-2.0M氯化钠，降低蛋白与核酸非特异 性结合，再将裂解液过镍柱，洗脱后加入终浓度为0.25-1.0M的硫酸铵室温搅 拌10-20min，使得蛋白暴露其疏水核心，再采用疏水柱进一步纯化蛋白，然后 采用superdex-200分子筛除去多聚体及其它杂蛋白，最终获得高纯度构象统一 的N蛋白。

优选的，上述的检测试剂，试剂盒还含有样本稀释液，所述样本稀释液为 pH7.1-7.4的Tris盐酸缓冲液，内含2-8％的牛血清白蛋白(w/v)、0.05-0.2％吐 温20(v/v)、0.25-1％Proclin300(v/v)。

本发明同时提供一种试剂盒，为含有检测血液中的新型冠状病毒 SARS-CoV-2IgA抗体的检测试剂和检测涎液化糖链抗原KL-6的检测试剂，用 于作为筛选特别是早期筛选新型冠状病毒感染肺炎，并预判重型患者的试剂盒。

优选的，上述的试剂盒，含有测试卡，测试卡由SARS-CoV-2 IgA测试条、 KL-6测试条和塑料盒组成，每个测试条均含有硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫、 吸水纸和PVC板支持物组成；其中

SARS-CoV-2 IgA测试条的硝酸纤维素膜包被有抗人-IgA抗体和抗鼠IgG多 克隆抗体，结合垫含有胶体金标记的SARS-CoV-2重组抗原；

KL-6测试条的硝酸纤维素膜包被有抗人-KL-6单克隆抗体和抗鼠IgG多克 隆抗体，结合垫含有胶体金标记的抗人KL-6抗体。

优选的，上述的试剂盒，还含有样本稀释液，所述样本稀释液为pH7.1-7.4 的Tris盐酸缓冲液，内含2-8％的牛血清白蛋白(w/v)、0.05-0.2％吐温20(v/v)、 0.25-1％Proclin300(v/v)。

优选的，上述的检测试剂盒，SARS-CoV-2重组抗原是在悬浮培养的人胚肾 细胞株HEK293F中表达的刺突蛋白，简称S蛋白(Spike protein,S蛋白)，截取 RBD结构域Gln321-Ser591位氨基酸序列进行蛋白表达；蛋白表达过程是：将 SARS-CoV-2S蛋白RBD基因在C端通过一个TEV酶切位点序列连接人IgG1 Fc，然后将其克隆到哺乳动物表达载体pTT5并在翻译起始区加入了Kozak序列， 然后转染到悬浮培养细胞HEK293F中，使用干扰素α-1作为信号肽使HEK293F 细胞分泌RBD-TEV-Fc融合蛋白，再采用Protein A柱子和镍柱进行两次纯化； 第一次纯化为采用Protein A柱子从培养基上清中获得RBD-TEV-Fc融合蛋白； 第二次纯化为采用带有6His tag的TEV酶对融合蛋白进行酶切，将酶切产物依 次流过Protein A柱子和镍柱，除去Fc、TEV酶以及第一次纯化时结合Protein A 柱子的杂蛋白，最终在流穿中获得纯净的RBD蛋白；或者

SARS-CoV-2重组抗原是在悬浮培养的用细菌表达的核衣壳蛋白，简称N 蛋白，N蛋白是截取Met1-Ala419位氨基酸序列进行表达的；

蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2N蛋白的基因在N端连接6His tag并克 隆到原核表达载体pET28a中，再转化到大肠杆菌细胞BL21中进行N蛋白表达， 然后取破碎细菌在细菌裂解液中加入0.5-2.0M氯化钠，降低蛋白与核酸非特异 性结合，再将裂解液过镍柱，洗脱后加入终浓度为0.25-1.0M的硫酸铵室温搅 拌10-20min，使得蛋白暴露其疏水核心，再采用疏水柱进一步纯化蛋白，然后 采用superdex-200分子筛除去多聚体及其它杂蛋白，最终获得高纯度构象统一 的N蛋白。

本发明同时检测血液中的新型冠状病毒SARS-CoV-2 IgA抗体和涎液化糖链 抗原KL-6用于筛查新型冠状病毒感染的试剂及试剂盒，可以更早期筛查新冠肺 炎并判断患者是否出现肺损伤和纤维化。可以实现一份样本、一个试剂卡同时 得到SARS-CoV-2 IgA抗体和KL-6两个检测结果，省时省力。申请人发现，多数 患者SARS-CoV-2 IgA抗体比IgM抗体出现时间更早；且SARS-CoV-2 IgA抗体比IgM 抗体在人体中阳性持续时间更长。因此，本发明的试剂及试剂盒，可用于更早 期诊断新冠肺炎，并结合KL-6可判断新冠肺炎患者是否出现肺损伤，能够及时 对病状作出判断，解决了因医疗条件不足，在家隔离情况下判断是否感染新冠 病毒及根据是否属于重症情况以便及时作出医院治疗的准确决定。

说明书附图

利用附图对本发明作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本发明的任 何限制。

图1是本发明实施例3的新冠肺炎患者及对照组血清SARS-CoV-2 IgA抗体 水平的结果示意图。

图2是本发明实施例3的SARS-CoV-2 IgA和IgM抗体随病程变化趋势图。

具体实施方式

结合以下实施例对本发明作进一步说明。

实施例1。

一种检测试剂，检测血液中的新型冠状病毒SARS-CoV-2 IgA抗体和检测涎 液化糖链抗原KL-6，用于作为筛选新型冠状病毒感染肺炎特别是早期筛选新型 冠状病毒感染肺炎，并预判重型患者的检测试剂的用途。

其中，重型患者为出现肺损伤或者纤维化的患者。当检测到位重型患者的 时候，一般提醒患者需要医院就医，为患者提供了准确的就医依据。

该检测试剂，可以检测血清、血浆和全血中的新型冠状病毒SARS-CoV-2 IgA 抗体和涎液化糖链抗原KL-6。

本发明的试剂，同时检测血液中的新型冠状病毒SARS-CoV-2 IgA抗体和涎液 化糖链抗原KL-6，可以更早期筛查新冠肺炎并判断患者是否出现肺损伤和纤维 化。可以实现一份样本、一个试剂卡同时得到SARS-CoV-2 IgA抗体和KL-6两个 检测结果，省时省力。申请人发现，多数患者SARS-CoV-2 IgA抗体比IgM抗体出 现时间更早；且SARS-CoV-2 IgA抗体比IgM抗体在人体中阳性持续时间更长。因 此，本发明的试剂及试剂盒盒及SARS-CoV-2IgA抗体免疫检测试剂，可用于更早 期诊断新冠肺炎，并结合KL-6可判断新冠肺炎患者是否出现肺损伤，能够及时 对病状作出判断，解决了因医疗条件不足，在家隔离情况下判断是否感染新冠 病毒及根据是否属于重症情况以便及时作出医院治疗的准确决定且具有检测结 果精确的特点。

实施例2。

一种检测试剂，为含有检测血液中的新型冠状病毒SARS-CoV-2 IgA抗体的 检测试剂和检测涎液化糖链抗原KL-6的检测试剂，用于作为早期筛选新型冠状 病毒感染肺炎，并预判重型患者的试剂盒。其中，重型患者为出现肺损伤或者 纤维化的患者。当检测到位重型患者的时候，一般提醒患者需要医院就医，为 患者提供了准确的就医依据。其中的检测试剂，可以检测血清、血浆和全血中 的新型冠状病毒SARS-CoV-2 IgA抗体和涎液化糖链抗原KL-6。

该试剂盒，含有测试卡、样本稀释液、吸管等。

测试卡，测试卡由SARS-CoV-2 IgA测试条、KL-6测试条和塑料盒组成， 每个测试条均含有硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫、吸水纸和PVC板支持物组 成。其中，SARS-CoV-2IgA测试条的硝酸纤维素膜包被有抗人-IgA抗体和抗鼠 IgG多克隆抗体，结合垫含有胶体金标记的SARS-CoV-2重组抗原；KL-6测试 条的硝酸纤维素膜包被有抗人-KL-6单克隆抗体和抗鼠IgG多克隆抗体，结合垫 含有胶体金标记的抗人KL-6抗体。

样本稀释液，为pH7.1—7.4的Tris盐酸缓冲液，内含2-8％的牛血清白蛋白 (w/v)、0.05-0.2％吐温20(v/v)、0.25-1％Proclin300(v/v)。优选样本稀释液 为pH7.4的Tris盐酸缓冲液，内含1％的牛血清白蛋白(w/v)、0.1％吐温20(v/v)、 0.5％Proclin300(v/v)。

该检测试剂，SARS-CoV-2重组抗原是在悬浮培养的人胚肾细胞株HEK293F 中表达的刺突蛋白，简称S蛋白(Spike protein,S蛋白)，截取RBD结构域 Gln321-Ser591位氨基酸序列进行蛋白表达；蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2S 蛋白RBD基因在C端通过一个TEV酶切位点序列连接人IgG1 Fc，然后将其 克隆到哺乳动物表达载体pTT5并在翻译起始区加入了Kozak序列，然后转染到 悬浮培养细胞HEK293F中，使用干扰素α-1作为信号肽使HEK293F细胞分泌 RBD-TEV-Fc融合蛋白，再采用Protein A柱子和镍柱进行两次纯化；第一次纯 化为采用Protein A柱子从培养基上清中获得RBD-TEV-Fc融合蛋白；第二次纯 化为采用带有6His tag的TEV酶对融合蛋白进行酶切，将酶切产物依次流过 Protein A柱子和镍柱，除去Fc、TEV酶以及第一次纯化时结合Protein A柱子的 杂蛋白，最终在流穿中获得纯净的RBD蛋白。

本方法表达的SARS-COV-2 spike RBD蛋白截取的是SARS-COV-2 spike 蛋白Gln321-Ser591位氨基酸序列，其编码基因序列如下序列1所示，其氨基酸 序列如下序列2所示。

序列1本专利中编码SARS-COV-2 spike RBD的基因序列

CAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTT TTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACA GGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGC ATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATC TCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGT CAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAA ATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTT GATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTC TAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGT AGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAAT CATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGT AGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAA AAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGG TTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTT CCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCC ACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCT。

序列2本专利中SARS-COV-2 spike RBD的氨基酸序列 QPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASF STFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPD DFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPC NGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTN LVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEIL DITPCS。

本方法的SARS-COV-2 spike RBD蛋白是采用分泌表达，所使用的信号肽是 IFNA1(干扰素α-1)信号肽，并在翻译起始区加入了Kozak序列。本专利的 SARS-COV-2 spike RBD蛋白C端通过一个TEV酶切位点序列连接人IgG1 Fc 序列，表达的融合蛋白命名为SARS-COV-2-RBD-TEV-Fc，其基因序列(包括信 号肽)如下序列3所示，氨基酸序列如下序列4所示。

序列3融合蛋白SARS-COV-2-RBD-TEV-Fc的基因序列

ATGGCCTCGCCCTTTGCTTTACTGATGGTCCTGGTGGTGCTCAGCTGCAAG TCAAGCTGCTCTCTGGGCGTCGACCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTT CCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGAT TTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTG ATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAG TGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCA TTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGG AAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTA TAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTAC CTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTT CAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTT TTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTT GGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCAC CAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAAT GTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGT CTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACA CTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACAC CATGTTCTTCTAGAGGTTCTGAGAATCTTTATTTCCAAGGTTCTGGTTCTCC CAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAC TCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC CTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAG CCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGT ACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGC AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGA GAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTAC ACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGAC CTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCA GGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTG CACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA。

序列4融合蛋白SARS-COV-2-RBD-TEV-Fc的氨基酸序列

MASPFALLMVLVVLSCKSSCSLGVDQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFAS VYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVI RGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLY RLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQ PYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKK FLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSSRGSENLYFQGSGSPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK。

本专利通过2次纯化获得高纯度的SARS-COV-2 spike RBD蛋白。第1次纯 化即采用protein A柱子从培养基上清中获得SARS-COV-2-RBD-TEV-Fc融合蛋 白。采用带有6Histag的TEV酶对融合蛋白进行酶切，将酶切产物依次流过 protein A柱子和镍柱，此时Fc、TEV酶以及第一次纯化时结合Protein A柱子的 杂蛋白均被除去，最终在流穿中获得纯净的SARS-COV-2 spike RBD蛋白。

作为另外一种实现方式，SARS-CoV-2重组抗原是在悬浮培养的用细菌表达 的核衣壳蛋白，简称N蛋白，N蛋白是截取Met1-Ala419位氨基酸序列进行表 达的。蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2N蛋白的基因在N端连接6His tag并 克隆到原核表达载体pET28a中，再转化到大肠杆菌细胞BL21中进行N蛋白表 达，然后取破碎细菌在细菌裂解液中加入0.5-2.0M氯化钠，优选加入1.0M氯 化钠，降低蛋白与核酸非特异性结合，再将裂解液过镍柱，洗脱后加入终浓度 为0.25-1.0M的硫酸铵室温搅拌10-20min，优选洗脱后加入终浓度为0.5M的硫酸铵室温搅拌15min，，使得蛋白暴露其疏水核心，再采用疏水柱进一步纯化 蛋白，然后采用superdex-200分子筛除去多聚体及其它杂蛋白，最终获得高纯 度构象统一的N蛋白。

本专利表达的SARS-COV-2N蛋白截取的是SARS-COV-2N蛋白 Met1-Ala419位氨基酸序列。其编码基因序列如下序列5所示，其氨基酸序列如 下序列6所示。

序列5本专利表达的SARS-COV-2N蛋白基因序列

ATGAGCGATAACGGTCCGCAAAACCAGCGTAACGCGCCGCGTATTACCTTC GGTGGTCCGAGCGATAGCACCGGTAGCAACCAAAACGGCGAACGTAGCG GTGCGCGTAGCAAACAACGTCGTCCGCAAGGTCTGCCGAACAACACCGC GAGCTGGTTTACCGCGCTGACCCAGCACGGTAAAGAAGACCTGAAGTTCC CGCGTGGTCAGGGCGTGCCGATTAACACCAACAGCAGCCCGGACGATCAA ATTGGTTATTACCGTCGTGCGACCCGTCGTATCCGTGGCGGTGATGGCAAA ATGAAAGATCTGAGCCCGCGTTGGTACTTCTATTACCTGGGTACCGGCCCG GAAGCGGGTCTGCCGTACGGTGCGAACAAGGATGGCATCATCTGGGTTGC GACCGAAGGTGCGCTGAACACCCCGAAAGACCACATTGGTACCCGTAACC CGGCGAACAACGCGGCGATTGTTCTGCAGCTGCCGCAAGGTACCACCCTG CCGAAAGGTTTCTATGCGGAGGGTAGCCGTGGTGGTAGCCAAGCGAGCAG CCGTAGCAGCAGCCGTAGCCGTAACAGCAGCCGTAACAGCACCCCGGGTA GCAGCCGTGGTACCAGCCCGGCGCGTATGGCGGGTAACGGTGGCGATGCG GCGCTGGCGCTGCTGCTGCTGGATCGTCTGAACCAACTGGAGAGCAAGAT GAGCGGCAAGGGTCAGCAACAACAGGGTCAAACCGTTACCAAAAAGAGC GCGGCGGAAGCGAGCAAGAAACCGCGTCAGAAACGTACCGCGACCAAGG CGTACAACGTGACCCAGGCGTTTGGTCGTCGTGGTCCGGAACAAACCCAG GGCAACTTTGGTGACCAAGAACTGATCCGTCAAGGCACCGACTACAAACA CTGGCCGCAGATCGCGCAATTCGCGCCGAGCGCGAGCGCGTTCTTTGGTAT GAGCCGTATTGGTATGGAAGTGACCCCGAGCGGTACCTGGCTGACCTACAC CGGTGCGATCAAACTGGACGATAAGGACCCGAACTTCAAAGACCAAGTGA TCCTGCTGAACAAGCACATCGACGCGTACAAAACCTTTCCGCCGACCGAG CCGAAGAAAGACAAGAAGAAAAAGGCGGATGAAACCCAGGCGCTGCCGC AACGTCAGAAAAAGCAACAGACCGTGACCCTGCTGCCGGCGGCGGATCT GGACGATTTCAGCAAACAGCTGCAGCAAAGCATGAGCAGCGCGGATAGCA CCCAAGCG。

序列6本专利表达的SARS-COV-2N蛋白氨基酸序列

MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTAS WFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKD LSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNA AIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPAR MAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPR QKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSA SAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFP PTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSAD STQA。

本专利的SARS-COV-2N蛋白是采用细菌内可溶性表达，在其N端连接了 6His tag，采用镍柱在细菌破碎上清中纯化可溶性的SARS-COV-2N，此时纯化 得到的N蛋白中结合有大量的核酸。为除去核酸，加入硫酸铵室温搅拌，使得 蛋白暴露其疏水核心，再采用疏水柱进一步纯化蛋白，此时核酸被除去。为进 一步除去多聚体及其它杂蛋白，采用superdex200分子筛进一步对蛋白进行纯化， 最终获得高纯度构象统一的SARS-COV-2N蛋白。

该试剂盒采用免疫层析技术原理，定性检测人血清、血浆、全血中的 SARS-CoV-2IgA和KL-6，当样本中含有SARS-CoV-2 IgA和KL-6时分别与胶 体金标记的SARS-CoV-2重组抗原、抗人KL-6抗体结合形成反应复合物，在层 析作用下复合物沿着硝酸纤维膜向前移动，分别被硝酸纤维素膜上检测区(T) 预先包被的抗人-IgA抗体、抗人-IgG抗体捕获，在检测区(T)凝集形成一条肉 眼可见的红色反应线，此时结果为阳性；当样本中SARS-CoV-2IgA和KL-6低 于最低检测限时，则检测区(T)无红色反应线出现，此时结果为阴性。

以RBD蛋白作为磁珠包被抗原的试剂盒进行检测，在几个临床单位进行研 究，对174位患者和202例对照人群进行临床研究，得到新冠肺炎患者及对照 组血清SARS-CoV-2IgA抗体水平结果如图1和表一所示。在图1中可以看出， 新冠肺炎患者的IgA水平比对照组显著升高。SARS-CoV-2 IgA和IgM抗体随病 程变化趋势如图2所示，在图2中可以看出患者的SARS-CoV-2 IgA比IgM抗 体更早转为阳性，平均早2(1-4)天。因此，患者就诊时临床检测SARS-CoV-2 IgA抗体，可更早地诊断出部分新冠肺炎患者。

表1新冠肺炎患者及对照组SARS-CoV-2 IgA抗体检测结果

将新冠肺炎患者分为轻型/普通型、重型/危重型两组，两组的KL-6阳性率 分别为21％、97.6％，两组相比有明显统计学差异(p<0.05)，KL-6判断重型新 冠肺炎的阳性预测值、阴性预测值分别是80％、97％，敏感性和特异性分别是 97.6％、79％。

可见，本发明的试剂盒可同时检测血液中的新型冠状病毒SARS-CoV-2 IgA 抗体和涎液化糖链抗原KL-6，可以更早期筛查新冠肺炎并判断患者是否出现肺 损伤和纤维化。

以RBD蛋白作为磁珠包被抗原的试剂盒进行检测，检测10例正常人血清、 发病2-8天的新冠肺炎患者轻型5例、重型5例的血清为例，其检测操作流程如 下：

1.检测前将待测样本、检测试剂及其他检测用材料等平衡至室温，检测应在 室温下进行。注：室温指温度为10℃～30℃，湿度为45％～75％。

2.旋开滴瓶滴头，用吸管吸取待测样本，滴加一滴待测样本到滴瓶中稀释(即 按1:10稀释)，旋紧滴头，上下摇摆，并混匀。

3.沿铝箔袋切口部位撕开，取出测试卡平放于台面上(注意：不要用手指 触摸测试条中间膜的表面)。

4.打开瓶盖，将混匀的样本滴加2～3滴于测试卡上。

5.15分钟观察两个测试条的显示结果，30分钟后显示结果无临床意义。

检测结果如表二所示。

表二

综上分析，本发明的试剂盒，能够准确检测新冠病毒感染，并通过KL-6获 得患者的轻重状态，为使用者提供了简便的判断是否需要就医的标准。方便了 用户使用。

实施例3。

以N蛋白作为磁珠包被抗原的试剂盒进行检测，检测12例正常人血清、发 病2-8天的新冠肺炎患者轻型5例、重型5例的血清为例，其检测操作流程如下：

1.检测前将待测样本、检测试剂及其他检测用材料等平衡至室温，检测应在 室温下进行。注：室温指温度为10℃～30℃，湿度为45％～75％。

2.旋开滴瓶滴头，用吸管吸取待测样本，滴加一滴待测样本到滴瓶中稀释(即 按1:10稀释)，旋紧滴头，上下摇摆，并混匀。

3.沿铝箔袋切口部位撕开，取出测试卡平放于台面上(注意：不要用手指 触摸测试条中间膜的表面)。

4.打开瓶盖，将混匀的样本滴加2～3滴于测试卡上。

5.15分钟观察两个测试条的显示结果，30分钟后显示结果无临床意义。

检测结果如表三所示。

表三

综上分析，本发明的试剂盒，能够准确检测新冠病毒感染，并通过KL-6获 得患者的轻重状态，为使用者提供了简便的判断是否需要就医的标准。方便了 用户使用。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发 明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普 通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不 脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 广州市康润生物科技有限公司

<120> 双指标筛选新冠病毒及预判重型肺炎的方法

<130> GZZRH0504-20-1-806

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 813

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 60

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 120

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 180

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 240

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 300

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 360

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 420

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 480

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 540

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 600

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 660

ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 720

cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 780

acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tct 813

<210> 2

<211> 271

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

1 5 10 15

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

20 25 30

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

35 40 45

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

50 55 60

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

65 70 75 80

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

85 90 95

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

100 105 110

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

115 120 125

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

130 135 140

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

145 150 155 160

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

165 170 175

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

180 185 190

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

195 200 205

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

210 215 220

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

225 230 235 240

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

245 250 255

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser

260 265 270

<210> 3

<211> 1623

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcctcgc cctttgcttt actgatggtc ctggtggtgc tcagctgcaa gtcaagctgc 60

tctctgggcg tcgaccaacc aacagaatct attgttagat ttcctaatat tacaaacttg 120

tgcccttttg gtgaagtttt taacgccacc agatttgcat ctgtttatgc ttggaacagg 180

aagagaatca gcaactgtgt tgctgattat tctgtcctat ataattccgc atcattttcc 240

acttttaagt gttatggagt gtctcctact aaattaaatg atctctgctt tactaatgtc 300

tatgcagatt catttgtaat tagaggtgat gaagtcagac aaatcgctcc agggcaaact 360

ggaaagattg ctgattataa ttataaatta ccagatgatt ttacaggctg cgttatagct 420

tggaattcta acaatcttga ttctaaggtt ggtggtaatt ataattacct gtatagattg 480

tttaggaagt ctaatctcaa accttttgag agagatattt caactgaaat ctatcaggcc 540

ggtagcacac cttgtaatgg tgttgaaggt tttaattgtt actttccttt acaatcatat 600

ggtttccaac ccactaatgg tgttggttac caaccataca gagtagtagt actttctttt 660

gaacttctac atgcaccagc aactgtttgt ggacctaaaa agtctactaa tttggttaaa 720

aacaaatgtg tcaatttcaa cttcaatggt ttaacaggca caggtgttct tactgagtct 780

aacaaaaagt ttctgccttt ccaacaattt ggcagagaca ttgctgacac tactgatgct 840

gtccgtgatc cacagacact tgagattctt gacattacac catgttcttc tagaggttct 900

gagaatcttt atttccaagg ttctggttct cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 960

ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 1020

cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 1080

agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 1140

gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 1200

accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1260

gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1320

caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 1380

tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1440

ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1500

tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1560

gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1620

aaa 1623

<210> 4

<211> 541

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Ser Pro Phe Ala Leu Leu Met Val Leu Val Val Leu Ser Cys

1 5 10 15

Lys Ser Ser Cys Ser Leu Gly Val Asp Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val

20 25 30

Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn

35 40 45

Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser

50 55 60

Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser

65 70 75 80

Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys

85 90 95

Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val

100 105 110

Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr

115 120 125

Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn

130 135 140

Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu

145 150 155 160

Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu

165 170 175

Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn

180 185 190

Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val

195 200 205

Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His

210 215 220

Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys

225 230 235 240

Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val

245 250 255

Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg

260 265 270

Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu

275 280 285

Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Ser Arg Gly Ser Glu Asn Leu Tyr

290 295 300

Phe Gln Gly Ser Gly Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

305 310 315 320

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

325 330 335

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

340 345 350

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

355 360 365

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

370 375 380

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

385 390 395 400

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

405 410 415

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

420 425 430

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

435 440 445

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

450 455 460

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

465 470 475 480

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

485 490 495

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

500 505 510

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

515 520 525

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

530 535 540

<210> 5

<211> 1257

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgagcgata acggtccgca aaaccagcgt aacgcgccgc gtattacctt cggtggtccg 60

agcgatagca ccggtagcaa ccaaaacggc gaacgtagcg gtgcgcgtag caaacaacgt 120

cgtccgcaag gtctgccgaa caacaccgcg agctggttta ccgcgctgac ccagcacggt 180

aaagaagacc tgaagttccc gcgtggtcag ggcgtgccga ttaacaccaa cagcagcccg 240

gacgatcaaa ttggttatta ccgtcgtgcg acccgtcgta tccgtggcgg tgatggcaaa 300

atgaaagatc tgagcccgcg ttggtacttc tattacctgg gtaccggccc ggaagcgggt 360

ctgccgtacg gtgcgaacaa ggatggcatc atctgggttg cgaccgaagg tgcgctgaac 420

accccgaaag accacattgg tacccgtaac ccggcgaaca acgcggcgat tgttctgcag 480

ctgccgcaag gtaccaccct gccgaaaggt ttctatgcgg agggtagccg tggtggtagc 540

caagcgagca gccgtagcag cagccgtagc cgtaacagca gccgtaacag caccccgggt 600

agcagccgtg gtaccagccc ggcgcgtatg gcgggtaacg gtggcgatgc ggcgctggcg 660

ctgctgctgc tggatcgtct gaaccaactg gagagcaaga tgagcggcaa gggtcagcaa 720

caacagggtc aaaccgttac caaaaagagc gcggcggaag cgagcaagaa accgcgtcag 780

aaacgtaccg cgaccaaggc gtacaacgtg acccaggcgt ttggtcgtcg tggtccggaa 840

caaacccagg gcaactttgg tgaccaagaa ctgatccgtc aaggcaccga ctacaaacac 900

tggccgcaga tcgcgcaatt cgcgccgagc gcgagcgcgt tctttggtat gagccgtatt 960

ggtatggaag tgaccccgag cggtacctgg ctgacctaca ccggtgcgat caaactggac 1020

gataaggacc cgaacttcaa agaccaagtg atcctgctga acaagcacat cgacgcgtac 1080

aaaacctttc cgccgaccga gccgaagaaa gacaagaaga aaaaggcgga tgaaacccag 1140

gcgctgccgc aacgtcagaa aaagcaacag accgtgaccc tgctgccggc ggcggatctg 1200

gacgatttca gcaaacagct gcagcaaagc atgagcagcg cggatagcac ccaagcg 1257

<210> 6

<211> 419

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln

260 265 270

Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala

Claims (10)

1.一种检测试剂，检测血液中的新型冠状病毒SARS-CoV-2IgA抗体和检测涎液化糖链抗原KL-6，用于作为筛选新型冠状病毒感染肺炎，并预判重型患者的检测试剂的用途。

2.根据权利要求1的检测试剂，其特征在于：用于作为早期筛选新型冠状病毒感染肺炎，并预判重型患者的检测试剂盒的用途。

3.根据权利要求1或2所述的检测试剂，其特征在于：重型患者为出现肺损伤或者纤维化的患者。

4.根据权利要求3所述的检测试剂，其特征在于：检测血清、血浆和全血中的新型冠状病毒SARS-CoV-2IgA抗体和涎液化糖链抗原KL-6。

5.根据权利要求4所述的检测试剂，其特征在于：试剂盒含有测试卡，测试卡由SARS-CoV-2IgA测试条、KL-6测试条和塑料盒组成；

每个测试条均含有硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫、吸水纸和PVC板支持物组成；

SARS-CoV-2IgA测试条的硝酸纤维素膜包被有抗人-IgA抗体和抗鼠IgG多克隆抗体，结合垫含有胶体金标记的SARS-CoV-2重组抗原；

KL-6测试条的硝酸纤维素膜包被有抗人-KL-6单克隆抗体和抗鼠IgG多克隆抗体，结合垫含有胶体金标记的抗人KL-6抗体。

6.根据权利要求5所述的检测试剂，其特征在于：

SARS-CoV-2重组抗原是在悬浮培养的人胚肾细胞株HEK293F中表达的刺突蛋白，简称S蛋白，截取RBD结构域Gln321-Ser591位氨基酸序列进行蛋白表达；蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2S蛋白RBD基因在C端通过一个TEV酶切位点序列连接人IgG1 Fc，然后将其克隆到哺乳动物表达载体pTT5并在翻译起始区加入了Kozak序列，然后转染到悬浮培养细胞HEK293F中，使用干扰素α-1作为信号肽使HEK293F细胞分泌RBD-TEV-Fc融合蛋白，再采用Protein A柱子和镍柱进行两次纯化；第一次纯化为采用Protein A柱子从培养基上清中获得RBD-TEV-Fc融合蛋白；第二次纯化为采用带有6His tag的TEV酶对融合蛋白进行酶切，将酶切产物依次流过Protein A柱子和镍柱，除去Fc、TEV酶以及第一次纯化时结合Protein A柱子的杂蛋白，最终在流穿中获得纯净的RBD蛋白；或者

SARS-CoV-2重组抗原是在悬浮培养的用细菌表达的核衣壳蛋白，简称N蛋白，N蛋白是截取Met1-Ala419位氨基酸序列进行表达的；

蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2N蛋白的基因在N端连接6His tag并克隆到原核表达载体pET28a中，再转化到大肠杆菌细胞BL21中进行N蛋白表达，然后取破碎细菌在细菌裂解液中加入0.5-2.0M氯化钠，降低蛋白与核酸非特异性结合，再将裂解液过镍柱，洗脱后加入终浓度为0.25-1.0M的硫酸铵室温搅拌10-20min，使得蛋白暴露其疏水核心，再采用疏水柱进一步纯化蛋白，然后采用superdex-200分子筛除去多聚体及其它杂蛋白，最终获得高纯度构象统一的N蛋白。

7.根据权利要求6所述的检测试剂，其特征在于：

试剂盒还含有样本稀释液，所述样本稀释液为pH7.1—7.4的Tris盐酸缓冲液，内含2-8％的牛血清白蛋白(w/v)、0.05-0.2％吐温20(v/v)、0.25-1％Proclin300(v/v)。

8.含有检测血液中的新型冠状病毒SARS-CoV-2IgA抗体的检测试剂和检测涎液化糖链抗原KL-6的检测试剂、用于作为筛选新型冠状病毒感染肺炎，并预判重型患者的试剂盒。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：含有，

测试卡，测试卡由SARS-CoV-2IgA测试条、KL-6测试条和塑料盒组成，每个测试条均含有硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫、吸水纸和PVC板支持物组成；其中

SARS-CoV-2IgA测试条的硝酸纤维素膜包被有抗人-IgA抗体和抗鼠IgG多克隆抗体，结合垫含有胶体金标记的SARS-CoV-2重组抗原；

KL-6测试条的硝酸纤维素膜包被有抗人-KL-6单克隆抗体和抗鼠IgG多克隆抗体，结合垫含有胶体金标记的抗人KL-6抗体；

样本稀释液，所述样本稀释液为pH7.1-7.4的Tris盐酸缓冲液，内含2-8％的牛血清白蛋白(w/v)、0.05-0.2％吐温20(v/v)、0.25-1％Proclin300(v/v)。

10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于：

SARS-CoV-2重组抗原是在悬浮培养的人胚肾细胞株HEK293F中表达的刺突蛋白，简称S蛋白，截取RBD结构域Gln321-Ser591位氨基酸序列进行蛋白表达；蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2S蛋白RBD基因在C端通过一个TEV酶切位点序列连接人IgG1 Fc，然后将其克隆到哺乳动物表达载体pTT5并在翻译起始区加入了Kozak序列，然后转染到悬浮培养细胞HEK293F中，使用干扰素α-1作为信号肽使HEK293F细胞分泌RBD-TEV-Fc融合蛋白，再采用Protein A柱子和镍柱进行两次纯化；第一次纯化为采用Protein A柱子从培养基上清中获得RBD-TEV-Fc融合蛋白；第二次纯化为采用带有6His tag的TEV酶对融合蛋白进行酶切，将酶切产物依次流过Protein A柱子和镍柱，除去Fc、TEV酶以及第一次纯化时结合Protein A柱子的杂蛋白，最终在流穿中获得纯净的RBD蛋白；或者

SARS-CoV-2重组抗原是在悬浮培养的用细菌表达的核衣壳蛋白，简称N蛋白，N蛋白是截取Met1-Ala419位氨基酸序列进行表达的；

蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2N蛋白的基因在N端连接6His tag并克隆到原核表达载体pET28a中，再转化到大肠杆菌细胞BL21中进行N蛋白表达，然后取破碎细菌在细菌裂解液中加入0.5-2.0M氯化钠，降低蛋白与核酸非特异性结合，再将裂解液过镍柱，洗脱后加入终浓度为0.25-1.0M的硫酸铵室温搅拌10-20min，使得蛋白暴露其疏水核心，再采用疏水柱进一步纯化蛋白，然后采用superdex-200分子筛除去多聚体及其它杂蛋白，最终获得高纯度构象统一的N蛋白。

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