CN111366735B - 新型冠状病毒更早期筛查方法 - Google Patents

Abstract

本发明的一种新型冠状病毒更早期筛查方法，可以检测新型冠状病毒，特别是用于在早期筛查SARS‑CoV‑2IgA抗体。试剂盒含有，作为R1的SARS‑CoV‑2磁珠包被物：含包被SARS‑CoV‑2重组抗原的磁珠包被物三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH值为7.1‑7.4；作为R2的抗人IgA抗体吖啶酯标记物：为含有吖啶酯标记鼠抗人IgA单克隆抗体的2‑(N‑吗啉)乙磺酸缓冲液。本发明的试剂盒及SARS‑CoV‑2IgA抗体免疫检测试剂，可用于更早期补充诊断新冠肺炎，且具有检测结果精确的特点。

Description

新型冠状病毒更早期筛查方法

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，特别是涉及一种新型冠状病毒感染肺炎(新 冠肺炎)的SARS-CoV-2IgA抗体的更早期筛查方法、试剂及其试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒感染肺炎(新冠肺炎)作为急性呼吸道传染病已纳入《中华 人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，按甲类传染病管理。新冠肺炎 一般感染SARS-CoV-2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) 后3-7天发病，症状以发热、干咳、乏力为主，亦可伴随鼻塞、流涕、咽痛、肌 痛和腹泻等。轻型患者无肺炎表现，重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/ 或低氧血症，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒性休克、难以纠 正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。值得注意的是重型、 危重型患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。因此能高效率检出新冠肺炎 患者并预判出重型肺炎患者很有意义。

最开始被采用的是病毒核酸检测试剂，用于新冠肺炎的确诊。因其检出率 低，许多企业开始研发SARS-CoV-2IgG、IgM快速检测试剂盒，包括胶体金法、 化学发光免疫分析法。第七版新冠肺炎诊疗方案纳入IgM、IgG血清学检测作为 实验室诊断手段。目前已注册的产品有11个核酸检测产品，6个抗体检测产品， 后者包括：胶体金法新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测试剂盒、胶体金法新 型冠状病毒(2019-nCoV)IgM抗体检测试剂盒、磁微粒化学发光法新型冠状病 毒(2019-nCoV)IgM抗体检测试剂盒、磁微粒化学发光法新型冠状病毒 (2019-nCoV)IgG抗体检测试剂盒、学发光微粒子免疫检测法新型冠状病毒 (2019-nCoV)抗体检测试剂盒。

因为SARS-CoV-2感染下呼吸道，患者少咳痰，采用咽拭子有很大机率采 集样本失败。核酸检测试剂对新冠肺炎的检出率低，敏感性只有30-50％，不能 满足将所有患者筛选出来的需求。

测总抗体提高了敏感性但不能有效分辨患者处于病程哪个时期，是否还具传 染性。胶体金法检测简便快速，但准确性不够。化学发光法测IgM、IgG抗体敏 感性、特异性均高，但是两者的窗口期较长，IgM要发病3-5天后检出，IgG要 恢复期检测值升高4倍以上才能诊断。

因此，目前公开的技术在在检测新型冠状病毒方面检测时间滞后，检测结果 有待提高。目前尚无关于IgA用于新冠肺炎筛选检测的报导，也没有IgA检测 试剂盒研发成功的报导。

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种能够更早检测 SARS-CoV-2IgA抗体的用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒及其试剂。

本发明的目的通过以下技术措施实现。

提供一种检测SARS-CoV-2IgA抗体的用于筛查新型冠状病毒感染的试剂 盒。

优选的，上述用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，用于在早期筛查 SARS-CoV-2IgA抗体。

优选的，上述用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，作为R1的SARS-CoV-2 磁珠包被物：含包被SARS-CoV-2重组抗原的磁珠包被物三羟甲基氨基甲烷缓 冲液，pH值为7.1-7.4；

作为R2的抗人IgA抗体吖啶酯标记物：为含有吖啶酯标记鼠抗人IgA单克 隆抗体的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液。

优选的，上述用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，SARS-CoV-2重组抗原 是在悬浮培养的人胚肾细胞株HEK293F中表达的刺突蛋白，简称S蛋白(Spike protein,S蛋白)，截取RBD结构域Gln321-Ser591位氨基酸序列进行蛋白表达；

蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2S蛋白RBD基因在C端通过一个TEV 酶切位点序列连接人IgG1 Fc，然后将其克隆到哺乳动物表达载体pTT5并在翻 译起始区加入了Kozak序列，然后转染到悬浮培养细胞HEK293F中，使用干扰 素α-1作为信号肽使HEK293F细胞分泌RBD-TEV-Fc融合蛋白，再采用Protein A柱子和镍柱进行两次纯化；第一次纯化为采用Protein A柱子从培养基上清中 获得RBD-TEV-Fc融合蛋白；第二次纯化为采用带有6Histag的TEV酶对融合 蛋白进行酶切，将酶切产物依次流过Protein A柱子和镍柱，除去Fc、TEV酶以 及第一次纯化时结合Protein A柱子的杂蛋白，最终在流穿中获得纯净的RBD蛋白。

另一优选的，上述用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，SARS-CoV-2重组 抗原是在悬浮培养的用细菌表达的核衣壳蛋白，简称N蛋白，N蛋白是截取 Met1-Ala419位氨基酸序列进行表达的；

蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2N蛋白的基因在N端连接6His tag并克 隆到原核表达载体pET28a中，再转化到大肠杆菌细胞BL21中进行N蛋白表达， 然后取破碎细菌在细菌裂解液中加入0.5-2.0M氯化钠，降低蛋白与核酸非特异 性结合，再将裂解液过镍柱，洗脱后加入终浓度为0.25-1.0M的硫酸铵室温搅 拌10-20min，使得蛋白暴露其疏水核心，再采用疏水柱进一步纯化蛋白，然后 采用superdex-200分子筛除去多聚体及其它杂蛋白，最终获得高纯度构象统一 的N蛋白。

优选的，上述用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，所述三羟甲基氨基甲 烷缓冲液内含0.05-0.2％吐温20(v/v)、2-8％牛血清白蛋白(w/v)、0.25-1％ Proclin300(v/v)；

2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液含有0.05-0.2％吐温20(v/v)、2-8％牛血清白蛋 白(w/v)、0.25-1％Proclin300(v/v)。

优选的，上述用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，还含有：

作为R3的反应缓冲液：含羊抗人IgG抗体的磷酸盐缓冲液，内含0.05-0.2％ 吐温20(v/v)、2-8％牛血清白蛋白(w/v)、0.25-1％Proclin300(v/v)；

SARS-CoV-2IgA阴性对照：为SARS-CoV-2IgA阴性血清；

SARS-CoV-2IgA阳性对照：为人源性纯化SARS-CoV-2IgM抗体；

阴阳性对照信息卡：含有阴阳性对照的发光值，用于筛选时的校正。

另一优选的，上述用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，含有，

测试卡：由SARS-CoV-2IgA测试条和塑料盒组成；测试条含有硝酸纤维素 膜、样品垫、结合垫、吸水纸、PVC板支持物组成；

硝酸纤维素膜包被有抗人-IgA抗体和抗鼠IgG多克隆抗体，结合垫含有胶 体金标记的SARS-CoV-2抗原。

优选的，上述用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，还含有作为样本稀释 液的Tris盐酸缓冲液，Tris盐酸缓冲液的pH值为7.1-7.4，内含0.5-2％的牛血 清白蛋白(w/v)、0.05-0.2％吐温20(v/v)、0.25-1％Proclin300(v/v)。

本发明还提供一种检测SARS-CoV-2IgA抗体的试剂在制备上述用于筛查 新型冠状病毒感染试剂或者试剂盒中的用途。

本发明用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒及其检测试剂，可以检测新型 冠状病毒。申请人发现，患者SARS-CoV-2IgA抗体比IgM抗体出现时间更早；且 SARS-CoV-2IgA抗体比IgM抗体在人体中阳性持续时间更长。因此，本发明的试 剂盒及SARS-CoV-2IgA抗体免疫检测试剂，可用于更早期补充诊断新冠肺炎，且 具有检测结果精确的特点。

说明书附图

利用附图对本发明作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本发明的任 何限制。

图1是本发明一个实验例的新冠肺炎患者及对照组血清SARS-CoV-2IgA抗 体水平的结果示意图。

图2是本发明一个实验例的SARS-CoV-2IgA和IgM抗体随病程变化趋势 图。

具体实施方式

结合以下实施例对本发明作进一步说明。

实施例1。

一种检测SARS-CoV-2IgA抗体的用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒。尤 其用于在早期筛查SARS-CoV-2IgA抗体。

该用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，包含：

1.SARS-CoV-2磁珠包被物(R1)：含包被SARS-CoV-2重组抗原的磁珠包 被物三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH值为7.1-7.4，含有0.05-0.2％吐温20(v/v)、 2-8％牛血清白蛋白(w/v)、0.25-1％Proclin300(v/v)；磁珠作为反应固相载体， 抗原用于结合待测物中的目标抗体。

2.抗人IgA抗体吖啶酯标记物(R2)：为吖啶酯标记鼠抗人IgA单克隆抗体 的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液，含有0.05-0.2％吐温20(v/v)、2-8％牛血清白蛋 白(w/v)、0.25-1％Proclin300(v/v)。同抗原抗体复合物结合，在碱性条件下， 吖啶酯被激发后可发光。

3.反应缓冲液(R3)：含羊抗人IgG抗体的磷酸盐缓冲液，内含0.05-0.2％吐 温20(v/v)、2-8％牛血清白蛋白(w/v)、0.25-1％Proclin300(v/v)。用于吸附 待测样本中的IgG，以抗干扰。

4.SARS-CoV-2IgA阴性对照：为SARS-CoV-2IgA阴性血清。

5.SARS-CoV-2IgA阳性对照：为人源性纯化SARS-CoV-2IgM抗体。

6.阴阳性对照信息卡：含有阴阳性对照的发光值，用于筛选时的校正。

实验另需要底物液(含NaOH的水溶液)、清洗液(含表面活性剂的磷酸盐 缓冲液)为通用试剂，不在本试剂盒提供。

通过临床研究，部分患者的SARS-CoV-2IgA比IgM抗体更早转为阳性，平 均早1-4天。因此，可更早期地通过临床检测SARS-CoV-2IgA抗体，及早筛查 处部分新冠肺炎患者。

实验发现，本试剂盒检测结果诊断肺炎的敏感性和特异性分别达到了99％、 96％以上，是一种优良的检测试剂盒。

实施例2。

一种检测SARS-CoV-2IgA抗体的用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，其 它特征与实施例1相同，不同之处在于，还具有如下特征：SARS-CoV-2重组 抗原是在悬浮培养的人胚肾细胞株HEK293F中表达的刺突蛋白(Spike protein,S 蛋白)，简称S蛋白，截取RBD结构域Gln321-Ser591位氨基酸序列进行蛋白表 达。蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2S蛋白RBD基因在C端通过一个TEV 酶切位点序列连接人IgG1 Fc，然后将其克隆到哺乳动物表达载体pTT5并在翻 译起始区加入了Kozak序列，然后转染到悬浮培养细胞HEK293F中，使用干扰素α-1作为信号肽使HEK293F细胞分泌RBD-TEV-Fc融合蛋白，再采用Protein A柱子和镍柱进行两次纯化；第一次纯化为采用Protein A柱子从培养基上清中 获得RBD-TEV-Fc融合蛋白；第二次纯化为采用带有6His tag的TEV酶对融合 蛋白进行酶切，将酶切产物依次流过Protein A柱子和镍柱，除去Fc、TEV酶以 及第一次纯化时结合Protein A柱子的杂蛋白，最终在流穿中获得纯净的RBD蛋 白。

本方法表达的SARS-COV-2spike RBD蛋白截取的是SARS-COV-2spike 蛋白Gln321-Ser591位氨基酸序列，其编码基因序列如下序列1所示，其氨基酸 序列如下序列2所示。

序列1本专利中编码SARS-COV-2spike RBD的基因序列 CAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTT TTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACA GGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGC ATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATC TCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGT CAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAA ATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTT GATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTC TAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAAT CATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGT AGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAA AAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGG TTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTT CCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCC ACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCT。

序列2本专利中SARS-COV-2spike RBD的氨基酸序列

本方法的SARS-COV-2spike RBD蛋白是采用分泌表达，所使用的信号肽是 IFNA1(干扰素α-1)信号肽，并在翻译起始区加入了Kozak序列。本专利的 SARS-COV-2spike RBD蛋白C端通过一个TEV酶切位点序列连接人IgG1 Fc 序列，表达的融合蛋白命名为SARS-COV-2-RBD-TEV-Fc，其基因序列(包括信 号肽)如下序列3所示，氨基酸序列如下序列4所示。

序列3融合蛋白SARS-COV-2-RBD-TEV-Fc的基因序列 ATGGCCTCGCCCTTTGCTTTACTGATGGTCCTGGTGGTGCTCAGCTGCAAG TCAAGCTGCTCTCTGGGCGTCGACCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTT CCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGAT TTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTG ATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAG TGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCA TTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGG AAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTA TAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTAC CTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTT CAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTT TTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTT GGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCAC CAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAAT GTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGT CTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACA CTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACAC CATGTTCTTCTAGAGGTTCTGAGAATCTTTATTTCCAAGGTTCTGGTTCTCC CAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAC TCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC CTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAG CCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGT ACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGC AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGA GAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTAC ACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGAC CTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCA GGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTG CACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA。

序列4融合蛋白SARS-COV-2-RBD-TEV-Fc的氨基酸序列 MASPFALLMVLVVLSCKSSCSLGVDQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFAS VYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVI RGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLY RLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQ PYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKK FLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSSRGSENLYFQGSGSPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK。

本专利通过2次纯化获得高纯度的SARS-COV-2spike RBD蛋白。第1次纯 化即采用protein A柱子从培养基上清中获得SARS-COV-2-RBD-TEV-Fc融合蛋 白。采用带有6Histag的TEV酶对融合蛋白进行酶切，将酶切产物依次流过 protein A柱子和镍柱，此时Fc、TEV酶以及第一次纯化时结合Protein A柱子的 杂蛋白均被除去，最终在流穿中获得纯净的SARS-COV-2spike RBD蛋白。

作为另外一种实现方式，SARS-CoV-2重组抗原是在悬浮培养的用细菌表达 的核衣壳蛋白，简称N蛋白，N蛋白是截取Met1-Ala419位氨基酸序列进行表 达的。蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2N蛋白的基因在N端连接6His tag并 克隆到原核表达载体pET28a中，再转化到大肠杆菌细胞BL21中进行N蛋白表 达，然后取破碎细菌在细菌裂解液中加入0.5-2.0M氯化钠，优选加入1.0M氯 化钠，降低蛋白与核酸非特异性结合，再将裂解液过镍柱，洗脱后加入终浓度 为0.25-1.0M的硫酸铵室温搅拌10-20min，优选洗脱后加入终浓度为0.5M的硫酸铵室温搅拌15min，，使得蛋白暴露其疏水核心，再采用疏水柱进一步纯化 蛋白，然后采用superdex-200分子筛除去多聚体及其它杂蛋白，最终获得高纯 度构象统一的N蛋白。

本专利表达的SARS-COV-2N蛋白截取的是SARS-COV-2N蛋白 Met1-Ala419位氨基酸序列。其编码基因序列如下序列5所示，其氨基酸序列如 下序列6所示。

序列5本专利表达的SARS-COV-2N蛋白基因序列

ATGAGCGATAACGGTCCGCAAAACCAGCGTAACGCGCCGCGTATTACCTTC GGTGGTCCGAGCGATAGCACCGGTAGCAACCAAAACGGCGAACGTAGCG GTGCGCGTAGCAAACAACGTCGTCCGCAAGGTCTGCCGAACAACACCGC GAGCTGGTTTACCGCGCTGACCCAGCACGGTAAAGAAGACCTGAAGTTCC CGCGTGGTCAGGGCGTGCCGATTAACACCAACAGCAGCCCGGACGATCAA ATTGGTTATTACCGTCGTGCGACCCGTCGTATCCGTGGCGGTGATGGCAAA ATGAAAGATCTGAGCCCGCGTTGGTACTTCTATTACCTGGGTACCGGCCCG GAAGCGGGTCTGCCGTACGGTGCGAACAAGGATGGCATCATCTGGGTTGC GACCGAAGGTGCGCTGAACACCCCGAAAGACCACATTGGTACCCGTAACC CGGCGAACAACGCGGCGATTGTTCTGCAGCTGCCGCAAGGTACCACCCTG CCGAAAGGTTTCTATGCGGAGGGTAGCCGTGGTGGTAGCCAAGCGAGCAG CCGTAGCAGCAGCCGTAGCCGTAACAGCAGCCGTAACAGCACCCCGGGTA GCAGCCGTGGTACCAGCCCGGCGCGTATGGCGGGTAACGGTGGCGATGCG GCGCTGGCGCTGCTGCTGCTGGATCGTCTGAACCAACTGGAGAGCAAGAT GAGCGGCAAGGGTCAGCAACAACAGGGTCAAACCGTTACCAAAAAGAGC GCGGCGGAAGCGAGCAAGAAACCGCGTCAGAAACGTACCGCGACCAAGG CGTACAACGTGACCCAGGCGTTTGGTCGTCGTGGTCCGGAACAAACCCAG GGCAACTTTGGTGACCAAGAACTGATCCGTCAAGGCACCGACTACAAACA CTGGCCGCAGATCGCGCAATTCGCGCCGAGCGCGAGCGCGTTCTTTGGTAT GAGCCGTATTGGTATGGAAGTGACCCCGAGCGGTACCTGGCTGACCTACAC CGGTGCGATCAAACTGGACGATAAGGACCCGAACTTCAAAGACCAAGTGA TCCTGCTGAACAAGCACATCGACGCGTACAAAACCTTTCCGCCGACCGAG CCGAAGAAAGACAAGAAGAAAAAGGCGGATGAAACCCAGGCGCTGCCGC AACGTCAGAAAAAGCAACAGACCGTGACCCTGCTGCCGGCGGCGGATCT GGACGATTTCAGCAAACAGCTGCAGCAAAGCATGAGCAGCGCGGATAGCA CCCAAGCG。

序列6本专利表达的SARS-COV-2N蛋白氨基酸序列

MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTAS WFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKD LSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNA AIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPAR MAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPR QKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSA SAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFP PTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSAD STQA。

本专利的SARS-COV-2N蛋白是采用细菌内可溶性表达，在其N端连接了 6His tag，采用镍柱在细菌破碎上清中纯化可溶性的SARS-COV-2N，此时纯化 得到的N蛋白中结合有大量的核酸。为除去核酸，加入硫酸铵室温搅拌，使得 蛋白暴露其疏水核心，再采用疏水柱进一步纯化蛋白，此时核酸被除去。为进 一步除去多聚体及其它杂蛋白，采用superdex200分子筛进一步对蛋白进行纯化， 最终获得高纯度构象统一的SARS-COV-2N蛋白。

本发明的试剂盒可更早期地通过临床检测SARS-CoV-2IgA抗体，及早筛查 处部分新冠肺炎患者。本试剂盒的检测结果诊断肺炎的敏感性和特异性分别达 到了99％、96％以上，是一种优良的检测试剂盒。

实施例3。

一种检测SARS-CoV-2IgA抗体的用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，尤 其用于在早期筛查SARS-CoV-2IgA抗体。

该用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，包含：

1.SARS-CoV-2磁珠包被物(R1)：含包被SARS-CoV-2重组抗原的磁珠包 被物三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH值为7.2，含有0.1％吐温20(v/v)、5％牛血 清白蛋白(w/v)、0.5％Proclin300(v/v)；磁珠作为反应固相载体，抗原用于结 合待测物中的目标抗体。

2.抗人IgA抗体吖啶酯标记物(R2)：为吖啶酯标记鼠抗人IgA单克隆抗体 的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液，含有0.1％吐温20(v/v)、5％牛血清白蛋白(w/v)、 0.5％Proclin300(v/v)。同抗原抗体复合物结合，在碱性条件下，吖啶酯被激发 后可发光。

3.反应缓冲液(R3)：含羊抗人IgG抗体的磷酸盐缓冲液，内含0.1％吐温20 (v/v)、5％牛血清白蛋白(w/v)、0.5％Proclin300(v/v)。用于吸附待测样本中 的IgG，以抗干扰。

4.SARS-CoV-2IgA阴性对照：为SARS-CoV-2IgA阴性血清。

5.SARS-CoV-2IgA阳性对照：为人源性纯化SARS-CoV-2IgM抗体。

6.阴阳性对照信息卡：含有阴阳性对照的发光值，用于筛选时的校正。

实验另需要底物液(含NaOH的水溶液)、清洗液(含表面活性剂的磷酸盐 缓冲液)为通用试剂，可不在本试剂盒提供。

通过临床研究，部分患者的SARS-CoV-2IgA比IgM抗体更早转为阳性，平 均早1-4天。因此，可更早期地通过临床检测SARS-CoV-2IgA抗体，及早筛查 处部分新冠肺炎患者。

实验发现，本试剂盒检测结果诊断肺炎的敏感性和特异性分别达到了99％、 96％以上，是一种优良的检测试剂盒。

实施例4。

以RBD蛋白作为磁珠包被抗原的试剂盒进行检测，对174位患者和202例 对照人群进行临床研究，得到新冠肺炎患者及对照组血清SARS-CoV-2IgA抗体 水平结果如图1所示。在图1中可以看出，新冠肺炎患者的IgA水平比对照组 显著升高。SARS-CoV-2IgA和IgM抗体随病程变化趋势如图2所示，在图2中 可以看出患者的SARS-CoV-2IgA比IgM抗体更早转为阳性，平均早2(1-4) 天。因此，患者就诊时临床检测SARS-CoV-2IgA抗体，可更早地诊断出部分新 冠肺炎患者。

本试剂盒检测结果诊断新冠肺炎的敏感性和特异性分别达到99.43％、 96.04％，是一种性能优良的检测试剂盒。

实施例5。

以N蛋白作为磁珠包被抗原的试剂盒进行检测，对100位新冠肺炎患者和 100例对照人群进行临床研究，检测结果显示SARS-CoV-2IgA在患者和对照组 中的阳性率分别是98.9％和4.2％，两组比较差别显著。

本试剂盒检测结果诊断新冠肺炎的敏感性和特异性分别达到98.9％、95.8％， 是一种性能优良的检测试剂盒。

实施例6。

采用实施例1至5任意一项所述的试剂盒，以化学发光免疫分析法检测10 例正常人血清、10例新冠肺炎患者血清。

1.在装机前，需要将磁珠包被物(R1)轻轻颠倒翻转约30次，使磁珠微粒 分散均匀。首次装载磁珠包被物(R1)后不需要继续混匀。

2.在仪器操作介面选取试剂位，扫描试剂架上的二维码，将试剂架放入试剂 仓中。

3.按样本稀释液说明书准备样本稀释液。

4.按清洗液说明书准备清洗液。

5.按全自动免疫检验系统用底物液说明书准备底物液A和底物液B。

6.将阴性对照和阳性对照放在样本架上并推入样本仓中，在“样本申请”界 面，分别设置样本类型为阴性对照和阳性对照，选取SARS-CoV-2IgA项目，阴 性对照和阳性对照应做2个复孔，确定后点击“运行”。

7.检测：将样本放入样本架上(样本量应大于300μL)，推入样本架，在操 作界面上编辑样本信息，选取SARS-CoV-2IgA项目，确定后点击“运行”。系 统将执行如下操作：

总孵育时间15分钟。

·将待测物(阴阳性对照、样本)传送至吸液点。

·将反应杯载入运行通道。

·分别吸取30μL待测物到反应杯。

·运送反应杯到试剂仓位，加入50μL试剂R1。

·震荡混合后，将反应杯运送至孵育仓，37℃孵育10分钟。

·将反应杯运送至洗涤通道，进行磁分离，用洗液清洗反应混合物，再重 复磁分离-清洗3次。

·再次运送反应杯到试剂仓位，加入50μL试剂R2。

·震荡混合后，将反应杯运送至孵育仓，37℃孵育5分钟。

·将反应杯运送至洗涤通道，进行磁分离，用洗液清洗反应混合物，再重 复磁分离-清洗3次。

·将反应杯运送至底物通道，加入100μL底物液A，震荡混合。

·将反应杯运送至检测通道，抓取反应杯至检测仓，加入100μL底物液B， 并立即检测发光信号，计算IgA的COI值。

·抓取反应杯到废料仓。

8.结果判定

当COI<0.8时，样本中的SARS-CoV-2IgA无反应性；

当0.8≤COI<1.0时，样本中的SARS-CoV-2IgA不确定；

当COI≥1.0时，样本中的SARS-CoV-2IgA有反应性。

化学发光免疫分析法的检验原理是：新型冠状病毒(SARS-CoV-2)IgA抗体检 测试剂盒(化学发光免疫分析法)采用两步间接法免疫检测。待测样本与磁珠 包被物一起孵育，经磁性分离洗涤未结合物质后，加入吖啶酯标记物一起孵育， 再次洗涤后，加入底物液，随后检测吖啶酯的发光反应。若样本中存在新型冠 状病毒IgA抗体，则可形成磁珠包被物-新型冠状病毒IgA抗体-吖啶酯标记物复 合物，吖啶酯的发光强度与新型冠状病毒IgA抗体的含量成正相关的关系，检 测结果以临界值指数(COI)表示。

本实施例的检测结果如表一所示。

表一

可见，本发明的试剂盒能够100％检测出新冠肺炎患者，检测结果准确， 灵敏度高。

实施例7。

一种用于筛查新型冠状病毒感染的试剂盒，含有，

测试卡：由SARS-CoV-2IgA测试条和塑料盒组成；测试条含有硝酸纤维素 膜、样品垫、结合垫、吸水纸、PVC板等支持物组成；硝酸纤维素膜包被有抗 人-IgA抗体和抗鼠IgG多克隆抗体，结合垫含有胶体金标记的SARS-CoV-2抗 原，抗原的获取方式可采用实施例2中的方式。

样本稀释液的Tris盐酸缓冲液：Tris盐酸缓冲液的pH值为7.1-7.4，内含 0.5-2％的牛血清白蛋白(w/v)、0.05-0.2％吐温20(v/v)、0.25-1％Proclin300 (v/v)。优选含有1％的牛血清白蛋白(w/v)、0.1％吐温20(v/v)、0.5％Proclin300 (v/v)。

胶体金法的检验原理是采用免疫层析技术原理，定性检测人血清、血浆、 全血中的SARS-CoV-2IgA，当样本中含有SARS-CoV-2IgA时与胶体金标记的 SARS-CoV-2抗原结合形成反应复合物，在层析作用下复合物沿着硝酸纤维膜向 前移动，分别被硝酸纤维素膜上检测区(T)预先包被的抗人-IgA抗体捕获，在 检测区(T)凝集形成一条肉眼可见的红色反应线，此时结果为阳性；当样本中 SARS-CoV-2IgA低于最低检测限时，则检测区(T)无红色反应线出现，此时 结果为阴性。

采用实施例1的试剂盒，以胶体金法检测10例正常人血清、10例新冠肺炎 患者血清。

1.检测前将待测样本、检测试剂及其他检测用材料等平衡至室温，检测应在 室温下进行。注：室温指温度为10℃～30℃，湿度为45％～75％。

2.旋开滴瓶滴头，用吸管吸取待测样本，滴加一滴待测样本到滴瓶中稀释(即 按1:10稀释)，旋紧滴头，上下摇摆，并混匀。

3.沿铝箔袋切口部位撕开，取出测试卡平放于台面上(注意：不要用手指触 摸测试条中间膜的表面)。

4.打开瓶盖，将混匀的样本滴加2～3滴于测试卡上。

5.15分钟观察两个测试条的显示结果，30分钟后显示结果无临床意义。

6.检验结果的解释

阳性：两条红色线，即在检测区(T)及质控区(C)各出现一条红色反应 线。

阴性：一条红色线，即仅在质控区(C)出现一条红色反应线。

无效：质控区(C)无红色线出现。

检测结果如表二所示。

表二

可见，本发明的试剂盒能够100％检测出新冠肺炎患者，检测结果准确，灵 敏度高。

实施例8。

本发明还提供一种检测SARS-CoV-2IgA抗体的试剂在制备上述用于筛查新 型冠状病毒感染试剂盒中的用途以及检测SARS-CoV-2IgA抗体的试剂在制备 用于筛查新型冠状病毒感染试剂中的用途。本发明可以检测新型冠状病毒，可 用于更早期补充诊断新冠肺炎，且具有检测结果精确的特点。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发 明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普 通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不 脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 广州市康润生物科技有限公司

<120> 新型冠状病毒更早期筛查方法

<130> GZZRH0504-20-1-805-2

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 813

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 60

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 120

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 180

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 240

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 300

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 360

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 420

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 480

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 540

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 600

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 660

ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 720

cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 780

acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tct 813

<210> 2

<211> 271

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

1 5 10 15

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

20 25 30

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

35 40 45

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

50 55 60

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

65 70 75 80

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

85 90 95

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

100 105 110

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

115 120 125

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

130 135 140

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

145 150 155 160

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

165 170 175

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

180 185 190

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

195 200 205

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

210 215 220

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

225 230 235 240

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

245 250 255

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser

260 265 270

<210> 3

<211> 1623

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcctcgc cctttgcttt actgatggtc ctggtggtgc tcagctgcaa gtcaagctgc 60

tctctgggcg tcgaccaacc aacagaatct attgttagat ttcctaatat tacaaacttg 120

tgcccttttg gtgaagtttt taacgccacc agatttgcat ctgtttatgc ttggaacagg 180

aagagaatca gcaactgtgt tgctgattat tctgtcctat ataattccgc atcattttcc 240

acttttaagt gttatggagt gtctcctact aaattaaatg atctctgctt tactaatgtc 300

tatgcagatt catttgtaat tagaggtgat gaagtcagac aaatcgctcc agggcaaact 360

ggaaagattg ctgattataa ttataaatta ccagatgatt ttacaggctg cgttatagct 420

tggaattcta acaatcttga ttctaaggtt ggtggtaatt ataattacct gtatagattg 480

tttaggaagt ctaatctcaa accttttgag agagatattt caactgaaat ctatcaggcc 540

ggtagcacac cttgtaatgg tgttgaaggt tttaattgtt actttccttt acaatcatat 600

ggtttccaac ccactaatgg tgttggttac caaccataca gagtagtagt actttctttt 660

gaacttctac atgcaccagc aactgtttgt ggacctaaaa agtctactaa tttggttaaa 720

aacaaatgtg tcaatttcaa cttcaatggt ttaacaggca caggtgttct tactgagtct 780

aacaaaaagt ttctgccttt ccaacaattt ggcagagaca ttgctgacac tactgatgct 840

gtccgtgatc cacagacact tgagattctt gacattacac catgttcttc tagaggttct 900

gagaatcttt atttccaagg ttctggttct cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 960

ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 1020

cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 1080

agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 1140

gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 1200

accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1260

gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1320

caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 1380

tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1440

ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1500

tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1560

gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1620

aaa 1623

<210> 4

<211> 541

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Ser Pro Phe Ala Leu Leu Met Val Leu Val Val Leu Ser Cys

1 5 10 15

Lys Ser Ser Cys Ser Leu Gly Val Asp Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val

20 25 30

Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn

35 40 45

Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser

50 55 60

Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser

65 70 75 80

Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys

85 90 95

Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val

100 105 110

Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr

115 120 125

Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn

130 135 140

Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu

145 150 155 160

Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu

165 170 175

Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn

180 185 190

Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val

195 200 205

Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His

210 215 220

Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys

225 230 235 240

Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val

245 250 255

Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg

260 265 270

Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu

275 280 285

Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Ser Arg Gly Ser Glu Asn Leu Tyr

290 295 300

Phe Gln Gly Ser Gly Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

305 310 315 320

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

325 330 335

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

340 345 350

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

355 360 365

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

370 375 380

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

385 390 395 400

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

405 410 415

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

420 425 430

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

435 440 445

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

450 455 460

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

465 470 475 480

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

485 490 495

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

500 505 510

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

515 520 525

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

530 535 540

<210> 5

<211> 1257

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgagcgata acggtccgca aaaccagcgt aacgcgccgc gtattacctt cggtggtccg 60

agcgatagca ccggtagcaa ccaaaacggc gaacgtagcg gtgcgcgtag caaacaacgt 120

cgtccgcaag gtctgccgaa caacaccgcg agctggttta ccgcgctgac ccagcacggt 180

aaagaagacc tgaagttccc gcgtggtcag ggcgtgccga ttaacaccaa cagcagcccg 240

gacgatcaaa ttggttatta ccgtcgtgcg acccgtcgta tccgtggcgg tgatggcaaa 300

atgaaagatc tgagcccgcg ttggtacttc tattacctgg gtaccggccc ggaagcgggt 360

ctgccgtacg gtgcgaacaa ggatggcatc atctgggttg cgaccgaagg tgcgctgaac 420

accccgaaag accacattgg tacccgtaac ccggcgaaca acgcggcgat tgttctgcag 480

ctgccgcaag gtaccaccct gccgaaaggt ttctatgcgg agggtagccg tggtggtagc 540

caagcgagca gccgtagcag cagccgtagc cgtaacagca gccgtaacag caccccgggt 600

agcagccgtg gtaccagccc ggcgcgtatg gcgggtaacg gtggcgatgc ggcgctggcg 660

ctgctgctgc tggatcgtct gaaccaactg gagagcaaga tgagcggcaa gggtcagcaa 720

caacagggtc aaaccgttac caaaaagagc gcggcggaag cgagcaagaa accgcgtcag 780

aaacgtaccg cgaccaaggc gtacaacgtg acccaggcgt ttggtcgtcg tggtccggaa 840

caaacccagg gcaactttgg tgaccaagaa ctgatccgtc aaggcaccga ctacaaacac 900

tggccgcaga tcgcgcaatt cgcgccgagc gcgagcgcgt tctttggtat gagccgtatt 960

ggtatggaag tgaccccgag cggtacctgg ctgacctaca ccggtgcgat caaactggac 1020

gataaggacc cgaacttcaa agaccaagtg atcctgctga acaagcacat cgacgcgtac 1080

aaaacctttc cgccgaccga gccgaagaaa gacaagaaga aaaaggcgga tgaaacccag 1140

gcgctgccgc aacgtcagaa aaagcaacag accgtgaccc tgctgccggc ggcggatctg 1200

gacgatttca gcaaacagct gcagcaaagc atgagcagcg cggatagcac ccaagcg 1257

<210> 6

<211> 419

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln

260 265 270

Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala

Claims (7)

1.检测新型冠状病毒SARS-CoV-2IgA抗体的试剂在制备用于作为早期筛选新型冠状病毒感染肺炎的检测试剂盒中的用途，检测所述SARS-CoV-2IgA抗体的SARS-CoV-2重组抗原是SARS-CoV-2刺突蛋白（简称S蛋白）RBD，该RBD蛋白截取的是SARS-CoV-2 S蛋白Gln321-Ser591位氨基酸序列；或者检测所述SARS-CoV-2IgA抗体的SARS-CoV-2重组抗原是SARS-CoV-2核衣壳蛋白（简称N蛋白）片段，该蛋白片段截取的是SARS-CoV-2 N蛋白Met1-Ala419位氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述试剂盒含有，

作为R1的SARS-CoV-2磁珠包被物：含包被SARS-CoV-2重组抗原的磁珠包被物三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH值为7.1-7.4；

作为R2的抗人IgA抗体吖啶酯标记物：为含有吖啶酯标记鼠抗人IgA单克隆抗体的2-（N-吗啉）乙磺酸缓冲液。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：

SARS-CoV-2重组抗原的蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2 S蛋白 RBD基因在C端通过一个TEV酶切位点序列连接人IgG1 Fc，然后将其克隆到哺乳动物表达载体pTT5并在翻译起始区加入了Kozak序列，然后转染到悬浮培养细胞HEK293F中，使用干扰素α-1作为信号肽使HEK293F细胞分泌RBD-TEV-Fc融合蛋白，再采用Protein A柱子和镍柱进行两次纯化；第一次纯化为采用Protein A柱子从培养基上清中获得RBD-TEV-Fc融合蛋白；第二次纯化为采用带有6His tag的TEV酶对融合蛋白进行酶切，将酶切产物依次流过Protein A柱子和镍柱，除去Fc、TEV酶以及第一次纯化时结合Protein A柱子的杂蛋白，最终在流穿中获得纯净的RBD蛋白；或者

SARS-CoV-2重组抗原的蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2 N蛋白的基因在N端连接6Histag并克隆到原核表达载体pET28a中，再转化到大肠杆菌细胞BL21中进行蛋白表达，然后取破碎细菌在细菌裂解液中加入0.5-2.0 M 氯化钠，降低蛋白与核酸非特异性结合，再将裂解液过镍柱，洗脱后加入终浓度为0.25-1.0 M的硫酸铵室温搅拌10-20 min，使得蛋白暴露其疏水核心，再采用疏水柱进一步纯化蛋白，然后采用superdex-200分子筛除去多聚体及其它杂蛋白，最终获得高纯度构象统一的N蛋白片段。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述三羟甲基氨基甲烷缓冲液内含0.05-0.2%吐温20（v/v）、2-8%牛血清白蛋白（w/v）、0.25-1% Proclin300（v/v）；

2-（N-吗啉）乙磺酸缓冲液含有0.05-0.2%吐温20（v/v）、2-8%牛血清白蛋白（w/v）、0.25-1% Proclin300（v/v）。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述试剂盒还含有：

作为R3的反应缓冲液：含羊抗人IgG抗体的磷酸盐缓冲液，内含0.05-0.2%吐温20（v/v）、2-8%牛血清白蛋白（w/v）、0.25-1% Proclin300（v/v）；

SARS-CoV-2 IgA阴性对照：为SARS-CoV-2 IgA阴性血清；

SARS-CoV-2 IgA阳性对照：为人源性纯化SARS-CoV-2 IgM抗体；

阴阳性对照信息卡：含有阴阳性对照的发光值，用于筛选时的校正。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述试剂盒含有测试卡，测试卡由SARS-CoV-2 IgA测试条和塑料盒组成；

测试条含有硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫、吸水纸和PVC板支持物组成；

硝酸纤维素膜包被有抗人-IgA抗体，结合垫含有胶体金标记的SARS-CoV-2抗原。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述试剂盒还含有作为样本稀释液的Tris盐酸缓冲液，Tris盐酸缓冲液的pH值为7.1—7.4，内含0.5-2％的牛血清白蛋白（w/v）、0.05-0.2%吐温20（v/v）、0.25-1% Proclin300（v/v）。

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