CN112961239B

CN112961239B - Tim抑制剂及其应用

Info

Publication number: CN112961239B
Application number: CN202110208575.2A
Authority: CN
Inventors: 赵健; 郎小玲; 耿树生
Original assignee: Beijing Zhaoderivative Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Zhaoderivative Technology Co ltd
Priority date: 2021-02-24
Filing date: 2021-02-24
Publication date: 2021-09-10
Anticipated expiration: 2041-02-24
Also published as: CN112961239A

Abstract

本发明公开了一种TIM‑3抑制剂，该TIM‑3抑制剂是针对TIM‑3的单克隆抗体，其中重链的可变结构域包含SEQ ID NO:1中给出的CDR‑H1的序列、SEQID NO:2中给出的CDR‑H2的序列和SEQ ID NO:3中给出的CDR‑H 3的序列，并且轻链的可变结构域包含SEQ ID NO:4中给出的CDR‑L1的序列、SEQ IDNO:5中给出的CDR‑L2的序列和SEQ ID NO:6中给出的CDR‑L3的序列。本发明还扩展至该抑制剂的治疗性用途、组合物和用于检测TIM‑3的方法。

Description

TIM抑制剂及其应用

技术领域

本发明属于分子免疫学领域，涉及一种TIM抑制剂及其应用。

背景技术

2001年，McIntire等研究发现了一个新的基因家族，结构上含有免疫球蛋白V区和粘蛋白区，因此命名为T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子(T cell immunoglobulin-andmucin-domain-containing molecules，Tim)家族。Tim蛋白特定地表达于Th1或Th2细胞上，是新的区分Th1和Th2的重要标志，在T细胞分化、T细胞效应功能以及自身免疫病、变态反应、哮喘等疾病中发挥重要作用。

人的Tim基因家族定位在染色体5q33.2上，包括3个基因，Tim-1、Tim-3、Tim-4。Tim-3基因编码含有281个氨基酸的I型膜蛋白，Tim-3蛋白特异性表达于活化的Th1、Th17效应细胞表面，而不表达于Th2。细胞Tim-3蛋白通过与Tim-3配体相互作用调节Th1的免疫应答。Gal-9是Tim-3的天然配体，Gal-9/Tim-3信号通路通过诱导T细胞凋亡在免疫耐受的诱导及自身免疫病防治中发挥重要作用。

Tim-3参与炎症发生发展过程，并通过调节巨噬细胞的活化及功能，抑制组织破坏性免疫应答，而在自身免疫性疾病中发挥重要的调节作用。研究发现，实验性自身免疫性脑脊髓炎是Th1细胞介导的一种自身免疫性中枢神经系统疾病，PCR检测发现脑组织和淋巴结中Tim-3表达上调，阻断Tim-3信号通路后，中枢神经系统中浸润的中性粒细胞和单核细胞明显增加。非肥胖症糖尿病是一种自身免疫性疾病，构建非肥胖症糖尿病小鼠模型，使用Tim-3单克隆处理加速了小鼠非肥胖症糖尿病发生，可能机制为：Tim-3与Tim-3L结合，对Th1细胞产生抑制性信号，发挥免疫调节功能，从而降低炎症，降低自身免疫应答；阻断了Tim-3信号通路后促进了自身免疫应答，加速了炎症。

在一些自身免疫病如系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘等疾病中，由于Tim-3表达的升高，导致Th1细胞的功能受到抑制，进而打破体内的免疫平衡，引起病理性的Th2细胞的活性增强，导致疾病的发病。在这种情况下，任何阻断Tim-3信号通路的方法均能有利于体内免疫平衡的恢复，缓解疾病的进程。例如给哮喘模型动物注射抗Tim-3抗体或重组Tim-3融合蛋白均能通过阻断Tim-3与其配体的结合，增强Th1细胞活性，纠正由Th2细胞介导的哮喘症状，恢复体内Th1/Th2细胞平衡。

上述研究资料表明，Tim-3通路具有重要的免疫调节功能，Tim-3表达的异常与多种疾病的发生、发展有密切关系。但目前国内外均无TIM-3靶点的药物获批上市。医药魔方全球新药数据库显示全球共有13种TIM-3抗体的在研项目，研发进展最快的是TESARO的TSR-022，目前处于II期临床，礼来、诺华、罗氏均在此靶点有所布局，而我国在此方面研究要落后于国外，因此我们亟需建立和发展具有自主知识产权的抗TIM-3抗体及其相关的检测产品，以提高我国抗体药物的国际地位。

发明内容

本发明提供了一种TIM-3抑制剂，所述TIM-3抑制剂是TIM-3的特异性抗体。在本发明的具体实施方案中，所述TIM-3抑制剂是TIM-3特异性单克隆抗体。所述TIM-3抑制剂能够增强PD-1抗体促INF-γ分泌的效果。

本发明的TIM-3抑制剂包括：

(1)SEQ ID NO:1所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2、SEQ ID NO:3所示的重链CDR3；和/或

(2)SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2、SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。

作为本发明的一个方面，本发明的TIM-3抑制剂包括：

(1)重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；和/或

(2)轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

作为本发明的一个方面，本发明的TIM-3抑制剂包括：

(1)重链，所述重链具有SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；和/或

(2)轻链，所述轻链具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。

为了方便解释以下抑制剂的功能变体，将上面所述的TIM-3抑制剂称之为亲代抑制剂。

本发明的TIM-3抑制剂可以是完整的免疫球蛋白分子，免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)类(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类。

本发明的TIM-3抑制剂还可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab片段，Fab'片段，Fab'-SH片段，F(ab')²片段，Fd片段，Fv片段，双抗体，单链Fv(scFv)，仅含有一个轻链可变区的单链多肽，含有轻链可变区的三个CDR的单链多肽，仅含有一个重链可变区的单链多肽，含有一个重链可变区的三个CDR的单链多肽，重链可变区和VHH。

本发明的TIM-3抑制剂还包括前面所述的TIM-3抑制剂的功能变体，所述的功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似、但是含有例如在亲代抑制剂中未发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这种修饰包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。换句话说，亲代抑制剂的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述抑制剂的结合特性，即所述抑制剂仍能识别并结合其靶位。

所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然氨基酸。

保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族己经在本领域中限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半肤氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸残基家族分类方式。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性的指导。

此外，功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代抑制剂相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合TIM-3。此后，当使用术语“抑制剂”时，其也涵盖所述抑制剂的功能变体。

所述功能变体还包含对高变区的修饰，高变区包含来自CDR的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。在本发明范围内的功能变体与本文所述亲代抑制剂具有至少大约50％至大约99％、优选至少大约60％至大约99％、更优选至少大约70％至大约99％、甚至更优选至少大约80％至大约99％、最优选至少大约90％至大约99％、特别是至少大约95％至大约99％，以及特别是至少大约97％至大约99％的氨基酸序列同源性。

本领域技术人员已知的计算机算法如Gap或者Bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域己知的普通分子生物学方法改变亲代抑制剂或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错PCR、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。

本发明提供了编码前面所述的TIM-3抑制剂的核酸分子。编码重链CDR1的核酸分子序列如SEQ ID NO:9所示，编码重链CDR2的核酸分子序列如SEQ ID NO:10所示，编码重链CDR3的核酸分子序列如SEQ ID NO:11所示，编码重链可变区的核酸分子序列如SEQ ID NO:12所示，编码重链的核酸分子序列如SEQ ID NO:19所示；编码轻链CDR1的核酸分子序列如SEQ ID NO:13所示，编码轻链CDR2的核酸分子序列如SEQ ID NO:14所示，编码轻链CDR3的核酸分子序列如SEQ ID NO:15所示，编码轻链可变区的核酸分子序列如SEQ ID NO:16所示，编码轻链的核酸分子序列如SEQ ID NO:20所示。

所述的核酸分子还可以包含在严格条件下与编码包含重链或轻链序列的抗体的核酸分子杂交的核苷酸序列。

本领域技术人员将意识到这些核酸分子的功能变体也是本发明的一部分。功能变体是这样的核酸序列，通过使用标准遗传密码可以将其直接翻译以提供与从亲代核酸分子中翻译的序列相同的氨基酸序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的抑制剂(或其片段，或其衍生物)的核酸序列。然后可将该核酸序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的抑制剂的序列中。

本发明还提供了一种包括前面所述的核酸分子的重组载体，除了前面所述的核酸分子之外，重组载体还包括与所述核酸分子序列操作性相连的调控序列。

在本发明的具体实施例中，重组载体是将前面所述的核酸分子插入ZY-CDMO载体中构建而成。

具体的，本发明的重组载体的构建方法如下所示：

通过常规PCR在抗体轻链的5’端引入EcoRI酶切位点，在3’端引入XbaI酶切位点，插入到ZY-CDMO载体的EcoRI和XbaI之间；在抗体重链的5’端引入HindIII酶切位点，在3’端引入PmeI酶切位点，插入到ZY-CDMO载体的HindIII和PmeI之间，构建获得重组载体。

这些重组载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达核酸分子或者蛋白质。

所述载体包括克隆载体或者表达载体。克隆载体用于扩增核酸分子，表达载体用于表达核酸分子编码的蛋白质。

本发明还提供了一种含有前面所述的核酸分子或前面所述的载体的重组细胞。

重组细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞：真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO,COS,293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明提供了一种包括治疗有效量的前面所述的TIM-3抑制剂的药物组合物。

进一步，所述药物组合物还可包括治疗有效量的以下抗体中的至少一种：抗T细胞膜上的负性免疫调节分子的抗体或其抗原结合片段、抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。

T细胞膜上的负性免疫调节分子包括CD25、Foxp3、CTLA-4、GITR。

在本发明的具体实施例中，抗PD-1抗体是nivolumab。

更进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的抑制剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。

可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。

本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。

可以和本发明的药物组合物联合应用的药物包括抗肿瘤药，所述的抗肿瘤药物包括目前经过FDA批准的所有抗肿瘤药。所述的抗肿瘤药包括经FDA批准的药物或未批准的药物。所述的抗肿瘤药包括已知靶向抗肿瘤药与未知靶向抗肿瘤药。所述的抗肿瘤药还包括任意的化疗药或化合物。

靶向抗肿瘤药包括(但不限于)17-AAG、2-deoxyglucose、阿比特龙(Abiraterone)、ABT-263、AC-220、AT-406、AZD4547、AZD5363、AZD7762、BI-2536、Birinapant、BMS-754807、硼替佐米(Bortezomib)、BX-795、卡博替尼(Cabozantinib)、CAL-101、卡非佐米(Carfilzomib)、克唑替尼(crizotinib)、danusertib、达沙替尼(Dasatinib)、Dovitinib、Elesclomol、Embelin、恩替诺特(Entinostat)(MS-275)、Enzastaurin、依维莫司(Everolimus)、Foretinib、氟维司群(Fulvestrant)、Ganetespib、GDC0941、GSK429286A、JQ1、KU-55933、KX2-391、Lenvatinib、Linifanib、Linsitinib、LY2157299、Masitinib、MK-1775、MK-2206、MLN-4924、Neratinib、NU7441、Nutlin-3、NVP-BEZ235、NVP-BKM120、Orantinib、PCI-32765、PD-0325901、PD-0332991、PD-173074、PH-797804、PRT062607、R-406、Refametinib、瑞戈非尼(Regorafenib)、SCH900776、sgi-1776、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、TAE684、替西莫司(Temsirolimus)、TG-101348、Tideglusib、Tipifarnib、Tivantinib、Toremifene、Tozasertib、曲美替尼(Trametinib)、维甲酸(Tretinoin)、Triptolide、伐地考昔(Valdecoxib)、维莫德吉(Vismodegib)、Volasertib、伏立诺他(Vorinostat)、YM-155、CHIR-99021、NVP-BGJ398、LY2090314。

所述的化疗药包括(但不限于)六甲蜜胺、氨鲁米特、阿那罗唑、阿扎胞苷、苯达莫司汀、白消安、卡巴他赛、卡培他滨、卡铂、顺铂、克拉曲滨、氯法拉宾、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、柔红霉素、地西他滨、多西他赛、多柔比星、表柔比星、依托泊甙、伊西美坦、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、依达比星、异环磷酰胺、伊立替康、来那度胺、来曲唑、亚叶酸、洛莫司丁、6-巯基嘌呤、美司钠、甲胺喋呤、米托坦、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、奈拉滨、培美曲塞、喷司他汀、普拉曲沙、甲苄肼、雷替曲噻、链脲霉素、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、长春花碱、长春瑞滨、唑来膦酸。

本发明还提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含本文所述至少一个抑制剂以及进一步包含至少一个标记物可检测的部分/物质。可检测的部分/物质包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。

为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记抑制剂的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术、激光扫描细胞计量术检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、生物测定(例如吞噬作用测定)、蛋白质印迹应用等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。

除了通过直接或间接(例如通过接头)缀合而化学产生免疫缀合物之外，所述免疫缀合物可以作为融合蛋白而产生，所述融合蛋白包含本发明的抑制剂及合适的标记。融合蛋白可以通过本领域已知方法产生，例如通过构建核酸分子以及随后表达所述核酸分子而重组产生，所述核酸分子包含符合读框的编码抑制剂的核苷酸序列以及编码合适标记的核苷酸序列。

本发明还提供了一种测定样品中TIM-3的检测产品，所述产品包括前面所述的TIM-3抑制剂。

进一步，所述产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述抑制剂的能够检测出TIM-3的检测产品均包括在本发明的范围之内。

本发明的TIM-3抑制剂，又可以叫做TIM-3抗体，可以通过多种技术中的任一种制备。通常，抗体可以通过细胞培养技术产生，包括通过常规技术产生单克隆抗体，或通过将抗体基因，重链和/或轻链转染到合适的细菌或哺乳动物细胞宿主中，以允许抗体的产生，其中所述抗体可以是重组的。术语“转染”的各种形式意在包括通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的各种技术，例如电穿孔，磷酸钙沉淀，DEAE-葡聚糖转染等。尽管可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是优选在真核细胞中表达抗体，并且最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为这种真核细胞(特别是哺乳动物细胞)更可能比原核细胞组装和分泌正确折叠和免疫活性的抗体。

用于表达重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞，本发明包括与DHFR选择标记一起使用的中国仓鼠卵巢(CHO细胞)，NS0骨髓瘤细胞，COS细胞，HEK 293T细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达的一段时间，或更优选地，将抗体分泌至培养宿主细胞的培养基。可以使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收抗体。

宿主细胞也可用于产生功能性抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。应当理解，上述程序的变化在本发明的范围内。例如，可能期望用编码本发明抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用于除去一些或所有编码轻链和重链之一或两者的DNA，其不是结合感兴趣的抗原所必需的。从这种截短的DNA分子表达的分子也包括在本发明的抗体中。此外，可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体(即，结合人TIM-3)，并且另一条重链和轻链对于除人TIM-3之外的抗原是特异性的。

制备单克隆抗体的方法涉及永生细胞的制备，能够产生具有所需特异性的抗体的细胞系。这样的细胞系可以从获自免疫动物的脾细胞产生。可以用免疫动物生产前面所述的抑制剂或其片段和/或变体。

可以从生长的杂交瘤的上清液中分离单克隆抗体。此外，可以采用各种技术来提高产量，例如将杂交瘤细胞系注射到合适的脊椎动物宿主(例如小鼠)的腹膜腔中。然后可以从腹水液体或血液收获单克隆抗体。污染物可以通过常规技术例如色谱，凝胶过滤，沉淀和提取从抗体中除去。亲和层析是可用于纯化抗体的方法的实例。

本发明提供了一种阻断TIM-3与TIM-3配体结合的方法，所述方法包括施用前面所述的TIM-3抑制剂，或者施用包括前面所述TIM-3抑制剂的药物组合物，或者施用前面所述的包括编码所述TIM-3抑制剂的核酸分子以及包括所述核酸分子的载体。

本发明提供了一种调节TIM-3活性或水平的方法，所述方法包括施用前面所述的TIM-3抑制剂，或者施用包括前面所述TIM-3抑制剂的药物组合物，或者施用前面所述的包括编码所述TIM-3抑制剂的核酸分子以及包括所述核酸分子的载体。

本发明提供了一种解除PD-1对机体免疫抑制的方法，所述方法包括施用前面所述的TIM-3抑制剂，或者施用包括前面所述TIM-3抑制剂的药物组合物，或者施用前面所述的包括编码所述TIM-3抑制剂的核酸分子以及包括所述核酸分子的载体或者细胞。

本发明提供了一种促进T淋巴细胞中IFN-γ表达的方法，所述方法包括施用前面所述的TIM-3抑制剂，或者施用包括前面所述TIM-3抑制剂的药物组合物，或者施用前面所述的包括编码所述TIM-3抑制剂的核酸分子以及包括所述核酸分子的载体。

本发明提供了一种治疗患有免疫障碍受试者的方法。所述方法包括向所述受试者施用所述TIM-3抑制剂，或者施用包括所述TIM-3抑制剂的药物组合物，或者施用包括编码所述TIM-3抑制剂的核酸分子以及包括所述核酸分子的载体或者细胞。

本发明还提供了一种检测或测量样品中的TIM-3的方法。该方法包括使样品与所述TIM-3抑制剂接触。

本发明还提供了前面所述的TIM-3抑制剂在制备测定TIM-3的产品中的应用。

所述产品包括前面所述的TIM-3抑制剂；所述产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述的TIM-3抑制剂能够检测出TIM-3的产品均包括在本发明的范围之内。

本发明还提供了前面所述的TIM-3抑制剂在制备前面所述的药物组合物中的应用。

本发明还提供了前面所述的TIM-3抑制剂在制备治疗以下药物中的应用。

(1)阻断TIM-3与TIM-3的配体结合的药物；

(2)调节TIM-3活性或水平的药物；

(3)解除PD-1对机体免疫抑制的药物；

(4)激活T细胞的药物；

(5)促进T淋巴细胞中IFN-γ表达的药物；

(6)逆转抗PD-1免疫治疗获得性耐药的药物；

(7)增强抗肿瘤免疫反应的药物；

(8)逆转机体外周耐受的药物；

(9)抗肿瘤药物；

(10)治疗免疫障碍的药物。

本发明还提供了前面所述的药物组合物在制备治疗以下药物中的应用：

(1)激活T细胞的药物；

(2)促进T淋巴细胞中IFN-γ表达的药物；

(3)解除PD-1对机体免疫抑制的药物；

(4)逆转抗PD-1免疫治疗获得性耐药的药物；

(5)增强抗肿瘤免疫反应的药物；

(6)逆转机体外周耐受的药物；

(7)抗肿瘤药物；

(8)治疗免疫障碍的药物。

本发明的免疫障碍的非限定性实例包括但不限于，类风湿性关节炎、多发性硬化、炎性肠病、克罗恩病、全身性红斑狼疮、I型糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、过度增生性免疫障碍、肿瘤和感染性疾病。

可以用于治疗的肿瘤种类没有特别限制，任何实体的、非实体的、恶性的或良性的肿瘤均包括在本发明的范围之内。肿瘤的实例包括但不限于：皮肤癌，白血病，肾上腺皮质癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌，脑癌，乳腺癌，气管及支气管肿瘤，淋巴瘤，神经系统肿瘤，宫颈癌，肠癌，肛门癌，子宫内膜癌、食管癌，鼻咽癌，卵巢癌，肉瘤，眼癌，恶性纤维组织细胞癌，胆囊癌，胃癌，结直肠癌、胃肠道类癌瘤，胃肠道间质瘤，胚细胞瘤，头颈癌，肝癌，下咽癌，黑色素瘤，胰腺癌，肾癌，喉癌，唇癌，口腔癌，口咽癌，肺癌，间皮瘤，骨髓瘤，甲状旁腺癌，阴茎癌，嗜络细胞瘤，垂体瘤，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，涎腺癌，皮肤癌，睾丸癌，喉癌，胸腺瘤，甲状腺癌，尿道癌，阴道癌，外阴癌。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。如有冲突，本文件(包括定义)将予以控制。优选的方法和材料如下所述，尽管与本文所述相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试。本文提及的所有出版物，专利申请，专利和其它参考文献通过引用以其全文并入本文。本文公开的材料，方法和实施例仅是说明性的，而不是限制性的。

本文所用的术语“单克隆抗体”指从一类基本均一的群体获得的抗体，除少数可能存在的天然发生的突变外，该群体中包含的单个抗体是相同的。修饰语“单克隆”仅表示抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不能解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

本文所用的术语“施用”是指接触和/或递送TIM-3抑制剂以获得期望的效果。TIM-3抑制剂可以以多种方式施用于受试者，包括但不限于口服，眼部，鼻部，静脉内，局部，气溶胶，栓剂等，并且可以组合使用。

本文使用的术语“有效量”是指在所需时间内有效的药物剂量，以实现所需的剂量治疗结果。有效剂量可以由本领域技术人员确定，并且可以根据个体的疾病状态，年龄，性别和体重等因素而变化药物在个体中引起所需反应的能力。本文使用的该术语还指在动物，哺乳动物，哺乳动物，或人类，例如减少和/或抑制雌激素受体的功能。治疗有效量可以一次或多次施用(例如，药剂可作为预防性治疗或在疾病进展的任何阶段治疗性地，在症状之前或之后等)，应用或剂量给予，并且不是预期的限于特定的制剂，组合或施用途径。给药次数和剂量取决于几个因素，例如治疗的目标，受试者等，并且可以由本领域技术人员容易地确定。

本发明的“样品”可以是血液，组织，尿液，血清，血浆，羊水，脑脊液，胎盘细胞或组织，内皮细胞，白细胞或单核细胞的样品。样品可以直接从患者获得或可以预处理，例如通过过滤，蒸馏，提取，浓缩，离心，干扰组分的灭活，添加试剂等，以修饰样品。

可以使用任何细胞类型，组织或体液来获得样品。这样的细胞类型，组织和流体可以包括组织切片，例如活组织检查和尸检样本，为组织学目的取得的冷冻切片，血液(例如全血)，血浆，血清，痰，粪便，眼泪，粘液，唾液，支气管肺泡灌洗液BAL)流体，毛发，皮肤，红细胞，血小板，间质液，眼晶状体液，脑脊髓液，汗液，鼻液，滑液，月经，羊水，精液等。细胞类型和组织也可包括淋巴流体，胃肠液，妇科液，尿，腹膜液，脑脊液，通过阴道冲洗收集的液体或通过阴道冲洗收集的液体。组织或细胞类型可以通过从动物中除去细胞样品来提供，但也可以通过使用先前分离的细胞(例如，由另一个人分离，在另一时间和/或为了另一个目的)来实现。也可以使用存档组织，例如具有治疗或结果历史的那些。蛋白质或核苷酸分离和/或纯化可能不是必需的。

本文所用的“受试者”和“患者”可互换地指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如牛，猪，骆驼，骆驼，马，山羊，兔，绵羊，仓鼠，豚鼠，猫，狗，大鼠和小鼠，非人灵长类动物，猴，例如食蟹猴或恒河猴，黑猩猩等)和人)。在一些实施方案中，受试者可以是人或非人。受试者或患者可以经历其他形式的治疗。

本文所用的“治疗”描述逆转，减轻或抑制该术语适用的疾病或该疾病的一种或多种症状的进展。根据受试者的状况，该术语还指预防疾病，并且包括预防疾病的发作或预防与疾病相关的症状。治疗可以以急性或慢性方式进行。该术语还指在患有疾病之前降低与该疾病相关的疾病或症状的严重性。在疾病之前这种疾病的预防或减轻的严重程度是指将本发明的抗体或药物组合物施用给不是在施用疾病的施用时间的受试者。

附图说明

图1显示ZY-CDMO载体的物理图谱；

图2显示利用ELISA检测抗体亲和活性的结果图；

图3显示利用ELISA检测抗体对T细胞分泌IFN-γ的影响的统计图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1抗TIM-3抗体表达载体的构建

前期经过噬菌体抗体库筛选获得与TIM抗原结合力较强的几个抗体，本申请研究的是其中一个抗体，编号为67#。

(1)利用基因合成的方法合成抗体重链序列(其中，67#抗体的重链核酸序列如SEQID NO:19所示)、轻链序列(其中，67#抗体轻链核酸序列如SEQ ID NO:20所示)，并将其利用分子克隆的方法将片段克隆入ZY-CDMO载体中，ZY-CDMO载体图谱如图1所示。

具体操作如下：通过常规PCR在轻链的5’端引入EcoRI酶切位点，在3’端引入XbaI酶切位点，插入到ZY-CDMO载体的EcoRI和XbaI之间；在重链的5’端引入HindIII酶切位点，在3’端引入PmeI酶切位点，插入到ZY-CDMO载体的HindIII和PmeI之间，构建获得真核表达载体。

实施例2抗TIM-3抗体的表达与纯化

于125ml细胞培养摇瓶中接种30ml密度0.5×10⁶cells/ml的CHO细胞，当细胞密度生长至2×10⁶cells/ml以上，细胞活率95％以上，细胞以1×10⁷cells/ml密度接种于电转缓冲液，将40μg质粒加入电击杯中，再加入0.7ml细胞悬液，最后补入电转缓冲液至0.8ml，轻轻混匀，不要产生气泡。在300V，900μF的条件下电击一次，将电击杯置于冰盒中冰浴5min，稀释到6ml培养基中在37℃CO₂培养箱中恢复48h，向种子培养基中加入75μM MSX接种96孔板并进行克隆筛选，通过有限稀释方法分单克隆细胞至96孔板内，37℃，5％CO₂培养箱培养，待细胞扩增至一定数量，进行ELISA验证，挑选阳性克隆依次放大到24孔板、6孔板、T25方瓶。经过6～8周的培养及筛选，获得能够高效表达抗TIM-3抗体的单克隆细胞株。

单克隆细胞株经过筛选培养基多步扩大培养，接种密度为0.5×10⁶cells/ml，持续2周后，离心收集细胞于125ml摇瓶中，于37℃、5％CO₂、转速125rpm的摇床中进行FedBatch培养12天，期间在第3、5、7、9天分别补加初始体积的10％补料培养基，并维持葡萄糖浓度3g/L-5g/L，培养结束后收获上清，将上清进行纯化。采用AKTA(GE公司)进行TIM-3抗体的分离纯化。首先收集过Protein A亲和层析柱(MabSelect SuRe)pH在3.4-3.6范围(用280nm进行监测)的洗脱液，调pH值至8.0，上样到阴离子交换层析柱(Q-Sepharose FF)，280nm进行监控和收集样品。将收集液pH值调节至5.5，上样到阳离子交换层析(Poros)收集样品，超滤浓缩后获得抗TIM-3的抗体。

实施例3抗TIM-3的抗体对TIM-3抗原的亲和活性检测

利用ELISA检测亲和力，具体步骤如下：

包被：取ELISA平板用pH9.6包被液稀释靶蛋白人TIM-3(Sino Biological，10390-H08H)至0.5μg/ml，100μl/孔在湿盒中4℃包被过夜。

弃去孔中液体，并倒置平板在纸巾上拍干残留液体，加入洗涤液(0.1％PBST)300μl/孔洗3次。

封闭：加入封阻液(2％M-PBS)300μl/孔37℃静置1.0h。

加入一抗：用DPBS将抗TIM-3抗体(37#、67#、75#)稀释成1mg/ml，再依次进行10倍稀释，共7个浓度梯度，将稀释后的样品加入对应孔中，100μl/孔，37℃静置1.0h。

同时加入DPBS作为阴性对照。稀释方式如下：

羊抗人-HRP二抗：用DPBS按1:3000稀释，100μl/孔，37℃静置1.0h。

显色：TMB显色，100μl/孔，室温显色10min。

终止：2N H₂SO₄ 100μl/孔，酶标仪测OD450nm。

结果：

结果如图2所示，本发明抗TIM-3抗体的EC50为0.02557μg/ml。

实施例4抗TIM抗体与TIM-3抗原的亲和动力学

使用表面等离子体共振生物传感器来测量抗体与TIM-3抗原的结合动力学和亲合力。除非另有说明，可以从GE公司购买所有试剂和材料，并且可以在25℃下进行测量。亲和力分析通过SPR(Biacore T200)仪器上进行分析，通过氨基偶联的方式在CM5芯片偶联抗人IgG Fc的抗体，将待测抗体在以30μL/min的流速流入，用偶联于芯片上的抗人IgG Fc的抗体捕获待测抗体；分析物(TIM-3)梯度稀释后(100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.13nM和0nM)，以流速30μL/min的流速流入，待测抗体与分析物结合时间120s，解离时间1200s；整个实验用HBS-EP作为运行缓冲液，芯片用10mM甘氨酸HCl、pH 2.1溶液60秒脉冲进行再生。测定数据拟合成1:1结合模型，来测定平衡解离常数KD。

结果：平衡解离常数KD为1.35×10^-9M。

实施例5抗TIM-3抗体对免疫细胞分泌INF-γ的影响

用人的淋巴细胞分离液从300mL新鲜血液的血细胞中分离人外周血单核细胞(PBMC)，用单核细胞磁珠分选试剂盒(美天旎公司，货号130-117-337)从PBMC中分离单核细胞。将分离得到的单核细胞以2.5×10^4/孔种于96孔板，培养基为10％血清、250U/mL humanGM-CSF和500U/mL human IL-4的1640培养基中，每三天更换一次培养基，培养七天，在第七天单核细胞分化为了树突状细胞(DC细胞)。

同时在第七天从另一份新鲜血液的PBMC中用CD4+T细胞磁珠分选(抗生物素磁珠(美天旎公司货号:130-091-153)及MS分选柱(美天旎公司货号:130-042-201))分离CD4+T细胞。将2×10⁵/孔的CD4+T细胞与树突状细胞按照5：1的比例充分混匀，并接种至96孔细胞培养板中，同时分别加入10μg/mL抗TIM-3抗体及0μg/mL、2μg/mL nivolumab抗体，培养五天后，收集上清，用IFN-γ检测试剂盒(购自BioLegend公司，货号430104)检测上清中IFN-γ的表达。

PBMC的分离步骤如下：

(1)从抽取300mL新鲜血液(加入肝素抗凝)，加入等体积的生理盐水稀释。

(2)向15mL离心管中加入5mL的人外周血淋巴细胞分离液，然后将稀释好的血液缓慢加到淋巴细胞分离液上层，2000rpm离心20min。

(3)离心后用吸管将白膜层吸出至加有10mL生理盐水的试管中，1500rpm离心10min，重复两次。

(4)显微镜下计数，并进行下一步实验。

单核细胞的磁珠分选步骤如下：

(1)每10⁷个PBMC细胞加入30μL分选Buffer重悬，加入10μL FcR BlockingReagent和10μL Biotin-Antibody Cocktail充分混匀，冰上避光孵育10min。

(2)每10⁷个PBMC细胞加入30μL分选Buffer和20μL Anti-Biotin MicroBeads充分混匀，冰上避光孵育15min。

(3)加入2mL/10⁷个细胞的分选Buffer，300g离心10min。

(4)加入500μL/10⁸个细胞的分选Buffer重悬细胞，准备好分离珠，放到磁极上，用300mL分选Buffer清洗分离柱。把细胞悬液加入柱子中。

(5)收集留下来的细胞液体，用3mL分选Buffer洗柱子两次。

CD4+T细胞的磁珠分选步骤如下：

(1)每10⁷个PBMC细胞加入40μL分选Buffer重悬，加入10μL CD4+T Cell Biotin-Antibody Cocktail，冰上孵育5min。

(2)每10⁷个PBMC细胞加入30μL分选Buffer和20μL CD4+T Cell MicroBeadCocktail充分混匀，冰上避光孵育10min。

(3)准备好分离珠，放到磁极上，用300mL分选Buffer清洗分离柱。把细胞悬液加入柱子中。

(4)收集流下来的细胞液体，用3mL分选Buffer洗柱子三次。

IFN-γ的ELISA检测步骤如下：

(1)每孔加入100μL稀释好的Capture Antibody，密封ELISA板子，4℃孵育过夜。

(2)洗板机洗板4次，每孔加入200μL的1×Assay Diluent A，密封ELISA板子，在摇床上室温孵育1h。

(3)洗板机洗板4次，每孔加入100μL稀释好的标准品和检测样品，密封ELISA板子，在摇床上室温孵育2h。

(4)洗板机洗板4次，每孔加入100μL稀释好的Detection Antibody，密封ELISA板子，在摇床上室温孵育1h。

(5)洗板机洗板4次，每孔加入100μL稀释好的Avidin-HRP，密封ELISA板子，在摇床上室温孵育30min。

(6)洗板机洗板5次，每孔加入100μL混合好的TMB显色液，避光孵育20min。

(7)每孔加入100μL Stop Solution，放在酶标板上450nm处读取ELISA板吸光度值。

结果

结果如图3所示，以人IgG作为阴性对照组，抗TIM-3抗体可显著增强CD4+T细胞分泌IFN-γ的能力，而且，抗TIM-3抗体与nivolumab协同作用的效果优于单独使用抗TIM-3抗体和nivolumab的效果之和。本结果说明本发明的抗体能够和PD-1抗体大幅度协同激活T细胞显著分泌INF-γ。

虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京昭衍生物技术有限公司

<120> TIM抑制剂及其应用

<141> 2021-02-24

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Gly Ser Phe Ser Arg Gly Gly Tyr Tyr

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Arg Asp His Tyr Ser Ser Ser Tyr Asn Tyr Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Ser Val Gln Ser Tyr Ile

1 5

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asn Ala Ser Gln Arg Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Gln Arg Phe Ser Trp Pro Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Arg Gly

20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Asp His Tyr Ser Ser Ser Tyr Asn Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Gln Ser Tyr

20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Ser Gln Arg Ser Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Phe Ser Trp Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggcggcagct ttagccgcgg cggctattat 30

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atttattata gcggcagcac c 21

<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcgcgcgatc attatagcag cagctacaac tacgattat 39

<210> 12

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

caggtgcagc tgcaggaaag cggcccgggc ctggtgaaac cgggcgaaac cctgagcctg 60

acctgcaccg tgagcggcgg cagctttagc cgcggcggct attattggaa ctggattcgc 120

cagccgccgg gcaaaggcct ggaatggatt ggctatattt attatagcgg cagcaccaac 180

tataacccga gcctgaaaag ccgcgtgacc attagcctgg ataccagcaa aaaccagttt 240

agcctgaaac tgagcagcgt gaccgcggaa gataccgcgg tgtattattg tgcgcgcgat 300

cattatagca gcagctacaa ctacgattat tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 360

agc 363

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

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<400> 13

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<211> 18

<212> DNA

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<400> 14

aatgcgagcc aacgctcc 18

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<211> 27

<212> DNA

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<400> 15

cagcagcgct tctcctggcc gccgacc 27

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<211> 321

<212> DNA

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<400> 16

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cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctggaaccg 240

gaagattttg cggtgtatta ttgccagcag cgcttctcct ggccgccgac ctttggccag 300

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Arg Gly

20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

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Cys Ala Arg Asp His Tyr Ser Ser Ser Tyr Asn Tyr Asp Tyr Trp Gly

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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

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Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

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Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

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Pro Gly Lys

450

<210> 18

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Gln Ser Tyr

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Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Phe Ser Trp Pro Pro

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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

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210

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<212> DNA

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<400> 20

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ctgagctgcc gcgcgagcga aagcgtgcag agctatatag cgtggtatca gcagaaaccg 120

ggccaggcgc cgcgcctgct gatttataat gcgagccaac gctccaccgg cattccggcg 180

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gaagattttg cggtgtatta ttgccagcag cgcttctcct ggccgccgac ctttggccag 300

ggcaccaaac tggaaattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642

Claims

1.一种分离的TIM-3抑制剂，其特征在于，所述TIM-3抑制剂包括：

（1）SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链可变区CDR2、SEQ IDNO:3所示的重链可变区CDR3；和

（2）SEQ ID NO:4所示的轻链可变区CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链可变区CDR2、SEQ IDNO:6所示的轻链可变区CDR3。

2.根据权利要求1所述的TIM-3抑制剂，其特征在于，所述TIM-3抑制剂包括：

（1）重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；和

（2）轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的TIM-3抑制剂，其特征在于，所述TIM-3抑制剂包括：

（1）重链，所述重链具有SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；和

（2）轻链，所述轻链具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。

4.编码权利要求1-3中任一项所述的TIM-3抑制剂的核酸分子。

5.根据权利要求 4所述的核酸分子，其特征在于，编码重链CDR1的核酸分子序列如SEQID NO:9所示，编码重链CDR2的核酸分子序列如SEQ ID NO:10所示，编码重链CDR3的核酸分子序列如SEQ ID NO:11所示，编码重链可变区的核酸分子序列如SEQ ID NO:12所示，编码重链的核酸分子序列如SEQ ID NO:19所示；编码轻链CDR1的核酸分子序列如SEQ ID NO:13所示，编码轻链CDR2的核酸分子序列如SEQ ID NO:14所示，编码轻链CDR3的核酸分子序列如SEQ ID NO:15所示，编码轻链可变区的核酸分子序列如SEQ ID NO:16所示，编码轻链的核酸分子序列如SEQ ID NO:20所示。

6.一种包括权利要求4或5所述的核酸分子的重组载体。

7.一种包括权利要求4或5所述的核酸分子或权利要求6所述的重组载体的重组细胞。

8.一种包括治疗有效量的权利要求1-3中任一项所述的TIM-3抑制剂的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括治疗有效量的以下抗体中的至少一种：抗T细胞膜上的负性免疫调节分子的抗体或其抗原结合片段、抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗 PD-L1抗体或其抗原结合片段。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，T细胞膜上的负性免疫调节分子包括CD25、Foxp3、CTLA-4、GITR。

10.一种包括权利要求1-3中任一项所述的TIM-3抑制剂的检测产品或免疫缀合物。

11.一种非诊断目的的检测TIM-3蛋白表达水平的方法，其特征在于，所述方法包括将含有TIM-3蛋白的样品与权利要求1-3中任一项所述的TIM-3抑制剂接触。

12.权利要求1-3中任一项所述的TIM-3抑制剂的应用，所述应用包括以下任一项：

（1）在制备权利要求10所述的检测产品中的应用；

（2）在制备权利要求8或9所述的药物组合物中的应用；

（3）在制备阻断TIM-3与TIM-3的配体结合的药物中的应用；

（4）在制备调节TIM-3活性或水平的药物中的应用；

（5）在制备促进T淋巴细胞中IFN-γ表达的药物中的应用。

13.权利要求8或9所述的药物组合物在制备促进T淋巴细胞中IFN-γ表达的药物中的应用。