JP7358361B2 - Tim3に対する抗体およびその使用 - Google Patents
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Description
本出願と共に電子的に提供したASCIIテキストファイルの配列表(名称:3338_098PC01_SequenceListing.txt;サイズ:912,981バイト;作成日:2019年1月11日)の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。
T細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有3(TIM3)はA型肝炎ウイルス細胞受容体2(HAVCR2)としても知られ、免疫応答の主要制御因子として機能するI型膜貫通タンパク質である。TIM3は活性化IFN-γ産生T細胞(例えば、タイプ1ヘルパーCD4+ T細胞および細胞毒性CD8+ T細胞)で同定され、ガレクチン-9に結合後、T細胞死または疲弊を誘導することが示された。最近の研究では、TIM3発現が多くの自然免疫細胞(例えば、マクロファージ、単球、樹状細胞、肥満細胞およびナチュラルキラー細胞)の活動の制御に重要であることも同定されている。Han G et al., Front Immunol. 4: 449 (2013)参照。
ここに提供されるのは、ヒトT細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有3(TIM3)(「抗TIM3抗体」)に特異的に結合し、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分、特にヒト(例えば、モノクローナル)抗体などの単離抗体である。ある実施態様において、重鎖CDR3は配列番号414または配列番号416を含む。ある実施態様において、重鎖CDR1は配列番号45を含む。ある実施態様において、重鎖CDR2は配列番号413または配列番号415を含む。ある実施態様において、軽鎖CDR1は配列番号64を含む。ある実施態様において、軽鎖CDR2は配列番号66を含む。ある実施態様において、軽鎖CDR3は配列番号69、配列番号68または配列番号419を含む。
(a)重鎖CDR1は配列番号45を含み;
(b)重鎖CDR2は配列番号413または配列番号415を含み;
(c)重鎖CDR3は配列番号414または配列番号416を含み;
(d)軽鎖CDR1は配列番号64を含み;
(e)軽鎖CDR2は配列番号66を含み;そして
(f)軽鎖CDR3は配列番号69、配列番号68または配列番号419を含む。
(a)配列番号410を含む重鎖可変領域(VH)および配列番号417を含む軽鎖可変領域(VL);
(b)配列番号411を含む重鎖可変領域(VH)および配列番号60を含む軽鎖可変領域(VL);
(c)配列番号411を含む重鎖可変領域(VH)および配列番号418を含む軽鎖可変領域(VL);または
(d)配列番号412を含む重鎖可変領域(VH)および配列番号60を含む軽鎖可変領域(VL)
を含む対照抗体とTIM3への結合について交差競合する。
(a)配列番号410を含む重鎖可変領域(VH)の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3および配列番号417を含む軽鎖可変領域(VL)の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3;
(b)配列番号411を含む重鎖可変領域(VH)の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3および配列番号60を含む軽鎖可変領域(VL)の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3;
(c)配列番号411を含む重鎖可変領域(VH)の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3および配列番号418を含む軽鎖可変領域(VL)の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3;または
(d)配列番号412を含む重鎖可変領域(VH)の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3および配列番号60を含む軽鎖可変領域(VL)の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3
を含む。
(a)配列番号410を含む重鎖可変領域(VH)および配列番号417を含む軽鎖可変領域(VL);
(b)配列番号411を含む重鎖可変領域(VH)および配列番号60を含む軽鎖可変領域(VL);
(c)配列番号411を含む重鎖可変領域(VH)および配列番号418を含む軽鎖可変領域(VL)または
(d)配列番号412を含む重鎖可変領域(VH)および配列番号60を含む軽鎖可変領域(VL)
を含む、対照抗体と同じエピトープに結合する。
(a)配列番号410を含む重鎖可変領域(VH)の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3および配列番号417を含む軽鎖可変領域(VL)の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3;
(b)配列番号411を含む重鎖可変領域(VH)の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3および配列番号60を含む軽鎖可変領域(VL)の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3;
(c)配列番号411を含む重鎖可変領域(VH)の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3および配列番号418を含む軽鎖可変領域(VL)の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3;または
(d)配列番号412を含む重鎖可変領域(VH)の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3および配列番号60を含む軽鎖可変領域(VL)の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3
を含む。
(a1)それぞれ配列番号386(または387)および408を含む重鎖および軽鎖配列;
(a2)それぞれ配列番号388(または389)および408を含む重鎖および軽鎖配列;
(a3)それぞれ配列番号390(または391)および408を含む重鎖および軽鎖配列;
(a4)それぞれ配列番号392(または393)および408を含む重鎖および軽鎖配列;
(b1)それぞれ配列番号394(または395)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(b2)それぞれ配列番号394(または395)および409を含む重鎖および軽鎖配列;
(b3)それぞれ配列番号396(または397)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(b4)それぞれ配列番号398(または399)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(b5)それぞれ配列番号400(または401)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(b6)それぞれ配列番号402(または403)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(b7)それぞれ配列番号404(または405)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(b8)それぞれ配列番号406(または407)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(c1)それぞれ配列番号451(または461)および453を含む重鎖および軽鎖配列;
(c2)それぞれ配列番号452(または462)および453を含む重鎖および軽鎖配列;
(d1)それぞれ配列番号457(または465)および453を含む重鎖および軽鎖配列;または
(d2)それぞれ配列番号458(または466)および453を含む重鎖および軽鎖配列
を含む。
(1)例えば、フローサイトメトリーで測定して、膜結合ヒトTIM3に、例えば、1μg/mL以下(例えば、0.01μg/mL~0.05μg/mL)のEC50で結合する;
(2)例えば、フローサイトメトリーで測定して、膜結合カニクイザルTIM3に結合する;
(3)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-IgVに5×10-8M、2×10-8M、10-8Mまたは5×10-9M以下のKDで結合する;
(4)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-IgVに10-7M、2×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する;
(5)実施例22に記載の方法で測定して、カニクイザルTIM3-ECDに5×10-7M、2×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する;
(6)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-ECDに8×10-8M、5×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する;
(7)TIM3発現T細胞(例えば、Th1細胞またはTIL)の増殖増大により証明されるとおり、T細胞活性化(例えば、TIM3の阻害効果の遮断または低減により)を誘導または増強する;および/または
(8)14H7、23B3、13A3、TIM3.7、TIM3.10、TIM3.11、TIM3.12、TIM3.13、TIM3.14、TIM3.15、TIM3.16、TIM3.17、TIM3.18、TIM3.20、TIM3.21、TIM3.22、TIM3.23、TIM3.24、TIM3.25、17C3、9F6、TIM3.7、3G4および17C8の何れかのVHおよびVLを含む抗体とヒトTIM3の結合についていずれかの方向でまたは両方向で競合する。
実施態様1. ヒトT細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有3(TIM3)に結合し、次の
(a)可溶性ヒトTIM3に結合する;
(b)膜結合ヒトTIM3に結合する;
(c)T細胞活性化を誘導または増強する;そして所望により:
(d)可溶性カニクイザルTIM3に結合する;および
(e)膜カニクイザルTIM3に結合する
の性質を示す、単離抗体(例えば、ヒト抗体)またはその抗原結合部分。
(a)重鎖CDR1が配列番号41、配列番号42;配列番号43;配列番号44;および配列番号45からなる群から選択される;
(b)重鎖CDR2が配列番号46、配列番号47;配列番号48;配列番号49;配列番号50;配列番号51;配列番号52;配列番号122;配列番号123;配列番号124および配列番号125からなる群から選択される;
(c)重鎖CDR3が配列番号53、配列番号54;配列番号55;配列番号56;配列番号57;配列番号58;配列番号59;配列番号126;配列番号127;配列番号128および配列番号129からなる群から選択される;
(d)軽鎖CDR1が配列番号64または配列番号65を含む;
(e)軽鎖CDR2が配列番号66または配列番号67を含む;および
(f)軽鎖CDR3が配列番号68、配列番号69、配列番号70または配列番号71を含む、
先の実施態様の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
(a1)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号41、46、53を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(a2)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号41、122、53を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(a3)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号41、123、53を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(a4)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号41、124、53を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(a5)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号41、46、126を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(a6)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号41、46、127を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(a7)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号41、46、128を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(a8)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号41、46、129を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(a9)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号41、122、128を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(a10)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号41、122、126を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(b1)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号42、47、54を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、69を含む;
(b2)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号42、125、54を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、69を含む;
(c)それぞれ配列番号43、48および55を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/またはそれぞれ配列番号64、66および69を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(d)それぞれ配列番号44、49および56を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/またはそれぞれ配列番号64、66および68を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(e)それぞれ配列番号45、50および57を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/またはそれぞれ配列番号64、66および69を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(f)それぞれ配列番号45、50および57を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/またはそれぞれ配列番号64、66および71を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(g1)それぞれ配列番号45、50および57を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/またはそれぞれ配列番号65、67および70を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(g2)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号45、50、57を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、71を含む;
(g3)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号45、50、57を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、69を含む;
(h)それぞれ配列番号45、51および58を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/またはそれぞれ配列番号64、66および68を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(i)それぞれ配列番号45、52および59を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/またはそれぞれ配列番号64、66および69を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列
を含む、抗体またはその抗原結合部分。
(a)配列番号34に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;
(b)配列番号35に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号61に示すアミノ酸配列を含むVL;
(c)配列番号36に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号61に示すアミノ酸配列を含むVL;
(d)配列番号37に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;
(e)配列番号38に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号61に示すアミノ酸配列を含むVL;
(f)配列番号38に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号62に示すアミノ酸配列を含むVL;
(g)配列番号38に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号63に示すアミノ酸配列を含むVL;
(h)配列番号39に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;
(i)配列番号40に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号61に示すアミノ酸配列を含むVL;
(j)それぞれ配列番号121に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号63に示すアミノ酸配列を含むVL;
(k)配列番号120に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号61に示すアミノ酸配列を含むVL;
(l)それぞれ配列番号112に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;
(m)それぞれ配列番号113に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;
(n)それぞれ配列番号114に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;
(o)それぞれ配列番号115に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;
(p)それぞれ配列番号116に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;
(q)それぞれ配列番号117に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;
(r)それぞれ配列番号118に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;
(s)それぞれ配列番号119に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;および
(t)それぞれ配列番号364に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL
を含む、単離抗体またはその抗原結合部分。
(a)配列番号34に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;
(b)配列番号35に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号61に示すアミノ酸配列を含むVL;
(c)配列番号36に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号61に示すアミノ酸配列を含むVL;
(d)配列番号37に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;
(e)配列番号38に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号61に示すアミノ酸配列を含むVL;
(f)配列番号38に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号62に示すアミノ酸配列を含むVL;
(g)配列番号38に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号63に示すアミノ酸配列を含むVL;
(h)配列番号39に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;
(i)配列番号40に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号61に示すアミノ酸配列を含むVL;
(j)それぞれ配列番号121に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号63に示すアミノ酸配列を含むVL;
(k)それぞれ配列番号120に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号61に示すアミノ酸配列を含むVL;
(l)それぞれ配列番号112に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;
(m)それぞれ配列番号113に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;
(n)それぞれ配列番号114に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;
(o)それぞれ配列番号115に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;
(p)それぞれ配列番号116に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;
(q)それぞれ配列番号117に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;
(r)それぞれ配列番号118に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;
(s)それぞれ配列番号119に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL;および
(t)それぞれ配列番号364に示すアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号60に示すアミノ酸配列を含むVL
からなる群から選択されるVHおよびVLを含む、実施態様37または38の抗体またはその抗原結合部分。
(a1)それぞれ配列番号301(または302)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a2)それぞれ配列番号1(または8)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a3)それぞれ配列番号15(または22)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a4)それぞれ配列番号303(または304)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a5)それぞれ配列番号72(または82)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a6)それぞれ配列番号92(または102)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a7)それぞれ配列番号305(または306)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a8)それぞれ配列番号73(または83)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a9)それぞれ配列番号93(または103)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a10)それぞれ配列番号307(または308)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a11)それぞれ配列番号74(または84)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a12)それぞれ配列番号94(または104)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a13)それぞれ配列番号309(または310)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a14)それぞれ配列番号75(または85)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a15)それぞれ配列番号95(または105)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a16)それぞれ配列番号311(または312)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a17)それぞれ配列番号76(または86)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a18)それぞれ配列番号96(または106)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a19)それぞれ配列番号313(または314)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a20)それぞれ配列番号77(または87)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a21)それぞれ配列番号97(または107)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a22)それぞれ配列番号315(または316)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a23)それぞれ配列番号78(または88)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a24)それぞれ配列番号98(または108)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a25)それぞれ配列番号317(または318)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a26)それぞれ配列番号79(または89)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a27)それぞれ配列番号99(または109)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a28)それぞれ配列番号319(または320)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a29)それぞれ配列番号349(または350)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a30)それぞれ配列番号351(または352)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a31)それぞれ配列番号353(または354)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(b1)それぞれ配列番号321(または322)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(b2)それぞれ配列番号2(または9)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(b3)それぞれ配列番号16(または23)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(b4)それぞれ配列番号323(または324)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(b5)それぞれ配列番号80(または90)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(b6)それぞれ配列番号100(または110)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(b7)それぞれ配列番号325(または326)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(c1)それぞれ配列番号327(または328)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(c2)それぞれ配列番号3(または10)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(c3)それぞれ配列番号17(または24)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(c4)それぞれ配列番号329(または330)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(d1)それぞれ配列番号331(または332)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(d2)それぞれ配列番号4(または11)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(d3)それぞれ配列番号18(または25)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(d4)それぞれ配列番号333(または334)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(e1.1)それぞれ配列番号335(または336)および32を含む重鎖および軽鎖配列;
(e1.2)それぞれ配列番号335(または336)および33を含む重鎖および軽鎖配列;
(e1.3)それぞれ配列番号335(または336)および31を含む重鎖および軽鎖配列;
(e2)それぞれ配列番号5(または12)および33を含む重鎖および軽鎖配列;
(e3)それぞれ配列番号19(または26)および33を含む重鎖および軽鎖配列;
(e4)それぞれ配列番号337(または338)および33を含む重鎖および軽鎖配列;
(e5)それぞれ配列番号81(または91)および33を含む重鎖および軽鎖配列;
(e6)それぞれ配列番号101(または111)および33を含む重鎖および軽鎖配列;
(e7)それぞれ配列番号339(または340)および33を含む重鎖および軽鎖配列;
(f1)それぞれ配列番号341(または342)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(f2)それぞれ配列番号6(または13)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(f3)それぞれ配列番号20(または27)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(f4)それぞれ配列番号343(または344)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(g1)それぞれ配列番号345(または346)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(g2)それぞれ配列番号7(または43)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(g3)それぞれ配列番号21(または28)および30を含む重鎖および軽鎖配列;または
(g4)それぞれ配列番号347(または348)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
を含み、ここで、抗体がヒトTIM3に特異的に結合する、実施態様1~52の何れかの抗体。
(1)例えば、Biacoreで測定して、可溶性ヒトTIM3に、例えば、10nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(2)例えば、Biacoreで測定して、可溶性カニクイザルTIM3に、例えば、100nM以下(例えば、0.01nM~100nM)のKDで結合する;
(3)例えば、フローサイトメトリーで測定して、膜結合ヒトTIM3に、例えば、1μg/mL以下(例えば、0.01μg/mL~1μg/mL)のEC50で結合する;
(4)例えば、スキャチャード解析で測定して、膜結合ヒトTIM3に、例えば、1nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(5)例えば、フローサイトメトリーで測定して、膜結合カニクイザルTIM3に、例えば、20μg/mL以下(例えば、0.01μg/mL~20μg/mL)のEC50で結合する;
(6)例えば、スキャチャード解析で測定して、膜結合カニクイザルTIM3に、例えば、1nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(7)(i)TIM3発現T細胞(例えば、Th1細胞またはTIL)のIFN-γ産生を増加させるおよび/または(ii)TIM3発現T細胞(例えば、Th1細胞またはTIL)の増殖を増大させることにより証明されるとおり、T細胞活性化(例えば、TIM3の阻害効果の遮断または低減により)を誘導または増強する;
(8)混合リンパ球反応(MLR)アッセイでT細胞増殖を刺激する;
(9)例えば、PS-hTIM3「イン・タンデム」遮断アッセイにより測定して、ホスファチジルセリンのTIM3への結合を阻害する;
(10)細胞のTIM3に結合したとき、細胞表面TIM3を内在化または下方制御しない;
(11)ヒトTIM3細胞外ドメイン(配列番号290)の次の領域(a)CPVFECG(配列番号296);(b)RIQIPGIMND(配列番号298);(c)CPVFECGおよびRIQIPGIMND(それぞれ配列番号296および298);および(d)WTSRYWLNGDFR(配列番号297)の一つに結合する;
(12)野生型ヒトTIM3への結合と比較して、アミノ酸L48、C58、P59、V60、F61、E62、C63、G64、W78、S80、R81、W83、L84、G86、D87、R89、D104、R111、Q113、G116、M118およびD120(配列番号286において番号付け(図30))の1以上が他のアミノ酸で置換されているヒトTIM3に対して結合が減少している;;
(13)13A3、3G4、17C3、17C8、9F6、8B9、8C4またはTIM3.7、TIM3.8、TIM3.10、TIM3.11、TIM3.12、TIM3.13、TIM3.14、TIM3.15、TIM3.16、TIM3.17およびTIM3.18の何れかのVHおよびVLドメインを含む抗体と、ヒトTIM3への結合について何れかの方向でまたは両方向で競合する;
(14)HDX-MSにより決定して、ヒトTIM3領域49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号367)および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号368)に結合する;
(15)X線結晶学(例えば、実施例に記載;番号付けは配列番号286による(図30))により決定して、ヒトTIM3の次のアミノ酸P50、V51、C52、P59、V60、F61、E62、C63、G64、N65、V66、V67、L68、R69、D71、E72、D74、R111、Q113、G116、I117、M118、D120そして所望によりT70および/またはI112の少なくとも5、10、15、20または全てと相互作用する重鎖および/または軽鎖可変領域を有する;および/または
(16)(a)野生型ヒトTIM3への結合と比較して、アミノ酸C58、P59、F61、E62、C63、R111、D120そして所望によりD104およびQ113(番号付けは配列番号286による(図30))の1、2、3、4、5、6、7、8または9が他のアミノ酸で置換されているヒトTIM3への結合が減少している;(b)実施例に記載のとおり、HDX-MSにより決定して、49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号367)、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号368)および119NDEKFNLKL127(配列番号373)に結合する;および/または(c)13A3またはTIM3.18.IgG1.3のヒトTIM3への結合と競合するまたは交差遮断する。
本明細書がより容易に理解され得るために、一部用語をまず定義する。さらなる定義は、詳細な記載を通して示される。
(A) ヒトTIM3アイソフォーム1(Accession No. NP_116171;配列番号286;Accession No. NM_032782.4を有するヌクレオチド配列によりコード;配列番号288;図25):
ここに記載されるのは、特定の機能的特性または性質により特徴づけられる抗体、例えば、完全ヒト抗体である。例えば、抗体は、ヒトTIM3およびより具体的に、ヒトTIM3の細胞外ドメイン内の特定のドメイン(例えば、機能的ドメイン)に特異的に結合する。ある実施態様において、抗体は、TIM3-Lが結合するTIM3の部位に特異的に結合する。ある実施態様において、抗体はアンタゴニスト抗体であり、すなわち、細胞、例えば、T細胞のT細胞阻害性活性を阻害または抑制する。ある実施態様において、抗TIM3抗体は、カニクイザルTIM3などの1以上の非ヒト霊長類からのTIM3と交差反応する。ある実施態様において、抗体はヒトTIM3の細胞外領域およびカニクイザルTIM3の細胞外領域に特異的に結合する。ある実施態様において、抗体は高親和性でヒトTIM3に結合する。
(a)可溶性および/または膜結合ヒトTIM3に結合する;
(b)可溶性および/または膜結合カニクイザルTIM3に結合する;
(c)免疫応答を誘発または刺激する;
(d)T細胞活性化、例えば、Th1細胞活性化を誘発または刺激する(例えば、サイトカイン分泌および/または増殖増強により証明);
(e)例えば、実施例に記載のような共培養アッセイでT細胞増殖(例えば、CD4+、CD8+ T細胞、Th1細胞またはTIL)を誘発または刺激する;
(f)例えば、実施例に記載するアッセイで決定して、T細胞、例えば、Th1細胞によるIFN-γ産生または腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、例えばヒト腎臓、肺、膵臓または乳癌腫瘍からのTILを誘発または刺激する;
(g)例えば、実施例に記載するアッセイで決定して、ヒトTIM3のPtdSerへの結合を遮断または阻害する;
(h)細胞のTIM3に結合したとき、細胞表面TIM3を内在化または下方制御しない;
(i)ヒトTIM3細胞外ドメイン(i)CPVFECG(配列番号296);(ii)RIQIPGIMND(配列番号298);(iii)CPVFECGおよびRIQIPGIMND(それぞれ配列番号296および298);または(iv)WTSRYWLNGDFR(配列番号297)に結合する;
(j)例えば、実施例に記載するアッセイで決定して、ヒトTIM3への結合のここに記載するTIM3への抗体結合(例えば、13A3、8B9、8C4、3G4、17C3、17C8、9F6、14H7、23B3またはTIM3.2のTIM3.18、TIM3.24およびTIM3.25への何れか)と競合または交差遮断する;
(k)ヒトTIM3に結合するが、次のアミノ酸残基の1以上のアミノ酸置換を有するヒトTIM3にしない:L48、C58、P59、V60、F61、E62、C63、G64、W78、S80、R81、W83、L84、G86、D87、R89、D104、R111、Q113、G116、M118およびD120(配列番号286(図25)による番号付け);および
(l)HDX-MSにより決定して、ヒトTIM3領域49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号367)および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号368)に結合する;
(m)X線結晶学により決定して、ヒトTIM3の次のアミノ酸P50、V51、C52、P59、V60、F61、E62、C63、G64、N65、V66、V67、L68、R69、D71、E72、D74、R111、Q113、G116、I117、M118、D120そして所望によりT70および/またはI112の少なくとも5、10、15、20または全てと相互作用する重鎖および/または軽鎖可変領域を有する;および/または
(n)例えば、実施例に記載する、13A3またはTIM3.18.IgG1.3のヒトTIM3への結合と競合するまたは交差遮断する。
(1)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性ヒトTIM3に、例えば、10nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(2)例えば、実施例に記載Biacoreで測定して、可溶性カニクイザルTIM3に、例えば、100nM以下(例えば、0.01nM~100nM)のKDで結合する;
(3)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合ヒトTIM3に、例えば、1μg/mL以下(例えば、0.01μg/mL~1μg/mL)のEC50で結合する;
(4)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合ヒトTIM3に、例えば、1nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(5)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合カニクイザルTIM3に、例えば、20μg/mL以下(例えば、0.01μg/mL~20μg/mL)のEC50で結合する;
(6)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合カニクイザルTIM3に、例えば、1nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(7)例えば、実施例に記載のとおり、(i)TIM3発現T細胞(例えば、Th1細胞またはTIL)のIFN-γ産生を増加させるおよび/または(ii)T細胞(例えば、Th1細胞またはTIL)増殖増強により証明されるとおり、T細胞活性化(例えば、TIM3の阻害効果の遮断または減少により)を誘導または増強する;
(8)例えば、実施例に記載のとおり、混合リンパ球反応(MLR)アッセイでT細胞増殖を刺激する;
(9)例えば、実施例に記載のとおり、例えば、PS-hTIM3「イン・タンデム」遮断アッセイにより測定して、ホスファチジルセリンのTIM3への結合を阻害する;
(10)細胞のTIM3に結合したとき、細胞表面TIM3を内在化または下方制御しない;
(11)例えば、実施例に記載のとおり、ヒトTIM3細胞外ドメイン(配列番号290)の次の領域(a)CPVFECG(配列番号296);(b)RIQIPGIMND(配列番号298);(c)CPVFECGおよびRIQIPGIMND(それぞれ配列番号296および298);および(d)WTSRYWLNGDFR(配列番号297)の一つに結合する;
(12)野生型ヒトTIM3、例えば、実施例に記載の結合と比較して、アミノ酸L48、C58、P59、V60、F61、E62、C63、G64、W78、S80、R81、W83、L84、G86、D87、R89、D104、R111、Q113、G116、M118およびD120(配列番号286において番号付け(図25))の1以上が他のアミノ酸で置換されているヒトTIM3に対して結合が減少している;
(13)13A3、3G4、17C3、17C8、9F6、8B9、8C4、14H7、23B3、TIM3.7、TIM3.8、TIM3.10、TIM3.11、TIM3.12、TIM3.13、TIM3.14、TIM3.15、TIM3.16、TIM3.17、TIM3.18およびTIM3.25、例えば、実施例に記載の何れかのVHおよびVLドメインを含む抗体と、ヒトTIM3への結合について何れかの方向でまたは両方向で競合する;
(14)例えば、実施例に記載のとおり、HDX-MSにより決定して、ヒトTIM3領域49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号367)および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号368)に結合する;
(15)X線結晶学(例えば、実施例に記載;番号付けは配列番号286による(図25))により決定して、ヒトTIM3の次のアミノ酸P50、V51、C52、P59、V60、F61、E62、C63、G64、N65、V66、V67、L68、R69、D71、E72、D74、R111、Q113、G116、I117、M118、D120そして所望によりT70および/またはI112の少なくとも5、10、15、20または全てと相互作用する重鎖および/または軽鎖可変領域を有する;および/または
(16)(a)野生型ヒトTIM3への結合と比較して、アミノ酸C58、P59、F61、E62、C63、R111、D120そして所望によりD104およびQ113(番号付けは配列番号286による(図25))の1、2、3、4、5、6、7、8または9が他のアミノ酸で置換されているヒトTIM3への結合が減少している;(b)実施例に記載のとおり、HDX-MSにより決定して、49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号367)、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号368)および119NDEKFNLKL127(配列番号373)に結合する;および/または(c)例えば、実施例に記載のとおり13A3またはTIM3.18.IgG1.3のヒトTIM3への結合と競合するまたは交差遮断する;
(17)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-IgVに5×10-8M、2×10-8M、10-8Mまたは5×10-9M以下のKDで結合する;
(18)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-IgVに10-7M、2×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する;
(19)実施例22に記載の方法で測定して、カニクイザルTIM3-ECDに5×10-7M、2×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する;および/または
(20)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-ECDに8×10-8M、5×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する。
特定のここに記載する抗TIM3抗体は、単離され、ここに記載するとおり構造的に特徴づけされた抗体13A3、3G4、17C3、17C8、9F6、8B9、8C4、14H7、23B3またはTIM3.2~TIM3.18、TIM3.20、TIM3.21、TIM3.22、TIM3.23、TIM3.24およびTIM3.25の何れかのCDRおよび/または可変領域配列を有する抗体、例えば、モノクローナル、組み換えおよび/またはヒト抗体ならびにその可変領域またはCDR配列と少なくとも80%同一性(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%同一性)を有する抗体である。全体を引用により本明細書に包含させるPCT/US2017/041946参照。13A3、8B9、8C4、17C3、9F6、3G4、17C8、14H7および23B3のVHアミノ酸配列は、それぞれ配列番号34~40、410および411に示す。13A3、8B9、9F6および23B3の突然変異型のVHアミノ酸配列は配列番号112~121、364および412に示す。VHのVTIM3.20およびTIM3.21アミノ酸配列は、配列番号449に示す。VHのVTIM3.22およびTIM3.23アミノ酸配列は、配列番号456に示す。VLのV13A3、17C3および3G4アミノ酸配列は、配列番号60に示す。VLのV8B9、8C4および17C8アミノ酸配列は、配列番号61に示す。9F6のVLアミノ酸配列は、配列番号61、62および63に示す。VLのV14H7アミノ酸配列は、配列番号417に示す。VLのV23B3アミノ酸配列は、配列番号60および418に示す。13A3、8B9、9F6および23B3の突然変異型のVLアミノ酸配列は、対応する非変異抗体のものに対応する。VLのVTIM3.20およびTIM3.22アミノ酸配列は、配列番号450に示す。VLのVTIM3.21およびTIM3.23アミノ酸配列は、配列番号63に示す。配列番号の帰属の概要を図16に提供する。
(a)それぞれ配列番号34および60を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(b)それぞれ配列番号35および61を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(c)それぞれ配列番号36および61を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(d)それぞれ配列番号37および60を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(e)それぞれ配列番号38および61を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(f)それぞれ配列番号38および62を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(g)それぞれ配列番号38および63を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(h)それぞれ配列番号39および60を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(i)それぞれ配列番号40および61を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(j)それぞれ配列番号121および63を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(k)それぞれ配列番号120および61を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(l)それぞれ配列番号112および60を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(m)それぞれ配列番号113および60を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(n)それぞれ配列番号114および60を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(o)それぞれ配列番号115および60を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(p)それぞれ配列番号116および60を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(q)それぞれ配列番号117および60を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(r)それぞれ配列番号118および60を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(s)それぞれ配列番号119および60を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(t)それぞれ配列番号364および60を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(u)それぞれ配列番号410および417を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(v)それぞれ配列番号411および60を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(w)それぞれ配列番号411および418を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(x)それぞれ配列番号412および60を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(y)それぞれ配列番号449および450を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(z)それぞれ配列番号449および63を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(aa)それぞれ配列番号456および450を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;または
(bb)それぞれ配列番号456および63を含む重鎖および軽鎖可変領域配列
を含む、単離抗ヒトTIM3抗体またはその抗原結合部分である。
(a)配列番号41~45および469からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域CDR1;
(b)配列番号46~52、122~125、413、415および470からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域CDR2;
(c)配列番号53~59、126~129、414、416および471からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域CDR3;
(d)配列番号64~65および472からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域CDR1;
(e)配列番号66~67および473からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域CDR2;および
(f)配列番号68~71、419および474からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域CDR3;
を含む単離抗ヒトTIM3抗体またはその抗原結合部分であり、ここで、該抗体はヒトTIM3に特異的に結合する。
(a)配列番号41、46、53;
(b)配列番号42、47、54;
(c)配列番号43、48、55;
(d)配列番号44、49、56;
(e)配列番号45、50、57;
(f)配列番号45、51、58;
(g)配列番号45、52、59;
(h)配列番号41、122、53;
(i)配列番号41、123、53;
(j)配列番号41、124、53;
(k)配列番号41、46、126;
(l)配列番号41、46、127;
(m)配列番号41、46、128;
(n)配列番号41、46、129;
(o)配列番号41、122、128;
(p)配列番号41、122、126;
(q)配列番号45、413、414;
(r)配列番号45、415、416;または
(s)配列番号469、470および471、
を含み、ここで、該抗体はヒトTIM3に特異的に結合する。
(a)配列番号64、66、68;
(b)配列番号64、66、69;
(c)配列番号65、67、70;
(d)配列番号64、66、71;
(e)配列番号64、66、419;または
(f)配列番号472、473、474、
を含み、ここで、該抗体はヒトTIM3に特異的に結合する。
(a1)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号41、46、53を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(a2)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号41、122、53を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(a3)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号41、123、53を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(a4)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号41、124、53を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(a5)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号41、46、126を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(a6)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号41、46、127を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(a7)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号41、46、128を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(a8)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号41、46、129を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(a9)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号41、122、128を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(a10)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号41、122、126を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(b1)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号42、47、54を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、69を含む;
(b2)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号42、125、54を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、69を含む;
(c)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号43、48、55を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、69を含む;
(d)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号44、49、56を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(e1)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号45、50、57を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、69を含む;
(e2)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号45、50、57を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、71を含む;
(e3)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号45、50、57を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号65、67、70を含む;
(f)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号45、51、58を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(g)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号45、52、59を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、69を含む;
(h)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号45、413、414を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、69を含む;
(i1)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号45、415、416を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、68を含む;
(i2)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号45、415、416を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66、419を含む;
(j1)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号469、470および471を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号472、473および474を含む;または
(j2)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号469、470および471を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3がそれぞれ配列番号64、66および71を含み、
ここで、該抗体はヒトTIM3に特異的に結合する。
または配列番号291のアロタイプバリアントであり、次のアミノ酸配列:
を有するものなどのヒトIgG、例えば、IgG1、定常領域に融合したここに記載するVHドメインの何れかのアミノ酸配列を含み得る。
または
の融合した、ここに記載するVHドメインの何れかのアミノ酸配列を含み得る。
に融合したここに記載するVHドメインの何れかのアミノ酸配列を含み得る。
に融合したここに記載するVLドメインの何れかのアミノ酸配列を含み得る。
(a1)それぞれ配列番号301(または302)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a2)それぞれ配列番号1(または8)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a3)それぞれ配列番号15(または22)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a4)それぞれ配列番号303(または304)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a5)それぞれ配列番号72(または82)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a6)それぞれ配列番号92(または102)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a7)それぞれ配列番号305(または306)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a8)それぞれ配列番号73(または83)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a9)それぞれ配列番号93(または103)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a10)それぞれ配列番号307(または308)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a11)それぞれ配列番号74(または84)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a12)それぞれ配列番号94(または104)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a13)それぞれ配列番号309(または310)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a14)それぞれ配列番号75(または85)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a15)それぞれ配列番号95(または105)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a16)それぞれ配列番号311(または312)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a17)それぞれ配列番号76(または86)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a18)それぞれ配列番号96(または106)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a19)それぞれ配列番号313(または314)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a20)それぞれ配列番号77(または87)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a21)それぞれ配列番号97(または107)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a22)それぞれ配列番号315(または316)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a23)それぞれ配列番号78(または88)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a24)それぞれ配列番号98(または108)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a25)それぞれ配列番号317(または318)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a26)それぞれ配列番号79(または89)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a27)それぞれ配列番号99(または109)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a28)それぞれ配列番号319(または320)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a29)それぞれ配列番号349(または350)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a30)それぞれ配列番号351(または352)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(a31)それぞれ配列番号353(または354)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(b1)それぞれ配列番号321(または322)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(b2)それぞれ配列番号2(または9)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(b3)それぞれ配列番号16(または23)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(b4)それぞれ配列番号323(または324)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(b5)それぞれ配列番号80(または90)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(b6)それぞれ配列番号100(または110)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(b7)それぞれ配列番号325(または326)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(c1)それぞれ配列番号327(または328)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(c2)それぞれ配列番号3(または10)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(c3)それぞれ配列番号17(または24)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(c4)それぞれ配列番号329(または330)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(d1)それぞれ配列番号331(または332)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(d2)それぞれ配列番号4(または11)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(d3)それぞれ配列番号18(または25)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(d4)それぞれ配列番号333(または334)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(e1.1)それぞれ配列番号335(または336)および32を含む重鎖および軽鎖配列;
(e1.2)それぞれ配列番号335(または336)および33を含む重鎖および軽鎖配列;
(e1.3)それぞれ配列番号335(または336)および31を含む重鎖および軽鎖配列;
(e2)それぞれ配列番号5(または12)および33を含む重鎖および軽鎖配列;
(e3)それぞれ配列番号19(または26)および33を含む重鎖および軽鎖配列;
(e4)それぞれ配列番号337(または338)および33を含む重鎖および軽鎖配列;
(e5)それぞれ配列番号81(または91)および33を含む重鎖および軽鎖配列;
(e6)それぞれ配列番号101(または111)および33を含む重鎖および軽鎖配列;
(e7)それぞれ配列番号339(または340)および33を含む重鎖および軽鎖配列;
(f1)それぞれ配列番号341(または342)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(f2)それぞれ配列番号6(または13)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(f3)それぞれ配列番号20(または27)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(f4)それぞれ配列番号343(または344)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(g1)それぞれ配列番号345(または346)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(g2)それぞれ配列番号7(または14)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(g3)それぞれ配列番号21(または28)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(g4)それぞれ配列番号347(または348)および30を含む重鎖および軽鎖配列;
(h1)それぞれ配列番号386(または387)および408を含む重鎖および軽鎖配列;
(h2)それぞれ配列番号388(または389)および408を含む重鎖および軽鎖配列;
(h3)それぞれ配列番号390(または391)および408を含む重鎖および軽鎖配列;
(h4)それぞれ配列番号392(または393)および408を含む重鎖および軽鎖配列;
(i1.1)それぞれ配列番号394(または395)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(i1.2)それぞれ配列番号394(または395)および409を含む重鎖および軽鎖配列;
(i2)それぞれ配列番号396(または397)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(i3)それぞれ配列番号398(または399)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(i4)それぞれ配列番号400(または401)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(i5)それぞれ配列番号402(または403)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(i6)それぞれ配列番号404(または405)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(i7)それぞれ配列番号406(または407)および29を含む重鎖および軽鎖配列;
(j1)それぞれ配列番号451(または461)および453を含む重鎖および軽鎖配列;
(j2)それぞれ配列番号452(または462)および453を含む重鎖および軽鎖配列;
(k1)それぞれ配列番号454(または463)および33を含む重鎖および軽鎖配列;
(k2)それぞれ配列番号455(または464)および33を含む重鎖および軽鎖配列;
(l1)それぞれ配列番号457(または465)および453を含む重鎖および軽鎖配列;
(l2)それぞれ配列番号458(または466)および453を含む重鎖および軽鎖配列;
(m1)それぞれ配列番号459(または467)および33を含む重鎖および軽鎖配列;または
(m2)それぞれ配列番号460(または468)および33を含む重鎖および軽鎖配列
を含む、単離抗ヒトTIM3抗体またはその抗原結合部分であり、ここで、該抗体はヒトTIM3に特異的に結合する。
(1)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性ヒトTIM3に、例えば、10nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(2)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性カニクイザルTIM3に、例えば、100nM以下(例えば、0.01nM~100nM)のKDで結合する;
(3)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合ヒトTIM3に、例えば、1μg/mL以下(例えば、0.01μg/mL~1μg/mL)のEC50で結合する;
(4)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合ヒトTIM3に、例えば、1nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(5)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合カニクイザルTIM3に、例えば、20μg/mL以下(例えば、0.01μg/mL~20μg/mL)のEC50で結合する;
(6)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合カニクイザルTIM3に、例えば、1nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(7)例えば、実施例に記載のとおり、(i)TIM3発現T細胞(例えば、Th1細胞またはTIL)のIFN-γ産生を増加させるおよび/または(ii)TIM3発現T細胞(例えば、Th1細胞またはTIL)の増殖を増大させることにより証明されるとおり、T細胞活性化(例えば、TIM3の阻害効果の遮断または低減により)を誘導または増強する;
(8)例えば、実施例に記載のとおり、混合リンパ球反応(MLR)アッセイでT細胞増殖を刺激する;
(9)例えば、実施例に記載のとおり、PS-hTIM3「イン・タンデム」遮断アッセイにより測定して、ホスファチジルセリンのTIM3への結合を阻害する;
(10)細胞のTIM3に結合したとき、細胞表面TIM3を内在化または下方制御しない;
(11)例えば、実施例に記載のとおり、ヒトTIM3細胞外ドメイン(配列番号290)の次の領域(a)CPVFECG(配列番号296);(b)RIQIPGIMND(配列番号298);(c)CPVFECGおよびRIQIPGIMND(それぞれ配列番号296および298);および(d)WTSRYWLNGDFR(配列番号297)の一つに結合する;
(12)実施例に記載したように、野生型ヒトTIM3への結合と比較して、アミノ酸L48、C58、P59、V60、F61、E62、C63、G64、W78、S80、R81、W83、L84、G86、D87、R89、D104、R111、Q113、G116、M118およびD120(配列番号286において番号付け(図25))の1以上が他のアミノ酸で置換されているヒトTIM3に対する結合が減少している;
(13) 実施例に記載の13A3、3G4、17C3、17C8、9F6、8B9、8C4、14H7、23B3、TIM3.7、TIM3.8、TIM3.10、TIM3.11、TIM3.12、TIM3.13、TIM3.14、TIM3.15、TIM3.16、TIM3.17、TIM3.18およびTIM3.25の何れかのVHおよびVLドメインを含む抗体と、ヒトTIM3への結合について何れかの方向でまたは両方向で競合する;
(14)例えば、実施例に記載のとおり、HDX-MSにより決定して、ヒトTIM3領域49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号367)および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号368)に結合する;
(15)X線結晶学(例えば、実施例に記載;番号付けは配列番号286による(図25))により決定して、ヒトTIM3の次のアミノ酸P50、V51、C52、P59、V60、F61、E62、C63、G64、N65、V66、V67、L68、R69、D71、E72、D74、R111、Q113、G116、I117、M118、D120そして所望によりT70および/またはI112の少なくとも5、10、15、20または全てと相互作用する重鎖および/または軽鎖可変領域を有する;
(16)(a)野生型ヒトTIM3への結合と比較して、アミノ酸C58、P59、F61、E62、C63、R111、D120そして所望によりD104およびQ113(番号付けは配列番号286による(図25))の1、2、3、4、5、6、7、8または9が他のアミノ酸で置換されているヒトTIM3への結合が減少している;(b)実施例に記載のとおり、HDX-MSにより決定して49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号367)、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号368)および119NDEKFNLKL127(配列番号373)に結合する;および/または(c)例えば、実施例に記載のとおり、13A3またはTIM3.18.IgG1.3のヒトTIM3への結合と競合するまたは交差遮断する;
(17)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-IgVに5×10-8M、2×10-8M、10-8Mまたは5×10-9M以下のKDで結合する;
(18)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-IgVに10-7M、2×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する;
(19)実施例22に記載の方法で測定して、カニクイザルTIM3-ECDに5×10-7M、2×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する;および/または
(20)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-ECDに8×10-8M、5×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する。
(i)HDX-MSにより決定して、(1)49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号367)、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号368)および119NDEKFNLKL127(配列番号373)に結合するが、例えば、(a)アミノ酸残基49のN末端に位置する配列を有するペプチド;(b)アミノ酸残基62~111に位置する配列を有するペプチド(例えば、78WTSRYWLNGDFRKGDVSL95(配列番号371));および(c)アミノ酸残基127のC末端に位置する配列を有するペプチドと顕著に結合しない(例えば、実施例に記載);
(ii)例えば、酵母表面ディスプレイ方法を使用して決定して、次のアミノ酸変異の1以上を有するヒトTIM3に結合しないまたは次のアミノ酸変異の1以上を有するヒトTIM3への結合が顕著に減少している(例えば、実施例に記載):C58、P59、F61、E62、C63、R111、D120そして所望によりD104およびQ113(番号付けは配列番号286による(図25));および/または
(iii)X線結晶学により決定して、ヒトTIM3の次のアミノ酸の少なくとも5、10、15、20または全てと相互作用する重鎖および/または軽鎖可変領域を有する:P50、V51、C52、P59、V60、F61、E62、C63、G64、N65、V66、V67、L68、R69、D71、E72、D74、R111、Q113、G116、I117、M118、D120そして所望によりT70および/またはI112(例えば、実施例に記載;番号付けは配列番号286による(図25))。
ある実施態様において、抗TIM3抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子からの重鎖可変領域および/または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子からの軽鎖可変領域を含む。
ここに包含されるのは、ここに記載する抗TIM3抗体のアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体であり、ここで、該抗体はここに記載する抗TIM3抗体の所望の機能的性質を保持する。
(a)重鎖可変領域は、配列番号34~40、112~121、364、410~412、449および456からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%であるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号34~40、112~121、364、410~412、449および456からなる群から選択されるアミノ酸配列に比して1、2、3、4、5、1~2、1~3、1~4、1~5、1~10、1~15、1~20、1~25または1~50アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含み、ここで、所望により重鎖可変領域はここに記載する抗TIM3抗体の一つのCDR配列を含む;
(b)軽鎖可変領域は、配列番号60~63、417および418からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%であるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号60~63、417、418および450からなる群から選択されるアミノ酸配列に比して1、2、3、4、5、1~2、1~3、1~4、1~5、1~10、1~15、1~20、1~25または1~50アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含み、ここで、所望により軽鎖可変領域はここに記載する抗TIM3抗体の一つのCDR配列を含む;
(c)抗体はヒトTIM3に特異的に結合するおよび
(d)抗体は次の機能的性質の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19または全てを示す:
(1)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性ヒトTIM3に、例えば、10nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(2)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性カニクイザルTIM3に、例えば、100nM以下(例えば、0.01nM~100nM)のKDで結合する;
(3)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合ヒトTIM3に、例えば、1μg/mL以下(例えば、0.01μg/mL~1μg/mL)のEC50で結合する;
(4)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合ヒトTIM3に、例えば、1nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(5)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合カニクイザルTIM3に、例えば、20μg/mL以下(例えば、0.01μg/mL~20μg/mL)のEC50で結合する;
(6)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合カニクイザルTIM3に、例えば、1nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(7)例えば、実施例に記載のとおり、(i)TIM3発現T細胞(例えば、Th1細胞またはTIL)のIFN-γ産生を増加させるおよび/または(ii)TIM3発現T細胞(例えば、Th1細胞またはTIL)の増殖を増大させることにより証明されるとおり、T細胞活性化(例えば、TIM3の阻害効果の遮断または低減により)を誘導または増強する;
(8)例えば、実施例に記載のとおり、混合リンパ球反応(MLR)アッセイでT細胞増殖を刺激する;
(9)例えば、実施例に記載のとおり、例えば、PS-hTIM3「イン・タンデム」遮断アッセイにより測定して、ホスファチジルセリンのTIM3への結合を阻害する;
(10)細胞のTIM3に結合したとき、細胞表面TIM3を内在化または下方制御しない;
(11)例えば、実施例に記載のとおり、ヒトTIM3細胞外ドメイン(配列番号290)の次の領域(a)CPVFECG(配列番号296);(b)RIQIPGIMND(配列番号298);(c)CPVFECGおよびRIQIPGIMND(それぞれ配列番号296および298);および(d)WTSRYWLNGDFR(配列番号297)の一つに結合する;
(12)例えば、実施例に記載のとおり、野生型ヒトTIM3への結合に比して、アミノ酸L48、C58、P59、V60、F61、E62、C63、G64、W78、S80、R81、W83、L84、G86、D87、R89、D104、R111、Q113、G116、M118およびD120(配列番号286において番号付け(図25))の1以上が他のアミノ酸に置換されているヒトTIM3への結合が低減している;
(13)実施例に記載の13A3、3G4、17C3、17C8、9F6、8B9、8C4、14H7、23B3またはTIM3.7、TIM3.8、TIM3.10、TIM3.11、TIM3.12、TIM3.13、TIM3.14、TIM3.15、TIM3.16、TIM3.17、TIM3.18、TIM3.20、TIM3.21、TIM3.22、TIM3.23およびTIM3.25の何れかのVHおよびVLドメインを含む抗体と、ヒトTIM3への結合について何れかの方向でまたは両方向で競合する;
(14)例えば、実施例に記載のとおり、HDX-MSにより決定して、ヒトTIM3領域49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号367)および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号368)に結合する;
(15)X線結晶学(例えば、実施例に記載;番号付けは配列番号286による(図25))により決定して、ヒトTIM3の次のアミノ酸P50、V51、C52、P59、V60、F61、E62、C63、G64、N65、V66、V67、L68、R69、D71、E72、D74、R111、Q113、G116、I117、M118、D120そして所望によりT70および/またはI112の少なくとも5、10、15、20または全てと相互作用する重鎖および/または軽鎖可変領域を有する;
(16)(a)野生型ヒトTIM3への結合と比較して、アミノ酸C58、P59、F61、E62、C63、R111、D120そして所望によりD104およびQ113(番号付けは配列番号286による(図25))の1、2、3、4、5、6、7、8または9が他のアミノ酸で置換されているヒトTIM3への結合が減少している;(b)実施例に記載のとおり、HDX-MSにより決定して、49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号367)、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号368)および119NDEKFNLKL127(配列番号373)に結合する;および/または(c)例えば、実施例に記載のとおり13A3またはTIM3.18.IgG1.3のヒトTIM3への結合と競合するまたは交差遮断する;
(17)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-IgVに5×10-8M、2×10-8M、10-8Mまたは5×10-9M以下のKDで結合する;
(18)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-IgVに10-7M、2×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する;
(19)実施例22に記載の方法で測定して、カニクイザルTIM3-ECDに5×10-7M、2×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する;および/または
(20)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-ECDに8×10-8M、5×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する。
(a)重鎖配列番号1~28、72~111および349~352、388~391(14H7/TIM3.24 HC IgG1.1fおよびIgG1.3f)、396~399(23B3 HC IgG1.1fおよびIgG1.3f)、402~405(TIM3.25 HC IgG1fおよびIgG1.3f)、451、452、461、462(TIM3.20 HC IgG1fおよびIgG1.3f)、454、455、463、464(TIM3.21 HC IgG1fおよびIgG1.3f)、457、458、465、466(TIM3.22 HC IgG1fおよびIgG1.3f)および459、460、467、468(TIM3.23 HC IgG1fおよびIgG1.3f)からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を含むまたは配列番号1~28、72~111、349~352、388~391(14H7/TIM3.24 HC IgG1.1fおよびIgG1.3f)、396~399(23B3 HC IgG1.1fおよびIgG1.3f)、402~405(TIM3.25 HC IgG1.1fおよびIgG1.3f)、451、452、461、462(TIM3.20 HC IgG.1fおよびIgG1.3f)、454、455、463、464(TIM3.21 HC IgG1fおよびIgG1.3f)、457、458、465、466(TIM3.22 HC IgG1fおよびIgG1.3f)および459、460、467、468(TIM3.23 HC IgG1fおよびIgG1.3f)からなる群から選択されるアミノ酸配列に比して、1、2、3、4、5、1~2、1~3、1~4、1~5、1~10、1~15、1~20、1~25または1~50アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含む、ただし、ある実施態様において、配列がエフェクターレス重鎖であるならば、IgG1.1定常領域について重鎖をエフェクターレスとする変異は修飾されない(例えば、R214、A234、E235、A237、S330およびS331は修飾されない)およびIgG1.3定常領域ついてR214、A234およびE235は修飾されず、ここで、所望により重鎖可変領域はここに記載する抗TIM3抗体の一つのCDR配列を含む;
(b)軽鎖は、配列番号29~33、408、409および453からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%であるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号29~33、408、409および453からなる群から選択されるアミノ酸配列に比して1、2、3、4、5、1~2、1~3、1~4、1~5、1~10、1~15、1~20、1~25または1~50アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含み、ここで、所望により軽鎖可変領域はここに記載する抗TIM3抗体の一つのCDR配列を含む;
(c)抗体はヒトTIM3に特異的に結合するおよび
(d)抗体は次の機能的性質の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または全てを示す:
(1)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性ヒトTIM3に、例えば、10nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(2)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性カニクイザルTIM3に、例えば、100nM以下(例えば、0.01nM~100nM)のKDで結合する;
(3)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合ヒトTIM3に、例えば、1μg/mL以下(例えば、0.01μg/mL~1μg/mL)のEC50で結合する;
(4)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合ヒトTIM3に、例えば、1nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(5)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合カニクイザルTIM3に、例えば、20μg/mL以下(例えば、0.01μg/mL~20μg/mL)のEC50で結合する;
(6)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合カニクイザルTIM3に、例えば、1nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(7)例えば、実施例に記載のとおり、(i)TIM3発現T細胞(例えば、Th1細胞またはTIL)のIFN-γ産生を増加させるおよび/または(ii)TIM3発現T細胞(例えば、Th1細胞またはTIL)の増殖を増大させることにより証明されるとおり、T細胞活性化(例えば、TIM3の阻害効果の遮断または低減により)を誘導または増強する;
(8)例えば、実施例に記載のとおり、混合リンパ球反応(MLR)アッセイでT細胞増殖を刺激する;
(9)例えば、実施例に記載のとおり、例えば、PS-hTIM3「イン・タンデム」遮断アッセイにより測定して、ホスファチジルセリンのTIM3への結合を阻害する;
(10)細胞のTIM3に結合したとき、細胞表面TIM3を内在化または下方制御しない;
(11)例えば、実施例に記載のとおり、ヒトTIM3細胞外ドメイン(配列番号290)の次の領域(a)CPVFECG(配列番号296);(b)RIQIPGIMND(配列番号298);(c)CPVFECGおよびRIQIPGIMND(それぞれ配列番号296および298);および(d)WTSRYWLNGDFR(配列番号297)の一つに結合する;
(12)野生型ヒトTIM3、例えば、実施例に記載への結合と比較して、アミノ酸L48、C58、P59、V60、F61、E62、C63、G64、W78、S80、R81、W83、L84、G86、D87、R89、D104、R111、Q113、G116、M118およびD120(配列番号286において番号付け(図25))の1以上が他のアミノ酸で置換されているヒトTIM3に対して結合が減少している;
(13)実施例に記載の13A3、3G4、17C3、17C8、9F6、8B9、8C4、14H7、23B3、TIM3.7、TIM3.8、TIM3.10、TIM3.11、TIM3.12、TIM3.13、TIM3.14、TIM3.15、TIM3.16、TIM3.17、TIM3.18およびTIM3.25の何れかのVHおよびVLドメインを含む抗体と、ヒトTIM3への結合について何れかの方向でまたは両方向で競合する;
(14)例えば、実施例に記載のとおり、HDX-MSにより決定して、ヒトTIM3領域49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号367)および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号368)に結合する;
(15)X線結晶学(例えば、実施例に記載;番号付けは配列番号286による(図25))により決定して、ヒトTIM3の次のアミノ酸P50、V51、C52、P59、V60、F61、E62、C63、G64、N65、V66、V67、L68、R69、D71、E72、D74、R111、Q113、G116、I117、M118、D120そして所望によりT70および/またはI112の少なくとも5、10、15、20または全てと相互作用する重鎖および/または軽鎖可変領域を有する;
(16)例えば、実施例に記載されるとおり、(a)野生型ヒトTIM3への結合と比較して、アミノ酸C58、P59、F61、E62、C63、R111、D120そして所望によりD104およびQ113(番号付けは配列番号286による(図25))の1、2、3、4、5、6、7、8または9が他のアミノ酸で置換されているヒトTIM3への結合が減少している;(b)実施例に記載のとおり、HDX-MSにより決定して、49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号367)、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号368)および119NDEKFNLKL127(配列番号373)に結合する;および/または(c)13A3またはTIM3.18.IgG1.3のヒトTIM3への結合と競合するまたは交差遮断する;
(17)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-IgVに5×10-8M、2×10-8M、10-8Mまたは5×10-9M以下のKDで結合する;
(18)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-IgVに10-7M、2×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する;
(19)実施例22に記載の方法で測定して、カニクイザルTIM3-ECDに5×10-7M、2×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する;および/または
(20)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-ECDに8×10-8M、5×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する。
抗TIM3抗体は、CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖可変領域およびCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含むことができ、ここで、これらCDR配列の1以上は、ここに記載する抗TIM3抗体(例えば、13A3、3G4、17C3、17C8、9F6、8B9、8C4、14H7、23B3またはTIM3.2~TIM3.18、TIM3.20、TIM3.21、TIM3.22、TIM3.23、TIM3.24およびTIM3.25の何れか)に基づき特定されたアミノ酸配列またはそれらの保存的修飾体を含み、ここで、該抗体はここに記載する抗TIM3抗体の所望の機能的性質を保持する。従って、単離抗TIM3抗体またはその抗原結合部分はCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖可変領域およびCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含むことができ、ここで、
(a)重鎖可変領域CDR3配列は、配列番号53~59、126~129、414、416および471およびそれらの保存的修飾体、例えば、1、2、3、4、5、1~2、1~3、1~4または1~5保存的アミノ酸置換のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、所望により重鎖可変領域はここに記載する抗TIM3抗体の一つのCDR配列を含む;
(b)軽鎖可変領域CDR3配列は、配列番号68~71、419および474およびそれらの保存的修飾体、例えば、1、2、3、4、5、1~2、1~3、1~4または1~5保存的アミノ酸置換のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、所望により軽鎖可変領域はここに記載する抗TIM3抗体の一つのCDR配列を含む;
(c)抗体はヒトTIM3に特異的に結合するおよび
(d)抗体は次の特性の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または全てを示す:
(1)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性ヒトTIM3に、例えば、10nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(2)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性カニクイザルTIM3に、例えば、100nM以下(例えば、0.01nM~100nM)のKDで結合する;
(3)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合ヒトTIM3に、例えば、1μg/mL以下(例えば、0.01μg/mL~1μg/mL)のEC50で結合する;
(4)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合ヒトTIM3に、例えば、1nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(5)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合カニクイザルTIM3に、例えば、20μg/mL以下(例えば、0.01μg/mL~20μg/mL)のEC50で結合する;
(6)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合カニクイザルTIM3に、例えば、1nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(7)例えば、実施例に記載のとおり、(i)TIM3発現T細胞(例えば、Th1細胞またはTIL)のIFN-γ産生を増加させるおよび/または(ii)TIM3発現T細胞(例えば、Th1細胞またはTIL)の増殖を増大させることにより証明されるとおり、T細胞活性化(例えば、TIM3の阻害効果の遮断または低減により)を誘導または増強する;
(8)例えば、実施例に記載のとおり、混合リンパ球反応(MLR)アッセイでT細胞増殖を刺激する;
(9)例えば、実施例に記載のとおり、例えば、PS-hTIM3「イン・タンデム」遮断アッセイにより測定して、ホスファチジルセリンのTIM3への結合を阻害する;
(10)細胞のTIM3に結合したとき、細胞表面TIM3を内在化または下方制御しない;
(11)例えば、実施例に記載のとおり、ヒトTIM3細胞外ドメイン(配列番号290)の次の領域(a)CPVFECG(配列番号296);(b)RIQIPGIMND(配列番号298);(c)CPVFECGおよびRIQIPGIMND(それぞれ配列番号296および298);および(d)WTSRYWLNGDFR(配列番号297)の一つに結合する;
(12)野生型ヒトTIM3、例えば、実施例に記載への結合と比較して、アミノ酸L48、C58、P59、V60、F61、E62、C63、G64、W78、S80、R81、W83、L84、G86、D87、R89、D104、R111、Q113、G116、M118およびD120(配列番号286において番号付け(図25))の1以上が他のアミノ酸で置換されているヒトTIM3に対して結合が減少している;
(13)実施例に記載の13A3、3G4、17C3、17C8、9F6、8B9、8C4、14H7、23B3またはTIM3.7、TIM3.8、TIM3.10、TIM3.11、TIM3.12、TIM3.13、TIM3.14、TIM3.15、TIM3.16、TIM3.17、TIM3.18、TIM3.20、TIM3.21、TIM3.22、TIM3.23およびTIM3.25の何れかのVHおよびVLドメインを含む抗体と、ヒトTIM3への結合について何れかの方向でまたは両方向で競合する;
(14)例えば、実施例に記載のとおり、HDX-MSにより決定して、ヒトTIM3領域49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号367)および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号368)に結合する;
(15)X線結晶学(例えば、実施例に記載;番号付けは配列番号286による(図25))により決定して、ヒトTIM3の次のアミノ酸P50、V51、C52、P59、V60、F61、E62、C63、G64、N65、V66、V67、L68、R69、D71、E72、D74、R111、Q113、G116、I117、M118、D120そして所望によりT70および/またはI112の少なくとも5、10、15、20または全てと相互作用する重鎖および/または軽鎖可変領域を有する;
(16)(a)野生型ヒトTIM3への結合と比較して、アミノ酸C58、P59、F61、E62、C63、R111、D120そして所望によりD104およびQ113(番号付けは配列番号286による(図25))の1、2、3、4、5、6、7、8または9が他のアミノ酸で置換されているヒトTIM3への結合が減少している;(b)実施例に記載のとおり、HDX-MSにより決定して49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号367)、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号368)および119NDEKFNLKL127(配列番号373)に結合する;および/または(c)例えば、実施例に記載のとおり13A3またはTIM3.18.IgG1.3のヒトTIM3への結合と競合するまたは交差遮断する;
(17)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-IgVに5×10-8M、2×10-8M、10-8Mまたは5×10-9M以下のKDで結合する;
(18)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-IgVに10-7M、2×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する;
(19)実施例22に記載の方法で測定して、カニクイザルTIM3-ECDに5×10-7M、2×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する;および/または
(20)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-ECDに8×10-8M、5×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する。
また提供されるのは、特定のここに記載する抗TIM3抗体の1以上(例えば、抗体13A3、3G4、17C3、17C8、9F6、8B9、8C4、14H7、23B3および/またはTIM3.2-TIM3.18、TIM3.20、TIM3.21、TIM3.22、TIM3.23、TIM3.24およびTIM3.25)とヒトTIM3への結合について競合する抗体である。このような競合抗体は、標準TIM3結合アッセイでモノクローナル抗体13A3、3G4、17C3、17C8、9F6、8B9、8C4、14H7、23B3および/またはTIM3.2-TIM3.18、TIM3.20、TIM3.21、TIM3.22、TIM3.23、IM3.24およびTIM3.25の1以上のヒトTIM3への結合を競合的に阻害する能力に基づき同定され得る。例えば、標準ELISAアッセイまたは競合的ELISAアッセイを使用でき、ここで、組み換えヒトTIM3タンパク質がプレートに固定化され、様々な濃度の非標識第一抗体を加え、プレートを洗浄し、標識第二抗体を加え、標識の量が測定される。非標識(第一)抗体(「遮断抗体」とも称する)の濃度を増加させると標識(第二)抗体の結合が阻害されるならば、第一抗体は、プレート上の標的への第二抗体の結合を阻害すると言えるまたは第二抗体の結合と競合すると言える。これに加えてまたはこれとは別に、Biacore分析を使用して、抗体が競合する能力を評価し得る。試験抗体がここに記載する抗TIM3抗体のTIM3への結合を阻害する能力は、試験抗体が、該抗体のヒトTIM3への結合と競合できることを示す。
また提供されるのは、修飾抗体を設計するためにここに開示するVHおよび/またはVL配列の1以上を有する抗体を出発物質として使用して製造できるエンジニアリングされ、修飾された抗体であり、その修飾抗体は出発抗体から改変された性質を有し得る。抗体を、一方または両方の可変領域内(すなわち、VHおよび/またはVL)、例えば1以上のCDR領域内および/または1以上のフレームワーク領域内の1以上の残基の修飾によりエンジニアリングされ得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗体を、例えば、抗体のエフェクター機能を変えるために、定常領域内の残基の修飾により加工し得る。
(a)配列番号41~45および469からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号41~45および469に比して1、2、3、4または5アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むVH CDR1領域;
(b)配列番号46~52、122~125、413、415および470からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号46~52、122~125、413、415および470に比して1、2、3、4または5アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むVH CDR2領域;
(c)配列番号53~59、126~129、414、416および471からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号53~59、126~129、414、416および471に比して1、2、3、4または5アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むVH CDR3領域;
(d)配列番号64~65および472からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号64~65および472に比して1、2、3、4または5アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むVL CDR1領域;
(e)配列番号66~67および473からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号66~67および473に比して1、2、3、4または5アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むVL CDR2領域;および
(f)配列番号68~71、419および474からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号68~71、419および474に比して1、2、3、4または5アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むVL CDR3領域
を含む重鎖可変領域を含む、単離抗TIM3モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
抗TIM3抗体、例えば、ここに記載のものは、実施例に記載する特徴などの、ここに記載する特定の抗TIM3抗体の物理的特徴の一部またはすべてを有する。
上記のとおり、ここに開示するVHおよびVL配列を有する抗TIM3抗体を使用して、VHおよび/またはVL配列またはそれに結合する定常領域の修飾により、新規抗TIM3抗体を作製できる。故に、ここに記載する他の態様において、ここに記載する抗TIM3抗体の構造的特性を使用して、ヒトTIM3およびカニクイザルTIM3への結合などのここに記載する抗TIM3抗体の機能的性質の少なくとも1つを保持する、構造的に関連する抗TIM3抗体を作製する。例えば、17C3、8B9、8C4、3G4、17C8、9F6、13A3、14H7、23B3またはTIM3.2~TIM3.18、TIM3.20、TIM3.21、TIM3.22、TIM3.23、TIM3.24およびTIM3.25の何れかのCDR領域の1以上を、既知フレームワーク領域および/または他のCDRと組み換えにより組み合わせ、上記のとおり、さらなる、組み換え技術によって作られた、ここに記載する抗TIM3抗体を作製できる。他のタイプの修飾は、先のセクションに記載のものを含む。操作方法のための出発物質は、ここに提供されるVHおよび/またはVL配列の1以上またはそのCDR領域の1以上である。操作抗体を作製するために、ここに提供されるVHおよび/またはVL配列の1以上またはそのCDR領域の1以上を有する抗体を実際作製する(すなわち、タンパク質として発現させる)必要はない。むしろ、配列に含まれる情報を出発物質として使用して、元の配列に由来する「第二世代」配列を作製し、次いで「第二世代」配列を製造し、タンパク質として発現させる。
(a)(i)配列番号41~45および469からなる群から選択されるCDR1配列、配列番号46~52、122~125、413、415および470からなる群から選択されるCDR2配列および/または配列番号53~59、126~129、414、416および471からなる群から選択されるCDR3配列を含む重鎖可変領域抗体配列;および(ii)配列番号64、65および472からなる群から選択されるCDR1配列、配列番号66、67および473からなる群から選択されるCDR2配列および/または配列番号68~71、419および474からなる群から選択されるCDR3配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供し;
(b)重鎖可変領域抗体配列および/または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも1つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも1つの改変抗体配列を提供し;そして
(c)改変抗体配列をタンパク質として発現する
ことを含む、方法である。
(1)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性ヒトTIM3に、例えば、10nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(2)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性カニクイザルTIM3に、例えば、100nM以下(例えば、0.01nM~100nM)のKDで結合する;
(3)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合ヒトTIM3に、例えば、1μg/mL以下(例えば、0.01μg/mL~1μg/mL)のEC50で結合する;
(4)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合ヒトTIM3に、例えば、1nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(5)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合カニクイザルTIM3に、例えば、20μg/mL以下(例えば、0.01μg/mL~20μg/mL)のEC50で結合する;
(6)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合カニクイザルTIM3に、例えば、1nM以下(例えば、0.01nM~10nM)のKDで結合する;
(7)例えば、実施例に記載のとおり、(i)TIM3発現T細胞(例えば、Th1細胞またはTIL)のIFN-γ産生を増加させるおよび/または(ii)TIM3発現T細胞(例えば、Th1細胞またはTIL)の増殖を増大させることにより証明されるとおり、T細胞活性化(例えば、TIM3の阻害効果の遮断または低減により)を誘導または増強する;
(8)例えば、実施例に記載のとおり、混合リンパ球反応(MLR)アッセイでT細胞増殖を刺激する;
(9)例えば、実施例に記載のとおり、例えば、PS-hTIM3「イン・タンデム」遮断アッセイにより測定して、ホスファチジルセリンのTIM3への結合を阻害する;
(10)細胞のTIM3に結合したとき、細胞表面TIM3を内在化または下方制御しない;
(11)例えば、実施例に記載のとおり、ヒトTIM3細胞外ドメイン(配列番号290)の次の領域(a)CPVFECG(配列番号296);(b)RIQIPGIMND(配列番号298);(c)CPVFECGおよびRIQIPGIMND(それぞれ配列番号296および298);および(d)WTSRYWLNGDFR(配列番号297)の一つに結合する;
(12)野生型ヒトTIM3、例えば、実施例に記載への結合と比較して、アミノ酸L48、C58、P59、V60、F61、E62、C63、G64、W78、S80、R81、W83、L84、G86、D87、R89、D104、R111、Q113、G116、M118およびD120(配列番号286において番号付け(図25))の1以上が他のアミノ酸で置換されているヒトTIM3に対して結合が減少している;
(13)13A3、3G4、17C3、17C8、9F6、8B9、8C4、14H7、23B3またはTIM3.7、TIM3.8、TIM3.10、TIM3.11、TIM3.12、TIM3.13、TIM3.14、TIM3.15、TIM3.16、TIM3.17、TIM3.18、TIM3.20、TIM3.21、TIM3.22、TIM3.23およびTIM3.25、例えば、実施例に記載の何れかのVHおよびVLドメインを含む抗体と、ヒトTIM3への結合について何れかの方向でまたは両方向で競合する;
(14)例えば、実施例に記載のとおり、HDX-MSにより決定して、ヒトTIM3領域49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号367)および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号368)に結合する;
(15)X線結晶学(例えば、実施例に記載;番号付けは配列番号286による(図25))により決定して、ヒトTIM3の次のアミノ酸P50、V51、C52、P59、V60、F61、E62、C63、G64、N65、V66、V67、L68、R69、D71、E72、D74、R111、Q113、G116、I117、M118、D120そして所望によりT70および/またはI112の少なくとも5、10、15、20または全てと相互作用する重鎖および/または軽鎖可変領域を有する;
(16)(a)野生型ヒトTIM3への結合と比較して、アミノ酸C58、P59、F61、E62、C63、R111、D120そして所望によりD104およびQ113(番号付けは配列番号286による(図25))の1、2、3、4、5、6、7、8または9が他のアミノ酸で置換されているヒトTIM3への結合が減少している;(b)実施例に記載のとおり、HDX-MSにより決定して、49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号367)、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号368)および119NDEKFNLKL127(配列番号373)に結合する;および/または(c)例えば、実施例に記載のとおり、13A3またはTIM3.18.IgG1.3の結合と競合または交差遮断する;
(17)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-IgVに5×10-8M、2×10-8M、10-8Mまたは5×10-9M以下のKDで結合する;
(18)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-IgVに10-7M、2×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する;
(19)実施例22に記載の方法で測定して、カニクイザルTIM3-ECDに5×10-7M、2×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する;および/または
(20)実施例22に記載の方法で測定して、hTIM3-ECDに8×10-8M、5×10-8Mまたは10-8M以下のKDで結合する。
ここに記載する他の態様は、ここに記載する抗TIM3抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は細胞全体に、細胞溶解物にまたは部分的に精製されたまたは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸、アルカリ/SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当分野で周知のその他を含む標準技術によりの細胞成分または他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸(例えば、他の染色体DNA、例えば、天然で単離DNAに結合する染色体DNA)またはタンパク質から精製されて離されたとき、「単離された」または「実質的に純粋とされた」。F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York参照。ここに記載する核酸は、例えば、DNAまたはRNAであってよく、イントロン配列を含んでも、含まなくてもよい。ある実施態様において、核酸はcDNA分子である。
ここに記載するモノクローナル抗TIM3抗体は、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)に記載の標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術などの多くの既知技術を使用して製造できる。体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、原則として、例えば、Bリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換、ヒト抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージディスプレー技術などの、モノクローナル抗体を製造する他の技術も用いることができる。
TIM3に対する完全ヒト抗体を産生するため、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルマウス(例えば、HCol2、HCo7またはKMマウス)を、他の抗原について、例えば、Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al., (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびWO98/24884により記載されるとおり、TIM3抗原および/またはTIM3またはそのフラグメントを発現する細胞の精製または富化により免疫化できる。あるいは、マウスをヒトTIM3またはそのフラグメントをコードするDNAで免疫化し得る。ある実施態様において、マウスは、最初の注入時6~16週齢である。例えば、組み換えTIM3抗原の精製または富化調製物(5~50μg)を、HuMAbマウスの腹腔内免疫化に使用し得る。TIM3抗原の精製または富化調製物を用いる免疫化が抗体をもたらさない場合、マウスを免疫応答を促進するためにTIM3発現細胞、例えば、細胞株でも免疫化し得る。細胞株の例は、TIM3を過発現する安定なCHOおよびRaji細胞株を含む。
ここに記載するヒトモノクローナル抗TIM3抗体を製造するハイブリドーマを製造するために、免疫化マウスからの脾細胞および/またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適切な不死化細胞株に融合し得る。得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体産生についてスクリーニングし得る。例えば、免疫化マウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、Sp2/0非分泌マウス骨髄腫細胞(ATCC、CRL 1581)にPEGを用いて融合する。細胞を、平底マイクロタイタープレートに播種し、続いて選択培地でインキュベーションし得る。数週間後、細胞を培地で培養し得る。次いで、個々のウェルをELISAでヒトモノクローナルIgMおよびIgG抗体についてスクリーニングし得る。広範なハイブリドーマ増殖が生じたら、通常10~14日後に培地を観察する。抗体分泌ハイブリドーマを置き換え、再びスクリーニングし、なおヒトIgGに陽性であるならば、モノクローナル抗体を限界希釈により少なくとも2回サブクローン化し得る。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴づけのため組織培養培地で少量の抗体を製造する。
抗体を、当分野で周知のとおり、例えば、組み換えDNA技術および遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマで製造し得る(Morrison, S. (1985)Science 229: 1202)。
(i)13A3 VHシグナル配列のアミノ酸配列:MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(配列番号269)
(ii)13A3 VHシグナル配列の核酸配列:ATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC(配列番号274)
(iii)13A3 VLシグナル配列のアミノ酸配列:METPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号268)
(iv)13A3 VLシグナル配列の核酸配列:ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号273)
(v)8B9 VHシグナル配列のアミノ酸配列:MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(配列番号269)
(vi)8B9 VHシグナル配列の核酸配列:ATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC(配列番号274)
(vii)8B9 VLシグナル配列のアミノ酸配列:METPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号268)
(viii)8B9 VLシグナル配列の核酸配列:ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号273)
(ix)8C4 VHシグナル配列のアミノ酸配列:MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(配列番号269)
(x)8C4 VHシグナル配列の核酸配列:ATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC(配列番号274)
(xi)8C4 VLシグナル配列のアミノ酸配列:METPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号268)
(xii)8C4 VLシグナル配列の核酸配列:ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号273)
(xiii)17C3 VHシグナル配列のアミノ酸配列:MDWTWRVFCLLAVAPGAHS(配列番号267)
(xiv)17C3 VHシグナル配列の核酸配列:ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号272)
(xv)17C3 VLシグナル配列のアミノ酸配列:METPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号268)
(xvi)17C3 VLシグナル配列の核酸配列:ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号273)
(xvii)9F6 VHシグナル配列のアミノ酸配列:MEFGLSWVFLVAIIKGVQC(配列番号270)
(xviii)9F6 VHシグナル配列の核酸配列:ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号275)
(xix)9F6 VL1シグナル配列のアミノ酸配列:MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(配列番号271)
(xx)9F6 VL1シグナル配列の核酸配列:ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT(配列番号276)
(xxi)9F6 VL2およびVL3シグナル配列のアミノ酸配列:METPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号268)
(xxii)9F6 VL2およびVL3シグナル配列の核酸配列:ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号273)
(xxiii)3G4 VHシグナル配列のアミノ酸配列:MEFGLSWVFLVAIIKGVQC(配列番号270)
(xxiv)3G4 VHシグナル配列の核酸配列:ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号275)
(xxv)3G4 VLシグナル配列のアミノ酸配列:METPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号268)
(xxvi)3G4 VLシグナル配列の核酸配列:ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号273)
(xxvii)17C8 VHシグナル配列のアミノ酸配列:MEFGLSWVFLVAIIKGVQC(配列番号270)
(xxviii)17C8 VHシグナル配列の核酸配列:ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号275)
(xxix)17C8 VLシグナル配列のアミノ酸配列:METPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号268)
(xxx)17C8 VLシグナル配列の核酸配列:ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号273)。
(i)重鎖のシグナル配列の核酸配列:ATGAGGGCTTGGATCTTCTTTCTGCTCTGCCTGGCCGGGAGAGCGCTCGCA(配列番号362)
(ii)軽鎖のシグナル配列の核酸配列:ATGAGGGCTTGGATCTTCTTTCTGCTCTGCCTGGCCGGGCGCGCCTTGGCC(配列番号363)
(iii)重鎖および軽鎖のシグナル配列のアミノ酸配列:MRAWIFFLLCLAGRALA(配列番号361)。
ここに記載する抗TIM3抗体を、例えば、標準ELISAでヒトTIM3への結合について試験し得る。簡潔には、マイクロタイタープレートを精製TIM3で被覆し、次いでウシ血清アルブミンで遮断する。抗体の希釈物(例えば、TIM3免疫化マウスからの血漿の希釈物)を各ウェルに加え、インキュベートする。プレートを洗浄し、二次試薬(例えば、ヒト抗体について、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートヤギ-抗ヒトIgG Fc特異的ポリクローナル試薬)とインキュベートする。洗浄後、プレートを展開し、分光光度計で分析し得る。次いで、免疫化マウスからの血清をさらにフローサイトメトリーで、TIM3を発現しない対照細胞株ではなく、ヒトTIM3発現細胞株への結合についてスクリーニングし得る。すなわち、抗TIM3抗体の結合を、TIM3発現CHO細胞と抗TIM3抗体をインキュベートすることにより評価できる。細胞を洗浄でき、結合を抗ヒトIgG Abで検出できる。フローサイトメトリー分析をFACScanフローサイトメトリー(Becton Dickinson, San Jose, CA)を使用して実施できる。最高力価を発揮するマウスが融合に使用され得る。
(1)ヒトドナーのPBMCから得た精製T細胞を使用するアッセイなどのT細胞活性化アッセイ。アッセイを総T細胞またはその下位集団、例えば、Th1細胞、T細胞毒性細胞、Treg細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞で使用できるが、但し、それらはTIM3を発現する。活性化を、あるサイトカイン、例えば、インターフェロン-γまたはIL-2の分泌レベルまたはT細胞増殖レベルの決定により測定し得る。特定の作用機序に拘束されることを意図しないが、TIM3抗体のT細胞上のTIM3への結合は、TIM3のTIM3リガンド(TIM3推定リガンドはガレクチン-9、HMGB1、セマフォリン-4A、CEACAM-1、ILT-4およびホスファチジルセリンを含む)への結合を阻止し、それによりT細胞のTIM3介在シグナル伝達を阻止し、それによりTIM3によるT細胞の負の制御を阻止する。Th1アッセイ、TILアッセイおよび混合リンパ球反応(MLR)を含むアッセイの例は実施例に提供される;
(2)マクロファージ、例えば、M1またはM2マクロファージの刺激を測定するアッセイ;および
(3)TIM3陽性骨髄細胞からの骨髄関連サイトカイン、例えば、TNFα、IL-1β、GM-CSF、IL-6、IL-2、IL-10、CCL2、CCL3、CCL4またはCCL5の分泌を測定するアッセイ。ある実施態様において、抗TIM3抗体はTIM3陽性骨髄細胞からのTNFα、IL-1β、GM-CSF、IL-6およびIL-2分泌を刺激するおよび/またはIL-10、CCL2、CCL3、CCL4またはCCL5分泌を阻害する。
ここに記載する抗TIM3抗体は、サンプル試験およびインビボ造影を含む診断目的で使用され得て、この目的で、抗体(またはその抗原結合部分)を適切な検出可能剤とコンジュゲートして、イムノコンジュゲートを形成し得る。診断目的で、適切な薬剤は検出可能剤であり、全身造影のための放射性同位体およびサンプル試験のための放射性同位体、酵素、蛍光標識および他の適当な抗体タグを含む。
ここに記載する抗TIM3抗体は、二重特異性分子形成のために使用され得る。抗TIM3抗体またはその抗原結合部分を、他の機能的分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質(例えば、受容体に対する他の抗体またはリガンド)で誘導体化または結合して、少なくとも2つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を産生し得る。例えば、抗TIM3抗体を、ここに記載するタンパク質(例えば、PD-1、PD-L1、GITRまたはLAG-3に対する抗体)などの組み合わせ処置の可能性のある標的として使用され得る何れかのタンパク質と特異的に結合する抗体またはscFvに結合させ得る。ここに記載する抗体は、実際、2を超える異なる結合部位および/または標的分子に結合する多特異的分子を産生するために、1を超える他の機能的分子で誘導体化または結合でき;このような多特異的分子はまたここに使用する用語「二重特異性分子」に包含されることが意図される。ここに記載する二重特異性分子を作製するために、ここに記載する抗体を、二重特異性分子がもたらされるように、他の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣体などの1以上の他の結合分子と機能的に結合(例えば、化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合的結合またはその他)させ得る。
さらに提供されるのは、薬学的に許容される担体と製剤された、ここに記載する抗TIM3抗体の一つまたは組み合わせまたは他の標的に対する抗体またはその抗原結合部分との組み合わせを含む、組成物、例えば、医薬組成物である。このような組成物は、ここに記載する抗体またはイムノコンジュゲートまたは二重特異性分子の一つまたは組み合わせ(例えば、2以上の異なる)を含み得る。例えば、ここに記載する医薬組成物は、標的抗原の異なるエピトープに結合するまたは相補的活性を有する、抗体(またはイムノコンジュゲートまたは二重特異性)の組み合わせを含み得る。
ここに記載する抗体、抗体組成物および方法は、例えば、TIM3(例えば、シグナル伝達)阻害(または拮抗)による免疫応答またはTIM3検出を含む、多くのインビトロおよびインビボ有用性がある。ある実施態様において、ここに記載する抗TIM3抗体はヒト抗体である。例えば、ここに記載する抗TIM3抗体を、培養細胞にインビトロまたはエクスビボでまたはヒト対象に、例えば、インビボで投与して、多くの疾患における免疫を増強し得る。従って、ここに提供されるのは、対象に、対象の免疫応答が修飾されるように、ここに記載する抗TIM3抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、対象における免疫応答を修飾する方法である。ある実施態様において、応答は増強、刺激または上方制御される。
抗TIM3抗体によるTIM3の阻害は、癌を有する患者の癌細胞に対する免疫応答を増強し得る。ここに提供されるのは、対象が処置されるように、例えば、癌性腫瘍の増殖が阻害または減少するおよび/または腫瘍が退縮するおよび/または生存延長が達成されるように対象にここに記載する抗TIM3抗体を投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法である。抗TIM3抗体は癌性腫瘍増殖阻害に単独で使用され得る。あるいは、抗TIM3抗体は、下記のとおり他の薬剤、例えば、他の免疫原性剤、標準癌処置または他の抗体と共に使用され得る。
ここに記載する方法はまた特定の毒素または病原体に曝されている患者の処置にも使用され得る。従って、ここに記載する他の態様は、対象が感染性疾患について処置されるように、対象に抗TIM3抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、対象における感染性疾患を処置する方法である。これに加えてまたはこれとは別に、抗体はキメラまたはヒト化抗体であり得る。
抗TIM3抗体は自己免疫性応答を誘導し、増強させ得る。実際、腫瘍細胞およびペプチドワクチンを使用する抗腫瘍応答の誘導は、多くの抗腫瘍応答が抗自己反応性に関与することを示している(van Elsas et al. (2001) J. Exp. Med. 194:481-489; Overwijk, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2982-2987; Hurwitz, (2000) supra; Rosenberg & White (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4)。それ故に、種々の自己タンパク質と組み合わせた抗TIM3抗体を、疾患処置のためにこれらの自己タンパク質に対する免疫応答を効率的に産生するためのワクチン接種プロトコールを作成するために考慮することが可能である。例えば、アルツハイマー病は、脳のアミロイド沈着物におけるAβペプチドの不適切な蓄積を含み、アミロイドに対する抗体応答が、これらのアミロイド沈着物を除去し得る(Schenk et al., (1999) Nature 400: 173-177)。
ここに記載する抗TIM3抗体は、抗TIM3抗体と目的の抗原(例えば、ワクチン)の共投与により、抗原特異的免疫応答を刺激するために使用され得る。従って、ここに提供されるのは、対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法であり、対象に(i)抗原;および(ii)抗TIM3抗体またはその抗原結合部分を、対象における抗原に対する免疫応答が増強されるように投与することを含む。抗体はヒト抗ヒトTIM3抗体(例えばここに記載するヒト抗TIM3抗体のいずれか)であり得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗体はキメラまたはヒト化抗体であり得る。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体からの抗原であり得る。このような抗原の非限定的例は、上のセクションに記載したもの、例えば上記腫瘍抗原(または腫瘍ワクチン)または上記ウイルス、細菌または他の病原体からの抗原を含む。
上記組み合わせ治療に加えて、抗TIM3抗体、例えば、ここに記載のものを、下記のとおり、例えば、癌の処置に組み合わせ治療としても使用し得る。
ヒトIgGトランスジェニック(KM)マウスを、ヒトTIM-3をトランスフェクトしたHEK-293ヒト細胞の原形質膜画分を用いて免疫処置した。免疫処置したすべてのマウスからのリンパ節細胞を、SP2/0融合パートナーと融合させた。ハイブリドーマ上清を、まず、ハイスループットアッセイを使用して、ヒトIgG抗体の存在に関してスクリーニングした。次いで、抗原特異性を、ヒトTIM-3をトランスフェクトした細胞においてFACS結合によって判定した。すなわち、47回の融合を行い、3935個のIgG陽性クローンを同定し、そのうちの448個が、ELISAによって、hTIM3陽性であると同定され、このうち126個が、hTIM3 FACSによって陽性であることが見出された。これらのうち、117個のクローン(または抗体)を、次のものを含む種々の方法によってさらに分析した:(1)Biacoreによって行われるエピトープビニング、(2)EC50を判定するための、TIM3の、TIM-3をトランスフェクトした細胞株(293-TIM3)との結合、(3)Th1アッセイ(以下にさらに記載される)および(4)TILアッセイ(以下にさらに記載される)。117個のうち、完全ヒト抗ヒトTIM3抗体を発現する9個のハイブリドーマ:13A3、8B9、8C4、17C3、9F6、3G4、17C8、14H7および23B3を、望ましい特徴を有するとして選択した。これらのハイブリドーマによって産生された抗体の可変ドメインのアミノ酸およびそれらをコードするヌクレオチド配列を、図1A~9Dに提供し、CDR、可変領域ならびに重鎖および軽鎖ならびにそれらのアイソタイプの配列番号を、図13に提供する(ハイブリドーマ名の行を参照のこと)。ハイブリドーマおよびそれによって分泌される抗体は、同じ名称を有する(例えば、13A3)。
選択抗TIM3抗体を、フローサイトメトリーを使用してTIM3発現細胞への結合についてアッセイした。図17Aおよび17Bに示すとおり、抗TIM3抗体13A3、17C3、17C8、3G4、8B9および9F6は、類似する親和性でヒトTIM3でトランスフェクトしたCHO細胞(図17A)および抗CD3/抗CD28活性化ヒトT細胞(図17B)両者に結合できた。抗TIM3抗体8C4はまた活性化ヒトT細胞に結合した(図17B)。同様に、抗TIM3抗体14H7および23B3も活性化ヒトT細胞に結合した(図18)。
抗TIM3 13A3 Fab断片の、ヒトおよびカニクイザルTIM3に対する動態および親和性を、以下にさらに記載されるとおり、37℃、0.05%(v/v)Tween-20を補充したPBS pH7.4において、Biacore T200機器で判定した。使用したヒトTIM3タンパク質は、マウスFcに連結されたヒトTIM3の細胞外ドメイン(ECD)からなり、したがって、二量体hTIM3 ECD-Fcタンパク質(「hTIM3-mFc」)を形成していた。この融合タンパク質は、安定にトランスフェクトしたCHO細胞から発現させ、プロテインA親和性、続いて、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、培地から精製した。使用した組換えカニクイザルTIM3タンパク質は、カニクイザルTIM3の細胞外ドメイン、続いて、リンカーおよび親和性タグからなり、したがって、単量体カニクイザルTIM3 ECDタンパク質(「カニクイザルTIM3-MycHisAvi」)を形成していた。この融合タンパク質は、一過性にトランスフェクトしたExpi293細胞(Life Tech)から発現させ、このタンパク質を、親和性タグを使用して(6x His)、続いて、サイズ排除クロマトグラフィーによって、培地から単離し、精製した。
TIM3.18IgGI.3抗体を、IODO-GEN(登録商標)固相ヨウ素化試薬(1,3,4,6-テトラクロロ-3a-6a-ジフェニルグリコウリル; Pierce Catalog 28601)を使用して、125I-Na(1mCi; PerkinElmer Catalog NEZ033H001MC)で放射ヨウ素標識した。過剰なヨウ素を、脱塩カラム(Pierce Catalog 43243)を使用して、除去した。標識した抗体の画分を採取し、Wizard 1470ガンマカウンター(PerkinElmer)で放射活性について分析した。各画分における125I-TIM3.18.IgGI.3抗体濃度を、InvitrogenのQubitフルオロメーターを用いて計算した。放射性純度を、ピークタンパク質および放射活性画分(Pinestar Technology Catalog 151-005)の薄層クロマトグラフィーによって確立した。
遺伝子バンク全体に対してTIM-3 IgVドメインをblast検索すると、最も高い相同性の分子は、TIM1およびTIM4(45%同一性)であった。ヒトTIM1またはTIM4をトランスフェクトした細胞株を使用したフローサイトメトリーによるTIM3.18.IgG1.3の選択的なプロファイリングでは、TIM1またはTIM4に対する交差反応性は示されなかった(データは示していない)。マウスTIM3をトランスフェクトした細胞におけるフローサイトメトリーによって、TIM3.18.IgG1.3が、マウスTIM-3をトランスフェクトした細胞と交差反応性ではないこともまた、示された(データは示していない)。
抗TIM3抗体をさらに特徴付け、インビボで有意なT細胞刺激活性を有する可能性が高いものを同定するために、特定のT細胞アッセイを開発した。アッセイは、新しい腫瘍組織から単離され、CD3を発現する照射したCHO細胞(「CHO-OKT3細胞」)の存在下においてインキュベートした、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)から分泌されるIFN-γの量を、TIM3抗体の存在下または非存在下(または対照)において、測定する。特定の作用機序に限定されることを望むものではないが、所与の抗TIM3抗体の存在下におけるIFN-γの分泌は、その抗体が、TIL上のTIM3によって通常提供される負のシグナル伝達を阻害し、TILの活性化(すなわち、IFN-γ産生)を刺激することを示す。
腎細胞癌患者に由来する新しい腫瘍組織[腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む]を、酵素消化(Miltenyi, Catalog #130-095-929)による単一細胞懸濁液に調製した。細胞生存率は、FACSによって判定した場合、80%を上回っていた。約1.5×105個の細胞を、2.5×104個の照射した(1時間20分間で67,000RAD、Rad Source Irradiator, RS-2000 Biological System)CHO-OKT3細胞とともに、IL-2含有培地[IL-2(Peprotech, Catalog # 200-02)、20IU/ml]において、アイソタイプ対照抗体または異なる濃度の抗TIM3抗体のいずれかの存在下で、5日間共培養した。培養の5日目に、細胞上清を収集し、IFN-γレベルを、ELISA(BD Opteia hIFNγ ELISAキット、BD、Catalog # 555152)によって評価した。図21に示される結果は、抗TIM3抗体13A3、3G4、17C3、17C8および9F6が、腎細胞癌TILによるIFN-γ産生を刺激できたことを示す。
肺癌患者に由来する新しい腫瘍組織を、Miltenyi酵素消化キット(Miltenyi, Catalog #130-095-929)を用いて消化させた。単一細胞懸濁液を、照射した(1時間20分間で67,000RAD、Rad Source Irradiator、RS-2000 Biological System)CHO-OKT3細胞とともに、IL-2含有培地[IL-2(Peprotech、Catalog # 200-02)、20IU/ml]において、アイソタイプ対照抗体または異なる濃度の抗TIM3抗体の存在下で、5日間共培養した。培養の5日目に、細胞上清を、IFN-γ ELISA(BD Opteia hIFNγ ELISAキット、BD、Catalog # 555152)のために収集した。図22Aに示すとおり、試験した抗TIM3抗体(すなわち、13A3および3G4)は、肺癌TILによるIFN-γ産生を刺激できた。
図23は、抗TIM3抗体13A3または3G4(すなわち、図の全ての点は、13A3または3G4で処理した1患者腫瘍サンプルからのTILを表す)に応答した複数の腫瘍TIL実験から集められたデータを示す(上記実施例のとおり実施)。上記データに一致して、抗TIM3抗体は全腎臓細胞癌(RCC)および肺癌患者から単離したTILでIFN-γ産生を誘発した。同様に、2膵臓癌患者からのTILも抗TIM3抗体に応答してIFN-γを産生した。対照的に、1甲状腺腫瘍患者からのTILは、抗TIM3抗体処置に応答したIFN-γは見られなかった。
全ヒトT細胞を、Miltenyi T細胞精製キットを使用して、PBMCから単離し、プレート結合型抗CD3(1μg/ml、抗CD3クローンOKT3、eBioscience、カタログ番号16-0037-85)および可溶性抗CD28(1μg/ml、抗CD28クローンCD28.2、BD Biosciences、カタログ番号555725)を用いて、4日間活性化させた。TIM3は、FACSによって判定した場合、T細胞の80%超に発現していた。T細胞を、種々の抗TIM3抗体とともに、30分間インキュベートした後、選択されたビオチン標識化抗TIM3抗体とともに、30分間インキュベートし、PEコンジュゲートしたストレプトアビジンによって検出した。図24Aおよび24Bに示される結果は、抗体13A3、3G4、17C3、17C8、9F6、14H7および23B3が、同一のビニング群(群I)である、すなわち、互いに交差競合するが、一方で、抗体8B9および8C4は、別個のビニング群(群II)である、すなわち、群Iの抗体とは交差競合しないが、互いには交差競合することを示す。ビニング群Iの抗体は、生物学的活性を有することが示されたが(実施例を参照のこと)、一方で、ビニング群IIのものは、それよりも弱い活性を有した。群Iまたは群IIのいずれとも交差競合しなかった2つの抗TIM3抗体は、いずれの生物学的活性も有するとは見えなかった。ビニング群Iの抗体はまた、TIM3のPSとの結合を妨害した(本明細書においてさらに記載される)。
ヒトTIM3(NM_032782)の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列、すなわち、
図26Aに示される「タンデム遮断アッセイ」を使用して、ここに開示する抗TIM3抗体が、ヒトTIM3とホスファチジルセリン(「PtSer」または「PS」)との間の相互作用を阻害するかどうかを判定した。PSは、水溶性ではないため、PS-リポソームを、アッセイのために作製した。すなわち、脂質を、メタノール/クロロホルムと混合し、次いで、クロロホルムを、窒素流および真空下において、一晩蒸発させた。続いて、脂質を、マイクロチップを用いて超音波処理し、脂質を完全に分散させて、リポソームを作製した。これらを、さらに、10回よりも多く押出器を通過させて、確実に均一なサイズになるようにした。
水素/重水素交換質量分析法(HDX-MS)を利用して、抗体13A3および3G4と結合するhTIM-3のエピトープを調べた。
mAb 13A3:49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号367)、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号368)およびそのフラグメント119NDEKFNLKL127;および
mAb 3G4:40YTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFE62(配列番号369)、66VVLRTDERDVNY77(配列番号370)、78WTSRYWLNGDFRKGDVSL95(配列番号371)および110CRIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号372)。
免疫組織化学的検査(IHC)を、ヒトおよびカニクイザルの脾臓の凍結切片において、抗TIM3抗体13A3を用いて行った。いずれの種でも、13A3(0.5μg/mL)により、静脈洞様血管の内皮が染色された。予測した通り、カニクイザルTIM-3と交差反応しない抗体3G4は、ヒト脾臓は染色したが、カニクイザル脾臓は染色しなかった(データは示していない)。
ラット抗マウスTIM-3(RMT3 23)およびPD-1(RMP1-14)の市販の抗体(Bio-X-Cell)を、CT26結腸直腸腫瘍モデルにおいて評価した。実験の設計は、インビボでの研究Ngiow et al. (2011) Cancer Res. 71:3540においてこれまでに説明されているものと同様であった。TIM-3は、この腫瘍モデルでは比較的後期(15日目)に発現されるため、腫瘍成長が最小限となり、TIM-3発現の時間が得られるように、少量の腫瘍細胞(2×105個)を、それぞれのマウスの側腹部に移植した。8日目に、腫瘍が容易にわかるようになったときに、マウスを、10匹ずつのマウスで4つの処置群に、平均腫瘍体積は40mm3で無作為化した。RMT3-23(抗TIM-3抗体)およびRMP1-14(抗PD-1抗体)を、単剤または組合せの薬剤(それぞれの抗体の1回の注射当たり250μg)のいずれかとして、腹腔内注射によって投与し、アイソタイプ対照は、1回の注射当たり500μgで投与した。それぞれの実験動物は、それぞれの注射で、250μgの1種類の抗体または500μgの2種類の抗体の組合せを、合計3回の用量で受容させた。腫瘍サイズを、2週間に1回評価した。
抗TIM3抗体をさらに特徴付けるために、インビトロで分極化したTh1細胞を使用する特定のT細胞増殖アッセイを開発した。分極化Th1細胞を、ナイーブCD4+T細胞を反復的に再刺激することによって得た。これらの細胞を、次いで、抗TIM3抗体(または対照)の存在下において、照射した(成長を停止させた)CHO-OKT3細胞とともにインキュベートし、Th1細胞増殖を測定した。
このアッセイは、抗CD28の存在下における、ヒトPD-L1(CHO-OKT3-PD-L1)をトランスフェクトした照射した(成長を停止させたもの、1時間20分で、67,000RAD、Rad Source Irradiator、RS-2000 Biological System)CHO-OKT3細胞とTh1細胞との間で、CHO:T細胞の比1:4での共培養であった。CHO-OKT3-PD-L1細胞株を、アッセイ構築の日に、振盪フラスコにおいて成長させ、照射した。分極化したTh1細胞を、本明細書の他の実施例に記載されるとおり、調製した。アッセイ構築の日に、分極化したTh1細胞を、完全培地中に再懸濁した。
このアッセイについては、新しい腫瘍組織を、外科手術により摘出されたヒト腎細胞癌サンプルまたは乳癌サンプルから得た。腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を、酵素的解離キット(Miltenyi、カタログ130-095-929)を使用して単離した。TILに、20IU/mL IL-2(組換えヒトIL-2、Peprotech、カタログ200-02)を補充し、照射した(成長を停止させたもの、1時間20分で67,000RAD、Rad Source Irradiator、RS-2000 Biological System)CHO-OKT3細胞とともに、CHO:Tの比1:6で、共培養した。CHO-OKT3細胞株を、アッセイ構築の日に、振盪フラスコにおいて成長させ、照射した。
健常なドナーから単離されたCD14+単球を、M-CSFを含有する培養培地において、M0期に分化させた。培養後6日目に、FACS染色によると、有意なマクロファージ集団が、CD163+およびCD206+を細胞表面上に発現しており、抑制性マクロファージのシグネチャーと一致した。抗TIM-3抗体を用いたフローサイトメトリーにより、TIM-3は、M0マクロファージに発現されることが示された(図39)。次いで、これらのM0マクロファージに、照射を行い(7分間で5,000RAD、Rad Source Irradiator、RS-2000 Biological System)、同種ドナーの全T細胞とともに共培養し、共培養後6日目に、混合細胞を、T細胞増殖を評価するために、3H-チミジンで一晩パルス処理した。
hTIM3 IgV領域を、以下のように、TIM3.18のFab断片とともに共結晶化した。使用した配列は、以下の通りであった。
hTim3_IgV:
Tim3.18_Fab:
Tim3.18_カッパ:
CHO細胞において発現されるTIM3.18.IgG1.3の生物学的特徴を、表4に提供する。
単回用量のPK/PDおよび寛容性研究において、すべてのサルを、2.5mgのサル免疫不全ウイルス(SIV)NefおよびGagタンパク質を発現するキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)ベクターおよび非増殖性組換えアデノウイルス-5(Ad5)ベクター(3×109個のそれぞれのベクター)を用いて、筋肉内に免疫処置した。免疫処置の後に、サルに、0(ビヒクル)、0.5、10または25mg/kg(N=3匹/群、性別混合)の用量で、TIM3.18.IgG1.3を静脈内投与した。血清サンプルを、薬物動態(PK)および抗薬物抗体(ADA)の評価のために、最大42日間採取し、血液サンプルを、受容体占有率の評価のために、最大42日間採取した。追加の血清サンプルを、可溶性TIM-3のレベルを含む、その他の試験的エンドポイントのために、保管した。
*外挿したAUCは、20%のカットオフを上回り、21%~55%の範囲に及んだ。
TIM3.18.IgG1.3での処置が、サイトカイン放出症候群の危険性を及ぼすかどうかを判定するために、16人のヒトドナーに由来する全血を、溶液中、20μg/mLのTIM3.18.IgG1.3または陽性対照とともにインキュベートした。75種類の血清サイトカインおよびケモカインのパネルを、それぞれのドナーについて試験した。T細胞に由来するサイトカインまたはケモカインの放出の増強の根拠は認められず、サイトカイン放出症候群の危険性は低いことが示唆された。数人のドナーからの全血アッセイでは、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-αおよびG-CSFの上昇があり、TIM-3の遮断が、単球またはマクロファージに由来するサイトカインの産生を増大するという上記に提示された証拠と一致した(データは示していない)。
13A3が、細胞膜上のヒトTIM3と結合した場合に、それを下方制御または内部移行するかどうかを判定するために、図43に示される蛍光消光研究を行った。3時間の処置の後の結果は、図44に示されるが、13A3抗体も変異体D101EまたはN60Qも、活性化ドナーCD8+T細胞において、細胞内TIM3抗体の用量依存性蓄積を引き起こさなかったことを示し、抗体が、内部移行されないことが示唆された。
TIM3.24(14H7)およびTIM3.25(23B3 VH-G6E-D79Y)のヒトおよびカニクイザルTIM3への結合親和性を次のとおり決定した。ヒトTIM3-IgV(0.63g/L)、カニクイザルTIM3-IgV(0.5g/L)およびカニクイザルTIM3-ECD(0.3g/L)を次の方法で使用した:Biacore T200、37℃、0.05%Tween-20および1g/L BSAを添加されたランニング緩衝液HBS pH7.4。EDAで遮断した固定Jackson anti-hFc pAb(cat# 109-005-098)を伴うCM4チップを使用した。
- このアッセイで、TIM3.24(14H7)はcyTIM3にhTIM3より高い親和性で結合する。
- 13A3および23B3バリアント(それぞれTIM3.18およびTIM3.25)は、cyTIM3より高い親和性でhTIM3に結合する。親和性差異は、TIM3.18で中程度(5×)およびTIM3.25で強い(39×)ものである。
- 完全長カニクイザルECDへの結合は、おそらくサイズ、また恐らく異なるサンプル活性が原因で、全3抗体について、カニクイザルIgVドメインへの結合より約2倍遅かった。cyTim3-IgVで見られた幾分非特異的結合にかかわらず、解離速度は極めて類似した。
TIM3.18、TIM3.24およびTIM3.25が結合するのと異なるhTIM3の領域に結合する抗体を同定した。この抗体は、5D6と称し、それぞれ配列番号469、470および471を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号450、472および474を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号449および450を含むVHおよびVLを含む(「TIM3.20」)。N30S変異を重鎖に導入した抗体も作製し、変異VHは配列番号456(「TIM3.22」)を含んだ。配列番号449または456を含むVHを含む抗体を、IgG1fおよびIgG1.3fアイソタイプの条件で製造した。これら抗体はまた配列番号63(VK2)を含む、別の軽鎖でも製造し、TIM3.21(5D6 VK2)およびTIM3.23(5D6VH_N30S VK2)と称したが、hTIM3への結合は見られなかった。
Claims (17)
- ヒトT細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有3(TIM3)に結合し、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3を含み、ここで、
(a)重鎖CDR1、CDR2およびCDR3が配列番号45、413、および414をそれぞれ含み、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3が配列番号64、66、および69をそれぞれ含む;
(b)重鎖CDR1、CDR2およびCDR3が配列番号45、415、および416をそれぞれ含み、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3が配列番号64、66、および68をそれぞれ含む;または
(c)重鎖CDR1、CDR2およびCDR3が配列番号45、415、および416をそれぞれ含み、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3が配列番号64、66、および419をそれぞれ含む、
単離抗体。 - 重鎖CDR1、CDR2およびCDR3が配列番号45、413、および414をそれぞれ含み、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3が配列番号64、66、および69をそれぞれ含む、請求項1に記載の抗体。
- 重鎖CDR1、CDR2およびCDR3が配列番号45、415、および416をそれぞれ含み、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3が配列番号64、66、および68をそれぞれ含む、請求項1に記載の抗体。
- 重鎖CDR1、CDR2およびCDR3が配列番号45、415、および416をそれぞれ含み、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3が配列番号64、66、および419をそれぞれ含む、請求項1に記載の抗体。
- 重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含み、ここで、
(a)VHが配列番号410または411に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む;または
(b)VLが配列番号417または418に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗体。 - 重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含み、ここで、VHが配列番号410を含み、VLが配列番号417を含む、請求項1、2および5の何れかに記載の抗体。
- 重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含み、ここで、VHが配列番号411を含み、VLが配列番号418を含む;またはVHが配列番号412を含み、VLが配列番号60を含む、請求項1および3~5の何れかに記載の抗体。
- 重鎖CDR1、CDR2およびCDR3および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3を含む、ヒトTIM3に結合する単離抗体であって、ここで
(a)重鎖CDR1は配列番号45を含み、重鎖CDR2は配列番号415を含み、そして重鎖CDR3は配列番号416を含み、軽鎖CDR1は配列番号64を含み、軽鎖CDR2は配列番号66を含み、そして軽鎖CDR3は配列番号68を含む;または
(b)重鎖CDR1は配列番号45を含み、重鎖CDR2は配列番号413を含み、そして重鎖CDR3は配列番号414を含み、軽鎖CDR1は配列番号64を含み、軽鎖CDR2は配列番号66を含み、そして軽鎖CDR3は配列番号69を含む、
単離抗体。 - 抗体がIgG1、IgG2、IgG3、IgG4およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項1~8の何れかに記載の抗体。
- エフェクターレスIgG1 Fcを含む、請求項9に記載の抗体。
- (a1)配列番号386または387を含む重鎖配列および配列番号408を含む軽鎖配列;
(a2)配列番号388または389を含む重鎖配列および配列番号408を含む軽鎖配列;
(a3)配列番号390または391を含む重鎖配列および配列番号408を含む軽鎖配列;
(a4)配列番号392または393を含む重鎖配列および配列番号408を含む軽鎖配列;
(b1)配列番号394または395を含む重鎖配列および配列番号29を含む軽鎖配列;
(b2)配列番号394または395を含む重鎖配列および配列番号409を含む軽鎖配列;
(b3)配列番号396または397を含む重鎖配列および配列番号29を含む軽鎖配列;
(b4)配列番号398または399を含む重鎖配列および配列番号29を含む軽鎖配列;
(b5)配列番号400または401を含む重鎖配列および配列番号29を含む軽鎖配列;
(b6)配列番号402または403を含む重鎖配列および配列番号29を含む軽鎖配列;
(b7)配列番号404または405を含む重鎖配列および配列番号29を含む軽鎖配列;または
(b8)配列番号406または407を含む重鎖配列および配列番号29を含む軽鎖配列、
を含む、請求項1および8~10の何れかに記載の抗体。 - 次の性質の1以上を有する、請求項1~11の何れかに記載の抗体:
(1)フローサイトメトリーで測定して膜結合ヒトTIM3に1μg/mL以下のEC50で結合する;
(2)膜結合カニクイザルTIM3に結合する;
(3)hTIM3-IgVに5×10-8 M以下のKDで結合する;
(4)hTIM3-IgVに1×10-7 M以下のKDで結合する;
(5)カニクイザルTIM3-ECDに5×10-7 M以下のKDで結合する;
(6)hTIM3-ECDに8×10-8 M以下のKDで結合する;および/または
(7)T細胞活性化を誘導または増強する。 - 第二の結合特異性を有する分子に結合している、請求項1~12の何れかに記載の抗体を含む二重特異性分子。
- 請求項1~12の何れかに記載の抗体のVHおよび/またはVLをコードする、核酸。
- 請求項14に記載の核酸を含む発現ベクターでトランスフォームされた、細胞
- 薬剤に結合した請求項1~12の何れかに記載の抗体を含む、イムノコンジュゲート。
- 対象における癌を処置するための、請求項1~12の何れかに記載の抗体、請求項13に記載の二重特異性分子、請求項14に記載の核酸、請求項15に記載の細胞または請求項16に記載のイムノコンジュゲートを含む、医薬組成物。
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