BR112020013475A2

BR112020013475A2 - Anticorpo de pd-l1, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e uso farmacêutico do mesmo

Info

Publication number: BR112020013475A2
Application number: BR112020013475-9A
Authority: BR
Inventors: Xiaoling GU; Jiahua JIANG; Lei Zhang; Qiyue Hu; Jinming Gu; Weikang Tao
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd
Priority date: 2018-01-10
Filing date: 2019-01-09
Publication date: 2020-12-08
Also published as: MX2020007406A; WO2019137397A1; AU2019206958A1; CN111278861A; ZA202004907B; TW201930360A; US20200339692A1; RU2020124261A3; EP3741777A1; TWI717678B; EP3741777A4; RU2020124261A; US11359021B2; KR20200108306A; JP2021510078A; CN111278861B; CA3087105A1

Abstract

um novo anticorpo de pd-l1, um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e um uso farmacêutico do mesmo. um anticorpo humanizado compreendendo uma cdr do anticorpo de pd-l1, uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de pd-l1 e o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e um uso do anticorpo de pd-l1 como um fármaco. um uso de um anticorpo de pd-l1 humanizado na preparação de um fármaco para tratar doenças ou distúrbios associados ao pd-l1.

Description

ANTICORPO DE PD-L1, FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO,

E USO FARMACÊUTICO DO MESMO

[001] A presente invenção reivindica a prioridade do 201810023267.0, depositado em 10 de janeiro de 2018, cujo conteúdo é incorporado na presente invenção na sua totalidade.

Campo da invenção

[002] A presente invenção refere-se a um anticorpo de PD-L1 e um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Além disso, a presente invenção também refere-se a um anticorpo quimérico e um anticorpo humanizado compreendendo CDR do anticorpo de PD-L1, e a presente invenção também refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de PD- L1 e o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e um uso do mesmo como um agente diagnóstico e um medicamento terapêutico para doenças associadas a PD-L1.

Antecedentes

[003] As declarações da presente invenção meramente fornecem informações sobre antecedentes relacionados à presente invenção e não constituem necessariamente o estado da técnica.

[004] A imunoterapia tumoral é um ponto crucial de longo prazo no campo da terapia tumoral, no qual a imunoterapia tumoral de células Té o núcleo. A imunoterapia tumoral é para fazer uso total e mobilizar células T exterminadoras em pacientes com tumor para matar tumores. Pode ser a maneira mais eficaz e segura de tratar tumores. Enquanto isso, o escape de tumor é um tremendo obstáculo para a imunoterapia tumoral. Células tumorais promovem o rápido crescimento de tumores exercendo seu próprio efeito supressor no sistema imune.

[005] A relação entre o mecanismo de escape imune do tumor e a resposta imune do corpo ao tumor é muito complicada. No estágio inicial da imunoterapia tumoral, as células T exterminadoras específicas de tumor eram biologicamente ativas, mas perderam sua função exterminadora no estágio posterior de crescimento do tumor. Portanto, a imunoterapia tumoral serve para maximizar a resposta do sistema imune do próprio paciente ao tumor. A chave da imunoterapia tumoral é não apenas ativar a resposta original do sistema imune do corpo, mas também manter a duração e a intensidade da resposta do sistema imune.

[006] Existem dois sistemas de vias de sinalização da ativação das células T no corpo humano. Além de fornecer o primeiro sinal, apresentando peptídeos de antígeno de MHC às células T por meio de células que apresentam antígeno, também é necessária uma série de moléculas coestimuladoras para fornecer o segundo sinal de modo que as células T produzam uma resposta imune normal. Esse sistema de via de sinalização dupla desempenha um papel vital no equilíbrio do sistema imune do corpo e regula estritamente o corpo para desencadear diferentes respostas imunes ao autoantígeno e antígenos exógenos. A ausência do segundo sinal fornecido pela molécula coestimuladora resultará em ausência de resposta ou sustentará resposta imune específica das células T, levando assim à tolerância. Portanto, a segunda via de sinalização desempenha um papel regulador fundamental em todo o processo de resposta imune.

[007] Descobriu-se em 1992 que a molécula de Morte Programada-1 (PD- 1) é um receptor de proteína expresso na superfície de células T, participando da apoptose de células. O PD-1 pertence à família CD28 e possui 23% de homologia de aminoácidos com o antígeno de linfócito T citotóxico 4 (CTLA-4), mas sua expressão é expressa principalmente em células T ativadas, células B e células mieloides, que são diferentes daquelas de CTLA. Existem dois ligantes de PD-1, PD-L1 e PD-L2, respectivamente. O PD-L1 é expresso principalmente em células T, células B, macrófagos e células dendríticas (DC), cuja expressão pode ser suprarregulada em células ativadas. A expressão de PD-L2 é relativamente limitada, principalmente em células que apresentam antígenos, como macrófagos ativados e células dendríticas.

[008] PD-L1 inibe o sistema imune ligando-se a PD-1 e B7-1. PD-L1 é expresso em muitas células tumorais e células imunes no microambiente do tecido tumoral. Novas pesquisas descobriram que alta expressão da proteína PD- L1 foi detectada em tecidos tumorais humanos, como câncer de mama, câncer de pulmão, carcinoma gástrico, câncer de intestino, câncer de rim, melanoma, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de cólon, câncer de bexiga, câncer de ovário, câncer de pâncreas e câncer de fígado e o nível de expressão de PD-L1 está intimamente associado ao clínico e ao prognóstico dos pacientes.

[009] Uma vez que PD-L1 desempenha um papel na inibição da proliferação de células T na segunda via de sinalização, o bloqueio da ligação de PD-L1/PD-1 tornou-se um novo alvo muito promissor da imunoterapia para tumores.

[010] Atualmente, muitas empresas farmacêuticas multinacionais estão desenvolvendo anticorpos monoclonais contra PD-L1. Bloqueando a ligação de PD-L1/PD-1, pode-se maximizar a resposta do sistema imune do próprio paciente aos tumores, alcançando assim o objetivo de matar as células tumorais. As seguintes são patentes relacionadas: WO0139722, WO2013173223, WO2014195852, —WO2013181634, WOZ2Z015048520, WOZ2Z015036511, US2014335093, WO2014100079, WO2014055897, US6803192B1, WO2014022758, US8617546B2 e WO2010089411A2.

Conteúdo da presente invenção

[011] A presente invenção fornece um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno (também referido como uma molécula de ligação ao PD-L1 humano) que se liga à sequência de aminoácidos ou à estrutura tridimensional da região extracelular de PD-L1.

[012] Em algumas modalidades alternativas, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno que se liga ao PD-L1 humano, que compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 10, 12 e 13, respectivamente; e a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente; em que X: é Fou M, X> é R ou V e X3 é N ou H na HCDR2 da SEQ ID NO: 12; ou (ii) uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 11, 12 e 13, respectivamente; e a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente; em que X1: é Fou M, X2 é Rou V e X3 é N ou H na HCDR2 da SEQ ID NO: 12; ou (iii) uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 20, 21 e 22, respectivamente; e a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 23, 24 e 25, respectivamente; em que HCDR1, HCDR2, HCDR3 e LCDR1, LCDR2, LCDR3, respectivamente, não são SEQ ID NOs: 30, 38, 22, 23, 40 e 25 simultaneamente, em que X, é S ou D, X; é Y ou K, Xç é Hou M, Xr é T, S, H ou G, Xgé S, N ou

G, Xs é S, Lou G, X16 é F, L Wou Me X1 é A, P ou T, Xi2 É M,V,LouS, X13 é F ou Y nas SEQID NOs: 20 e 21 e Xm é Vou A, X15 é Y ou N, X1s É A, Lou Ve X15 É E, E, Y ou A na LCDR2 da SEQID NO: 24.

[013] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao PD-L1 humano, conforme definido acima, compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQID NO: 10, uma HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 ou 29 e uma HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente.

[014] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à PD-L1 humano, conforme definido acima, compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, uma HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 ou 29 e uma HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, a região variável de cadeia leve compreende uma LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente.

[015] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à PD-L1 humano, conforme definido acima, compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30, uma HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 32 a 37 e uma HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, a região variável de cadeia leve compreende uma LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQID NO: 23, uma LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 39, 40, 41, 67 e 69 e uma LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25.

[016] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao PD-L1 humano, conforme definido acima, compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQID NO: 31, uma HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 35, 36 e 37 e uma HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 , a região variável de cadeia leve compreende uma LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, uma LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 39, 40, 41, 67 e 69 e uma LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25.

[017] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 13, respectivamente; a região variável de cadeia leve que compreende LCDRI1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 14 a 16, respectivamente; ou

[018] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 13,

respectivamente; a região variável de cadeia leve que compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 14 a 16, respectivamente; ou

[019] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 13, respectivamente; a região variável de cadeia leve que compreende LCDRI1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 14 a 16, respectivamente; ou

[020] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 22, respectivamente; a região variável de cadeia leve que compreende LCDRI1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQID NO: 39 e SEQID NO: 25, respectivamente; ou

[021] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 22, respectivamente; a região variável de cadeia leve que compreende LCDRI1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 e SEQID NO: 25, respectivamente; ou

[022] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 22, respectivamente; a região variável de cadeia leve que compreende LCDRI1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 e SEQID NO: 25, respectivamente; ou

[023] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 22, respectivamente; a região variável de cadeia leve que compreende LCDRI1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQID NO: 40 e SEQID NO: 25, respectivamente; ou

[024] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 22, respectivamente; a região variável de cadeia leve que compreende LCDRI1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 e SEQID NO: 25, respectivamente; ou

[025] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 22, respectivamente; a região variável de cadeia leve que compreende LCDRI1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQID NO: 67 e SEQID NO: 25, respectivamente.

[026] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo,

conforme definido acima, compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 22, respectivamente; a região variável de cadeia leve que compreende LCDRI1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 69 e SEQID NO: 25, respectivamente.

[027] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 22, respectivamente; a região variável de cadeia leve que compreende LCDRI1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41 e SEQID NO: 25, respectivamente;

[028] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 22, respectivamente; a região variável de cadeia leve que compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQID NO: 40 e SEQID NO: 25, respectivamente; ou

[029] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 22, respectivamente; a região variável de cadeia leve que compreende LCDRI1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 e SEQID NO: 25, respectivamente; ou

[030] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 22, respectivamente; a região variável de cadeia leve que compreende LCDRI1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 e SEQID NO: 25, respectivamente.

[031] Em algumas modalidades, o valor de afinidade KD do anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, ao PD-L1 humano é inferior a 10ºM ou 10*ºM.

[032] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, liga-se de maneira cruzada ao PD-L1 de macaco cinomolgo ou rhesus e/ou PD-L1 de camundongo.

[033] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19.

[034] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19.

[035] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.

[036] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45.

[037] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45.

[038] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45.

[039] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46 e a região variável de cadeia leve tendo sequências de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56 e 57.

[040] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 e a região variável de cadeia leve tendo sequências de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56 e 57.

[041] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56 e 57.

[042] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56 e 57.

[043] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 e a região variável de cadeia leve tendo sequências de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56 e 57.

[044] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56 e 57.

[045] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56 e 57.

[046] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56 e 57.

[047] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55 e 57.

[048] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 70 e 72.

[049] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 70 e 72.

[050] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 70 e 72.

[051] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 70 e 72.

[052] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 70 e 72.

[053] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 70 e 72.

[054] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 70 e 72.

[055) Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 70 e 72.

[056] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 70 e 72.

[057] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO: 54 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 57, 70 e 72.

[058] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal, conforme definido acima, é um anticorpo de comprimento total, compreendendo adicionalmente regiões constantes de anticorpo humano; preferencialmente, a região constante de cadeia pesada das regiões constantes de anticorpo humano é selecionada a partir de regiões constantes de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humano e variantes convencionais das mesmas, e a região constante da cadeia leve das regiões constantes de anticorpo humano é selecionada a partir de regiões constantes da cadeia « e À de anticorpo humano e as variantes convencionais das mesmas; preferencialmente compreendendo uma região constante de cadeia pesada de anticorpo humano tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58, 60 ou 65 e uma região constante de cadeia leve humana tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59.

[059] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal, conforme definido acima, é um anticorpo de comprimento total, compreendendo adicionalmente regiões constantes de anticorpo humano, que compreendem uma região constante de cadeia pesada de anticorpo humano da SEQ ID NO: 58 e uma região constante de cadeia leve humana da SEQ ID NO: 59.

[060] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal, conforme definido acima, é um anticorpo de comprimento total, compreendendo adicionalmente regiões constantes de anticorpo humano, que compreendem uma região constante de cadeia pesada de anticorpo humano da SEQ ID NO: 60 e uma região constante de cadeia leve humana da SEQ ID NO: 59.

[061] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal, conforme definido acima, é um anticorpo de comprimento total, compreendendo adicionalmente regiões constantes de anticorpo humano, que compreendem uma região constante de cadeia pesada de anticorpo humano da SEQ ID NO: 65 e uma região constante de cadeia leve humana da SEQ ID NO: 59.

[062] Em algumas modalidades, o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em Fab, Fab', F(ab')», fragmento variável de cadeia simples (scFv), domínio dimerizado V (diacorpo), Fv estabilizado por dissulfeto (dsFv) e peptídeos contendo CDR.

[063] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis; preferencialmente, a quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é uma dose unitária de 0,1 a 3000 mg/kg do anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima.

[064] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima.

[065) Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um vetor recombinante compreendendo a molécula de ácido nucleico, conforme definido acima.

[066] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece uma célula hospedeira transformada com o vetor recombinante, conforme definido acima, em que a célula hospedeira é selecionada a partir de uma célula procariótica e uma célula eucariótica, preferencialmente uma célula eucariótica, mais preferencialmente uma célula de mamífero.

[067] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um método para produzir o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, em que o método compreende cultivar a célula hospedeira, conforme definida acima, em um meio para produzir e acumular o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, e a coleta do anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a partir da cultura.

[068] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um método para imunodetecção ou determinação de PD-L1 humano, em que o método compreende o uso do anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima.

[069] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um uso do anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, na preparação de um agente diagnóstico para uma doença relacionada a PD-L1 humano.

[070] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um método para o tratamento de doenças associadas a PD-L1 humano, em que o método compreende administrar a um indivíduo uma quantidade farmaceuticamente eficaz do anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, ou compreendendo a composição farmacêutica, conforme definida acima, ou a molécula de ácido nucleico, conforme definida acima, para o tratamento de doenças associadas a PD-L1 humano, em que a doença é preferencialmente um tumor ou um câncer; mais preferencialmente carcinoma de células escamosas, mieloma, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC), glioma, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma folicular, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda

(AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mieloide crônica (CML), linfoma primário do mediastino de grandes células B, linfoma de células do manto (MCL), linfoma linfocítico pequeno (SLL), linfoma de grandes células B rico em células T/histócitos, mieloma múltiplo, proteína 1 da leucelia de células mieloides (Mcl-1), síndrome mielodisplásica (MDS), câncer (do trato) gastrointestinal, câncer renal, câncer de ovário, câncer de fígado, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de próstata, câncer de tireoide, melanoma, condrosarcoma, neuroblastoma, câncer de pâncreas, glioblastoma multiforme, carcinoma gástrico, câncer de osso, sarcoma de Ewing, câncer cervical, câncer cerebral, carcinoma gástrico, câncer de bexiga, carcinoma hepatocelular, câncer de mama, câncer de cólon, carcinoma hepatocelular (HCC), carcinoma de células renais de células claras (RCC), câncer de cabeça e pescoço, câncer de garganta, câncer hepatobiliar, câncer do sistema nervoso central, câncer de esôfago, mesotelioma pleural maligno, amiloidose sistêmica de cadeia leve, linfoma linfoplasmocítico, síndrome mielodisplásica, tumor mieloproliferativo, neoplasia neuroendócrina, carcinoma de células Merkel, câncer de testículo e câncer de pele; mais preferencialmente um carcinoma de células PD-L1 positivo, mieloma, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC), glioma, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma folicular, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mieloide crônica (CML), linfoma primário do mediastino de grandes células B, linfoma de células do manto (MCL), linfoma linfocítico pequeno (SLL), linfoma de grandes células B rico em células T/histócitos, mieloma múltiplo, proteína 1 da leucelia de células mieloides (Mcl-1), síndrome mielodisplásica (MDS), câncer

(do trato) gastrointestinal, câncer renal, câncer de ovário, câncer de fígado, leucemia linfoblástica, leucemia linfocíticay câncer colorretal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de próstata, câncer de tireoide, melanoma, condrosarcoma, neuroblastoma, câncer de pâncreas, glioblastoma multiforme, carcinoma gástrico, câncer de osso, sarcoma de Ewing, câncer cervical, câncer cerebral, carcinoma gástrico, câncer de bexiga, carcinoma hepatocelular, câncer de mama, câncer de cólon, carcinoma hepatocelular (HCC), carcinoma de células renais de células claras (RCC), câncer de cabeça e pescoço, câncer de garganta, câncer hepatobiliar, câncer do sistema nervoso central, câncer de esôfago, mesotelioma pleural maligno, amiloidose sistêmica de cadeia leve, linfoma linfoplasmocítico, síndrome mielodisplásica, tumor mieloproliferativo, neoplasia neuroendócrina, carcinoma de células Merkel, câncer de testículo e câncer de pele.

[071] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um uso do anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, ou compreendendo a composição farmacêutica, conforme definida acima, ou compreendendo a molécula de ácido nucleico, conforme definida acima, na preparação de um agente terapêutico contra doenças associadas ao PD-L1 humano, em que a doença é preferencialmente um tumor ou um câncer; mais preferencialmente carcinoma de células escamosas, mieloma, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC), glioma, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma folicular, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mieloide crônica (CML), linfoma primário do mediastino de grandes células B, linfoma de células do manto (MCL), linfoma linfocítico pequeno (SLL), linfoma de grandes células B rico em células T/histócitos, mieloma múltiplo, proteína 1 da leucelia de células mieloides (Mcl-1), síndrome mielodisplásica (MDS), câncer (do trato) gastrointestinal, câncer renal, câncer de ovário, câncer de fígado, leucemia linfoblástica, leucemia linfocíticaa câncer colorretal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de próstata, câncer de tireoide, melanoma, condrosarcoma, neuroblastoma, câncer de pâncreas, glioblastoma multiforme, carcinoma gástrico, câncer de osso, sarcoma de Ewing, câncer cervical, câncer cerebral, carcinoma gástrico, câncer de bexiga, carcinoma hepatocelular, câncer de mama, câncer de cólon, carcinoma hepatocelular (HCC), carcinoma de células renais de células claras (RCC), câncer de cabeça e pescoço, câncer de garganta, câncer hepatobiliar, câncer do sistema nervoso central, câncer de esôfago, mesotelioma pleural maligno, amiloidose sistêmica de cadeia leve, linfoma linfoplasmocítico, síndrome mielodisplásica, tumor mieloproliferativo, neoplasia neuroendócrina, carcinoma de células Merkel, câncer de testículo e câncer de pele; mais preferencialmente um carcinoma de células PD-L1 positivo, mieloma, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC), glioma, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma folicular, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mieloide crônica (CML), linfoma primário do mediastino de grandes células B, linfoma de células do manto (MCL), linfoma linfocítico pequeno (SLL), linfoma de grandes células B rico em células T/histócitos, mieloma múltiplo, proteína 1 da leucelia de células mieloides (Mcl-1), síndrome mielodisplásica (MDS), câncer (do trato) gastrointestinal, câncer renal, câncer de ovário, câncer de fígado, leucemia linfoblástica, leucemia linfocíticay câncer colorretal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de próstata, câncer de tireoide, melanoma,

condrosarcoma, neuroblastoma, câncer de pâncreas, glioblastoma multiforme, carcinoma gástrico, câncer de osso, sarcoma de Ewing, câncer cervical, câncer cerebral, carcinoma gástrico, câncer de bexiga, carcinoma hepatocelular, câncer de mama, câncer de cólon, carcinoma hepatocelular (HCC), carcinoma de células renais de células claras (RCC), câncer de cabeça e pescoço, câncer de garganta, câncer hepatobiliar, câncer do sistema nervoso central, câncer de esôfago, mesotelioma pleural maligno, amiloidose sistêmica de cadeia leve, linfoma linfoplasmocítico, síndrome mielodisplásica, tumor mieloproliferativo, neoplasia neuroendócrina, carcinoma de células Merkel, câncer de testículo e câncer de pele.

[072] Um medicamento do anticorpo monoclonal ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, ou compreendendo a composição farmacêutica, conforme definida acima, ou a molécula de ácido nucleico, conforme definida acima.

[073] Um medicamento do anticorpo monoclonal ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido acima, ou compreendendo a composição farmacêutica, conforme definida acima, ou a molécula de ácido nucleico, conforme definida acima, em que o medicamento é usado para tratar um tumor ou um câncer de PD-L1 positivo; preferencialmente, o câncer é selecionado a partir de carcinoma de células escamosas, mieloma, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC), glioma, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mieloide crônica (CML), linfoma primário do mediastino de grandes células B, linfoma de células do manto (MCL), linfoma linfocítico pequeno (SLL), linfoma de grandes células B rico em células T/histócitos, mieloma múltiplo, proteína 1 da leucelia de células mieloides (Mcl-1), síndrome mielodisplásica (MDS), câncer (do trato) gastrointestinal, câncer renal, câncer de ovário, câncer de fígado, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de próstata, câncer de tireoide, melanoma, condrosarcoma, neuroblastoma, câncer de pâncreas, glioblastoma multiforme, carcinoma gástrico, câncer de osso, sarcoma de Ewing, câncer cervical, câncer cerebral, carcinoma gástrico, câncer de bexiga, carcinoma hepatocelular, câncer de mama, câncer de cólon, carcinoma hepatocelular (HCC), carcinoma de células renais de células claras (RCC), câncer de cabeça e pescoço, câncer de garganta, câncer hepatobiliar, câncer do sistema nervoso central, câncer de esôfago, mesotelioma pleural maligno, amiloidose sistêmica de cadeia leve, linfoma linfoplasmocítico, síndrome mielodisplásica, tumor mieloproliferativo, neoplasia neuroendócrina, carcinoma de células Merkel, câncer de testículo e câncer de pele.

Breve descrição dos desenhos

[074] Figura 1: Anticorpo de PD-L1 promove secreção de IFNy de células nos ensaios de ativação de linfócitos PBMC-T.

[075] Figura 2: Comparação do efeito de ADCC das formas IgG1 e IgG4 de diferentes anticorpos PD-L1. A Figura 2A é uma comparação das formas IgG1 e IgG4 de HRPOOO49, a Figura 2B é uma comparação das formas IgG1 e IgG4 de H5L11, a Figura 2C é uma comparação das formas IgG1 e IgG4 de HRPOOOS52, a Figura 2D é uma comparação das formas IgG1 e IgG4 de H6L11, e a Figura 2E é uma comparação das formas IgG1 e IgG4 de H18L61, a Figura 2F é uma comparação das formas IgG1 e IgG4 de H12L64.

[076] Figura 3: Efeito do anticorpo de PD-L1 no volume tumoral do modelo de xenoenxerto de camundongo A375.

[077] Figura 4: Efeito do anticorpo de PD-L1 no volume tumoral do modelo de câncer de cólon de camundongo.

[078] Figura 5: Efeito do anticorpo de PD-L1 no volume tumoral do modelo de xenoenxerto de camundongo.

Descrição detalhada da modalidade preferencial |. Terminologia

[079] De modo a entender melhor a presente invenção, certos termos técnicos e científicos são especificamente definidos abaixo. A menos que definido de outra maneira na presente invenção, todos os outros termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o significado comumente entendido pelos técnicos no assunto ao qual essa invenção pertence.

[080] Os códigos de três letras e de uma letra dos aminoácidos usados na presente invenção são descritos em J. biol. chem, 243, p 3558 (1968).

[081] O "anticorpo" descrito na presente invenção refere-se a uma imunoglobulina, que é uma estrutura de cadeia de tetrapeptídeos formada pela conexão de duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas por meio de ligações dissulfeto intercadeias. A composição de aminoácidos e a ordem de arranjo da região constante da cadeia pesada de imunoglobulina são diferentes, portanto, sua antigenicidade também é diferente. De acordo com isso, as imunoglobulinas podem ser divididas em cinco categorias, ou chamadas isotipos de imunoglobulinas, a saber IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, e as cadeias pesadas correspondentes são as cadeias yu, 6, y, a e e, respectivamente. A mesma classe de Igs pode ser dividida em diferentes subclasses de acordo com as diferenças na composição de aminoácidos da região de dobradiça e o número e posição de ligações dissulfeto de cadeia pesada. Por exemplo, IgG pode ser dividido em IBG1, IgG2, IgG3 e IBgG4. A cadeia leve é dividida em uma cadeia kappa ou uma cadeia lambda pela diferença de regiões constantes. Cada um dos cinco tipos de

Ig pode ter uma cadeia kappa ou uma cadeia lambda.

[082] Na presente invenção, a cadeia leve de anticorpos descrita na presente invenção pode incluir adicionalmente uma região constante de cadeia leve compreendendo cadeia «, À humana ou murina, ou variantes das mesmas.

[083] Na presente invenção, a cadeia pesada de anticorpo descrita na presente invenção pode incluir adicionalmente uma região constante de cadeia pesada compreendendo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humano ou murino ou variantes das mesmas.

[084] A sequência de cerca de 110 aminoácidos próxima ao N-terminal das cadeias pesada e leve do anticorpo varia bastante, sendo assim chamada de região variável (região Fv); as demais sequências de aminoácidos próximas ao C- terminal são relativamente estáveis, por isso é chamada região constante. À região variável inclui três regiões hipervariáveis (HVR) e quatro regiões de arcabouço (framework) (FR) relativamente conservadas. As três regiões hipervariáveis determinam a especificidade do anticorpo, também conhecidas como regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Cada região variável de cadeia leve (LCVR) e região variável de cadeia pesada (HCVR) é composta por três regiões CDR e quatro regiões FR, que são arranjadas sequencialmente a partir do terminal amino ao carbóxi-terminal: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As três regiões CDR da cadeia leve são referidas como LCDR1, LCDR2 e LCDR3; as três regiões CDR da cadeia pesada são referidas como HCDR1, HCDR2 e HCDR3. O número e a posição dos resíduos de aminoácidos de CDR do LCVR e HCVR do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno descrito na presente invenção estão em conformidade com as conhecidas regras de numeração de Kabat (LCDR1-3, HCDR1-3).

[085] Anticorpos da presente invenção incluem anticorpos murinos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, preferencialmente anticorpos humanizados.

[086] "Anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que constituem a população são os mesmos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto por possíveis anticorpos variantes (por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou mutações formadas durante a fabricação de preparações de anticorpos monoclonais, e estas variantes estão geralmente presentes em pequenas quantidades). Ao contrário de preparações de anticorpos policlonais, que normalmente contêm diferentes anticorpos que tem como alvo diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal (formulação) tem como alvo um único determinante em um antígeno. Assim, o modificador "monoclonal" indica as propriedades de um anticorpo como obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos e não deve ser interpretado como exigindo a fabricação de anticorpos por qualquer método específico. Por exemplo, o anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser preparado por várias técnicas, incluindo, mas não limitado a, método de hibridoma, método de DNA recombinante, método de exibição de fagos (phage display) e método usando animais transgênicos contendo toda ou parte dos loci de imunoglobulina humana, tal tipo de métodos, bem como outros métodos exemplares para a preparação de anticorpos monoclonais, são descritos na presente invenção.

[087] O termo "anticorpo murino" nesta invenção é um anticorpo monoclonal anti-PD-L1 humano preparado de acordo com o conhecimento e competência na técnica. Os indivíduos de teste são injetados com antígeno PD- L1 durante a preparação, e hibridomas que expressam anticorpos com a sequência ou características funcionais desejadas são isolados. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o anticorpo anti-PD-L1 murino ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode compreender adicionalmente uma região constante de cadeia leve compreendendo a cadeia K, À de murino ou variantes da mesma, ou compreender adicionalmente uma região constante de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 murino ou variantes das mesmas.

[088] Otermo "anticorpo quimérico" é um anticorpo obtido pela fusão da região variável de um anticorpo murino com a região constante de um anticorpo humano, o qual pode reduzir a resposta imune desencadeada pelo anticorpo murino. Para construir um anticorpo quimérico, a primeira coisa é estabelecer um hibridoma que secreta anticorpo monoclonal específico de murino, e então clona o gene da região variável de célula de hibridoma murino e então clona o gene da região constante do anticorpo humano, conforme necessário. O gene da região variável murina é ligado ao gene da região constante humana para formar um gene quimérico para subsequente inserção em um vetor de expressão. Por último, a molécula de anticorpo quimérico é expressa em um sistema eucariótico ou em um sistema procariótico. Numa modalidade preferencial da presente invenção, a cadeia leve de anticorpo quimérico PD-L1 compreende adicionalmente uma região constante da cadeia leve compreendendo uma cadeia «, À humana ou uma variante da mesma. A cadeia pesada de anticorpo do anticorpo quimérico PD-L1 compreende adicionalmente uma região constante de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humano ou uma variante da mesma, de preferência uma região constante de cadeia pesada humana de IgG1, IgG2 ou IgG4 ou uma variante de IgG1 , IgG2 ou IgG4 com mutação de aminoácidos (por exemplo, mutação YTE ou mutação inversa).

[089] O termo "anticorpo humanizado", que também é chamado de anticorpo enxertado de CDR, refere-se a um anticorpo produzido enxertando uma sequência de CDR murina em um arcabouço da região variável de anticorpo humano, ou seja, um anticorpo produzido a partir de um tipo diferente de estrutura de anticorpo de sequências de linha germinal humana.

Ele pode evitar a resposta heterogênea desencadeada pelo anticorpo quimérico que transporta uma grande quantidade de componentes da proteína murina.

Tais sequências de arcabouço podem ser obtidas a partir de um banco de dados público de DNA contendo sequências de genes de anticorpos da linha germinal ou referências publicadas.

Por exemplo, sequências de DNA de linha germinal de genes de região variável de cadeia pesada e cadeia leve humana podem ser obtidas no banco de dados de sequência germinal humana "VBase" (disponível no site: WWww.mrccpe.com.ac.uk/vbase) e em Kabat, EA, etc., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º edição.

De modo a evitar a diminuição de atividade causada pela diminuição de imunogenicidade, a sequência de arcabouço de região variável de anticorpo humano pode ser submetida a uma mutação reversa mínima ou uma mutação inversa para reter atividade.

Os anticorpos humanizados da presente invenção também incluem anticorpos humanizados com maturação por afinidade de CDRs por exibição de fagos.

Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o arcabouço da região variável de anticorpo humano é projetada e selecionada, em que a sequência FR de cadeia pesada na região variável de cadeia pesada de anticorpo é derivada da sequência combinada de cadeia pesada da linha germinal humana IGHV3-23* 04 e hJH4.1 e a sequência combinada de cadeia leve da linha germinal humana IGKV1-12* 01 e hJK4.1. De modo a evitar a diminuição da atividade causada pela diminuição da imunogenicidade, a região variável de anticorpo humano pode ser submetida a uma mutação reversa mínima (mutação inversa, ou seja, os resíduos de aminoácidos na FR do anticorpo humano são mutados para os resíduos de aminoácidos na posição correspondente do anticorpo original) para reter atividade.

[090] O enxerto de CDRs pode resultar em uma diminuição na afinidade de anticorpo de PD-L1 produzido ou no fragmento de ligação ao antígeno do mesmo devido aos resíduos de arcabouço em contato com o antígeno. Tais interações podem ser o resultado de células somáticas altamente mutadas. Portanto, ainda pode ser necessário enxertar tais aminoácidos de arcabouço de doador ao arcabouço de um anticorpo humanizado. Os resíduos de aminoácidos envolvidos na ligação ao antígeno do anticorpo de PD-L1 não humano ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo podem ser identificados examinando a sequência e a estrutura da região variável de anticorpo monoclonal murino. Resíduos na estrutura de doador de CDR que diferem da linha germinal podem ser considerados relacionados. Se a linha germinal mais próxima não puder ser determinada, a sequência poderá ser comparada com a sequência de consenso de subclasse ou a sequência de consenso de sequência murina com uma alta porcentagem de similaridade. Acredita-se que resíduos de estrutura raros sejam o resultado de mutações de alta frequência de células somáticas, desempenhando assim um papel importante na ligação.

[091] O termo "fragmento de ligação ao antígeno" ou "fragmento funcional" de um anticorpo refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, PD-L1). Foi mostrado que fragmentos de um anticorpo de comprimento total podem ser utilizados para executar a função de ligação ao antígeno do anticorpo. Exemplos de fragmentos de ligação indicados no termo "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, isto é, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab'),, um fragmento bivalente que inclui dois fragmentos Fab conectados por ponte(s) dissulfeto na região de dobradiça, (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste no domínio VH e domínio VL de um anticorpo de braço único; (v) um único domínio ou fragmento de dAb (Ward et al. (1989) Nature341: 544-546)) que é composto por um domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementariedade (CDR) isolada ou (vii) opcionalmente uma combinação de duas ou mais CDRs separadas conectadas por um ligante sintético. Adicionalmente, embora os dois domínios VL e VH do fragmento Fv sejam codificados por genes separados, esses genes podem ser combinados por meio de um ligante sintético usando métodos recombinantes, produzindo assim uma única cadeia proteica que é uma molécula monovalente formada pelo emparelhamento das regiões VL e VH (referida como Fv de cadeia simples (scFv); vide, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci EUA 85: 5879- 5883) Tais scFvs também devem ser incluídos no termo "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo. Tais fragmentos de anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas dos técnicos no assunto e triados por sua funcionalidade da mesma maneira que os anticorpos intactos. As frações de ligação ao antígeno podem ser produzidas por tecnologia de DNA recombinante ou por clivagem enzimática ou química de imunoglobulinas intactas. Os anticorpos podem ser anticorpos de diferentes isotipos, por exemplo, IgG (por exemplo, subtipos de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4), anticorpos IgA1, IgA2, IgD, IgE ou IgM.

[092] Os fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção incluem Fab, F(ab')2, Fab', fragmento variável de cadeia única (scFv), domínio dimerizado V (diacorpo), Fv estabilizado com dissulfeto (dsFv), peptídeos contendo CDR, etc..

[093] Fabéum fragmento de anticorpo tendo um peso molecular de cerca de 50.000 obtido pelo tratamento da molécula de anticorpo IgG com uma protease como a papaína (cliva o resíduo de aminoácido na posição 224 da cadeia H), que possui atividade de ligação ao antígeno dos fragmentos, em que cerca de metade do lado N-terminal da cadeia H e toda a cadeia L são conectados por ligações dissulfeto.

[094] O Fab da presente invenção pode ser produzido pelo tratamento do anticorpo monoclonal da presente invenção que reconhece especificamente e liga-se à sequência de aminoácidos da região extracelular de PD-L1 humano ou sua estrutura tridimensional com papaína. Adicionalmente, o Fab pode ser produzido inserindo o DNA que codifica o Fab do anticorpo em um vetor de expressão procariótico ou vetor de expressão eucariótico e transformando o vetor em procariota ou eucariota para expressar o Fab.

[095] F(ab')2 é um fragmento de anticorpo tendo um peso molecular de cerca de 100.000, clivando as porções inferiores de duas ligações dissulfeto na região de dobradiça de IgG com a enzima pepsina, que possui atividade de ligação ao antígeno e duas regiões Fab conectadas nas posições de dobradiça.

[096] O F(ab')2 da presente invenção pode ser produzido pelo tratamento do anticorpo monoclonal da presente invenção que reconhece especificamente e liga-se à sequência de aminoácidos da região extracelular de PD-L1 humano ou sua estrutura tridimensional com pepsina. Além disso, o F(ab')2 pode ser produzido conectando Fabs descritos abaixo com ligações tioéter ou ligações dissulfeto.

[097] Fab' é um fragmento de anticorpo tendo um peso molecular de cerca de 50.000 obtido pela clivagem da ligação dissulfeto da região de dobradiça de F(ab')2 descrita acima, que possui atividade de ligação ao antígeno. O Fab' da presente invenção pode ser produzido pelo tratamento de F(ab')2 da presente invenção que reconhece especificamente e liga-se à sequência de aminoácidos da região extracelular de PD-L1 ou sua estrutura tridimensional com um agente redutor como ditiotreitol.

[098] Além disso, o Fab' pode ser produzido inserindo o fragmento de Fab' que codifica DNA do anticorpo em um vetor de expressão procariótico ou vetor de expressão eucariótico e transformando o vetor em um procariota ou eucariota para expressar o Fab".

[099] Os termos "fragmento variável de cadeia simples", "Fv de cadeia simples" ou "scFv" referem-se à molécula que inclui um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (ou região; VH) e um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (ou região; VL) conjugadas por um ligante. Tais moléculas de scFv podem ter uma estrutura geral: NH2-VL-ligante-VH-COOH ou NH2-VH-ligante-VL- COOH. Ligantes adequados do estado da técnica consistem em sequências repetidas de aminoácidos GGGGS ou variantes dos mesmos, por exemplo, usando 1 a 4 variantes repetidas (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sei. USA9O: 6444-6448). Outros ligantes que podem ser usados para a presente invenção são descritos por Alfthan et al. (1995), Protein Eng.8: 725-731, Choi et al. (2001), Eur.J.Immuno 1.31: 94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res.56: 3055- 3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293: 41-56 e Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.

[100] O scFv da presente invenção pode ser produzido usando as seguintes etapas: obter o cDNA que codifica VH e VL do anticorpo monoclonal da presente invenção que reconhece especificamente e se liga à sequência de aminoácidos da região extracelular do PD-L1 humano ou sua estrutura tridimensional, e construir o scFv que codifica DNA, inserir o DNA em um vetor de expressão procariótico ou eucariótico e então transformar o vetor de expressão em um procariota ou eucariota para expressar o scFv.

[101] O diacorpo é um fragmento de anticorpo no qual o scFv é dimerizado e possui atividade de ligação ao antígeno bivalente. Dois antígenos em uma atividade bivalente de ligação ao antígeno podem ser iguais ou diferentes.

[102] O diacorpo da presente invenção pode ser produzido usando as seguintes etapas: obter o cDNA que codifica VH e VL do anticorpo monoclonal da presente invenção que reconhece especificamente e se liga à sequência de aminoácidos da região extracelular humana de PD-L1 ou sua estrutura tridimensional, e construir o DNA que codifica scFv, de modo que o comprimento da sequência de aminoácidos do ligante peptídico seja de 8 resíduos ou menos, inserir o DNA em um vetor de expressão procariótico ou eucariótico e depois transformar o vetor de expressão em um procariota ou eucariota para expressar o diacorpo.

[103] OdsFvé obtido pela ligação de um polipeptídeo no qual um resíduo de aminoácido em cada um dos VH e VL é substituído por um resíduo de cisteína via ligação dissulfeto entre os resíduos de cisteína. Os resíduos de aminoácidos substituídos por resíduos de cisteína podem ser selecionados de acordo com um método conhecido (Protein Engineering, 7.697 (1994)) com base na previsão da estrutura tridimensional do anticorpo.

[104] O dsFv da presente invenção pode ser produzido usando as seguintes etapas: obter o cDNA que codifica VH e VL do anticorpo monoclonal da presente invenção que reconhece especificamente e se liga à sequência de aminoácidos da região extracelular do PD-L1 humano ou sua estrutura tridimensional, e construir o dsFv que codifica DNA, inserir o DNA em um vetor de expressão procariótico ou eucariótico e então transformar o vetor de expressão em um procariota ou eucariota para expressar o dsFv.

[105]) Um peptídeo contendo CDR compreende uma ou mais CDRs derivadas de VH ou VL. Múltiplas CDRs contendo peptídeo podem ser conjugadas diretamente ou via um ligante peptídico adequado.

[106] Peptídeos contendo CDR da presente invenção podem ser produzidos usando as seguintes etapas: construir as CDRs que codificam DNA derivado a partir de VH e VL do anticorpo monoclonal da presente invenção que reconhece especificamente e se liga à sequência de aminoácidos da região extracelular do PD-L1 humano ou sua estrutura tridimensional, inserir o DNA em um vetor de expressão procariótico ou eucariótico e então transformar o vetor de expressão em um procariota ou eucariota para expressar o peptídeo. O peptídeo contendo CDR também pode ser produzido por um método de síntese química, como o método Fmoc ou o método tBoc.

[107] O termo "CDR" refere-se a uma das seis regiões hipervariáveis no domínio variável de um anticorpo que contribui principalmente para a ligação ao antígeno. Uma das definições usadas mais comuns das 6 CDRs é fornecida por Kabat EA et al. ((1991) Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication 91-3242). Conforme usado na presente invenção, a definição de CDRs de Kabat se aplica a CDR1, CDR2 e CDR3 (CDR L1, CDR L2, CDR L3 ou L1, L2, L3) do domínio variável de cadeia leve e CDR1, CDR2 e CDR3 (CDR H1, CDR H2, CDR H3 ou H2, H3) do domínio variável de cadeia pesada.

[108] O termo "arcabouço de anticorpo", como usado na presente invenção, refere-se a uma parte do domínio variável VL ou VH, que serve como um suporte para a alça de ligação ao antígeno (CDR) do domínio variável. Em essência, é um domínio variável sem CDR.

[109] A "variante convencional" da região constante de cadeia pesada do anticorpo humano e da região constante de cadeia leve do anticorpo humano refere-se à variantes da região constante de cadeia pesada ou da região constante de cadeia leve derivada de humano que não altera a estrutura e a função da região variável de um anticorpo, que foi divulgado no estado da técnica. Variantes exemplares compreendem variantes de região constante de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 que sofrem modificação direcionada ao sítio e substituição de aminoácidos da região constante de cadeia pesada, substituição específica tal como as conhecidas no estado da técnica: Mutações YTE, mutação L234A e /ou mutação L235A ou mutação S228P, ou uma mutação para obter uma estrutura knob into hole (de modo que a cadeia pesada do anticorpo tenha uma combinação de knob-Fc e hole-Fc) ou uma combinação dos mutantes acima mencionados. Essas mutações foram confirmadas para fazer com que o anticorpo tenha novas propriedades, mas não alteram a função da região variável do anticorpo.

[110] O termo "epítopo" ou "determinante antigênico" refere-se a uma parte de um antígeno à qual uma imunoglobulina ou anticorpo se liga especificamente (por exemplo, certas partes da molécula de PD-L1). Um epítopo inclui tipicamente pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos consecutivos ou não consecutivos em uma conformação espacial única. Vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols em Methods in Molecular Biology, vol.66, GE Morris, Ed. (1996).

[111] Os termos "especificamente ligar", "seletivamente ligar", "ligar seletivamente" e "ligar especificamente" dizem respeito à ligação de um anticorpo a epítopos em um antígeno predeterminado. Geralmente, os anticorpos se ligam antígenos com uma afinidade (KD) de menos que cerca de 10ºM, como menos que cerca de 10ºM, 10*ºM, 10ººM ou menos.

[112] O termo "KD" ou "Kd" refere-se à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno específica. Geralmente, os anticorpos da presente invenção se ligam à PD-L1 com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) de menos que cerca de 107M, tal como menos que cerca de 10 ºM, 10ºM ou 10ººM ou menos, por exemplo, conforme medido por um instrumento BIACORE usando a tecnologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR).

[113] Quando o termo "competição" é usado no caso de proteínas de ligação aos antígenos que competem pelo mesmo epítopo (como proteínas de ligação aos antígenos neutralizantes ou anticorpos neutralizantes), significa competição entre as proteínas de ligação aos antígenos, o que é determinado pelo seguinte ensaio: No ensaio, a proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo ou um fragmento imunologicamente funcional do mesmo) a ser testado, impede ou inibe (por exemplo, reduz) a ligação de uma proteína de ligação ao antígeno de referência (por exemplo, um ligante ou anticorpo de referência) a um antígeno comum (por exemplo, um antígeno PD-L1 ou um fragmento do mesmo). Vários tipos de ensaios de ligação competitiva podem ser usados para determinar se uma proteína de ligação ao antígeno compete com outra, como: radioimunoensaio direto ou indireto (RIA) de fase sólida, imunoensaio enzimático (EIA) direto ou indireto de fase sólida, ensaio de competição em sanduíche (vide, por exemplo, Stahli et al., 1983, Methodsin Enzymology 9: 242-253); EIA de biotina-avidina direta de fase sólida (vide, por exemplo, Kirkland et al., 1986, J.

Immunol. 137: 3614-3619), ensaio de rotulagem direta em fase sólida, ensaio em sanduíche de rotulagem direta de fase sólida (vide, por exemplo, Harlow e Lane , 1988, (Antibodies, A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Press); RIA de rotulagem direta de fase sólida usando 1-125 (vide, por exemplo, Morel et al., 1988, Molec.

Immunol.25: 7-15); EIA de biotina- avidina direta de fase sólida (vide, por exemplo, Cheung, et al., 1990, Virology176: 546-552); e RIA de rotulagem direta (Moldenhauer et al., 1990, Scand.J.Immunol.32: 77-82). Geralmente, o ensaio envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou célula que contém a proteína de ligação ao antígeno de detecção não rotulado ou a proteína de ligação ao antígeno de referência rotulada.

A inibição competitiva é medida medindo o número de rótulos que se ligam a uma superfície sólida ou célula na presença da proteína de ligação ao antígeno testada. Geralmente, há um excesso de proteínas de ligação ao antígeno testadas. As proteínas de ligação ao antígeno identificadas por ensaio competitivo (proteína de ligação ao antígeno competitivo) incluem: uma proteína de ligação ao antígeno que se liga ao mesmo epítopo que a proteína de ligação ao antígeno de referência; e uma proteína de ligação ao antígeno que se liga ao epítopo adjacente suficientemente perto do epítopo de ligação da proteína de ligação ao antígeno de referência, enquanto os dois epítopos impedem espacialmente a ligação um do outro. Detalhes adicionais a respeito dos métodos usados para determinar ligações competitivas são fornecidos nas modalidades da presente invenção. Geralmente, quando há um excesso de proteínas de ligação aos antígenos concorrentes, ele inibe (por exemplo, reduz) pelo menos 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% ou 75% ou mais da ligação específica da proteína de ligação ao antígeno de referência ao antígeno comum. Em alguns casos, a ligação é inibida em pelo menos 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97% ou 97% ou mais.

[114] O termo "molécula de ácido nucleico", como usado na presente invenção, refere-se a ambas as moléculas de DNA e moléculas de RNA. À molécula de ácido nucleico pode ser de fita simples ou dupla, preferencialmente DNA de fita dupla. Um ácido nucleico é "efetivamente ligado" quando é colocado em um relacionamento funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, se um promotor ou intensificador afeta a transcrição de uma sequência de codificação, o promotor ou intensificador é efetivamente ligado à sequência de codificação.

[115] O termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico a qual foi ligada. Em uma modalidade, o vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alça de DNA circular de fita dupla à qual outros segmentos de DNA podem ser ligados. Em outra modalidade, o vetor é um vetor viral, em que outros segmentos de DNA podem ser ligados ao genoma viral. Os vetores divulgados na presente invenção são capazes de replicação autônoma em células hospedeiras nas quais foram introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos com origens bacterianas de replicação e vetores de mamíferos epissomais) ou podem ser integrados ao genoma da célula hospedeira após a transfecção para a célula hospedeira, desse modo replicando junto com o genoma do hospedeiro (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais).

[116] Métodos para produzir e purificar anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno são bem conhecidos no estado da técnica, como os Capítulos 5-8 e 15, Using Antibodies: A Laboratory Manual, publicado por Cold Spring Harbor. Por exemplo, os camundongos podem ser imunizados com PD-L1 humano ou fragmentos do mesmo, e os anticorpos resultantes podem ser renaturados, purificados e o aminoácido pode ser sequenciado usando métodos convencionais. Os fragmentos de ligação ao antígeno também podem ser preparados por métodos convencionais. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno, conforme definido na invenção, é geneticamente modificado para adicionar uma ou mais regiões de FR humanas a uma região de CDR não humana. A sequência de linha germinal de FR humana pode ser obtida alinhando o banco de dados de genes de linha germinal de região variável de anticorpo humano IMGT e o software MOE no site da ImMunoGeneTics (IMGT) http://imgt.cines.fr ou no Journal of Immunoglobulins, 2001ISBN012441351.

[117] O termo "célula hospedeira" refere-se a uma célula na qual um vetor de expressão foi introduzido. As células hospedeiras podem incluir bactérias, microrganismos, células vegetais ou animais. Bactérias que são fáceis de serem transformadas incluem membros das Enterobacteriaceae, como cepas de Escherichia coli ou Salmonella; Bacilillaceae, como Bacillus subtilis;

Pneumococcus; Streptococcus e Haemophilus influenzae. Os microrganismos adequados incluem Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. Linhagens celulares hospedeiras de animais adequadas incluem células de CHO (Linhagem celular de Ovário de Hamster Chinês) e células NSO.

[118] Osanticorpos manipulados ou os fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção podem ser preparados e purificados usando métodos convencionais. Por exemplo, sequências de cDNA que codificam cadeias pesadas e leves podem ser clonadas e recombinadas em um vetor de expressão GS. O vetor de expressão de imunoglobulina recombinante pode ser transfectado de maneira estável em células de CHO. Como um estado da técnica mais recomendado, os sistemas de expressão em mamíferos podem causar glicosilação de anticorpos, especialmente em sítios de N-terminais altamente conservados da região Fc. Clones estáveis são obtidos expressando anticorpos que se ligam especificamente a PD-L1 humano. Clones positivos foram expandidos em meio isento de soro no biorreator para produzir anticorpos. O meio de cultura em que o anticorpo é secretado pode ser purificado por técnicas convencionais, por exemplo, uma coluna A ou G de Sepharose FF com tampão ajustado. Os componentes não especificamente ligados são removidos por lavagem. O anticorpo ligado foi eluído pelo método de gradiente de pH e os fragmentos de anticorpo foram detectados por SDS-PAGE e agrupados. O anticorpo pode ser concentrado por filtração usando um método convencional. Misturas solúveis e polímeros também podem ser removidos por métodos convencionais, como peneira molecular ou troca iônica. O produto resultante precisa ser congelado imediatamente, como -70º C, ou liofilizado.

[119] Quando aplicado a um animal, humano, indivíduo experimental, célula, tecido, órgão ou fluido biológico, "administrar" e "tratar" dizem respeito ao contato de um fármaco exógeno, agente terapêutico, agente diagnóstico ou composição a animal, humano, indivíduo, célula, tecido, órgão ou fluido biológico. "Administrar" e "tratar" podem se referir a, por exemplo, tratamento, farmacocinética, diagnóstico, pesquisa e métodos experimentais. O tratamento de uma célula inclui o contato de um reagente com uma célula e o contato de um reagente com um fluido, em que o fluido está em contato com a célula. "Administrar" e "tratar" também significam o tratamento de células in vitro e ex vivo por um agente, diagnóstico, composição de ligação ou por outra célula. Quando aplicado a um indivíduo humano, veterinário ou de pesquisa, "tratar" refere-se à tratamento terapêutico, prevenção ou medidas preventivas, aplicações de pesquisa e diagnóstico.

[120] "Terapia" significa a administração de um agente terapêutico para uso interno ou externo, tal como uma composição compreendendo qualquer um dos compostos de ligação da presente invenção, a um paciente apresentando um ou vários sintomas da doença à qual os agentes terapêuticos são conhecidos por terem efeito terapêutico. Geralmente, um agente terapêutico é administrado em uma quantidade para aliviar efetivamente um ou mais sintomas da doença em um paciente ou população em tratamento para induzir a deterioração de tais sintomas ou inibir o desenvolvimento de tais sintomas em qualquer grau clinicamente mensurável. A quantidade de agente terapêutico (também referido como "quantidade terapeuticamente eficaz") que é eficaz em aliviar sintomas de qualquer doença específica, pode variar dependendo de vários fatores, como estado da doença, idade e peso do paciente e a capacidade do fármaco em ser eficaz da maneira desejada no paciente. Pode se avaliar se os sintomas da doença foram aliviados por meio de qualquer método de teste clínico que um médico ou outro profissional de saúde geralmente use para avaliar a gravidade ou progressão dos sintomas. Embora modalidades da presente invenção (por exemplo, métodos ou artigos de tratamento) possam não ser eficazes para aliviar cada sintoma da doença alvo, eles devem aliviar os sintomas da doença alvo em um número estatisticamente significativo de pacientes confirmados por qualquer método de teste estatístico conhecido na técnica como teste t de Student, teste qui-quadrado, teste U de Mann e Whitney, teste Kruskal-Wallis (teste H), teste Jonckheere-Terpstra e teste Wilcoxon.

[121] "Modificação conservadora" ou "reposição ou substituição conservadora" refere-se à substituição de aminoácidos de proteína por outros aminoácidos com características similares (como carga, tamanho de cadeia lateral, hidrofobicidade/hidrofilicidade, conformação e rigidez de cadeia principal, etc.), de modo que mudanças podem ser feitas frequentemente sem alterar a atividade biológica da proteína. Os técnicos no assunto reconhecem que, em geral, substituições de aminoácidos únicos em regiões não essenciais do polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica (vide, por exemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., P224 (4º edição)). Adicionalmente, é improvável que a substituição de aminoácidos estrutural ou funcionalmente semelhantes interrompa a atividade biológica.

[122] Uma "quantidade eficaz" inclui uma quantidade suficiente para melhorar ou prevenir os sintomas ou condições de uma doença médica. Uma quantidade eficaz também significa uma quantidade suficiente para permitir ou facilitar o diagnóstico. A quantidade eficaz para um paciente em particular ou indivíduo veterinário pode variar dependendo de fatores como a condição a ser tratada, a saúde geral do paciente, a via e dosagem de administração e a gravidade dos efeitos colaterais. A quantidade eficaz pode ser a dose máxima ou regime de dosagem para evitar efeitos colaterais ou efeitos tóxicos significativos.

[123] "Exógeno" refere-se a uma substância que é produzida fora do organismo, célula ou corpo humano, conforme apropriado. "Endógeno" refere-

se a uma substância que é produzida em uma célula, organismo ou corpo humano, conforme apropriado.

[124] "Homologia" refere-se à similaridade de sequência entre duas sequências polinucleotídicas ou entre dois polipeptídeos. Quando as posições em duas sequências comparadas são ocupadas pelas mesmas bases ou subunidades de monômeros de aminoácidos, por exemplo, se cada posição de duas moléculas de DNA é ocupada por adenina, então as moléculas são homólogas nessa posição. A porcentagem de homologia entre duas sequências é uma função do número de posições correspondentes ou homólogas compartilhadas pelas duas sequências divididas pelo número de posições comparadas x 100. Por exemplo, quando as sequências são comparadas de maneira ótima, se 6 de 10 posições nas duas sequências corresponderem ou forem homólogas, as duas sequências serão então 60% homólogas; se 95 de 100 posições nas duas sequências corresponderem ou forem homólogas, as duas sequências serão 95% homólogas. Em geral, são feitas comparações quando as duas sequências são comparadas para a maior porcentagem de homologia.

[125] Como usado na presente invenção, os termos "célula", "linhagem celular" e "cultura celular" são usados intercambiavelmente e todos esses nomes incluem sua prole. Assim, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem células de teste primárias e culturas delas derivadas, independentemente do número de passagens. Também deve ser entendido que, devido a mutações intencionais ou não intencionais, toda a prole não pode ter exatamente o mesmo conteúdo de DNA. A prole mutante que têm a mesma atividade funcional ou biológica que os triados originalmente nas células transformadas estão incluídos. Onde diferentes nomes são significados, o significado é claramente entendido a partir do contexto.

[126] Como usado na presente invenção, "reação em cadeia de polimerase" ou "PCR" refere-se a um procedimento ou técnica em que uma quantidade específica de ácido nucleico, RNA e/ou DNA é amplificada como descrito, por exemplo, na Patente US Nº 4,683,195. Geralmente, é necessário obter informações de sequência a partir do terminal ou fora da região alvo, para que os iniciadores oligonucleotídicos que sejam idênticos ou semelhantes em sequência às fitas correspondentes do modelo a ser amplificado possam ser projetados. Os nucleotídeos terminais 5' dos dois iniciadores podem coincidir com o terminal do material a ser amplificado. PCR pode ser utilizada para amplificar sequências de RNA específicas, sequências de DNA específicas derivadas do DNA genômico total e sequências de cDNA, fago ou plasmídeo transcritas a partir do RNA celular total. Vide geralmente Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51: 263; editado por Erlich, (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, NY). A PCR usada na presente invenção é considerada um, mas não o único exemplo, de um método de reação da polimerase de ácido nucleico para amplificar a amostra de teste de ácido nucleico, incluindo o uso de ácidos nucleicos conhecidos como iniciadores e polimerases de ácido nucleico para amplificar ou produzir porções específicas de ácidos nucleicos.

[127] "Opcional" ou "opcionalmente" significa que o evento ou ambiente descrito posteriormente pode, mas não precisa, ocorrer, e a descrição inclui ocasiões em que o evento ou ambiente ocorre ou não ocorre. Por exemplo, "opcionalmente compreendendo 1 a 3 regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo" significa que uma região variável de cadeia pesada de anticorpo de uma sequência específica pode, mas não precisa, estar presente.

[128] "Composição farmacêutica" significa uma mistura contendo um ou mais compostos ou um sal ou pró-fármaco fisiológico/farmaceuticamente aceitável do mesmo descrito na presente invenção com outros componentes químicos, tais como veículos e excipientes fisiológicos/farmaceuticamente aceitáveis. O objetivo da composição farmacêutica é promover a administração ao organismo, facilitando assim a absorção do princípio ativo e exercendo a atividade biológica.

[129] Além disso, a presente invenção inclui um medicamento para o tratamento de uma doença associada a células positivas para PD-L1, compreendendo um anticorpo monoclonal ou um fragmento de anticorpo do mesmo da presente invenção como um princípio ativo.

[130] Não há limitação nas doenças associadas ao PD-L1, desde que sejam doenças associadas ao PD-L1, por exemplo, a resposta terapêutica induzida pelas moléculas divulgadas na presente invenção inclui a ligação ao PD-L1 humano e o bloqueio da ligação de PD-L1 ao seu ligante PD-1 e B7-1, ou exterminar células tumorais que superexpressam PD-L1. Portanto, as moléculas da presente invenção são muito úteis para aqueles que sofrem de um tumor ou câncer, preferencialmente melanoma, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de pulmão, carcinoma gástrico, câncer intestinal, câncer renal, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de bexiga, etc., quando em preparações e formulações adequadas para aplicações terapêuticas.

[131] Além disso, a presente invenção refere-se a um método para imunodetecção ou determinação de PD-L1, um reagente para imunodetecção ou determinação de PD-L1, um método para imunodetecção ou determinação de células que expressam PD-L1 e um agente diagnóstico para diagnosticar doenças associadas com células positivas para PD-L1, que compreende o anticorpo monoclonal ou o fragmento de anticorpo que reconhece especificamente o PD-L1 humano e se liga à sequência de aminoácidos da região extracelular ou à estrutura tridimensional do mesmo como um princípio ativo.

[132] Na presente invenção, o método para detectar ou determinar a quantidade de PD-L1 pode ser qualquer método conhecido. Por exemplo, inclui detecção imunológica ou método de medição.

[133] O método de imunodetecção ou determinação é um método para detectar ou determinar a quantidade de anticorpo ou antígeno usando um antígeno ou anticorpo rotulado. Exemplos do método de imunodetecção ou determinação incluem radioimunoensaio usando radioimunoensaio (RIA), imunoensaio enzimático (EIA ou ELISA), imunoensaio fluorescente (FIA), imunoensaio luminescente, western blotting, método físico-químico, etc.

[134] As doenças acima mencionadas associadas às células positivas para PD-L1 podem ser diagnosticadas detectando ou medindo células que expressam PD-L1 com os anticorpos monoclonais ou os fragmentos de anticorpos das mesmas da presente invenção.

[135] Demodo a detectar células que expressam um polipeptídeo, podem ser usados um método conhecido de imunodetecção, preferencialmente um método de imunoprecipitação, um método de coloração de células fluorescentes, um método imuno-histoquímico e similares. Além disso, pode ser usado um método de coloração de anticorpo fluorescente usando o sistema FMAT8100HTS (Applied Biosystem).

[136] Na presente invenção, não há restrição específica à amostra viva para detectar ou medir PD-L1, desde que haja a possibilidade de incluir células que expressam PD-L1, como células de tecido, sangue, plasma, soro, suco pancreático, urina, fezes, fluido de tecido ou fluido de cultura.

[137] O agente diagnóstico contendo o anticorpo monoclonal ou o fragmento de anticorpo do mesmo da presente invenção pode conter adicionalmente um reagente para realizar uma reação antígeno-anticorpo ou um reagente para testar a reação de acordo com o método de diagnóstico, conforme necessário. Reagentes para realizar a reação antígeno-anticorpo incluem tampões, sais e similares. Reagentes para detecção incluem reagentes comumente usados em métodos de imunodetecção ou determinação, como um segundo anticorpo rotulado que reconhece o anticorpo monoclonal, o fragmento de anticorpo do mesmo ou conjugado do mesmo e um substrato correspondente ao rótulo e similares.

[138] Pormeio de modificação, os anticorpos PD-L1 com maior afinidade, atividade de exterminação de tumores mais fortes e menor imunogenicidade são obtidos na presente invenção.

ll. Modalidades e exemplos de teste

[139] A invenção é descrita adicionalmente abaixo com referência às modalidades, mas essas modalidades não se destinam a limitar o escopo da invenção. Métodos experimentais sem especificar determinadas condições nas modalidades da presente invenção estão geralmente de acordo com as condições convencionais, como o Using Antibodies: A Laboratory Manual, e Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor; ou as condições propostas pelos fabricantes de matérias-primas ou commodities. Reagentes são reagentes convencionais disponíveis comercialmente, a menos que especificado de outra maneira.

Modalidade 1. Construção da biblioteca de levedura maturada por afinidade de anticorpo de PD-L1 e validação da biblioteca

[140] A fim de obter melhores anticorpos anti-PD-L1 humano, uma biblioteca de leveduras maturada por afinidade de anticorpos scFv, a partir da qual os novos anticorpos de PD-L1 humanos foram triados, foi projetada e preparada com base nos anticorpos HRPOOO52 e HRPOOO49. Sequências das CDRs, as regiões variáveis de cadeia leve e as regiões variáveis de cadeia pesada de HRPOOO52 e HRPOOO49 são todas derivadas do WOZ2017084495A1. As sequências específicas são as seguintes:

HRPOOO49: 9-2 (H2/L10) I8G4 (AA) (S5228P)

[141] Cadeia pesada: Sequência de cadeia pesada do anticorpo HRPOOO49: (SEQ ID NO: 1)

QVOLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGYISYTGST YYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRV VSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

[142] A sequência do gene que codifica a cadeia pesada do anticorpo HRPOOO49: (SEQ ID NO: 2)

CAGGTGCAACTGCAGGAGAGCGGCCCCEGGACTEGTGAAACCCTCCCAGACCCT GAGCCTGACCTGTACCGTGAGCGGCEGGCAGCATCAGCAACGACTACTGGACTTGGAT CAGGCAGCACCCCGGCAAAGGCCTGGAGTACATCGGCTACATCAGCTACACCGGCTCE CACCTACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGGGTGACCATCAGCCGGGACACCAGCAA GAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCTGCCGACACAGCEGTGTACTA

TTGTGCCAGAAGCGGCGGATGGCTGGCCCCTTTCGACTACTGGGGCAGAGGCACCET GGTGACCGTGAGCAGCGCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCeTGGCECCCTG

CTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCETGGGCTEGCCTGETCAAGGACTACTT CCCCGAACCGGTGACGEGTETCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTECACAC CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTG CCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGC AACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGC CCAGCACCTGAGGCTGCTGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAMACCCAAGG ACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTEGTEGACGETGAGCC AGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAAT GCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGT CCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTC CAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCEGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC CCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCA GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTG GGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACT CCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGG AGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACA GAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA

[143] Cadeia leve: Sequência de cadeia leve do anticorpo HRPOOO49: (SEQ ID NO: 3)

DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQOPPKLLIYG ASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOQWKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC

[144] A sequência de gene que codifica a cadeia leve do anticorpo HRPOOO49: (SEQ ID NO: 4)

GACATCGTGATGACCCAGAGCCCTGATAGCCTGGCTGTGAGCCTGGGCGAGAG AGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGTTCTACCATAGCAACCAGAAGCA CAGCCTCGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAACCCCCCAAGCTGCTGATCTACGG CGCCAGCACAAGAGAGAGCGGAGTGCCCGATAGGTTCAGCGGCAGCGGATCCEGGCA CCGATTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACT GCCAGCAGTACTACGGCTACCCTTACACCTTCGGCGGCEGCACCAAGGTGGAGATCA AGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAA GTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACA GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAG

CTCGCCCEGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA HRPOOO52: 24D5 (GF) IgG4 (AA) (S228P)

[145] Cadeia pesada: Sequência de cadeia pesada do anticorpo HRPOOOS52: (SEQ ID NO: 5)

QVOQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVROAPGOGLEWMGRIG PNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQ GTIVIVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEA AGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVOQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTYRVVSVLTVLHOQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDK SRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

[146] A sequência de gene que codifica a cadeia pesada do anticorpo HRPOOOS5?2: (SEQ ID NO: 6)

CAGGTGCAACTGGTGCAGAGCGGTGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCAAGCG TGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGG TGAGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAGTEGGATGGGCAGGATCGGGCCCAACAGT GGTTTCACTAGCTACAATGAAAAGTTCAAGAACAGGGTAACCATGACCAGGGACACC TCCACCAGCACAGTGTATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGT GTACTACTGTGCCAGAGGCGGCAGCAGCTACGACTACTTCGACTATIGGGGCCAGGEG CACCACCGTGACCGTGAGCAGTGCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCETGGCG CCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGETCAAGGAC TACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCETGACCAGCGGCGTG CACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGA CCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGC CCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCAC CATGCCCAGCACCTGAGGCTGCTGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACC CAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTEGACGT GAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGC ATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG GTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGC AGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGA ACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCEGTGG AGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTG GACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG CAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTAC ACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA

[147] Cadeia leve: Sequência de cadeia leve do anticorpo HRPOOOS2: (SEQ ID NO: 7)

DIVLTOSPASLAVSPGORATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASN LESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQOSFEDPLTFGQGTKLEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOQWKVDNALOSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNRGEC

[148] A sequência de gene que codifica a cadeia leve do anticorpo HRPOOO52: (SEQ ID NO: 8)

GACATCGTGCTGACCCAGAGTCCCGCCTCACTTIGCEGTGAGCCCEGGTCAGAGG GCCACCATCACCTGTAGGGCCAGCGAGAGCGTGAGCATCCACGGCACCCACCTGATG CACTGGTATCAACAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAMACTGCTGATCTACGCCEGCCAGE AACCTGGAGAGCGGCGTGCCEGCCAGGTTCAGEGGCTCEGGCAGCEGGCACEGACTT CACCCTCACTATCAACCCEGTGGAGGCCEGAGGACACCEGCCAACTACTACTGCCAGCA GAGCTTCGAGGACCCCCTGACCTTICGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTAC GGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGA ACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGT GGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAG GACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGA CTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCC CGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA

[149] A parte sublinhada na sequência de anticorpos acima indica parte da região variável do anticorpo e a outra forma padronizada representa parte da região constante do anticorpo.

[150] Construção de biblioteca de leveduras: iniciadores degenerados foram projetados, e os aminoácidos mutantes projetados foram introduzidos nas bibliotecas de anticorpos HRPOOO49 e HRPOOOS52 por PCR. Em seguida, o QC da biblioteca foi verificado pelo método de sequenciamento de segunda geração, no qual sete bibliotecas de leveduras de anticorpos com capacidade de 10º foram construídas com base nas sequências HRPOOO49 e HRPOOOS2.

Modalidade 2: Preparação de antígeno

[151] A proteína de fusão PD-L1-lGG1Fc humana foi projetada e sintetizada, e purificada com a coluna de afinidade de proteína A para obter alta pureza de proteína PD-L1-Fc recombinante para detectar a ligação do anticorpo anti-PD-L1 ao antígeno.

[152] PD-L1-lgG1Fc humano: (SEQ ID NO: 9)

MEFGLSWLFLVAILKGVOQCFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVY WEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLODAGVYRC MISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCOAEGYPKAEVIWTSSDHQV LSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNER EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVYMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[153] Nota: peptídeo sinal + domínio extracelular + h/gG1Fc.

Modalidade 3. Triagem de anticorpos

[154] A biblioteca de HRPOOO52 usou o antígeno PD-L1-hlgG1Fc humano biotinilado e passou por duas rodadas de triagem de MACS (grânulos magnéticos de estreptomicina, Invitrogen) e duas rodadas de triagem de FACS (BD FACSAria"M FUSION). Em seguida, cerca de 400 culturas monoclonais de levedura foram selecionadas e induzidas a expressar. O FACS (BD FACSCanto Il) foi usado para detectar a ligação de levedura monoclonal ao antígeno PD-L1-hlgG1Fc humano e a levedura monoclonal com maior afinidade do que o anticorpo HRPOOOS5?2 do tipo selvagem foi selecionada para verificação de sequência. Após comparar e analisar os clones sequenciados e remover sequências redundantes, as sequências não redundantes foram convertidas em IgG de comprimento total (v1, «) para expressão de células de mamíferos. Os anticorpos de comprimento total após purificação por afinidade foram submetidos à determinação de afinidade usando BIAcore"“ X-100 (GE Life Sciences).

[155] A biblioteca de HRPOOO049 usou o antígeno PD-L1-hlgG1Fc humano biotinilado e o PD-L1-hligG1Fc de camundongo biotinilado e passou por três rodadas de triagem de MACS e três rodadas de triagem de FACS. Em seguida, cerca de 400 culturas monoclonais de levedura foram selecionadas e induzidas a expressar. FACS foi usado para detectar a ligação de levedura monoclonal ao antígeno PD-L1-hIlgG1Fc humano e antígeno PD-L1-hlgG1Fc de camundongo, e a levedura monoclonal que combina antígeno PD-L1-hlgG1Fc humano e antígeno PD-L1-hlgG1Fc de camundongo foi selecionada para verificação de sequência. Após remover sequências redundantes, as sequências não redundantes foram convertidas em IgG de comprimento total (y1, «) para expressão de células de mamíferos. Os anticorpos de comprimento total após purificação por afinidade foram submetidos a determinação de afinidade usando BIAcore"“ X-100 (GE Life Sciences).

[156] Após a triagem, a sequência da região CDR do anticorpo foi selecionada.

Anticorpo da biblioteca de HRPOOO049 mutante

[157] Os clones selecionados com base nas sequências da biblioteca de HRPOOO49 mutante são diferentes de HRPOOO49 em HCDR1 e HCDR?2. Sequências de CDR relacionadas ou fórmulas gerais e suas regiões variáveis de cadeia pesada correspondentes são descritas abaixo.

HCDR1 é DGSAYWS (SEQ ID NO: 10) ou NDYWT (SEQ ID NO: 11) HCDR2 XaISX2AGSTYX3TPSLKG SEQ ID NO: 12 HCDR3 SGGWLAPFDY SEQ ID NO: 13 LCDR1 KSSQSLFYHSNQKHSLA SEQ ID NO: 14 LCDR2 GASTRES SEQ ID NO: 15 LCDR3 QQYYGYPYT SEQ ID NO: 16

[158] A fórmula geral de sequência da região variável de cadeia pesada relacionada é obtida da seguinte maneira: QVQOLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISDGSAYWSWIRQHPGKGLEYIGX1ISX? AGSTYX3TPSLKGRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTL VTVSS (SEQ ID NO: 17) Ou QVQOLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGX1ISX2AG STYX3TPSLKGRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVT VSS (SEQ ID NO: 18) X1 é selecionado a partir de F ou M, X? é selecionado a partir de R ou V, X; é selecionado a partir de N ou H na HCDR2 acima da SEQID NO. 12 e a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO. 17 ou 18.

[159] A sequência de região variável de cadeia leve relacionada foi obtida da seguinte maneira: (SEQ ID NO: 19)

DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYG

ASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCQAQQYYGYPYTFGGGTKVEIK Anticorpo da biblioteca de HRPOOO52 mutante

[160] Os clones selecionados com base nas sequências da biblioteca de HRPOOO52 mutante são diferentes de HRPOO0O52 em HCDR1, HCDR2 e LCDR2. Sequências de CDR relacionadas ou fórmulas gerais e suas regiões variáveis de cadeia pesada correspondentes são descritas abaixo.

HCDR1 XaXsWMXs SEQ ID NO: 20 HCDR2 RIX7PX8X9GX10X11X12YNEKX13KN SEQ ID NO: 21 HCDR3 GGSSYDYFDY SEQ ID NO: 22 LCDR1 RASESVSIHGTHLMH SEQ ID NO: 23 LCDR2 XuASX15sX16X17S SEQ ID NO: 24 LCDR3 QQOSFEDPLT SEQ ID NO: 25

[161] A fórmula geral de sequência de região variável de cadeia pesada relacionada é obtida da seguinte maneira: (SEQ ID NO: 26) QVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTXaXsWMX;WVRQAPGQGLEWMGRI X7PXgX9GX10X11X12Y NEKX13KNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYD YFDYWGOGTTVTVSS, na HCDR1 e HCDR2 acima da SEQID NO. 20 e 21 e a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO. 26, Xa é selecionado a partir de Se D, Xs é selecionado a partir de Y e K, Xs é selecionado a partir de He M, X; é selecionado a partir de T, S, H e G, Xg é selecionado a partir de S, N e G, Xo é selecionado a partir de S, Le G, X1o é selecionado a partir de E, L We M, Xu é selecionado a partir de A, P e T, X12 é selecionado a partir de M, V, Le S, X13 é selecionado a partirde Fe Y.

[162] A fórmula geral de sequência da região variável de cadeia leve relacionada é obtida da seguinte maneira: (SEQ ID NO: 27) DIVLTOSPASLAVSPGORATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYXuLAS XasX16X17S GVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQOSFEDPLTFGQOGTKLEIK, em que Xu é selecionado a partir de V e A, X15 é selecionado a partir de Ye N, X16 é selecionado a partir de A, Le V e X17 é selecionado a partir de E, E, Ye A (incluindo que X17 é selecionado a partir de E, Fe A e X17 é selecionado a partir de Y) na LCDR2 da SEQ ID NO: 24 e na região variável de cadeia leve da SEQ ID NO. 27. As sequências relacionadas específicas obtidas compreendem, mas não estão limitadas, às descritas na Tabela 1 e na Tabela 2: Tabela 1. Sequências de região variável de cadeia pesada determinadas por triagem por afinidade Região Sequência de Sequência de variável Sequência Sequência de HCDR2 HCDR1 HCDR3 de cadeia | VÕÓENO compreendida compreendida compreendida pesada SEQ ID NO: | DGSAYWS FISRAGSTYNTPSLKG SGGWLAPFDY 9-2 H5 42 (SEQID NO: 10) | (SEQID NO: 28) (SEQ ID NO: 13) SEQ ID NO: | NDYWT FISRAGSTYNTPSLKG SGGWILAPFDY 9-2 H6 43 (SEQ ID NO: 11) (SEQID NO: 28) | (SEQIDNO: 13) SEQ ID NO: | NDYWT MISVAGSTYHTPSLKG SGGWLAPFDY 9-2 H7 44 (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 29) SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: | SYWMH RITPSSGFAMYNEKFKN GGSSYDYFDY 24D5 H12 46 (SEQID NO: 30) | (SEQID NO: 32) (SEQ ID NO: 22) SEQ ID NO: | STWMH RISPSLGLAVYNEKFKN GGSSYDYFDY 24D5 H13 47 (SEQID NO: 30) | (SEQID NO: 33) (SEQ ID NO: 22) SEQ ID NO: | SIWMH RIHPSLGLPLYNEKFKN GGSSYDYFDY 24D5 H14 48 (SEQID NO: 30) | (SEQID NO: 34) (SEQ ID NO: 22) SEQ ID NO: | DAWMM RITPSSGFAMYNEKFKN GGSSYDYFDY 24D5 H15 49 (SEQID NO: 31) | (SEQID NO: 32) (SEQ ID NO: 22)

SEQ ID NO: | SYWMH RISPSLGLAVYNEKFKN GGSSYDYFDY 24D5 H16 50 (SEQID NO: 30) | (SEQID NO: 33) (SEQ ID NO: 22) SEQ ID NO: | STWMH RIGPNLGWAMYNEKYKN | GGSSYDYFDY 24D5 H17 51 (SEQID NO: 30) | (SEQID NO: 35) (SEQ ID NO: 22) SEQ ID NO: | SIWMH RISPSSGMAVYNEKFKN GGSSYDYFDY 24D5 H18 52 (SEQID NO: 30) | (SEQID NO: 36) (SEQ ID NO: 22) SEQ ID NO: | SYWMH RISPGGGFTLYNEKFKN GGSSYDYFDY 24D5 H19 53 (SEQID NO: 30) | (SEQID NO: 37) (SEQ ID NO: 22) SEQ ID NO: | SIWMH RIGPNSGFTSYNEKFKN GGSSYDYFDY 24D5 H20 54 (SEQID NO: 30) | (SEQID NO: 38) (SEQ ID NO: 22) SEQ ID NO: | DOWMM RITPSSGFAMYNEKFKN GGSSYDYFDY 24D5 H21 66 (SEQID NO: 31) | (SEQID NO: 32) (SEQ ID NO: 22) Tabela 2. Sequências de região variável de cadeia leve determinadas por triagem por afinidade Região variável Sequência Sequência LCDR1 Sequência LCDR2 | Sequência LCDR3 de VH NO compreendida compreendida compreendida cadeia leve

SEQID KSSQOSLFYHSNQKHSLA GASTRES QQYYGYPYT 9-2111 NO: 45 (SEQID NO: 14) (SEQID NO: 15) | (SEQIDNO: 16) 24D5 SEQID RASESVSIHGTHLMH VASYAAS QOQSFEDPLT L64 NO: 55 (SEQID NO: 23) (SEQID NO: 39) | (SEQIDNO: 25) 24D5 SEQID RASESVSIHGTHLMH AASNLES QQSFEDPLT L61 NO: 56 (SEQID NO: 23) (SEQID NO: 40) | (SEQID NO: 25) 24D5 SEQID RASESVSIHGTHLMH VASNVFS QQSFEDPLT L66 NO: 57 (SEQID NO: 23) (SEQID NO: 41) | (SEQIDNO: 25) 24D5 SEQID RASESVSIHGTHLMH VASNVES QOQOSFEDPLT L67 NO: 70 (SEQID NO: 23) (SEQID NO: 67) | (SEQIDNO: 25)

24D5 SEQID RASESVSIHGTHLMH VASNVWS QQSFEDPLT 24D5 SEQID RASESVSIHGTHLMH VASNVYS QOQSFEDPLT

[163] Sequências específicas de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo e regiões variáveis de cadeia pesada derivadas da biblioteca de mutação de anticorpo HRPO0049:

[164] Região variável de cadeia pesada 9-2 H5 (SEQ ID NO: 42)

QVQOLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISDGSAYWSWIRQHPGKGLEYIGFISRAG STYNTPSLKGRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVT VSS

[165] Região variável de cadeia pesada 9-2 H6 (SEQ ID NO: 43)

QVQOLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGFISRAGST YNTPSLKGRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDY WGRGTLVTVSS

[166] Região variável de cadeia pesada 9-2 H7 (SEQ ID NO: 44)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGMISVAGS TYHTPSLKGRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDY WSGRGTLVTVSS

[167] Região variável de cadeia leve 9-2 L11 (SEQID NO: 45)

DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYG ASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCAQQYYGYPYTFGGGTKVEIK

[168] Sequências específicas de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo e regiões variáveis de cadeia pesada derivadas da biblioteca de mutação de anticorpo HRPOO0O52:

[169] Região variável de cadeia pesada 24D5 H12 (SEQ ID NO: 46)

QVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQOAPGQOGLEWMGRIT PSSGFAMYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGOQO. GTTVTVSS

[170] Região variável de cadeia pesada 24D5 H13 (SEQ ID NO: 47)

QVOQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVROAPGOGLEWMG RISPSLGLAVYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYW GOGTTVTVSS

[171] Região variável de cadeia pesada 24D5 H14 (SEQ ID NO: 48)

QVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQOAPGOGLEWMGRIH PSLGLPLYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDY WGOGTTVTVSS

[172] Região variável de cadeia pesada 24D5 H15 (SEQ ID NO: 49)

QVOQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKANGYTFTDKWMMWVRQOAPGOGLEWMGRI TPSSGFAMYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSGTVDYFDY WGOGTTVTVSS

[173] Região variável de cadeia pesada 24D5 H16 (SEQ ID NO: 50)

QVQLVOSGAEVKKPGASMKVSCKASGYTFTSYWMHWVROAPGOGLEWMG RISPSLGLAVYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSSSDTVFDY WGOGTTVTVSS

[174] Região variável de cadeia pesada 24D5 H17 (SEQ ID NO: 51)

QVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVROAPGOGLEWMGRIG PNLGWAMYNEKYKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLGSEDTAVYYCARGGSSYDYFDWG QGTTVTIVSS

[175] Região variável de cadeia pesada 24D5 H18 (SEQ ID NO: 52)

QVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQOAPGQOGLEWMGRISP SSGMAVYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSSSDTVFDYWG QGTTVTVSS

[176] Região variável de cadeia pesada 24D5 H19 (SEQ ID NO: 53)

QVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQOAPGOGLEWMGRISP GGGFTLYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSGTVDYFDYWG QGTTVTVSS

[177] Região variável de cadeia pesada 24D5 H20 (SEQ ID NO: 54)

QVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQOAPGQOGLEWMGRIG PNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSTTVDYFDYWG QGTTVTVSS

[178] Região variável de cadeia pesada 24D5 H21 (SEQ ID NO: 66)

QVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDKWMMWVROAPGQOGLEWMGRIT PSSGFAMYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQ GTTVTVSS

[179] Região variável de cadeia leve 24D5 L64 (SEQ ID NO: 55)

DIVLTOSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYVASY AASGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQOSFEDPLTFGOGTKLEIK

[180] Região variável de cadeia leve 24D5 L61 (SEQ ID NO: 56)

DIVLTOSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIVYAASN LESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQOGTKLEIK

[181] Região variável de cadeia leve 24D5 L66 (SEQ ID NO: 57)

DIVLTOSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQOPPKLLIYVASN VESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQOSFEDPLTFGOGTKLEIK

[182] Região variável de cadeia leve 24D5 L67 (SEQ ID NO: 70)

DIVLTOSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYVASN VESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK

[183] Região variável de cadeia leve 24D5 L68 (SEQ ID NO: 71)

DIVLTOSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYVASN VWSGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQOSFEDPLTFGOGTKLEIK

[184] Região variável de cadeia leve 24D5 L69 (SEQ ID NO: 72)

DIVLTOSPASLAVSPGQORATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYVASN VYSGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK

[185] Para as regiões variáveis de cadeia leve e regiões variáveis de cadeia pesada dos anticorpos acima, a região constante de IgG1 de cadeia pesada humana/cadeia leve kappa é selecionada e combinada com cada região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve para formar uma cadeia pesada de anticorpo completa e uma cadeia leve de anticorpo completa. As sequências da região constante e da região constante de cadeia leve são as seguintes:

[186] Região constante de cadeia pesada IgG1 (SEQID NO: 58)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTOQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WOQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[187] Região constante de cadeia leve kappa (SEQ ID NO: 59)

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQOSGNSQESV

TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC Tabela 3 Combinações de região variável de cadeia leve e região variável de cadeia pesada de anticorpos intactos derivados de mutação HRPOO049 Nome do Combinação de região pesada e região variável de cadeia pesada

Tabela 4-1 Combinações da região variável de cadeia leve e da região variável de cadeia pesada de anticorpos completos derivados de mutação HRPOOO52 Nome da Combinação de região Nome da Combinação de região combinação | variável de cadeia pesada e | combinação variável de cadeia das regiões região variável de cadeia das regiões | pesada e região variável variáveis leve variáveis de cadeia leve Fa er Tabela 4-2 Combinações de região variável de cadeia leve e região variável de cadeia pesada de anticorpos completos derivados de mutação de HRPOOO52 Nome das |24D5L61 |24D5L64 |24D5L66 | 24D5L67 | 24D5 L68 | 24D5 L69 regiões variáveis

[188] Em modalidades específicas da presente invenção, todas as regiões variáveis pesadas e regiões variáveis de cadeia leve derivadas das bibliotecas de anticorpos mutantes HRPOOO49 e HRPOOO52 conforme descrito na Tabela 5-1 e Tabela 5-2, quando ligados às regiões constantes pesadas e regiões constantes de cadeia leve para formar um anticorpo completo, representam o anticorpo completo formado conectando com a região constante de cadeia pesada de IgG1 humano (SEQ ID NO: 58) e região constante da cadeia leve kappa (SEQ ID NO: 59), descritas acima. Por exemplo, H15L61 refere-se ao anticorpo completo que é formado pela conexão de H15 com a região constante de cadeia pesada de IBG1 e a cadeia leve é formada pela conexão de L61 com a região constante kappa de cadeia leve, e as cadeias leve e pesada são ligadas para formar um anticorpo completo, e outros anticorpos foram nomeados por analogia.

[189] HRPOOOS52-IgG1 refere-se a que o anticorpo completo é formado substituindo a região constante de cadeia pesada (subclasse IgG4) de HRPOOO52 com a região constante de cadeia pesada de IgG1 acima (SEQ ID NO: 58).

Tabela 5-1 Nomes de anticorpos de comprimento total obtidos pela conexão de regiões variáveis de cadeia pesada com a região constante de cadeia pesada IgG1 (SEQ ID NO: 58) e as regiões variáveis de cadeia leve com a região constante de cadeia leve kappa (SEQ ID NO: 59) Nome da |24D5L61 |24D5L64|24D5L66 | 24D5L67 | 24D5 L68 | 24D5 L69 região variável

Tabela 5-2 Nomes de anticorpos de comprimento total obtidos pela conexão de regiões variáveis de cadeia pesada com a região constante de cadeia pesada IgG1 (SEQ ID NO: 58) e as regiões variáveis de cadeia leve com a região constante de cadeia leve kappa (SEQ ID NO: 59) Nome dalg9-2H5 9-2H6 J92H7 região =

[190] De modo a comparar com anticorpos completos que se conectam com a região constante da cadeia pesada de IgG1 humano, em algumas modalidades específicas, os anticorpos de comprimento total na Tabela 6-1 e na Tabela 6-2 são anticorpos completos formados pela conexão da região variável de cadeia pesada e da região variável de cadeia leve triada a partir das bibliotecas derivadas das HRPOOO49 e HRPOOO52 acima com a seguinte região constante de cadeia pesada de IgG4 humana (da SEQ ID NO: 60, contendo as mutações S228P e 234A235A) e região constante da cadeia leve kappa (igual ao SEQ ID NO: 59), respectivamente. Por exemplo, H15L61-lgG4 refere-se ao anticorpo completo que é formado pela conexão da cadeia pesada com a cadeia leve, em que a cadeia pesada é formada pela conexão de H15 com a região constante de cadeia pesada de IgG4 e a cadeia leve é formada pela conexão de L61 com a região constante kappa de cadeia leve, e outros anticorpos foram nomeados por analogia.

[191] Região constante de cadeia pesada de IgG4 humana: (SEQ ID NO: 60)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRVVSVLTVLHOQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWOQO.

EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Tabela 6-1 Nomes de anticorpos de comprimento total obtidos pela conexão da região variável de cadeia pesada com a região constante de cadeia pesada de IgG4 (SEQ ID NO: 60) e a região variável de cadeia leve com a região constante de cadeia leve kappa (SEQ ID NO: 59) Nome 24D5 L61 24D5 L64 24D5 L66 24D5 L67 24D5 L68 24D5 L69 da região variável 24D5 H12L61- H12L64- H12L66- H12L67- H12L68- H12L69- 24D5 H13L61- H13L64- H13L66- H13L67- H13L68- H13L69- 24D5 H14L61- H14L64- H14L66- H14L67- H14L68- H14L69- 24D5 H15L61- H15L64- H15L66- H15L67- H15L68- H15L69- 24D5 H16L61- H16L64- H16L66- H16L67- H16L68- H16L69- 24D5 H17L61- H17L64- H17L66- H17L67- H17L68- H17L69- 24D5 H18L61- H18L64- H18L66- H18L67- H18L68- H18L69- 24D5 H19L61- H19L64- H19L66- H19L67- H19L68- H19L69- 24D5 H20L61- H20L64- H20L66- H20L67- H20L68- H20L69-

24D5 | H21L61- H21L64- H21L66- H21L67- H21L68- H21L69- Tabela 6-2 Nomes de anticorpos de comprimento total obtidos pela conexão da região variável de cadeia pesada com a região constante de cadeia pesada de IgG4 (SEQ ID NO: 60) e a região variável de cadeia leve com a região constante de cadeia leve kappa (SEQ ID NO: 59) Nome da|9-2H5 9-2 H6 9-2 H7 Er variável ma o 9-2111 IgG4 IgG4 IgG4

[192] Em algumas modalidades específicas, os anticorpos de comprimento total na Tabela 7-1 e na Tabela 7-2 são anticorpos completos formados pela conexão da região variável de cadeia pesada e da região variável de cadeia leve triada a partir das bibliotecas derivadas das HRPOOO49 e HRPOOOS52 acima com a seguinte região constante de cadeia pesada de IgG4 S228P humana (da SEQ ID NO: 65, contendo a mutação S228P) e região constante da cadeia leve kappa (igual ao SEQ ID NO: 59), respectivamente. Por exemplo, H15L61-IgG4 refere-se ao anticorpo completo que é formado pela combinação da cadeia pesada com a cadeia leve, em que a cadeia pesada é formada pela conexão de H15 com a região constante de cadeia pesada de IgG4 e a cadeia leve é formada pela conexão de L61 com a região constante de cadeia leve kappa e outros anticorpos foram nomeados por analogia. A sequência da região constante de cadeia pesada de IgG4 S228P é a seguinte: (SEQ ID NO: 65)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ.

EGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSLGK Tabela 7-1 Nomes de anticorpos de comprimento total obtidos pela conexão da região variável de cadeia pesada com a região constante de cadeia pesada de IgG4 S228P (SEQ ID NO: 65) e a região variável de cadeia leve com a região constante de cadeia leve kappa (SEQ ID NO: 59) Nome 24D5 L61 24D5 L64 24D5 L66 24D5 L67 24D5 L68 24D5 L69 da região variável 24D5 | H12L61- H12L64- H12L66- H12L67- H12L68- H12L69- 24D5 H13L61- H13L64- H13L66- H13L67- H13L68- H13L69- 24D5 H14L61- H14L64- H14L66- H14L67- H14L68- H14L69- 24D5 H15L61- H15L64- H15L66- H15L67- H15L68- H15L69- 24D5 H16L61- H16L64- H16L66- H16L67- H16L68- H16L69- 24D5 H17L61- H17L64- H17L66- H17L67- H17L68- H17L69- 24D5 H18L61- H18L64- H18L66- H18L67- H18L68- H18L69- 24D5 H19L61- H19L64- H19L66- H19L67- H19L68- H19L69- 24D5 H20L61- H20L64- H20L66- H20L67- H20L68- H20L69- 24D5 H21L61- H21L64- H21166- H21L67- H21L68- H21L69-

Tabela 7-2 Nomes de anticorpos de comprimento total obtidos pela conexão da região variável de cadeia pesada com a região constante de cadeia pesada de IgG4 S228P (SEQ ID NO: 65) e a região variável de cadeia leve com a região constante de cadeia leve kappa (SEQ ID NO: 59) Nome da|9-2H5 9-2 H6 9-2 H7 região E eae modes ms mm) 9-2111 S228P Ss228P S228P

[193] Aregião constante da cadeia leve específica e a região constante da cadeia pesada não se destinam a limitar as regiões constantes de anticorpo da presente invenção, e outras regiões constantes da cadeia leve e regiões constantes da cadeia pesada e regiões constantes e mutantes das mesmas conhecidas na técnica também podem ser selecionadas para melhorar seu desempenho.

[194] O anticorpo de PD-L1 da Merck, Avelumab (AO9) e/ou o 3280A da Genetech foram usados como controle positivo na presente invenção, em que as sequências de aminoácidos da sequência de aminoácidos de cadeia leve e a cadeia pesada de AO9 (originária do US20140341917) são as seguintes:

[195] Cadeia pesada de AO9: (SEQ ID NO: 61)

EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVROAPGKGLEWVSSIYPSG GITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGOGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVWYNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WOQOQGNVFSCSVYMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[196] Cadeia leve de AO9: (SEQ ID NO: 62)

QSALTOPASVSGSPGOSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNR PSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLOAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANP TVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQOSNNKYA ASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

[197] As sequências de aminoácidos da sequência de aminoácidos de cadeia leve e de cadeia pesada de 3280A (Genetech, Atezolizumab, WHO Drug Information, Vol. 28, No. 4, 2014, P488) são as seguintes:

[198] Cadeia pesada de 3280A: (SEQ ID NO: 63)

EVQLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPY GGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGOGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL LGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYAST YRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ. GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[199] Cadeia leve de 3280A: (SEQ ID NO: 64)

DIQMTQOSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQQYLYHPATFGOGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHOGLSSPVTKSFN RGEC

[200] Os anticorpos PD-L1 descritos acima foram purificados por métodos convencionais.

[201] Os anticorpos nos exemplos a seguir são todos anticorpos de comprimento total

Modalidade 4. Teste de bloqueio de ligante de anticorpo

[202] O efeito de bloqueio do produto na ligação de PD-L1 e PD1 foi estudado adicionalmente, enquanto o produto foi comparado com produtos similares em ensaios clínicos. Os métodos referem-se aos Exemplos de Teste 2 e 3 do WO2017084495A1, e o anticorpo de PD-L1 humano foi usado para bloquear a ligação do PD-L1/PD-1 de camundongo no teste de bloqueio da ligação de PD- L1/PD-1 de camundongo. Vide a Tabela 8 abaixo para detalhes dos dados.

Tabela 8 Teste de anticorpo de PD-L1 bloqueando a ligação de PD-L1 ao seu ligante Anticorpo Bloqueio da Bloqueio da ligação | Bloqueio da ligação ligação de PD- de PD-L1/PD-1 de de B7-1 a PD-L1/PD- L1/PD-1 humano | camundongo 1 humano (1ug/ml*) (10ug/ml*) IC50 (5pg/ml*) IC50 IC50 (ng/ml) (ng/ml) (ng/ml) oe fo lg rs fa li so fas as EE E Ft ps a a a *10ug/ml, 5ug/ml e 1ug/ml são as concentrações de PD-L1 em diferentes testes de bloqueio.

[203] O teste de bloqueio de ligantes prova que o anticorpo de PD-L1 da presente invenção pode bloquear a ligação de PD-L1 e PD1, bem como a ligação de PD-L1 e B7-1, e os anticorpos H5L11 e H6L11 mutados a partir de HRPOO049 têm a atividade de ligação cruzada do PD-L1 de camundongo que pode bloquear a capacidade de ligação do PD-L1 de camundongo ao PD-1. Modalidade 5. Teste de afinidade de anticorpos BlAcore de anticorpos exemplares

[204] De acordo com o método no manual do kit anticaptura humano (Cat. H BR-1008-39, GE), o anticorpo anticaptura humano foi acoplado covalentemente ao chip biossensor CM5 (Cat. tt BR-1000-12, GE ) para que uma certa quantidade de PD-L1 humano (Cat. tt 10084-H08H, Sino Biological), PD-L1 de macaco (Cat. tt 90251-CO8H, Sino Biological), PD-L1 de camundongo (Cat. tt 50010-MO8H , Sino Biological) foram capturados por afinidade. A afinidade do anticorpo de PD-L1 reagindo com PD-L1 foi medida com o instrumento Biacore X100, GE. Neste teste, foi usada a solução tampão HBS-EP + 10 X (Cat. tt BR-1006- 69, GE) diluindo com água D.l. até 1 x (pH7,4) e BlAevaluation versão 4.1, software GE, foi utilizado para ajustar os dados com o modelo Langmuir (1:1) para obter o valor de afinidade. Os resultados são mostrados na Tabela 9. Tabela 9-1 Afinidade de ligação Biacore de HRPOOO49, HRPOOO52 e anticorpos mutantes do mesmo a diferentes espécies de PD-L1 (teste em batelada) Anticorpo | Proteína alvo ka kd (1/s) KD (M) PS fee Qa [SL Fumano 2,55E6 | 6,66E-5 | 2,61E-11 PD-L1 2,53E6 | 6,43E-5 | 2,54E-11

1,71E6 | 5,63E-5 | 3,30E-11 2,34E6 | 7,65E-5 | 3,27E-11 4,95E5 | 1,13E-4 | 2,27E-10 Macaco 1,60E6 | 7,68E-5 | 4,80E-11 4,74E5 | 1,51E-4 | 3,18E-10 5,72E5 | 1,21E-4 | 2,11E-10 Sem ligação Sem ligação Camundongo PD-L1 8,11E5 | 5,64E-2 | 6,96E-8 6,55E5 | 1,19E-2 | 1,81E-8 Tabela 9-2 Afinidade de ligação Biacore de HRPOOO52 e anticorpos mutantes do mesmo a diferentes espécies de PD-L1 (teste em batelada) Anticorpo Proteína ka kd (1/s) KD (M) [ES qa [OO HRPOOO52 | hPDLI |1,26E+06| 1,39E-04 O rasa es i 1,26E+06 | 1,43E-04 | 1,14E-10 cino — elas i 2,17E+06 | 1,22E-04 | 5,63E-11 cino

H21L67 hPD-L1 |[2,30E+06| 1,20E-04 Er 2,35E+06 | 1,24E-04 | 5,28E-11 cino cino Eee ee 2,27E+06 | 1,19E-04 | 5,26E-11 cino

[205] Os resultados mostraram que a afinidade dos anticorpos triados da biblioteca de anticorpos mutantes HRPOOO52 (exceto H21L68) para PD-L1 humano foi maior que a de HRPOOOS52, e os dois acima foram ambos superiores à do anticorpo de controle positivo, enquanto os anticorpos H5L11, H6L11 e H7L11 triados a partir da biblioteca de anticorpos mutantes HRPOOO049 mostraram forte atividade de afinidade cruzada do camundongo com PD-L1.

Modalidade 6. Secreção de IFNy celular de anticorpo de PD-L1 no teste de ativação de linfócitos PBMC-T

[206] De modo a estudar o efeito do anticorpo de PD-L1 na função dos linfócitos T primários humanos, células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) foram coletadas e purificadas. Após 5 dias de estimulação in vitro com tuberculina (TB), foi detectado o nível de secreção de citocina IFNy. O processo experimental é brevemente descrito da seguinte maneira:

[207] PBMC foi obtido a partir de sangue fresco por centrifugação em gradiente de densidade Ficoll-Hypaque (Stem Cell Technologies) e cultivado em meio RPM! 1640, ao qual foi adicionado 10% (v/v) de FBS, seguido de cultura a 37 ºC e 5% de CO.

[208] PBMC recém-isolado e purificado foi preparado em uma suspensão de células com uma densidade de 2x10º/ml usando um meio RPMI 1640, e 25 ul de tuberculina foi adicionado a cada 20 ml de suspensão de células, seguidos por cultura em uma incubadora a 37º C e 5% de CO, por 5 dias. No sexto dia, as células cultivadas foram centrifugadas, lavadas uma vez com PBS, ressuspensas em meio RPM! 1640 fresco, ajustadas a uma densidade de 1x105/ml, e semeadas em placas de cultura de células de 96 poços a um volume de 90 ul por poço. Amostras de anticorpo diluídas em gradiente (diluídas com PBS) ou quantidade igual de isotipo IgG foram adicionadas simultaneamente como controle em branco a um volume de 104! por poço. A placa de cultura de células foi colocada em uma incubadora e incubada a 37º C e 5% de CO, por 3 dias, e depois retirada e centrifugada (4000 rpm, 10 min) para coletar o sobrenadante da cultura de células. ELISA (kit de teste para IFN-y humano, Xinbosheng, EHC102g.96) foi usado para detectar o nível de IFN-y. Consulte o manual do reagente para operações específicas.

[209] Os resultados (vide Figura 1) mostram que H18L61, H12L64, H5L11 e H6L11 podem estimular fortemente a secreção intracelular de IFNy. Entre eles, H12L64, H5L11 e H6L11 exibem uma tendência dependente da dose ao promover a secreção intracelular de IFNy. Todos os quatro anticorpos acima são superiores ao HRPOOO52-IgG1 em algumas doses ou em todas as doses.

Modalidade 7. Efeito ADCC mediado por anticorpo exemplar de PD-L1 + células

[210] O sangue total humano diluído com um volume igual de tampão PBS foi adicionado ao fundo de um tubo SepMate (STEMCELL Technologies Inc., 15460) com uma quantidade apropriada de Lymphoprep (STEMCELL Technologies Inc., 07851) e centrifugado a 1200g por 10 minutos à temperatura ambiente. Despejando o líquido superior no tubo em um novo tubo de centrífuga de 50 ml, as células foram lavadas com tampão PBS e centrifugadas à 300 g por 8 minutos para obter PBMC. O PBMC foi então ressuspenso no meio

RPMI-1640 contendo 5% de baixo FBS de IgG (BIOSUN, BS-0007-500) e a contagem de células foi realizada.

[211] As células CHO-S/PD-L1 foram ressuspensas no meio RPMI1640 contendo 5% de IgG FBS baixo e contadas, semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 10.000 células por poço e incubadas com gradiente diluído de anticorpo de PD-L1 por 15 minutos, em seguida, 300.000 células PBMC humanas foram adicionadas a cada poço e interagiram com o anticorpo por 4 horas. Foram estabelecidos controles médios, como controle de liberação espontânea de células CHO-S/PD-L1, controle de liberação espontânea de células PBMC e controle máximo de lise de células CHO-S/PD-L1. Após 4 horas, a placa de 96 poços foi centrifugada, 50 ul de sobrenadante de cada poço foram transferidos para outra placa de 96 poços, 50 ul de Teste de Citotoxicidade não Radioativa CytoTox 96 (Promega, G1780) foram adicionados a cada poço e incubados por minutos em temperatura ambiente no escuro. A solução de parada foi adicionada e a absorvância a 490 nm foi lida. Os dados foram analisados de acordo com a seguinte fórmula para calcular a taxa de lise. O software Graphpad Prism foi usado para calcular o valor EC5O do efeito ADCC do anticorpo de acordo com a concentração de anticorpos e a taxa de lise correspondente.

[212] Taxa de lise%m = (poço de amostrassonm-células PBMC liberadas espontaneamenteassonm-células CHO-S/PD-L1 liberadas espontaneamenteansonm) / (células CHO-S / PD-L1 lise máximassonm células-CHO-S/PD-L1 liberadas espontaneamenteassonm)x100

[213] Os resultados mostram (como mostrado nas Figuras 2A a 2F) que todas as formas de IgG1 de diferentes anticorpos PD-L1 HRPOOO49-IgG1, H5L11, HRPOOO52-IgG1, H6L11, H18L61 e H12L64 têm fortes efeitos ADCC, e os efeitos ADCC dessas moléculas são todos significativamente superiores à forma de IgG4 de vários anticorpos de PD-L1.

Modalidade 8. Efeito de anticorpos exemplares no modelo de xenoenxerto melanoma humano A375

[214] As células A375 cultivadas e PBMC foram misturadas e inoculadas subcutaneamente em camundongos NOG. As experiências foram classificadas no grupo PBMC + PBS, grupo PBMC + H12L64 20 mg/kg, grupo PBMC + H121L64- IgG4-20 mg/kg e grupo PBMC + HRPOOO52 20 mg/kg. Seis camundongos em cada grupo foram administrados intraperitonealmente uma vez a cada dois dias por 11 vezes consecutivas. Após a administração ter sido completada, o efeito terapêutico foi avaliado usando a taxa de inibição do crescimento tumoral TGI (%) e a taxa de crescimento tumoral relativa T/C (%).

[215] Os resultados são mostrados na Figura 3 e na Tabela 10. O TGI do grupo H12L64 20 mg/kg foi de 98,15%, o que foi significativamente diferente do grupo PBMC + PBS (p= 0,0018); a taxa de inibição tumoral TGI do grupo H12L64- IgG4 20mg/kg foi de 82,15%, significativamente diferente da do grupo PBMC + PBS (p= 0,0064); a taxa de inibição tumoral TGI do grupo HRPOOO52 20mg/kg foi de 68,84%, significativamente diferente da do grupo PBMC + PBS (p= 0,0291). Os resultados mostram que o grupo H12L64 20 mg/kg, H12L64-IgG4 20 mg/kg e HRPOOO52 20 mg/kg podem inibir efetivamente o crescimento de A375 (p<0,05). Durante todo o experimento, os camundongos portadores de tumor H12L64, H12L64-IgG4 e HRPOOO52 não apresentaram perda de peso ou morte animal, indicando que H12L64, H12L64-I8G4 e HRPOOO52 nessa dose foram bem tolerados pelos camundongos.

Tabela 10 Eficácia de anticorpos de PD-L1 no modelo de xenoenxerto subcutâneo humanizado A375 Grupo de Volume TGI% | T/C% Pp Observações experimento Dia21 | Dia21 Vs

Dia21 PBS les [mom se = PBMC+H12L64 |6| 10,77X7,38 |98,15| 1,85 | 0,0018 4/6(CR) PBMC+H12L64-IgG4 103,74+30,41 | 82,15 | 17,85 | 0,0064 0/6(CR) [Pam PBMC+HRPOOO52 | 5 | 181,14+39,94 | 68,84 | 31,16 | 0,0291 0/5(CR)

NC A

[216] TGI%: valor de inibição de crescimento de tumor; T/C%: taxa de crescimento de tumor; CR: regressão de tumor. Modalidade 9. Efeito do anticorpo de PD-L1 no câncer de cólon de camundongo modelo MC38-hPD-L1

[217] 100 ul de células de MC38-hPD-L1 foram inoculadas (hPD-L1 pode ser expressa na superfície celular após a transformação de hPD-L1 em células cancerígenas de cólon de camundongos MC38,, 4 x 10º células) na costela direita de 50 camundongos C57 e animais com volume muito grande ou pequeno de tumor foram removidos. De acordo com o volume médio do tumor de cerca de 52 mm?, os camundongos foram divididos aleatoriamente em três grupos de uso único de anticorpos PD-L1 e um grupo de controle negativo, com um total de 4 grupos e 10 camundongos em cada grupo. Após o agrupamento, cada fármaco foi administrado por via intraperitoneal (um volume igual de PBS foi injetado nos camundongos no grupo de controle) três vezes ao dia por um total de 12 vezes. O período de administração foi de 28 dias e o monitoramento de camundongos portadores de tumor terminou dois dias após a suspensão do fármaco. O volume tumoral foi medido, o peso foi pesado e os dados foram registrados duas vezes por semana. Vide a tabela a seguir para agrupamento e administração. Peso corporal, o volume tumoral e o peso do tumor dos animais em cada grupo foram caracterizados por média + desvio padrão (Média + SEM). Os softwares Graphpad Prism 5 e Excel foram usados para plotagem e o teste t de student foi usado para análise estatística. Volume tumoral (TV)= 1/2xLiongoXLeurto? Taxa de proliferação do tumor T/C%=(T-TO) /(C-CO)x100% Taxa de inibição de crescimento de tumor% TGI=1-T/C% Dose de Número de/| - administração Via de pa ame e HRPOOOS52-IgG1- free amo 1 | + | grs] mon | e | e mm [e o

[218] Resultados experimentais (vide Figura 4) mostram que tanto o H6L11 como o AO9 podem inibir significativamente o crescimento de tumores implantados subcutaneamente MC38-hPD-L1. Comparado com o grupo de controle negativo, o volume tumoral dos dois grupos apresentou diferenças estatísticas 3 dias após a administração (p<0,05). Ao final do experimento (27 dias após a administração), os valores de inibição do crescimento tumoral dos dois grupos foram de 106,74% e 103,47%, respectivamente, o que foi significativamente muito diferente daqueles do grupo de controle negativo (p<0,001). Cerca de 80% a 90% dos tumores puderam regredir completamente e o H6L11 tem melhor efeito de supressão tumoral do que o AO9, mas não há diferença estatística entre esses dois (vide a Figura 4). Ao final do experimento, a taxa de inibição de crescimento tumoral de HRPOOO52-IgG1 foi de 29,10%.

[219] Após o experimento, os camundongos portadores de tumor foram sacrificados, e o tumor foi retirado e pesado. Os resultados da pesagem de tumor foram basicamente consistentes com o tamanho do volume tumoral: em três grupos de fármacos, o peso médio de tumor no grupo H6L11 foi o menor, seguido pelo grupo AOS9, e o peso médio de tumor no HRPOOO52-IgG1 foi o maior; houve diferença significativa entre cada um dos dois grupos de H6L11 e AO9 e o grupo controle (p<0,001). Camundongos portadores de tumor foram bem tolerantes a vários fármacos e não apresentaram sintomas como perda de peso causada por fármacos.

Modalidade 10. Efeito do anticorpo de PD-L1 no câncer de cólon de camundongo modelo MC38-hPD-L1

[220] As células MC38-hPD-L1 foram inoculadas subcutaneamente em camundongos C57/BL-6 a uma densidade de 5,8 x 10º células/100 ul/camundongo. Após o modelo portador de tumor ter sido construído, o volume tumoral foi medido e os animais com peso ou tamanho corporal muito grande ou pequeno foram removidos. Os camundongos portadores de tumor foram divididos aleatoriamente em 2 grupos (n = 7): O grupo de controle IgG- PBS (C25-IgG4), o grupo experimental H5L11-lgG4 S228P de acordo com o tamanho do tumor e a data de agrupamento e administração foram definidos como DO. Após o agrupamento, cada fármaco foi administrado por via intraperitoneal três vezes por semana, por um total de 10 vezes. O período de administração foi de 18 dias e o monitoramento de camundongos portadores de tumor terminou dois dias após a suspensão do fármaco. O volume tumoral foi medido, o peso foi pesado e os dados foram registrados duas vezes por semana. Vide a tabela a seguir para agrupamento e administração. Peso corporal, o volume tumoral e o peso do tumor dos animais em cada grupo foram caracterizados por média + desvio padrão (Média + SEM). Os softwares Graphpad Prism 5 e Excel foram usados para plotagem e o teste t de Student foi usado para análise estatística.

Volume tumoral (TV)= 1/2XLiongoXLeurto” Taxa de proliferação do tumor T/C%=(T-TO) /(C-CO)x100% Taxa de inibição de crescimento de tumor% TGI=1-T/C%

[221] O resultado foi mostrado na Figura 5, o volume tumoral do grupo experimental de anticorpo monoclonal PD-L1 (grupo H5L11-IgG4 S228P) que reagiu de maneira cruzada com o PD-L1 de camundongo foi significativamente menor que o do grupo de controle, e existe uma diferença estatística entre o grupo experimental e o grupo de controle cerca de uma semana após a administração.

[222] Após o experimento, os camundongos portadores de tumor foram sacrificados, e o tumor foi retirado e pesado. Os resultados de peso do tumor foram semelhantes ao volume tumoral. Durante o experimento, não houve diferença significativa no peso corporal entre o grupo de administração e o grupo de controle, e cada anticorpo administrado foi bem tolerado pelos camundongos.

[223] Embora a invenção acima tenha sido descrita em detalhes com a ajuda das figuras e modalidades para um entendimento claro, a descrição e as modalidades não se destinam a limitar o escopo da presente invenção. As divulgações de todas as patentes e literatura científica referida na presente invenção são total e claramente incorporadas por referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao PD-L1 humano e compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que: (1) a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQID NOs: 10, 12 e 13, respectivamente; e a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente; em que X; é Fou M, X2º é Rou Ve X3 é N ou H na HCDR2 da SEQ ID NO: 12; ou (ii) a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQID NOs: 11, 12 e 13, respectivamente; e a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente; em que X; é F ou M, X2 é Rou Ve X3 é N ou H no HCDR2 da SEQ ID NO: 12; ou (iii) a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQID NOs: 20, 21 e 22, respectivamente; e a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 23, 24 e 25, respectivamente; em que HCDR1, HCDR2, HCDR3 e LCDR1, LCDR2, LCDR3 não são simultaneamente SEQ ID NOs: 30, 38, 22, 23, 40 e 25, respectivamente, em que X. é S ou D, Xs é Y ou K, Xçé Hou M, Xr é T, S, H ou G, Xgé S, N ou G, Xsé S, Lou G, X1o é F, L, W ou M, X11 É A, Pou T, Xi2 é M, V, Lou S, X1i3 é Fou Y nas SEQID NOs: 20 e 21 e Xi é Vou A, X15 é Y ou N, Xi6 É A, Lou Ve X157 É E, E, Y ou A na LCDR2 da SEQ ID NO: 24.

2. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao PD-L1 humano e compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que:

a região variável de cadeia pesada compreende uma HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, uma HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 ou 29 e uma HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente; ou a região variável de cadeia pesada compreende uma HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, uma HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 ou 29 e uma HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente; ou a região variável de cadeia pesada compreende uma HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30, uma HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 32 a 37 e uma HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, a região variável de cadeia leve compreende uma LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, uma LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 39, 40, 41, 67 e 69 e uma LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; ou a região variável de cadeia pesada compreende uma HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31, uma HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 32 a 37 e uma HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, a região variável de cadeia leve compreende uma LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID

NO: 23, uma LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 39, 40, 41, 67 e 69 e uma LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25.

3. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que: a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQID NO: 10, SEQ ID NO: 28 e SEQID NO: 13, respectivamente; a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente; a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQID NO: 11, SEQ ID NO: 28 e SEQID NO: 13, respectivamente; a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente; a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQID NO: 11, SEQ ID NO: 29 e SEQID NO: 13, respectivamente; a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente; a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQID NO: 30, SEQ ID NO: 32 e SEQID NO: 22, respectivamente; a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQID NO: 39 e SEQ ID NO: 25, respectivamente; a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 e SEQID NO:

22, respectivamente; a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 25, respectivamente;

a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 e SEQID NO: 22, respectivamente; a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 25, respectivamente;

a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQID NO: 30, SEQ ID NO: 34 e SEQID NO: 22, respectivamente; a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 25, respectivamente;

a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 e SEQID NO: 22, respectivamente; a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 25, respectivamente;

a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQID NO: 31, SEQ ID NO: 32 e SEQID NO: 22, respectivamente; a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 67 e SEQ ID NO: 25, respectivamente;

a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 e SEQID NO: 22, respectivamente; a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 69 e

SEQ ID NO: 25, respectivamente; a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 22, respectivamente; a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 25, respectivamente; a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQID NO: 30, SEQ ID NO: 35 e SEQID NO: 22, respectivamente; a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 25, respectivamente; a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO:22, respectivamente; a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 e SEQID NO: 25, respectivamente; ou a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 22, respectivamente; a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 25, respectivamente.

4. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19;

a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19; ou a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.

5. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno compreende: a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45; a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45; a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45; a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46 e a região variável de cadeia leve tendo sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 70 e 72; a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 e a região variável de cadeia leve tendo sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 70 e 72; a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQID NO: 48 e a região variável de cadeia leve tendo sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 70 e 72;

a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49 e a região variável de cadeia leve tendo sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 70 e 72; a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 e a região variável de cadeia leve tendo sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 70 e 72; a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 e a região variável de cadeia leve tendo sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 70 e 72; a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52 e a região variável de cadeia leve tendo sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 70 e 72; a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53 e a região variável de cadeia leve tendo sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 70 e 72; a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66 e a região variável de cadeia leve tendo sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 70 e 72;

6. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de comprimento total, compreendendo adicionalmente regiões constantes de anticorpo humano; preferencialmente, a região constante de cadeia pesada das regiões constantes de anticorpo humano é selecionada a partir de regiões constantes de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanos e variantes convencionais dos mesmos, e a região constante de cadeia leve das regiões constantes de anticorpo humano é selecionada a partir de regiões constantes de cadeia « e À de anticorpo humano e variantes convencionais das mesmas; mais preferencialmente, o anticorpo de comprimento total compreende uma região constante de cadeia pesada de anticorpo humano da SEQ ID NO: 58, 60 ou 65 e uma região constante de cadeia leve humana da SEQ ID NO: 59.

7. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em Fab, Fab', F(ab'),, fragmento variável de cadeia simples (scFv), domínio dimerizado V (diacorpo), Fv estabilizado por dissulfeto (dsFv) e peptídeos contendo CDR.

8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclonal ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

9. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

10. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico definida na reivindicação 9.

11. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de ser transformada com o vetor recombinante definido na reivindicação 10, em que a célula hospedeira é selecionada a partir de uma célula procariótica e uma célula eucariótica, preferencialmente uma célula eucariótica, mais preferencialmente uma célula de mamífero.

12. Método para produzir o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a

7, caracterizado pelo fato de que o método compreende cultivar a célula hospedeira definida na reivindicação 11 em um meio para produzir e acumular o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e coletar o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da cultura.

13. Método para imunodetecção ou determinação do PD-L1 humano, caracterizado pelo fato de que o método compreende usar o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

14. Uso do anticorpo monoclonal ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para preparação de um agente de diagnóstico para doenças associadas ao PD-L1 humano.

15. Método para tratar doenças associadas ao PD-lLi humano, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar a um indivíduo, uma quantidade farmaceuticamente eficaz do anticorpo monoclonal ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou compreendendo a composição farmacêutica definida na reivindicação 8, ou a molécula de ácido nucleico definida na reivindicação 9 para tratar doenças associadas ao PD-L1 humano, em que a doença é preferencialmente um tumor ou um câncer; mais preferencialmente carcinoma de células escamosas de PD-L1 positivo, mieloma, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC), glioma, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mieloide crônica (CML),

linfoma primário do mediastino de grandes células B, linfoma de células do manto (MCL), linfoma linfocítico pequeno (SLL), linfoma de grandes células B rico em células T/histócitos, mieloma múltiplo, proteína 1 da leucelia de células mieloides (Mcl-1), síndrome mielodisplásica (MDS), câncer (do trato) gastrointestinal, câncer renal, câncer de ovário, câncer de fígado, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de próstata, câncer de tireoide, melanoma, condrosarcoma, neuroblastoma, câncer de pâncreas, glioblastoma multiforme, carcinoma gástrico, câncer de osso, sarcoma de Ewing, câncer cervical, câncer cerebral, carcinoma gástrico, câncer de bexiga, carcinoma hepatocelular, câncer de mama, câncer de cólon, carcinoma hepatocelular (HCC), carcinoma de células renais de células claras (RCC), câncer de cabeça e pescoço, câncer de garganta, câncer hepatobiliar, câncer do sistema nervoso central, câncer de esôfago, mesotelioma pleural maligno, amiloidose sistêmica de cadeia leve, linfoma linfoplasmocítico, síndrome mielodisplásica, tumor mieloproliferativo, neoplasia neuroendócrina, carcinoma de células Merkel, câncer de testículo e câncer de pele.

16. Uso do anticorpo monoclonal ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou compreendendo a composição farmacêutica definida na reivindicação 8, ou a molécula de ácido nucleico definida na reivindicação 9, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um agente terapêutico para doenças associadas ao PD-L1 humano, em que a doença é preferencialmente um tumor ou um câncer; mais preferencialmente carcinoma de células escamosas de PD-L1 positivo, mieloma, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC), glioma, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mieloide crônica (CML), linfoma primário do mediastino de grandes células B, linfoma de células do manto (MCL), linfoma linfocítico pequeno (SLL), linfoma de grandes células B rico em células T/histócitos, mieloma múltiplo, proteína 1 da leucelia de células mieloides (Mcl-1), síndrome mielodisplásica (MDS), câncer (do trato) gastrointestinal, câncer renal, câncer de ovário, câncer de fígado, leucemia linfoblástica, leucemia linfocíticay câncer colorretal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de próstata, câncer de tireoide, melanoma, condrosarcoma, neuroblastoma, câncer de pâncreas, glioblastoma multiforme, carcinoma gástrico, câncer de osso, sarcoma de Ewing, câncer cervical, câncer cerebral, carcinoma gástrico, câncer de bexiga, carcinoma hepatocelular, câncer de mama, câncer de cólon, carcinoma hepatocelular (HCC), carcinoma de células renais de células claras (RCC), câncer de cabeça e pescoço, câncer de garganta, câncer hepatobiliar, câncer do sistema nervoso central, câncer de esôfago, mesotelioma pleural maligno, amiloidose sistêmica de cadeia leve, linfoma linfoplasmocítico, síndrome mielodisplásica, tumor mieloproliferativo, neoplasia neuroendócrina, carcinoma de células Merkel, câncer de testículo e câncer de pele.

17. Medicamento, caracterizado pelo fato de ser do anticorpo monoclonal ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou compreendendo a composição farmacêutica definida na reivindicação 8, ou a molécula de ácido nucleico definida na reivindicação 9.

18. Medicamento do anticorpo monoclonal ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou compreendendo a composição farmacêutica definida na reivindicação 8, ou a molécula de ácido nucleico definida na reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o medicamento é usado para tratar um PD-L1 positivo um tumor ou um câncer; preferencialmente, o câncer é selecionado a partir de carcinoma de células escamosas, mieloma, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC), glioma, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mieloide crônica (CML), linfoma primário do mediastino de grandes células B, linfoma de células do manto (MCL), linfoma linfocítico pequeno (SLL), linfoma de grandes células B rico em células T/histócitos, mieloma múltiplo, proteína 1 da leucelia de células mieloides (Mcl-1), síndrome mielodisplásica (MDS), câncer gastrointestinal (trato), câncer renal, câncer de ovário, câncer de fígado, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de próstata, câncer de tireoide, melanoma, condrosarcoma, neuroblastoma, câncer de pâncreas, glioblastoma multiforme, carcinoma gástrico, câncer de osso, sarcoma de Ewing, câncer cervical, câncer cerebral, carcinoma gástrico, câncer de bexiga, carcinoma hepatocelular, câncer de mama, câncer de cólon, carcinoma hepatocelular (HCC), carcinoma de células renais de células claras (RCC), câncer de cabeça e pescoço, câncer de garganta, câncer hepatobiliar, câncer do sistema nervoso central, câncer de esôfago, mesotelioma pleural maligno, amiloidose sistêmica de cadeia leve, linfoma linfoplasmocítico, síndrome mielodisplásica, tumor mieloproliferativo, neoplasia neuroendócrina, carcinoma de células Merkel, câncer de testículo e câncer de pele.