TW201930360A - Pd-l1抗體、其抗原結合片段及醫藥用途 - Google Patents
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Abstract
本發明關於一種新的PD-L1抗體、其抗原結合片段及醫藥用途。進一步地,本發明關於包含所述PD-L1抗體CDR區的人源化抗體,以及包含PD-L1抗體及其抗原結合片段的藥物組合物,以及其作為藥物的用途。特別地,本發明關於一種人源化的PD-L1抗體在製備用於治療PD-L1相關的疾病或病症的藥物中的用途。
Description
本申請要求申請日為2018年01月10日的中國專利申請CN201810023267.0的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本發明關於PD-L1抗體以及其抗原結合片段,進一步地,本發明還關於包含所述PD-L1抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體,本發明還關於包含所述PD-L1抗體及其抗原結合片段的藥物組合物,以及其作為PD-L1相關疾病診斷劑和治療藥物的用途。
這裡的陳述僅提供與本發明有關的背景資訊,而不必然地構成現有技術。
腫瘤免疫治療是腫瘤治療領域一個長時期的熱點,其中T細胞的腫瘤免疫治療又處於其核心位置。腫瘤免疫治療是充分利用、調動腫瘤患者體內的殺手T細胞,對腫瘤進行殺傷作用,它可能是最有效的也是最安全的治療腫瘤的途徑。與此同時,腫瘤逃逸是腫瘤免疫治療面臨的一個巨大障礙,腫瘤細胞利用其自身對免疫系統的抑制作用促進了腫瘤的快速生長。
腫瘤的免疫逃逸機制與機體對腫瘤的免疫反應之間存在著極為複雜的關係。腫瘤免疫治療早期腫瘤特異性的殺手T細胞是有其生物活性的,但隨著腫瘤生長後期失去了殺傷的功能。所以腫瘤免疫治療是為了最大限度的提高患者自身對腫瘤的免疫系統反應,它不但要在體內活化原有的免疫系統反應,更要維持免疫系統反應的持續時間和反應強度,才是免疫治療腫瘤的關鍵。
人體內T細胞的活化採取了兩條訊號途徑系統,除了需要通過抗原呈現細胞呈現MHC-抗原肽給T細胞提供第一訊號外,還需要一系列協同刺激分子提供第二訊號,進而才能使T細胞產生正常的免疫反應。這個雙訊號途徑系統對體內免疫系統的平衡起著至關重要的作用,它嚴格調控機體對自身和非自身抗原產生不同的免疫反應。如果缺少協同刺激分子提供的第二訊號,將會導致T細胞的無反應或持續特異性免疫反應,從而產生耐受。因此,第二訊號途徑在機體免疫反應的整個過程中起著非常關鍵的調節作用。
程序性死亡分子1(programmed death-l,PD-l)是1992年發現的表現在T細胞表面的一個蛋白受體,參與到細胞的凋亡過程之中。PD-l屬於CD28家族,與細胞毒性T淋巴細胞抗原4(cytotoxic T Iymphocyte antigen 4,CTLA-4)具有23%的胺基酸同源性,但其表現卻與CTLA不同,主要表現在活化的T細胞、B細胞和髓系細胞上。PD-1有兩個配體,分別為PD-L1和PD-L2。PD-L1主要表現於T細胞、B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞(dendritic cell,DC)上,在活化後細胞上的表現能夠進行上調。而PD-L2的表現相對較局限,主要表現在抗原呈現細胞上,如活化的巨噬細胞和樹突狀細胞。
PD-L1 通過和PD-1及B7-1的結合抑制免疫系統,很多腫瘤細胞及腫瘤組織微環境的免疫細胞表現PD-L1。新的研究發現乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑素瘤、非小細胞肺癌、結腸癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌及肝癌等人類腫瘤組織中檢測到高PD-L1蛋白的表現,且PD-L1的表現程度和患者的臨床及預後緊密相關。
由於PD-L1起到第二訊號途徑抑制T細胞增殖的作用,所以阻斷PD-L1 / PD-1之間結合成為了腫瘤免疫治療領域一個非常有潛力的新興靶點。
目前有多家跨國製藥公司在研發針對PD-L1的單株抗體,它通過阻斷PD-L1 / PD-1之間結合,最大限度的提高患者自身對腫瘤的免疫系統反應,從而達到對腫瘤細胞進行殺傷的目的。相關的專利如:WO0139722、WO2013173223、WO2014195852、WO2013181634、WO2015048520、WO2015036511、US2014335093、WO2014100079、WO2014055897、US6803192B1、WO2014022758、US8617546B2和WO2010089411A2。
本發明提供與PD-L1的胞外區的胺基酸序列或三維結構結合的單株抗體或抗原結合片段(也可稱人PD-L1結合分子)。
在一些可選的實施方案中,本發明提供一種單株抗體或其抗原結合片段,所述單株抗體或抗原結合片段結合人PD-L1,所述單株抗體或其抗原結合片段包含:
(i)重鏈可變區和輕鏈可變區,其中重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:10、12和13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:14、15和16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區,所述SEQ ID NO.12所示的HCDR2中X1 為F或M,X2 為R或V,X3 為N或H;或
(ii)重鏈可變區和輕鏈可變區,其中重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:11、12和13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:14、15和16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區,所述SEQ ID NO.12所示的HCDR2中X1 為F或M,X2 為R或V,X3 為N或H;或
(iii)重鏈可變區和輕鏈可變區,其中重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:20、21和22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、24和25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區,其中HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3依次不同時為SEQ ID NO:30、38、22、23、40和25,
所述SEQ ID NO.20和21所示的HCDR1和HCDR2中X4 為S或D,X5 為Y或K,X6 為H或M,X7 為T、S、H或G,X8 為S、N或G,X9 為S、L或G,X10 為F、L、W或M,X11 為A、P或T,X12 為M、V、L或S,X13 為F或Y,所述SEQ ID NO:24所示的LCDR2中X14 為V或A,X15 為Y或N,X16 為A、L或V,X17 為E、F、Y或A(其中包括X17 選自E、F和A與X17 選自Y的情況)。
(i)重鏈可變區和輕鏈可變區,其中重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:10、12和13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:14、15和16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區,所述SEQ ID NO.12所示的HCDR2中X1 為F或M,X2 為R或V,X3 為N或H;或
(ii)重鏈可變區和輕鏈可變區,其中重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:11、12和13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:14、15和16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區,所述SEQ ID NO.12所示的HCDR2中X1 為F或M,X2 為R或V,X3 為N或H;或
(iii)重鏈可變區和輕鏈可變區,其中重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:20、21和22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、24和25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區,其中HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3依次不同時為SEQ ID NO:30、38、22、23、40和25,
所述SEQ ID NO.20和21所示的HCDR1和HCDR2中X4 為S或D,X5 為Y或K,X6 為H或M,X7 為T、S、H或G,X8 為S、N或G,X9 為S、L或G,X10 為F、L、W或M,X11 為A、P或T,X12 為M、V、L或S,X13 為F或Y,所述SEQ ID NO:24所示的LCDR2中X14 為V或A,X15 為Y或N,X16 為A、L或V,X17 為E、F、Y或A(其中包括X17 選自E、F和A與X17 選自Y的情況)。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段結合人PD-L1,所述單株抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區,其中重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO:10所示的HCDR1、如SEQ ID NO:28或29所示的HCDR2和如SEQ ID NO:13所示的HCDR3區,輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:14、15和16胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段的所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO:11所示的HCDR1、如SEQ ID NO:28或29所示的HCDR2和如SEQ ID NO:13所示的HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:14、15和16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段的所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO:30所示的HCDR1、如SEQ ID NO:32至37任一所示的HCDR2和如SEQ ID NO:22所示的HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO:23的LCDR1、如SEQ ID NO:39、40、41、67和69任一的LCDR2和如SEQ ID NO:25的LCDR3區。
在一些實施方案中,如前的所述單株抗體或其抗原結合片段的所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO:31所示的HCDR1、如SEQ ID NO:32、33、34、35、36和37任一所示的HCDR2和如SEQ ID NO:22所示的HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO:23的LCDR1、如SEQ ID NO:39、40、41、67和69任一的LCDR2和如SEQ ID NO:25的LCDR3區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:14-16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:14-16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:14-16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:14-16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:14-16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;
或在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區。
或在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段與人PD-L1的親和力KD值小於10-9
M或10-10
M。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或其抗原結合片段交叉結合食蟹猴或恆河猴PD-L1和/或小鼠PD-L1。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:17所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:19所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:18所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:19所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:26所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:27所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:42所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:45所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:43所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:45所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:44所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:45所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:46所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56和57任一所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:47所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56和57任一所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:48所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56和57任一所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:49所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56和57任一所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:50所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56和57任一所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:51所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56和57任一所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:52所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56和57任一所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:53所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56和57任一所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:54所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55和57任一所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:46所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56、57、70和72任一所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:47所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56、57、70和72任一所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:48所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56、57、70和72任一所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:49所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56、57、70和72任一所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:50所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56、57、70和72任一所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:51所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56、57、70和72任一所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:52所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56、57、70和72任一所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:53所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56、57、70和72任一所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:66所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56、57、70和72任一所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體或抗原結合片段包含胺基酸序列如SEQ ID NO:54所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、57、70和72任一所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體為全長抗體,進一步包括人抗體恆定區,優選地,所述人抗體恆定區的重鏈恆定區選自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恆定區及其常規變體,所述人抗體恆定區的輕鏈恆定區選自人抗體κ和λ鏈恆定區及其常規變體,優選包含胺基酸序列如SEQ ID NO:58、60或65所示的人抗體重鏈恆定區和SEQ ID NO:59所示的人輕鏈恆定區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體為全長抗體,進一步包括人抗體恆定區,包含胺基酸序列如SEQ ID NO:58所示的人抗體重鏈恆定區和SEQ ID NO:59所示的人輕鏈恆定區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體為全長抗體,進一步包括人抗體恆定區,包含胺基酸序列如SEQ ID NO:60所示的人抗體重鏈恆定區和SEQ ID NO:59所示的人輕鏈恆定區。
在一些實施方案中,如前所述單株抗體為全長抗體,進一步包括人抗體恆定區,包含胺基酸序列如SEQ ID NO:65所示的人抗體重鏈恆定區和SEQ ID NO:59所示的人輕鏈恆定區。
在一些實施方案中,所述抗原結合片段是選自Fab、Fab'、F(ab')2
、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)和包含CDR的肽的抗原結合片段。
另一方面,本發明提供一種藥物組合物,其含有治療有效量的根據前述所述的單株抗體或其抗原結合片段,以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑,優選地,所述治療有效量的單株抗體或其抗原結合片段為單位劑量0.1-3000mg/kg的如前所述單株抗體或其抗原結合片段。
在一些方面,本發明提供一種核酸分子,其編碼前述的單株抗體或其抗原結合片段。
在一些方面,本發明提供一種重組載體,其包含如前所述的核酸分子。
在一些方面,本發明提供一種用根據如前所述的重組載體轉化的宿主細胞,所述宿主細胞選自原核細胞和真核細胞,優選為真核細胞,更優選哺乳動物細胞。
在一些方面,本發明提供用於生產如前所述的單株抗體或其抗原結合片段的方法,所述方法包括將前述的宿主細胞在培養基中進行培養以形成並積累前述的單株抗體或其抗原結合片段,以及從培養物回收所述單株抗體或其抗原結合片段。
在一些方面,本發明提供用於免疫檢測或測定人PD-L1的方法,所述方法包括使用如前所述的單株抗體或其抗原結合片段。
在一些方面,本發明提供如前所述的單株抗體或其抗原結合片段在製備與人PD-L1相關的疾病的診斷劑中的應用。
在一些方面,本發明提供與人PD-L1相關的疾病的治療方法,所述方法包括向受試者施用藥物有效量的如前所述的單株抗體或其抗原結合片段,或包含如前所述的藥物組合物,或如前所述的核酸分子,以治療人PD-L1相關的疾病,其中所述疾病優選為腫瘤或癌症;更優選為鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭和頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、神經膠質瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、瀰漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL )、濾泡性淋巴瘤、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、髓樣細胞白血病-1蛋白( Mcl-1)、骨髓異常增症候群(MDS)、胃腸(道)癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴細胞性白血病、淋巴細胞白血病、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、黑素瘤、軟骨肉瘤、神經母細胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質細胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、肝細胞癌(HCC)、透明細胞腎細胞癌(RCC)、頭和頸癌、咽喉癌、肝膽癌(hepatobiliary cancer)、中樞神經系統癌、食管癌、惡性胸膜間皮瘤、全身性輕鏈澱粉樣變性、淋巴漿細胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓異常增生症候群、骨髓增生性腫瘤、神經內分泌腫瘤、梅克爾細胞癌、睪丸癌和皮膚癌,最優選為PD-L1陽性的鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭和頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、神經膠質瘤、何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、瀰漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL) 、慢性骨髓性白血病(CML)、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、髓樣細胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓異常增生症候群(MDS)、胃腸(道)癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴細胞性白血病、淋巴細胞白血病、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、黑素瘤、軟骨肉瘤、神經母細胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質細胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、肝細胞癌(HCC)、透明細胞腎細胞癌(RCC)、頭和頸癌、咽喉癌、肝膽癌(hepato biliary cancer)、中樞神經系統癌、食管癌、惡性胸膜間皮瘤、全身性輕鏈澱粉樣變性、淋巴漿細胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓異常增生症候群、骨髓增生性腫瘤、神經內分泌腫瘤、梅克爾細胞癌、睪丸癌和皮膚癌。
在一些方面,本發明提供如前所述的單株抗體或其抗原結合片段,或包含如前所述的藥物組合物,或如前所述的核酸分子在製備與人PD-L1相關的疾病的治療劑中的應用,其中所述疾病優選為腫瘤或癌症;更優選為鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭和頸鱗狀細胞癌(HNSCC) 、神經膠質瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、瀰漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL )、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、髓樣細胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓異常增生症候群(MDS)、胃腸(道)癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、淋巴細胞性白血病、淋巴細胞白血病、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、黑素瘤、軟骨肉瘤、神經母細胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質細胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、肝細胞癌(HCC)、透明細胞腎細胞癌(RCC)、頭和頸癌、咽喉癌、肝膽癌(hepatobiliary cancer)、中樞神經系統癌、食管癌、惡性胸膜間皮瘤、全身性輕鏈澱粉樣變性、淋巴漿細胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓異常增生症候群、骨髓增生性腫瘤、神經內分泌腫瘤、梅克爾細胞癌、睪丸癌和皮膚癌,最優選為PD-L1陽性的鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭和頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、神經膠質瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、瀰漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、髓樣細胞白血病-1蛋白(Mcl-1) 、骨髓異常增生症候群(MDS)、胃腸(道)癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴細胞性白血病、淋巴細胞白血病、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、黑素瘤、軟骨肉瘤、神經母細胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質細胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、肝細胞癌(HCC)、透明細胞腎細胞癌(RCC)、頭和頸癌、咽喉癌、肝膽癌(hepatobiliary cancer)、中樞神經系統癌、食管癌、惡性胸膜間皮瘤、全身性輕鏈澱粉樣變性、淋巴漿細胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓異常增生症候群、骨髓增生性腫瘤、神經內分泌腫瘤、梅克爾細胞癌、睪丸癌和皮膚癌。
作為藥物的如前所述單株抗體或其抗原結合片段,或包含如前所述的藥物組合物,或如前所述的核酸分子。
作為藥物的根據如前所述的單株抗體或其抗原結合片段,或包含如前所述的藥物組合物,或如前所述的核酸分子,所述藥物用於治療PD-L1陽性的腫瘤或癌症,優選地,所述癌症選自鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭和頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、神經膠質瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、瀰漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、髓樣細胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓異常增生症候群(MDS)、胃腸(道)癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴細胞性白血病、淋巴細胞血病、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、黑素瘤、軟骨肉瘤、神經母細胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質細胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、肝細胞癌(HCC)、透明細胞腎細胞癌(RCC)、頭和頸癌、咽喉癌、肝膽癌(hepatobiliary cancer)、中樞神經系統癌、食管癌、惡性胸膜間皮瘤、全身性輕鏈澱粉樣變性、淋巴漿細胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓異常增生症候群、骨髓增生性腫瘤、神經內分泌腫瘤、梅克爾細胞癌、睪丸癌和皮膚癌。
[術語]
為了更容易理解本發明,以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義,本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J. biol. chem, 243, p3558 (1968)中所述。
本發明所述的「抗體」指免疫球蛋白,是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同,故其抗原性也不同。據此,可將免疫球蛋白分為五類,或稱為免疫球蛋白的同種型,即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE,其相應的重鏈分別為µ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別,又可分為不同的亞類,如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈通過恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本發明中,本發明所述的抗體輕鏈可進一步包含輕鏈恆定區,所述的輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
在本發明中,本發明所述的抗體重鏈可進一步包含重鏈恆定區,所述的重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。
抗體重鍊和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大,為可變區(Fv區);靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定,為恆定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性,又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成,從胺基端到羧基端依次排列的順序為:FR1,CDR1,FR2,CDR2 ,FR3,CDR3,FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3;重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本發明所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3,HCDR1-3)。
本發明的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體,優選人源化抗體。
「單株抗體」是指從基本上均質抗體的群體獲得的抗體,即除可能的變體抗體(例如含有天然存在的突變或在製造單株抗體製劑的期間產生的突變,這些變體通常以少量存在)之外,構成所述群體的個別抗體相同和/或結合相同表位。與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多複製抗體製備物不同,單株抗體製備物(製劑)的每個單株抗體是針對抗原上的單一決定簇的。因此,修飾語「單株」指示如從基本上均質抗體群體獲得的抗體的特性,且不應解釋為需要通過任何特定方法來製造抗體。例如,本發明的單株抗體可通過各種技術製備,所述技術包括但不限於融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的轉基因動物的方法,此類方法以及用於製備單株抗體的其他示例性方法在本文中進行描述。
術語「鼠源抗體」在本發明中為根據本領域知識和技能製備的對人PD-L1的單株抗體。製備時用PD-L1抗原註射試驗對象,然後分離表現具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本發明一個優選的實施方案中,所述的鼠源PD-L1抗體或其抗原結合片段,可進一步包含鼠源κ、λ鍊或其變體的輕鏈恆定區,或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其變體的重鏈恆定區。
術語「嵌合抗體(chimeric antibody)」,是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體,可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫反應反應。建立嵌合抗體,要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤,然後從鼠融合瘤細胞中複製可變區基因,再根據需要複製人抗體的恆定區基因,將鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入表現載體中,最後在真核系統或原核系統中表現嵌合抗體分子。在本發明一個優選的實施方案中,所述的PD-L1嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。所述的PD-L1嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區,優選包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區,或者使用胺基酸突變(如YTE突變或回復突變)的IgG1、IgG2或IgG4變體。
術語「人源化抗體(humanized antibody)」,也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody),是指將鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架,即不同類型的人種系抗體框架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量鼠蛋白成分,從而誘導的異源性反應。此類架構序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或發明的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在「VBase」人種系序列數據庫(在www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得),以及在Kabat,E.A.等人,1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時,引起的活性下降,可對所述的人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變,以保持活性。本發明的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。在本發明一個優選的實施方案中,人的抗體可變區框架經過設計選擇,其中所述抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列,來源於人種系重鏈IGHV3-23*04和hJH4.1的組合序列,和人種系輕鏈IGKV1-12*01和hJK4.1的組合序列。為避免免疫原性下降的同時,引起的活性下降,可對所述的人抗體可變區可進行最少反向突變(回復突變,即將人抗體來源的FR區胺基酸殘基突變成原始來源抗體對應位置的胺基酸殘基),以保持活性。
CDR的移植可由於與抗原接觸的架構殘基而導致產生的PD-L1抗體或其抗原結合片段對抗原的親和力減弱。此類相互作用可以是體細胞高度突變的結果。因此,可能仍然需要將此類供體架構胺基酸移植至人源化抗體的架構。來自非人PD-L1抗體或其抗原結合片段的參與抗原結合的胺基酸殘基可通過檢查鼠單株抗體可變區序列和結構來鑒定。CDR供體架構中與種系不同的的各殘基可被認為是相關的。如果不能確定最接近的種系,那麼可將序列與亞型共有序列或具有高相似性百分數的鼠序列的共有序列相比較。稀有架構殘基被認為可能是體細胞高度突變的結果,從而在結合中起著重要作用。
術語抗體的「抗原結合片段」或「功能片段」 是指抗體的保持特異性結合抗原(例如,PD-L1)的能力的一個或多個片段。已顯示可利用全長抗體的片段來進行抗體的抗原結合功能。術語抗體的「抗原結合片段」中包含的結合片段的實例包括(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段;(ii)F(ab')2
片段,包含通過鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段,(iii)由VH和CH結構域組成的Fd片段;(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段;(v)單結構域或dAb片段(Ward等人,(1989) Nature 341: 544-546),其由VH結構域組成;和(vi)分離的互補決定區(CDR)或(vii)可任選地通過合成的接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的組合。此外,雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼,但可使用重組方法,通過合成的接頭連接它們,從而使得其能夠產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv);參見,例如,Bird等人(1988)Science 242: 423-426;和Huston 等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的「抗原結合片段」中。使用本領域技術人員已知的常規技術獲得此類抗體片段,並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段。可通過重組DNA技術或通過酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體,例如,IgG(例如,IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗體。
本發明的抗原結合片段包括Fab、F(ab')2
、Fab'、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)、包含CDR的肽等。
Fab是通過用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H鏈的224位的胺基酸殘基)處理IgG抗體分子所獲得的片段中的具有約50,000的分子量並具有抗原結合活性的抗體片段,其中H鏈N端側的約一半和整個L鏈通過二硫鍵結合在一起。
本發明的Fab可以通過用木瓜蛋白酶處理本發明的特異性識別人PD-L1並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體來生產。此外,可以通過將編碼所述抗體的Fab的DNA插入到原核生物表現載體或真核生物表現載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表現Fab來生產所述Fab。
F(ab')2
是通過用酶胃蛋白酶消化IgG鉸鏈區中兩個二硫鍵的下方部分而獲得的分子量為約100,000並具有抗原結合活性並包含在鉸鏈位置相連的兩個Fab區的抗體片段。
本發明的F(ab')2
可以通過用胃蛋白酶處理本發明的特異性識別人PD-L1並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體來生產。此外,可以通過用硫醚鍵或二硫鍵連接下面描述的Fab'來生產所述F(ab')2
。
Fab'是通過切割上述F(ab')2
的鉸鏈區的二硫鍵而獲得的分子量為約50,000並具有抗原結合活性的抗體片段。本發明的Fab'可以通過用還原劑例如二硫蘇糖醇處理本發明的特異性識別PD-L1並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的F(ab')2
來生產。
此外,可以通過將編碼抗體的Fab'片段的DNA插入到原核生物表現載體或真核生物表現載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表現Fab'來生產所述Fab'。
術語「單鏈抗體」、「單鏈Fv」或「scFv」意指包含通過接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域;VH)和抗體輕鏈可變結構域(或區域;VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構:NH2
-VL-接頭-VH-COOH或NH2
-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成,例如使用1-4個重複的變體(Holliger等人(1993),Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 6444-6448)。可用於本發明的其他接頭由Alfthan 等人(1995),Protein Eng.8:725-731,Choi 等人(2001),Eur.J.Immuno l.31:94-106,Hu 等人(1996),Cancer Res.56:3055-3061,Kipriyanov 等人(1999),J.Mol.Biol.293:41-56 和Roovers 等人(2001),Cancer Immunol.描述。
本發明的scFv可以通過以下步驟來生產:獲得本發明的特異性識別人PD-L1並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA,構建編碼scFv的DNA,將所述DNA插入到原核生物表現載體或真核生物表現載體中,然後將所述表現載體導入到原核生物或真核生物中以表現scFv。
雙抗體是其中scFv被二聚體化的抗體片段,是具有二價抗原結合活性的抗體片段。在二價抗原結合活性中,兩個抗原可以是相同或不同的。
本發明的雙抗體可以通過以下步驟來生產:獲得本發明的特異性識別人PD-L1並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA,構建編碼scFv的DNA以使肽接頭的胺基酸序列長度為8個殘基或更少,將所述DNA插入到原核生物表現載體或真核生物表現載體中,然後將所述表現載體導入到原核生物或真核生物中以表現雙抗體。
dsFv是通過將其中每個VH和VL中的一個胺基酸殘基被半胱胺酸殘基取代的多肽經由半胱胺酸殘基之間的二硫鍵相連而獲得的。可以按照已知方法(Protein Engineering,7,697(1994))基於抗體的三維結構預測來選擇被半胱胺酸殘基取代的胺基酸殘基。
本發明的dsFv可以通過以下步驟來生產:獲得本發明的特異性識別人PD-L1並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH 和VL的編碼cDNA,構建編碼dsFv的DNA,將所述DNA插入到原核生物表現載體或真核生物表現載體中,然後將所述表現載體導入到原核生物或真核生物中以表現dsFv。
包含CDR的肽是通過包含VH或VL的CDR中的一個或多個區域而構成的。包含多個CDR的肽可以被直接相連或經由適合的肽接頭相連。
本發明的包含CDR的肽可以通過以下步驟來生產:構建本發明的特異性識別人PD-L1並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的CDR的編碼DNA,將所述DNA插入到原核生物表現載體或真核生物表現載體中,然後將所述表現載體導入到原核生物或真核生物中以表現所述肽。也可以通過化學合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法來生產所述包含CDR的肽。
術語「CDR」是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。所述6個CDR的最常用的定義之一由Kabat E.A.等人,(1991) Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication 91-3242提供。如本文中使用的,CDR的Kabat定義應用於輕鏈可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3),以及重鏈可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR H1、CDR H2、CDR H3或H2、H3)。
本文中使用的術語「抗體框架」,是指可變結構域VL或VH的一部分,其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講,其是不具有CDR的可變結構域。
人抗體重鏈恆定區和人抗體輕鏈恆定區的「常規變體」是指現有技術已發明的來源於人的不改變抗體可變區結構和功能的重鏈恆定區或輕鏈恆定區的變體,示例性變體包括對重鏈恆定區進行定點改造和胺基酸替換的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定區變體,具體替換如現有技術已知的YTE突變,L234A和/或L235A突變,或S228P突變,或獲得knob-into-hole結構的突變(使得抗體重鏈具有knob-Fc和hole-Fc組合),或上述突變體的組合,這些突變已被證實使得抗體具有新的性能,但不改變抗體可變區的功能。
術語「表位」或「抗原決定位」是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位(例如,PD-L1分子上的特定部位)。表位通常以獨特的空間構象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個連續或非連續的胺基酸。參見,例如,Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷,G.E. Morris,Ed. (1996)。
術語「特異性結合」、「選擇性結合」、「選擇性地結合」和「特異性地結合」是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常,抗體以大約小於10-8
M,例如大約小於10-9
M、10-10
M、10-11
M或更小的親和力(KD)結合。
術語「KD」或「Kd」是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。通常,本發明的抗體以小於大約10-7
M,例如小於大約10-8
M、10-9
M或10-10
M或更小的解離平衡常數(KD)結合PD-L1,例如,如使用表面等離子體共振(SPR)技術在BIACORE 儀中測定的。
當術語「競爭」用於競爭相同表位的抗原結合蛋白(例如中和抗原結合蛋白或中和抗體)的情況中時,意指在抗原結合蛋白之間競爭,其通過以下測定法來測定:在所述測定法中,待檢測的抗原結合蛋白(例如抗體或其免疫學功能片段)防止或抑制(例如降低)參考抗原結合蛋白(例如配體或參考抗體)與共同抗原(例如PD-L1抗原或其片段)的特異性結合。眾多類型的競爭性結合測定可用於確定一種抗原結合蛋白是否與另一種競爭,這些測定例如:固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定(參見例如Stahli等,1983,Methodsin Enzymology 9:242-253);固相直接生物素-親和素EIA(參見例如Kirkland等,1986,J. Immunol. 137:3614-3619)、固相直接標記測定、固相直接標記夾心測定(參見例如Harlow和Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual(抗體,實驗室手冊),Cold Spring Harbor Press);用I-125標記物的固相直接標記RIA(參見例如Morel等,1988,Molec.Immunol.25:7-15);固相直接生物素-親和素EIA(參見例如Cheung,等,1990,Virology 176:546-552);和直接標記的RIA(Moldenhauer等,1990,Scand. J. Immunol. 32:77-82)。通常所述測定法關於使用結合荷有未標記的檢測抗原結合蛋白及標記的參考抗原結合蛋白任一種的固態表面或細胞的純化的抗原。通過測量在所測抗原結合蛋白存在下結合固態表面或細胞的標記的量來測量競爭性抑制。通常所測抗原結合蛋白過量存在。由競爭性測定(競爭抗原結合蛋白)鑒定的抗原結合蛋白包括:結合與參考抗原結合蛋白同一表位的抗原結合蛋白;和結合充分接近參考抗原結合蛋白的結合表位的鄰近表位的抗原結合蛋白,所述兩個表位在空間上互相妨礙發生結合。在本文實施例中提供關於用於測定競爭性結合的方法的其它詳細資料。通常當競爭的抗原結合蛋白過量存在時,其將抑制(例如降低)至少40-45%、45-50%、50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或75%或更多參考抗原結合蛋白與共同抗原的特異性結合。在某些情況下,結合被抑制至少80-85%、85-90%、90-95%、95-97%或97%或更多。
本文中使用的術語「核酸分子」是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的,但優選是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時,核酸是「有效連接的」。例如,如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄,那麼啟動子或增強子有效地連接至所述編碼序列。
術語「載體」是指能夠運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中,載體是「質體」,其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA 環。在另一個實施方案中,載體是病毒載體,其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中發明的載體能夠在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如,具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組,從而隨宿主基因組一起複製(例如,非附加型哺乳動物載體)。
現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法,如冷泉港的抗體實驗技術指南,5-8章和15章。例如,鼠可以用人PD-L1或其片段免疫,所得到的抗體能被覆性、純化,並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以通過比對IMGT人類抗體可變區種系基因資料庫和MOE軟體,從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http://imgt.cines.fr得到,或者從免疫球蛋白雜誌,2001ISBN012441351上獲得。
術語「宿主細胞」是指已向其中引入了表現載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員,例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株;芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis);肺炎球菌(Pneumococcus);鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)和NS0細胞。
本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如,編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列,可以複製並重組至GS表現載體。重組的免疫球蛋白表現載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術,哺乳動物類表現系統會導致抗體的糖基化,特別是在Fc區的高度保守N端位點。通過表現與人PD-L1特異性結合的抗體得到穩定的複製。陽性的複製在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如,用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用pH梯度法洗脫結合的抗體,用SDS-PAGE檢測抗體片段,收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體,也可以用常規方法去除,比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍,如-70℃,或者凍乾。
「給予」和「處理」當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時,是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。「給予」和「處理」可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸,以及試劑與流體的接觸,其中所述流體與細胞接觸。「給予」和「處理」還意指通過試劑、診斷、結合組合物或通過另一種細胞體外和離體處理例如細胞。「處理」當應用於人、獸醫學或研究受試者時,是指治療處理、預防或預防性措施,研究和診斷應用。
「治療」意指給予患者內用或外用治療劑,例如包含本發明的任一種結合化合物的組合物,所述患者具有一種或多種疾病症狀,而已知所述治療劑對這些症狀具有治療作用。通常,在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑,以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作「治療有效量」)可根據多種因素變化,例如患者的疾病狀態、年齡和體重,以及藥物在患者產生需要療效的能力。通過醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法,可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本發明的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效,但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定,其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
「保守修飾」或「保守置換或取代」是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸,使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉,一般而言,多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987) Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224頁,(第4版))。另外,結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破壞生物學活性。
「有效量」包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化:例如,待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
「外源性」指根據情況在生物、細胞或人體外產生的物質。「內源性」指根據情況在細胞、生物或人體內產生的物質。
「同源性」是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同堿基或胺基酸單體亞基佔據時,例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時,那麼所述分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如,在序列最佳比對時,如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源,那麼兩個序列為60%同源;如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源,那麼兩個序列為95%同源。一般而言,當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
本文使用的表述「細胞」、「細胞系」和「細胞培養物」可互換使用,並且所有這類名稱都包括後代。因此,單詞「轉化體」和「轉化細胞」包括原代受試細胞和由其衍生的培養物,而不考慮轉移數目。還應當理解的是,由於故意或非有意的突變,所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下,其由上下文清楚可見。
本文使用的「聚合酶鏈式反應」或「PCR」是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美國專利號4,683,195中所述擴增的程序或技術。一般來說,需要獲得來自目標區域末端或之外的序列資訊,使得可以設計寡核苷酸引物;這些引物在序列方面與待擴增模板的對應鏈相同或相似。2個引物的5’末端核苷酸可以與待擴增材料的末端一致。PCR可用於擴增特定的RNA序列、來自總基因組DNA的特定DNA序列和由總細胞RNA轉錄的cDNA、噬菌體或質體序列等。一般參見Mullis等(1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263; Erlich編輯,(1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.)。本文使用的PCR被視為用於擴增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應法的一個實例,但不是唯一的實例,所述方法包括使用作為引物的已知核酸和核酸聚合酶,以擴增或產生核酸的特定部分。
「任選」或「任選地」意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生,該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如,「任選包含1-3個抗體重鏈可變區」意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
「藥物組合物」表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物,所述其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進對生物體的給藥,利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
此外,本發明包括用於治療與PD-L1陽性細胞相關的疾病的藥劑,所述藥劑包含本發明的單株抗體或其抗體片段作為活性成分。
對與PD-L1相關的疾病沒有限制,只要它是與PD-L1相關的疾病即可,例如利用本發明的分子誘導的治療反應可通過結合人類PD-L1,然後阻遏PD-L1與其配體PD-1、B7-1的結合,或殺傷過表現PD-L1的腫瘤細胞。因此,當處於適於治療應用的製備物和製劑中時,本發明的分子對這樣一些人是非常有用的,他們患有腫瘤或癌症,優選黑色素瘤、結腸癌、乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、非小細胞肺癌、膀胱癌等。
此外,本發明關於用於免疫檢測或測定PD-L1的方法、用於免疫檢測或測定PD-L1的試劑、用於免疫檢測或測定表現PD-L1的細胞的方法和用於診斷與PD-L1陽性細胞相關的疾病的診斷劑,其包含本發明的特異性識別人PD-L1並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體或抗體片段作為活性成分。
在本發明中,用於檢測或測定PD-L1的量的方法可以是任何已知方法。例如,它包括免疫檢測或測定方法。
免疫檢測或測定方法是使用標記的抗原或抗體檢測或測定抗體量或抗原量的方法。免疫檢測或測定方法的實例包括放射性物質標記的免疫抗體方法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法、蛋白質免疫印跡法、物理化學方法等。
上述與PD-L1陽性細胞相關的疾病可以通過用本發明的單株抗體或抗體片段檢測或測定表現PD-L1的細胞來診斷。
為了檢測表現多肽的細胞,可以使用已知的免疫檢測方法,並優選使用免疫沉澱法、螢光細胞染色法、免疫組織染色法等。此外,可以使用利用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystem)的螢光抗體染色法等。
在本發明中,對用於檢測或測定PD-L1的活體樣品沒有特別限制,只要它具有包含表現PD-L1的細胞的可能性即可,例如組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿液、糞便、組織液或培養液。
根據所需的診斷方法,含有本發明的單株抗體或其抗體片段的診斷劑還可以含有用於執行抗原-抗體反應的試劑或用於檢測反應的試劑。用於執行抗原-抗體反應的試劑包括緩衝劑、鹽等。用於檢測的試劑包括通常用於免疫檢測或測定方法的試劑,例如識別所述單株抗體、其抗體片段或其結合物的標記的第二抗體和與所述標記對應的受質等。
通過改造,本發明獲得了親和力更高、腫瘤殺傷活性更強、免疫原性更低等效果的PD-L1抗體。
[實施例與測試例]
以下結合實施例進一步描述本發明,但這些實施例並非限制著本發明的範圍。本發明實施例中未註明具體條件的實驗方法,通常按照常規條件,如冷泉港的抗體技術實驗手冊,分子複製手冊;或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑,為市場購買的常規試劑。
實施例1. PD-L1抗體的親和力成熟酵母文庫的構建以及文庫的驗證
為獲得藥效更佳的抗人PD-L1抗體,在HRP00052和HRP00049兩個抗體的基礎上設計並製備scFv抗體的親和力成熟酵母文庫,並從中篩選新的人PD-L1抗體。HRP00052和HRP00049的CDR和輕重鏈可變區序列均來自WO2017084495A1。具體序列如下:
HRP00049:9-2(H2/L10) IgG4(AA)(S228P)
重鏈: HRP00049抗體重鏈序列:(SEQ ID NO:1)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
HRP00049抗體重鏈序列編碼基因序列:(SEQ ID NO:2)
CAGGTGCAACTGCAGGAGAGCGGCCCCGGACTCGTGAAACCCTCCCAGACCCTGAGCCTGACCTGTACCGTGAGCGGCGGCAGCATCAGCAACGACTACTGGACTTGGATCAGGCAGCACCCCGGCAAAGGCCTGGAGTACATCGGCTACATCAGCTACACCGGCTCCACCTACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGGGTGACCATCAGCCGGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCTGCCGACACAGCCGTGTACTATTGTGCCAGAAGCGGCGGATGGCTGGCCCCTTTCGACTACTGGGGCAGAGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC GCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCTGCTGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA
輕鏈:HRP00049抗體輕鏈序列:(SEQ ID NO:3)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
HRP00049抗體輕鏈序列編碼基因序列:(SEQ ID NO:4)
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCTGATAGCCTGGCTGTGAGCCTGGGCGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGTTCTACCATAGCAACCAGAAGCACAGCCTCGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAACCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGCGCCAGCACAAGAGAGAGCGGAGTGCCCGATAGGTTCAGCGGCAGCGGATCCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACGGCTACCCTTACACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
HRP00052:24D5(GF)IgG4(AA) (S228P)重鏈:HRP00052抗體重鏈序列:(SEQ ID NO:5)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
HRP00052抗體重鏈序列編碼基因序列:(SEQ ID NO:6)
CAGGTGCAACTGGTGCAGAGCGGTGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCAAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAGGATCGGGCCCAACAGTGGTTTCACTAGCTACAATGAAAAGTTCAAGAACAGGGTAACCATGACCAGGGACACCTCCACCAGCACAGTGTATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCGGCAGCAGCTACGACTACTTCGACTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGT GCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCTGCTGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA
輕鏈:HRP00052抗體輕鏈序列:(SEQ ID NO:7)DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
HRP00052抗體輕鏈序列編碼基因序列:(SEQ ID NO:8)
GACATCGTGCTGACCCAGAGTCCCGCCTCACTTGCCGTGAGCCCCGGTCAGAGGGCCACCATCACCTGTAGGGCCAGCGAGAGCGTGAGCATCCACGGCACCCACCTGATGCACTGGTATCAACAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAACTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTCACTATCAACCCCGTGGAGGCCGAGGACACCGCCAACTACTACTGCCAGCAGAGCTTCGAGGACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
HRP00049:9-2(H2/L10) IgG4(AA)(S228P)
重鏈: HRP00049抗體重鏈序列:(SEQ ID NO:1)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
HRP00049抗體重鏈序列編碼基因序列:(SEQ ID NO:2)
CAGGTGCAACTGCAGGAGAGCGGCCCCGGACTCGTGAAACCCTCCCAGACCCTGAGCCTGACCTGTACCGTGAGCGGCGGCAGCATCAGCAACGACTACTGGACTTGGATCAGGCAGCACCCCGGCAAAGGCCTGGAGTACATCGGCTACATCAGCTACACCGGCTCCACCTACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGGGTGACCATCAGCCGGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCTGCCGACACAGCCGTGTACTATTGTGCCAGAAGCGGCGGATGGCTGGCCCCTTTCGACTACTGGGGCAGAGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC GCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCTGCTGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA
輕鏈:HRP00049抗體輕鏈序列:(SEQ ID NO:3)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
HRP00049抗體輕鏈序列編碼基因序列:(SEQ ID NO:4)
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCTGATAGCCTGGCTGTGAGCCTGGGCGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGTTCTACCATAGCAACCAGAAGCACAGCCTCGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAACCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGCGCCAGCACAAGAGAGAGCGGAGTGCCCGATAGGTTCAGCGGCAGCGGATCCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACGGCTACCCTTACACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
HRP00052:24D5(GF)IgG4(AA) (S228P)重鏈:HRP00052抗體重鏈序列:(SEQ ID NO:5)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
HRP00052抗體重鏈序列編碼基因序列:(SEQ ID NO:6)
CAGGTGCAACTGGTGCAGAGCGGTGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCAAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAGGATCGGGCCCAACAGTGGTTTCACTAGCTACAATGAAAAGTTCAAGAACAGGGTAACCATGACCAGGGACACCTCCACCAGCACAGTGTATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCGGCAGCAGCTACGACTACTTCGACTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGT GCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCTGCTGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA
輕鏈:HRP00052抗體輕鏈序列:(SEQ ID NO:7)DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
HRP00052抗體輕鏈序列編碼基因序列:(SEQ ID NO:8)
GACATCGTGCTGACCCAGAGTCCCGCCTCACTTGCCGTGAGCCCCGGTCAGAGGGCCACCATCACCTGTAGGGCCAGCGAGAGCGTGAGCATCCACGGCACCCACCTGATGCACTGGTATCAACAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAACTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTCACTATCAACCCCGTGGAGGCCGAGGACACCGCCAACTACTACTGCCAGCAGAGCTTCGAGGACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
上述抗體序列中下劃線部分為抗體的可變區部分,其他正體部分為抗體恆定區部分。
酵母文庫的構建: 設計簡並引物,通過PCR的方法將設計的突變胺基酸引入到HRP00049和HRP00052抗體的文庫中。再通過二代測序的方法對文庫的QC進行驗證,其中基於HRP00049和HRP00052序列分別各構建了7個庫容為109
級別的抗體酵母文庫。
實施例2. 抗原的製備
設計並合成人PD-L1-IgG1Fc融合蛋白,經Protein A的親和柱純化,可獲得高純度的重組PD-L1-Fc蛋白,用於檢測抗PD-L1抗體與抗原的結合。
人PD-L1-IgG1Fc:(SEQ ID NO:9)
MEFGLSWLFLVAILKGVQC FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNEREPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
註釋:訊號肽 +胞外區+hIgG1Fc 。
人PD-L1-IgG1Fc:(SEQ ID NO:9)
MEFGLSWLFLVAILKGVQC FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNEREPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
註釋:訊號肽 +胞外區+hIgG1Fc 。
實施例3. 抗體的篩選
HRP00052文庫利用生物素化的人PD-L1-hIgG1Fc抗原,經過兩輪MACS篩選(鏈黴素磁珠,Invitrogen)和兩輪FACS篩選(BD FACSAriaTM
FUSION)。再挑選400個左右的酵母單株培養和誘導表現,FACS(BD FACSCanto II)檢測酵母單株對人PD-L1-hIgG1Fc抗原的結合,挑選出比野生型HRP00052抗體親和力高的酵母單株測序驗證,經過對測序複製進行比對分析,去除冗餘序列之後,將非冗余序列轉換成全長IgG(γ1, κ)進行哺乳動物細胞表現。親和純化之後的全長抗體採用BIAcoreTM
X-100(GE Life Sciences)進行親合力測定。
HRP00049文庫利用生物素化的人PD-L1-hIgG1Fc抗原和生物素化的小鼠PD-L1-hIgG1Fc,經過三輪MACS篩選和三輪FACS篩選。再挑選400個左右的酵母單株培養和誘導表現,FACS檢測酵母單株對人PD-L1-hIgG1Fc抗原和小鼠PD-L1-hIgG1Fc抗原的結合,挑選出同時結合人PD-L1-hIgG1Fc抗原和小鼠PD-L1-hIgG1Fc抗原的酵母單株測序驗證。去除冗餘序列之後,將非冗余序列轉換成全長IgG(γ1, κ)進行哺乳動物細胞表現。親和純化之後的全長抗體採用BIAcoreTM
X-100(GE Life Sciences)進行親合力測定。
經篩選確認選擇抗體CDR區序列。
來自HRP00049突變文庫的抗體
基於HRP00049序列的突變文庫所挑選的複製與HRP00049在HCDR1和HCDR2上有差異。相關的CDR序列或通式及其相應重鏈可變區如下所描述。
HCDR1 為DGSAYWS(SEQ ID NO:10)或NDYWT(SEQ ID NO:11)
HCDR2 X1ISX2AGSTYX3TPSLKG SEQ ID NO:12
HCDR3 SGGWLAPFDY SEQ ID NO:13
LCDR1 KSSQSLFYHSNQKHSLA SEQ ID NO:14
LCDR2 GASTRES SEQ ID NO:15
LCDR3 QQYYGYPYT SEQ ID NO:16
進而獲得相關的重鏈可變區序列通式如下:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISDGSAYWS WIRQHPGKGLEYIGX1 ISX2 AGSTYX3 TPSLKG RVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDY WGRGTLVTVSS(SEQ ID NO:17)
或
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWT WIRQHPGKGLEYIGX1 ISX2 AGSTYX3 TPSLKG RVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDY WGRGTLVTVSS(SEQ ID NO:18)。上述SEQ ID NO.12所示的HCDR2和SEQ ID NO.17或18所示的重鏈可變區中X1 選自F或M,X2 選自R或V,X3 選自N或H。
獲得相關的輕鏈可變區序列如下:(SEQ ID NO:19)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLA WYQQKPGQPPKLLIYGASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYT FGGGTKVEIK
HCDR1 為DGSAYWS(SEQ ID NO:10)或NDYWT(SEQ ID NO:11)
HCDR2 X1ISX2AGSTYX3TPSLKG SEQ ID NO:12
HCDR3 SGGWLAPFDY SEQ ID NO:13
LCDR1 KSSQSLFYHSNQKHSLA SEQ ID NO:14
LCDR2 GASTRES SEQ ID NO:15
LCDR3 QQYYGYPYT SEQ ID NO:16
進而獲得相關的重鏈可變區序列通式如下:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISDGSAYWS WIRQHPGKGLEYIGX1 ISX2 AGSTYX3 TPSLKG RVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDY WGRGTLVTVSS(SEQ ID NO:17)
或
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWT WIRQHPGKGLEYIGX1 ISX2 AGSTYX3 TPSLKG RVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDY WGRGTLVTVSS(SEQ ID NO:18)。上述SEQ ID NO.12所示的HCDR2和SEQ ID NO.17或18所示的重鏈可變區中X1 選自F或M,X2 選自R或V,X3 選自N或H。
獲得相關的輕鏈可變區序列如下:(SEQ ID NO:19)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLA WYQQKPGQPPKLLIYGASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYT FGGGTKVEIK
來自HRP00052突變文庫的抗體
基於HRP00052序列的突變文庫所挑選的複製與HRP00052在HCDR1和HCDR2及LCDR2上有差異。相關的HCDR1和HCDR2及LCDR2通式及其相應重輕鏈可變區如下所描述。
HCDR1 X4 X5 WMX6 SEQ ID NO:20
HCDR2 RIX7 PX8 X9 GX10 X11 X12 YNEKX13 KN SEQ ID NO:21
HCDR3 GGSSYDYFDY SEQ ID NO:22
LCDR1 RASESVSIHGTHLMH SEQ ID NO:23
LCDR2 X14 ASX15 X16 X17 S SEQ ID NO:24
LCDR3 QQSFEDPLT SEQ ID NO:25
進而獲得相關的重鏈可變區序列通式如下:(SEQ ID NO:26)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTX4 X5 WMX6 WVRQAPGQGLEWMGRIX7 PX8 X9 GX10 X11 X12 YNEKX13 KN RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDY WGQGTTVTVSS,上述SEQ ID NO.20和21所示的HCDR1和HCDR2及SEQ ID NO.26所示的重鏈可變區中X4 選自S和D,X5 選自Y和K,X6 選自H和M,X7 選自T、S、H和G,X8 選自S、N和G,X9 選自S、L和G,X10 選自F、L、W和M,X11 選自A、P和T,X12 選自M、V、L和S,X13 選自F和Y。
進而獲得相關的輕鏈可變區序列通式如下:(SEQ ID NO:27)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMH WYQQKPGQPPKLLIYX14 ASX15 X16 X17 S GVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLT FGQGTKLEIK,上述SEQ ID NO:24所示的LCDR2及SEQ ID NO.27所示的輕鏈可變區中X14 選自V和A,X15 選自Y和N,X16 選自A、L和V,X17 選自E、F、Y和A(其中包括X17 選自E、F和A與X17 選自Y的情況)。獲得的具體相關序列包括但不限於表1和表2所述:
表1. 親和力篩選所確定的重鏈可變區序列
表2. 親和力篩選所確定的輕鏈可變區序列
HCDR1 X4 X5 WMX6 SEQ ID NO:20
HCDR2 RIX7 PX8 X9 GX10 X11 X12 YNEKX13 KN SEQ ID NO:21
HCDR3 GGSSYDYFDY SEQ ID NO:22
LCDR1 RASESVSIHGTHLMH SEQ ID NO:23
LCDR2 X14 ASX15 X16 X17 S SEQ ID NO:24
LCDR3 QQSFEDPLT SEQ ID NO:25
進而獲得相關的重鏈可變區序列通式如下:(SEQ ID NO:26)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTX4 X5 WMX6 WVRQAPGQGLEWMGRIX7 PX8 X9 GX10 X11 X12 YNEKX13 KN RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDY WGQGTTVTVSS,上述SEQ ID NO.20和21所示的HCDR1和HCDR2及SEQ ID NO.26所示的重鏈可變區中X4 選自S和D,X5 選自Y和K,X6 選自H和M,X7 選自T、S、H和G,X8 選自S、N和G,X9 選自S、L和G,X10 選自F、L、W和M,X11 選自A、P和T,X12 選自M、V、L和S,X13 選自F和Y。
進而獲得相關的輕鏈可變區序列通式如下:(SEQ ID NO:27)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMH WYQQKPGQPPKLLIYX14 ASX15 X16 X17 S GVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLT FGQGTKLEIK,上述SEQ ID NO:24所示的LCDR2及SEQ ID NO.27所示的輕鏈可變區中X14 選自V和A,X15 選自Y和N,X16 選自A、L和V,X17 選自E、F、Y和A(其中包括X17 選自E、F和A與X17 選自Y的情況)。獲得的具體相關序列包括但不限於表1和表2所述:
表1. 親和力篩選所確定的重鏈可變區序列
衍生自HRP00049抗體突變文庫的抗體輕重鏈可變區具體序列:
9-2 H5重鏈可變區(SEQ ID NO:42)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISDGSAYWS WIRQHPGKGLEYIGFISRAGSTYNTPSLKG RVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDY WGRGTLVTVSS
9-2 H6重鏈可變區(SEQ ID NO:43)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWT WIRQHPGKGLEYIGFISRAGSTYNTPSLKG RVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDY WGRGTLVTVSS
9-2 H7重鏈可變區(SEQ ID NO:44)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWT WIRQHPGKGLEYIGMISVAGSTYHTPSLKG RVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDY WGRGTLVTVSS
9-2 L11輕鏈可變區(SEQ ID NO:45)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLA WYQQKPGQPPKLLIYGASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYT FGGGTKVEIK
9-2 H5重鏈可變區(SEQ ID NO:42)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISDGSAYWS WIRQHPGKGLEYIGFISRAGSTYNTPSLKG RVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDY WGRGTLVTVSS
9-2 H6重鏈可變區(SEQ ID NO:43)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWT WIRQHPGKGLEYIGFISRAGSTYNTPSLKG RVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDY WGRGTLVTVSS
9-2 H7重鏈可變區(SEQ ID NO:44)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWT WIRQHPGKGLEYIGMISVAGSTYHTPSLKG RVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDY WGRGTLVTVSS
9-2 L11輕鏈可變區(SEQ ID NO:45)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLA WYQQKPGQPPKLLIYGASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYT FGGGTKVEIK
衍生自HRP00052抗體突變文庫的抗體輕重鏈可變區具體序列:
24D5 H12重鏈可變區(SEQ ID NO:46)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMH WVRQAPGQGLEWMGRITPSSGFAMYNEKFKN RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDY WGQGTTVTVSS
24D5 H13重鏈可變區(SEQ ID NO:47)
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24D5 H14重鏈可變區(SEQ ID NO:48)
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24D5 H15重鏈可變區(SEQ ID NO:49)
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24D5 H16重鏈可變區(SEQ ID NO:50)
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24D5 H17重鏈可變區(SEQ ID NO:51)
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24D5 H18重鏈可變區(SEQ ID NO:52)
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24D5 H19重鏈可變區(SEQ ID NO:53)
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24D5 H20重鏈可變區(SEQ ID NO:54)
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24D5 H21重鏈可變區(SEQ ID NO:66)
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24D5 L64輕鏈可變區(SEQ ID NO:55)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMH WYQQKPGQPPKLLIYVASYAAS GVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLT FGQGTKLEIK
24D5 L61輕鏈可變區(SEQ ID NO:56)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMH WYQQKPGQPPKLLIYAASNLES GVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLT FGQGTKLEIK
24D5 L66輕鏈可變區(SEQ ID NO:57)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMH WYQQKPGQPPKLLIYVASNVFS GVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLT FGQGTKLEIK
24D5 L67輕鏈可變區(SEQ ID NO:70)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYVASNVESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK
24D5 L68輕鏈可變區(SEQ ID NO:71)
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24D5 L69輕鏈可變區(SEQ ID NO:72)
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24D5 H12重鏈可變區(SEQ ID NO:46)
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24D5 H13重鏈可變區(SEQ ID NO:47)
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24D5 H14重鏈可變區(SEQ ID NO:48)
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24D5 H15重鏈可變區(SEQ ID NO:49)
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24D5 H16重鏈可變區(SEQ ID NO:50)
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24D5 H17重鏈可變區(SEQ ID NO:51)
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24D5 H18重鏈可變區(SEQ ID NO:52)
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24D5 H19重鏈可變區(SEQ ID NO:53)
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24D5 H20重鏈可變區(SEQ ID NO:54)
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24D5 H21重鏈可變區(SEQ ID NO:66)
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24D5 L64輕鏈可變區(SEQ ID NO:55)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMH WYQQKPGQPPKLLIYVASYAAS GVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLT FGQGTKLEIK
24D5 L61輕鏈可變區(SEQ ID NO:56)
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24D5 L66輕鏈可變區(SEQ ID NO:57)
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24D5 L67輕鏈可變區(SEQ ID NO:70)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYVASNVESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK
24D5 L68輕鏈可變區(SEQ ID NO:71)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYVASNVWSGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK
24D5 L69輕鏈可變區(SEQ ID NO:72)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYVASNVYSGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK
上述抗體的輕重鏈可變區,選用人重鏈IgG1/輕鏈kappa的恆定區分別與各重鏈可變區和輕鏈可變區組合,形成完整的抗體重鏈和輕鏈,具體重鏈恆定區和輕鏈恆定區序列如下:
IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO:58)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO:59)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
表3. 由HRP00049突變衍生的完整抗體的輕重鏈可變區組合
表4-1. 由HRP00052突變衍生的完整抗體的輕重鏈可變區組合
表4-2. 由HRP00052突變衍生的完整抗體的輕重鏈可變區組合
IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO:58)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO:59)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
表3. 由HRP00049突變衍生的完整抗體的輕重鏈可變區組合
在本發明具體實施方案中,如表5-1和表5-2所述衍生自HRP00049和HRP00052突變抗體文庫中的重輕鏈可變區,在與重輕鏈恆定區連接形成完整抗體時,均表示與上述人IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO:58)和kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO:59)連接形成完整抗體,如H15L61即指由H15與IgG1重鏈恆定區連接形成重鏈和L61與kappa輕鏈恆定區連接形成輕鏈,輕重鏈組合形成完整抗體,其他命名類推。
HRP00052-IgG1則指將HRP00052的重鏈恆定區(IgG4亞類)替換為上述IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO:58)後形成的完整抗體。
表5-1. 重鏈可變區連接IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO:58)和輕鏈可變區連接kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO:59)後的全長抗體名稱
表5-2. 重鏈可變區連接IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO:58)和輕鏈可變區連接kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO:59)後的全長抗體名稱
表5-1. 重鏈可變區連接IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO:58)和輕鏈可變區連接kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO:59)後的全長抗體名稱
為了與連接人IgG1重鏈恆定區的完整抗體進行對比,某些具體實施方案中,表6-1和表6-2中的全長抗體,是上述衍生自HRP00049和HRP00052突變抗體文庫中篩選獲得的重輕鏈可變區分別與下述人IgG4重鏈恆定區(如SEQ ID NO:60所示,含S228P和234A235A突變)和kappa輕鏈恆定區(同SEQ ID NO:59)連接形成完整抗體,如H15L61-IgG4即指由H15與IgG4重鏈恆定區連接形成重鏈和L61與kappa輕鏈恆定區連接形成輕鏈,輕重鏈組合形成完整抗體,其他命名類推。
人IgG4重鏈恆定區:(SEQ ID NO:60)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
表6-1. 重鏈可變區連接人IgG4重鏈恆定區(SEQ ID NO:60)和輕鏈可變區連接kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO:59)後的全長抗體名稱
表6-2. 重鏈可變區連接人IgG4重鏈恆定區(SEQ ID NO:60)和輕鏈可變區連接kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO:59)後的全長抗體名稱
人IgG4重鏈恆定區:(SEQ ID NO:60)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
表6-1. 重鏈可變區連接人IgG4重鏈恆定區(SEQ ID NO:60)和輕鏈可變區連接kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO:59)後的全長抗體名稱
某些具體實施方案中,表7-1和表7-2中的全長抗體,是上述衍生自HRP00049和HRP00052突變抗體文庫中篩選獲得的重輕鏈可變區分別與下述人IgG4 S228P重鏈恆定區(如SEQ ID NO:65所示,含S228P突變)和kappa輕鏈恆定區(同SEQ ID NO:59)連接形成完整抗體,如H15L61-IgG4即指由H15與IgG4重鏈恆定區連接形成重鏈和L61與kappa輕鏈恆定區連接形成輕鏈,輕重鏈組合形成完整抗體,其他命名類推。IgG4S228P的重鏈恆定區序列如下:(SEQ ID NO:65)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPP CPAPEFL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
表7-1. 重鏈可變區連接人IgG4 S228P重鏈恆定區(SEQ ID NO:65)和輕鏈可變區連接kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO:59)後的全長抗體名稱
表7-2. 重鏈可變區連接人IgG4 S228P重鏈恆定區(SEQ ID NO:65)和輕鏈可變區連接kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO:59)後的全長抗體名稱
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPP CPAPEFL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
表7-1. 重鏈可變區連接人IgG4 S228P重鏈恆定區(SEQ ID NO:65)和輕鏈可變區連接kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO:59)後的全長抗體名稱
具體輕重鏈恆定區並非作為本發明抗體恆定區的限制,也可選用本領域其它已知的輕重鏈恆定區及其突變體來增加其性能。
本發明以Merck的PD-L1抗體Avelumab(A09)和/或Genetech的3280A為陽性對照,其中A09的輕重鏈胺基酸序列(來源自US20140341917)如下:
>A09重鏈:(SEQ ID NO:61)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>A09輕鏈:(SEQ ID NO:62)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
3280A(Genetech,Atezolizumab,WHO Drug Information, Vol. 28, No. 4, 2014,P488)的輕重鏈胺基酸序列如下:
>3280A重鏈:(SEQ ID NO:63)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>3280A輕鏈:(SEQ ID NO:64)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC
PD-L1抗體經常規方法純化獲得。
>A09重鏈:(SEQ ID NO:61)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>A09輕鏈:(SEQ ID NO:62)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
3280A(Genetech,Atezolizumab,WHO Drug Information, Vol. 28, No. 4, 2014,P488)的輕重鏈胺基酸序列如下:
>3280A重鏈:(SEQ ID NO:63)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>3280A輕鏈:(SEQ ID NO:64)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC
PD-L1抗體經常規方法純化獲得。
以下實施例中抗體均為全長抗體
實施例4. 抗體和配體阻斷試驗
深入研究了本品對PD-L1與PD1結合的阻斷作用,同時與在臨床試驗中的同類產品進行了比較。方法參照WO2017084495A1測試例2和3,在小鼠PD-L1/PD-1結合阻斷試驗中使用人PD-L1抗體阻斷小鼠PD-L1/PD-1的結合。數據詳見下表8。
表8. PD-L1抗體阻斷PD-L1與其配體的結合測試
*10μg/ml,5μg/ml和1μg/ml分別是不同阻斷試驗中PD-L1的濃度。
表8. PD-L1抗體阻斷PD-L1與其配體的結合測試
配體阻斷實驗證明,本發明PD-L1抗體能夠阻斷PD-L1與PD1的結合,也能夠阻斷PD-L1與B7-1的結合,並且由HRP00049突變而來的H5L11,H6L11抗體具有小鼠PD-L1交叉結合活性,可阻斷小鼠PD-L1與PD-1結合的能力。
實施例5. 實例性抗體的BIAcore抗體親和力實驗
按照人抗捕獲試劑盒(Cat. # BR-1008-39,GE)說明書中的方法將人抗捕獲抗體共價偶聯於生物傳感芯片CM5(Cat. # BR-1000-12,GE)生物芯片上,從而親和捕獲一定量的人PD-L1(Cat. #10084-H08H,Sino Biological),猴PD-L1(Cat. #90251-C08H,Sino Biological),小鼠PD-L1(Cat.#50010-M08H,Sino Biological)。用Biacore X100,GE儀器測定PD-L1 抗體和PD-L1的反應親和力。試驗使用的是HBS-EP+ 10 X緩衝溶液(Cat. # BR-1006-69,GE)用D. I. Water稀釋至1×(pH7.4),用BIAevaluation version 4.1,GE軟件以(1:1)Langmuir模型擬合數據,得出親和力數值,結果見表9。
表9-1. HRP00049和HRP00052及其突變抗體與不同物種PD-L1結合的Biacore親和力(同批次試驗)
表9-2. HRP00052及其突變抗體與不同物種PD-L1結合的Biacore親和力(同批次试验)
表9-1. HRP00049和HRP00052及其突變抗體與不同物種PD-L1結合的Biacore親和力(同批次試驗)
結果顯示,篩選自HRP00052突變抗體文庫的抗體(除H21L68外)與人PD-L1的親和力均較HRP00052有所提高,且均高於陽性對照抗體。而篩選自HRP00049突變抗體文庫的抗體H5L11、H6L11、H7L11則產生較強的鼠PD-L1交叉親和活性。
實施例6. PD-L1抗體在PBMC-T 淋巴細胞活化實驗中對細胞IFNγ的分泌作用
為了研究PD-L1抗體對人原代T淋巴細胞功能的影響,收集和純化人外周血單核細胞(PBMC),採用結核菌素(TB)體外刺激5天後,檢測細胞因子IFNγ分泌程度。實驗過程簡單描述如下:
新鮮血液利用 Ficoll-Hypaque 密度梯度離心(Stem Cell Technologies)得到PBMC,於RPMI 1640 培養基中培養,該培養基中添加10% (v/v) FBS,37℃、5% CO2
條件下培養。
新鮮分離純化的PBMC以RPMI 1640培養基調整密度為2×106
/ ml,20mL 細胞懸液中加入25µl 結核菌素,37℃、5% CO2
培養箱培養5天。第6天,收集上述培養的細胞離心,用PBS洗一次,重懸至新鮮的RPMI 1640培養基中,調整密度為1×106
/ ml ,接種至96孔細胞培養板,每孔90µl。同時加入梯度稀釋的抗體樣品(用PBS稀釋)或等量的同型IgG作為空白對照,每孔10µl。細胞培養板置於37℃,5% CO2
培養箱孵育3天。取出細胞培養板,離心(4000rpm,10min)收集細胞培養上清,採用ELISA的方法(人IFN-γ檢測試劑盒,欣博盛,EHC102g.96)檢測IFN-γ的程度。具體操作參考試劑說明書。
結果(見圖1)顯示,H18L61、H12L64、H5L11、H6L11均能較強地刺激細胞IFNγ的分泌,其中H12L64、H5L11、H6L11在促進細胞IFNγ分泌時,呈現出劑量依賴關係,上述四種抗體在某些劑量或所有劑量上優於HRP00052-IgG1的作用。
實施例7. 實例性抗體介導的PD-L1+細胞的ADCC效應
將人全血用等體積的PBS緩衝液進行稀釋後,加入已有適量Lymphoprep(STEMCELL Technologies Inc., 07851)的SepMate(STEMCELL Technologies Inc., 15460)管底部,室溫下以1200g離心10分鐘。將管中上層液體倒入新的50ml離心管中,用PBS緩衝液洗滌細胞,並以300g離心8分鐘,得到PBMC。用含有5% Low IgG FBS(BIOSUN,BS-0007-500)的RPMI-1640培養液重懸PBMC,進行細胞計數。
將CHO-S/PD-L1細胞用含有5% Low IgG FBS的RPMI1640培養基重懸並計數,以每孔10,000個細胞的密度接種在96孔板中,然後加入梯度稀釋的PD-L1抗體孵育15分鐘,再在每孔中加入300,000個人PBMC細胞作用4小時,設置培養基對照,CHO-S/PD-L1細胞自發釋放對照,PBMC細胞自發釋放對照和CHO-S/PD-L1細胞最大裂解對照。4小時後,將96孔板離心,每孔取50 μL上清轉移至另一96孔板,每孔加入50 μL CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega,G1780),避光室溫孵育30分鐘,加入終止液,在490nm波長處讀取吸光值。按照下列公式分析數據,計算出裂解率,用Graphpad Prism軟件根據抗體各濃度與相應的裂解率計算抗體ADCC效應的EC50
值。
裂解率%=(樣品孔490nm
-PBMC細胞自發釋放490nm
-CHO-S/PD-L1細胞自發釋放490nm
)/( CHO-S/PD-L1細胞最大裂解490nm
- CHO-S/PD-L1細胞自發釋放490nm
)×100
結果顯示(圖2A至圖2F所示),不同PD-L1抗體HRP00049-IgG1、H5L11、HRP00052-IgG1、H6L11、H18L61、H12L64的IgG1形式都有較強的ADCC效應,並且這些分子的ADCC效應均明顯優於各PD-L1抗體的IgG4形式。
實施例8. 實例性抗體在人的黑色素瘤A375異種移植模型中的作用
將培養的A375細胞與PBMC混合接種於NOG小鼠皮下。實驗分為PBMC + PBS組、PBMC + H12L64 20 mg/kg組、PBMC + H12L64- IgG4-20 mg/kg組和PBMC + HRP00052 20 mg/kg組。每組6隻,每兩天一次,腹腔注射給藥,連續給藥11次。給藥實驗結束後,使用腫瘤生長抑制率TGI(%)和相對腫瘤增值率T/C(%)進行療效評價。
結果見圖3和表10,H12L64 20 mg/kg組TGI為98.15%,與PBMC + PBS組相比有顯著性差異(p
=0.0018);H12L64-IgG4 20 mg/kg組腫瘤抑制率TGI為82.15%,與PBMC + PBS組相比有顯著性差異(p
=0.0064);HRP00052 20mg/kg組腫瘤抑制率TGI為68.84%,與PBMC+PBS組相比有顯著性差異(p
=0.0291)。該結果表明,H12L64 20 mg/kg組和H12L64-IgG4 20mg/kg及HRP00052 20mg/kg能有效抑制A375的生長(p<0.05)。在整個實驗過程中,H12L64、H12L64-IgG4和HRP00052荷瘤小鼠均沒有出現體重下降或動物死亡情況,表明小鼠對該劑量下的H12L64、H12L64-IgG4和HRP00052耐受性良好。
表10. PD-L1抗體在人源化A375皮下移植瘤模型的療效
TGI%:抑瘤率;T/C%: 腫瘤增值率; CR:腫瘤消退。
表10. PD-L1抗體在人源化A375皮下移植瘤模型的療效
實施例9. PD-L1抗體在小鼠結腸癌模型MC38-hPD-L1中的作用
將MC38-hPD-L1細胞(向小鼠結腸癌細胞MC38轉化hPD-L1後在細胞表面可表現hPD-L1,4×105
個)100μl接種至50隻C57小鼠右肋部皮下,7天後去除腫瘤體積過大過小動物,按平均腫瘤體積約52mm3
將小鼠隨機分為:3個PD-L1抗體單用組和陰性對照組,共4組,每組10隻。分組後腹腔給與各藥物(對照組注射等量體積的PBS),每週天三次,共12次,給藥週期28天,停藥後兩天結束對荷瘤小鼠的監測。每週測2次瘤體積,稱體重,記錄數據。分組及給藥情況見下表。各組動物體重、腫瘤體積以及瘤重均用平均值±標準差(Mean ± SEM)表示,並用Graphpad Prism 5 和Excel軟體作圖,使用student t test統計分析。
腫瘤體積(TV)=1/2×L長 ×L短 2
腫瘤增殖率T/C%=(T-T0)/(C-C0) ×100%
抑瘤率 %TGI=1- T/C %
腫瘤體積(TV)=1/2×L長 ×L短 2
腫瘤增殖率T/C%=(T-T0)/(C-C0) ×100%
抑瘤率 %TGI=1- T/C %
實驗結果(見圖4)顯示,H6L11,A09都能顯著抑制MC38-hPD-L1小鼠皮下移植瘤的生長。與陰性對照組相比,兩組瘤體積從給藥後3天都出現統計學差異(p
<0.05),實驗結束時(給藥後27d),兩組抑瘤率分別為106.74%、103.47%,與陰性對照組有極顯著差異(p<0.001),約80%-90%的腫瘤能完全消退,H6L11比A09抑瘤效果更好,但二者沒有統計學差異(見圖4)。HRP00052-IgG1在實驗結束時,抑瘤率為29.10%。
實驗結束後將荷瘤鼠安樂死並剝瘤稱重,瘤重結果與瘤體積大小基本相符:三個藥物組中,H6L11組平均瘤重最小,A09組次之,HRP00052-IgG1的平均瘤重最大;H6L11,A09兩組與對照組之間都存在顯著差異(p
<0.001)。荷瘤小鼠對各藥物均能很好耐受,無藥物致體重減輕等症狀發生。
實施例10. PD-L1抗體在小鼠結腸癌模型MC38-hPD-L1中的作用
將MC38-hPD-L1細胞以5.8×105
個/100μl/隻接種到C57/BL-6小鼠皮下,荷瘤模型確立後,測量腫瘤體積,去除體重、腫瘤過大和過小的動物,按照腫瘤體積大小將荷瘤小鼠隨機分為2組(n=7):IgG-PBS(C25-IgG4)對照組、H5L11-IgG4 S228P實驗組,以分組給藥日期設定為D0。分組後腹腔給與各藥物,每週三次,共10次,給藥週期18天,停藥後兩天結束對荷瘤小鼠的監測。每週測2次瘤體積,稱體重,記錄數據。分組及給藥情況見下表。各組動物體重、腫瘤體積以及瘤重均用平均值±標準差(Mean ± SEM)表示,並用Graphpad Prism 6和Excel軟體作圖,使用student t test統計分析。
腫瘤體積(TV)=1/2×L長 ×L短 2
腫瘤增殖率T/C%=(T-T0)/(C-C0) ×100%
抑瘤率 %TGI=1- T/C %
腫瘤體積(TV)=1/2×L長 ×L短 2
腫瘤增殖率T/C%=(T-T0)/(C-C0) ×100%
抑瘤率 %TGI=1- T/C %
如圖5結果顯示,與小鼠PD-L1存在交叉反應的PD-L1單抗(H5L11-IgG4 S228P組)實驗組腫瘤體積顯著小於對照組,並且在給藥後一周左右開始即與對照組之間出現統計學差異。
實驗結束後對荷瘤小鼠進行安樂死並剝瘤稱重,瘤重結果與瘤體積大小存在一定相似性。實驗過程中,給藥組與對照組動物體重未出現明顯差異,小鼠對各給藥抗體耐受良好。
雖然為了清楚的理解,已經借助於附圖和實例詳細描述了上述發明,但是描述和實例不應當解釋為限制本發明的範圍。本文中引用的所有專利和科學文獻的發明內容通過引用完整地清楚結合。
無
圖1:PD-L1抗體在PBMC-T 淋巴細胞活化實驗中對細胞IFNγ的分泌促進作用。
圖2:不同PD-L1抗體的IgG1形式與IgG4形式的ADCC效應比較。圖2A是HRP00049的IgG1和IgG4形式比較,圖2B是H5L11的IgG1和IgG4形式比較,圖2C是HRP00052的IgG1和IgG4形式比較,圖2D是H6L11的IgG1和IgG4形式比較,圖2E是H18L61的IgG1和IgG4形式比較,圖2F是H12L64的IgG1和IgG4形式比較。
圖3:PD-L1抗體對小鼠A375異種移植模型腫瘤體積的影響。
圖4:PD-L1抗體對小鼠結腸癌模型腫瘤體積的影響。
圖5:PD-L1抗體對小鼠移植瘤模型腫瘤體積的影響。
Claims (18)
- 一種單株抗體或其抗原結合片段,所述單株抗體或抗原結合片段結合人PD-L1,所述單株抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區,其中: (i)所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:10、12和13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,且所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:14、15和16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區,所述SEQ ID NO.12所示的HCDR2中X1 為F或M,X2 為R或V,X3 為N或H;或 (ii)所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:11、12和13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,且所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:14、15和16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區,所述SEQ ID NO.12所示的HCDR2中X1 為F或M,X2 為R或V,X3 為N或H;或 (iii)所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:20、21和22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,且所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、24和25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區,其中HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3依次不同時為SEQ ID NO:30、38、22、23、40和25, 所述SEQ ID NO.20和21中的X4 為S或D,X5 為Y或K,X6 為H或M,X7 為T、S、H或G,X8 為S、N或G,X9 為S、L或G,X10 為F、L、W或M,X11 為A、P或T,X12 為M、V、L或S,X13 為F或Y,所述SEQ ID NO:24所示的LCDR2中X14 為V或A,X15 為Y或N,X16 為A、L或V,X17 為E、F、Y或A。
- 一種單株抗體或其抗原結合片段,所述單株抗體或其抗原結合片段結合人PD-L1,所述單株抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區,其中: 所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO:10所示的HCDR1、如SEQ ID NO:28或29所示的HCDR2和如SEQ ID NO:13所示的HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:14、15和16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或 所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO:11所示的HCDR1、如SEQ ID NO:28或29所示的HCDR2和如SEQ ID NO:13所示的HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:14、15和16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或 所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO:30所示的HCDR1、如SEQ ID NO:32至37任一所示的HCDR2和如SEQ ID NO:22所示的HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO:23的LCDR1、如SEQ ID NO:39、40、41、67和69任一的LCDR2和如SEQ ID NO:25的LCDR3區;或 所述重鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO:31所示的HCDR1、如SEQ ID NO:32至37任一所示的HCDR2和如SEQ ID NO:22所示的HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列如SEQ ID NO:23的LCDR1、如SEQ ID NO:39、40、41、67和69任一的LCDR2和如SEQ ID NO:25的LCDR3區。
- 如請求項2所述的單株抗體或其抗原結合片段,其中: 所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:14、15和16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區; 所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:14、15和16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區; 所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:14、15和16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區; 所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區; 所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區; 所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區; 所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區; 所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區; 所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區; 所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區; 所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區; 所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區; 所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或 所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區。
- 如請求項1或2所述的單株抗體或其抗原結合片段,其中所述單株抗體或抗原結合片段包含: 胺基酸序列如SEQ ID NO:17所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:19所示的輕鏈可變區; 胺基酸序列如SEQ ID NO:18所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:19所示的輕鏈可變區;或 胺基酸序列如SEQ ID NO:26所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:27所示的輕鏈可變區。
- 如請求項4所述的單株抗體或其抗原結合片段,其中所述單株抗體或抗原結合片段包含: 胺基酸序列如SEQ ID NO:42所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:45所示的輕鏈可變區; 胺基酸序列如SEQ ID NO:43所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:45所示的輕鏈可變區; 胺基酸序列如SEQ ID NO:44所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:45所示的輕鏈可變區; 胺基酸序列如SEQ ID NO:46所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56、57、70和72任一所示的輕鏈可變區; 胺基酸序列如SEQ ID NO:47所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56、57、70和72任一所示的輕鏈可變區; 胺基酸序列如SEQ ID NO:48所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56、57、70和72任一所示的輕鏈可變區; 胺基酸序列如SEQ ID NO:49所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56、57、70和72任一所示的輕鏈可變區; 胺基酸序列如SEQ ID NO:50所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56、57、70和72任一所示的輕鏈可變區; 胺基酸序列如SEQ ID NO:51所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56、57、70和72任一所示的輕鏈可變區; 胺基酸序列如SEQ ID NO:52所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56、57、70和72任一所示的輕鏈可變區; 胺基酸序列如SEQ ID NO:53所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56、57、70和72任一所示的輕鏈可變區;或 胺基酸序列如SEQ ID NO:66所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:55、56、57、70和72任一所示的輕鏈可變區。
- 如請求項1至5任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體為全長抗體,進一步包括人抗體恆定區,優選地,所述人抗體恆定區的重鏈恆定區選自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恆定區及其常規變體,所述人抗體恆定區的輕鏈恆定區選自人抗體κ和λ鏈恆定區及其常規變體,更優選所述全長抗體包含胺基酸序列如SEQ ID NO:58、60或65所示的人抗體重鏈恆定區和SEQ ID NO:59所示的人輕鏈恆定區。
- 如請求項1至5任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段,其中所述抗原結合片段是選自Fab、Fab'、F(ab')2 、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)和包含CDR的肽的抗原結合片段。
- 一種藥物組合物,其含有治療有效量的如請求項1至7任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段,以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
- 一種核酸分子,其編碼請求項1至7任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段。
- 一種重組載體,其包含請求項9所述的核酸分子。
- 一種用如請求項10所述的重組載體轉化的宿主細胞,所述宿主細胞選自原核細胞和真核細胞,優選真核細胞,更優選哺乳動物細胞。
- 一種用於生產如請求項1至7任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段的方法,所述方法包括將如請求項11所述的宿主細胞在培養基中進行培養以形成並積累請求項1至7任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段,以及從培養物回收所述單株抗體或其抗原結合片段。
- 一種用於免疫檢測或測定人PD-L1的方法,所述方法包括使用如請求項1至7任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段。
- 一種如請求項1至7任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段在製備與人PD-L1相關的疾病的診斷劑中的應用。
- 一種與人PD-L1相關的疾病的治療方法,所述方法包括向受試者施用藥物有效量的如請求項1至7任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段,或包含請求項8所述的藥物組合物,或請求項9所述的核酸分子,以治療人PD-L1相關的疾病,其中所述疾病優選腫瘤或癌症;更優選PD-L1陽性的鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、頭和頸鱗狀細胞癌、神經膠質瘤、何傑金氏淋巴瘤、非何傑金氏淋巴瘤、彌漫性大B-細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、急性淋巴細胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、髓樣細胞白血病-1蛋白、骨髓異常增生症候群、胃腸(道)癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴細胞性白血病、淋巴細胞白血病、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、黑素瘤、軟骨肉瘤、神經母細胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質細胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、肝細胞癌、透明細胞腎細胞癌、頭和頸癌、咽喉癌、肝膽癌、中樞神經系統癌、食管癌、惡性胸膜間皮瘤、全身性輕鏈澱粉樣變性、淋巴漿細胞性淋巴瘤、骨髓異常增生症候群、骨髓增生性腫瘤、神經內分泌腫瘤、梅克爾細胞癌、睪丸癌和皮膚癌。
- 一種如請求項1至7任一項所示的單株抗體或其抗原結合片段,或包含請求項8所述的藥物組合物,或請求項9所述的核酸分子在製備與人PD-L1相關的疾病的治療劑中的應用,其中所述疾病優選腫瘤或癌症;更優選PD-L1陽性的鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、頭和頸鱗狀細胞癌、神經膠質瘤、何傑金氏淋巴瘤、非何傑金氏淋巴瘤、彌漫性大B-細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、急性淋巴細胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、髓樣細胞白血病-1蛋白、骨髓異常增生症候群、胃腸(道)癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴細胞性白血病、淋巴細胞白血病、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、黑素瘤、軟骨肉瘤、神經母細胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質細胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、肝細胞癌、透明細胞腎細胞癌、頭和頸癌、咽喉癌、肝膽癌、中樞神經系統癌、食管癌、惡性胸膜間皮瘤、全身性輕鏈澱粉樣變性、淋巴漿細胞性淋巴瘤、骨髓異常增生症候群、骨髓增生性腫瘤、神經內分泌腫瘤、梅克爾細胞癌、睪丸癌和皮膚癌。
- 一種作為藥物的如請求項1至7任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段,或包含請求項8所述的藥物組合物,或請求項9所述的核酸分子。
- 一種作為藥物的如請求項1至7任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段,或包含請求項8所述的藥物組合物,或請求項9所述的核酸分子,所述藥物用於治療PD-L1陽性的腫瘤或癌症,優選地,所述癌症選自鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、頭和頸鱗狀細胞癌、神經膠質瘤、何傑金氏淋巴瘤、非何傑金氏淋巴瘤、彌漫性大B-細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、急性淋巴細胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、髓樣細胞白血病-1蛋白、骨髓異常增生症候群、胃腸(道)癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴細胞性白血病、淋巴細胞白血病、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、黑素瘤、軟骨肉瘤、神經母細胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質細胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、肝細胞癌、透明細胞腎細胞癌、頭和頸癌、咽喉癌、肝膽癌、中樞神經系統癌、食管癌、惡性胸膜間皮瘤、全身性輕鏈澱粉樣變性、淋巴漿細胞性淋巴瘤、骨髓異常增生症候群、骨髓增生性腫瘤、神經內分泌腫瘤、梅克爾細胞癌、睪丸癌和皮膚癌。
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