JP6979971B2 - 抗ｐｄ−ｌ１抗体 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、出願の開示内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる、2016年5月9日に出願された米国仮特許出願第62/333,643号の出願日の優先権の恩典を主張する。
発明の分野
本発明は、単離された抗PD-L1抗体、ならびにそれらの調製および使用に関する。
発明の背景
プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)は、細胞の認識、結合、および接着プロセスに関与している細胞表面タンパク質および可溶性タンパク質を含む免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞表面受容体である。このファミリーの初期のメンバーは、モノクローナル抗体の添加後のT細胞増殖の増大に対する機能的作用が原因で発見された(Hutloff et al. (1999) Nature 397:263-266; Hansen et al. (1980) Immunogenics 10:247-260)。PD-L1およびPD-L2と呼ばれる、PD-1に対する2種類の細胞表面糖タンパク質リガンドが同定されており、PD-1に結合するとT細胞活性化およびサイトカイン分泌を下方調節することが示されている(Freeman et al. (2000) J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43; Ohigashi et al. (2005) Clin Cancer Res 11:2947-53)。PD-L1およびPD-L2の両方とも、PD-1に結合するが他のCD28ファミリーメンバーには結合しない、B7ホモログである(Blank et al. (2004)。細胞表面でのPD-L1の発現が、IFN-γ刺激によって上方調節されることも示されている。
PD-L1発現は、ヒトの肺がん、卵巣がん、および結腸がん、ならびに様々な骨髄腫を含む、いくつかのマウスおよびヒトのがんにおいて見出されている(Iwai et al. (2002) PNAS 99:12293-7; Ohigashi et al. (2005) Clin Cancer Res 11:2947-53)。PD-L1はまた、抗原特異的なT細胞クローンのアポトーシスを増加させることによって、腫瘍免疫においてある役割を果たすことも示唆されている(Dong et al. (2002) Nat Med 8:793-800)。したがって、PD-1とPD-L1の相互作用を標的とすることは、治療的介入のために特に関心対象となっている分野である。この経路中の標的に対する治療的組成物、例えば抗PD-L1抗体が、必要とされている。
本発明の局面には、単離された抗PD-L1抗体、ならびにそのような抗体を含む組成物、およびPD-L1シグナル伝達によって媒介される疾患または病態を治療する際にそれらを使用する方法が含まれる。
いくつかの態様において、単離された抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片は、(i)配列GFSLTSYDIS(SEQ ID NO: 4)に対する少なくとも約99％の配列同一性を有しているHVR-H1配列;(ii)配列VIWTGVGTN(SEQ ID NO: 5)に対する少なくとも約99％の配列同一性を有しているHVR-H2配列;および(iii)配列DPYYYGMDY(SEQ ID NO: 6)に対する少なくとも約99％の配列同一性を有しているHVR-H3配列、を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、HVR-H1配列は、配列GFSLTSYDIS(SEQ ID NO: 4)を含み;HVR-H2配列は、配列VIWTGVGTN(SEQ ID NO: 5)を含み;かつHVR-H3配列は、配列DPYYYGMDY(SEQ ID NO: 6)を含む。いくつかの態様において、単離された抗PD-L1抗体は、(i)配列RASQDISIWLS(SEQ ID NO: 1)に対する少なくとも約99％の配列同一性を含むHVR-L1;(ii)配列KASNLHT(SEQ ID NO: 2)に対する少なくとも約99％の配列同一性を含むHVR-L2;および(iii)配列LQSQSFPRT(SEQ ID NO: 3)に対する少なくとも約99％の配列同一性を含むHVR-L3からなる群より選択される、少なくとも1つのHVR配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む。特定の態様において、軽鎖可変領域は、該HVR-L1配列、該HVR-L2配列、および該HVR-L3配列をすべて含む。
いくつかの態様において、抗DP-L1抗体またはその抗原結合断片は、(i)配列RASQDISIWLS(SEQ ID NO: 1)を含むHVR-L1;(ii)配列KASNLHT(SEQ ID NO: 2)を含むHVR-L2;および(iii)配列LQSQSFPRT(SEQ ID NO: 3)を含むHVR-L3を含む。いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、(i)配列RASQDISIWLS (SEQ ID NO: 1)を含むHVR-L1;(ii)配列KASNLHT(SEQ ID NO: 2)を含むHVR-L2;および(iii) 配列LQSQSFPRT(SEQ ID NO: 3)を含むHVR-L3を含む。
いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、モノクローナル抗体である。いくつかの態様において、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。いくつかの態様において、重鎖可変領域は、フレームワーク配列を含む。いくつかの態様において、フレームワーク配列についての少なくとも1つの部分は、ヒトフレームワーク配列を含む。いくつかの態様において、フレームワーク配列についての少なくとも1つの部分は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列を含む。いくつかの態様において、フレームワーク配列は、SEQ ID NO: 7、8、9、10、および11からなる群より選択されるフレームワーク領域1(FR1)配列を含む。いくつかの態様において、フレームワーク配列は、SEQ ID NO: 12、13、14、15、および16からなる群より選択されるフレームワーク領域2(FR2)配列を含む。いくつかの態様において、フレームワーク配列は、SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、22、23、および24からなる群より選択されるフレームワーク領域3(FR3)配列を含む。いくつかの態様において、フレームワーク配列は、SEQ ID NO: 25および26からなる群より選択されるフレームワーク領域4(FR4)配列を含む。いくつかの態様において、フレームワーク配列は、SEQ ID NO: 7、8、9、10、および11からなる群より選択されるFR1配列; SEQ ID NO: 12、13、14、15、および16からなる群より選択されるFR2配列; SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、22、23、および24からなる群より選択されるFR3配列;ならびにSEQ ID NO: 25および26からなる群より選択されるFR4配列、を含む。
いくつかの態様において、軽鎖可変領域は、フレームワーク配列を含む。いくつかの態様において、フレームワーク配列についての少なくとも1つの部分は、ヒトフレームワーク配列を含む。いくつかの態様において、フレームワーク配列についての少なくとも1つの部分は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列を含む。いくつかの態様において、フレームワーク配列は、SEQ ID NO: 27、28、および29からなる群より選択されるフレームワーク領域1(FR1)配列を含む。いくつかの態様において、フレームワーク配列は、SEQ ID NO: 30および31からなる群より選択されるフレームワーク領域2(FR2)配列を含む。いくつかの態様において、フレームワーク配列は、SEQ ID NO: 32および33からなる群より選択されるフレームワーク領域3(FR3)配列を含む。いくつかの態様において、フレームワーク配列は、SEQ ID NO: 34および35からなる群より選択されるフレームワーク領域4(FR4)配列を含む。いくつかの態様において、フレームワーク領域は、SEQ ID NO: 27、28、および29からなる群より選択されるFR1配列;SEQ ID NO: 30および31からなる群より選択されるFR2配列;SEQ ID NO: 32および33からなる群より選択されるFR3配列;ならびにSEQ ID NO: 34および35からなる群より選択されるFR4配列、を含む。
いくつかの態様において、単離された抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO: 45に対する少なくとも約90％の配列同一性を有している重鎖可変ドメインおよび/またはSEQ ID NO: 46に対する少なくとも約90％の配列同一性を有している軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、単離された抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO: 45を含む重鎖可変ドメインおよび/またはSEQ ID NO: 46を含む軽鎖可変ドメインを含む。
いくつかの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの態様において、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。
いくつかの態様において、単離された抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO: 36、37、38、39、40、41、もしくは42のいずれか1つに対する少なくとも90％の配列同一性を有している重鎖可変ドメインおよび/またはSEQ ID NO: 43もしくは44に対する少なくとも90％の配列同一性を有している軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、単離された抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO: 36、37、38、39、40、41、もしくは42のいずれか1つを含む重鎖可変ドメインおよび/またはSEQ ID NO: 43もしくは44を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、ある抗体は、(i)SEQ ID NO: 36、37、38、39、40、41、もしくは42のいずれか1つの重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO: 43もしくは44の軽鎖可変ドメインを含む抗PD-L1抗体と同じエピトープに実質的に結合するか;または(ii)SEQ ID NO: 36、37、38、39、40、41、もしくは42のいずれか1つの重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO: 43もしくは44の軽鎖可変ドメインを含む抗PD-L1抗体と同じエピトープへの結合に関して競合する。いくつかの態様において、抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片は、(a)SEQ ID NO: 36、37、38、39、40、41、または42のいずれか1つの重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO: 43または44の軽鎖可変ドメインを含む抗体を発現する細胞を培養する工程;ならびに(b)その細胞からまたはその細胞が培養される細胞培養培地から抗体を単離する工程によって作製される。いくつかの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの態様において、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。
いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、単一特異性である。いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、二重特異性である。いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、PD-L1タンパク質および細胞表面タンパク質に結合する。いくつかの態様において、細胞表面タンパク質は、CD20、EGFR、HER2、CTLA-4、TIM3、LAG3、VISTA、およびTIGITからなる群より選択される。いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、多重特異性である。いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、PD-L1タンパク質および1種類または複数種類の細胞表面タンパク質に結合する。いくつかの態様において、細胞表面タンパク質は、CD20、EGFR、HER2、CTLA-4、TIM3、LAG3、VISTA、およびTIGITからなる群より選択される。
いくつかの態様において、抗原結合断片は、Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv、scFv、および単一ドメイン抗体からなる群より選択される。いくつかの態様において、抗体は、κ軽鎖またはλ軽鎖を含む。いくつかの態様において、抗体は、IgG、IgM、IgA、IgD、またはIgEアイソタイプである。いくつかの態様において、抗体はIgGアイソタイプであり、かつ抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4からなる群より選択されるサブクラスである。いくつかの態様において、抗体は、IgMアイソタイプである。いくつかの態様において、抗体は、J鎖を含む。いくつかの態様において、抗体はIgAアイソタイプであり、かつ抗体は、IgA1およびIgA2からなる群より選択されるサブクラスである。いくつかの態様において、抗体は、J鎖を含む。いくつかの態様において、抗体は、J鎖を含む、IgG/IgMハイブリッド抗体またはIgG/IgAハイブリッド抗体である。いくつかの態様において、J鎖は、外来性結合部分を含む改変J鎖である。いくつかの態様において、外来性結合部分は、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体-薬物コンジュゲート、抗体様分子、抗体様分子の抗原結合断片、可溶性タンパク質および膜結合型タンパク質、リガンド、ならびに受容体からなる群より選択される。いくつかの態様において、外来性部分は、抗体の抗原結合断片であり、かつFab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv、scFv、および単一ドメイン抗体からなる群より選択される。いくつかの態様において、抗原結合断片は、scFvである。
いくつかの態様において、外来性結合部分は、T細胞シグナル伝達経路に影響を及ぼす。いくつかの態様において、外来性結合部分は、T細胞抑制シグナル伝達経路をアンタゴナイズする。いくつかの態様において、外来性結合部分は、CTLA-4、PD-1、TIM3、LAG3、BTLA、VISTA、およびTIGITからなる群より選択される細胞表面タンパク質に結合する。いくつかの態様において、外来性結合部分は、アルブミンタンパク質またはアルブミンタンパク質の断片に結合する。いくつかの態様において、外来性結合部分は、アルブミン結合ペプチドを含む。いくつかの態様において、外来性結合部分は、アルブミン結合抗体断片を含む。いくつかの態様において、アルブミン結合抗体断片は、Fab、scFv、VHH、scFab、およびdAbからなる群より選択される。いくつかの態様において、外来性結合部分は、FcRn結合ペプチドを含む。いくつかの態様において、外来性結合部分は、FcRn結合抗体断片を含む。いくつかの態様において、FcRn結合抗体断片は、Fab、scFv、VHH、scFab、およびdAbからなる群より選択される。いくつかの態様において、外来性結合部分は、Fcドメインを含む。
本発明の局面には、外来性結合部分を含む改変J鎖を含む、IgM抗体、IgA抗体、IgG/IgM抗体、もしくはIgG/IgA抗体、または抗原結合断片であって、抗体が細胞表面タンパク質に結合し、かつ外来性結合部分が、本明細書において説明される抗PD-L1抗体または抗原結合断片を含む、IgM抗体、IgA抗体、IgG/IgM抗体、もしくはIgG/IgA抗体、または抗原結合断片が含まれる。いくつかの態様において、細胞表面タンパク質は、CD20、EGFR、HER2、CTLA-4、PD-1、TIM3、LAG3、BTLA、VISTA、およびTIGITからなる群より選択される。
いくつかの態様において、外来性結合部分は、エフェクター細胞に結合する。いくつかの態様において、エフェクター細胞は、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、および好中球からなる群より選択される。いくつかの態様において、エフェクター細胞はT細胞である。いくつかの態様において、外来性結合部分は、T細胞上のCD3タンパク質(例えばCD3εタンパク質)に結合する。いくつかの態様において、エフェクター細胞はNK細胞である。いくつかの態様において、外来性結合部分はNK細胞上の標的に結合し、該標的は、CD16、CD64、およびNKG2Dからなる群より選択される。いくつかの態様において、エフェクター細胞はマクロファージである。いくつかの態様において、外来性結合部分は、マクロファージ上のCD14に結合する。いくつかの態様において、エフェクター細胞は好中球である。いくつかの態様において、外来性結合部分は、好中球上のCD16bまたはCD177に結合する。
いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、PD-L1アンタゴニストである。いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、PD-L1シグナル伝達経路をアンタゴナイズする。いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、PD-L1タンパク質とPD-1タンパク質の相互作用をアンタゴナイズする。いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、PD-L1タンパク質とPD-1タンパク質の結合を阻害する。いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、PD-L1タンパク質とPD-1タンパク質の結合を阻止する。いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、PD-L1タンパク質に結合し、かつPD-1タンパク質の1つまたは複数の機能を阻害する。
本発明の局面には、本明細書において説明される抗体の重鎖および/または軽鎖をコードするポリヌクレオチドが含まれる。本発明の局面には、本明細書において説明されるポリヌクレオチドを含むベクターが含まれる。本発明の局面には、本明細書において説明されるベクターを含む宿主細胞が含まれる。いくつかの態様において、宿主細胞は原核細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は真核細胞である。
本発明の局面には、本明細書において説明される抗PD-L1抗体を含むキットが含まれる。
本発明の局面には、本明細書において説明される抗PD-L1抗体の重鎖および/または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を、宿主細胞にトランスフェクトする工程;抗PD-L1抗体を産生するのに適した条件下で宿主細胞を培養する工程;ならびに抗PD-L1抗体を単離する工程を含む、単離された抗PD-L1抗体を作製する方法が含まれる。
本発明の局面には、PD-L1タンパク質を本明細書において説明される抗体と接触させる工程を含む、PD-1タンパク質の1つまたは複数の機能を阻害する方法が含まれる。いくつかの態様において、方法は、インビトロで実施される。いくつかの態様において、方法は、哺乳動物対象においてインビボで実施される。
本発明の局面には、PD-L1を発現する腫瘍細胞を有している対象に本明細書において説明される抗体を投与する工程であって、それによって、(i)腫瘍細胞の成長もしくは増殖を抑制するか、または(ii)腫瘍細胞の死を誘導する、工程を含む、該腫瘍細胞の増殖を抑制する方法が含まれる。
本発明の局面には、本明細書において説明される抗体および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が含まれる。
本発明の局面には、本明細書において説明される薬学的組成物の有効量をがんに罹患している対象に投与する工程を含む、対象を治療する方法が含まれる。本発明の局面には、がんを治療するための医薬を調製する際の、本明細書において説明される抗体の使用が含まれる。いくつかの態様において、がんは、血液がんまたは上皮がんである。いくつかの態様において、血液がんは、白血病、リンパ腫、骨髄腫、または骨髄異形成症候群である。いくつかの態様において、白血病は、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、または慢性リンパ性白血病である。いくつかの態様において、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫である。いくつかの態様において、上皮がんは、非小細胞肺がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、結腸直腸がん、卵巣がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、甲状腺がん、乳がん、または鼻咽腔がんである。いくつかの態様において、乳がんは、ホルモン受容体陰性乳がんまたは三重陰性乳がんである。いくつかの態様において、がんは黒色腫である。いくつかの態様において、がんは膠芽腫である。
いくつかの態様において、薬学的組成物または医薬は、有効量の第2の治療物質をさらに含む。
本発明の局面には、試料を本明細書において説明される抗PD-L1抗体と接触させる工程;および抗PD-L1抗体が試料中においてPD-L1ポリペプチドに結合するかどうか判定する工程であって、そのような結合の存在によって試料中においてPD-L1ポリペプチドの存在が示される、工程を含む、試料をスクリーニングして試料においてPD-L1ポリペプチドの存在を判定する方法が含まれる。いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は検出可能に標識され、かつ抗PD-L1抗体がPD-L1ポリペプチドに結合するかどうか判定する工程は、検出可能な標識を検出することを含む。
[本発明1001]
(i)配列GFSLTSYDIS(SEQ ID NO: 4)に対する少なくとも約99％の配列同一性を有しているHVR-H1配列;
(ii)配列VIWTGVGTN(SEQ ID NO: 5)に対する少なくとも約99％の配列同一性を有しているHVR-H2配列;および
(iii)配列DPYYYGMDY(SEQ ID NO: 6)に対する少なくとも約99％の配列同一性を有しているHVR-H3配列
を含む重鎖可変領域を含む、単離された抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1002]
(i)前記HVR-H1配列が、配列GFSLTSYDIS(SEQ ID NO: 4)を含み;
(ii)前記HVR-H2配列が、配列VIWTGVGTN(SEQ ID NO: 5)を含み;かつ
(iii)前記HVR-H3配列が、配列DPYYYGMDY(SEQ ID NO: 6)を含む、
本発明1001の抗体または抗原結合断片。
[本発明1003]
(i)配列RASQDISIWLS(SEQ ID NO: 1)に対する少なくとも約99％の配列同一性を含むHVR-L1;
(ii)配列KASNLHT(SEQ ID NO: 2)に対する少なくとも約99％の配列同一性を含むHVR-L2;および
(iii)配列LQSQSFPRT(SEQ ID NO: 3)に対する少なくとも約99％の配列同一性を含むHVR-L3
からなる群より選択される少なくとも1つのHVR配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、
本発明1001または1002の抗体または抗原結合断片。
[本発明1004]
前記軽鎖可変領域が、前記HVR-L1配列、前記HVR-L2配列、および前記HVR-L3配列をすべて含む、本発明1003の抗体または抗原結合断片。
[本発明1005]
(i)HVR-L1が配列RASQDISIWLS(SEQ ID NO: 1)を含み;
(ii)HVR-L2が配列KASNLHT(SEQ ID NO: 2)を含み;かつ
(iii)HVR-L3が配列LQSQSFPRT(SEQ ID NO: 3)を含む、
本発明1003の抗体または抗原結合断片。
[本発明1006]
(i)HVR-L1が配列RASQDISIWLS(SEQ ID NO: 1)を含み;
(ii)HVR-L2が配列KASNLHT(SEQ ID NO: 2)を含み;かつ
(iii)HVR-L3が配列LQSQSFPRT(SEQ ID NO: 3)を含む、
本発明1004の抗体または抗原結合断片。
[本発明1007]
前記抗体がモノクローナル抗体である、本発明1001〜1006のいずれかの抗体または抗原結合断片。
[本発明1008]
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、本発明1007の抗体または抗原結合断片。
[本発明1009]
前記重鎖可変領域がフレームワーク配列を含む、本発明1001〜1008のいずれかの抗体または抗原結合断片。
[本発明1010]
前記フレームワーク配列についての少なくとも1つの部分が、ヒトフレームワーク配列を含む、本発明1009の抗体または抗原結合断片。
[本発明1011]
前記ヒトフレームワーク配列がヒトコンセンサスフレームワーク配列である、本発明1010の抗体または抗原結合断片。
[本発明1012]
前記フレームワーク配列が、SEQ ID NO: 7、8、9、10、および11からなる群より選択されるフレームワーク領域1(FR1)配列を含む、本発明1009の抗体または抗原結合断片。
[本発明1013]
前記フレームワーク配列が、SEQ ID NO: 12、13、14、15、および16からなる群より選択されるフレームワーク領域2(FR2)配列を含む、本発明1009の抗体または抗原結合断片。
[本発明1014]
前記フレームワーク配列が、SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、22、23、および24からなる群より選択されるフレームワーク領域3(FR3)配列を含む、本発明1009の抗体または抗原結合断片。
[本発明1015]
前記フレームワーク配列が、SEQ ID NO: 25および26からなる群より選択されるフレームワーク領域4(FR4)配列を含む、本発明1009の抗体または抗原結合断片。
[本発明1016]
前記フレームワーク配列が、
SEQ ID NO: 7、8、9、10、および11からなる群より選択されるFR1配列;
SEQ ID NO: 12、13、14、15、および16からなる群より選択されるFR2配列;
SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、22、23、および24からなる群より選択されるFR3配列;ならびに
SEQ ID NO: 25および26からなる群より選択されるFR4配列
を含む、本発明1009の抗体または抗原結合断片。
[本発明1017]
前記軽鎖可変領域がフレームワーク配列を含む、本発明1003〜1006のいずれかの抗体または抗原結合断片。
[本発明1018]
前記フレームワーク配列についての少なくとも1つの部分が、ヒトフレームワーク配列を含む、本発明1017の抗体または抗原結合断片。
[本発明1019]
前記ヒトフレームワーク配列がヒトコンセンサスフレームワーク配列である、本発明1018の抗体または抗原結合断片。
[本発明1020]
前記フレームワーク配列が、SEQ ID NO: 27、28、および29からなる群より選択されるフレームワーク領域1(FR1)配列を含む、本発明1017の抗体または抗原結合断片。
[本発明1021]
前記フレームワーク配列が、SEQ ID NO: 30および31からなる群より選択されるフレームワーク領域2(FR2)配列を含む、本発明1017の抗体または抗原結合断片。
[本発明1022]
前記フレームワーク配列が、SEQ ID NO: 32および33からなる群より選択されるフレームワーク領域3(FR3)配列を含む、本発明1017の抗体または抗原結合断片。
[本発明1023]
前記フレームワーク配列が、SEQ ID NO: 34および35からなる群より選択されるフレームワーク領域4(FR4)配列を含む、本発明1017の抗体または抗原結合断片。
[本発明1024]
前記フレームワーク領域が、
SEQ ID NO: 27、28、および29からなる群より選択されるFR1配列;
SEQ ID NO: 30および31からなる群より選択されるFR2配列;
SEQ ID NO: 32および33からなる群より選択されるFR3配列;ならびに
SEQ ID NO: 34および35からなる群より選択されるFR4配列
を含む、本発明1017の抗体または抗原結合断片。
[本発明1025]
SEQ ID NO: 45に対する少なくとも約90％の配列同一性を有している重鎖可変ドメインおよび/またはSEQ ID NO: 46に対する少なくとも約90％の配列同一性を有している軽鎖可変ドメインを含む、単離された抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1026]
SEQ ID NO: 45を含む重鎖可変ドメインおよび/またはSEQ ID NO: 46を含む軽鎖可変ドメインを含む、単離された抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1027]
前記抗体がモノクローナル抗体である、本発明1025または1026の抗体または抗原結合断片。
[本発明1028]
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、本発明1027の抗体または抗原結合断片。
[本発明1029]
SEQ ID NO: 36、37、38、39、40、41、もしくは42のいずれか1つに対する少なくとも90％の配列同一性を有している重鎖可変ドメインおよび/またはSEQ ID NO: 43もしくは44に対する少なくとも90％の配列同一性を有している軽鎖可変ドメインを含む、単離された抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1030]
SEQ ID NO: 36、37、38、39、40、41、もしくは42のいずれか1つを含む重鎖可変ドメインおよび/またはSEQ ID NO: 43もしくは44を含む軽鎖可変ドメインを含む、単離された抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1031]
単離された抗PD-L1抗体が、
(i)SEQ ID NO: 36、37、38、39、40、41、もしくは42のいずれか1つの重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO: 43もしくは44の軽鎖可変ドメインを含む抗PD-L1抗体と同じエピトープに実質的に結合するか;または
(ii)SEQ ID NO: 36、37、38、39、40、41、もしくは42のいずれか1つの重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO: 43もしくは44の軽鎖可変ドメインを含む抗PD-L1抗体と同じエピトープへの結合に関して競合する、
該単離された抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1032]
(a)SEQ ID NO: 36、37、38、39、40、41、または42のいずれか1つの重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO: 43または44の軽鎖可変ドメインを含む抗体を発現する細胞を培養する工程;ならびに
(b)該細胞からまたは該細胞が培養される細胞培養培地から該抗体を単離する工程
によって作製される、単離された抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1033]
前記抗体がモノクローナル抗体である、本発明1029〜1032のいずれかの抗体または抗原結合断片。
[本発明1034]
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、本発明1033の抗体または抗原結合断片。
[本発明1035]
単一特異性である、本発明1001〜1034のいずれかの抗体または抗原結合断片。
[本発明1036]
二重特異性である、本発明1001〜1034のいずれかの抗体または抗原結合断片。
[本発明1037]
前記二重特異性抗体または前記抗原結合断片が、PD-L1タンパク質および細胞表面タンパク質に結合する、本発明1036の抗体または抗原結合断片。
[本発明1038]
前記細胞表面タンパク質が、CD20、EGFR、HER2、CTLA-4、TIM3、LAG3、VISTA、およびTIGITからなる群より選択される、本発明1037の抗体または抗原結合断片。
[本発明1039]
多重特異性である、本発明1001〜1034のいずれかの抗体または抗原結合断片。
[本発明1040]
前記多重特異性抗体または前記抗原結合断片が、PD-L1タンパク質および1種類または複数種類の細胞表面タンパク質に結合する、本発明1039の抗体または抗原結合断片。
[本発明1041]
前記1種類または複数種類の細胞表面タンパク質が、CD20、EGFR、HER2、CTLA-4、TIM3、LAG3、VISTA、およびTIGITからなる群より選択される、本発明1040の抗体または抗原結合断片。
[本発明1042]
前記抗原結合断片が、Fab、Fab'、F(ab) 2 、F(ab') 2 、Fv、scFv、および単一ドメイン抗体からなる群より選択される、本発明1001〜1041のいずれかの抗体または抗原結合断片。
[本発明1043]
前記抗体がκ軽鎖またはλ軽鎖を含む、本発明1001〜1042のいずれかの抗体または抗原結合断片。
[本発明1044]
前記抗体が、IgG、IgM、IgA、IgD、またはIgEアイソタイプである、本発明1001〜1043のいずれかの抗体または抗原結合断片。
[本発明1045]
前記抗体がIgGアイソタイプであり、かつ該抗体が、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4からなる群より選択されるサブクラスである、本発明1044の抗体または抗原結合断片。
[本発明1046]
前記抗体がIgMアイソタイプである、本発明1044の抗体または抗原結合断片。
[本発明1047]
前記抗体がJ鎖を含む、本発明1046の抗体または抗原結合断片。
[本発明1048]
前記抗体がIgAアイソタイプであり、かつ該抗体が、IgA1およびIgA2からなる群より選択されるサブクラスである、本発明1044の抗体または抗原結合断片。
[本発明1049]
前記抗体がJ鎖を含む、本発明1048の抗体または抗原結合断片。
[本発明1050]
前記抗体が、J鎖を含むIgG/IgMハイブリッド抗体またはIgG/IgAハイブリッド抗体である、本発明1001〜1043のいずれかの抗体または抗原結合断片。
[本発明1051]
前記J鎖が、外来性結合部分を含む改変J鎖である、本発明1047、1049、または1050のいずれかの抗体または抗原結合断片。
[本発明1052]
前記外来性結合部分が、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体-薬物コンジュゲート、抗体様分子、抗体様分子の抗原結合断片、可溶性タンパク質および膜結合型タンパク質、リガンド、ならびに受容体からなる群より選択される、本発明1051の抗体または抗原結合断片。
[本発明1053]
前記外来性結合部分が、抗体の抗原結合断片であり、かつFab、Fab'、F(ab) 2 、F(ab') 2 、Fv、scFv、および単一ドメイン抗体からなる群より選択される、本発明1052の抗体または抗原結合断片。
[本発明1054]
前記抗原結合断片がscFvである、本発明1053の抗体または抗原結合断片。
[本発明1055]
前記外来性結合部分が、T細胞シグナル伝達経路に影響を及ぼす、本発明1051の抗体または抗原結合断片。
[本発明1056]
前記外来性結合部分が、T細胞抑制シグナル伝達経路をアンタゴナイズする、本発明1055の抗体または抗原結合断片。
[本発明1057]
前記外来性結合部分が、CTLA-4、TIM3、LAG3、BTLA、VISTA、およびTIGITからなる群より選択される細胞表面タンパク質に結合する、本発明1056の抗体または抗原結合断片。
[本発明1058]
前記外来性結合部分が、アルブミンタンパク質またはアルブミンタンパク質の断片を含む、本発明1051の抗体または抗原結合断片。
[本発明1059]
前記外来性結合部分がアルブミン結合ペプチドを含む、本発明1051の抗体または抗原結合断片。
[本発明1060]
前記外来性結合部分がアルブミン結合抗体断片を含む、本発明1051の抗体または抗原結合断片。
[本発明1061]
前記アルブミン結合抗体断片が、Fab、scFv、VHH、scFab、およびdAbからなる群より選択される、本発明1060の抗体または抗原結合断片。
[本発明1062]
前記外来性結合部分がFcRn結合ペプチドを含む、本発明1051の抗体または抗原結合断片。
[本発明1063]
前記外来性結合部分がFcRn結合抗体断片を含む、本発明1051の抗体または抗原結合断片。
[本発明1064]
前記FcRn結合抗体断片が、Fab、scFv、VHH、scFab、およびdAbからなる群より選択される、本発明1063の抗体または抗原結合断片。
[本発明1065]
前記外来性結合部分がFcドメインを含む、本発明1051の抗体または抗原結合断片。
[本発明1066]
外来性結合部分を含む改変J鎖を含む、IgM抗体、IgA抗体、IgG/IgM抗体、もしくはIgG/IgA抗体、または抗原結合断片であって、該抗体または該抗原結合断片が、細胞表面タンパク質に結合し、かつ、該外来性結合部分が、本発明1001〜1034のいずれかの抗PD-L1抗体または抗原結合断片を含む、IgM抗体、IgA抗体、IgG/IgM抗体、もしくはIgG/IgA抗体、または抗原結合断片。
[本発明1067]
前記細胞表面タンパク質が、CD20、EGFR、HER2、CTLA-4、TIM3、LAG3、VISTA、およびTIGITからなる群より選択される、本発明1066の抗体または抗原結合断片。
[本発明1068]
前記外来性結合部分がエフェクター細胞に結合する、本発明1051の抗体または抗原結合断片。
[本発明1069]
前記エフェクター細胞が、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、および好中球からなる群より選択される、本発明1068の抗体または抗原結合断片。
[本発明1070]
前記エフェクター細胞がT細胞である、本発明1069の抗体または抗原結合断片。
[本発明1071]
前記外来性結合部分が前記T細胞上のCD3に結合する、本発明1070の抗体または抗原結合断片。
[本発明1072]
前記エフェクター細胞がNK細胞である、本発明1069の抗体または抗原結合断片。
[本発明1073]
前記外来性結合部分がNK細胞上の標的に結合し、該標的が、CD16、CD64、およびNKG2Dからなる群より選択される、本発明1072の抗体または抗原結合断片。
[本発明1074]
前記エフェクター細胞がマクロファージである、本発明1069の抗体または抗原結合断片。
[本発明1075]
前記外来性結合部分が前記マクロファージ上のCD14に結合する、本発明1074の抗体または抗原結合断片。
[本発明1076]
前記エフェクター細胞が好中球である、本発明1069の抗体または抗原結合断片。
[本発明1077]
前記外来性結合部分が、前記好中球上のCD16bまたはCD177に結合する、本発明1076の抗体または抗原結合断片。
[本発明1078]
PD-L1アンタゴニストである、本発明1001〜1077のいずれかの抗体または抗原結合断片。
[本発明1079]
PD-L1シグナル伝達経路をアンタゴナイズする、本発明1001〜1078のいずれかの抗体または抗原結合断片。
[本発明1080]
PD-L1タンパク質とPD-1タンパク質の相互作用をアンタゴナイズする、本発明1078または1079の抗体または抗原結合断片。
[本発明1081]
PD-L1タンパク質とPD-1タンパク質の結合を阻害する、本発明1078または1079の抗体または抗原結合断片。
[本発明1082]
PD-L1タンパク質とPD-1タンパク質の結合を阻止する、本発明1078または1079の抗体または抗原結合断片。
[本発明1083]
PD-L1タンパク質に結合し、かつPD-1タンパク質の1つまたは複数の機能を阻害する、本発明1001〜1082のいずれかの抗体または抗原結合断片。
[本発明1084]
前記本発明のいずれかの抗体の重鎖および/または軽鎖をコードする、ポリヌクレオチド。
[本発明1085]
本発明1084のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[本発明1086]
本発明1084のポリヌクレオチドまたは本発明1085のベクターを含む、組換え宿主細胞。
[本発明1087]
原核細胞である、本発明1086の宿主細胞。
[本発明1088]
真核細胞である、本発明1086の宿主細胞。
[本発明1089]
本発明1001〜1083のいずれかの抗PD-L1抗体を含む、キット。
[本発明1090]
本発明1001〜1083のいずれかの抗PD-L1抗体の重鎖および/または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を、宿主細胞にトランスフェクトする工程;
該抗PD-L1抗体を産生するのに適した条件下で該宿主細胞を培養する工程;ならびに
該抗PD-L1抗体を単離する工程
を含む、単離された抗PD-L1抗体を作製する方法。
[本発明1091]
PD-L1タンパク質を本発明1001〜1083のいずれかの抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含む、PD-1タンパク質の1つまたは複数の機能を阻害する方法。
[本発明1092]
インビトロで実施される、本発明1091の方法。
[本発明1093]
哺乳動物対象においてインビボで実施される、本発明1091の方法。
[本発明1094]
PD-L1を発現する腫瘍細胞を有している対象に本発明1001〜1083のいずれかの抗体を投与する工程であって、それによって、(i)該腫瘍細胞の成長もしくは増殖を抑制するか、または(ii)該腫瘍細胞の死を誘導する、工程を含む、該腫瘍細胞の成長を抑制する方法。
[本発明1095]
本発明1001〜1083のいずれかの抗体および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
[本発明1096]
本発明1095の薬学的組成物の有効量をがんに罹患している対象に投与する工程を含む、該対象を治療する方法。
[本発明1097]
がんを治療するための医薬を調製する際の、本発明1001〜1083のいずれかの抗体の使用。
[本発明1098]
がんの治療において使用するための、本発明1001〜1083のいずれかの単離された抗体。
[本発明1099]
前記がんが血液がんまたは上皮がんである、本発明1096〜1098のいずれかの方法または使用。
[本発明1100]
前記血液がんが、白血病、リンパ腫、骨髄腫、または骨髄異形成症候群である、本発明1099の方法または使用。
[本発明1101]
前記白血病が、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、または慢性リンパ性白血病である、本発明1100の方法または使用。
[本発明1102]
前記リンパ腫が、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫である、本発明1100の方法または使用。
[本発明1103]
前記上皮がんが、非小細胞肺がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、結腸直腸がん、卵巣がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、甲状腺がん、乳がん、または鼻咽腔がんである、本発明1099の方法または使用。
[本発明1104]
前記乳がんが、ホルモン受容体陰性乳がんまたは三重陰性乳がんである、本発明1103の方法または使用。
[本発明1105]
前記がんが黒色腫である、本発明1096〜1098のいずれかの方法または使用。
[本発明1106]
前記がんが膠芽腫である、本発明1096〜1098のいずれかの方法または使用。
[本発明1107]
前記薬学的組成物または前記医薬が、有効量の第2の治療物質をさらに含む、本発明1096〜1106のいずれかの方法または使用。
[本発明1108]
試料を本発明1001〜1083のいずれかの抗PD-L1抗体と接触させる工程;および
該抗PD-L1抗体が該試料中においてPD-L1ポリペプチドに結合するかどうか判定する工程であって、そのような結合の存在によって該試料中において該PD-L1ポリペプチドの存在が示される、工程
を含む、該試料をスクリーニングして該試料におけるPD-L1ポリペプチドの存在を判定する方法。
[本発明1109]
前記抗PD-L1抗体が検出可能に標識され、かつ、該抗PD-L1抗体が前記PD-L1ポリペプチドに結合するかどうか判定する工程が検出可能な標識を検出することを含む、本発明1108の方法。
間接的ELISAアッセイ法の概略図である。 抗ヒトPD-L1抗体の反応性および特異性を明らかにするのに使用されるフローサイトメトリーアッセイ法の概略図である。 パネルAは、間接的ELISAでの3種類のハイブリドーマ上清の活性を陽性対照抗体および陰性対照抗体と共に示すグラフである。パネルBは、ハイブリドーマ上清のFACSスクリーニングから得られたデータ例を陽性対照および陰性対照と共に示すグラフである。 PD-1を過剰発現し、PD-L1抗原を過剰発現するCHO細胞の存在下では抑制されるジャーカットを基にしたレポーター細胞株におけるNFATに駆動されたルシフェラーゼ発現に基づく、PD-1/PD-L1遮断アッセイ法の概略図である。 パネルAは、PD-1/PD-L1遮断アッセイ法におけるハイブリドーマ上清のスクリーニングから得られたデータ例を示すグラフである。パネルBは、ハイブリドーマスクリーニングの戦略および結果の模式的説明である。 パネルAは、3C5-2G12軽鎖に由来するNGSによって導き出された配列の分布を示す棒グラフである。パネルBは、3C5-2G12重鎖に由来するNGSによって導き出された配列の分布を示す棒グラフである。すべての重鎖が同じレベルで発現されたわけではなかった。 クーマシー染色したハイブリッドゲル(左)および抗J鎖抗体を用いたウェスタンブロットの画像である。これらの画像は、完全に組み立てられたIgM五量体の形成ならびにJ鎖の組込みを示している。 3C5.2G12 IgM、3C5.2G12 IgM+J鎖、および3C5.2G12 IgGの抗体型によるPD-L1遮断データを示すグラフである。 パネルAは、カニクイザルPD-L1との3C5.2G12の交差反応性を示すグラフである。パネルBは、マウスPD-L1との3C5.2G12の交差反応性がないことを示すグラフである。パネルCは、ヒトPD-L2との3C5.2G12の交差反応性がないことを示すグラフである。 3C5.2G12 IgMおよび3C5.2G12 IgG型の抗体、ならびにIgG h3C5-1抗体、IgG h3C5-2抗体、IgG h3C5-3抗体、およびIgG h3C5-4抗体によるPD-L1遮断データを示すグラフである。 非標識のS70(黒四角)または3C5(黒丸)の段階希釈物と予め結合させた細胞である、ヒトPD-L1を発現する組換えCHO細胞への蛍光標識した抗PD-L1抗体S70 IgG(パネルA)または蛍光標識した抗PD-L1抗体3C5(パネルB)の結合を示す。これらの結果から、S70が3C5の結合を阻止でき、3C5がS70の結合を阻止できることが実証される。
発明の詳細な説明
一般的な技術
本発明の実践は、別段の定めが無い限り、当業者の技能の範囲内である分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition (Sambrook et al., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, ed., 1984); "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice" (Goding, Academic Press, 3rd Edition, 1996); “Antibody Engineering” (R.E. Kontermann & S. Dubel, 2013); “Animal Cell Culture” (R. I. Freshney, ed., 1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Current Protocols in Molecular Biology” (F. M. Ausubel et al., eds., 1987および定期的な最新版); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis et al., ed., 1994); “A Practical Guide to Molecular Cloning” (Perbal Bernard V., 1988); “Phage Display: A Laboratory Manual” (Barbas et al., 2001)などの文献で十分に説明されている。
当業者は、本発明の実践において使用され得る、本明細書において説明されるものと同様または等価な多くの方法および材料を認識するであろう。実際、本発明は、説明される方法および材料に決して限定されない。本発明のために、以下の用語を下記に定義する。
定義
本明細書を説明するために、以下の定義が適用され、適宜、単数形で使用される用語は複数形も含み、逆もまた同様である。説明される任意の定義が、参照により本明細書に組み入れられる任意の文書と矛盾する場合には、下記に説明する定義が優先されるものとする。
本明細書において同義的に使用される用語「PD-L1」および「プログラム細胞死タンパク質1リガンド1」は、別段の定めが無い限り、霊長類(例えばヒト)およびげっ歯動物(例えば、マウスおよびラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源に由来する任意のPD-L1を意味する。具体的には、「ヒトPD-L1」は、SEQ ID NO: 48の290アミノ酸長のPD-L1ヒトポリペプチド(UniProtKB-Q9NZQ7)を含む。
用語「PD-L1」は、「完全長の」プロセシングされていないPD-L1、ならびに細胞内でのプロセシングの結果として生じる任意の形態のPD-L1を包含する。この用語はまた、PD-L1の天然に存在する変種、例えば、スプライス変種、対立遺伝子変種、およびアイソフォームも包含する。本明細書において説明されるPD-L1ポリペプチドは、様々な供給源のいずれかから、例えば、ヒト組織型もしくは別の供給源から単離されてもよく、または組換え方法もしくは合成方法によって調製されてもよい。「ネイティブ配列PD-L1ポリペプチド」は、自然界に由来する対応するPD-L1ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有しているポリペプチドを含む。このようなネイティブ配列PD-L1ポリペプチドは、自然界から単離することができるか、または組換え手段もしくは合成手段を用いて作製することができる。具体的には、用語「ネイティブ配列PD-L1ポリペプチド」は、PD-L1の天然に存在する短縮型または分泌型(例えば細胞外ドメイン配列)、天然に存在する変種型(例えば、選択的にスプライシングされた型)、およびポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変種を包含する。本発明の特定の態様において、本明細書において開示されるネイティブ配列PD-L1ポリペプチドは、PD-L1の完全長アミノ酸配列を含む、成熟したまたは完全長のネイティブ配列ポリペプチドである。具体的には、用語「PD-L1」は、アミノ酸1〜18の位置のN末端シグナルペプチドを含むまたは含まない、SEQ ID NO: 48のヒトPD-L1ポリペプチドを非限定的に含む、ネイティブのヒトPD-L1ポリペプチドを包含する。
本明細書において同義的に使用される用語「PD-1」および「プログラム細胞死タンパク質1」は、別段の定めが無い限り、霊長類(例えばヒト)およびげっ歯動物(例えば、マウスおよびラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源に由来する任意のPD-1を意味する。具体的には、「ヒトPD-1」は、UniProtKB-Q15116において提供される288アミノ酸長のPD-1ヒトポリペプチドを含む。
用語「PD-1」は、「完全長の」プロセシングされていないPD-1、ならびに細胞内でのプロセシングの結果として生じる任意の形態のPD-1を包含する。この用語はまた、PD-1の天然に存在する変種、例えば、スプライス変種、対立遺伝子変種、およびアイソフォームも包含する。本明細書において説明されるPD-1ポリペプチドは、様々な供給源のいずれかから、例えば、ヒト組織型もしくは別の供給源から単離されてもよく、または組換え方法もしくは合成方法によって調製されてもよい。「ネイティブ配列PD-1ポリペプチド」は、自然界に由来する対応するPD-1ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有しているポリペプチドを含む。このようなネイティブ配列PD-1ポリペプチドは、自然界から単離することができるか、または組換え手段もしくは合成手段を用いて作製することができる。具体的には、用語「ネイティブ配列PD-1ポリペプチド」は、PD-1の天然に存在する短縮型または分泌型(例えば細胞外ドメイン配列)、天然に存在する変種型(例えば、選択的にスプライシングされた型)、およびポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変種を包含する。本発明の特定の態様において、本明細書において開示されるネイティブ配列PD-1ポリペプチドは、PD-1の完全長アミノ酸配列を含む、成熟したまたは完全長のネイティブ配列ポリペプチドである。具体的には、用語「PD-1」は、N末端シグナルペプチドを含むまたは含まない、UniProtKB-Q15116のヒトPD-1ポリペプチドを非限定的に含む、ネイティブのヒトPD-1ポリペプチドを包含する。
「エピトープ」とは、単一の抗体分子が結合する、抗原分子の表面の部位である。通常、抗原は、いくつかまたは多くの異なるエピトープを有しており、多くの異なる抗体と反応する。具体的には、この用語は、直線状エピトープおよび立体構造的エピトープを含む。
「エピトープマッピング」は、抗体の標的抗原上の結合部位またはエピトープを特定する方法である。抗体エピトープは、直線状エピトープまたは立体構造的エピトープであってよい。直線状エピトープは、1つのタンパク質中のアミノ酸の連続的配列によって形成される。立体構造的エピトープは、タンパク質配列中で連続していないがタンパク質が3次元構造にフォールディングすると寄せ集められるアミノ酸で形成されている。
本明細書において定義する「エピトープビニング」は、抗体が認識するエピトープに基づいて抗体をグループ分けする方法である。より具体的には、エピトープビニングは、抗体をそれらのエピトープ認識特性に基づいてクラスター化し、独特な結合特異性を有している抗体を同定するためのコンピューターによる処理と組み合わせた、様々な抗体のエピトープ認識特性を区別するための方法およびシステムを含む。
2種類の抗体が同一のエピトープまたは立体的に共通の部分があるエピトープを認識する場合、抗体は、参照抗体と「本質的に同じエピトープ」に結合する。2つのエピトープが同一のエピトープまたは立体的に共通の部分があるエピトープに結合するかどうかを判定するための最も広く使用されており迅速な方法は、競合アッセイ法であり、これらは、標識抗原または標識抗体のいずれかを用いて多くの異なる形式で構成することができる。通常、抗原が96ウェルプレート上に固定され、非標識抗体が標識抗体の結合を阻止する能力が、放射性標識または酵素標識を用いて測定される。好ましくは、このような抗体は、GFSLTSYDIS(SEQ ID NO: 4)のHVR-H1、VIWTGVGTN(SEQ ID NO: 5)のHVR-H2配列、およびDPYYYGMDY(SEQ ID NO: 6)のHVR-H3配列を含む抗体によって結合されるものと同じPD-L1エピトープに本質的に結合する。1つの態様において、このような抗体は、SEQ ID NO: 4の配列に対する少なくとも約99％の配列同一性を有しているHVR-H1配列、SEQ ID NO: 5の配列に対する少なくとも約99％の配列同一性を有しているHVR-H2配列、およびSEQ ID NO: 6の配列に対する少なくとも約99％の配列同一性を有しているHVR-H3配列を含む。この文脈において、「PD-L1」は、好ましくは、N末端シグナルペプチドを含むまたは含まない、SEQ ID NO: 48のヒトPD-L1ポリペプチドである。
本明細書において使用される場合、アミノ酸残基/位置の「改変」とは、出発アミノ酸配列と比べた一次アミノ酸配列の変更を意味し、この変更は、該アミノ酸残基/位置を含む配列変更に起因する。例えば、典型的な改変には、別のアミノ酸による残基の(または該位置における)置換(例えば、保存的置換または非保存的置換)、該残基/位置の近くへの1つまたは複数(通常、5個もしくは3個より少ない)アミノ酸の挿入、および該残基/位置の欠失が含まれる。「アミノ酸置換」またはその変形は、所定の(出発)アミノ酸配列中の既存のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることを意味する。通常、かつ好ましくは、改変の結果として、出発(または「野生型」)アミノ酸配列を含むポリペプチドと比べて、変種ポリペプチドの少なくとも1種類の物理的活性または生化学的活性が変化する。例えば、抗体の場合、変化する物理的活性または生化学的活性は、標的分子に対する結合親和性、結合能力、および/または結合作用であってよい。
用語「抗体」は、モノクローナル抗体(免疫グロブリンFc領域を有している完全長抗体を含む)、単鎖分子、ならびに抗体断片(例えば、Fab、F(ab')2、およびFv)を含む。用語「免疫グロブリン」(Ig)は、本明細書において「抗体」と同義的に使用される。基本的な4鎖抗体単位は、2つの同一の軽(L)鎖および2つの同一の重(H)鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。別段の言及が無い限り、用語「抗体」は、本明細書において最も幅広い意味で使用され、具体的には、IgG抗体、IgM抗体、IgA抗体、IgD抗体、およびIgE抗体を含む、あらゆるアイソタイプ、サブクラス、および形態の抗体、ならびにそれらの断片、好ましくは抗原結合断片を含む。本明細書において好ましい抗体には、IgG抗体、IgM抗体、およびIgA抗体、ならびにそれらの抗原結合断片が含まれる。いくつかの態様において、IgMのような第1のアイソタイプの抗体を、IgGのような別のアイソタイプに由来する配列を含むように改変して、ハイブリッド抗体を作製してよく、非限定的な例には、IgG/IgMハイブリッド抗体およびIgG/IgAハイブリッド抗体が含まれる。
別段の記載が無い限り、具体的には、用語「抗体」は、天然に存在する変種を含む、ネイティブのヒトおよび非ヒトのIgG1抗体、IgG2(IgG2a、IgG2b)抗体、IgG3抗体、IgG4抗体、IgE抗体、IgA抗体、IgD抗体、およびIgM抗体を含む。したがって、例えば、ヒトIgM配列は、GenBankアクセッション番号X14940.1として利用可能であり、変種は、GenBank CAB37838.1、CAC20458.1、AFM37312.1、X57331.1、およびJ00260.1として報告されている。
ポリペプチド(例えば、抗体またはJ鎖)に関連する用語「ネイティブ」は、本明細書において、調製の様式にかかわらず、自然界に存在する配列を有しているポリペプチドを意味するために使用される。したがって、用語「ネイティブ」および「ネイティブ配列」は、本明細書において同義的に使用され、自然界に見出される配列を含む組換えポリペプチドを特に包含する。
本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同種の抗体集団から得られた抗体を意味する。すなわち、この集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する可能性がある変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を対象とする。さらに、様々な決定基(エピトープ)を対象とする様々な抗体を典型的には含む慣例的な(ポリクローナル)抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、その抗原上の単一の決定基を対象とする。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られたものであるという抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の作製を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohler et al. (1975) Nature 256:495によって最初に説明されたハイブリドーマ法によって作製されてよく、または組換えDNA法(例えば米国特許第4,816,567号を参照されたい)によって作製されてよい。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628およびMarks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597に説明されている技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
具体的には、本明細書におけるモノクローナル抗体には、重鎖および/または軽鎖の一部分は、特定の種に由来する抗体中の対応する配列と同一または相同であるが、その鎖の残りの部分が、別の種に由来する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、ならびに所望の生物活性を示す限りにおいて、そのような抗体の断片が含まれる(米国特許第4,816,567号;およびMorrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855)。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む抗体である。たいていは、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有しているマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種の超可変領域(ドナー抗体)に由来する残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基もまた、対応する非ヒト残基で置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見出されない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良するために施される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、および典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、その中の超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、任意で、免疫グロブリン定常領域についての少なくとも一部分(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含む。さらなる詳細については、Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329;およびPresta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596を参照されたい。
本明細書における「単離された」抗体とは、組換え宿主細胞中のその天然環境の構成要素から同定および分離され、かつ/または回収されたものである。その天然環境の混入構成要素は、抗体の診断的使用または治療的使用を妨げると考えられる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性溶質または非タンパク性溶質、ならびに望まれない製造副産物が含まれ得る。好ましい態様において、本明細書における単離された抗体は、(1)SDS-PAGE法もしくはSEC-HPLC法によって測定した場合に、95重量％を超えるまで、もしくは98重量％を超えるまで、もしくは99重量％を超えるまで、(2)アミノ酸シークエンサーの使用によってN末端もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで、または(3)クーマシーブルー染色、もしくは好ましくは銀染色を用いる、還元条件もしくは非還元条件下でのSDS-PAGEによって均質になるまで、精製される。普通、単離された抗体は、少なくとも1つの精製段階によって調製される。
IgGの場合、通常、4鎖単位は約150,000ダルトンである。各L鎖は1つのジスルフィド共有結合によってH鎖に連結されており、2本のH鎖は、H鎖のアイソタイプに応じて1つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに連結されている。各H鎖およびL鎖はまた、規則正しく間隔の空いた鎖内ジスルフィド架橋も有している。各H鎖は、N末端に可変ドメイン(VH)、続いて、α鎖およびγ鎖のそれぞれの場合は3つの定常ドメイン(CH)、ならびにμアイソタイプおよびεアイソタイプの場合は4つのCHドメインを有している。各L鎖は、N末端に可変ドメイン(VL)、続いてもう一方の端に定常ドメインを有している。VLは、VHと向き合うように並び、CLは、重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)と向き合うように並んでいる。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間の境界面を形成すると考えられている。VHおよびVLは対合して一緒になって、単一の抗原結合部位を形成する。
IgMは、複数の免疫グロブリンがジスルフィド結合によって共有結合的に共に連結されているポリマーを形成する糖タンパク質である。IgMは、大部分は五量体として存在するが、六量体としても存在し、したがって、10個または12個の抗原結合部位を含む。典型的には、五量体型は、J鎖と呼ばれる付加的なポリペプチドを含むが、J鎖がない場合でも生じ得る。五量体IgM分子の分子量は、約970kDaである。ポリマーの性質によって、IgMは高い結合活性を有しており、補体活性化にあたって特に有効である。IgGとは違って、IgM単量体中の重鎖は、1つの可変ドメインおよび4つの定常ドメインから構成される。IgM定常ドメインは、本明細書においてCM1またはCμ1、CM2またはCμ2、CM3またはCμ3、およびCM4またはCμ4と呼ばれ、「CM」および「Cμ」という記号表示は同義的に使用される。
用語「IgM」は、本明細書において最も幅広い意味で使用され、具体的には、単一特異性および多重特異性(二重特異性を含む)のIgM分子、例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に明確に組み入れられるPCT出願番号PCT/US2014/054079で開示される多重特異性IgM結合分子を含む。
用語「IgM結合単位」または「IgM抗体結合単位」は、最も幅広い意味で使用され、具体的には、少なくとも1つのCμ4定常ドメインを含み、標的(例えば抗原)に結合する可変ドメイン配列(VH)に融合され、結合した抗体軽鎖可変ドメイン(VL)配列を伴うまたは伴わない、IgM抗体重鎖定常領域ポリペプチドを包含する。
用語「二重特異性IgM結合単位」または「二重特異性IgM抗体結合単位」は、最も幅広い意味で使用され、具体的には、少なくとも1つのCμ4定常ドメインを含み、可変ドメイン配列(VH)に融合され、各可変ドメイン配列は異なる標的に結合し、結合した抗体軽鎖可変ドメイン(VL)配列を伴うまたは伴わない、一対のIgM抗体重鎖定常領域ポリペプチドを包含する。1つの態様において、二重特異性IgM抗体は、1つの抗原上の異なるエピトープまたは2つの異なる抗原上のエピトープにそれぞれが結合できる、2つのVHVL抗原結合領域を含む。二重特異性IgM抗体結合単位は、単一の種に由来する完全長であってもよく、またはキメラ化もしくはヒト化されていてもよい。本発明の二重特異性IgM抗体は、5個または6個の二重特異性IgM結合単位を含む、五量体または六量体の環構造を有することができる。
用語「多重特異性IgM」は、本明細書において最も広い意味で使用されて、2つまたはそれより多い結合特異性を有しているIgM抗体を意味する。したがって、用語「多重特異性の」は、「二重特異性」、例えば、二重特異性抗体または二重特異性結合単位を含み、それぞれが異なる抗原に結合する少なくとも2個の単一特異性サブユニット(AA、BB)、またはそれぞれが2つの異なる抗原に結合する5個もしくは6個の二重特異性サブユニット(AB、AB)を含むIgM五量体を含む。したがって、二重特異性IgM五量体および多重特異性IgM五量体は、5個の同一の二重特異性結合単位、そのうちの少なくとも2個が異なる結合特異性を有している単一特異性IgM結合単位、またはそれらの任意の組合せを含んでよい。
「完全長IgM抗体重鎖」は、N末端からC末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、抗体定常重鎖定常ドメイン1(CM1またはCμ1)、抗体重鎖定常ドメイン2(CM2またはCμ2)、抗体重鎖定常ドメイン3(CM3またはCμ3)、および抗体重鎖定常ドメイン4(CM4またはCμ4)からなるポリペプチドである。本明細書において定義される二重特異性完全長IgM抗体は、2つの異なる結合標的(エピトープ)に特異的に結合する2つの抗原結合部位をそれぞれが有している、5個または6個の単量体(結合単位)を含む。完全長抗体の重鎖または軽鎖のC末端とは、重鎖または軽鎖のC末端に位置する最後のアミノ酸を指す。完全長抗体の重鎖または軽鎖のN末端とは、重鎖または軽鎖のN末端に位置する最初のアミノ酸を指す。
ネイティブのIgAは、2つの同一の軽鎖(κまたはλ)および2つの同一の重鎖(α)を含む、四量体タンパク質である。ヒトでは、2種類のIgAアイソタイプ、すなわちIgA1およびIgA2がある。IgAは、IgGと同様に、3つの定常ドメイン(CA1〜CA3またはCα1〜Cα3)を含み、Cα1ドメインとCα2ドメインの間にヒンジ領域を有している。ここで、「CA」および「Cα」という記号表示は同義的に使用される。IgAアイソタイプはすべて、Cα3ドメインのC末端に位置し、多量体Ig形成を可能にする18アミノ酸の「尾部」を有している(例えば、Garcia-Pardo et al., 1981, J. Biol. Chem. 256, 11734-11738およびDavis et al., 1988, Eur. J. Immunol. 18, 1001-1008を参照されたい)。血清IgAは単量体であるが、重合することもできる。分泌型の場合、IgAは、尾部を含んでもよく、かつ分泌成分が結合していてもよい、J鎖によって連結された基本的な4鎖単位を2〜5個含む。IgA抗体は、サブクラスIgA1およびIgA2にさらに分けることができる。用語「IgA」抗体は、本明細書において使用されて、具体的には、すべてのサブクラス、すなわち、分泌成分を伴うおよび伴わない二量体型および多量体型を含む、IgA1抗体およびIgA2抗体、ならびにそのような抗体の断片、好ましくは抗原結合断片を含む。本発明の目的のために、好ましくは、IgA抗体は、2つの尾部がJ鎖によって連結されている二量体である。
用語「IgA」は、本明細書において最も幅広い意味で使用され、具体的には、単一特異性および多重特異性のIgA分子、例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に明確に組み入れられるPCT出願番号PCT/US2015/015268で開示される多重特異性IgA結合分子を含む。
用語「多重特性IgA」は、本明細書において最も広い意味で使用されて、2つまたはそれより多い結合特異性を有しているIgA抗体を意味する。したがって、用語「多重特異性の」は、「二重特異性の」、例えば、二重特異性抗体または二重特異性結合単位を含み、それぞれが異なる抗原に結合する2個の単一特異性サブユニット(AA、BB)、またはそれぞれが2つの異なる抗原に結合する2個の二重特異性サブユニット(AB、AB)を含むIgA二量体を含む。
1つの態様において、二量体の多重特異性IgA分子は、異なる結合標的に対する結合特異性を各結合単位が有している、2個の単一特異性結合単位からなる(AA、BB)。別の態様において、二量体IgA分子では、2個の結合単位のうちの少なくとも1個が、2つの異なる結合特異性を有している(すなわち、二重特異性、例えば、AA、AB、またはAA、BCである)。別の態様において、2個の結合単位のそれぞれが、2つの特異性を有しており、それらは同じ(AB、AB)でも、異なっていてもよい(例えば、AC、CD、またはAB、AC)。
用語「二重特異性IgA抗体結合単位」は、最も幅広い意味で使用され、具体的には、少なくとも1つのCA3定常ドメインを含み、可変ドメイン配列(VH)に融合され、各可変ドメイン配列は異なる標的に結合し、結合した抗体軽鎖可変ドメイン(VL)配列を伴うまたは伴わない、一対のIgA抗体重鎖定常領域ポリペプチドを包含する。1つの態様において、二重特異性IgA抗体は、1つの抗原上の異なるエピトープまたは2つの異なる抗原上のエピトープにそれぞれが結合できる、2つのVHVL抗原結合領域を含む。二重特異性IgA抗体結合単位は、単一の種に由来する完全長であってもよく、またはキメラ化もしくはヒト化されていてもよい。
「完全長IgA抗体重鎖」は、N末端からC末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、抗体定常重鎖定常ドメイン1(CA1またはCα1)、抗体定常重鎖定常ドメイン2(CA2またはCα2)、および抗体重鎖定常ドメイン3(CM3またはCα3)からなるポリペプチドである。本発明による二重特異性または多重特異性の完全長IgA抗体は、それぞれが単一特異性または二重特異性であってよく、分泌成分を伴うまたは伴わない、2個の単量体(結合単位)を含むことができる。したがって、本発明の多重特異性IgA抗体には、結果として生じるIgA抗体が少なくとも2つの結合特異性を有していることを条件として、単一特異性結合単位および二重特異性結合単位を含み得る。完全長抗体の軽鎖または重鎖のC末端とは、重鎖または軽鎖のC末端に位置する最後のアミノ酸を指す。完全長抗体の軽鎖または重鎖のN末端とは、重鎖または軽鎖のN末端に位置する最初のアミノ酸を指す。
異なるクラスの抗体の構造および特性についてさらに詳しいことについては、例えば、Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71 and Chapter 6を参照されたい。
本明細書において使用される場合、用語「境界面」は、第2の抗体重鎖定常領域中の1つまたは複数の「接触」アミノ酸残基(または他の非アミノ酸基)と相互作用する第1の抗体重鎖定常領域中の「接触」アミノ酸残基(または他の非アミノ酸基、例えば炭水化物基)を含む領域を意味するのに使用される。
用語「非対称性境界面」は、2つの抗体鎖、例えば、第1のIgM重鎖定常領域と第2のIgM重鎖定常領域の間で、かつ/またはIgM重鎖定常領域とそれに合う軽鎖の間で形成され、その際、第1の鎖および第2の鎖の接触残基が意図的に異なり、相補的な接触残基を含む、(本明細書において上記で定義したような)境界面を意味するのに使用される。非対称性境界面は、ノブ/ホール相互作用および/もしくは塩橋結合(電荷交換)ならびに/または当技術分野において公知の他の技術、例えば、μ重鎖をそれに合う軽鎖に結合させるためのCrossMabアプローチによって、生成することができる。
「窪み」または「ホール」とは、第2のポリペプチドの境界面からへこんでおり、したがって第1のポリペプチドの隣接した境界面上の対応する隆起部(「ノブ」)を受け入れる、少なくとも1つのアミノ酸側鎖を意味する。窪み(ホール)は、元の境界面に存在してもよく、または合成によって(例えば、境界面をコードする核酸を変更することによって)導入してもよい。通常、第2のポリペプチドの境界面をコードする核酸は、窪みをコードするように変更される。これを実現するために、第2のポリペプチドの境界面の少なくとも1つの「元の」アミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基より側鎖の体積が小さい少なくとも1つの「移入」アミノ酸残基をコードするDNAで置換される。複数の元の残基および対応する移入残基があってよいことが認識されるであろう。置換される元の残基の数の上限は、第2のポリペプチドの境界面の残基の総数である。通常、窪みを形成するための好ましい移入残基は、天然に存在するアミノ酸残基であり、好ましくは、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、およびグリシン(G)より選択される。最も好ましいアミノ酸残基は、セリン、アラニン、またはトレオニンであり、最も好ましくはアラニンである。好ましい態様において、隆起部を形成するための元の残基は、側鎖の体積が大きく、例えば、チロシン(Y)、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、またはトリプトファン(W)である。
「元の」アミノ酸残基とは、元の残基より小さな、または大きな側鎖体積を有し得る「移入」残基によって置換される残基である。移入アミノ酸残基は、天然に存在するアミノ酸残基または天然に存在しないアミノ酸残基であってよいが、好ましくは前者である。
「天然に存在しない」アミノ酸残基とは、遺伝コードによってコードされていないが、ポリペプチド鎖中の隣接したアミノ酸残基に共有結合することができる残基を意味する。天然に存在しないアミノ酸残基の例は、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、および他のアミノ酸残基類似体、例えばEllman et al., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)で説明されているものなどである。このような天然に存在しないアミノ酸残基を作製するために、Noren et al. Science 244:182 (1989)およびEllman, et al.、前記に記載の手順を使用することができる。簡単に説明すると、これは、天然に存在しないアミノ酸残基を用いてサプレッサーtRNAを化学的に活性化し、続いて、そのRNAをインビトロで転写および翻訳することを含む。本発明の方法は、特定の態様において、IgM重鎖中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を置換することを含むが、複数の元の残基が置換されてもよい。通常、第1のポリペプチドまたは第2のポリペプチドの境界面の全残基を超えない残基が、置換される元のアミノ酸残基を構成する。置換のための好ましい元の残基は、「埋もれて」いる。「埋もれて」とは、その残基が、本質的に溶媒に近付きにくいことを意味する。好ましい移入残基は、起こり得る酸化またはジスルフィド結合の誤対合を防ぐために、システインではない。
隆起部は、窪み中に「配置可能」であり、これは、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドの境界面の隆起部および窪みそれぞれの空間的位置ならびに隆起部および窪みの大きさが、境界面での第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドの通常の結合を顕著に乱すことなく隆起部が窪みに配置され得るようなものであることを意味する。Tyr、Phe、およびTrpなどの隆起部は、典型的には境界面の軸から垂直には伸びずに、好ましい立体構造を有しているため、隆起部と対応する窪みとの位置合わせは、X線結晶解析または核磁気共鳴(NMR)によって得られるもののような三次元構造に基づいて隆起部/窪みペアをモデル化することに依拠する。これは、分子モデリング技術を含む当技術分野で広く認められている技術を用いて実現することができる。
「元の核酸」とは、隆起部または窪みをコードするように「変更され」(すなわち、遺伝的に操作されるか、または変異させられ)得る、関心対象のポリペプチドをコードする核酸を意味する。元の核酸または出発核酸は、天然に存在する核酸であってよく、または事前の変更(例えばヒト化抗体断片)に供された核酸を含んでもよい。核酸を「変更する」とは、関心対象のアミノ酸残基をコードする少なくとも1つのコドンを挿入、欠失、または置換することによって元の核酸を変異させることを意味する。通常、元の残基をコードするコドンが、移入残基をコードするコドンによって置換される。この様式でDNAを遺伝子改変するための技術は、Mutagenesis: a Practical Approach, M. J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, UK. (1991)で概説されており、例えば、部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)変異誘発が含まれる。
隆起部または窪みは、合成手段によって、例えば、組換え技術、インビトロペプチド合成、先に説明した天然に存在しないアミノ酸残基を導入するための技術によって、ペプチドの酵素的もしくは化学的結合によって、またはこれらの技術の何らかの組合せによって、第1のポリペプチドまたは第2のポリペプチドの境界面に「導入」することができる。従って、「導入」される隆起部または窪みは、「天然に存在しない」または「非ネイティブ」であり、これは、それが自然界にも元のポリペプチド(例えばヒト化モノクローナル抗体)中にも存在しないことを意味する。
好ましくは、隆起部を形成するための移入アミノ酸残基は、比較的少ない数の「回転異性体」(例えば、約3〜6個)を有している。「回転異性体」は、アミノ酸側鎖のエネルギー的に好都合な立体構造である。様々なアミノ酸残基についての回転異性体の数は、Ponders and Richards, J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987)で概説されている。
本明細書において使用される用語「ネイティブ配列J鎖」または「ネイティブJ鎖」は、そのアミノ酸配列がSEQ ID NO: 47に示される成熟ヒトJ鎖を含む、任意の動物種のネイティブ配列IgM抗体またはIgA抗体のJ鎖を意味する。
用語「改変J鎖」は、本明細書において、ネイティブ配列に導入された外来性結合部分を含む、ネイティブ配列J鎖ポリペプチドの変種を意味するために使用される。導入は、外来性結合部分の直接的もしくは間接的融合を含む任意の手段によって、または化学的リンカーを介した結合によって、実現することができる。具体的には、用語「改変ヒトJ鎖」は、非限定的に、結合部分の導入によって改変されたSEQ ID NO: 47のアミノ酸配列のネイティブ配列ヒトJ鎖を包含する。具体的には、この用語は、非限定的に、IgMまたはIgAの効率的重合(二量体化)および標的へのこのような重合体(二量体)の結合の邪魔をしない外来性結合部分の導入によって改変されたSEQ ID NO: 47のアミノ酸配列のネイティブ配列ヒトJ鎖を包含する。
用語「結合部分」は、本明細書において最も広い意味で使用されて、抗原のような標的に特異的結合することができる任意の化学的実体を包含する。結合部分の例には、非限定的に、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体-薬物コンジュゲート、抗体様分子、抗体様分子の抗原結合断片、リガンド、および受容体が含まれる。好ましい結合部分は、生物学的機能を好ましくは有しているポリペプチド(ペプチドを含む)である。生物学的機能の例は、結合部分が結合して、シグナル伝達経路の働きを活性化または阻止する能力である。
用語「ポリペプチド」は、本明細書において最も広い意味で使用され、ペプチド配列を含む。一般に、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって共有結合的に連結された最高で約60個、好ましくは最高で約30個のアミノ酸を含む、アミノ酸の直線状分枝鎖を説明するものである。
「結合部分」に関連する用語「外来性の」は、本明細書において、基準のネイティブポリペプチド配列の同じ位置には存在しない結合部分を意味するために使用される。したがって、外来性ポリペプチド配列(ペプチド配列を含む)は、対応するネイティブ配列内の、ただし異なる位置に、含まれていてもよい。好ましい態様において、「外来性の」配列は、対応するネイティブ配列のいかなる位置にも存在していない。
用語「特異的結合」または「に特異的に結合する」または「に特異的」であるとは、標的抗原、例えば特定のポリペプチド、ペプチド、または他の標的(例えば糖タンパク質標的)上のエピトープへの抗体の結合のような、結合標的への結合部分の結合を意味し、測定可能な程度に非特異的相互作用と異なる結合を意味する(例えば、非特異的相互作用は、ウシ血清アルブミンまたはカゼインへの結合であり得る)。特異的結合は、例えば、標的分子への、結合部分、または抗体、もしくは結合部分の導入によって改変された抗体の結合を対照分子への結合と比べて明らかにすることによって測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似している対照分子、例えば、過剰な非標識標的との競合に基づいて明らかにすることができる。この場合、プローブへの標識標的の結合が、過剰な非標識標的によって競合的に阻害される場合、特異的結合が示される。本明細書において使用される、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的のエピトープへの用語「特異的結合」または「に特異的に結合する」または「に特異的」であることは、例えば、標的に対するKdが少なくとも約200nM、もしくは少なくとも約150nM、もしくは少なくとも約100nM、もしくは少なくとも約60nM、もしくは少なくとも約50nM、もしくは少なくとも約40nM、もしくは少なくとも約30nM、もしくは少なくとも約20nM、もしくは少なくとも約10nM、もしくは少なくとも約8nM、もしくは少なくとも約6nM、もしくは少なくとも約4nM、もしくは少なくとも約2nM、もしくは少なくとも約1nM、またはそれより大きい分子によって示され得る。特定の場合において、用語「特異的結合」は、ある分子が、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチドのエピトープに結合し、他のいかなるポリペプチドにもポリペプチドエピトープにも実質的に結合しない結合を意味する。
「結合親和性」とは、ある分子(例えば抗体)の1つの結合部位とその結合相手(例えば抗原)との非共有結合性相互作用を全て足した強さを意味する。別段の定めが無い限り、本明細書において使用される場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー(例えば、抗体および抗原)間の1:1相互作用を反映する固有の結合親和性を意味する。通常、分子Xの相手Yに対する親和性は、解離定数(Kd)によって表すことができる。例えば、Kdは、約200nM、150nM、100nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、1nM、またはそれより大きくてよい。親和性は、本明細書において説明されるものを含む、当技術分野において公知の一般的な方法によって測定することができる。一般に、低親和性抗体は抗原にゆっくりと結合し、すぐに解離する傾向があるのに対し、一般に、高親和性抗体は、より速く抗原に結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が、当技術分野において公知である。
本明細書において使用される場合、「Kd」または「Kd値」とは、抗体と標的のペアにとって適切な技術によって、例えば表面プラズモン共鳴アッセイ法を用いて、例えば、約10応答単位(RU)で固定された抗原CM5チップを用いて25℃でBIAcore(商標)-2000またはBIAcore(商標)-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)を用いて測定される、解離定数を指す。
用語「コンジュゲート」、「コンジュゲートされた」、および「コンジュゲーション」は、任意およびすべての形態の共有結合または非共有結合を指し、非限定的に、直接的な遺伝的または化学的融合、リンカーまたは架橋剤を介する結合、および非共有結合性の結合を含む。
用語「融合」は、本明細書において、起源の異なるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のインフレームの組合せによる、1本のポリペプチド鎖中のそれらのアミノ酸配列の組合せを意味するために使用される。用語「融合」は、内部融合、すなわち、ポリペプチド鎖の末端のうちの1つへの融合に加えて、ポリペプチド鎖内部への起源の異なる配列の挿入も明確に包含する。用語「融合」は、本明細書において、起源の異なるアミノ酸配列の組合せを意味するために使用される。
本明細書において使用される用語「価」は、抗体中の指定された数の結合部位の存在を意味する。したがって、用語「二価」、「四価」、および「六価」は、それぞれ、2個の結合部位、4個の結合部位、および6個の結合部位の存在を意味する。したがって、本発明による二重特異性IgA抗体において、各結合単位が二価である場合、二重特異性IgA抗体は四価を有している。
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができる任意の分子決定基を含む。特定の態様において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなど分子の化学的に活性な表面基を含み、特定の態様において、特殊な三次元構造特徴および/または特殊な荷電特徴を有している場合がある。エピトープとは、抗体が結合する抗原領域である。「結合領域」とは、結合分子が結合する、結合標的上の領域である。
「ポリエピトープ特異性」とは、同じまたは異なる標的上の2つまたはそれより多い異なるエピトープに特異的に結合する能力を意味する。「単一特異性の」とは、ただ1つのエピトープに結合する能力を意味する。いくつかの態様において、抗体は、少なくとも10-7M、もしくは10-8M、またはそれより優れた親和性で各エピトープに結合する。
用語「標的」または「結合標的」は、最も広い意味で使用され、具体的には、自然界で存在する際の生物学的機能の有無に関わらず、ポリペプチド、非限定的に、核酸、炭水化物、脂質、細胞、および他の分子を含む。
用語「抗原」は、抗体に結合するか、または細胞性免疫応答を引き起こすことができる、実体またはその断片を意味する。免疫原とは、生物、特に動物、より具体的には人を含む哺乳動物において免疫応答を誘発できる抗原を意味する。抗原という用語は、上記に定義したように、抗原決定基またはエピトープとして公知の領域を含む。
本明細書において使用される場合、用語「免疫原性の」とは、抗体の産生を誘発し、かつ/またはT細胞および/もしくは免疫原である抗原を対象とする他の反応性免疫細胞を活性化する物質を意味する。
本発明の抗体の「抗原結合部位」または「抗原結合領域」は、典型的には、抗原に対する結合部位の親和性に様々な程度で寄与する、6つの超可変領域(HVR)を含む。用語「相補性決定領域」または「CDR」は、本明細書において用語「超可変領域」または「HVR」と同義的に使用される。3つの重鎖可変ドメインHVR(HVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3)ならびに3つの軽鎖可変ドメインHVR(HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3)がある。HVRおよびフレームワーク領域(FR)の範囲は、配列の可変性および/または抗体/抗原複合体から得られる構造情報に基づいてそれらの領域が定められた、アミノ酸配列をまとめたデータベースと比較することによって、決定される。数の少ないHVRから構成される機能的抗原結合部位(すなわち、結合特異性が3つ、4つ、または5つのHVRによって決定される場合)もまた、本発明の範囲内に含まれる。6つのHVRという完全なセットに満たないものが、一部の結合標的に結合するのに十分である場合がある。したがって、場合によっては、VHドメインのみまたはVLドメインのみのHVRで十分である。さらに、ある種の抗体は、抗原に対して、HVRが関連していない結合部位を有している場合がある。このような結合部位は、具体的には、本発明の定義の範囲内に含まれる。
本出願において使用される用語「宿主細胞」は、本発明による抗体を作製するために操作できる任意の種類の細胞系を意味する。1つの態様において、チャイニーズハムスター(CHO)細胞が宿主細胞として使用される。
本明細書において使用される場合、語句「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」は同義的に使用され、このような呼称はすべて、子孫を含む。したがって、単語「形質転換体」および「形質転換細胞」は、初代対象細胞および継代の回数に関係なく、それに由来する培養物を含む。意図的な変異または偶発性の変異が原因で、すべての子孫のDNA内容物が全く同一ではない場合があることもまた、理解されている。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能または生物活性を有している変種子孫が含まれる。
核酸は、別の核酸配列と機能的に関係して配置されている場合、「機能的に連結」されている。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのDNAは、あるポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、そのポリペプチドのDNAに機能的に連結されており;プロモーターもしくはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、そのコード配列に機能的に連結されており;または、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に機能的に連結されている。一般に、「機能的に連結される」とは、連結されるDNA配列が隣接していていること、および分泌リーダーの場合、隣接し、かつリーディングフレーム中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接していなくてもよい。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合には、合成のオリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣例に従って使用される。
用語「抗PD-L1抗体」、「PD-L1抗体」、または「PD-L1に結合する抗体」は、いずれも、十分な親和性でPD-L1に結合することができ、その結果、その抗体がPD-L1を標的とする際に診断用物質および/または治療物質として有用である、抗体を意味する。特定の態様において、抗PD-L1抗体は、様々な種に由来するPD-L1間で保存されているPD-L1のエピトープに結合する。
1つの態様において、「PD-L1抗体」は、本明細書において、(i)SEQ ID NO: 36〜42もしくは45のいずれか1つで提供される重鎖可変ドメイン配列、および/またはSEQ ID NO: 43、44、もしくは46のいずれか1つで提供される軽鎖可変ドメイン配列を含むか;あるいは(ii)SEQ ID NO: 1〜6で提供されるHVRのうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つを含む、抗PD-L1モノクローナル抗体を具体的に指すために使用される。
用語「可変」は、可変ドメインの特定の区間の配列が抗体間で甚だしく異なるということを意味する。「可変」または「V」ドメインは、抗原結合を媒介し、個々の抗体の、その特定の抗原に対する特異性を定める。しかし、可変性は、可変ドメインの110アミノ酸の範囲の全域に均等に分布しているわけではない。その代わりに、V領域は、それぞれ9〜12アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極端な可変性を有している短い領域で隔てられた、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる15〜30アミノ酸の比較的不変なストレッチからなる。ネイティブな重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、主としてβシート形状を選び、3つの超可変領域によって連結される4つのFRを含み、これらの超可変領域は、βシート構造を連結し、場合によってはβシート構造の一部を形成するループを形成する。各鎖の超可変領域は、FRによって極めて接近してまとめられており、他方の鎖の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)を参照されたい)。
「インタクト」抗体とは、抗原結合部位、ならびに軽鎖定常ドメイン(CL)および特定の抗体クラスの少なくとも重鎖定常ドメインを含むものである。例えば、インタクトIgG抗体は、抗原結合部位、軽鎖定常ドメインCL、ならびに少なくとも重鎖定常ドメインCH1(Cγ1)、CH2(Cγ2)、およびCH3(Cγ3)を含む。インタクトIgM抗体は、抗原結合部位、軽鎖定常ドメインCL、ならびに少なくとも重鎖定常ドメインCM1(Cμ1)、CM2(Cμ2)、CM3(Cμ3)、およびCM4(Cμ4)を含む。インタクトIgA抗体は、抗原結合部位、軽鎖定常ドメインCL、ならびに少なくとも重鎖定常ドメインCA1(Cα1)、CA2(Cα2)、およびCA3(Cα3)を含む。インタクトIgD抗体は、抗原結合部位、軽鎖定常ドメインCL、ならびに少なくとも重鎖定常ドメインCD1(Cδ1)、CD2(Cδ2)、およびCD3(Cδ3)を含む。インタクトIgE抗体は、抗原結合部位、軽鎖定常ドメインCL、ならびに少なくとも重鎖定常ドメインCE1(Cε1)、CE2(Cε2)、CE3(Cε3)、およびCE4(Cε4)を含む。定常ドメインは、ネイティブ配列定常ドメイン(例えば、ヒトネイティブ配列定常ドメイン)またはそのアミノ酸配列変種であることができる。好ましくは、インタクト抗体は、1つまたは複数のエフェクター機能を有している。
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部分、好ましくは、インタクト抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の非限定的な例には、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、およびFv断片;ダイアボディ;直線状抗体(米国特許第5,641,870号、実施例2;Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)を参照されたい);単鎖抗体分子;ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。1つの態様において、抗体断片は、インタクト抗体の抗原結合部位を含み、したがって、抗原に結合する能力を保持している。当業者は、抗体についての少なくとも1つの抗原結合部分をその軽鎖および重鎖の残りの部分から切り離して抗原結合断片を作製することによって、任意のインタクト抗体、例えば、IgG抗体、IgM抗体、IgA抗体、IgD抗体、またはIgE抗体から抗体断片を作製できることを理解するであろう。特定の態様において、抗体断片は、抗体の抗原結合領域、ならびに抗体の軽鎖および/または重鎖の1つまたは複数の付加的なドメインを含むことができる。例えば、いくつかの態様において、抗体断片は、VHドメインおよびVLドメイン、軽鎖定常ドメインCL、ならびに1つまたは複数の重鎖定常ドメイン、例えば、CH1(Cγ1)ドメイン、CM1(Cμ1)ドメイン、CA1(Cα1)ドメイン、CD1(Cδ1)ドメイン、またはCE1(Cε1)ドメインを含む抗原結合領域を含むことができる。
IgG抗体断片の場合、パパイン消化によって、「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片、および容易に結晶化する能力を反映した呼称である、残りの「Fc」断片が生じる。Fab断片は、L鎖全体、ならびにH鎖の可変領域ドメイン(VH)、および1本の重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)からなる。各Fab断片は、抗原結合に関して一価である、すなわち、1つの抗原結合部位を有している。IgG抗体をペプシン処理すると、二価の抗原結合活性を有しているジスルフィド結合された2つのFab断片にだいたい相当する単一の大きなF(ab')2断片が得られ、これは依然として、抗原を架橋することができる。Fab’断片は、抗体ヒンジ領域に由来する1つまたは複数のシステインを含む、CH1ドメインのカルボキシ末端の付加的な数残基を有している点が、Fab断片とは異なる。Fab'-SHは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有しているFab'の呼称である。F(ab')2抗体断片は、最初は、間にヒンジシステインを有しているFab'断片のペアとして作製された。抗体断片の他の化学的結合もまた、公知である。
IgG抗体のFc断片は、ジスルフィドによって結合した、両方のH鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Fc領域中の配列によって決定され、この領域はまた、特定のタイプの細胞上に見出されるFc受容体(FcR)によって認識される部分でもある。
「Fv」は、1つの完全な抗原認識および結合部位を含む、最小抗体断片である。この断片は、しっかりと非共有結合的に結合した1つの重鎖可変領域ドメインと1つの軽鎖可変領域ドメインとの二量体からなる。単鎖Fv(scFv)種では、1つの重鎖可変ドメインおよび1つの軽鎖可変ドメインが可動性ペプチドリンカーによって共有結合的に連結されてよく、その結果、軽鎖および重鎖が、二本鎖Fv種のものに類似した「二量体」構造で結合することができる。これら2つのドメインのフォールディングによって、抗原結合のためのアミノ酸残基を提供し、抗原結合特異性を抗体に与える6つの超可変ループ(H鎖およびL鎖から3ループずつ)が生じる。しかし、単一の可変ドメイン(または抗原に特異的な3つのHVRのみを含む、Fvの半分)でさえ、結合部位全体より親和性は低いものの、抗原を認識し結合する能力を有している。
「sFv」または「scFv」とも略される「単鎖Fv」は、単一のポリペプチド鎖になるように連結されたVH抗体ドメインおよびVL抗体ドメインを含む、抗体断片である。好ましくは、sFvポリペプチドは、sFvが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能にする、VHドメインとVLドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。sFvの概要については、後掲のPluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995を参照されたい。
本明細書において使用される用語「アンタゴニスト」は、その分子の非存在下での同じ機能または活性と比べた際に機能または活性の低下を引き起こす分子を意味する。したがって、シグナル伝達経路の「アンタゴニスト」は、その存在が、シグナル伝達経路の機能または活性の低下を引き起こす分子である。本明細書において使用される用語「アンタゴナイズする」は、機能または活性の低下を引き起こすことを意味する。「阻止」抗体または「アンタゴニスト」もしくは「拮抗性」抗体とは、それが結合する抗原の生物活性を阻害または低減させるものである。好ましい阻止抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的にまたは完全に阻害することができる。
関心対象の抗原、例えばPD-L1エピトープ抗原標的「に結合する」抗体とは、その抗原に十分な親和性で結合し、その結果、抗体が、抗原を発現する細胞または組織を標的とする際に治療物質として有用であり、他のタンパク質と顕著には交差反応しない、ものである。標的分子への抗体の結合に関して、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープに「特異的結合」または「特異的に結合する」または「特異的で」あるという用語は、測定可能な程度に非特異的相互作用と異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、通常、結合活性を有していない構造が類似した分子である対照分子の結合と比べて、分子の結合を明らかにすることによって、測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似している対照分子、例えば、過剰な非標識標的との競合に基づいて明らかにすることができる。この場合、プローブへの標識標的の結合が、過剰な非標識標的によって競合的に阻害される場合、特異的結合が示される。1つの態様において、用語「特異的結合」は、ある分子が、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチドのエピトープに結合し、他のいかなるポリペプチドにもポリペプチドエピトープにも実質的に結合しない結合を意味する。
「PD-L1エピトープを発現する腫瘍細胞の増殖を抑制する」抗体または「増殖抑制性の」抗体とは、PD-L1エピトープを発現または過剰発現するがん細胞の測定可能な増殖抑制をもたらすものである。PD-L1エピトープは、がん細胞の表面で発現される膜貫通ポリペプチドであってもよく、またはがん細胞によって産生され分泌されるポリペプチドであってもよい。好ましい増殖抑制性抗PD-L1抗体は、PD-L1発現腫瘍細胞の増殖を、適切な対照と比べて、20％より多く、好ましくは約20％〜約50％、およびさらにより好ましくは50％より多く(例えば、約50％〜約100％)、抑制する。典型的には、対照は、試験される抗体で処置されない腫瘍細胞である。
「PD-L1エピトープを発現する腫瘍細胞の増殖を抑制する」抗体はまた、(i)それらが結合する細胞の成長もしくは増殖を抑制し得るか;(ii)それらが結合する細胞の死を誘導し得るか;または(iii)それらが結合する細胞の転移を抑制し得る。
本明細書において使用される用語「アゴニスト」は、その分子の非存在下での同じ機能または活性と比べた際に機能または活性の上昇を引き起こす分子を意味する。したがって、シグナル伝達経路の「アゴニスト」は、その存在が、シグナル伝達経路の機能または活性の上昇を引き起こす分子である。本明細書において使用される用語「刺激する」は、機能または活性の上昇を引き起こすことを意味する。
本明細書において使用される用語「T細胞抑制シグナル伝達経路」は、T細胞免疫応答の質的または量的な減少、阻止、または停止をもたらすT細胞シグナル伝達経路を意味する。
本明細書において使用される用語「T細胞刺激シグナル伝達経路」は、T細胞免疫応答の質的または量的な増大または維持をもたらすT細胞シグナル伝達経路を意味する。
「がん」および「がん性」という用語は、未制御の細胞増殖を典型的に特徴とする、哺乳動物の生理的状態を意味するか、または説明する。「腫瘍」は、1つまたは複数のがん細胞を含む。がんの例には、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病、またはリンパ系腫瘍が含まれるが、それらに限定されるわけではない。このようながんのより具体的な例には、扁平上皮がん(例えば上皮性の扁平上皮がん)、皮膚がん、黒色腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん(「NSCLC」)、肺腺がん、および肺扁平上皮がんを含む肺がん、腹膜がん、肝細胞がん、消化器がんを含む胃のがんまたは胃がん、膵がん(例えば膵管腺がん)、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん(例えば高悪性度の漿液性卵巣がん)、肝臓がん(例えば肝細胞がん(HCC))、膀胱がん(例えば尿路上皮膀胱がん)、精巣(胚細胞性腫瘍)がん、ヘパトーマ、乳がん、脳がん(例えば星状細胞腫)、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がん、唾液腺がん、腎臓がんまたは腎がん(例えば、腎細胞がん、腎芽腫、またはウィルムス腫瘍)、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝がん、肛門がん、陰茎がん、ならびに頭頸部がんが含まれる。がんのその他の例には、非限定的に、網膜芽細胞腫、莢膜細胞腫、男性化細胞腫、ヘパトーマ;非ホジキンリンパ腫(NHL)、多発性骨髄腫、および急性血液悪性腫瘍を含む血液悪性腫瘍;子宮内膜がんまたは子宮がん、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛がん、唾液腺がん、外陰がん、甲状腺がん、食道がん、肝がん、肛門がん、陰茎がん、上咽頭がん、喉頭がん、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚がん、シュワン腫、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、および尿路がんが含まれる。
用語「転移性がん」は、原発組織のがん細胞が、血管またはリンパ管によって、元の部位から体内の1つまたは複数の他の部位へと運ばれて、原発組織に加えて1つまたは複数の器官において1つまたは複数の続発性腫瘍を形成する、がんの状態を意味する。有名な例は、転移性乳がんである。
本明細書において使用される場合、「PD-L1に関連するがん」とは、PD-L1遺伝子またはPD-L1遺伝子産物の発現または過剰発現に関連しているがんであり、これは、適切な対照細胞と比べて、正常レベルまたは高レベルの1つまたは複数のPD-L1遺伝子産物を発現する細胞を特徴とする、任意のがんであってよい。適切な対照細胞は、PD-L1を発現または過剰発現するがんに冒されていない個体に由来する細胞であることができ、またはそれらは、必要としているどちらかの対象に由来する非がん性細胞であってもよく、またはそれらは、PD-L1を発現または過剰発現するがんに冒されている別の個体に由来する非がん性細胞であってもよい。
用語「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」は、何らかの程度の異常な細胞増殖に関連している障害を意味する。1つの態様において、細胞増殖性障害はがんである。
本明細書において使用される場合、「腫瘍」とは、悪性であるか良性であるかを問わず、すべての新生細胞の成長および増殖、ならびにすべての前がん性およびがん性の細胞および組織を意味する。
本明細書において使用される用語「予測的」および「予後の」もまた、予測または予後判定のための方法によって、その方法を実践する者が、抗PD-L1抗体を含む抗がん剤による治療に応答する可能性がより高いと考えられる患者を(通常、治療より前に、ただし必ずしもそうではない)選択することが可能になるという意味で、同義的である。
本明細書において使用される用語「治療する」、「治療」、または「治療すること」とは、目的が、標的とする病理学的な状態または障害を予防するか、または遅らせる(減らす)ことである、治療的処置と予防的手段または防止的手段との両方を意味する。治療を必要とする対象には、特定の病態または障害を既に有している者、ならびに障害を有する傾向がある者または障害を予防すべき者が含まれる。
抗PD-L1組成物
本発明の局面には、抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片が含まれ、具体的には、非限定的に、IgM抗体、IgG抗体、およびIgA抗体が含まれる。1つの局面において、本発明は、本明細書において説明されるように、PD-L1ポリペプチドに好ましくは特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの態様において、抗体は、モノクローナル抗体または、例えば、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、およびFv断片、ダイアボディ、ならびに単一ドメイン抗体を含む、その抗原結合断片である。いくつかの態様において、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、または各抗原エピトープへの抗PD-L1抗体の結合を競合的に阻害する抗体である。本発明の抗体は、任意で、CHO細胞または細菌細胞中で作製されてよく、PD-L1タンパク質とそれが結合する受容体またはリガンドとの相互作用を阻害することができる。いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は、それが結合する細胞の死を誘導することができる。検出を目的として、本発明の抗体は、検出可能に標識されるか、または固体支持体に結合されるなどしてよい。
1つの局面において、以下の活性のうちの1つまたは複数を有している抗PD-L1抗体が提供される:(i)PD-L1タンパク質とPD-L1タンパク質が結合できる受容体もしくはリガンド(例えばPD-1タンパク質)との相互作用を阻害する;(ii)インビボで腫瘍転移を抑制する;(iii)インビボで腫瘍増殖を抑制する;(iv)インビボで腫瘍サイズを小さくする;(v)インビボでPD-L1発現腫瘍細胞に対して細胞障害活性を示す;または(vi)インビボでPD-L1発現腫瘍細胞に対して細胞増殖抑制活性を示す。特定の局面において、抗PD-L1抗体は、PD-L1とPD-1の相互作用を阻害する拮抗性抗体である。特定の局面において、抗PD-L1抗体は、PD-L1タンパク質に結合し、それによってPD-1タンパク質の1つまたは複数の機能(例えば、1つまたは複数の免疫抑制機能)を抑制することができる。
1つの局面において、SEQ ID NO: 4、5、および6で提供される配列に対する少なくとも約99％の配列同一性を有している1つまたは複数の重鎖HVR配列を含む、PD-L1に結合する抗体が提供される。いくつかの態様において、抗体は、SEQ ID NO: 4、5、および6で提供される重鎖HVR配列の3つすべてを含む。いくつかの態様において、抗体は、SEQ ID NO: 1、2、および3で提供される配列に対する少なくとも約99％の配列同一性を有している1つまたは複数の軽鎖HVR配列をさらに含む。いくつかの態様において、抗体は、SEQ ID NO: 1、2、および3で提供される軽鎖HVR配列の3つすべてを含む。特定の態様において、抗体は、SEQ ID NO: 4、5、および6で提供される重鎖HVR配列の3つすべてを含む重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 1、2、および3で提供される軽鎖HVR配列の3つすべてを含む軽鎖可変ドメインを含む。
本発明の局面には、その重鎖配列および軽鎖配列がフレームワーク配列を含む抗PD-L1抗体が含まれる。発明の態様に従うフレームワーク配列には、例えば、ヒトタンパク質およびDNAの生殖系列配列、ならびに任意の数のヒトタンパク質および/またはDNAの生殖系列配列に由来するコンセンサスフレームワーク配列が含まれる。いくつかの態様において、抗PD-L1抗体軽鎖配列は、ヒトフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列を含む。いくつかの態様において、抗PD-L1抗体重鎖配列は、ヒトフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列を含む。
いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 7〜11で提供される重鎖FR1配列のいずれか1つと少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である重鎖フレームワーク領域1(FR1)配列を含む。特定の態様において、抗体は、SEQ ID NO: 7〜11のいずれか1つで提供される重鎖FR1配列を含む。
いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 12〜16で提供される重鎖FR2配列のいずれか1つと少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である重鎖フレームワーク領域2(FR2)配列を含む。特定の態様において、抗体は、SEQ ID NO: 12〜16のいずれか1つで提供される重鎖FR2配列を含む。
いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 17〜24で提供される重鎖FR3配列のいずれか1つと少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である重鎖フレームワーク領域3(FR3)配列を含む。特定の態様において、抗体は、SEQ ID NO: 17〜24のいずれか1つで提供される重鎖FR3配列を含む。
いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 25〜26で提供される重鎖FR4配列のいずれか1つと少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である重鎖フレームワーク領域4(FR4)配列を含む。特定の態様において、抗体は、SEQ ID NO: 25または26で提供される重鎖FR4配列を含む。
いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 27〜29で提供される軽鎖FR1配列のいずれか1つと少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である軽鎖フレームワーク領域1(FR1)配列を含む。特定の態様において、抗体は、SEQ ID NO: 27〜29のいずれか1つで提供される軽鎖FR1配列を含む。
いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 30〜31で提供される軽鎖FR2配列のいずれか1つと少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である軽鎖フレームワーク領域2(FR2)配列を含む。特定の態様において、抗体は、SEQ ID NO: 30または31で提供される軽鎖FR2配列を含む。
いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 32〜33で提供される軽鎖FR3配列のいずれか1つと少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である軽鎖フレームワーク領域3(FR3)配列を含む。特定の態様において、抗体は、SEQ ID NO: 32または33で提供される軽鎖FR3配列を含む。
いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 34〜35で提供される軽鎖FR4配列のいずれか1つと少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である軽鎖フレームワーク領域4(FR4)配列を含む。特定の態様において、抗体は、SEQ ID NO: 34または35で提供される軽鎖FR4配列を含む。
1つの局面において、SEQ ID NO: 36〜42または45で提供される重鎖可変ドメイン配列のいずれか1つと少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である重鎖可変ドメイン配列を含む、PD-L1に結合する抗体が提供される。いくつかの態様において、抗体は、SEQ ID NO: 36〜42または45のいずれか1つで提供される重鎖可変ドメイン配列を含む。
いくつかの態様において、抗体は、SEQ ID NO: 43、44、または46で提供される軽鎖可変ドメイン配列のいずれか1つと少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である軽鎖可変ドメイン配列を含む。いくつかの態様において、抗体は、SEQ ID NO: 43、44、または46のいずれか1つで提供される重鎖可変ドメイン配列を含む。
いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 45で提供される重鎖可変ドメイン配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 46で提供される軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である軽鎖可変ドメイン配列を含む。いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 45で提供される重鎖可変ドメイン配列およびSEQ ID NO: 46で提供される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 36で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 43で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である軽鎖可変ドメイン配列を含む。1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 36で提供される重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 43で提供される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 37で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 43で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である軽鎖可変ドメイン配列を含む。1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 37で提供される重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 43で提供される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 38で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 43で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である軽鎖可変ドメイン配列を含む。1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 38で提供される重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 43で提供される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 39で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 43で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である軽鎖可変ドメイン配列を含む。1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 39で提供される重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 43で提供される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 36で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 44で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である軽鎖可変ドメイン配列を含む。1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 36で提供される重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 44で提供される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 37で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 44で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である軽鎖可変ドメイン配列を含む。1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 37で提供される重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 44で提供される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 38で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 44で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である軽鎖可変ドメイン配列を含む。1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 38で提供される重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 44で提供される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 39で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 44で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である軽鎖可変ドメイン配列を含む。1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 39で提供される重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 44で提供される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 40で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 43で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である軽鎖可変ドメイン配列を含む。1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 40で提供される重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 43で提供される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 41で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 43で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である軽鎖可変ドメイン配列を含む。1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 41で提供される重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 43で提供される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 42で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 43で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である軽鎖可変ドメイン配列を含む。1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 42で提供される重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 43で提供される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 40で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 44で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である軽鎖可変ドメイン配列を含む。1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 40で提供される重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 44で提供される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 41で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 44で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である軽鎖可変ドメイン配列を含む。1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 41で提供される重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 44で提供される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 42で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 44で提供される配列と少なくとも約80％同一、例えば、約85％、約90％、約95％、または約99％同一である軽鎖可変ドメイン配列を含む。1つの態様において、抗PD-L1抗体は、SEQ ID NO: 42で提供される重鎖可変ドメイン配列を含み、かつSEQ ID NO: 44で提供される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
いくつかの態様において、本明細書において挙げる配列または配列の組合せのいずれかを含む抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。
いくつかの態様において、抗体は、ヒトVHサブグループIII(VH3)重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。いくつかの態様において、抗体は、ヒトVHサブグループII(VH2)重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。いくつかの態様において、抗体は、ヒトVHサブグループI(VH1)重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。VH3重鎖FR1配列の例が、SEQ ID NO: 10および11で提供される。VH3重鎖FR2配列の例が、SEQ ID NO: 15および16で提供される。VH3重鎖FR3配列の例が、SEQ ID NO: 22、23、および24で提供される。
いくつかの態様において、抗体は、ヒトκ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。いくつかの態様において、抗体は、ヒトλ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
当技術分野において公知であるように、かつ本明細書においてより詳細に説明されるように、抗体の超可変領域を線引きするアミノ酸位置/境界は、状況および(後述する)当技術分野において公知の様々な定義によって、変わり得る。可変ドメイン内のいくつかの位置は、これらの位置が1組の判定基準のもとでは超可変領域の内部にあるとみなすことができる一方で、別の組の判定基準のもとでは超可変領域の外部にあるとみなされるという点で、ハイブリッド超可変位置として見てもよい。これらの位置のうちの1つまたは複数はまた、範囲を拡張した超可変領域(下記にさらに定義する)中にも見出すことができる。本発明は、これらのハイブリッド超可変位置に改変を含む抗体を提供する。1つの態様において、これらの超可変位置には、重鎖可変ドメイン中の位置26〜30、33〜35B、47〜49、57〜65、93、94、および101〜102のうちの1つまたは複数が含まれる。1つの態様において、これらのハイブリッド超可変位置には、軽鎖可変ドメイン中の位置24〜29、35〜36、46〜49、56、および97のうちの1つまたは複数が含まれる。
本発明の局面に従う抗体には、具体的には、IgG抗体、IgM抗体、IgA抗体、IgD抗体、およびIgE抗体、ならびにそれらの断片、好ましくは抗原結合断片を非限定的に含む、あらゆるアイソタイプ、サブクラス、および形態の抗体が含まれる。本明細書において好ましい抗体には、IgG抗体、IgM抗体、およびIgA抗体、ならびにそれらの抗原結合断片が含まれ、これらは、IgGのような他のアイソタイプに由来する配列を含むように改変して、キメラ抗体を作製してもよい。
いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は、IgG抗体である。特定の態様において、IgG抗体は、IgG1、IgG2(IgG2a、IgG2b)、IgG3、またはIgG4からなる群より選択されるサブクラスである。
いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は、IgM抗体である。IgM抗体は、その開示内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる公開されたPCT出願PCT/US2014/054079で説明されている。
いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は、IgA抗体である。特定の態様において、IgA抗体は、IgA1またはIgA2からなる群より選択されるサブクラスである。IgA抗体は、その開示内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる公開されたPCT出願PCT/US2015/015268で説明されている。
いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は、改変J鎖を含むIgM抗体である。いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は、改変J鎖を含むIgA抗体である。いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は、改変J鎖を含むIgG/IgMハイブリッド抗体である。いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は、改変J鎖を含むIgG/IgAハイブリッド抗体である。改変J鎖を含むIgM抗体、IgA抗体、IgG/IgM抗体、およびIgG/IgA抗体は、その開示内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる公開されたPCT出願PCT/US2015/024149で説明されている。
本発明の態様に従う抗体は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であってよい。二重特異性IgG抗体は、例えば、その開示内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2014/0120096号で説明されている。
本発明の局面には、2種類の異なる結合領域に対する結合特異性を有している二重特異性IgM抗体が含まれる。二重特異性IgM抗体は、その開示内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる公開されたPCT出願PCT/US2014/054079で説明されている。
本発明の局面には、2種類の異なる結合領域に対する結合特異性を有している二重特異性IgA抗体が含まれる。二重特異性IgA抗体は、例えば、その開示内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる公開されたPCT出願PCT/US2015/015268で説明されている。
本発明の局面には、IgG/IgMハイブリッド抗体およびIgG/IgAハイブリッド抗体が含まれる。このような抗体は、その開示内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる公開されたPCT出願PCT/US2015/024149で説明されている。
1つの特定の態様において、完全長抗PD-L1抗体は、IgG抗体である。
1つの特定の態様において、完全長抗PD-L1抗体は、IgM抗体である。1つの態様において、完全長抗PD-L1 IgM抗体は、外来性結合部分を含む改変J鎖を含む。
1つの特定の態様において、完全長抗PD-L1抗体は、IgA抗体である。1つの態様において、完全長抗PD-L1 IgA抗体は、外来性結合部分を含む改変J鎖を含む。
1つの特定の態様において、完全長抗PD-L1抗体は、IgG/IgM抗体ハイブリッド抗体である。1つの態様において、完全長抗PD-L1 IgG/IgMハイブリッド抗体は、外来性結合部分を含む改変J鎖を含む。
1つの特定の態様において、完全長抗PD-L1抗体は、IgG/IgAハイブリッド抗体である。1つの態様において、完全長抗PD-L1 IgG/IgA抗体は、外来性結合部分を含む改変J鎖を含む。
本明細書において言及されるアミノ酸配列を、下記の表1に提供する。
（表１）アミノ酸配列
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本発明の局面には、IgM抗体、IgA抗体、IgG/IgM抗体、またはIgG/IgA抗体がその結合標的(例えばPD-L1)に結合する能力に干渉せずに、T細胞抑制シグナル伝達経路をアンタゴナイズする結合部分を含むJ鎖を含む抗体が含まれる。本発明の態様に従う抗体は、例えば、IgM抗体、IgA抗体、またはIgG/IgMハイブリッド抗体もしくはIgG/IgAハイブリッド抗体であることができ、このハイブリッド抗体は、IgG重鎖においてIgM尾部もしくはIgA尾部を含み、したがって、その結合部分がT細胞抑制シグナル伝達経路をアンタゴナイズする改変J鎖を有している多量体を組み入れ、形成する能力を含めて、IgGとIgMまたはIgAの特性を組み合わせ得る。IgG/IgMハイブリッド抗体およびIgG/IgAハイブリッド抗体に関するさらなる詳細については、例えば、Koteswara et al., Clinical Immunology 2001, 101(1):21-31を参照されたい。
T細胞抑制シグナル伝達経路は、当技術分野において公知であり、その開示内容の全体が参照により本明細書に組み入れられるPardoll, Drew M. "The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy." Nature Reviews Cancer 12.4 (2012): 252-264で説明されているものが、非限定的に含まれる。T細胞抑制シグナル伝達経路およびその構成要素の非限定的な例を、下記にさらに詳細に説明する。
通常、プログラム細胞死-1(PD-1)およびそのリガンドであるプログラム細胞死リガンド-1(PD-L1)は、T細胞の免疫抑制活性に関与している。PD-1は、免疫グロブリンスーパーファミリーの抑制性細胞表面受容体タンパク質であり、T細胞の表面で発現され、免疫および自己寛容におけるT細胞機能の調節に関与している。PD-L1は、T細胞表面のPD-1と相互に作用し、細胞周期の進行およびサイトカイン産生を阻止することによってT細胞の増殖を抑制する。前掲書。PD-1の免疫抑制機能の例には、PD-1を発現するT細胞の消耗、アネルギー、および静止が含まれるが、それらに限定されるわけではない。先に概説したように、いくつかの態様において、抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片は、PD-L1タンパク質に結合し、それによってPD-1タンパク質の免疫抑制機能のうちの1つまたは複数を抑制することができる。
細胞障害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、T細胞に抑制シグナルを伝達することが示されている。CTLA-4の膜結合型アイソフォームは、ジスルフィド結合によって互いにつながったホモ二量体として機能し、一方、可溶性アイソフォームは、単量体として機能する。例えば、Pardollの255頁。
T細胞抑制シグナル伝達経路の別の例は、T細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン3(TIM3)を含むシグナル伝達経路である。TIM3は、T細胞の表面で発現される細胞表面糖タンパク質であり、Th1細胞の停止に関与している抑制分子として機能する。前掲書。
T細胞抑制シグナル伝達経路の別の例は、リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)を含むシグナル伝達経路である。LAG3は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、T細胞の細胞増殖、活性化、および恒常性の抑制物質として機能する。前掲書。
T細胞抑制シグナル伝達経路の別の例は、Bリンパ球およびTリンパ球アテニュエータータンパク質(BTLA)を含むシグナル伝達経路である。BTLAは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーとの相互作用を介してT細胞を阻害することによって機能する細胞表面タンパク質である。BTLAは、T細胞免疫応答を負に調節することが公知である。前掲書。
T細胞抑制シグナル伝達経路の別の例は、T細胞活性化のVドメインIg抑制因子(VISTA)を含むシグナル伝達経路である。VISTAは、造血細胞および白血球において発現されるT細胞機能調節因子であり、T細胞活性化を抑制することによって機能する。例えば、Lines JL, et al., Cancer research. 2014;74(7):1924-1932。
T細胞抑制シグナル伝達経路の別の例は、IgおよびITIMドメインを有しているT細胞免疫受容体(TIGIT)タンパク質を含むシグナル伝達経路である。TIGITは、いくつかのクラスのT細胞において発現され、ポリオウイルス受容体に高い親和性で結合する。TIGITは、成熟した免疫調節性樹状細胞の発生を促進することによってT細胞活性化を抑制する。例えば、Yu X. et al., Nat Immunol. 2009 Jan;10(1):48-57。
上記に概説したように、本発明の態様に従う抗体は、T細胞抑制シグナル伝達経路をアンタゴナイズするJ鎖上の結合部分を含むことができる。いくつかの態様において、J鎖上の結合部分は、T細胞抑制シグナル伝達経路中の標的に結合し、それによって、その経路を介してT細胞が受け取る抑制シグナルを阻止するか、または減らす。結果として、T細胞の免疫応答は阻止されず、停止されず、減らされもしないか、または少なくとも、T細胞の免疫応答の抑制が軽減されるか、もしくは弱められる。対象抗体のJ鎖上の結合部分を用いて、限定されるわけではないが、下記の表2に挙げるタンパク質を含む抑制シグナル伝達経路を含む、任意のT細胞抑制シグナル伝達経路をアンタゴナイズすることができる。これらのT細胞抑制シグナル伝達経路標的のヒトタンパク質配列に対応するGenBankアクセッション番号を、下記の表2に提供する。
（表２）T細胞抑制シグナル伝達経路標的に関する配列情報
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本発明の局面には、対象の血液循環からの抗体のクリアランスを減少させる結合部分を含み、それによって対象における抗体の半減期を長くするJ鎖を有している抗PD-L1抗体が含まれる。アルブミン結合は、タンパク質の薬物動態を改善するための一般的戦略として当技術分野において公知である。例えば、アルブミンとの非共有結合は、短寿命タンパク質の半減期を延ばすことが示されている。例えば、その開示内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる、Dennis, Mark S. et al., J. Biol. Chem., 2002, 277:35035-35043。したがって、対象抗PD-L1抗体中のJ鎖上の結合部分としてアルブミン(ヒト血清アルブミン)、アルブミン様タンパク質、またはアルブミン結合ペプチドを使用することは、抗体の薬物動態を操作するための有効な戦略になる。さらに、新生児型Fc受容体(FcRn)は、循環血中半減期がより長い免疫グロブリン分子を提供する再循環経路を提供することが公知である。例えば、Roopenian D.C. et al., Nature Reviews Immunology 7, 715-725 (2007)。したがって、FcRn結合タンパク質、FcRnに結合するFcドメイン、またはFcRnに結合する抗体部分を使用することもまた、抗体の薬物動態を操作するための有効な戦略になる。
いくつかの態様において、対象抗PD-L1抗体のJ鎖上の結合部分は、アルブミンタンパク質を含む。アルブミンタンパク質は、血漿中に通常見出される可溶性の非グリコシル化タンパク質である。アルブミンタンパク質は、FcRnを介する再循環経路と相互作用し、結果として、並外れて長い循環半減期を有していることが公知である。
特定の態様において、対象抗PD-L1抗体のJ鎖上の結合部分は、アルブミンタンパク質に結合し、それによって、それ自身をアルブミンタンパク質に連結し、FcRnを介する再循環経路を利用する。したがって、特定の態様において、対象抗PD-L1抗体のJ鎖上の結合部分は、アルブミン結合ペプチドを含む。アルブミン結合ペプチドの非限定的な例は、その開示内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開US20050287153で説明されている。いくつかの態様において、対象抗PD-L1抗体のJ鎖上の結合部分は、アルブミンに結合する抗体部分を含む。アルブミンに結合する抗体部分の非限定的な例には、抗アルブミンFab、抗アルブミンscFv、抗アルブミンVHH(例えばラクダ科動物様抗体分子)、抗アルブミンscFab、および抗アルブミンdAb(例えばヒトドメイン抗体)が含まれる。
いくつかの態様において、対象抗PD-L1抗体のJ鎖上の結合部分は、FcRn結合ペプチドを含む。特定の態様において、対象抗PD-L1抗体のJ鎖上の結合部分は、FcRn結合抗体部分を含む。FcRnに結合する抗体部分の非限定的な例には、抗FcRn Fab、抗FcRn scFv、抗FcRn VHH、抗FcRn scFab、および抗FcRn dAbが含まれる。
いくつかの態様において、対象抗PD-L1抗体のJ鎖上の結合部分は、FcRn受容体が結合する、免疫グロブリン分子のFcドメインを含む。抗PD-L1抗体のクリアランスを減少させるために対象抗PD-L1抗体のJ鎖上に含めることができる結合部分には、非限定的に、下記の表3に提供される結合部分が含まれる。対象抗PD-L1抗体のJ鎖上の結合部分として使用できる抗体部分を作製するのに使用できるタンパク質の非限定的な例もまた、表3に提供される。
（表３）クリアランスを減少させる結合部分に関する配列情報
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対象抗体のJ鎖上の結合部分には、非限定的に、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体-薬物コンジュゲート、抗体の抗原結合断片-薬物コンジュゲート、抗体様分子、抗体様分子の抗原結合断片、可溶性タンパク質および膜結合型タンパク質、リガンド、ならびに受容体が含まれ得る。いくつかの態様において、抗体の抗原結合断片は、Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv、scFvおよび単一ドメイン抗体からなる群より選択される。好ましい態様において、J鎖上の結合部分は、T細胞抑制シグナル伝達経路のアンタゴニストとして機能する、単一特異性、二重特異性、および多重特異性の抗体および抗体断片を含む、抗体または抗体の抗原結合断片(「抗体断片」とも呼ばれる)である。好ましい態様において、抗体断片は単鎖Fv(scFv)である。
本発明の局面には、細胞表面タンパク質(例えば、CD20タンパク質、EGFRタンパク質、HER2タンパク質、CTLA-4タンパク質、TIM3タンパク質、LAG3タンパク質、VISTAタンパク質、またはTIGITタンパク質)に結合する、IgM抗体、IgA抗体、IgG/IgM抗体、もしくはIgG/IgA抗体、またはそれらの抗原結合断片が含まれ、その際、これらのIgM抗体、IgA抗体、IgG/IgM抗体、もしくはIgG/IgA抗体、または抗原結合断片は、本明細書において説明される抗PD-L1抗体または抗原結合断片を含む外来性結合部分を含む改変J鎖を含む。
いくつかの局面において、本発明は、本明細書において説明される抗PD-L1抗体のいずれかをコードするDNAを含むベクターを提供する。任意のそのようなベクターを含む宿主細胞もまた、提供される。例えば、宿主細胞は、CHO細胞、大腸菌(E.coli)細胞、または酵母細胞であってよい。本明細書において説明されるポリペプチドのいずれかを作製するための方法もさらに提供され、この方法は、所望のポリペプチドを発現するのに適した条件下で宿主細胞を培養する工程、および細胞培養物から所望のポリペプチドを回収する工程を含む。
本発明の態様に従う抗体は、ELISA、競合的結合アッセイ法、直接的サンドイッチアッセイ法および間接的サンドイッチアッセイ法、ならびに免疫沈降アッセイ法など任意の公知のアッセイ法において使用することができる(Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158, CRC Press, Inc.)。
検出標識は、結合事象または認識事象を位置決定、可視化、および定量するのに有用であり得る。本発明の標識抗体は、細胞表面受容体を検出することができる。検出可能に標識された抗体の別の用途は、ビーズを蛍光標識抗体とコンジュゲートする工程、およびリガンド結合の際の蛍光シグナルを検出する工程を含む、ビーズに基づく免疫捕捉の方法である。同様の結合検出方法論では、表面プラズモン共鳴(SPR)効果を利用して、抗体-抗原相互作用を測定および検出する。
蛍光色素および化学発光色素などの検出標識(Briggs et al (1997) "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1:1051-1058)は、検出可能なシグナルを提供し、一般に、抗体の標識に適用可能であり、好ましくは次の特性を有している:(i)標識抗体は、少量の抗体を無細胞アッセイ法と細胞ベースのアッセイ法の両方で感度良く検出できるように、バックグラウンドが少ない非常に高レベルのシグナルを生じるべきであり;かつ(ii)標識抗体は、かなりの光退色を行わずに蛍光シグナルを観察、モニター、および記録できるように、光安定性であるべきである。膜または細胞表面、特に生細胞への標識抗体の細胞表面結合を要する適用の場合、標識は、好ましくは、(iii)有効なコンジュゲート濃度および検出感度を実現するために良好な水溶解性を有しており、かつ(iv)細胞の正常な代謝過程を乱しもせず、時期尚早な細胞死を引き起こしもしないように、生細胞にとって有毒ではない。
細胞蛍光強度の直接的定量および蛍光標識事象、例えばペプチド-色素コンジュゲートの細胞表面結合の計数は、生細胞またはビーズを用いるミックスアンドリード式の非放射性アッセイ法を自動化するシステム(FMAT(登録商標)8100 HTS System, Applied Biosystems, Foster City, Calif.)によって実施することができる(Miraglia, "Homogeneous cell- and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) J. of Biomolecular Screening 4:193-204)。標識抗体の用途には、細胞表面受容体結合アッセイ法、免疫捕捉アッセイ法、蛍光結合免疫吸着アッセイ法(FLISA)、カスパーゼ切断(Zheng, "Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:618-23; US 6372907)、アポトーシス(Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V" (1995) J. Immunol. Methods 184:39-51)、および細胞障害性アッセイ法もまた含まれる。蛍光微量容量アッセイ技術を用いて、細胞表面に導かれる分子による上方調節または下方調節を確認することができる(Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) Anal. Biochem. 271:143-51)。
本発明の標識抗体は、(i)MRI(magnetic resonance imaging);(ii)MicroCT(computerized tomography);(iii)SPECT(single photon emission computed tomography);(iv)PET(positron emission tomography) Chen et al (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49;(v)生物発光;(vi)蛍光;および(vii)超音波などの生物医学的かつ分子的な画像化の様々な方法および技術による画像化バイオマーカーおよびプローブとして有用である。免疫シンチグラフィーは、放射性物質で標識された抗体が患畜またはヒト患者に投与され、抗体が集まる体内部位の写真が撮影される画像検査である(US 6528624)。画像化バイオマーカーは、正常な生物学的過程、発病過程、または治療的介入に対する薬理学的応答の指標として客観的に測定および評価され得る。
ペプチド標識方法は、周知である。Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al (1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) “Chemical Modification of Proteins”, Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlin and New York;およびWong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.); De Leon-Rodriguez et al (2004) Chem.Eur. J. 10:1149-1155; Lewis et al (2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324; Li et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115; Mier et al (2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237を参照されたい。
2種類の部分、すなわち十分に近接している蛍光レポーターおよびクエンチャーで標識されたペプチドおよびタンパク質は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を起こす。典型的には、レポーター基は、特定の波長の光によって励起される蛍光色素であり、最大輝度の発光に対する適切なストークスシフトを伴って、アクセプター基またはクエンチャー基にエネルギーを移動させる。蛍光色素には、フルオレセインおよびローダミン、ならびにそれらの誘導体など芳香族性を高めた分子が含まれる。蛍光レポーターは、インタクトペプチド中のクエンチャー部分によって部分的または顕著に消光され得る。ペプチダーゼまたはプロテアーゼによってペプチドが切断されると、蛍光の検出可能な増加を測定することができる(Knight, C. (1995) “Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes”, Methods in Enzymology, Academic Press, 248:18-34)。
本発明の標識抗体はまた、アフィニティー精製剤としても使用され得る。このプロセスにおいて、標識抗体は、当技術分野において周知の方法を用いて、Sephadex樹脂またはろ紙などの固相上に固定される。固定された抗体を、精製しようとする抗原を含む試料と接触させ、その後、固定されたポリペプチド変種に結合している精製しようとする抗原を除いて試料中の実質的にすべての材料を除去する適切な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ポリペプチド変種から抗原を遊離させるグリシン緩衝液pH5.0のような別の適切な溶媒で、支持体を洗浄する。
いくつかの態様において、本発明は、治療物質として本明細書において使用され得る抗PD-L1抗体を提供する。例示的な抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体が含まれる。
ポリクローナル抗体
好ましくは、ポリクローナル抗体は、関連する抗原およびアジュバントを複数回皮下(sc)注射または腹腔内(ip)注射することによって、動物において産生させる。関連する抗原(特に、合成ペプチドが使用される場合)を、免疫化しようとする種において免疫原性であるタンパク質にコンジュゲートすることが有用である場合がある。例えば、抗原を、二官能性物質または誘導体化物質、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介したコンジュゲーション)、N-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、またはR'N=C=NR(RおよびR1は、異なるアルキル基である)を用いて、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、血清アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターにコンジュゲートすることができる。
例えば、(それぞれ、ウサギ用またはマウス用の)100μgまたは5μgのタンパク質またはコンジュゲートを3倍体積量の完全フロイントアジュバントと混合し、その溶液を複数の部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して動物を免疫化する。1ヶ月後に、完全フロイントアジュバントに溶かした最初の量の1/5〜1/10のペプチドまたはコンジュゲートを複数の部位に皮下注射することによって、動物に追加免疫する。7〜14日後に、動物から採血し、血清の抗体力価を検査する。力価が頭うちになるまで、動物に追加免疫する。また、コンジュゲートは、組換え細胞培養によってタンパク質融合物として作製することもできる。また、ミョウバンのような凝集剤を適切に使用して、免疫応答を増強する。
モノクローナル抗体
関心対象の抗原に対するモノクローナル抗体(mAb)は、当技術分野において公知の任意の技術を用いて調製することができる。これらには、KohlerおよびMilstein(1975, Nature 256, 495-497)によって最初に説明されたハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72)、ならびにEBVハイブリドーマ技術(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。選択的リンパ球抗体法(SLAM)(Babcook, J.S., et al., A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. 93 (15): p. 7843-8.)および(McLean GR, Olsen OA, Watt IN, Rathanaswami P, Leslie KB, Babcook JS, Schrader JW. Recognition of human cytomegalovirus by human primary immunoglobulins identifies an innate foundation to an adaptive immune response. J Immunol. 2005 Apr 15;174(8):4768-78。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、およびIgD、ならびにそれらの任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスのものであってよい。本発明において有用なmAbを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養されてよい。
モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)によって最初に説明されたハイブリドーマ法を用いて作製することができ、または組換えDNA法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターを前述したようにして免疫化して、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、インビトロでリンパ球を免疫化してもよい。免疫化後、リンパ球を単離し、次いで、ポリエチレングリコールのような適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞株と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。
このようにして調製したハイブリドーマ細胞を、融合していない親骨髄腫細胞(融合相手とも呼ばれる)の増殖または生存を阻害する1種類または複数種類の物質を好ましくは含む適切な培地に播種し、増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠く場合、ハイブリドーマ用の選択培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み(HAT培地)、これらの物質はHGPRT欠損細胞の増殖を妨げる。
好ましい融合相手である骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定な高レベルの抗体産生を支援し、融合していない親細胞を淘汰する選択培地に対して感受性であるものである。好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えばSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USAから入手可能なMOPC-21マウス腫瘍およびMPC-11マウス腫瘍に由来するもの、ならびにAmerican Type Culture Collection, Manassas, Va., USAから入手可能なSP-2および派生物、例えばX63-Ag8-653細胞である。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス-ヒト異種骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の作製のために説明されている(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984);およびBrodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生に関して分析する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法またはインビトロ結合アッセイ法、例えばラジオイムノアッセイ法(RIA)もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)によって測定される。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)で説明されているスキャッチャード解析によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、および/または活性を有している抗体を産生するハイブリドーマ細胞をひとたび同定すると、クローンを限界希釈処置によってサブクローニングし、標準的な方法(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))によって増殖させてよい。この目的に適した培地には、例えば、D-MEM培地またはRPMI-1640培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、例えばマウスに細胞を腹腔内注射することによって、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させてもよい。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体を、従来の抗体精製手順、例えば、アフィニティークロマトグラフィー(例えばプロテインA-セファロースもしくはプロテインG-セファロースを用いる)、またはイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などによって、培地、腹水、または血清から適切に分離される。
モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手順を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって)、容易に単離および配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの好ましい供給源として役立つ。単離した後、DNAを発現ベクター中に配置して、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を実現することができ、この発現ベクターは、配置後、宿主細胞に、例えば、大腸菌細胞に、サルCOS細胞に、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に、または抗体タンパク質をさもなければ産生しない骨髄腫細胞にトランスフェクトされる。抗体をコードするDNAの細菌における組換え発現に関する総説には、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)およびPliickthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)が含まれる。
さらなる態様において、モノクローナル抗体または抗体断片は、McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)で説明されている技術を用いて作製した抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) は、ファージライブラリーを用いるマウス抗体およびヒト抗体の単離をそれぞれ説明している。その後の出版物では、チェーンシャッフリングによる高親和性(nM範囲)ヒト抗体の作製(Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992))、ならびに非常に大規模なファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびインビボ組換え(Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993))が説明されている。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体を単離するための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実用的な代替案である。
抗体をコードするDNAは、例えば、同種のマウス配列をヒトの重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメイン(CH配列およびCO配列)で置換することによって(米国特許第4,816,567号;およびMorrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984))、または免疫グロブリンコード配列を非免疫グロブリンポリペプチド(異種ポリペプチド)のコード配列のすべてもしくは一部分と融合させることによって、キメラ抗体ポリペプチドまたは融合抗体ポリペプチドを生じるように改変することができる。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常ドメインの代わりになることができ、またはそれらが抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに用いられて、ある抗原に対する特異性を有している1つの抗原結合部位および異なる抗原に対する特異性を有している別の抗原結合部位を含む、キメラの二価抗体を生成する。
キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体
いくつかの態様において、抗PD-L1抗体は、キメラ抗体である。いくつかのキメラ抗体が、例えば、米国特許第4,816,567号;およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)において説明されている。1つの例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはヒト以外の霊長類、例えばサルに由来する可変領域)およびヒト定常領域を含む。別の例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された、「クラススイッチされた」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
いくつかの態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体をヒト化して、非ヒト親抗体の特異性および親和性を保持しつつ、ヒトに対する免疫原性を低下させる。通常、ヒト化抗体は、HVR (またはその一部分)が非ヒト抗体に由来し、FR(またはその一部分)がヒト抗体配列に由来する、1つまたは複数の可変ドメインを含む。また、ヒト化抗体は、ヒト定常領域についての少なくとも一部分も任意で含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復させるか、または向上させるために、非ヒト抗体(例えば、HVR残基の由来元である抗体)に由来する対応する残基で置換されている。
本発明の態様に従う抗PD-L1抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体であることができる。非ヒト(例えば、マウスまたはウサギ)抗体のヒト化型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらの断片(例えば、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、もしくは抗体の他の抗原結合部分配列)である。ヒト化抗体には、レシピエントのHVRに由来する残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有しているマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のHVRに由来する残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)が含まれる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基で置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体中にも、移入されるHVR配列またはフレームワーク配列中にも見出されない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、すべてまたは実質的にすべてのHVRが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、すべてまたは実質的にすべてのFR領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つ、および典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含むと考えられる。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域についての少なくとも一部分(例えばFc領域)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含む(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992))。
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野において周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源に由来する、それに導入された1つまたは複数のアミノ酸残基を有している。しばしば、これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と呼ばれ、典型的には「移入」可変ドメインから取ってこられる。ヒト化は、本質的には、Winterおよび同僚の方法(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))に従って、げっ歯動物のHVRまたはHVR配列でヒト抗体の対応配列を置換することによって、実施することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、実質的に完全ではないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応配列によって置換されている、キメラ抗体である(米国特許第4,816,567号)。実際には、ヒト化抗体は、いくつかのHVR残基および場合によってはいくつかのFR残基がげっ歯動物抗体中の類似部位に由来する残基で置換されているヒト抗体であることが、典型的である。
ヒト化抗体を作製する際に使用する、軽鎖および重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、その抗体をヒト治療で使用するつもりである場合、抗原性およびHAMA応答(ヒト抗マウス抗体)を減少させるために非常に重要である。HAMA応答の減少または除去は、適切な治療物質の臨床開発の重要な一面である。例えば、Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937; Jaffers et al., Transplantation (1986), 41:572; Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135:1530; Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138; Miller et al., Blood (1983), 62:988; Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147:1352; Reichmann et al., Nature (1988), 332:323; Junghans et al., Cancer Res. (1990), 50:1495を参照されたい。本明細書において説明されるように、本発明は、HAMA応答が減少するか、または除去されるようにヒト化された抗体を提供する。これらの抗体の変種はさらに、当技術分野において公知である常法を用いて得ることができ、それらの常法の一部をさらに後述する。いわゆる「ベストフィット」法にしたがって、げっ歯動物抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列の完全なライブラリーに対してスクリーニングする。げっ歯動物のものに最も近いヒトVドメイン配列が同定されており、その範囲内のヒトフレームワーク領域(FR)がヒト化抗体のために容認されている(Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987))。別の方法では、特定のサブグループの軽鎖または重鎖に属する、全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用されてもよい(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993))。
例えば、本明細書において説明される抗体に由来するアミノ酸配列は、フレームワーク配列および/または超可変配列を多様化するための出発(親)配列の役割を果たすことができる。出発超可変配列が連結される選択されたフレームワーク配列は、本明細書においてアクセプターヒトフレームワークと呼ばれる。アクセプターヒトフレームワークは、ヒト免疫グロブリン(そのVL領域および/またはVH領域)を起源とするか、またはそれに由来してよいが、好ましくは、アクセプターヒトフレームワークは、ヒトコンセンサスフレームワーク配列を起源とするか、またはそれに由来し、これは、このようなフレームワークがヒト患者において最小限の免疫原性を有しているか、または有していないことが実証されているためである。
アクセプターがヒト免疫グロブリンに由来する場合、ドナーフレームワーク配列をヒトフレームワーク配列のコレクション中の様々なヒトフレームワーク配列と位置合わせすることによって、ドナーフレームワーク配列に対する相同性に基づいて選択されるヒトフレームワーク配列を任意で選択し、最も相同性が高いフレームワーク配列をアクセプターとして選択してよい。
アクセプターは、それがヒト免疫グロブリン由来であろうとヒトコンセンサスフレームワーク由来であろうと、選択されるヒトフレームワーク配列と配列が同一であってよい一方で、本発明は、アクセプター配列が、ヒト免疫グロブリン配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と比べて既存のアミノ酸置換を含んでもよいことを企図する。これらの既存の置換は、好ましくは最小限であり、通常、ヒト免疫グロブリン配列またはコンセンサスフレームワーク配列と比べて4個、3個、2個、または1個のアミノ酸が異なる。
いくつかの態様において、非ヒト抗体の超可変領域残基が、VLアクセプターヒトフレームワークおよび/またはVHアクセプターヒトフレームワーク中に組み入れられる。例えば、KabatのCDR残基に対応する残基、Chothiaの超可変ループ残基、Abm残基、および/または接触残基を組み入れることができる。任意で、次のような範囲を拡張した超可変領域残基が組み入れられる:24〜34(L1)、50〜56(L2)、および89〜97(L3)、26〜35B(H1)、50〜65、47〜65、または49〜65(H2)、ならびに93〜102、94〜102、または95〜102(H3)。
超可変領域残基の「組み入れ」が本明細書において論じられるが、これは様々な方法で実現できることが認識されるであろう。例えば、所望のアミノ酸配列をコードする核酸は、マウス可変ドメイン配列をコードする核酸を変異させ、それにより、そのフレームワーク残基をアクセプターヒトフレームワーク残基に変化させることによって、もしくはヒト可変ドメイン配列をコードする核酸を変異させ、それにより、可変ドメイン残基を非ヒト残基に変化させることによって、または所望の配列をコードする核酸を合成することなどによって、作製することができる。
本明細書において説明されるように、超可変領域を接ぎ合わせた変種は、各超可変領域に対して別々のオリゴヌクレオチドを用いて、ヒトアクセプター配列をコードする核酸をKunkel法で変異誘発することによって作製することができる。Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)。慣用技術を用いてフレームワーク領域および/または超可変領域内に適切な変化を導入して、しかるべき超可変領域-抗原相互作用を修正し、回復させることができる。
ファージ(ミド)ディスプレイ(本明細書において一部の文脈ではファージディスプレイとも呼ばれる)は、配列ランダム化によって作製されるライブラリーにおいて様々な多くの潜在的変種抗体を作製しスクリーニングするための簡便かつ迅速な方法として使用することができる。しかし、変更された抗体を作製およびスクリーニングするための他の方法が、当業者には利用可能である。
ファージ(ミド)ディスプレイ技術は、抗原のようなリガンドに結合する新規のタンパク質を作製および選択するための強力な手段を提供した。ファージ(ミド)ディスプレイの技術を用いることにより、標的分子に高い親和性で結合する配列を求めて迅速に選別できる、タンパク質変種の大きなライブラリーを作製することが可能になる。通常、変種ポリペプチドをコードする核酸が、遺伝子IIIタンパク質または遺伝子VIIIタンパク質などのウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列に融合される。タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列が遺伝子IIIタンパク質の一部分をコードする核酸配列に融合される、一価ファージミドディスプレイ系が開発されている。(Bass, S., Proteins, 8:309 (1990); Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991))。一価ファージミドディスプレイ系において、遺伝子融合物は低レベルで発現され、野生型遺伝子IIIタンパク質もまた発現され、したがって、粒子の感染力は保持されている。ペプチドライブラリーを作製しそれらのライブラリーをスクリーニングする方法は、多くの特許で開示されている(例えば、米国特許第5,723,286号;米国特許第5,432,018号;米国特許第5,580,717号;米国特許第5,427,908号;および米国特許第5,498,530号)。
抗体または抗原結合ポリペプチドのライブラリーは、ランダムなDNA配列を挿入することによって単一遺伝子を変更すること、または関連遺伝子のファミリーをクローニングすることを含む、いくつかの方法で調製されている。ファージ(ミド)ディスプレイを用いて抗体または抗原結合断片をディスプレイするための方法は、米国特許第5,750,373号、同第5,733,743号、同第5,837,242号、同第5,969,108号、同第6,172,197号、同第5,580,717号、および同第5,658,727号で説明されている。次いで、ライブラリーは、所望の特徴を有している抗体または抗原結合タンパク質の発現について、スクリーニングされる。
最適なアミノ酸を鋳型核酸に代入する方法は、当技術分野において十分に確立されており、そのうちのいくつかは本明細書において説明される。例えば、超可変領域残基を、Kunkel法を用いて置換することができる。例えば、Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)を参照されたい。
オリゴヌクレオチドの配列は、変更しようとする超可変領域残基に対する設計されたコドンセットのうちの1つまたは複数を含む。コドンセットとは、所望の変種アミノ酸をコードするために使用される様々なヌクレオチドトリプレット配列のセットである。コドンセットは、IUBコードに従って下記に示す個々のヌクレオチドまたはヌクレオチドの等モル混合物を名付ける記号を用いて、表すことができる。
IUBコード: G グアニン;A アデニン;T チミン;C シトシン;R (AまたはG);Y (CまたはT);M (AまたはC);K (GまたはT);S (CまたはG);W (AまたはT);H (AまたはCまたはT);B (CまたはGまたはT);V (AまたはCまたはG);D (AまたはGまたはT);H (AまたはCまたはT);N (AまたはCまたはGまたはT)。
例えば、コドンセットDVKにおいて、Dは、ヌクレオチドAまたはGまたはTであることができ;Vは、AまたはGまたはCであることができ;Kは、GまたはTであることができる。このコドンセットは、18種類の異なるコドンを示すことができ、アミノ酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly、およびCysをコードすることができる。
オリゴヌクレオチドセットまたはプライマーセットは、標準的方法を用いて合成することができる。コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットのありうる組合せすべてに相当し、かつ所望のアミノ酸群をコードする配列を含む、オリゴヌクレオチドのセットは、例えば固相合成によって合成することができる。選択されたヌクレオチド「縮重」を特定の位置に有しているオリゴヌクレオチドの合成は、この技術分野において周知である。特定のコドンセットを有しているこのようなヌクレオチドセットは、市販の核酸合成装置(例えば、Applied Biosystems, Foster City, Calif.から入手可能)を用いて合成することができ、または(例えば、Life Technologies, Rockville, Md.から)市販品として得ることができる。したがって、特定のコドンセットを有している合成されたオリゴヌクレオチドセットは、典型的には、異なる配列を有している複数のオリゴヌクレオチドを含み、これらの差異は、配列全体の範囲内のコドンセットによって確立される。本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、可変ドメイン核酸鋳型へのハイブリダイゼーションを可能にし、かつクローニングのための制限酵素部位も含むことができる配列を有している。
1つの方法において、変種アミノ酸をコードする核酸配列は、オリゴヌクレオチドを媒介とした変異誘発によって作製することができる。この技術は、Zoller et al. Nucleic Acids Res. 10:6487-6504 (1987)によって説明されているように、当技術分野において周知である。手短に言えば、変種アミノ酸をコードする核酸配列は、所望のコドンセットをコードするオリゴヌクレオチドセットをDNA鋳型にハイブリッドすることによって作製され、その際、鋳型は、可変領域核酸鋳型配列を含む一本鎖型のプラスミドである。ハイブリダイゼーション後、DNAポリメラーゼを使用して、したがってオリゴヌクレオチドプライマーを組み入れ、オリゴヌクレオチドセットによって提供されるコドンセットを含むと考えられる、鋳型の第2の相補鎖全体を合成する。
一般に、少なくとも25ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが使用される。最適なオリゴヌクレオチドは、変異をコードするヌクレオチドのどちらか片側の鋳型に完全に相補的である12〜15ヌクレオチドを有している。これにより、そのオリゴヌクレオチドが一本鎖DNA鋳型分子に正しくハイブリダイズするように徹底される。これらのオリゴヌクレオチドは、Crea et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 75:5765 (1978)によって説明されているもののような当技術分野において公知の技術を用いて容易に合成される。
DNA鋳型は、バクテリオファージM13ベクターにいずれも由来するベクター(市販のM13 mp 18ベクターおよびM13 mp 19ベクターが適している)によって、またはViera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987)によって説明されているような一本鎖ファージ複製起点を含むベクターによって作製される。したがって、変異させようとするDNAを、一本鎖鋳型を生じさせるためにこれらのベクターのうちの1つに挿入することができる。一本鎖鋳型の作製は、前記Sambrook et al.のセクション4.21〜4.41で説明されている。
ネイティブDNA配列を変更するためには、オリゴヌクレオチドを適切なハイブリダイゼーション条件下で一本鎖鋳型にハイブリダイズさせる。次いで、DNA重合酵素、通常T7 DNAポリメラーゼまたはDNAポリメラーゼIのクレノウ断片を添加して、合成用プライマーとしてオリゴヌクレオチドを用いて鋳型の相補鎖を合成する。このようにして、DNAの一方の鎖が遺伝子1の変異型をコードし、他方の鎖(元の鋳型)が遺伝子1のネイティブな未変化の配列をコードするように、ヘテロ二重鎖分子を形成させる。次いで、このヘテロ二重鎖分子を適切な宿主細胞、通常は大腸菌JM101のような原核生物に形質転換する。細胞を増殖させた後、それらをアガロースプレートに播種し、32-ホスファートで放射性標識したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてスクリーニングして、変異DNAを含む細菌コロニーを特定する。
すぐ前に説明した方法は、プラスミドの両方の鎖が変異を含むホモ二重鎖分子が作製されるように改変することができる。改変は次のとおりである:一本鎖オリゴヌクレオチドを、前述の一本鎖鋳型にアニールする。3種類のデオキシリボヌクレオチド、すなわちデオキシリボアデノシン(dATP)、デオキシリボグアノシン(dGTP)、およびデオキシリボチミジン(dTT)の混合物を、dCTP-(aS)と呼ばれる改変チオデオキシリボシトシン(Amershamから入手することができる)と混合する。この混合物を、鋳型-オリゴヌクレオチド複合物に添加する。この混合物にDNAポリメラーゼを添加すると、変異塩基以外は鋳型と同一のDNA鎖が生じる。さらに、この新しいDNA鎖は、dCTPの代わりにdCTP-(aS)を含み、dCTP-(aS)は、制限エンドヌクレアーゼ消化からそれを保護する役割を果たす。二本鎖ヘテロ二重鎖の鋳型鎖に適切な制限酵素で切れ目を入れた後、鋳型鎖を、変異誘発しようとする部位を含む領域を通り過ぎた位置で、ExoIIIヌクレアーゼまたは別のヌクレアーゼで消化することができる。次いで、反応を停止して、部分的にのみ一本鎖である分子を残す。次いで、4種すべてのデオキシリボヌクレオチド3リン酸、ATP、およびDNAリガーゼの存在下でDNAポリメラーゼを用いて、完全な二本鎖DNAホモ二重鎖を形成させる。次いで、このホモ二重鎖分子を適切な宿主細胞に形質転換することができる。
以前に示したように、オリゴヌクレオチドセットの配列は、鋳型核酸にハイブリダイズするのに十分な長さのものであり、また、必ずしもそうではないが、制限部位も含んでよい。DNA鋳型は、バクテリオファージM13ベクターにいずれも由来するベクターまたはViera et al. Meth. Enzymol., 153:3 (1987)によって説明されているような一本鎖ファージ複製起点を含むベクターによって作製することができる。したがって、変異させようとするDNAを、一本鎖鋳型を生じさせるためにこれらのベクターのうちの1つに挿入しなければならない。一本鎖鋳型の作製は、前記Sambrook et al.のセクション4.21〜4.41で説明されている。
別の方法によれば、修復された超可変領域を選択することにより、抗体のヒト化の間に抗原結合を回復させることができる(2005年2月18日に出願された米国特許出願第11/061,841号を参照されたい)。この方法は、アクセプターフレームワーク上に非ヒト超可変領域を組み入れる工程、およびさらに、アクセプターフレームワーク配列を改変せずに1つまたは複数の超可変領域に1つまたは複数のアミノ酸置換を導入する工程を含む。あるいは、1つまたは複数のアミノ酸置換の導入は、アクセプターフレームワーク配列の改変を伴ってもよい。
別の方法によれば、上流および下流のオリゴヌクレオチドセットを提供することによってライブラリーを作製することができ、各セットは、異なる配列を有している複数のオリゴヌクレオチドを有しており、これらの異なる配列は、オリゴヌクレオチドの範囲内で提供されるコドンセットによって確立される。上流および下流のオリゴヌクレオチドセットを、可変ドメイン鋳型核酸配列と共にポリメラーゼ連鎖反応で用いて、PCR産物の「ライブラリー」を作製することができる。PCR産物は、確立されている分子生物学技術を用いて、他の関連核酸配列または関連しない核酸配列、例えば、ウイルスコートタンパク質および二量体形成ドメインと融合させることができるため、「核酸カセット」と呼ぶことができる。
PCRプライマーの配列は、超可変領域中の溶媒に露出した極めて多様な位置に対する設計されたコドンセットのうちの1つまたは複数を含む。前述したように、コドンセットとは、所望の変種アミノ酸をコードするために使用される様々なヌクレオチドトリプレット配列のセットである。
適切なスクリーニング/選択段階によって選択される、所望の判定基準を満たす抗体選択物は、標準組換え技術を用いて単離およびクローン化することができる。
抗原に対する高い結合親和性および他の有利な生物学的特性を保持しながら抗体をヒト化することが、さらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法によれば、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いて親配列および様々な概念的ヒト化産物を解析する過程によって、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列のありそうな三次元立体構造を図示し表示するコンピュータープログラムが、利用可能である。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能化において残基が果たしている可能性が高い役割を解析すること、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基を解析することが可能になる。こうして、標的抗原に対する高い親和性のような所望の抗体特徴が実現するように、FR残基をレシピエントおよび移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基が、抗原結合への影響に直接的かつ最も大きく関与している。
様々な形態のヒト化抗PD-L1抗体が企図される。例えば、ヒト化抗体は、Fabのような抗体断片であってよい。あるいは、ヒト化抗体は、インタクトなIgG抗体、IgM抗体、またはIgA抗体などのインタクト抗体であってよい。いくつかの態様において、インタクト抗体は、インタクトIgM抗体であることができる。
ヒト化の代替方法として、ヒト抗体を作製することができる。例えば、免疫化した際に、内因性の免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができる、トランスジェニック動物(例えばマウス)を作製することが現在可能である。例えば、キメラの生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖連結領域(JH)遺伝子のホモ接合性欠失によって内因性抗体産生が完全に阻害されることが説明されている。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイをこのような生殖系列変異マウスに移入すると、抗原曝露の際にヒト抗体を産生するようになる。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993);米国特許第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,591,669号(すべてGenPharm);同第5,545,807号;およびWO 97/17852を参照されたい。
あるいは、ファージディスプレイ技術(McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990))を用いて、免疫化されていないドナーに由来する免疫グロブリン可変(V)ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロでヒト抗体および抗体断片を作製することもできる。この技術によれば、抗体Vドメイン遺伝子を、M13またはfdなどの糸状ファージのメジャーコートタンパク質遺伝子またはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片としてディスプレイする。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含むため、抗体の機能的特性に基づいて選択すると、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子も選択される。このように、ファージは、B細胞の特性の一部を再現する。ファージディスプレイは、例えばJohnson, Kevin S, and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)において概説されている様々な形態で実施することができる。いくつかの供給源のV遺伝子セグメントをファージディスプレイのために使用することができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)では、免疫化マウスの脾臓に由来するV遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから、多種多様な抗オキサゾロン抗体を単離した。免疫化されていないヒトドナーに由来するV遺伝子のレパートリーを構築することができ、多種多様な抗原(自己抗原を含む)に対する抗体を、Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)またはGriffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)によって説明されている技術に本質的に従って、単離することができる。米国特許第5,565,332号および同第5,573,905号もまた、参照されたい。
上述したように、ヒト抗体はまた、インビトロで活性化したB細胞によって産生させることもできる(米国特許第5,567,610号および同第5,229,275号を参照されたい)。
いくつかの態様において、本開示の抗体はヒトモノクローナル抗体である。PD-L1に対するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系の代わりに、ヒト免疫系の一部分を有しているトランスジェニックマウスまたは染色体導入されたマウスを用いて産生させることができる。これらのトランスジェニックマウスおよび染色体導入されたマウスには、それぞれHuMAbマウス(商標)およびKMマウス(商標)と本明細書において呼ばれるマウスが含まれ、本明細書において、まとめて「ヒトIgマウス」と呼ばれる。
HuMAbマウス(商標)(Medarex, Inc.)は、内因性のμ鎖およびκ鎖の遺伝子座を不活性化する狙いを定めた変異と共に、再配列されてないヒト重鎖(μおよびγ)ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含む(例えばLonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859を参照されたい)。したがって、マウスは、マウスIgMまたはκの発現の低減を示し、かつ免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞変異を経て、高親和性のヒトIgGκモノクローナル抗体を生じる(Lonberg, N. et al. (1994)、前記;Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93、およびHarding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546で概説されている)。HuMAbマウス(商標)の調製および使用、ならびにそのようなマウスが有するゲノム改変は、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591;およびFishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851においてさらに説明されており、これらすべての内容は、それらの全体が参照により本明細書に具体的に組み入れられる。さらに、すべてLonbergおよびKayに付与された、米国特許第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,789,650号、同第5,877,397号、同第5,661,016号、同第5,814,318号、同第5,874,299号、および同第5,770,429号; Suraniらに付与された米国特許第5,545,807号すべてLonbergおよびKayに付与された;PCT公開番号WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884、およびWO 99/45962;ならびにKormanらに付与されたPCT公開番号WO 01/14424も参照されたい。
別の態様において、本開示の態様に従うヒト抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を有しているマウスのような、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を有しているるマウスを用いて、産生させることができる。このマウスは、本明細書において「KMマウス(商標)」と呼ばれ、Ishidaらに付与されたPCT公開WO 02/43478で詳細に説明されている。
さらになお、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスジェニック動物系も当技術分野において利用可能であり、本開示の抗PD-L1抗体を産生させるために使用することができる。例えば、ゼノマウス(Abgenix, Inc.)と呼ばれる代替のトランスジェニック系を使用することができる。このようなマウスは、例えば、Kucherlapatiらに付与された米国特許第5,939,598号、同第6,075,181号、同第6,114,598号、同第6150,584号、および同第6,162,963号で説明されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替の染色体導入された動物系も当技術分野において利用可能であり、本開示の抗PD-L1抗体を産生させるために使用することができる。例えば、「TCマウス」と呼ばれる、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両方を有しているマウスを使用することができる。このようなマウスは、Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727で説明されている。さらに、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体を有している雌ウシが当技術分野において説明されており (例えば、Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894およびPCT出願WO 2002/092812)、本開示の抗PD-L1抗体を産生させるために使用することができる。
抗体断片
ある種の状況では、全長抗体ではなく抗体断片を使用することが有利である。断片のサイズが小さいほど、迅速なクリアランスが可能になり、より上手く固形腫瘍に接近するようになり得る。
抗体断片を作製するために、様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクト抗体のタンパク質消化によって誘導された(例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992);およびBrennan et al., Science, 229:81 (1985)を参照されたい)。しかし、現在は、組換え宿主細胞によってこれらの断片を直接的に産生させることができる。Fab抗体断片、Fv抗体断片、およびscFv抗体断片はすべて、大腸菌において発現され、それから分泌されることができ、したがって、多量のこれらの断片の容易な作製が可能になる。抗体断片は、上記の抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Fab'-SH断片を大腸菌から直接的に回収し、化学的に結合させてF(ab')2断片を形成させることもできる(Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992))。別のアプローチによれば、F(ab')2断片は、組換え宿主細胞培養物から直接的に単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、インビボ半減期を長くされたFab断片およびF(ab')2断片が、米国特許第5,869,046号で説明されている。抗体断片を作製するための他の技術は、当業者には明らかであると考えられる。他の態様において、最適な抗体は、単鎖Fv断片(scFvまたはsFv)である。WO 93/16185、米国特許第5,571,894号、および米国特許第5,587,458号を参照されたい。FvおよびsFvは、定常領域を欠くインタクトな結合部位を有している唯一の種である;したがって、これらは、インビボ使用時の非特異的結合を減らすのに適している。sFv融合タンパク質は、sFvのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおいてエフェクタータンパク質の融合をもたらすように構築され得る。前記Antibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照されたい。抗体断片はまた、例えば、米国特許第5,641,870号などで説明されているように、「直線状抗体」であってもよい。
二重特異性抗体および多重特異性抗体
上記に概説したように、二重特異性抗体および多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対する結合特異性を有している抗体である。例示的な二重特異性抗体は、本明細書において説明されるPD-L1タンパク質の2つの異なるエピトープに結合することができる。他のこのような抗体では、PD-L1結合部位を別のタンパク質(例えば細胞表面タンパク質、例えば、腫瘍抗原)に対する結合部位と組み合わせることができる。あるいは、抗PD-L1結合単位は、細胞防御機構をPD-L1発現細胞に集中させ局在化するために、白血球上の引き金分子、例えば、T細胞受容体分子(例えばCD3)、またはFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、およびFcγRIII(CD16)などのIgGに対するFc受容体(FcγR)に結合する結合単位と組み合わせることもできる。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、PD-L1に結合する1つの結合単位および別の結合標的、例えば腫瘍抗原のような細胞表面タンパク質に結合する第2の結合単位を含むことができる。結合標的の役割を果たすことができる細胞表面タンパク質の非限定的な例には、CD20、EGFR、HER2、CTLA-4、TIM3、LAG3、VISTA、およびTIGITが含まれる。CTLA-4、TIM3、LAG3、VISTA、およびTIGITに対応するGenBankアクセッション番号は、表2に見出すことができる。ヒトCD20のアミノ酸配列は、UniProtKB番号P11836で提供される。ヒトEGFRのアミノ酸配列は、UniProtKB番号P00533で提供される。ヒトHER2(ヒトERBB2)のアミノ酸配列は、UniProtKB番号P04626で提供される。
二重特異性抗体はまた、PD-L1を発現する細胞に細胞障害性物質を局在化させるのにも使用され得る。これらの抗体は、PD-L1結合単位および細胞障害性物質(例えば、サポリン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキサート、または放射性同位元素ハプテン)に結合する結合単位を備えている。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製することができる(例えばF(ab')2二重特異性抗体)。
二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野において公知である。完全長二重特異性抗体の従来の作製は、2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づいており、これら2つの鎖は異なる特異性を有している(Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983))。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖がランダムに寄せ集められるため、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は、10種類の異なる抗体分子の潜在的混合物を生じ、このうち1種類のみが、正確な二重特異性構造を有している。通常はアフィニティークロマトグラフィー工程によって実施される、正確な分子の精製は、かなり煩雑であり、産物収率は低い。同様の手順がWO 93/08829およびTraunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
エフェクター機能の操作
例えば、抗体の抗原依存性細胞障害性(ADCC)および/または補体依存性細胞障害性(CDC)を強化するために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変することが望ましい場合がある。これは、抗体の重鎖定常領域(すなわちFc領域)中に1つまたは複数のアミノ酸置換を導入することによって実現することができる。あるいはまたはさらに、システイン残基をFc領域中に導入し、それによって、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させてもよい。このようにして作製されたホモ二量体抗体は、内部移行能力が向上し、かつ/または補体に媒介される細胞死滅および抗体依存性細胞障害性(ADCC)が強化されている場合がある。Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)およびShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照されたい。抗腫瘍活性が高められたホモ二量体抗体はまた、Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)で説明されているヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することもできる。あるいは、数を増やしたFc領域を有するように抗体を操作することもでき(例えば、2個またはそれより多いFc領域を有するように操作されたIgG分子)、抗体はそれによって、強化された補体溶解およびADCC能力を有することができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照されたい。抗体の血清半減期を長くするために、例えば米国特許第5,739,277号で説明されているように、サルベージ受容体結合エピトープを抗体(特に抗体断片)に組み入れてもよい。本明細書において使用される場合、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、エピトープを含む分子(例えばIgG抗体)のインビボでの血清半減期の延長に関与している、IgG分子(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4)のFc領域のエピトープを意味する。
抗体変種
本明細書において説明される抗PD-L1抗体に加えて、抗PD-L1抗体変種を調製できることも企図される。抗PD-L1抗体変種は、適切なヌクレオチド変更をコーディングDNAに導入することによって、かつ/または所望の抗体もしくはポリペプチドの合成によって調製することができる。当業者は、アミノ酸変更によって抗PD-L1抗体の翻訳後処理が変わり得る、例えば、グリコシル化部位の数もしくは位置が変わる、または膜に固着する特徴が変わることを理解するであろう。
本明細書において説明される抗PD-L1抗体の変異は、例えば、米国特許第5,364,934号などで説明されている保存的変異および非保存的変異のための技術および指針のいずれかを用いて、生成することができる。変異は、ネイティブ配列の抗体またはポリペプチドと比べてアミノ酸配列の変化をもたらす、抗体またはポリペプチドをコードする1つまたは複数のコドンの置換、欠失、または挿入であってよい。任意で、変異は、抗PD-L1抗体のドメインのうちの1つまたは複数において少なくとも1つのアミノ酸を他の任意のアミノ酸で置換することによる。所望の活性に悪影響を及ぼさずに、どのアミノ酸残基を挿入し得るか、置換し得るか、または欠失させ得るかを決定する際の手引きは、抗PD-L1抗体の配列を公知の同種タンパク質分子の配列と比較し、相同性が高い領域に起こすアミノ酸配列変更の数を最小限に抑えることによって、見出すことができる。アミノ酸置換は、1つのアミノ酸を同様の構造特性および/または化学特性を有している別のアミノ酸で置き換えること、例えばセリンによるロイシンの置換、すなわち保存的アミノ酸置換の結果であってよい。任意で、挿入または欠失は、約1〜5個のアミノ酸の範囲であってよい。許容される変異は、アミノ酸の挿入、欠失、または置換を配列中に系統的に起こし、得られた変種を完全長もしくは成熟したネイティブ配列によって示される活性について試験することによって判定することができる。
抗PD-L1抗体断片が、本明細書において提供される。このような断片は、例えば、完全長のネイティブ抗体またはタンパク質と比べた場合に、N末端もしくはC末端を切断されていてもよく、または内部残基を欠いていてもよい。ある種の断片は、抗PD-L1抗体の所望の生物活性に不可欠ではないアミノ酸残基を欠いていてよい。
抗PD-L1抗体断片は、いくつかの従来技術のいずれかによって調製してよい。所望のペプチド断片は、化学的に合成してよい。代替のアプローチは、酵素消化により、例えば、特定のアミノ酸残基によって定められる部位でタンパク質を切断することが公知の酵素でタンパク質を処理することによって、または適切な制限酵素でDNAを消化し、所望の断片を単離することによって、抗体断片またはポリペプチド断片を作製することを含む。さらに別の適切な技術は、所望の抗体断片またはポリペプチド断片をコードするDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって単離および増幅することを含む。DNA断片の所望の末端を定めるオリゴヌクレオチドが、PCRにおける5'プライマーおよび3'プライマーの位置で使用される。好ましくは、抗PD-L1抗体断片は、本明細書において開示される完全長抗PD-L1抗体と少なくとも1つの生物学的活性および/または免疫学的活性を共有する。
特定の態様において、関心対象の保存的置換を、表4の好ましい置換という項目の下に示している。このような置換によって生物活性が変化する場合は、表4で例示的置換と呼んでいる、またはアミノ酸クラスに関してさらに後述するような、より大幅な変化を導入し、それらの産物をスクリーニングする。
（表４）
Figure 0006979971
抗PD-L1抗体の機能または免疫学的個性の実質的な改変は、(a)例えば、シート状もしくはらせん状の立体構造としての、置換領域のポリペプチド骨格の構造、(b)分子の標的部位の電荷もしくは疎水性、または(c)側鎖のかさ、を維持することに対する影響が顕著に異なる置換を選択することによって、達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、グループに分けられる:
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性で親水性:cys、ser、thr;
(3)酸性:asp、glu;
(4)塩基性:asn、gln、his、lys、arg;
(5)鎖の向きに影響する残基:gly、pro;および
(6)芳香族:trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。このような置換する残基はまた、保存的置換部位に、またはより好ましくは、残りの(保存されていない)部位に導入されてもよい。
変異は、オリゴヌクレオチドを介した(部位特異的)変異誘発、アラニンスキャニング、およびPCR変異誘発などの当技術分野において公知の方法を用いて起こすことができる。部位特異的変異誘発(Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987))、カセット変異誘発(Wells et al., Gene, 34:315 (1985))、制限選択変異誘発(Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986))、または他の公知の技術をクローン化DNAに対して実施して、抗PD-L1抗体変種DNAを作製することができる。
スキャニングアミノ酸解析を用いて、連続的な配列に沿って1つまたは複数のアミノ酸を同定することもできる。好ましいスキャニングアミノ酸として、比較的小型の中性アミノ酸が挙げられる。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが含まれる。典型的には、アラニンがこの群の中で好ましいスキャニングアミノ酸であり、アラニンはβ炭素以外の側鎖を除去すること、および変種の主鎖の立体構造を変更する可能性が低いことがその理由である(Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989))。アラニンは、最も高頻度に存在するアミノ酸であることからも、典型的に好ましい。さらに、アラニンは、埋もれた位置と露出した位置の両方において、頻繁に見出される(Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976))。アラニン置換しても十分な量の変種が得られない場合、イソテリック(isoteric)なアミノ酸を用いることができる。
抗PD-L1抗体の適切な立体構造を維持するのに関与していない任意のシステイン残基を、通常はセリンで置換して、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を防止することもできる。逆に、システイン結合を抗PD-L1抗体に追加して安定性を向上させてもよい(特に、抗体が、Fv断片のような抗体断片である場合)。
置換変種の特に好ましいタイプは、親抗体(例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体)の1つまたは複数の超可変領域残基の置換を含む。一般に、その後の開発のために選択される得られた変種は、それらが作製された元である親抗体と比べて改善された生物学的特性を有している。このような置換変種を作製するための簡便な方法は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟を伴う。簡単に説明すると、いくつかの超可変領域部位(例えば、6〜7部位)を変異させて、起こり得るすべてのアミノ酸置換を各部位に生じさせる。このようにして作製した抗体変種を、各粒子内部に詰められたM13の遺伝子III産物への融合物として繊維状ファージ粒子から一価の様式でディスプレイする。次いで、ファージディスプレイさせた変種を、本明細書において開示されるそれらの生物学的活性(例えば結合親和性)についてスクリーニングする。改変のための候補超可変領域部位を特定するために、アラニンスキャニング変異誘発を実施して、抗原結合に顕著に貢献している超可変領域残基を特定することができる。あるいはまたはさらに、抗原-抗体複合体の結晶構造を解析して、抗体とPD-L1ポリペプチドの接触点を特定することも有益である場合がある。このような接触残基および隣接残基は、本明細書において提供される技術による置換の候補である。このような変種を作製した後で、変種のパネルを本明細書において説明されるスクリーニングに供し、1つまたは複数の関連するアッセイ法において優れた特性を有している抗体を、さらに開発するために選択することができる。
抗PD-L1抗体のアミノ酸配列変種をコードする核酸分子は、当技術分野において公知の様々な方法によって調製される。これらの方法には、天然供給源からの単離(天然に存在するアミノ酸配列変種の場合)、または抗PD-L1抗体の前もって調製された変種もしくは非変種型を対象とするオリゴヌクレオチドを介した(もしくは部位特異的)変異誘発、PCR変異誘発、およびカセット変異誘発による調製が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
抗体修飾
抗PD-L1抗体の共有結合的修飾は、本発明の範囲内に含まれる。1つのタイプの共有結合的修飾は、抗PD-L1抗体の標的とされたアミノ酸残基を、抗PD-L1抗体の選択された側鎖またはN末端残基もしくはC末端残基と反応できる誘導体化有機物質と反応させることを含む。二官能性物質による誘導体化は、例えば、抗PD-L1抗体を精製するための方法で使用する非水溶性支持体マトリックスまたは表面に抗PD-L1抗体を架橋結合させるのに有用であり、逆もまた同じである。よく使用される架橋剤には、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4-アジドサリチル酸とのエステル、3,3'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-N-マレイミド-1,8-オクタンのような二官能性マレイミド、およびメチル-3-[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミダートのような物質が含まれる。
他の修飾には、グルタミニル残基およびアスパラギニル残基をそれぞれ対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基にする脱アミド、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジンの側鎖のα-アミノ基のメチル化(T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983))、N末端アミンのアセチル化、およびC末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
本発明の範囲内に含まれる抗PD-L1抗体に対する別のタイプの共有結合的修飾は、抗体またはポリペプチドの先天的グリコシル化パターンを変更することを含む。「先天的グリコシル化パターンを変更すること」は、本明細書の目的において、(潜在的なグリコシル化部位を除去することによって、または化学的手段および/もしくは酵素的手段によってグリコシル化を取り消すことのいずれかによって)ネイティブ配列抗PD-L1抗体中に見出される1つまたは複数の炭水化物部分を欠失させること、ならびに/またはネイティブ配列抗PD-L1抗体中に存在しない1つまたは複数のグリコシル化部位を追加することを意味するものとする。さらに、この語句は、存在する様々な炭水化物部分の性質および比率の変化を含む、ネイティブタンパク質のグリコシル化の定性的変化も含む。
典型的には、抗体および他のポリペプチドのグリコシル化は、N結合型またはO結合型のいずれかである。N結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。Xがプロリン以外の任意のアミノ酸である、トリペプチド配列のアスパラギン-X-セリンおよびアスパラギン-X-トレオニン(は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が生成される。O結合型グリコシル化とは、糖であるN-アセイルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの1つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの結合を意味するが、5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリジンも使用されてよい。
抗PD-L1抗体へのグリコシル化部位の追加は、前述のトリペプチド配列のうちの1つまたは複数を含むようにアミノ酸配列を変更することによって、簡便に達成される(N結合型グリコシル化部位の場合)。変更はまた、元の抗PD-L1抗体の配列に対する、1つまたは複数のセリン残基またはトレオニン残基の付加、またはそれらによる置換によって起こすこともできる(O結合型グリコシル化部位の場合)。任意で、抗PD-L1抗体アミノ酸配列は、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生じるように、抗P-L1抗体をコードするDNAの予め選択された塩基を変異させることによって、DNAレベルでの変化を通して変更してもよい。
抗PD-L1抗体上の炭水化物部分の数を増やす別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的結合または酵素的結合によるものである。このような方法は、当技術分野において、例えば、1987年9月11日に公開されたWO 87/05330およびAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)で説明されている。
抗PD-L1抗体上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的にもしくは酵素的に、またはグリコシル化の標的の役割を果たすアミノ酸残基をコードしているコドンの変異的置換によって、達成することができる。化学的脱グリコシル化技術は、当技術分野において公知であり、例えば、Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)およびEdge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981)によって説明されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138:350 (1987)によって説明されている様々なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを用いることによって実現することができる。
免疫コンジュゲート
本発明の局面には、細胞障害性物質、例えば、化学療法剤、増殖抑制物質、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物に由来する酵素的に活性な毒素、またはその断片)、または放射性同位元素(すなわち放射性コンジュゲート)にコンジュゲートされた(本明細書において説明される)抗体を含む、免疫コンジュゲート(同義的に「抗体-薬物コンジュゲート」または「ADC」と呼ばれる)が含まれる。毒素の非限定的な例には、開示内容の全体が参照により本明細書に組み入れられるWO2014144871および米国特許第8,466,260号で説明されているものが含まれる。本発明の態様による免疫コンジュゲートまたは「ADC」は、下記の式Iのものであってよく、式中、抗体は任意のリンカー(L)を介して1つまたは複数の薬物部分(D)にコンジュゲート(すなわち共有結合的に結合)されている。ADCには、チオMAb薬物コンジュゲート(「TDC」)が含まれてよい。
Ab-(L-D)p I
したがって、抗体は、直接的またはリンカーを介して薬物にコンジュゲートされてよい。式Iにおいて、pは、抗体1つ当たりの薬物部分の平均数であり、例えば、抗体1つ当たり約1個〜約20個の薬物部分、および特定の態様において、抗体1つ当たり1個〜約8個の薬物部分の範囲であることができる。本発明の局面には、抗体1つ当たりの平均薬物添加量が約2〜約5個または約3〜約4個である、式Iの抗体-薬物化合物の混合物を含む組成物が含まれる。
リンカーは、1つまたは複数のリンカー構成要素を含んでよい。例示的なリンカー構成要素には、開示内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,466,260号で説明されているものが含まれる。ストレッチャー単位、スペーサー単位、およびアミノ酸単位を含むリンカー構成要素は、開示内容の全体が参照により本明細書に組み入れられるU.S. 2005/0238649 A1で説明されているもののような当技術分野において公知の方法によって合成されてよい。リンカーのさらなる非限定的な例には、開示内容の全体が参照により本明細書に組み入れられるWO 2015095953で説明されているものが含まれる。
マイタンシノイドを含む免疫コンジュゲート、それを作製する方法、およびそれらの治療的使用が、例えば、開示内容が参照により本明細書に明確に組み入れられるErickson, et al (2006) Cancer Res. 66(8):4426-4433;米国特許第5,208,020号、同第5,416,064号、US 2005/0276812 A1、および欧州特許EP 0 425 235 B1において開示されている。
いくつかの態様において、免疫コンジュゲートは、ドラスタチンまたはドラスタチンのペプチド類似体もしくは誘導体、例えばアウリスタチンにコンジュゲートされた抗体を含む(開示内容の全体が本明細書に組み入れられる米国特許第5,635,483号および同第5,780,588号)。
いくつかの態様において、免疫コンジュゲートは、1つまたは複数のカリケアミシン分子にコンジュゲートされた抗体を含む。カリケアミシンファミリーのコンジュゲートの調製については、開示内容の全体が本明細書に組み入れられる米国特許第5,712,374号、同第5,714,586号、同第5,739,116号、同第5,767,285号、同第5,770,701号、同第5,770,710号、同第5,773,001号、同第5,877,296号(すべてAmerican Cyanamid Companyに付与)を参照されたい。
抗体にコンジュゲートすることができる他の抗腫瘍剤には、BCNU、ストレプトゾシン、ビンクリスチン、および5-フルオロウラシル、米国特許第5,053,394号、同第5,770,710で説明されている、まとめてLL-E33288複合体として公知である作用物質のファミリー、ならびに米国特許第5,877,296号で説明されているエスペラミシンが含まれ、これらの文献の開示内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。
薬学的製剤
本発明の抗PD-L1組成物(例えば、本明細書において説明される抗PD-L1抗体、抗PD-L1抗体の抗原結合断片、またはADC)は、治療しようとする病態にとって適切である任意の経路によって投与されてよい。典型的には、投与は、非経口的に、すなわち、注入、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、くも膜下腔内、および/または硬膜外の投与によって遂行される。
1つの態様において、組成物は、静脈内注入によって投与される。注入によって投与される投薬量は、1回当たり約1μg/m2〜約10,000μg/m2の範囲で、通常1週当たり1回を合計1回、2回、3回、または4回である。いくつかの態様において、投薬量は、約1μg/m2〜約1,000μg/m2、約1μg/m2〜約800μg/m2、約1μg/m2〜約600μg/m2、約1μg/m2〜約400μg/m2、約1μg/m2〜約200μg/m2、または約1μg/m2〜約100μg/m2の範囲である。いくつかの態様において、投薬量は、約10μg/m2〜約500μg/m2、約10μg/m2〜約300μg/m2、または約10μg/m2〜約200μg/m2の範囲である。
いくつかの態様において、用量を、1日1回、1週1回、1日1回より少ない頻度ではあるが1週に複数回、1日1回より少ない頻度ではあるが1ヶ月に複数回、1週1回より少ない頻度ではあるが1ヶ月に複数回、1ヶ月に1回、1ヶ月おきに1回、3ヶ月おきに1回、6ヶ月おきに1回、毎年1回、または間欠的に投与して、疾患の症状を軽減または緩和する。投与は、治療される腫瘍またはがんの症状の寛解まで、開示された間隔のいずれかで続いてよい。投与は、症状の寛解または軽減が実現した後も、そのような寛解または軽減がそのような継続投与によって延長される場合、続いてよい。
1つの局面において、本発明は、本発明の少なくとも1つの抗PD-L1組成物を含む薬学的製剤を提供する。いくつかの態様において、薬学的製剤は、(1)本発明の抗PD-L1組成物および(2)薬学的に許容される担体を含む。
本発明に従って使用される抗PD-L1抗体を含む治療用製剤は、望ましい純度を有している抗体を任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤と混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))、凍結乾燥製剤または水性液剤の形態で保存用に調製される。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される投薬量および濃度において受取人にとって非毒性であり、アセタート、Tris、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール;メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レソルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾールなど);低分子量(約10残基未満の)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物;EDTAのようなキレート剤;トレハロースおよび塩化ナトリウムなどの等張化剤;スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖;ポリソルベートのような界面活性剤;ナトリウムのような塩を形成する対イオン;金属複合体(例えばZn-タンパク質複合体);ならびに/またはTWEEN(登録商標)、PLURONICS(登録商標)、もしくはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン系界面活性剤が含まれる。通常、インビボ投与のために使用される薬学的製剤は、滅菌済みである。これは、滅菌ろ過膜に通すろ過によって、容易に達成される。
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メチルメタシラート)マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル)中に、またはマクロエマルジョン中に閉じ込めてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)で開示されている。
徐放性製剤が調製されてよい。徐放性製剤の適切な例には、抗PD-L1組成物を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、これらのマトリックスは、造形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態で存在する。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリラート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸およびγエチル-L-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT(登録商標)(乳酸-グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用マイクロスフェア)、ならびにポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸-グリコール酸などのポリマーは、分子を100日より長く放出することを可能にするのに対し、ある種のヒドロゲルは、より短い期間、タンパク質を放出する。カプセルに封入された免疫グロブリンが体内に長期間残る場合、37℃で水分にさらされた結果として、それらが変性または凝集して、その結果、生物活性を失い、免疫原性がおそらく変わる場合がある。関与するメカニズムに応じて、安定化するための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集メカニズムがチオ-ジスルフィド交換による分子間S-S結合形成であることが発見されている場合、安定化は、スルフヒドリル残基を改変すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、含水量を調節すること、適切な添加剤を使用すること、および特殊なポリマーマトリックス組成物を開発することによって、実現することができる。
抗PD-L1組成物は、標的細胞/組織に送達するための任意の適切な形態で製剤化されてよい。例えば、抗体は、免疫リポソームとして製剤化されてよい。「リポソーム」とは、哺乳動物への薬物の送達に有用である、様々なタイプの脂質、リン脂質、および/または界面活性剤から構成される小型の小胞である。一般に、リポソームの構成要素は、生体膜の脂質配置に似た二重層構成で並んでいる。抗体を含むリポソームは、例えばEpstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980);米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号;ならびに1997年10月23日に公開されたWO97/38731で説明されているような、当技術分野において公知の方法によって調製される。循環時間を長くされたリポソームが、米国特許第5,013,556号で開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法によって作製することができる。所定の孔径のフィルターを通してリポソームを押し出して、所望の直径を有しているリポソームを得る。Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)で説明されているように、ジスルフィド交換反応を介して、本発明の抗体のFab'断片をリポソームにコンジュゲートすることができる。任意で、化学療法剤がリポソーム内に含まれる。Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989)を参照されたい。
インビボ投与のために使用される製剤は、滅菌済みでなければならない。これは、滅菌ろ過膜に通すろ過によって、容易に達成される。
製造品およびキット
本発明の局面には、PD-L1によって媒介される疾患または障害、例えばPD-L1発現がんの治療、予防、および/または診断に有用な材料を含む製造品が含まれる。製造品は、容器、および容器の上または容器に付随するラベルまたは添付文書を含む。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど様々な材料から形成されてよい。容器は、疾患または障害を治療、予防、および/または診断するために有効である組成物を収容し、無菌取出口を有していてよい(例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能な栓を有している静注液バッグまたはバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも1種類の活性物質は、本発明の抗PD-L1組成物である。ラベルまたは添付文書は、その組成物が、疾患または障害を治療するのに使用されることを示す。ラベルまたは添付文書は、抗体組成物を患者に投与するための指示をさらに含む。さらに、製造品は、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、またはデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第2の容器をさらに含んでよい。これは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料もさらに含んでよい。
様々な目的のために、例えば、PD-L1発現細胞死滅アッセイ法、または細胞からのPD-L1ポリペプチドの精製もしくは免疫沈降のために有用であるキットもまた、提供される。PD-L1ポリペプチドを単離および精製するために、キットは、ビーズ(例えばセファロースビーズ)に結合された抗PD-L1抗体を含むことができる。インビトロで、例えばELISAまたはウェスタンブロットでPD-L1ポリペプチドを検出および定量するための抗体を含むキットを提供することができる。製造品と同様に、キットは、容器、および容器の上または容器に付随するラベルまたは添付文書を含む。容器は、本発明の少なくとも1つの抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を収容する。例えば、希釈剤、緩衝剤、および/または対照抗体を含む追加の容器が含まれてよい。ラベルまたは添付文書は、組成物の説明、ならびに意図されるインビトロ用途または検出用途のための指示を提供してよい。
使用方法
本発明の局面には、限定されるわけではないが様々ながんおよび免疫疾患の治療を含む、PD-L1によって(例えばPD-1とPD-L1の相互作用によって)少なくとも部分的に媒介される疾患または病態の治療、予防、および/または診断において、本明細書において説明されるように、1種類または複数種類の抗PD-L1組成物(例えば、抗PD-L1抗体、抗PD-L1抗体の抗原結合断片、またはADC)を使用する方法が含まれる。非限定的な使用例を、下記にさらに詳細に説明する。
A 治療方法
本発明の抗PD-L1組成物は、例えば、インビトロ、エクスビボ、およびインビボの治療方法で使用され得る。1つの局面において、本発明は、PD-L1タンパク質と1つまたは複数の受容体またはリガンド(例えばPD-1タンパク質)との相互作用を阻害するための方法を提供する。1つの局面において、本発明は、組成物中の抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片がPD-L1に結合するのを許容する条件下で細胞を抗PD-L1組成物と接触させる工程を含む、インビボまたはインビトロのいずれかで細胞の成長または増殖を抑制するための方法を提供する。「細胞の成長または増殖を抑制すること」とは、細胞の成長または増殖を少なくとも約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、または最大で100％、減少させることを意味し、細胞死を誘導することを含む。特定の態様において、細胞は腫瘍細胞である。本発明の態様に従う抗PD-L1組成物は、(i)PD-L1タンパク質とPD-L1タンパク質が結合できる受容体もしくはリガンド(例えばPD-1タンパク質)との相互作用を阻害するか;(ii)インビボで腫瘍転移を抑制するか;(iii)インビボで腫瘍増殖を抑制するか;(iv)インビボで腫瘍サイズを小さくするか;(v)インビボでPD-L1発現腫瘍細胞に対して細胞障害活性を示すか;または(vi)インビボでPD-L1発現腫瘍細胞に対して細胞増殖抑制活性を示すことができる。いくつかの局面において、抗PD-L1組成物は、PD-L1タンパク質に結合し、それによってPD-1タンパク質の1つまたは複数の機能を阻害する(例えば、PD-1タンパク質の1つまたは複数の免疫抑制機能を阻害する)ことができる。したがって、いくつかの局面において、有用な対象治療方法は、PD-L1タンパク質を本明細書において説明される抗PD-L1抗体または抗原結合断片と接触させる工程であって、それによって、PD-1タンパク質の1つまたは複数の機能(例えば、1つまたは複数の免疫抑制機能)を阻害する、工程を含む。
本発明の局面には、PD- L1タンパク質を本明細書において説明される抗PD-L1抗体と接触させることによってPD-1タンパク質とPD-L1タンパク質の相互作用を阻害する方法が含まれる。いくつかの態様において、この方法は、治療法を必要としている対象に有効量の抗PD-L1抗体を投与することによってインビボで実施されて、対象におけるPD-1タンパク質とPD-L1タンパク質の相互作用を阻害する。
1つの局面において、本発明の抗PD-L1組成物は、がんのような細胞増殖性障害を治療または予防するのに使用される。がんのタイプの例には、非限定的に、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、胆道がん、乳がん(例えば、三重陰性乳がん、ホルモン受容体陰性乳がん)、子宮頸がん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、鼻咽腔がん、ホジキンリンパ腫、肺がん(例えば非小細胞肺がん)、髄様甲状腺がん、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、腎がん、卵巣がん、膵がん、神経膠腫、黒色腫、肝臓がん、前立腺がん、膀胱がん、黒色腫、および膠芽腫が含まれる。
いくつかの局面において、がんは上皮がんである。対象抗PD-L1組成物を用いる治療に適している上皮がんには、非限定的に、非小細胞肺がん、膀胱がん、腎がん、肝臓がん、結腸直腸がん、卵巣がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、甲状腺がん、乳がん(例えば、ホルモン受容体陰性乳がんまたは三重陰性乳がん)、および鼻咽腔がんが含まれる。
いくつかの局面において、がんは血液がんである。対象抗PD-L1組成物を用いる治療に適している血液がんには、非限定的に、白血病、リンパ腫、骨髄腫、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫が含まれる。
いくつかの局面において、がんは、黒色腫または膠芽腫である。
1つの好ましい態様において、がんは黒色腫である。1つの好ましい態様において、がんは腎がんである。1つの好ましい態様において、がんは膀胱がんである。1つの好ましい態様において、がんは肺がんである。1つの好ましい態様において、がんは非小細胞肺がんである。1つの好ましい態様において、がんは小細胞肺がんである。
1つの局面において、本発明は、有効量の抗PD-L1組成物を個体に投与する工程を含む、細胞増殖性障害を治療するための方法を提供する。いくつかの態様において、抗PD-L1組成物は、獣医学的目的のために、またはヒト疾患の動物モデルとして、抗体が交差反応するPD-L1を発現する非ヒト哺乳動物(例えば、霊長類、ブタ、ラット、またはマウス)に投与することができる。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗PD-L1組成物の治療的有効性を評価する(例えば、投薬量および投与の経時変化を調査する)ために有用な場合がある。
本発明の抗PD-L1組成物(ならびに任意の追加の治療物質またはアジュバント)は、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与、および鼻腔内投与、ならびに局所的治療が望ましい場合は病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与が含まれる。さらに、抗PD-L1組成物は、特に、用量を段階的に減少させた組成物を用いて、パルス注入によって適切に投与することもできる。投薬は、投与が短時間であるかまたは長期的であるかにある程度応じて、任意の適切な経路によって、例えば、静脈内注射または皮下注射などの注射によって行うことができる。
一般に、本発明の態様に従う抗PD-L1組成物は、優良医療規範と一致する様式で製剤化され、1回分ずつに分けられ、投与される。この状況で考慮すべき因子には、治療される個々の障害、治療される個々の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、作用物質の送達部位、投与方法、投与スケジューリング、および医療担当者に公知である他の因子が含まれる。
スクリーニング方法
本発明の局面には、試料をPD-L1ポリペプチドに結合する抗体と接触させる工程、および試料においてPD-L1ポリペプチドへのその抗体の結合を判定する工程であって、そのような結合の存在によって試料においてPD-L1ポリペプチドの存在が示される、工程を含む、PD-L1ポリペプチドを含むと推測される試料においてPD-L1ポリペプチドの存在を判定する方法が含まれる。任意で、試料は、PD-L1ポリペプチドを発現すると推測される細胞(例えばがん細胞)も含んでよい。この方法で使用される抗体は、任意で、検出可能に標識されるか、または固体支持体に結合されるなどしてよい。
本発明の別の態様は、(a)哺乳動物から得られた細胞を含む試験試料を、PD-L1ポリペプチドに結合する抗体と接触させる工程、および(b)抗体と試験試料中のPD-L1ポリペプチドとの複合体の形成を検出する工程であって、複合体の形成によって哺乳動物においてPD-L1を発現する腫瘍の存在が示される、工程を含む、哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法を対象としている。任意で、抗体は、検出可能に標識されるか、もしくは固体支持体に結合されるなどし、かつ/または試験試料は、がん性腫瘍を有していると推測される個体から得られる。抗体検出は、本明細書において説明される様々な技術、例えば、IHCおよびPET画像化によって実現することができる。
活性アッセイ法
本発明の態様に従う抗PD-L1組成物は、当技術分野において公知の様々なアッセイ法で利用することができる。1つの局面において、抗PD-L1組成物は、生物活性アッセイ法で使用することができる。生物活性アッセイ法は、例えば、抗PD-L1組成物が細胞の成長もしくは増殖を抑制する能力(例えば「細胞死滅」活性)またはプログラム細胞死(アポトーシス)を含む細胞死を誘導する能力を測定することができる。
特定の態様において、抗PD-L1組成物は、細胞の成長または増殖の抑制を測定するためのインビトロアッセイ法で使用することができる。細胞の成長または増殖の抑制についてのアッセイ法は、当技術分野において周知である。本明細書において説明される「細胞死滅」アッセイ法を例とする、細胞増殖についてのある種のアッセイ法は、細胞の生存能を測定する。1つのこのようなアッセイ法は、Promega(Madison, WI)から市販されているCellTiter-Glo(商標)発光式細胞生存度アッセイ法である。このアッセイ法は、代謝的に活性菜細胞の指標である、存在するATPの定量に基づいて、培養中の生細胞の数を測定する。Crouch et al (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88、米国特許第6602677号を参照されたい。このアッセイ法は、96ウェル形式または384ウェル形式で実施できるため、自動化されたハイスループットなスクリーニング(HTS)に適用できる。Cree et al (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404を参照されたい。このアッセイ法の手順は、培養細胞に単一の試薬(CellTiter-Glo(登録商標)試薬)を直接添加することを含む。これにより、細胞が溶解し、ルシフェラーゼ反応によって生じる発光シグナルが生成する。発光シグナルは、培養状態で存在する生細胞の数に正比例する、存在するATPの量に比例する。データは、ルミノメーターまたはCCDカメラ画像化装置によって記録することができる。産出発光量は、相対発光量(RLU)として表される。
細胞増殖についての別のアッセイ法は、「MTT」アッセイ法、すなわち、ミトコンドリアの還元酵素による3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミドのホルマザンへの酸化を測定する比色アッセイ法である。CellTiter-Glo(商標)アッセイ法と同様に、このアッセイ法は、細胞培養物中に存在する代謝的に活性な細胞の数を示す。例えば、Mosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65:55-63およびZhang et al. (2005) Cancer Res. 65:3877-3882を参照されたい。
1つの局面において、抗PD-L1組成物は、インビトロで細胞死を誘導する能力を測定するためのアッセイ法で利用することができる。細胞死の誘導についてのアッセイ法は、当技術分野において周知である。いくつかの態様において、このようなアッセイ法は、例えば、ヨウ化プロピジウム(PI)、トリパンブルー(Moore et al. (1995) Cytotechnology, 17:1-11を参照されたい)、または7AADの取込みによって示される、膜の完全性の喪失を測定する。例示的なPI取込みアッセイ法において、細胞は、10％熱不活化FBS(Hyclone)および2mM L-グルタミンを添加したダルベッコ改変イーグル培地(D-MEM):ハムF-12(50:50)中で培養される。したがって、このアッセイ法は、補体および免疫エフェクター細胞の非存在下で実施される。100×20mmのシャーレにシャーレ1枚につき3×106個の密度で細胞を播種し、一晩付着させる。培地を除去し、新鮮な培地のみ、または様々な濃度の抗PD-L1組成物を含む培地に交換する。これらの細胞を3日間の期間、インキュベートする。処理後、単層をPBSで洗浄し、トリプシン処理によって剥がす。次いで、1200rpm、4℃で5分間、細胞を遠心分離し、沈殿物を3mlの冷たいCa2+結合緩衝液(10mM Hepes、pH7.4、140mM NaCl、2.5mM CaCl2)中に再懸濁し、細胞凝集塊を除去するために35mmストレーナーキャップ付き12×75mmチューブ中に等分する(チューブ1本につき1ml、処理群1つにつき3本のチューブ)。次いで、チューブにPIを加える(10μg/ml)。試料をFACSCAN(商標)フローサイトメーターおよびFACSCONVERT(商標)CellQuestソフトウェア(Becton Dickinson)を用いて解析する。PI取込みに基づいて測定した場合に統計学的に有意なレベルの細胞死を誘導する抗PD-L1組成物が、このようにして同定される。
1つの局面において、抗PD-L1組成物を、インビトロでアポトーシス(プログラム細胞死)を誘導する能力について試験することができる。アポトーシスを誘導する抗体についての例示的なアッセイ法は、アネキシン結合アッセイ法である。例示的なアネキシン結合アッセイ法では、上記のパラグラフで論じたように、細胞をシャーレにおいて培養および播種する。培地を除去し、新鮮な培地のみ、または0.001〜10μg/mlの抗体を含む培地に交換する。3日間のインキュベーション期間の後、単層をPBSで洗浄し、トリプシン処理によって剥がす。次いで、上記のパラグラフで論じたように、細胞を遠心分離し、Ca2+結合緩衝液中に再懸濁し、チューブ中に等分する。次いで、標識されたアネキシン(例えばアネキシンV-FITC)をチューブに加える(1μg/ml)。試料をFACSCAN(商標)フローサイトメーターおよびFACSCONVERT(商標)CellQuestソフトウェア(BD Biosciences)を用いて解析する。対照と比べて統計学的に有意なレベルのアネキシン結合を誘導する抗体が、このようにして同定される。アポトーシスを誘導する抗体についての別の例示的なアッセイ法は、ゲノムDNAのヌクレオソーム間分解を検出するためのヒストンDNA ELISA比色アッセイ法である。このようなアッセイ法は、例えば細胞死検出ELISAキット(Roche, Palo Alto, CA)を用いて実施することができる。
上記のインビトロアッセイ法のいずれかで使用するための細胞には、PD-L1を天然に発現するか、またはPD-L1を発現するように操作された、細胞または細胞株が含まれる。このような細胞には、同じ組織に由来する正常細胞と比べてPD-L1を発現または過剰発現する腫瘍細胞が含まれる。このような細胞にはまた、PD-L1を発現する細胞株(腫瘍細胞株を含む)、および通常はPD-L1を発現しないがPD-L1をコードする核酸をトランスフェクトされている細胞株が含まれる。
1つの局面において、抗PD-L1組成物は、インビボで細胞の成長または増殖を抑制する能力について試験される。特定の態様において、抗PD-L1組成物は、インビボで腫瘍増殖を抑制する能力について試験される。異種移植モデルのようなインビボモデル系が、このような試験のために使用され得る。例示的な異種移植系では、ヒト腫瘍細胞が、適切に免疫低下させた非ヒト動物、例えばSCIDマウス中に導入される。本発明の抗PD-L1組成物は、動物に投与される。抗PD-L1組成物の、腫瘍増殖を抑制するか、または減少させる能力が、測定される。上記の異種移植系の特定の態様において、ヒト腫瘍細胞は、ヒト患者に由来する腫瘍細胞である。特定の態様において、ヒト腫瘍細胞は、乳腺脂肪パッドのような適切な部位への皮下注射または移植によって、適切に免疫低下させた非ヒト動物中に導入される。
結合アッセイ法および他のアッセイ法
本発明の局面には、PD-L1タンパク質を本明細書において説明される抗PD-L1抗体と接触させることによってPD-1タンパク質とPD-L1タンパク質の相互作用を阻害する方法が含まれる。いくつかの態様において、この方法は、インビトロで実施される。
1つの局面において、抗PD-L1抗体は、その抗原結合活性について試験される。例えば、特定の態様において、抗PD-L1抗体は、細胞、例えば腫瘍細胞の表面で発現されるPD-L1に結合する能力について試験される。FACSアッセイ法が、このような試験のために使用され得る。
1つの局面において、競合アッセイ法を用いて、本明細書において説明されるモノクローナル抗体とPD-L1への結合に関して競合する1つまたは複数の抗体(例えば、1つまたは複数のモノクローナル抗体)を同定することができる。特定の態様において、このような競合抗体は、本明細書において説明されるモノクローナル抗体が結合する同じエピトープ(例えば、直線状エピトープまたは立体構造的エピトープ)に結合する。例示的な競合アッセイ法には、Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)で提供されるもののような慣用のアッセイ法が含まれるが、それらに限定されるわけではない。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)で提供されている。2つの抗体は、それぞれが他方の結合を50％またはそれより多く阻止する場合、同じエピトープに結合すると表現される。
例示的な競合アッセイ法では、固定されたPD-L1が、PD-L1に結合する第1の標識抗体(例えば本明細書において説明されるモノクローナル抗体)およびPD-L1への結合に関して第1の抗体と競合する能力を試験される第2の非標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第2の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してよい。対照として、固定されたPD-L1は、第1の標識抗体を含むが第2の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。PD-L1への第1の抗体の結合を許容する条件下でのインキュベーションの後、余分な未結合抗体を除去し、固定されたPD-L1に結合した標識の量を測定する。固定されたPD-L1に結合した標識の量が、対照試料と比べて試験試料において実質的に減少している場合、このことから、第2の抗体がPD-L1への結合に関して第1の抗体と競合していることが示される。特定の態様において、固定されたPD-L1は、細胞の表面に、またはその表面でPD-L1を発現する細胞から得られた膜調製物中に存在する。
1つの局面において、限定されるわけではないが、N末端配列決定、アミノ酸解析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー、およびパパイン消化を含む一連のアッセイ法によって、精製した抗PD-L1抗体の特徴をさらに明らかにすることができる。
以下の実施例は、例示を目的として提供されるにすぎず、本発明の範囲を限定することを決して意図しない。いくつかの態様を本開示において提供してきたが、開示される系および方法は、本開示の精神からも範囲からも逸脱することなく、他の多くの個別の形態で具体化され得ることを理解すべきである。本実施例は、例示的であり制限的ではないとみなされるべきであり、その意図は、本明細書において与えられる詳細に限定されるべきではない。変化、代用、および変更の様々な例は、当業者によって確認可能であり、本明細書において開示される精神および範囲から逸脱することなく実施され得る。
本明細書の全体を通して挙げられる参考文献はすべて、参照により明確に本明細書に組み入れられる。
実施例1: マウスハイブリドーマの作製およびスクリーニング
1.1 免疫化のプロトコールおよびスケジュール
(i)HISタグ付きのヒトPD-L1(Sino Bio、カタログ番号10084-H084)および(ii)HISタグ付きのカニクイザルPD-L1(Sino Bio、カタログ番号90251-C08H)の細胞外部分を含む組換え融合タンパクを、免疫化プロトコールにおいて抗原として利用した。PD-L1に対する完全なヒトモノクローナル抗体を作製するために、3つの異なる系統のマウスを免疫化しスクリーニングした。Balb/C(3)、C57/Black6(3)、およびスイスウェブスター(3)を、タンパク質を交互に用いて(ヒトPD-L1およびカニクイザルPD-L1)、0日目、7日目、14日目、21日目、28日目、および35日目に6回免疫化した。1回目の免疫化は、50ugのタンパク質を投与し、その後の免疫化は25ugを投与した。抗原の皮下投与は、MagicMouseアジュバントを用いて、左および右の鼠径リンパ節、左および右の上腕リンパ節、ならびに左および右の軸リンパ節の近くに50uL/部位の量で行った。9匹のマウスすべてから、1回目の免疫化の前の0日目(事前採血)および42日目にに血液を採取して、抗体応答に関する血清力価を評価した。血清を(後述の)ELISAによってスクリーニングし、十分な力価の抗ヒト-PD-L1免疫グロブリンを有しているマウスを融合用に使用した。屠殺および膵臓切除の3日前に、静脈内経由でマウスに組換えヒトPD-L1を追加免疫した。
1.2 PD-L1に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
スイスウェブスターマウスから単離したマウス脾細胞を、標準的なプロトコールに従って、マウス骨髄腫細胞株と融合させた。次いで、結果として生じるハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングした。
免疫化スイスウェブスターマウス由来の脾細胞の単細胞懸濁液を、PEGを用いてSp2/0細胞、すなわち非分泌性マウス骨髄腫細胞株に融合させた。滅菌済み平底96ウェルマイクロタイタープレートに約1×105個/ウェルの密度で細胞を播種し、続いて、完全DMEM-F12、10％FBS、グルタマックス、ピルビン酸ナトリウム、HEPES、非必須アミノ酸、およびPenn/Strepにおいて1×HATを用いて2週間選択した。2週間後、HAT選択をHTで置き換えた培地中で細胞を培養した。次いで、個々のウェルを、(後述の)ELISAにより、抗ヒトPD-L1モノクローナルIgG抗体およびIgM抗体についてスクリーニングした。抗体を分泌するハイブリドーマを再度播種し、再びスクリーニングして、それらが抗ヒトPD-L1 IgGまたはIgMについて依然として陽性であるかを確認した。次いで、抗ヒトPD-L1抗体を限界希釈によってサブクローニングした。安定なクローンをHT培地から引き離してDMEM-F12+10％FBS+グルタマックス+Pen Strepに移し、培養して、さらに特徴決定するために少量の抗体を産生させた。ハイブリドーマをまた、10％ DMSO 90％FBS中で凍結した。
1.3 上清中のマウスIgG特異的ヒトPD-L1抗体の検出
間接的な捕捉ELISA:
最初のスクリーニングにおいて、抗体を産生するマウス血清またはハイブリドーマの検出を、間接的ELISAプロトコールおよび血清またはハイブリドーマ上清の一点希釈物を用いて実施した。その後のスクリーニングは、マウス血清またはイブリドーマ上清の希釈物を用いて実施した。ELISAの形式は、模式的な図1に示したとおりである。
96ウェルの高度結合タンパク質プレートを、4℃で一晩、50uLのPBS中1ug/mLヤギ抗ヒトIgG Fc(Southern Biotech、カタログ番号2014-01)でコーティングした。これらのプレートをPBS 0.05％ Tween20で3回洗浄し、次いで、ペーパータオルに数回軽くたたきつけて乾かした。室温で1時間、200uLの1％ミルクでプレートをブロッキングした。これらの洗浄および乾燥段階を上記のように繰り返し、プレートを室温で1時間、1％ミルクに溶かした50uLの200ng/mL組換えヒトB7-H1(PD-L1)Fcキメラタンパク質(R&D、カタログ番号156-87-1000)と共にインキュベートした。特異性についてスクリーニングするために、組換えカニクイザルPD-L1 Fcキメラ(Sino Biological、カタログ番号90251-C02H)、組換えマウスPD-L1 Fcキメラ(Sino Biologicals、カタログ番号50010-M02H)、または組換えヒトPD-L2 Fcキメラタンパク質(Sino Biological、カタログ番号10292-H02H)をヒトPD-L1 Fcキメラの代わりに使用した。上記のようにプレートを洗浄し乾かした後に、陽性対照抗体(マウス抗ヒトPD-L1、29E.2A3、BioLegend、カタログ番号329702)およびそのアイソタイプ対照(マウスIgG2b k、BioLegend、カタログ番号400302)を3ug/mLから始めて0.1ng/mLまで、1％ミルク中で段階的に3倍希釈し、用量設定されたこれらの抗体50uLを全プレートの各ウェルに添加した。ハイブリドーマ上清は、それぞれ、1％ミルク中で1:3希釈した。これらの上清50μLを各ウェルに添加した。これらのプレートを室温で1時間インキュベートした。これらを上記のように洗浄し乾かし、次いで、室温で1時間、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)とコンジュゲートされた1:5000ヤギ抗マウスIgG Fc(Jackson Immuno Research、カタログ番号115-035-071)50uLと共にインキュベートした。洗浄および乾燥段階を繰り返した後、TMB基質(BD OptiIEIA、カタログ番号555214)50uLを用いて20〜30分間、プレートを発色させた。50uLの2N H2SO4を用いて反応を停止し、Spectramax Gemini分光光度計を用いて450nmでの吸光度を読み取った。段階希釈したハイブリドーマ上清についてのデータ例を図3のパネルAに示している。
1.4 ヒトPD-L1発現細胞への抗体結合の検出
フローサイトメトリーに基づく結合反応性:
細胞表面でヒトPD-L1を発現するGranta細胞(DSMZ ACC番号342)またはPromega 187103細胞(Promega、カタログ番号187106)などの細胞株を用いて、図2に示すようにフローサイトメトリーによって、ハイブリドーマ上清中の抗ヒトPD-L1モノクローナル抗体の反応性および特異性を明らかにした。
染色の前日に、細胞に新鮮な培地を補給した。染色する日に、HyQtase(GE Health & Life Sciences、カタログ番号SV30030.01)を用いて細胞を取り外した。培地をすべて吸引除去した後、カルシウムもマグネシウムも含まない10mLのPBSで細胞をすすいだ。PBSを吸引除去した後、37℃で5分間、5mlのHyQtaseと共にこれらの細胞をインキュベートした。次いで、フラスコを軽くたたきつけることによって細胞を取り外して、単細胞懸濁液を生成した。等量の培地を添加することによってHyQtaseの効力を消し、細胞計数器(BioRad TC20)においてトリパンブルー排除を用いて、生細胞数を測定した。細胞の濃度は、60μLのFACS 2％FBS緩衝液につき細胞1.5×10e4個に調整した。
圧縮染色[3(ハイブリドーマ上清プレート)対1(PD-L1発現細胞プレート)]
FACS 2％FBS緩衝液(BD Pharmingen、カタログ番号554656)60uLに溶かした1.5×104個/ウェルの細胞を「v」底96ウェルプレートに添加した。12ウェルマルチチャンネルピペットを用いて、ハイブリドーマプレートの各ウェルから得られる上清10uLを、それらのウェルに対応する細胞に添加した。3つのハイブリドーマ上清プレートを用いてこれを繰り返して、3つのハイブリドーマウェルから得られる上清を、細胞を含む各ウェル中にまとめ合わせた。陽性対照29E.2A3(BioLegend、カタログ番号329702)およびIgG2b kアイソタイプ対照(BioLegend、カタログ番号400302)をこれらの細胞に1ug/mLの濃度で添加し、対照ウェルと呼んだ。これらのプレートを4℃で30分間インキュベートした。細胞をFACS 2％FBS緩衝液150μLで洗浄した後、プレートを1200rpmで5分間、遠心分離し(Sorvall Legend XIR遠心分離機)、細胞ペレットを乱さずに上清を穏やかに吸引した。これらの細胞をAF647ヤギ抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch、カタログ番号115-605-164)と共に4℃で30分間インキュベートすることによって、抗体結合を検出した。上記のように洗浄工程を繰り返し、1:100の7_AAD(BD Pharm、カタログ番号68981E)を含む60μLのFACS 2％FBS中に細胞を再懸濁した。これらの試料の1000個の事象を、FACSCalibur(Becton Dickinson)を用いて各試料について獲得し、FLOJO(登録商標)フローサイトメトリープラットフォームで解析を行った。上清において検出された結合を、陽性対照およびアイソタイプ対照と比較し、陽性ウェルに印を付けた。
FACS陽性ハイブリドーマウェルのデコンボリューション:
圧縮プレート/ウェルから得られた陽性ウェルのそれぞれを個々のプレート/ウェルに復元し、3つの圧縮プレートのそれぞれの個々のウェルから得られるハイブリドーマ上清を、上記のプロトコールに従ってPromega 187103細胞に対する陽性染色について個別に試験した。結合をアイソタイプ対照と比較して、抗PD-L1抗体を産生するハイブリドーマを同定し、PD-L1発現細胞に対して高レベルの結合を示しているELISA陽性ウェルを次のスクリーニングに進めた。ハイブリドーマ上清のFACSスクリーニングについてのデータ例を図3のパネルBに示している。
間接的捕捉ELISA:FACS陽性上清の滴定
ハイブリドーマの1回目のスクリーニングから得られる陽性上清の滴定を、前述の間接的ELISAプロトコールを用いて実施し、その際、上清はウェルに添加する前に1％ミルク中で段階的に3倍希釈した。選択されたハイブリドーマ上清中のマウス抗体の濃度を、濃度が公知である市販の29E.2A3抗体を用いる間接的ELISAによって推定した。次いで、PD1/PD-L1遮断アッセイ法において陽性上清の機能性について試験した。
実施例2: PD-1/PD-L1遮断についての機能アッセイ法におけるFACSおよびELISA陽性ハイブリドーマ上清の試験
前述のスクリーニングアッセイ法は、プレート上にコーティングされた抗原または細胞表面の抗原としてのPD-L1に結合できるクローンを同定することができるが、本発明者らが開発したい抗体は、PD-1とPD-L1の相互作用を効果的に阻止することが要求される。上記で同定されたFACSおよびELISA陽性抗体がこの相互作用を阻止する能力を試験するために、本発明者らは、発光に基づく読取りを用いる市販のPD-1/PD-L1遮断アッセイ法(Promega)を使用した(図4)。
簡単に説明すると、PD-L1を表面で発現する凍結したCHO細胞(Promega CS187103)を37℃で解凍し、10％ウシ胎児血清(Invitrogen)を添加したDMEM中に再懸濁した。細胞7,500個を含む培地を37℃および5％CO2で16時間、384ウェルプレートのウェル中に添加した。培地を、抗体を含む10uLのRPMI+2％FBSに交換した。操作されたジャーカット細胞(Promega CS187105)10,000個を含むさらに10uLの培地をウェルに添加し、37℃および5％CO2で5時間インキュベートした。細胞を、ルシフェリンを含む20μLの溶解緩衝液(Promega、Cell Titer Glo)と混合して、ルシフェラーゼレポーター活性を測定した。EnVisionプレートリーダーによって光出力を測定した。Prismソフトウェアを用いて4パラメーター曲線当てはめによって、EC50を明らかにした。
遮断アッセイ法でのハイブリドーマ上清のスクリーニングから得られるデータ例を図5のパネルAに示している。ハイブリドーマスクリーニングの戦略および結果を図5のパネルBに要約している。全体として、約3000個のハイブリドーマ上清をスクリーニングし、121個のELISA陽性クローンを得た。これらのうちで、9個がFACS陽性クローンであり、1個だけ(3C5)が、バイオアッセイ法において機能的活性を示した。このクローンをさらにサブクローニングし、サブクローン3C5-2G12のうちの1個を用いて、後述するようにVH配列およびVL配列を同定するために次世代シーケンシングを実施した。
実施例3: 次世代シーケンシング(NGS)プロトコールを用いるハイブリドーマ配列決定
典型的なハイブリドーマでは、複数の重鎖および軽鎖が発現され、これらのうちの1つまたは複数は、機能アッセイ法で認められる活性に関与している配列であり得る。次世代シーケンシング(NGS)法を適用して、ELISA、FACS、および遮断アッセイ法で陽性であると確認されたハイブリドーマに由来する配列を同定した。簡単に説明すると、RNAをハイブリドーマ(1×106個の細胞)から抽出し、RACE-PCRプロトコールを用いて一本鎖DNAを生じさせた。重鎖および軽鎖の両方を増幅するために、マウスIgG領域およびマウスIgK領域に対する縮重プライマーを使用した。これらのプライマーは、FR1からFR4までの可変領域を包含するように設計した。試料にバーコードを付け、MiSeq NGSシークエンサー(Illumina)を用いてペアエンド法で配列決定した。得られたFastqファイルは、Panoply Bio(Carlsbad、CA)で特別仕様のソフトウェアを用いて解析された。これらの配列を、共通の部分があるペアエンドについて位置合わせし、マウスフレームワーク領域を用いてCDRを同定した。各配列の頻度に基づいてデータを集めて整理した。いくつかの切断が、この配列アセンブリ過程で発生する場合があり、したがって、クローニングおよびさらなる試験のために選択される配列は、以下の基準に基づいた。
(1)3つのCDRすべてが存在すること。
(2)配列のファミリーに複数回出現すること。
(3)CDRの頻度が最も高いこと。
(4)N末端に明らかな切断がないこと。
ハイブリドーマでは、最も数の多いクローンが、最も頻度の高い配列を有している可能性が高い。通常、標的にちょうど同じように、またはより良くもしくはより悪く結合する他のクローンが存在し得るが、それらは、それほど高発現されることができないか、または培養状態で同じようにうまく増殖することができない。軽鎖から得られた配列のファミリーにおいて、これらの判定基準に基づくと、1つの配列が他のすべての配列よりも優勢であった。図6のパネルAに示すように、1つの配列が24回出現した。これを下記に再現する。
3C5-2G12軽鎖配列:
Figure 0006979971
しかし、重鎖の配列決定から得られたNGSデータは、図6のパネルBに示すように、出現頻度が高い複数の配列を示した。したがって、追加のフィルターを用いて、どの配列が、このハイブリドーマによって産生される活性抗体をコードする可能性を最も高く示したかを判定した。例えば、このセット中に最も高い頻度で存在する配列は47回出現したが、大規模なN末端切断が起こっておりCDR1を欠いていたため、考慮に入れなかった。その代わりに、3つのCDRすべてを有しておりN末端での切断が起こっていない最も高頻度の配列を試験用に選択した。この配列は、この配列セット中で19回出現した。この配列は、3つのCDRすべてを含み、完全な状態のN末端を有していると考えられる(生殖系列と同様)。
3C5-2G12重鎖配列:
Figure 0006979971
実施例4: 3C5-2G12 IgGおよび3C5-2G12 IgMの作製および試験
1 設計された変異を有しているDNA構築物の作製
DNA構築物の合成。各々の発現ベクターにサブクローニングするために適合する制限部位を両端に有している、設計された変異を有しているDNA構築物はすべて、商業的販売業者(例えばGenescript、Lake Pharma)によって合成された。
発現ベクターの構築。合成されたDNA構築物を、Tris-EDTA緩衝液中に1μg/mlの濃度で再懸濁した。DNA(1μg)を酵素消化に供し、合成された遺伝子を電気泳動によってキャリアプラスミドDNAから分離させた。標準的な分子生物学技術によって、消化されたDNAを予め消化された発現ベクタープラスミドDNAに連結した。連結されたDNAをコンピテントな細菌に形質転換し、複数の選択用抗生物質を含むLBプレート上に播種した。いくつかの細菌コロニーを採取し、標準的な分子生物学技術によってDNA調製物を作製した。調製されたDNAを配列決定によって検証した。設計されたDNA配列と100％一致するDNA配列を有している細菌クローンのみを、プラスミドDNA調製のために、続いて細胞トランスフェクションのために使用した。
IgGおよびIgMの重鎖および軽鎖との関連での3C5-2G12 VH配列および3C5-2G12 VL配列の配列を下記に示す。
3C5-2G12 IgG1抗体HC:
Figure 0006979971
3C5-2G12 IgM抗体HC:
Figure 0006979971
3C5-2G12 IgG、IgM抗体LC:
Figure 0006979971
3C5-2G12 IgM+J抗体J鎖配列:
Figure 0006979971
これらの配列に対応するDNAを合成し、HEK293細胞にトランスフェクトしてタンパク質を産生させ、次いでそれを、IgMに特異的なラクダ科動物抗体アフィニティーマトリックスを用いて精製した。図7に示すように、J鎖は、IgMと合体することが可能であり、対応するJ鎖を伴う五量体型IgMは、J鎖を伴わない六量体型とはっきりと識別可能であった。
2 タンパク質の発現、精製、および特徴決定
a トランスフェクション
重鎖、軽鎖、およびJ鎖のDNAをCHO細胞またはHEK293細胞にトランスフェクトした。典型的には、発現ベクター用のDNAを1:1:1の比でPEIと混合し、次いでCHO-S細胞に添加した。確立されている技術に従って、CHO-S細胞を用いるPEIトランスフェクションを実施した(Biotechnology and Bioengineering, Vol 87, 553-545を参照されたい)。
b 免疫沈降法
i Capture Select IgM(BAC, Thermo Fisher): トランスフェクトされたCHO細胞上清から得られたIgMタンパク質を、製造業者のプロトコールに従って(GE Life Sciences)、Capture Select IgMアフィニティーマトリックスを用いる免疫沈降によって、ある程度精製した。室温で2時間インキュベーションした後、遠心分離によってアフィニティーマトリックスを上清から分離させた。PBSで3回、マトリックスをさらに洗浄した後、PBSを注意深く除去した。NuPage LDSタンパク質緩衝液(Life Technology)と共に5分間インキュベートすることによって、捕捉されたタンパク質をマトリックスから溶出させた。
c ゲル電気泳動
i 非還元SDS PAGE: 非還元SDS PAGEは、大きさに基づいてネイティブIgM およびその変異型を分離する。ホモ二量体の重鎖および軽鎖から構成される五量体IgMは、分子量が約1,000,000のタンパク質バンドを生じる。ゲルに載せる前に、25℃で30分間、NuPage LDS試料緩衝液(Life Technologies)をIgMタンパク質試料に添加した。NativePage Novex 3〜12％ビス-トリスゲル(Life Technologies)をNovexトリス-酢酸SDS泳動用緩衝液(Life Technologies)と共に使用した。色素の前部がゲルの底面に到達するまで、ゲルを泳動させた。
ii 還元SDS-PAGE: NuPage LDS試料用緩衝液(Life Technologies)およびNuPage還元剤ジチオトレイトール(Life Technologies)をIgMタンパク質試料に添加し、NuPage Novex 4〜12％ビス-トリスゲル(Life Technologies)に載せる前に10分間80℃まで加熱した。NuPage MES SDS泳動用緩衝液(Life Technologies)をゲル電気泳動のために使用した。色素の前部がゲルの底面に到達するまで、ゲルを泳動させた。電気泳動が完了した後、ゲルを装置から除去し、コロイド状ブルー染色(Life Technologies)を用いて染色した。
iii ウェスタンブロット: 前述した条件下で泳動させたアクリルアミドゲルを20％エタノール溶液中で10分間洗い、次いで、iBlotドライブロッティングシステム(Invitrogen)を20Vで10分間用いて、iBlot PVDF膜(Invitrogen)にタンパク質を転写した。転写後、2％ウシ血清アルブミン、0.05％Tween20を用いてPVDF膜を少なくとも12時間ブロッキングした。Pierce J鎖抗体(ThermoFisher)の1/500希釈物を膜に添加し、1時間インキュベートし、次いでペルオキシダーゼをコンジュゲートしたヤギ抗ウサギIgG(Jackson ImmunoResearch)の1/5000希釈物を添加し、暗所で30分間インキュベートさせた。最後に、Super Signal West Pico化学発光基質(ThermoFisher)をブロットに添加し、結果として生じるシグナルを、ChemiDoc-It HR410画像化システム(UVP)を用いて、またはブロットをX線フィルムに曝露することによって可視化した。
実施例5: 3C5-2G12 IgGおよび3C5-2G12 IgMの機能試験
前と同じように、PD-L1を表面で発現する凍結したCHO細胞(Promega CS187103)を37℃で解凍し、10％ウシ胎児血清(Invitrogen)を添加したDMEM中に再懸濁した。細胞7,500個を含む培地を37℃および5％CO2で16時間、384ウェルプレートのウェル中に添加した。培地を、3C5-1G12抗体または対照抗体を含む10uLのRPMI+2％FBSに交換した。操作されたジャーカット細胞(Promega CS187105)10,000個を含むさらに10uLの培地をウェルに添加し、37℃および5％CO2で5時間インキュベートした。細胞を、ルシフェリンを含む20μLの溶解緩衝液(Promega、Cell Titer Glo)と混合して、ルシフェラーゼレポーター活性を測定した。EnVisionプレートリーダーによって光出力を測定した。Prismソフトウェアを用いて4パラメーター曲線当てはめによって、EC50を明らかにした。
遮断アッセイ法における精製3C5-2G12抗体調製物の試験から得られるデータ例を図8に示している。IgM型およびIgM+J型は、このアッセイ法において著しく強力(61pMおよび96pM)で、IgG型よりも強力であると考えられる。
実施例6: 3C5-2G12 IgGおよび3C5-2G12 IgMの交差反応性試験
組換えヒトPD-L1 Fcキメラ(Sino Biological、カタログ番号10084-H02H)、組換えカニクイザルPD-L1 Fcキメラ(Sino Biological、カタログ番号90251-C02H)、組換えマウスPD-L1 Fcキメラ(Sino Biologicals、カタログ番号50010-M02H)、および組換えヒトPD-L2 Fcキメラタンパク質(Sino Biological、カタログ番号10292-H02H)を、4℃で一晩インキュベーションすることによって、1ug/mLの濃度でELISAプレートに直接コーティングした。これらのプレートをPBS 0.05％Tweenで3回洗浄し、ペーパータオルに数回軽くたたきつけて乾かした。室温で1時間、200uLの1％ミルクで、すべてのプレートをブロッキングした。上記のようにプレートを洗浄し乾かした後に、3C5.2G12 IgG抗体、3C5.2G12 IgM抗体、および3C5.2G12 IgM+wtJ抗体をそれぞれ、3ug/mLから始めて0.1ng/mLまで、1％ミルク中で1:3希釈した。希釈した抗体50μLを全プレートの各ウェルに添加した。陽性対照抗体(マウス抗ヒトPD-L1、29E.2A3(BioLegend、カタログ番号329702)およびそのアイソタイプ対照マウスIgG2b k(BioLegend、カタログ番号400302)を3ug/mLから始めて0.1ng/mLまで、1％ミルク中で段階的に3倍希釈し、用量設定されたこれらの抗体50uLを各プレート/ウェルに添加した。同様に、ラット抗マウスPD-L1(BioLegend、カタログ番号124302)およびラットIgG2bアイソタイプ(BioLegend、カタログ番号400622)、抗ヒトPD-L2(BioLegend、カタログ番号345502)およびマウスIgG1アイソタイプ(BioLegend、カタログ番号4011402)を前述したように用量設定し、各プレート/ウェルに添加した。これらのプレートを室温で1時間インキュベートした。これらを上記のように洗浄し乾かし、次いで、すべての3C5.2G12を、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)とコンジュゲートされた1:5000ヤギ抗ヒトκ軽鎖抗体(Jackson Immuno Research、カタログ番号115-035-071)50uLと共に室温で1時間インキュベートした。対照ウェルのために、適切な二次抗体、すなわちヤギ抗マウスHRP(Southern Biotech、カタログ番号1033)およびマウス抗ラットHRP(Southern Biotech、カタログ番号3070-05)を希釈し、上記のようにインキュベートした。洗浄および乾燥段階を繰り返した後、TMB基質(BD OptiIEIA、カタログ番号555214)50uLを用いて20〜30分間、プレートを発色させた。50uLの2N H2SO4を用いて反応を停止し、Spectramax Gemini分光光度計を用いて450nmでの吸光度を読み取った。段階希釈した3C5.2G12についてのデータ例を図9のパネルA、パネルB、およびパネルCに示している。
実施例7: 3C5-2G12 IgGおよび3C5-2G12 IgMのヒト化
3C5-2G12抗体のヒト化を両方の型(IgGおよびIgM)で実施した。試験のために作製した配列および組合せを下記に示す。
Figure 0006979971
Figure 0006979971
以下の組合せを、前述の標準技術を用いてIgGの形態で作製し、プロテインAを用いて精製した。
h3C5H1-h3C5L1
h3C5H2-h3C5L2
h3C5H3-h3C5L2
h3C5H4-h3C5L2
PD-L1遮断アッセイ法においてこれらの各抗体を試験した結果を図10に示す。ヒト化工程の間に生じた保存的変化はすべて、ヒト化抗体の遮断活性にほとんど影響しなかったと考えられる。
実施例8: エピトープマッピング
PEPSCAN(商標)システムを用いる固体支持体上への直接的合成によってPD-L1(Q9NZQ7、SEQ ID NO: 48)の細胞外ドメインのアミノ酸19〜132をカバーする重複15アミノ酸直線状ペプチドすべてのライブラリーを作製することにより、ペプチドエピトープマッピングを実施した。
自動化されたELISAタイプの読取りを用いるPEPSCAN(商標)システムで、抗体結合を定量した。3C5抗体(IgG型)および対照抗体YW243.55S70(本明細書において「S70」と呼ばれる)、すなわちPD-L1に結合する参照抗体の、ペプチドアレイへの結合を測定した。S70の重鎖および軽鎖の配列は、その開示内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,217,149号で開示されている。S70抗体に結合するhPD-L1エピトープは、アミノ酸配列QDAGVYRCMIS(SEQ ID NO: 48のアミノ酸107〜117)にはっきりとマッピングされた。このエピトープは、hPD-1と接触するように意図されたhPD-L1の14個の非連続的残基のうちの3つのアミノ酸(R113、M115、およびS117)を含んでいる。その全体が参照により本明細書に組み入れられるLin, D.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:3011-3016 (2008)を参照されたい。
3C5エピトープは、低ストリンジェンシー結合条件(例えば、抗体の前準備およびELISA反応で使用される0.1×試料緩衝液)を用いた場合、部分的にしか決定することができなかった。これらの結合結果は、3C5エピトープがS70エピトープと部分的に重複することと一致していた。hPD-L1の他の領域もまた、例えば非連続的エピトープまたは立体構造的エピトープとして3C5に結合される可能性は、これらの結合結果によって除外されなかった。下記の実施例9に示すように、3C5抗体およびS70抗体はヒトPD-L1への結合を得るために交差競合することから(下記の実施例9を参照されたい)、これら2種類の抗体に対するエピトープが重複していることがさらに裏付けられる。
実施例9: 抗体の交差阻止
以下の方法によって、抗体の交差阻止解析を行った。ヒトPD-L1を発現するCHO細胞(反応1回当たり20,000〜30,000個)を、3C5(IgG)抗体、S70抗体、または無関係なアイソタイプ対照IgG抗体のいずれかの用量設定された非標識希釈物と共に4℃で30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、次いで、Alexa Fluor(登録商標)647で標識した一定濃度の3C5またはS70(1μg/mL)と共に4℃で30分間インキュベートした。FACSCalibur(商標)システムを用いて蛍光染色強度を測定した。同一の抗体による競合は陽性対照であり、無関係な抗体による競合の欠如は陰性対照であった。交差阻止の結果を図11のパネルAおよびパネルBに示す。これらの結果から、3C5およびS70によるヒトPD-L1への結合の相互の交差阻止が実証される。前述の本発明は、理解を明確にするために、例示および例としていくらか詳しく説明してきたが、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、いくつかの変更および修正をそれに加え得ることが、本発明の教示に照らして、当業者には容易に明らかになる。
したがって、上記の内容は、本発明の原理を例示するにすぎない。当業者は、本明細書において明瞭に説明も示しもしないが、本発明の原理を具体化し、その精神および範囲内に含まれる様々な仕組みを考え出せることが、認識されるであろう。さらに、本明細書において列挙する例および条件的な言い回しはすべて、本発明の原理および技術促進のために本発明者らが与えた概念を読者が理解するのを助けることを主に意図し、このような具体的に列挙される例および条件に限定されることはないと解釈すべきである。さらに、本発明の原理および局面、ならびにそれらの具体的な例を列挙する本明細書の記載はすべて、それらの構造的等価物および機能的等価物の両方を包含することが意図される。さらに、このような等価物には、現在公知の等価物および将来開発される等価物、すなわち、構造に関わらず同じ機能を果たす、開発された任意の要素の両方が含まれると意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書において示し説明する例示的な局面に限定されるものではない。正しくは、本発明の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。

Claims (17)

  1. 重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、単離された抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖可変領域が、
    (i)配列GFSLTSYDIS(SEQ ID NO: 4)を含むHVR-H1;
    (ii)配列VIWTGVGTN(SEQ ID NO: 5)を含むHVR-H2;および
    (iii)配列DPYYYGMDY(SEQ ID NO: 6)を含むHVR-H3
    を含み、
    かつ軽鎖可変領域が、
    (iv)配列RASQDISIWLS(SEQ ID NO: 1)を含むHVR-L1;
    (v)配列KASNLHT(SEQ ID NO: 2)を含むHVR-L2;および
    (vi)配列LQSQSFPRT(SEQ ID NO: 3)を含むHVR-L3
    を含む、
    単離された抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片。
  2. SEQ ID NO: 36、37、38、39、40、41、42、または45のいずれか1つに対する少なくとも90％の配列同一性を有している重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO: 43、44、または46のいずれか1つに対する少なくとも90％の配列同一性を有している軽鎖可変ドメインを含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  3. (a)SEQ ID NO: 36、37、38、39、40、41、42、または45のいずれか1つの重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO: 43、44、または46のいずれか1つの軽鎖可変ドメインを含む抗体を発現する細胞を培養する工程;ならびに
    (b)該細胞からまたは該細胞が培養される細胞培養培地から該抗体を単離する工程
    によって作製される、単離された抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片。
  4. 二重特異性である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
  5. 前記二重特異性の抗体または抗原結合断片が、PD-L1タンパク質および細胞表面タンパク質に結合する、請求項4に記載の抗体または抗原結合断片。
  6. 前記抗原結合断片が、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv、およびscFvからなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
  7. 前記抗体がκ軽鎖またはλ軽鎖を含み、かつ該抗体が、IgMアイソタイプもしくはIgAアイソタイプである、またはIgG/IgMハイブリッド抗体もしくはIgG/IgAハイブリッド抗体である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
  8. 前記抗体がJ鎖を含む、請求項7に記載の抗体または抗原結合断片。
  9. 前記J鎖が、外来性結合部分を含む改変J鎖である、請求項8に記載の抗体または抗原結合断片であって、
    該外来性結合部分が、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体-薬物コンジュゲート、抗体様分子、抗体様分子の抗原結合断片、可溶性タンパク質および膜結合型タンパク質、リガンド、ならびに受容体からなる群より選択され、かつ抗体の該抗原結合断片が、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv、およびscFvからなる群より選択される、抗体または抗原結合断片。
  10. 前記外来性結合部分が、
    （a）CTLA-4、TIM3、LAG3、BTLA、VISTA、およびTIGITからなる群より選択される細胞表面タンパク質に結合する；
    （b）アルブミンタンパク質もしくはアルブミンタンパク質の断片を含む；
    （c）アルブミン結合ペプチドもしくはアルブミン結合抗体断片を含む；
    （d）FcRn結合ペプチドもしくはFcRn結合抗体断片を含む；
    （e）T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、および好中球からなる群より選択されるエフェクター細胞に結合する；または
    （f）T細胞上のCD3に結合する、
    請求項9に記載の抗体または抗原結合断片。
  11. 外来性結合部分を含む改変J鎖を含み、かつ細胞表面タンパク質に結合する、IgM抗体、IgA抗体、IgG/IgM抗体、またはIgG/IgA抗体であって、該外来性結合部分が、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗PD-L1抗体または抗原結合断片を含む、IgM抗体、IgA抗体、IgG/IgM抗体、またはIgG/IgA抗体。
  12. 請求項1〜11のいずれか一項に記載の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド、および請求項1〜11のいずれか一項に記載の抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む組成物。
  13. 請求項1〜11のいずれか一項に記載の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド、および請求項1〜11のいずれか一項に記載の抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  14. 請求項12に記載の組成物または請求項13に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
  15. 請求項1〜11のいずれか一項に記載の抗PD-L1抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、および請求項1〜11のいずれか一項に記載の抗PD-L1抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を、宿主細胞にトランスフェクトする工程;
    該抗PD-L1抗体を産生するのに適した条件下で該宿主細胞を培養する工程;ならびに
    該抗PD-L1抗体を単離する工程
    を含む、単離された抗PD-L1抗体を作製する方法。
  16. がんの治療のための、請求項1〜11のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬。
  17. がんを治療するための医薬の調製における請求項1〜11のいずれか一項に記載の単離された抗体の使用。
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