KR20210083260A - 다가 IgM- 및 IgA-Fc 기반 결합 분자 - Google Patents

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폴 힌턴
딘 응
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아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은 다량체화 IgM 또는 IgA 불변 영역에 융합된 결합 폴리펩티드 예를 들어, 수용체 엑토도메인, 리간드, 또는 그의 수용체 결합 단편, 등을 포함하는 IgM- 및 IgA-유래된 결합 분자를 제공한다.

Description

다가 IgM- 및 IgA-Fc 기반 결합 분자
관련 출원의 교차 참조
본원은 그 전체가 본원에 참조로 포함되어 있는, 2018년 10월 23일자로 출원된 미국 임시 특허 출원 일련 제62/749,429호의 이익을 주장한다.
서열 목록
본원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하고 그 전체 내용은 본원에 인용되어 포함된다. ASCII 복사물은 2019년 10월 23에 생성되었고, 09789-021WO1-Sequence-Listing로 명명되고, 그 크기는 190,396 바이트이다.
IgA 및 IgM 항체와 같이 다량체화할 수 있는 항체 및 항체-유사 분자는 예를 들어, 개선된 특이성, 개선된 결합능, 및 다중 결합 표적에 결합하는 능력을 허용하는 면역-종양학 및 감염성 질환의 분야에서 유망한 약물 후보로서 부각되었다. 예를 들어, 미국 특허 번호 9,951,134, 10,400,038, 및 9,938,347, 미국 특허 출원 공개 번호 US20190100597A1, US20180118814A1, US20180118816A1, US20190185570A1, 및 US20180265596A1, 및 PCT 공개 번호 WO2018/017888, WO2018/017763, WO2018/017889, WO2018/017761, 및 WO2019/165340을 참조하고, 이들의 내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다
IgG의 Fc 영역은 치료적 폴리펩티드의 융합 파트너로서 오랫 동안 사용되어 왔다. 기재된 제1 Fc 융합 단백질은 HIV가 세포로 유입되는 것을 차단하는 데 사용되는 CD4-Fc 융합 이었다(Capon, DJ, 등, Nature 337:515-531 (1989)). 치료적 단백질의 IgG Fc로의 융합은 치료적 폴리펩티드를 안정화시키고 그 반감기를 연장할, 뿐만 아니라 IgG-특이적 효과기 기능을 제공한다(Czajkowsky, DM, 등, EMBO Mol. Med. 4:1015-1028 (2012)). 1998년 FDA에 의해 승인된 이량체성 IgG1-fc-인간 TNF 수용체 융합체인 에타네르셉트로 시작하여, 다양한 Fc 융합 단백질이 현재 치료제로서 시판되고 있다(참고 예를 들어, Czajkowsky 등, 표 1). 그러나, IgG 융합 단백질로 제한되는 IgG 융합은 단지 단량체 또는 이량체로서 발현될 수 있어, 일부 상황에서 효능을 제한한다. 실제로, TNF 수용체 Fc 융합 단백질의 단량체 형태는 이량체에 비해 TNFα 억제 활성을 크게 감소시켰다(Pepel, K., 등, J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991)).
많은 보고서에는 다양한 방법을 통해 중합된 치료 단백질-Fc 융합체를 기재하였다. 한 보고서에서, IgG Fc 영역은 말라리아 항원-IgG 융합의 육량체화를 용이하게 하도록 조작되었지만, IgG 융합 부분의 효과기 기능은 변경되었고, 분자는 상응하는 단량체 융합 단백질과는 대조적으로 동물을 면역화하는데 사용될 때 면역원성이 아니었다(Mekhaiel, DN, 등, Scientific Reports 1, Doi: 10.1038/srep00124 (2011)). 또 다른 연구에서, 인간 PD-L1 엑토도메인을 야생형 인간 IgM 불변 영역에 융합시키고, 인간 J-사슬을 갖거나 갖지 않고 발현시키고, 시험관내 유세포측정 및 플레이트-기반 면역분석법에서 시험하였으나, PD-1-발현 세포에서 신호 전달을 유도하는 작제물의 능력은 시험되지 않았다(Ammann, JU., 등, Eur. J. Immunol 42:1354-1356 (2012).
IgG Fc 융합 단백질의 안정성 및 혈청 반감기 특성을 유지하는 더 높은 결합능 Fc 융합 치료제에 대한 요구가 남아 있다.
본 개시내용은 2, 5, 또는 6개의 2가 결합 단위 또는 그의 변이체 또는 단편을 포함하는 다량체 결합 분자를 제공하고, 각각의 결합 단위는 2개의 IgA 또는 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체를 포함하되, 이들 각각은 세포의 표면 상에서 발현된 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드 또는 그의 단편에 융합되고, 결합 폴리펩티드는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편이 아니고, 그리고 상기 결합 파트너에 대한 결합 폴리펩티드의 결합은 세포에서 신호 전달을 조절한다. 특정 구현예에서 결합 폴리펩티드의 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11 또는 12개는 동일한 결합 파트너에 결합하고 그 신호 전달을 조절한다. 또한, 특정 구현예에서 결합 분자는 동일한 결합 파트너에 결합하는 1개 또는 2개의 결합 폴리펩티드를 갖는 1가 또는 2가 결합 분자의 당량보다 더 높은 효능으로 세포에서 신호 전달을 유도하거나 억제할 수 있다.
본 개시내용은 추가로 2, 5, 또는 6개의 2가 결합 단위 또는 그의 변이체 또는 단편을 포함하는 다량체 결합 분자를 제공하고, 각각의 결합 단위는 2개의 IgA 또는 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체를 포함하되, 이들 각각은 결합 폴리펩티드에 융합되고, 결합 폴리펩티드의 적어도 3개는 리간드 또는 그의 수용체 결합 단편을 포함하는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 수용체 엑토도메인을 포함하고, 상기 수용체 엑토도메인은 항체 또는 항체의 항원-결합 단편이 아니고, 그리고 상기 리간드에 대한 수용체 엑토도메인의 결합은 상기 수용체를 발현시키는 세포에서 신호 전단을 조절할 수 있다. 특정 구현예에서 상기 수용체 엑토도메인의 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11 또는 12개는 동일한 리간드에 결합한다. 또한, 특정 구현예에서 결합 분자는 동일한 리간드에 결합하는 1 또는 2개의 수용체 엑토도메인을 갖는 단량체성 또는 이량체성 결합 분자의 당량보다 더 높은 효능으로 신호 전달을 조절할 수 있다.
본 개시내용에 의해 제공된 특정 결합 다량체 결합 분자에서, 각각의 결합 단위는 2개의 IgA 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체를 포함하되, 이들 각각은 IgA Cα3 도메인 및 IgA 테일피스(tailpiece) 도메인을 포함하고, 그리고 다량체 결합 분자는 추가로 J-사슬 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체를 포함한다. 특정 구현예에서, 각각의 IgA 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체는 추가로 IgA Cα3 및 IgA 테일피스 도메인에 대해 N-말단에 위치한 IgA Cα2 도메인을 포함한다. 예를 들어, 다량체 결합 분자의 중쇄 불변 영역은 서열번호: 24의 아미노산 125 내지 353, 또는 서열번호: 25의 아미노산 113 내지 340을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 각각의 IgA 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체는 추가로 IgA Cα2 도메인에 대해 N-말단에 위치한 IgA 힌지 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다량체 결합 분자의 중쇄 불변 영역은 서열번호: 24의 아미노산 102 내지 353, 또는 서열번호: 25의 아미노산 102 내지 340을 포함할 수 있다.
본 개시내용에 의해 제공된 특정 결합 다량체 결합 분자에서, 각각의 결합 단위는 2개의 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체를 포함하되, 이들 각각은 IgM Cμ4 도메인 및 IgM 테일피스 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 각각의 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체는 추가로 IgM Cμ4 및 IgM 테일피스 도메인에 대해 N-말단에 위치한 IgM Cμ3 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 각각의 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체는 추가로 IgM Cμ3 도메인에 대해 N-말단에 위치한 IgM Cμ2 도메인을 포함한다. 예를 들어, 다량체 결합 분자의 중쇄 불변 영역은 아미노산 서열 서열번호: 3을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 각각의 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체는 아미노산 서열 서열번호: 4를 포함하고, 이는 서열번호: 3의 인간 IgM 불변 영역의 야생형 다량체화 단편을 포함하는 상응하는 결합 분자에 비해 감소된 보체-의존적 세포독성 (CDC) 활성을 다량체 결합 분자 상에 부여한다. 각각의 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체는 IgM Cμ4 및 IgM 테일피스 도메인에 대해 N-말단에 위치한 IgM Cμ3 도메인을 포함하는 특정 구현예에서, 각각의 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체는 추가로 IgM Cμ3 도메인에 대해 N-말단에 위치한 IgG 힌지 영역 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다. 특정 구현예에서 IgG 힌지 영역은 Cμ3, Cμ4, 및 TP 도메인을 포함하는 인간 IgM 불변 영역의 다량체화 단편에 융합된 변이체 인간 IgG1 힌지 영역이다. 예를 들어, 다량체화 힌지-IgM 불변 영역 단편은 아미노산 서열 서열번호: 6, 또는 아미노산 서열 서열번호: 7을 포함할 수 있고, 후자 서열은 서열번호: 6의 다량체화 힌지-IgM 단편을 포함하는 상응하는 결합 분자에 비해 감소된 CDC 활성을 결합 분자에 부여하는 Cμ3 영역을 포함한다.
특정 구현예에서 본 개시내용에 의해 제공된 IgM-Fc 기반 다량체 결합 분자는 오량체이고, 추가로 J-사슬 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체를 포함한다. J-사슬 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체는 변이체 J-사슬은 예를 들어, 다량체 결합 분자의 혈청 반감기에 영향을 줄 수 있는 야생형 J-사슬에 대해 하나 이상의 단일 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 다량체 결합 분자는 하나 이상의 단일 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 제외하고는 동일하고, 동일한 방식으로 동일한 동물 종에 투여되는 참조 다량체 결합 분자에 비해 동물에게 투여 시 증가된 혈청 반감기를 나타낸다. 특정 구현예에서, J-사슬 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체는 야생형 인간 J-사슬 (서열번호: 15)의 아미노산 Y102에 상응하는 아미노산 위치 에서 아미노산 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 서열번호: 15의 Y102에 상응하는 아미노산은 알라닌(A), 세린(S), 또는 아르기닌(R)로 치환된다. 특정 구현예에서, 서열번호: 15의 Y102에 상응하는 아미노산은 알라닌(A)로 치환된다. 특정 구현예에서, J-사슬은 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 J-사슬이다. 특정 구현예에서 J-사슬 또는 그의 기능적 단편은 인간 J-사슬(서열번호: 15)의 아미노산 N49, 아미노산 S51, 또는 N49와 S51 둘 모두에 상응하는 아미노산 위치 에서 아미노산 치환을 포함하고, 단, 서열번호: 15의 위치 S51에 상응하는 단일 아미노산 치환은 트레오닌(T) 치환이 아니다. 특정 구현예에서, 서열번호: 15의 N49에 상응하는 위치는 알라닌(A), 글리신(G), 트레오닌(T), 세린(S) 또는 아스파르트산(D)로 치환된다. 특정 구현예에서, 서열번호: 15의 N49에 상응하는 위치는 알라닌(A)로 치환된다. 특정 구현예에서, J-사슬은 변이체 인간 J-사슬이고, 아미노산 서열 서열번호: 17을 포함한다. 특정 구현예에서, 서열번호: 15의 S51에 상응하는 위치는 알라닌(A) 또는 글리신(G)로 치환된다. 특정 구현예에서, 서열번호: 15의 S51에 상응하는 위치는 알라닌(A)로 치환된다. 특정 구현예에서, J-사슬은 변이체 인간 J-사슬이고, 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 의해 제공된 다량체 결합 분자가 J-사슬 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체를 포함하는 특정 구현예에서, J-사슬 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체는 추가로 이종성 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 이종성 폴리펩티드는 예를 들어, 적어도 5개의 아미노산을 포함하지만, 25개 이하의 아미노산을 포함할 수 있는 펩티드 링커를 통해 J-사슬 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체에 직접적으로 또는 간접적으로 융합된다. 특정 구현예에서 펩티드 링커는 GGGGS (서열번호: 19), GGGGSGGGGS (서열번호: 20), GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 21), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 22), 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 23)로 이루어진다. 특정 구현예에서, 이종성 폴리펩티드는 J-사슬 또는 그의 단편 또는 변이체의 N-말단, J-사슬 또는 그의 단편 또는 변이체의 C-말단에 융합될 수 있거나, 또는 동일하거나 동일하지 않은 이종성 폴리펩티드는 J-사슬 또는 그의 단편 또는 변이체의 N-말단 및 C-말단 둘 모두에 융합될 수 있다. 특정 구현예에서, 이종성 폴리펩티드는 다량체 결합 분자의 흡수, 분포, 대사 및/또는 배출 (ADME)에 영향을 미칠 수 있다. 특정 구현예에서, 이종성 폴리펩티드는 항원 결합 도메인 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있고, 항원-결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일-사슬 Fv (scFv) 단편, 디설파이드-연결된 Fv (sdFv) 단편, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 특정 구현예에서, 항원-결합 단편은 scFv 단편이다.
특정 구현예에서 본원에 제공된 IgA-Fc 기반 결합 분자는 4개의 동일한 결합 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서 본원에 제공된 IgM-Fc 기반 결합 분자는 오량체일 수 있고, 10개의 동일한 결합 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서 본원에 제공된 IgM-Fc 기반 결합 분자는 오량체일 수 있고, 12개의 동일한 결합 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 개시내용에 의해 제공된 특정 결합 다량체 결합 분자에서, 각각의 결합 폴리펩티드는 리간드 또는 그의 수용체 결합 단편, 사이토카인 또는 그의 수용체 결합 단편, 성장 인자 또는 그의 수용체 결합 단편, 신경전달물질 또는 그의 수용체 결합 단편, 펩티드 또는 단백질 호르몬 또는 그의 수용체 결합 단편, 면역 체크포인트 조절제 리간드 또는 그의 수용체 결합 단편, 또는 세포외 기질 단백질의 수용체 결합 단편이다. 리간드 또는 그의 수용체 결합 단편은 비제한적으로, 케모카인, 보체 단백질, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 계열 리간드, 면역 체크포인트 조절제 리간드, 표피 성장 인자 (EGF), 인터페론, 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리(superfamily) (TNFSF) 리간드, 혈관 내피성 성장 인자 (VEGF) 계열 리간드, 형질전환 성장 인자-β 슈퍼패밀리 (TGFβsf) 리간드, 그의 임의의 수용체 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 결합 폴리펩티드가 TNFSF 리간드 또는 그의 수용체 결합 단편을 포함하는 특정 구현예에서, TNFSF 리간드는 비제한적으로, TRAIL, OX40 리간드, CD40 리간드, 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체 리간드(GITRL), 4-1BB 리간드, 그의 임의의 수용체 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 결합 폴리펩티드가 면역 체크포인트 조절제 리간드 단백질 또는 그의 수용체 결합 단편을 포함하는 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절 단백질은 CD86 또는 그의 수용체 결합 단편, CD80 또는 그의 수용체 결합 단편, PD-L1 또는 그의 수용체 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 인간 PD-L1의 수용체 결합 단편 예를 들어, 인간 PD-L1의 V-형 도메인을 함유하는 서열번호: 8의 아미노산 19 내지 127, 또는 인간 PD-L1의 V-형 및 C2-형 도메인을 함유하는 서열번호: 9를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본 개시내용에 의해 제공된 다량체 결합 분자는 아미노산 서열 서열번호: 11 또는 서열번호: 13을 포함하는 폴리펩티드의 10 또는 12개의 카피를 포함하고, 추가로 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 변이체 J-사슬을 포함할 수 있다. 이러한 예시적인 구현예에 따른 결합 분자는 PD-1의 효능제일 수 있다.
특정 구현예에서, 결합 파트너는 세포-표면 수용체 단백질 또는 면역 체크포인트 조절제일 수 있다.
결합 폴리펩티드가 수용체 엑토도메인을 포함하는 특정 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 비제한적으로, 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 수용체(TNFrSF)의 리간드 결합 단편, 면역 체크포인트 조절제 수용체의 리간드 결합 단편, TGFβ 수용체의 리간드 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, TNFrSF 수용체 단편은 비제한적으로, 수용체-4를 함유하는 사멸 도메인(DR4), 수용체-5를 함유하는 사멸 도메인(DR5), OX-40, CD40, 4-1BB, 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체(GITR), 또는 이들의 임의의 조합의 리간드 결합 단편을 포함할 수 있다. 추가 예로서, 면역 체크포인트 조절제 수용체 엑토도메인은 비제한적으로 PD-1의 리간드 결합 단편, CTLA4의 리간드 결합 단편, LAG3의 리간드 결합 단편, CD28의 리간드 결합 단편, 수용체 2를 함유하는 면역글로불린-유사 도메인(ILDR2)의 리간드 결합 단편, T-세포 면역글로불린 뮤신 패밀리 일원 3 (TIM-3)의 리간드 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 추가 예로서, TGFβ 수용체는 비제한적으로 TGFβR-1, TGFβR-2, TGFβR3, 또는 이들의 임의의 조합의 리간드 결합 단편을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 추가로 본원에 제공된 다량체 결합 분자의 서브유닛을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 각각의 서브유닛은 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드 또는 그의 단편, 또는 리간드에 특이적으로 결합하는 수용체 엑토도메인에 융합된 IgA 또는 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체를 포함한다. 또한 개시된는 제공된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 제공된 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 개시된다. 특정 구현예에서, 제공된 숙주 세포는 추가로 본 개시내용에 제공된 J-사슬 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 추가로 치료가 필요한 대상체에서 자가면역 장애, 염증성 장애, 또는 이들의 조합을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체에게 본원에 제공된 다량체 결합 분자의 유효량을 투여하는 것을 포함하고, 다량체 결합 분자는 동일한 결합 파트너에 결합하는 단량체성 또는 이량체성 결합 분자의 당량보다 더 큰 효능을 나타낸다.
본 개시내용은 추가로 이식 수령체에서 이식 거부를 방지하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체에게 본원에 제공된 다량체 결합 분자의 유효량을 투여하는 것을 포함하고, 다량체 결합 분자는 동일한 결합 파트너에 결합하는 단량체성 또는 이량체성 결합 분자의 당량보다 더 큰 효능을 나타낸다.
도 1a는 Cμ2 도메인, Cμ3 도메인, 및 Cμ4-tp 도메인을 포함하는 2개의 IgM-유래된 중쇄 단편을 각각 갖는 6개의 IgM-유래된 결합 단위을 갖는 프로토타입 육량체 결합 분자를 도시하고, IgM 유래된 중쇄 단편은 리간드 또는 수용체 결합 폴리펩티드의 C-말단에 융합된다.
도 1b는 프로토타입 오량체 결합 분자가 Cμ2 도메인, Cμ3 도메인, 및 Cμ4-tp 도메인을 갖는 2개의 IgM-유래 중쇄 단편을 각각 갖는 5개의 IgM-유래 결합 단위를 갖는 것을 도시하고, IgM 유래된 중쇄 단편은 결합 폴리펩티드의 C-말단에 융합되고, 그리고 오량체 결합 분자는 추가로 이종성 폴리펩티드 예를 들어, scFv 항체 결합 도메인의 선택적인 N-및 C-말단 융합을 보유하는 변형된 J-사슬을 포함한다.
도 2는 프로토타입 오량체 결합 분자가 Cμ2 도메인, Cμ3 도메인, 및 Cμ4-tp 도메인을 갖는 2개의 IgM-유래 중쇄 단편을 각각 갖는 5개의 IgM-유래 결합 단위를 갖는 것을 도시하고, IgM 유래된 중쇄 단편은 결합 폴리펩티드의 C-말단에 융합되고, 결합 폴리펩티드는 수용체 엑토도메인이고, 그리고 오량체 결합 분자는 추가로 이종성 폴리펩티드 예를 들어, scFv 항체 결합 도메인의 선택적인 N-및 C-말단 융합을 보유하는 변형된 J-사슬을 포함한다.
도 3a 내지 c 는 실시예 1에 따라 생성된 PD-L1 결합 분자의 구조를 도시한다. 도 3a: PD-L1-IgM; 도 3b: PD-L1-H-IgM; 도 3c: PD-L1-Fc.
도 4는 리포터 주르카트(Jurkat) T-세포에서 PD-1 활성을 자극하기 위한 다양한 PD-L1 결합 분자의 능력을 보여주는 그래프이다.
정의
용어 "a" 또는 "an" 독립체는 그 독립체 중 하나 이상을 지칭하고; 예를 들어, "결합 분자"는 하나 이상의 결합 분자를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "a"(또는 "an"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 "및/또는"은 다른 것과 함께 또는 다른 것 없이 2개의 특정된 특징 또는 구성요소 각각의 특정 개시로서 취해져야 한다. 따라서, 본원의 어구 예컨대 "A 및/또는 B"에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A 및 B," "A 또는 B," "A"(단독), 및 "B"(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, 어구 예컨대 "A, B, 및/또는 C"에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 각각의 다음의 구현예를 포함하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용 관련된 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press은 본 개시내용에서 사용된 많은 용어의 일반적인 사전을 당업자에게 제공한다
단위, 접두사, 및 기호는 이들의
Figure pct00001
(SI) 허용 형태로 표시된다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수를 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노("N")에서 카복시("C") 배향으로 좌측에서 우측으로 기록된다. 본원에 제공된 제목은 본 개시내용의 다양한 구현예 또는 구현예의 제한이 아니며, 이는 전체적으로 명세서를 참조하여 이루어질 수 있다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 명세서 전체를 참조하여 보다 전체적으로 정의된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 단수 "폴리펩티드" 뿐만 아니라 복수의 "폴리펩티드들"을 포함하는 것으로 의도되고, 아미드 결합(펩티드 결합이라고도 알려져 있음)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 이루어진 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 지칭하고, 생성물의 특정 길이를 지칭하지 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 사슬", 또는 2개 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 지칭하는데 사용되는 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 이들 용어 대신에, 또는 이들 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 또한 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 및 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 또는 비-자연 발생 아미노산에 의한 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는 폴리펩티드의 후-발현 변형의 생성물을 지칭하는 것으로 의도된다. 폴리펩티드는 생물학적 공급원으로부터 유래되거나 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역될 필요는 없다. 이는 화학적 합성을 포함하는 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
본원에서 개시된 폴리펩티드는 그 크기가 약 3 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 25 이상, 50 이상, 75 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상, 1,000 이상, 또는 2,000 또는 그 초과 개의 아미노산일 수 있다. 폴리펩티드는 정의된 3차원 구조를 가질 수 있지만 반드시 그러한 구조를 가질 필요는 없다. 정의된 3차원 구조를 갖는 폴리펩타이드는 폴딩된 것으로 지칭되며, 정의된 3 차원 구조를 갖지 않지만, 오히려 많은 상이한 형태를 채택할 수 있는 폴리펩티드는 폴딩되지 않은 것으로 지칭된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 당단백질은 아미노산 예를 들어, 세린 또는 아스파라긴의 산소-함유 또는 질소-함유 측쇄를 통해 단백질에 부착된 적어도 하나의 탄수화물 모이어티에 커플링된 단백질을 지칭한다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체는 그의 천연 환경이 아닌 폴리펩티드를 의미한다. 특정 수준의 정제가 요구되지 않는다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 그의 자연 또는 천연 환경으로부터 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생산된 폴리펩티드 및 단백질은 임의의 적합한 기술에 의해 분리, 분별, 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드와 같이 본원에 개시된 바와 같이 단리된 것으로 간주된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비-자연 발생 폴리펩티드" 또는 그의 임의의 문법적 변이체는 "자연 발생"인 것으로 판단 또는 행정 또는 사법 기구에 의해 결정되거나 해석될 수 있는 폴리펩티드의 형태를 명시적으로 배제시키지만 배제시키는 조건적 정의이다.
본원에 개시된 다른 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 단편, 유도체, 유사체 또는 변이체, 및 이들의 임의의 조합이다. 본원에 개시된 바와 같은 용어 "단편", "변이체," "유도체" 및 "유사체"는 상응하는 천연 폴리펩티드의 특성 중 적어도 일부를 보유하는, 예를 들어 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드의 단편은 예를 들어 단백질분해 단편뿐만 아니라 결실 단편을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드의 변이체는 상기 기재된 바와 같은 단편, 및 또한 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 인해 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체는 비-자연적으로 발생할 수 있다. 비-자연 발생 변이체는 당업계에 공지된 돌연변이유발 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다. 유도체는 원래의 폴리펩티드에서 발견되지 않는 추가의 특징을 나타내도록 변경된 폴리펩티드이다. 그 예는 융합 단백질 또는 화학적 접합체를 포함한다. 변이체 폴리펩티드는 또한 본원에서 "폴리펩티드 유사체"로 지칭될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 폴리펩티드의 "유도체"는 또한 기능성 측면 기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 아미노산을 갖는 대상 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 20개의 표준 아미노산의 하나 이상의 유도체를 함유하는 펩티드가 "유도체"로서 또한 포함된다. 예를 들어, 4-하이드록시프롤린은 프롤린을 대체할 수 있고; 5-하이드록시라이신은 라이신을 대체할 수도 있고; 3-메틸히스티딘은 히스티딘을 대체할수 있고; 호모세린은 세린을 대체할 수 있고; 오르니틴은 라이신을 대체할 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"은, 하나의 아미노산이 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산으로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산의 계열은 염기성 측쇄 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 무전하 극성 측쇄 (예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 무극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함하여 당업계에서 정의되었다. 예를 들어, 티로신에 대한 페닐알라닌의 치환은 보존적 치환이다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 및 결합 분자의 서열에서의 보존적 치환은 결합 분자가 결합하는 결합 파트너에 대한 폴리펩티드 또는 아미노산 서열을 함유하는 결합 분자의 결합을 방해하지 않는다. 결합 파트너-결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Brummell 등, Biochem. 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi 등, Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); 및 Burks 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)를 참조한다).
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단일 핵산뿐만 아니라 복수의 핵산을 포함하도록 의도되고, 단리된 핵산 분자 또는 작제물, 예를 들어 메신저 RNA (mRNA), cDNA, 또는 플라스미드 DNA (pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포디에스테르 결합 또는 비-통상적인 결합 (예를 들어, 펩티드 핵산(PNA) 에서 발견되는 것과 같은 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 세그먼트, 예를 들어 DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다.
"단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 그의 천연 환경으로부터 분리된 임의의 형태의 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들어, 겔-정제된 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터에 함유된 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 "단리된" 것으로 간주될 것이다. 또한, 클로닝을 위한 제한 부위를 갖도록 조작된 폴리뉴클레오티드 분절, 예를 들어 PCR 생성물은 "단리된" 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가의 예는 이종성 숙주 세포에서 유지되는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 완충액 또는 염수와 같은 비-천연 용액에서 정제된 (부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 RNA 분자는 폴리뉴클레오티드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함하며, 여기서 전사체는 자연에서 발견되는 것이 아니다. 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성적으로 생산된 이러한 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 프로모터, 리보솜 결합 부위, 또는 전사 종결제와 같은 조절 인자일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비-자연 발생 폴리펩티드" 또는 그의 임의의 문법적 변이체는 "자연 발생"인 것으로 판단 또는 행정 또는 사법 기구에 의해 결정되거나 해석될 수 있는 폴리펩티드의 형태를 명시적으로 배제시키지만 배제시키는 조건적 정의이다
본원에서 사용된 바와 같이, 코딩 영역은 아미노산으로 번역된 코돈으로 이루어진 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA, 또는 TAA)이 아미노산으로 번역되지는 않지만, 이는 코딩 영역의 일부인 것으로 간주될 수 있지만, 임의의 측접 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 인트론 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 2개 이상의 코딩 영역은 단일 폴리뉴클레오티드 작제물, 예를 들어 단일 벡터 상에 존재하거나, 또는 별도의 폴리뉴클레오티드 작제물 또는 예를 들어 별도의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 함유할 수 있거나, 또는 둘 이상의 코딩 영역들을 함유할 수 있다. 또한, 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 핵산은 다른 코딩 영역에 융합되거나 융합되지 않은 이종 코딩 영역을 포함할 수 있다. 이종성 코딩 영역은 제한 없이 분비 신호 펩티드 또는 이종성 기능성 도메인과 같은 특화된 요소 또는 모티프를 코딩하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 하나 이상의 코딩 영역과 작동가능하게 회합된 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소를 포함할 수 있다. 작동가능한 회합은 유전자 생성물, 예를 들어 폴리펩티드에 대한 코딩 영역이 조절 서열(들)의 영향 또는 제어 하에 유전자 생성물의 발현을 위치시키는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 회합될 때이다. 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 생성물을 인코딩하는 mRNA의 전사를 초래하는 경우 및 2개의 DNA 단편 사이의 연결의 성질이 유전자 생성물의 발현을 지시하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 전사될 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우, 2개의 DNA 단편 (예컨대 폴리펩티드 코딩 영역 및 그와 관련된 프로모터)은 "작동가능하게 회합"된다. 따라서, 프로모터가 그 핵산의 전사를 수행할 수 있다면, 프로모터 영역은 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산과 작동적으로 회합될 것이다. 프로모터는 소정의 세포에서 DNA의 실질적인 전사를 지시하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외에, 다른 전사 제어 요소, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 억제자, 및 전사 종결 신호는 세포-특이적 전사를 유도하기 위해 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 회합될 수 있다.
다양한 전사 조절 영역은 당업자에게 알려져 있다. 이들은 비제한적으로, 척추동물 세포에서 기능하는 전사 조절 영역, 예컨대, 비제한적으로, 사이토메갈로바이러스 (인트론-A와 공조한 즉각적인 초기 프로모터), 유인원 바이러스 40 (초기 프로모터), 및 레트로바이러스 (예컨대 루 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 증진제 세그먼트를 포함한다. 다른 전사 조절 영역은 척추동물 유전자로부터 유래된 것 예컨대 액틴, 열충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈, 뿐만 아니라 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가의 적합한 전사 조절 영역은 조직-특이적 프로모터 및 증진제뿐만 아니라 림포카인-유도성 프로모터 (예를 들어, 인터페론 또는 인터류킨에 의해 유도되는 프로모터)를 포함한다.
유사하게, 다양한 번역 조절 요소는 당업자에게 알려져 있다. 이들은 비제한적으로 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 피코나바이러스 (특히 내부 리보솜 유입 부위, 또는 IRES, 이는 CITE 서열로도 지칭됨)로부터 유래된 요소를 포함한다.
다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA, 또는 리보솜 RNA 형태의 RNA일 수 있다.
폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 분비 또는 신호 펩티드를 인코딩하는 추가의 코딩 영역과 회합될 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은 거친 내혈징 망을 가로질러 성장하는 단백질 사슬의 배출이 개시되면 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 펩티드 또는 분비 선도 서열을 갖는다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드가 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드를 가질 수 있고, 이는 완전한 또는 "전장" 폴리펩티드로부터 절단되어 분비된 또는 "성숙" 형태의 폴리펩티드를 생성한다는 것을 알고 있다. 특정 구현예에서, 천연 신호 펩티드, 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드가 사용되거나, 이와 작동가능하게 회합된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 능력을 보유하는 상기 서열의 기능적 유도체가 사용된다. 대안적으로, 이종성 포유동물 신호 펩티드, 또는 이의 기능적 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 선도 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 선도 서열로 치환될 수 있다.
특정 결합 분자, 또는 결합 -파트너-결합 단편, 변이체, 또는 그의 유도체가 본원에 개시되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합 분자"는 가장 넓은 의미로 "결합 파트너" 표적 또는 분자 결정인자, 또는 2개 이상의 "결합 파트너" 표적 또는 분자 결정인자에 특이적으로 결합하는 "결합 폴리펩티드," 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 "결합 폴리펩티드를 포함하는 분자를 지칭한다. 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 결합 분자는 본원에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 "결합 폴리펩티드" 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 결합 분자의 비-제한적인 예는 항원-특이적 결합을 보유하는 항체 또는 그의 단편이다. 그러나 본 개시내용의 특정 구현예에 따르면, 결합 분자의 하나 이상의 "결합 폴리펩티드"는 항체 또는 항체로부터 유래된 항원-결합 도메인은 아니다. 즉, 결합 폴리펩티드는 항체 분자의 항원-결합 도메인 예를 들어, VH 및/또는 VL을 포함하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합 폴리펩티드"는 결합 파트너, 예를 들어 세포의 표면 상에 발현된 수용체에 특이적으로 결합하기에 충분한, IgM 또는 IgA 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편에 대해 N-말단에 위치한 결합 분자의 영역을 지칭하거나, 또는 결합 폴리펩티드가 리간드 결합 파트너와 특이적으로 결합하기 충분한 부분인 수용체 엑토도메인을 포함하는 경우이다. 예를 들어, 수용체 PD-1에 특이적으로 결합하는 리간드, 예컨대 PD-L1, 또는 그의 수용체-결합 단편은 본원에 정의된 "결합 폴리펩티드"인 반면, PD-1은, 세포 상에서 발현되는 "결합 파트너"로서 PD-L1에 대해 정의되는데, 이는 PD-L1 결합 폴리펩티드가 결합하는 것이다.
본원에 사용된 용어 "면역글로불린"은 면역글로불린 분자이거나 이로부터 유래된 폴리펩티드를 지칭하고, 본원에 제공된 결합 분자의 일부를 포함한다. 본 개시내용은 항체의 전형적인 항체 항원-결합 도메인을 포함하지 않지만 본원에 제공된 결합 분자가 이량체, 오량체 또는 육량체로 용이하게 다량체화되도록 하는 특정 면역글로불린 불변 영역 도메인을 포함한다는 점에서 전통적인 "항체"가 아닌 결합 분자를 제공한다. 척추동물 시스템에서 기본적인 면역글로불린 구조는 비교적 잘 이해된다. (예를 들어, Harlow 등, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988을 참조한다).
아래에 더 상세히 논의된 바와 같이, 용어 "면역글로불린"은 생화학적으로 구별될 수 있는 다양한 넓은 부류의 폴리펩티드를 포함한다. 면역글로불린 폴리펩티드의 하위세트만이 다량체화되는 능력을 갖는다. 중쇄는 이들 중 일부 서브클래스 (예를 들어, γ1-γ4 또는 α1-α2))를 갖는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론, (γ, μ, α, δ, ε)로서 분류됨을 당업자는 인정할 것이다. IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE, 각각으로서 항체의 "아이소타입"을 결정하는 이러한 사슬의 특성이다. 면역글로불린 서브클래스 (아형) 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2는, 잘 특성화되고 기능적 특수화를 부여하는 것으로 알려져 있다. 각각의 이들 면역글로불린의 변형된 버전은 본 개시내용의 관점에서 당업자에게 쉽게 식별할 수 있고, 따라서 본 개시내용의 범위 내에 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 변형된 인간 IgM 불변 영역을 제공한다.
경쇄 카파 또는 람다(κ, λ)로 분류되고, 본원에 제공된 결합 분자에서 선택적이거나 불필요하다. 각각의 중쇄 부류는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수 있다. 일반적으로, 존재하는 경우 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되고, 2개의 중쇄의 "테일(tail)" 부분은 면역글로불린이 발현되는 경우 공유 디설파이드 결합 또는 비공유 결합에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 배열의 포크형 말단의 N-말단으로부터 각 사슬의 하단의 C-말단으로 이어진다. 본원에 제공된 다량체 결합 분자의 기본 서브유닛 구조, 예를 들어 결합 폴리펩티드의 C-말단에 각각 융합된 2개의 IgM 중쇄는 디술피드 결합을 통해 공유적으로 연결되어 "Y" 구조를 형성하는 2개의 중쇄 서브유닛을 포함하며, 이는 본원에서 "결합 단위"로도 지칭된다.
용어 "결합 단위"는 표준 면역글로불린 구조에 대응하는 결합 분자, 예를 들어, 항체-유사 분자, 및 표준 "H2L2" 면역글로불린 구조, 즉, 2개의 경쇄 또는 이의 단편을 추가로 포함할 수 있는 2개의 중쇄 또는 이의 단편에 대응하는 항체-유래 분자, 이의 결합 파트너-결합 단편, 또는 이의 다량체화 단편의 일부를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 특정 구현예에서, 예를 들어 결합 분자가 IgG 면역글로불린인 경우, 용어 "결합 분자" 및 "결합 단위"는 동등하다. 다른 구현예에서, 예를 들어, 결합 분자가 다량체, 예를 들면, 이량체 IgA 면역글로불린 유래 분자, 오량체 IgM 면역글로불린 유래의 분자, 또는 육량체 IgM 면역글로불린 유래의 분자의 경우, 결합 분자는 2, 4, 또는 5개의 "결합 단위"를 포함한다. 결합 단위는 전장 면역글로불린 중쇄를 포함할 필요는 없지만, 본원에 제공된 다량체 결합 분자에서, 각각의 결합 단위는 다량체화를 허용하기에 충분한 부분의 IgA 또는 IgM 면역글로불린 불변 영역 ("다량체화 단편")을 포함할 것이다. 본 개시내용에 제공된 특정 IgM-유래 결합 분자는 오량체 또는 육량체이고, IgM 불변 영역, 예를 들어 변형된 인간 IgM 가변 영역, 또는 "그의 다량체화 단편", 즉 IgM 불변 영역의 적어도 Cμ4 및 테일피스 영역을 포함하는 5 또는 6개의 2가 결합 단위를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 2개 이상의 결합 단위, 예를 들어 2, 5 또는 6개의 결합 단위를 포함하는 결합 분자는 "다량체"로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "J-사슬"은 임의의 동물 종의 천연 서열 IgM 또는 IgA 항체의 J-사슬, 그의 임의의 기능적 단편, 그의 유도체, 및/또는 그의 변이체를 지칭하며, 이는 본원에 서열번호: 15로서 제공된 성숙 인간 J-사슬 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 J-사슬 변이체 및 변형된 J-사슬 유도체가 본원에 개시된다. 당업자가 인식할 바와 같이, "기능적 단편" 또는 "기능성 변이체"는 IgM 중쇄 불변 영역과 회합하여 오량체 IgM-유래 결합 분자 또는 이량체성 IgA 결합 분자를 형성할 수 있고/있거나 세포 상의 특정 면역글로불린 수용체, 예컨대 중합체성 Ig 수용체(PIgR)와 회합할 수 있는 단편 및 변이체를 포함한다.
용어 "변이체 J-사슬"은 폴리펩티드의 물리적 또는 생리학적 특성을 변화시키는 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 J-사슬을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, J-사슬의 글리코실화 패턴을 변경시키거나, 변이체 J-사슬을 포함하는 IgM 결합 분자의 혈청 반감기를 증가시키는 특정 변이체 J-사슬 아미노산 서열이 본원에 제공된다. 예시적인 변형 J-사슬이 예를 들어 PCT 공개 번호 WO2019/169314에서 제공되며, 그 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
용어 "변형된 J-사슬"은 본원에서 천연 서열 내로 도입된 이종성 모이어티, 예를 들어 이종성 폴리펩티드, 예컨대 외래 결합 도메인을 포함하는 J-사슬 폴리펩티드를 지칭하기 위해 사용된다. 도입은 이종성 폴리펩티드 또는 다른 모이어티의 직접 또는 간접 융합을 포함하는 임의의 수단에 의해 또는 펩티드 또는 화학적 링커를 통한 부착에 의해 달성될 수 있다. 용어 "변형된 인간 J-사슬"은, 비제한적으로, 이종성 모이어티, 예를 들어, 이종성 폴리펩타이드, 예를 들면, 외래 결합 도메인의 첨가에 의해 변형된 서열번호: 15의 아미노산 서열의 천연 서열 성숙 인간 J-사슬 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 이종성 모이어티는 오량체로의 IgM의 효율적인 중합 및 이러한 중합체의 표적에의 결합을 방해하지 않는다. 예시적인 변형된 J-사슬은 예를 들어, 미국 특허 번호 9,951,134 및 10,400,038, 미국 특허 출원 공개 번호 US-2019-0185570 및 US-2018-0265596에서 발견될 수 있고(이들 각각은 그 전체가 본원에 인용되어 포함됨).
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "IgM-유래된 결합 분자"는 천연 IgM 항체, IgM-유사 항체, 뿐만 아니라 비-항체 결합 및/또는 기능적 도메인을 항체 항원 결합 도메인 또는 그의 서브유닛, 및 임의의 단편 예를 들어, 다량체화 단편, 변이체, 또는 그의 유도체 대신에 포함하는 다른 IgM-유래된 결합 분자를 집합적으로 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "IgM-유사 결합 분자"는 일반적으로 육량체를 형성하거나, J-사슬과 함께 오량체를 형성하는 능력을 여전히 보유하는 변이체 항체-유래 결합 분자를 지칭한다. IgM 유사 결합 분자 또는 다른 IgM 유래 결합 분자는 전형적으로 IgM 불변 영역의 적어도 Cμ4-tp 도메인을 포함하지만, 동일한 종 또는 상이한 종으로부터의 다른 항체 아이소타입, 예를 들어 IgG로부터의 중쇄 불변 영역 도메인을 포함할 수 있다. IgM 유사 결합 분자 또는 다른 IgM 유래 결합 분자는 마찬가지로 IgM 유사한 항체가 육량체 및/또는 오량체를 형성할 수 있는 한, 하나 이상의 불변 영역 도메인이 결실된 단편일 수 있다. 따라서, IgM-유사 결합 분자 또는 다른 IgM-유래된 결합 분자는 예를 들어, 하이브리드 IgM/IgG 항체일 수 있거나 IgM-유래된 결합 분자의 "다량체화 단편"일 수 있다.
용어들 "원자가," "2가," "다가" 및 문법적 당량은, 본원에 제공된 주어진 결합 분자 또는 결합 단위에서 결합 폴리펩티드 도메인의 수를 지칭한다. 이와 같이, 주어진 결합 분자, 예를 들어 IgM-유래 결합 분자 또는 그의 단편과 관련하여 용어 "2가", "4가" 및 "6가"는 각각 2개의 결합 폴리펩티드, 4개 결합 폴리펩티드 및 6개 결합 폴리펩티드의 존재를 나타낸다. 각각의 결합 단위가 2가인 전형적인 IgM-유래 결합 분자에서, 결합 분자 자체는 10 또는 12개의 원자가를 가질 수 있다. 2가 또는 다가 결합 분자는 단일특이적일 수 있고, 즉, 모든 결합 폴리펩티드는 동일하거나, 또는 이중특이적 또는 다중특이적일 수 있고, 예를 들어, 2개 이상의 결합 폴리펩티드가 상이하거나, 예컨대, 동일한 결합 파트너 상의 상이한 에피토프에 결합하거나, 완전히 상이한 결합 파트너에 결합할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 본원에 정의된 결합 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 파트너 상의 임의의 분자 결정기를 포함한다. 특정 구현예에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹을 포함할 수 있고, 특정 실시양형에서 3차원 구조 특성 및/또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다.
용어 "결합 파트너"는 가장 넓은 의미로 본원에 제공된 결합 폴리펩티드의 표적인 것으로 사용되고 본원에 제공된 결합 분자에 의해 결합될 수 있는 물질을 포함한다. 결합 파트너는 예를 들어, 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 또는 다른 분자일 수 있다. 특정 구현예에서 결합 파트너는 수용체 또는 세포의 표면 상에서 발현되거나 존재하는 다른 모이어티이다. 다른 구현예에서, 결합 폴리펩티드가 수용체 엑토도메인인 경우, 결합 파트너는 가용성 또는 세포-결합된 리간드, 또는 그의 수용체 결합 단편일 수 있다. 또한, "결합 파트너"는 예를 들어, 세포, 기관, 또는 유기체 예를 들어, 동물, 식물, 미생물, 또는 바이러스일 수 있고, 이는 결합 분자 또는 본원에 제공된 결합 폴리펩티드에 의해 결합될 수 있는 에피토프를 포함한다.
면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 모두는 구조 및 기능적 상동성의 영역 또는 "도메인"으로 나누어진다. 예를 들어, IgM 중쇄의 불변 영역 도메인(예를 들어, CH1 또는 Cμ1, CH2 또는 Cμ2, CH3 또는 Cμ3, CH4 또는 Cμ4, 또는 테일피스)은 생물학적 특성, 예컨대 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합, 다량체화 능력 등을 부여한다. 관례상, 불변 영역 도메인의 넘버링은 이들이 전형적인 면역글로불린의 아미노-말단으로부터 더욱 원위가 됨에 따라 증가한다.
인간 IgM 불변 도메인에 대한 카밧 넘버링 시스템은 문헌[Kabat, 등 "Tabulation and Analysis of Amino acid and nucleic acid Sequences of Precursors, V-Regions, C-Regions, J-Chain, T-Cell Receptors for Antigen, T-Cell Surface Antigens, β-2 Microglobulins, Major Histocompatibility Antigens, Thy-1, Complement, C-Reactive Protein, Thymopoietin, Integrins, Post-gamma Globulin, α-2 Macroglobulins, and Other Related Proteins," U.S. Dept. of Health and Human Services (1991)]에서 발견될 수 있다. IgM 불변 영역은 순차적으로 (즉, 즉 불변 영역의 제1 아미노산으로 출발하는 아미노산 #1로, 또는 카밧 넘버링 스킴을 사용하여) 넘버링될 수 있다. 인간 IgM 불변 영역의 2개의 대립유전자의 넘버링을 순차적으로 (본원에서 서열번호: 1 (대립유전자 IGHM*03) 및 서열번호: 60 (대립유전자 IGHM*04)로 제시됨) 및 카바트 시스템에 의해 비교하는 것이 하기에 제시된다. IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편을 포함하는 본원에 제공된 각각의 서열에서, 임의의 대립유전자는 대립유전자 IGHM*03을 대체할 수 있으며, 이는 예를 들어 서열번호 2 내지 4 및 11에 제시된다. 밑줄친 아미노산 잔기는 카밧 시스템(Kabat system)에서 고려되지 않는다(아래에 이중 밑줄 친 "X"는 세린(S)(서열번호: 1) 또는 글리신(G)(서열번호: 60)일 수 있다):
IgM 중쇄에 대한 순차적인(서열번호: 1 또는 서열번호: 60)/카밧 넘버링 키(key)
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"특이적으로 결합한다"는 일반적으로 본원에 제공된 결합 분자가 결합 폴리펩티드를 통해 결합 파트너 상의 에피토프에 결합하고, 결합이 결합 폴리펩티드와 결합 파트너 사이에 일부 상보성을 수반하는 것을 의미한다. 이러한 정의에 따르면, 결합 분자는 무작위의 관련되지 않은 결합 파트너에 결합하는 것보다 더 쉽게 그의 결합 폴리펩티드를 통해, 결합 파트너와 결합할 때 결합 파트너에 "특이적으로 결합"하는 것으로 언급된다. 용어 "특이성"은 본원에서 특정 결합 분자가 특정 결합 파트너에 결합하는 상대 친화도를 평가하기 위해 사용된다. 예를 들어, 결합 분자 "A"는 주어진 결합 파트너에 대해 결합 분자 "B"보다 더 높은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수 있거나, 또는 결합 분자 "A"는 관련된 결합 파트너 "D"에 대해 갖는 것보다 더 높은 특이성으로 결합 파트너 "C"에 결합하는 것으로 언급될 수 있다.
본원에 제공된 결합 분자는 조류 및 포유동물을 포함하는 임의의 동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 결합 분자는 인간, 뮤린, 당나귀, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 라마(llama), 말, 또는 닭 결합 분자일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "중쇄 서브유닛"은 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 서브유닛을 포함하는 본원에 제공된 결합 분자는 은 하기 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: CH1 도메인, 힌지 (예를 들어, 상부, 중간, 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, CH4 도메인, 테일피스, 또는 변이체 또는 그의 단편, 단, 생성된 결합 분자는 다량체화될 수 있다. 예를 들어, 결합 분자, 또는 단편 예를 들어, 다량체화 단편, 변이체, 또는 그의 유도체는 비제한적으로 CH1 도메인; CH1 도메인, 힌지, 및 CH2 도메인; CH1 도메인 및 CH3 도메인; CH1 도메인, 힌지, 및 CH3 도메인; 또는 CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서 결합 분자 또는 단편 예를 들어, 다량체화 단편, 변이체, 또는 그의 유도체는 CH3 도메인 및 CH4 도메인; 또는 CH3 도메인, CH4 도메인, 및 J-사슬을 포함할 수 있다. 또한, 결합 분자는 특정 불변 영역 부분, 예를 들어, CH2 도메인의 전부 또는 일부가 결여될 수 있다. 당업자는 이들 도메인(예를 들어, 중쇄 서브유닛)이 원래 면역글로불린 분자로부터의 아미노산 서열이 변하도록 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 본 개시내용의 구현예에 따르면, 본원에 제공된 IgM 항체, IgM-유사 항체, 또는 다른 IgM-유래된 결합 분자는, IgM 항체, IgM-유사 항체, 또는 다른 IgM-유래된 결합 분자가 다량체 예를 들어, 육량체 또는 오량체를 형성하도록 IgM 중쇄 불변 영역의 충분한 부분을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이 그와 같은 단편은 "다량체화 단편"을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "경쇄 서브유닛"은 면역글로불린 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 경쇄 서브유닛은 CL (예를 들어, Cκ 또는 Cλ) 도메인을 포함한다.
본원에 제공된 결합 분자는 이들이 인식하거나 특이적으로 결합하는 결합 파트너(들)의 관점에서 기재되거나 명시될 수 있다. 결합 파트너는 단일 에피토프 또는 적어도 2개의 에피토프를 포함할 수 있고, 결합 파트너의 크기, 형태, 및 유형에 따라 임의의 수의 에피토프를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "디설파이드 결합"은 예를 들어 폴리펩티드의 시스테인 잔기에서 2개의 황 원자 사이에 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 제2 티올기와 디설파이드 결합 또는 가교를 형성할 수 있는 티올기를 포함한다. 디설파이드 결합은 "사슬내", 즉 단일 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 서브유닛 내의 시스테인 잔기에 연결될 수 있거나, 또는 "사슬간", 예컨대 항체 중쇄 및 항체 경쇄, 2개의 항체 중쇄, 또는 IgM 또는 IgA 항체 중쇄 불변 영역 및 J-사슬과 같은 2개의 별개의 폴리펩티드 서브유닛을 연결할 수 있다.
용어 "다중특이적 결합 분자 예를 들어, "이중특이적 결합 분자"는 2개 이상의 상이한 결합 파트너, 또는 단일 결합 파트너의 상이한 에피토프에 결합하는 결합 폴리펩티드를 갖는 본원에 제공된 결합 분자를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합" 또는 다른 문법적 등가물은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이들 용어는 화학적 접합 또는 재조합 수단을 포함하는 어떠한 수단에 의해서도 둘 이상의 요소 또는 성분을 함께 결합시키는 것을 지칭한다. "프레임내 융합"은 원래의 ORF의 번역 해독틀을 유지하는 방식으로, 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 열린 해독틀(ORF)을 연결하여 연속적인 더 긴 ORF를 형성하는 것을 지칭한다. 따라서, 재조합 융합 단백질은 원래의 ORF에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 상응하는 2개 이상의 분절을 함유하는 단일 단백질이다(이 세그먼트는 천연적으로 그렇게 결합되지 않는다). 해독틀이 따라서 융합된 세그먼트 전체에 걸쳐 연속적으로 제조되지만, 세그먼트는 예를 들어 인-프레임 링커 서열에 의해 물리적으로 또는 공간적으로 분리될 수 있다.
폴리펩티드의 문맥에서, "선형 서열" 또는 "서열"은 서열에서 서로 이웃하는 아미노산이 폴리펩티드의 일차 구조에서 인접하는 아미노에서 카르복실 말단 방향으로 폴리펩티드 내의 아미노산의 순서이다. 폴리펩티드의 다른 부분에 "아미노-말단" 또는 "N-말단"인 폴리펩티드의 부분은 순차적인 폴리펩티드 사슬에서 더 일찍 나오는 부분이다. 유사하게, 폴리펩티드의 다른 부분에 대한 "카르복시-말단" 또는 "C-말단"인 폴리펩티드의 부분은 순차적인 폴리펩티드 사슬에서 나중에 오는 부분이다. 예를 들어, 본원에 제공된 전형적인 결합 분자에서, 결합 폴리펩티드는 면역글로불린 불변 영역에 "N-말단"이고, 불변 영역은 결합 폴리펩티드에 "C-말단"이다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 유전자가 생화학적, 예를 들어 폴리펩티드를 생성하는 과정을 지칭한다. 상기 방법은 비제한적으로 유전자 녹다운 뿐만 아니라 일시적 발현 및 안정한 발현 둘 다를 포함하는 세포 내 유전자의 기능적 존재의 임의의 징후를 포함한다. 이는 비제한적으로 RNA, 예를 들어 메신저 RNA (mRNA)로의 유전자의 전사, 및 폴리펩티드(들)로의 이러한 mRNA의 번역을 포함한다. 최종 목적 생성물이 생화학적인 경우, 발현은 생화학적 및 임의의 전구체의 생성을 포함한다. 유전자의 발현은 "유전자 산물"을 생성한다. 본원에 사용된 바와 같이, 유전자 산물은 핵산, 예를 들어 유전자의 전사에 의해 생성된 메신저 RNA, 또는 전사체로부터 번역되는 폴리펩티드일 수 있다. 본 명세서에 기재된 유전자 산물은 전사후 변형을 갖는 핵산, 예를 들어 폴리아데닐화, 또는 번역후 변경을 갖는 폴리펩티드, 예컨대 메틸화, 글리코실화, 지질의 첨가, 다른 단백질 서브유닛과의 회합, 단백질분해 절단 등을 추가로 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "신호 전달" 또는 "세포 신호전달"은 예를 들어, 세포의 표면 상에 발현된 수용체에 대한 리간드의 결합을 통해, 세포의 외부로부터 세포의 내부로의 분자 또는 생화학적 신호의 전달을 지칭한다. 신호는 세포에서의 하나 이상의 생화학적 사건, 예를 들어 다양한 단백질 키나제에 의한 단백질 인산화를 통해 전달될 수 있고, 궁극적으로 세포 활성화 (예를 들어, 사이토카인의 생성), 세포 증식, 아폽토시스, 또는 형태형성과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 세포 반응을 초래한다. 예를 들어, 리간드가 세포의 표면 상에 노출된 수용체의 부분과 접촉하는 경우, 생화학적 캐스케이드가 세포에서 수용체의 세포내 부분을 통해 개시되어, 예를 들어 유전자의 전사 또는 번역, 또는 유전자 생성물, 단백질의 번역후 변형 또는 형태 변화, 또는 단백질의 전좌를 초래한다. 예를 들어, 문헌[Bradshaw, Ralph A.; Dennis, Edward A., eds. (2010). Handbook of Cell Signaling (2nd ed.). Amsterdam, Netherlands: Academic Press]를 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 신호 전달의 "조절"은 정상적인 신호 전달에 영향을 미치는 임의의 개입, 예를 들어, 신호 전달을 향상시키고, 신호 전달이 정상적으로 차단되는 신호 전달을 개시하거나, 신호 변환을 억제 또는 지연시키거나, 또는 신호 변환이 정상적으로 활성인 신호 전달을 차단하는 개입을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 신호 전달 경로의 "효능제"는 신호 전달을 강화시키거나 또는 신호 전달을 개시하고, 여기서 신호 전달은 정상적으로 차단되고, 신호 변환의 "길항제"가 신호 전달을 억제하거나 차단한다. 신호 전달 작용제는 전형적으로 예를 들어, 천연 리간드가 작용할 만큼 세포의 표면 상의 수용체와 상호작용함으로써 신호 전달 경로 상에 직접 작용한다. 신호 전달의 길항제는 신호 전달 경로에 직접 작용할 수 있거나, 예를 들어 수용체가 그의 천연 리간드에 결합하는 것을 차단함으로써, 또는 예를 들어 리간드가 그의 수용체(예를 들어, "유인 수용체" 또는 "수용체 엑토도메인")에 결합하고 그에 의해 그의 수용체에 결합하는 것이 전환됨으로써, 또는 신호 전달이 더 이상 일어나지 않도록 리간드 또는 수용체 결합 도메인을 알로스테릭하게 변경함으로써 간접적으로 작용할 수 있다.
용어, 예컨대 "치료하는" 또는 "치료", "치료하기 위해", 또는 "완화하는" 또는 "완화시키기 위해"는 장애 또는 병적 상태를 갖는 대상체에서 기존의 진단된 병적 상태 또는 장애의 치유, 둔화, 증상 감소, 및/또는 진행을 중단 또는 둔화시키는 치료적 조치를 지칭한다. "예방하다", "예방", "피하다", "억제" 등과 같은 용어는 진단되지 않은 표적화된 병리학적 상태 또는 장애의 발생을 예방하는 예방 또는 예방 조치를 지칭한다. 따라서, "치료를 필요로 하는 대상체"는 장애로 이미 진단된 대상체; 장애를 갖기 쉬운 대상체; 및 장애가 예방되어야 하는 대상체를 포함할 수 있다.
"대상체" 또는 "개체", "동물", 또는 "환자" 및 "포유동물"은 진단, 예후 또는 치료가 요구되는 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체 또는 인간 대상체를 의미한다. 포유류 대상체는 인간, 가축, 농장 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물 예컨대 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 돼지, 소, 곰, 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 어구, 예컨대 "치료로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체" 및 "치료를 필요로 하는 동물"은 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는, 본원에 제공된 결합 분자의 투여로부터 이익을 얻는 대상체, 예컨대 포유동물 대상체를 포함한다. 이러한 결합 분자, 예를 들어 항체는 예를 들어 진단 절차 및/또는 질환의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "혈청 반감기" 또는 "혈장 반감기"는 본원에 제공된 약물, 예를 들어 다량체 결합 분자의 혈청 또는 혈장 농도가 50% 감소되는데 걸리는 시간 (예를 들어, 분, 시간 또는 일)을 지칭한다. 2개의 반감기가 설명될 수 있다: 알파 반감기, α 반감기, 또는 t1/2α (이는 중앙 구획, 예를 들어 정맥내 전달의 경우 혈액으로부터 주변 구획 (예를 들어, 조직 또는 기관)으로의 약물 재분배 과정으로 인한 혈장 농도의 감소 속도임), 및 베타 반감기, β 반감기, 또는 t1/2β (이는 배설 또는 대사 과정에서 인한 감소 속도이다).
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "혈장 약물 농도-시간 곡선 하의 면적" 또는 "AUC"는 약물의 용량의 투여 후 약물에 대한 실제 신체 노출을 반영하고 mg*h/L로 표현된다. 곡선 하의 이 면적은 시간 0(t0)으로부터 무한대(∞)까지 측정되고, 신체로부터 약물의 제거 속도 및 투여되는 용량에 의존한다. 본원에 사용된 용어 "평균 체류 시간" 또는 "MRT"는 약물이 신체에 남아있는 시간의 평균 길이를 지칭한다.
다량체 결합 분자
본 개시내용은 2개 이상 예를 들어, 2, 5, 또는 6개의 2가 결합 단위 또는 그의 변이체 또는 단편을 포함하는 다량체 결합 분자를 제공하고, 다량체 결합 분자의 각각의 결합 단위는 2개의 IgA 또는 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체를 포함하고, IgA 또는 IgM 불변 영역 또는 그의 단편의 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12개, 또는 특정 구현예에서 각각의 IgA 또는 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편은 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드 또는 그의 단편에 융합된다. 예시적인 결합 폴리펩티드 및 결합 파트너는 본원의 다른 곳에 기재되어 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 결합 분자의 일부인 결합 폴리펩티드 또는 그의 단편은 항체, 항체의 항원-결합 단편, 또는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편의 변이체 또는 유도체가 아니다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 결합 분자에 포함된 결합 폴리펩티드의 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11 또는 12개는 동일한 결합 파트너에 결합된다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 결합 분자에 포함된 결합 폴리펩티드의 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11 또는 12개는 동일하다. 본 개시내용에 제공된 예시적인 육량체 및 오량체 IgM-유래된 결합 분자의 구조는 도 1a 및 도 1b에 도시되어 있다.
본원에 제공된 다량체 결합 분자는, 특정 구현예에서, 세포, 예를 들어, 전형적으로 결합 폴리펩티드를 그의 표면 상에서 발현하는 세포 또는 전형적으로 결합 파트너를 그의 표면 상에 발현하는 세포에서 신호 전달을 조절할 수 있다. "신호 전달 조절"은 세포에서의 신호 전달에 영향을 주고, 예를 들어, 신호 전달 경로가 현재 비활성인 세포에서 신호 전달을 개시하고, 활성이지만 보다 낮은 수준으로 존재하는 경로에서 신호 전달 활성을 증가시키거나, 신호 변환 경로를 차단 또는 억제하거나, 활성 신호 전달 경로의 활성 수준을 감소시키는 것을 의미한다. 신호 전달의 조절은 일부 경우에 직접적일 수 있으며, 예를 들어 결합 분자가 세포의 표면 상의 결합 파트너에 직접 결합하여, 그 결합 파트너를 통한 신호 전달에 영향을 미친다. 신호 전달의 조절은 일부 경우에 간접적일 수 있으며, 예를 들어 결합 분자는 신호 전달 경로가 영향을 받는 세포에 직접 결합하지 않지만, 신호 전달 경로의 일부로서 세포에 결합하는 모이어티에 결합한다. 따라서, 결합 분자는 그 모이어티가 세포에 결합하는 것을 방지하거나 세포에 결합하는 데 이용가능한 그 모이어티의 농도를 감소시킴으로써 신호 전달에 간접적으로 영향을 미칠 수 있다. 세포에서 특정 신호 전달 경로의 활성을 개시 또는 증가시키는 본원에 제공된 다량체 결합 분자는 그 경로의 "효능제"이다. 신호 전달 경로의 활성을 감소시키거나 신호 전달 경로를 차단하는 본원에 제공된 다량체 결합 분자는 그 신호 전달 경로에 대한 "길항제"이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 다량체 결합 분자는 modulate 단량체성 또는을 포함하는 이량체성 결합 분자이다 동일한 결합 파트너에 결합하는 1개 또는 2개의 결합 폴리펩티드 예를 들어, 동일한 결합 폴리펩티드의 2개의 카피 중 1개의 당량보다 더 높은 효능으로 세포의 신호 전달을 조절할 수 있다.
특정 구현예에서, 이의 예는 본원에 제공되며, 결합 파트너는 세포의 표면 상에서 발현되고, 상기 결합 파트너에 대한 결합 폴리펩티드의 결합은 상기 세포에서 신호 전달을 조절한다. 예를 들어, 결합 폴리펩티드는 리간드 또는 리간드의 수용체 결합 단편일 수 있고, 결합 파트너는 세포의 표면 상에 발현된 수용체일 수 있으며, 여기서 리간드 및 수용체의 결합은 예를 들어 수용체를 통한 신호 전달을 유도, 증가, 억제 또는 차단할 수 있다. 다른 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 예를 들어, 사이토카인 또는 그의 수용체 결합 단편, 성장 인자 또는 그의 수용체 결합 단편, 신경전달물질 또는 그의 수용체 결합 단편, 펩티드 또는 단백질 호르몬 또는 그의 수용체 결합 단편, 면역 체크포인트 조절제 리간드 또는 그의 수용체 결합 단편, 또는 세포외 기질 단백질의 수용체 결합 단편일 수 있다. 특정 구현예에서 결합 분자의 결합 폴리펩티드의 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11 또는 12는 세포의 동일한 결합 파트너를 통한 신호 전달에 결합하고 이를 조절한다. 특정 구현예에서 결합 분자의 결합 폴리펩티드의 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11 또는 12는 동일하다. 특정 구현예에서, 결합 분자와 세포 상의 결합 파트너의 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 카피와의 접촉은 예를 들어, 동일한 결합 파트너에 결합하는 1개 또는 2개의 결합 폴리펩티드만을 갖는 1가 또는 2가 결합 분자의 당량보다 더 높은 효능으로 세포에서 신호 전달을 유도, 증가, 억제 또는 차단할 수 있다.
특정 구현예에서, 이의 예는 본원에 제공되며, 결합 분자의 결합 폴리펩티드의 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11 또는 12는 리간드 또는 그의 수용체 결합 단편을 포함하는 결합 파트너에 특이적으로 결합할 수 있는 수용체 엑토도메인을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "수용체 엑토도메인"은 세포외로 노출되는 세포 상에서 전형적으로 발현되는 수용체의 일부를 지칭한다. "수용체 엑토도메인"은 수용체 단백질의 막관통 또는 세포내 부분을 포함하지 않을 것이다. 이들 실시양태에 따르면, 결합 파트너는 예를 들어 세포의 표면 상에서 발현되는 세포와 회합될 수 있거나, 세포외 모이어티 또는 세포-연관 모이어티의 가용성 단편일 수 있다. 특정 구현예에서, 수용체 엑토도메인은 항체 또는 항체의 항원-결합 단편이 아니다. 또한, 이들 구현예에 따르면, 리간드 또는 이의 단편에 대한 수용체 엑토도메인의 결합은 전형적으로 간접적으로 수용체를 발현하는 세포에서 신호 전달을 조절할 수 있다. 예를 들어, 결합 분자의 수용체 엑토도메인의 각각의 리간드 또는 그의 단편에의 결합은 리간드가 세포-발현된 수용체와 회합하는 것을 경쟁적으로 억제할 수 있고, 이에 의해 세포에서의 신호 전달을 억제한다. 경쟁적 저해는 예를 들어, 리간드 결합에 대한 증가된 친화도를 통해, 세포-발현된 수용체의 수에 비해 증가된 양의 수용체 엑토도메인을 통해, 또는 이들의 조합을 통해 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 수용체 엑토도메인의 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11 또는 12개는 동일한 리간드에 결합한다. 특정 구현예에서, 상기 수용체 엑토도메인의 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11 또는 12개는 동일하다. 특정 구현예에서, 결합 분자의 수용체 엑토도메인과 그의 각각의 리간드 또는 그의 단편의 접촉은, 예를 들어, 동일한 리간드에 결합하는 1 또는 2개의 수용체 액토도메인만을 갖는 1가 또는 2가 결합 분자의 당량보다 더 높은 효능으로 수용체를 발현하는 세포에서 신호 전달을 억제 또는 차단할 수 있다. 결합 폴리펩티드가 수용체 엑토도메인인 다량체 결합 분자의 개략도가 도 2에 제시된다.
IgM-유래된 다량체 결합 분자
특정 구현예에서, 본 개시내용에 의해 제공된 다량체 결합 분자는 본원에서 기재된 바와 같은 결합 폴리펩티드에 융합된 IgM 중쇄 불변 영역, 또는 그의 다량체화 단편을 포함하는 육량체 또는 오량체 결합 분자이다. 본원에 제공된 바와 같이, IgM-유래된 결합 분자는 다량체 결합 분자의 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편에 N-말단 융합된 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 또는 12개의 결합 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 다량체 결합 분자의 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 또는 12개의 결합 폴리펩티드는 동일한 결합 파트너에 결합된다. 특정 구현예에서, 다량체 결합 분자의 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 또는 12개의 결합 폴리펩티드는 동일하다.
본원에 제공된 2가 IgM-유래된 결합 단위는 2 IgM 중쇄 불변 영역을 포함하고, IgM-유래된 결합 분자는 전형적으로 5 또는 6개의 결합 단위를 포함한다. 전장 IgM 중쇄 (μ) 불변 영역은 4개의 불변 영역 도메인, Cμ1 (또한 CM1, CMu1, 또는 CH1로 지칭됨), Cμ2 (또한 CM2, CMu2, 또는 CH2로 지칭됨), Cμ3 (또한 CM3, CMu3, 또는 CH3으로 지칭됨), 및 Cμ4 (또한 CM4, CMu4, 또는 CH4로 지칭됨), 및 "테일피스"(tp)를 포함한다. 인간 IgM 불변 영역은 전형적으로 (예를 들어, 유전자은행 수탁 번호 pir||S37768, CAA47708.1, 및 CAA47714.1, 대립유전자 IGHM*03과 동일한) 아미노산 서열 서열번호: 1 또는 (예를 들어, 유전자은행 수탁 번호 sp|P01871.4, 대립유전자 IGHM*04와 동일한) 서열번호: 60을 포함한다. 인간 Cμ1 도메인은 서열번호: 1 또는 서열번호: 60의 약 아미노산 5에서 약 아미노산 102로 연장되고; 인간 Cμ2 도메인은 서열번호: 1 또는 서열번호: 60의 약 아미노산 114에서 약 아미노산 205로 연장되고, 인간 Cμ3 도메인은 서열번호: 1 또는 서열번호: 60의 약 아미노산 224에서 약 아미노산 319로 연장되고, Cμ 4 도메인은 서열번호: 1 또는 서열번호: 60의 약 아미노산 329에서 약 아미노산 430으로 연장되고, 그리고 테일피스(tp)는 서열번호: 1 또는 서열번호: 60의 약 아미노산 431에서 약 아미노산 453로 연장된다.
5개의 IgM-유래된 결합 단위는 추가의 작은 폴리펩티드 사슬 (J-사슬)와 복합체를 형성하여 IgM 결합 분자를 형성할 수 있다. 전구체 인간 J-사슬은 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함한다.
성숙한 인간 J-사슬은 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함한다. J-사슬 없이, IgM-유래된 결합 단위는 전형적으로 육량체로 조립된다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 오량체 또는 육량체 결합 분자로의 IgM 결합 단위의 조립은 적어도 Cμ4, 및/또는 tp 도메인을 포함하는 것으로 생각된다. 참고 예를 들어, Braathen, R., 등, J. Biol. Chem. 277:42755-42762 (2002). 따라서, 본 개시내용에 제공된 오량체 또는 육량체 결합 분자는 전형적으로 적어도 Cμ4, 및/또는 tp 도메인을 포함하는 IgM 불변 영역을 포함한다.
IgM 중쇄 불변 영역은 추가로 Cμ3 도메인 또는 그의 단편, Cμ2 도메인 또는 그의 단편, Cμ1 도메인 또는 그의 단편, 및/또는 다른 IgM 또는 다른 면역글로불린 중쇄 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 완전한 IgM 중쇄 (μ) 불변 영역 예를 들어, 서열번호: 1 또는 서열번호: 60, 또는 이의 변이체, 유도체, 또는 유사체를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서 본원에 제공된 다량체 결합 분자의 각각의 결합 단위는 2 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체를 포함하고, 이들 각각은 적어도 IgM Cμ4 도메인 및 IgM 테일피스 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서 IgM 중쇄 불변 영역은 각각 추가로 IgM Cμ4 및 IgM 테일피스 도메인에 대해 N-말단에 위치한 IgM Cμ3 도메인을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서 IgM 중쇄 불변 영역은 각각 추가로 IgM Cμ3 도메인에 대해 N-말단에 위치한 IgM Cμ2 도메인을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 예시적인 다량체 결합 분자는 야생형 인간 Cμ2, Cμ3, Cμ4-TP 도메인을 포함하는 서열번호: 3을 포함하는 인간 IgM 불변 영역을 포함한다.
본원에 제공된 특정 IgM-유래된 다량체 결합 분자에서, 각각의 IgM 불변 영역은 IgM Cμ2 도메인 대신에 또는 그것에 추가하여, IgM Cμ3 도메인에 대해 N-말단에 위치한 IgG 힌지 영역 또는 그의 기능적 변이체를 포함할 수 있다. 6번 위치의 시스테인이 세린으로 치환된 예시적인 변이체 인간 IgG1 힌지 영역 아미노산 서열은 VEPKSSDKTHTCPPCPAP (서열번호: 5)이다. 이러한 유형의 예시적인 IgM 불변 영역은 Cμ3, Cμ4, 및 TP 도메인을 포함하는 인간 IgM 불변 영역의 다량체화 단편에 융합된 변이체 인간 IgG1 힌지 영역을 포함하고, 아미노산 서열 서열번호: 6을 포함한다.
감소된 CDC 활성, 변경된 글리코실화, 또는 증가된 혈청 반감기를 갖는 변형된 인간 IgM 불변 영역
특정 구현예에서, 변형된 인간 IgM 불변 영역은, 본원에 제공된 바와 같은 변형된 인간 IgM-유래된 결합 분자의 일부로서 발현될 때, 상응하는 야생형 인간 IgG 불변 영역에 비해, 보체의 존재 하에 세포에 대한 감소된 보체-의존적 세포독성(CDC) 활성을 나타낸다. "상응하는 야생형 인간 IgM 불변 영역"은 CDC 활성에 영향을 미치는 불변 영역에서의 변형 또는 변형들을 제외하고는 변형된 IgM 불변 영역과 동일한 야생형 IgM의 불변 영역을 의미한다. 예를 들어, "상응하는 야생형 인간 IgM 불변 영역"은 동일한 결합 폴리펩티드 및 변형된 인간 IgG 불변이 CDC 활성에 영향을 미치는 변형 이외의 것을 가질 수 있는 임의의 다른 변형 또는 절단에 융합될 것이다. 특정 구현예에서, 변형된 인간 IgM 불변 영역은 예를 들어, 문헌[PCT 공개 번호 WO2018/187702, 이는 그 전체가 참조로 포함됨]에 기재된 야생형 인간 IgM 불변 영역에 대해 예를 들어, Cμ3 도메인에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. CDC를 측정하기 위한 검정은 당업자에게 잘 알려져 있고, 그리고 예시적인 검정은 예를 들어, 문헌[PCT 공개 번호 WO2018/187702]에 기재되어 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 인간 IgM 불변 영역은 서열번호: 1 또는 서열번호: 60의 위치 P311에서 야생형 인간 IgM 불변 영역에 대한 치환을 포함한다. 다른 구현예에서 본원에 제공된 변형된 IgM 불변 영역은 서열번호: 1 또는 서열번호: 60의 위치 P313에서 야생형 인간 IgM 불변 영역에 대한 치환을 함유한다. 다른 구현예에서 본원에 제공된 변형된 IgM 불변 영역은 서열번호: 1 또는 서열번호: 60의 위치 P311 및 서열번호: 1 또는 서열번호: 60의 P313에서 야생형 인간 IgM 불변 영역에 대한 치환의 조합을 함유한다. 서열번호: 1 또는 서열번호: 60의 아미노산 위치 P311에서 변형된 IgM 불변 영역은 알라닌(P311A), 세린(P311S), 또는 글리신(P311G)로 치환될 수 있다. 서열번호: 1 또는 서열번호: 60의 아미노산 위치 P313에서 변형된 IgM 불변 영역은 알라닌(P313A), 세린(P313S), 또는 글리신(P313G)으로 치환될 수 있다. 서열번호: 1 또는 서열번호: 60의 아미노산 위치 P311 및 P313에서 변형된 IgM 불변 영역은 각각 알라닌(P311A) 및 세린(P313S), (서열번호: 2 또는 알라닌, 세린, 및/또는 글리신의 임의의 조합)으로 치환될 수 있다.
일 구현예에서, P311 및/또는 P313 예를 들어, P311A, P311S, P311G, P313A, P313S, 및/또는 P313G 또는 이들의 임의의 조합에서 아미노산 치환을 포함하는 변형된 인간 IgM 불변 영역을 포함하는 본원에 제공된 결합 분자는, 상응하는 야생형 IgM 불변 영역을 포함하는 결합 분자에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%까지 감소된 용량-반응 검정에서 달성된 최대 CDC를 갖는다.
따라서 본 개시내용은 적어도 하나의 결합 단위, 2개 이상의 결합 단위 또는 각각의 결합 단위가 감소된 CDC 활성을 나타내는 2개의 변형된 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체를 포함하는 다량체 IgM-유래된 결합 분자를 제공한다. 특정 구현예에서 변형된 IgM 불변 영역은 IgM Cμ4 도메인 및 IgM 테일피스 도메인을 포함하고, 추가로 변형된 IgM Cμ4 및 IgM 테일피스 도메인에 대해 N-말단에 위치한 IgM Cμ3 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서 IgM 중쇄 불변 영역은 각각 추가로 변형된 IgM Cμ3 도메인에 대해 N-말단에 위치한 IgM Cμ2 도메인을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 예시적인 다량체 결합 분자는 인간 Cμ2 도메인, P311A 및 P313S 돌연변이를 포함하는 변형된 인간 Cμ3 도메인, 및 인간 Cμ4-TP 도메인을 포함하는 서열번호: 4를 포함하는 인간 IgM 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, IgM 중쇄 불변 영역이 아미노산 서열 서열번호: 4를 포함하는 다량체 결합 분자는 IgM 중쇄 불변 영역이 아미노산 서열 서열번호: 3을 포함하는 상응하는 결합 분자에 비해 감소된 CDC 활성을 갖는다.
본원에 제공된 감소된 CDC 활성을 갖는 특정 IgM-유래된 다량체 결합 분자 에서, 각각의 IgM 불변 영역은 IgM Cμ2 도메인 대신에 또는 그것에 추가하여, 변이체 IgM Cμ3 도메인에 대해 N-말단에 위치한 IgG 힌지 영역 또는 그의 기능적 변이체를 포함할 수 있다. 예시적인 변이체 인간 IgG1 힌지 영역 아미노산 서열은 VEPKSSDKTHTCPPCPAP (서열번호: 5)이다. 본원에 제공된 예시적인 다량체 결합 분자는 변형된 인간 IgG1 힌지 영역, P311A 및 P313S 돌연변이를 포함하는 변형된 인간 Cμ3 도메인, 및 인간 Cμ4-TP 도메인을 포함하는 서열번호: 7을 포함하는 인간 IgM 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, IgM 중쇄 불변 영역이 아미노산 서열 서열번호: 7을 포함하는 다량체 결합 분자는 IgM 중쇄 불변 영역이 아미노산 서열 서열번호: 6을 포함하는 상응하는 결합 분자에 비해 감소된 CDC 활성을 갖는다.
특정 본원에 제공된 IgM-유래된 결합 분자는 향상된 혈청 반감기를 갖도록 조작될 수 있다. IgM-유래된 결합 분자의 혈청 반감기를 향상시킬 수 있는 예시적인 IgM 중쇄 불변 영역 돌연변이는 문헌[PCT 공개 번호 WO2019/169314, 그 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨]에 개시되어 있다. 예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 글리코실화 돌연변이 중 하나 이상에 추가하여, 본원에 제공된 IgM-유래된 결합 분자의 변이체 IgM 중쇄 불변 영역은 야생형 인간 IgM 불변 영역(예를 들어, 서열번호: 1 또는 서열번호: 60)의 아미노산 S401, E402, E403, R344, 및/또는 E345에 상응하는 아미노산 위치 에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다. "야생형 인간 IgM 불변 영역의 아미노산 S401, E402, E403, R344, 및/또는 E345에 상응하는 아미노산"이란, 인간 IgM 불변 영역에서 S401, E402, E403, R344, 및/또는 E345와 상동성인 임의의 종의 IgM 불변 영역의 서열에서의 아미노산을 의미한다. 특정 구현예에서, 서열번호: 1 또는 서열번호: 60의 S401, E402, E403, R344, 및/또는 E345에 상응하는 아미노산은 임의의 아미노산 예를 들어, 알라닌로 치환될 수 있다.
본원에 제공된 인간 IgM 불변 영역, 및 또한 특정 비-인간 영장류 IgM 불변 영역은, 전형적으로 5개의 자연 발생 아스파라긴 (N)-연결된 글리코실화 모티프 또는 부위를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이 "N-연결된 글리코실화 모티프"는 아미노산 서열 N-X1-S/T를 포함하거나 그것으로 이루어지고, N은 아스파라긴, X1은 프롤린(P)을 제외한 임의의 아미노산이고, 그리고 S/T는 세린(S) 또는 트레오닌(T)이다. 글리칸은 아스파라긴 잔기의 질소 원자에 부착된다. 예를 들어, 문헌[Drickamer K, Taylor ME (2006), Introduction to Glycobiology (2nd ed.). Oxford University Press, USA]을 참조한다. N-연결된 글리코실화 모티프는 위치 46 ("N1"), 209 ("N2"), 272 ("N3"), 279 ("N4"), 및 440 ("N5")에서 시작하는 서열번호: 1 또는 서열번호: 60의 인간 IgM 중쇄 불변 영역에서 일어난다. 이들 5개의 모티프는 비-인간 영장류 IgM 중쇄 불변 영역에서 보존되고, 5개 중 4개는 마우스 IgM 경쇄 불변 영역에서 보존된다. N4를 제외하고, 인간 IgM 중쇄 불변 영역 내의 이들 부위 각각은 돌연변이되어 그 부위에서 글리코실화를 방지하면서, 여전히 IgM 발현 및 육량체 또는 오량체로의 조립을 가능하게 할 수 있다. 문헌[2019년 8월 23일자로 출원된 미국 임시 출원 번호 62/891,263]을 참조하며, 그 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
IgA-유래된 결합 분자
특정 구현예에서, 본 개시내용에 의해 제공된 다량체 결합 분자는 IgA 중쇄 불변 영역, 또는 그의 다량체화 단편을 포함하는 이량체성 결합 분자이다. 본원에 제공된 바와 같이, IgA-유래된 결합 분자는 다량체 결합 분자의 IgA 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편에 융합된 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 적어도 3 또는 모두 4개의 결합 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 다량체 결합 분자의 적어도 3 또는 모두 4개의 결합 폴리펩티드는 동일한 결합 파트너에 결합된다. 특정 구현예에서, 다량체 결합 분자의 적어도 3 또는 모두 4개의 결합 폴리펩티드는 동일하다.
2가 IgA-유래된 결합 단위는 2개의 IgA 중쇄 불변 영역을 포함하고, 그리고 이량체성 IgA-유래된 결합 분자는 2개의 결합 단위를 포함한다. IgA는 다음의 중쇄 불변 도메인, Cα1 (또는 대안적으로 CA1 또는 CH1), 힌지 영역, Cα2 (또는 대안적으로 CA2 또는 CH2), 및 Cα3 (또는 대안적으로 CA3 또는 CH3), 및 C-말단 "테일피스"를 함유한다. 인간 IgA는 2개의 아형, IgA1 및 IgA2를 갖는다. 인간 IgA1 불변 영역은 전형적으로 아미노산 서열 서열번호: 24를 포함한다. 인간 Cα1 도메인은 서열번호: 24의 약 아미노산 6에서 약 아미노산 98로 연장되고; 인간 IgA1 힌지 영역은 서열번호: 24의 약 아미노산 102에서 약 아미노산 124로 연장되고, 인간 Cα2 도메인은 서열번호: 24의 약 아미노산 125에서 약 아미노산 219로 연장되고, 인간 Cα3 도메인은 서열번호: 24의 약 아미노산 228에서 약 아미노산 330으로 연장되고, 그리고 테일피스는 서열번호: 24의 약 아미노산 331에서 약 아미노산 352로 연장된다. 인간 IgA2 불변 영역은 전형적으로 아미노산 서열 서열번호: 25를 포함한다. 인간 Cα1 도메인은 서열번호: 25의 약 아미노산 6에서 약 아미노산 98로 연장되고; 인간 IgA2 힌지 영역은 서열번호: 25의 약 아미노산 102에서 약 아미노산 111로 연장되고, 인간 Cα2 도메인은 서열번호: 25의 약 아미노산 113에서 약 아미노산 206으로 연장되고, 인간 Cα3 도메인은 서열번호: 25의 약 아미노산 215에서 약 아미노산 317로 연장되고, 그리고 테일피스는 서열번호: 25의 약 아미노산 318에서 약 아미노산 340로 연장된다.
2개의 IgA 결합 단위는 2 추가의 폴리펩티드 사슬, J 사슬 (서열번호: 15) 및 분비 성분 (전구체, 서열번호: 26, 성숙한, 서열번호: 27)과 복합체를 형성하여 본원에 제공된 2가 분비 IgA (sIgA)-유래된 결합 분자를 형성할 수 있다. 이론에 의해 구속되기를 바라지 않지만, 이량체성 IgA-유래된 결합 분자에의 2개의 IgA 결합 단위의 조립은 Cα3 및 테일피스 도메인을 포함하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 문헌[Braathen, R., 등, J. Biol. Chem. 277:42755-42762 (2002)]를 참조한다. 따라서, 본 개시내용에 제공된 다량체화 이량체성 IgA-유래된 결합 분자는 전형적으로 적어도 Cα3 및 테일피스 도메인을 포함하는 IgA 불변 영역을 포함한다.
IgA 중쇄 불변 영역은 Cα2 도메인 또는 그의 단편, IgA 힌지 영역 또는 그의 단편, Cα1 도메인 또는 그의 단편, 및/또는 예를 들어, IgG 힌지 영역을 포함하는 다른 IgA (또는 다른 면역글로불린 예를 들어, IgG) 중쇄 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 완전한 IgA 중쇄 (α) 불변 도메인(예를 들어, 서열번호: 24 또는 서열번호: 25), 또는 이의 변이체, 유도체, 또는 유사체를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서 본원에 제공된 다량체 결합 분자의 각각의 결합 단위는 2 IgA 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체를 포함하고, 이들 각각은 적어도 IgA Cα3 도메인 및 IgA 테일피스 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서 IgA 중쇄 불변 영역은 각각 추가로 IgA Cα3 및 IgA 테일피스 도메인에 대해 N-말단에 위치한 IgA Cα2 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, IgA 중쇄 불변 영역은 서열번호: 24의 아미노산 125 내지 353 또는 서열번호: 25의 아미노산 113 내지 340을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서 IgA 중쇄 불변 영역은 각각 추가로 IgA Cα2 도메인에 대해 N-말단에 위치한 IgA 또는 IgG 힌지 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, IgA 중쇄 불변 영역은 서열번호: 24의 아미노산 102 내지 353 또는 서열번호: 25의 아미노산 102 내지 340을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서 IgA 중쇄 불변 영역은 각각 추가로 IgA 힌지 영역에 대해 N-말단에 위치한 IgA Cα1 도메인을 포함할 수 있다.
결합 폴리펩티드 및 결합 파트너
본원에 제공된 다량체 결합 분자는 아주 다양한 비제한적인 결합 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 결합 파트너가 세포의 표면 상에서 발현되는 경우, 결합 폴리펩티드는 예를 들어, 리간드 또는 리간드의 수용체 결합 단편 (예를 들어, 리간드 자체가 전형적으로 또 다른 세포의 표면 상에 발현되는 경우), 사이토카인 또는 그의 수용체 결합 단편, 성장 인자 또는 그의 수용체 결합 단편, 신경전달물질 또는 그의 수용체 결합 단편, 펩티드 또는 단백질 호르몬 또는 그의 수용체 결합 단편, 면역 체크포인트 조절제 리간드 또는 그의 수용체 결합 단편, 또는 세포외 기질 단백질의 수용체 결합 단편일 수 있다. 본원에 제공된 결합 분자는 결합 파트너에 결합하고 세포에서 신호 전달을 직접 또는 간접적으로 조절하기 위해 필요한 결합 폴리펩티드의 부분만을 포함할 필요가 있다.
"리간드"는 넓게는 세포-표면 수용체에 결합하여 수용체에서 변화, 예를 들어 형태 변화를 유발하여 수용체를 발현하는 세포에서 사건을 촉발할 수 있는 신호전달 분자를 의미한다. 수천 개가 아니라면 수백 개의 개별 리간드가 확인되고 특성화되며, 전형적으로 구조 또는 기능에 의해 패밀리에 의해 조직화된다. 리간드 계열은 하기를 포함하지만 그에 제한되지 않는다: 액티빈 및 인히빈 리간드, 뼈 골 형태형성 단백질, 케모카인, 보체 성분, 에프린, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 계열 리간드, 갈렉틴, 당단백질 호르몬, 면역 체크포인트 조절제, 인터페론, 인터류킨, 뉴로펩티드, 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 (TNFSF) 리간드, 혈관 내피성 성장 인자 (VEGF) 계열 리간드, TNF-β 슈퍼패밀리 리간드, 및 wnt 계열 리간드. 참고 예를 들어, PHARMACOLOGY (www_dot_guidetopharmacology_dot_org/GRAC/LigandFamiliesForward, 및 www_dot_guidetopharmacology_dot_org/GRAC/LigandListForward에 대한 IUPHAR/BPS 가이드, 2개의 사이트들 모두가 7월 23일에 마지막으로 방문하였다). 리간드는 세포외 환경에서 가용성 분자일 수 있거나 그 자체가 세포의 표면 상에서 발현될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 다량체 결합 분자의 결합 폴리펩티드는 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 (TNFSF) 리간드일 수 있다. 이들 리간드는 TNF 수용체 슈퍼패밀리 (TNFrSF)의 수용체에 결합하고 그를 활성화하고, 이는 수용체-발현 세포 예를 들어, 염증, 아폽토시스, 세포 증식, 세포 침입, 혈관형성, 또는 세포 분화의 아주 다양한 기능을 촉발한다. 예를 들어, 문헌[Aggarwal, B.B. 등, Blood 119:651-665 (2012)]를 참조한다. TNF 슈퍼패밀리는 하기를 비제한적으로 포함하는 적어도 19개의 리간드 및 29개의 상호작용 수용체를 포함한다: TNF-α (카켁틴으로도 알려져 있음, 서열번호: 28로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 28의 아미노산 57-233), TNF-β (림프독소-알파로도 알려져 있음, 서열번호: 29로서 제시된 예시적인 인간 서열, 서열번호: 29의 성숙한 가용성 단백질: 아미노산 35-205), 림프독소-β (LT-β) (서열번호: 30으로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 30의 아미노산 49-244), OX40L (gp34 또는 CD252 로도 알려져 있음, 서열번호: 31로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 31의 아미노산 51-183), CD40L (서열번호: 32로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 32의 아미노산 47-261), FasL (아폽토시스 항원 리간드 또는 APTL 로도 알려져 있음, 서열번호: 33으로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 33의 103-281), 4-1BBL (서열번호: 34로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 34의 아미노산 50-254), TNF-관련된 아폽토시스-유도 리간드(TRAIL) (서열번호: 35로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 35의 아미노산 39-281), 및 글루코코르티코이드-유도된 TNF 수용체 리간드(GITRL) (서열번호: 36으로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 36의 아미노산 72-199). 당업자는 이들 제시된 서열의 다양한 관련된 인간 동형이 존재하고, 오쏘로그가 다른 종에 존재한다는 것을 인지할 것이다. 더욱이, 이들 리간드는 많은 상이한 명칭 및 두문자어에 의해 문헌에 나타나지만, 이들의 일차 구조 및 기능에 의해 구별될 수 있다. 이들 리간드에 의해 활성화된 많은 신호 전달 경로는 예를 들어, 암, 감염성 질환, 염증성 질환, 및/또는 신경퇴행성 질환을 치료하는데 있어서 치료학적으로 중요하다.
TNFSF-TNFrSF 상호작용의 공통 특징은 신호 전달이 일어나도록 하기 위해 리간드가 세포 표면 상에 3개 이상의 수용체 단량체와 결합하기 위한 요건이다. 전형적으로 동종삼량체로서 조립되는 TNFSF 리간드는 이러한 작업을 달성하기에 적합하다. 예를 들어, 문헌[Locksley, R.M., 등, Cell 104:487-501 (2001)]을 참조한다. 이와 같이, TNFrSF 결합 파트너와 결합할 수 있는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 TNFSF 리간드 결합 폴리펩티드를 포함할 수 있는 본원에 제공된 결합 분자는 수용체 활성화를 위한 초효능제로서 작용할 수 있다. 예를 들어, TRAIL의 수용체-결합 단편의 최대 12개의 카피, 예를 들어 서열번호: 35의 아미노산 39-281을 포함하는 본원에 제공된 육량체 결합 분자는, 사멸-도메인 함유 수용체 DR4 및/또는 DR5를 과발현하는 종양 세포와 회합시, 이들 종양 세포의 아폽토시스를 매우 효율적으로 유도할 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 다량체 결합 분자의 결합 폴리펩티드는 면역 체크포인트 조절제 리간드 또는 그의 수용체 결합 단편일 수 있다. 면역 체크포인트 조절제 리간드 비제한적으로, 프로그래밍된 세포사 1 리간드 1 (PD-L1, 또한 CD274로 지칭됨, B7 동족체 1 또는 B7-H1, 서열번호: 8로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 8, 또는 서열번호: 9의 아미노산 19-238), CD80 (또한 B7-1로 지칭됨, 서열번호: 37로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 37의 아미노산 35-242), 및 CD86 (또한 B7-2로 지칭됨, 서열번호: 38로서 제시된 예시적인 인간 서열)을 포함한다. 특정 구현예에서, 결합 파트너는 예를 들어, 면역 체크포인트 조절제 경로에서의 수용체이다. 예를 들어, 결합 파트너는 PD-1 또는 CTLA4일 수 있다.
PD-L1은 수지상 세포 및 단핵구를 포함하는 다양한 세포에서 전형적으로 발현되는 40 kDa 막관통 단백질이다. PD-L1은 프로그램화된 세포 사멸 단백질-1(PD-1)의 리간드이다. 예를 들어, 활성화된 T 세포 상의 PD-1 수용체에 대한 PD-L1의 결합은 항원-특이적 T 세포의 증식을 감소시키고, 또한 조절 T 세포 (Treg)의 아폽토시스를 감소시킬 수 있다. 종양 세포는 PD-L1을 과발현하여 항종양 면역의 억제를 유도할 수 있고 (참고 예를 들어, Dong H., 등, Nat. Med. 8:793-800 (2002)), 그러나 자가면역과도 연관된 PD-L1의 감소된 발현이다(참고 예를 들어, Ansari, M.J., 등, J. Exp. Med. 198:63-69 (2003); Mozaffarian, N., 등, Rheumatology 47:1335-1341 (2008)). 전구체 인간 PD-L1의 예시적인 아미노산 서열은 서열번호: 8로서 제시된다.
인간 PD-L1의 신호 펩티드는 서열번호: 8의 아미노산 1에서 약 아미노산 18로 연장된다. 성숙한 인간 PD-L1 단백질은 서열번호: 8의 약 아미노산 19에서 아미노산 290으로 연장된다. 인간 PD-L1은 2 세포외 도메인, 서열번호: 8의 약 아미노산 19에서 약 아미노산 127로 연장된 Ig-유사 V-형 도메인 및 서열번호: 8의 약 아미노산 133에서 약 아미노산 225로 연장된 Ig-유사 C2-형 도메인을 갖는다. 인간 PD-L1의 막관통 도메인은 서열번호: 8의 약 아미노산 239에서 약 아미노산 259로 연장된다. 인간 PD-L1의 세포질 도메인은 서열번호: 8의 약 260에서 아미노산 290로 연장된다. 막관통 단백질로서, PD-L1의 수용체-결합 가용성 단편이 전형적으로 본 개시내용에 의해 제공된 바와 같은 다가 결합 분자에 포함될 것이라는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 또한 인간 PD-L1의 상이한 수용체 결합 동형체 및/또는 스플라이스 변이체가 존재하고 본원에 제공된 결합 분자에 포함될 수 있음을 당업자는 인정할 것이다. 또한, 인간 PD-L1의 오쏘로그는 다른 종에 존재하고, 그리고 임의의 종의 PD-L1의 수용체 결합 단편은 본원에 제공된 다가 결합 분자에 포함될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 다량체 결합 분자의 결합 폴리펩티드는 PD-L1 예를 들어, 인간 PD-L1의 수용체 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서 결합 폴리펩티드는 PD-L1 예를 들어, 인간 PD-L1의 V-형 엑토도메인 예를 들어, 서열번호: 8의 아미노산 18 내지 127 또는 19 내지 127을 포함한다. 특정 구현예에서 결합 폴리펩티드는 서열번호: 8의 아미노산 18 내지 134 또는 19 내지 134를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Zak 등 Structure 23:2341-2348 (2015)]를 참조한다. 특정 구현예에서 결합 폴리펩티드는 PD-L1 예를 들어, 인간 PD-L1 예를 들어, 서열번호: 8의 아미노산 18 내지 238 또는 19 내지 238의 V-형 및 C2-형 엑토도메인을 포함한다(예시적인 인간 PD-L1의 엑토도메인은 서열번호: 9로서 본원에 제시됨).
특정 구현예에서, 본원에 제공된 다량체 결합 분자의 결합 폴리펩티드는 수용체 엑토도메인일 수 있다. 그 예는 비제한적으로, TNF 슈퍼패밀리 수용체의 엑토도메인, 면역 체크포인트 조절제 수용체의 엑토도메인, TGF-β 수용체의 엑토도메인, 혈관 내피성 성장 인자 수용체(VEGFR)의 엑토도메인, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
예를 들어, 결합 폴리펩티드는 TNF 슈퍼패밀리 수용체(TNFrSF)의 가용성 리간드 결합 단편 예를 들어, 수용체-4를 함유하는 사멸 도메인의 가용성 단편 (DR4, 또한 TRAIL-R1 또는 APO2로 알려져 있음, 서열번호: 39로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 39의 아미노산 24-239); 수용체-5를 함유하는 사멸 도메인(DR5, 또한 TRAIL-R2, Ly98, 또는 CD262로 알려져 있음, 서열번호: 40으로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 40의 아미노산 56-210); OX-40 (서열번호: 41로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 41의 아미노산 29-214); CD40 (서열번호: 42로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 42의 아미노산 21-193); 4-1BB (또한 CD137으로 알려져 있음, 서열번호: 43으로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 43의 아미노산 24-186); 및/또는 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체(GITR, 또한 AITR 또는 CD357로 알려져 있음, 서열번호: 44로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 44의 아미노산 26-162); 또는 이들의 임의의 조합을 포할 수 있다.
결합 폴리펩티드는 또한 예를 들어, 면역 체크포인트 조절제 수용체의 엑토도메인 예를 들어, 세포독성 T-림프구 관련 단백질-4 (CTLA4, 또한 CD152로 알려져 있음, 서열번호: 45으로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 45의 아미노산 36-161)의의 가용성 리간드 결합 단편, PD-1 (서열번호: 46으로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 46의 아미노산 21-170), LAG3 (또한 CD223으로 알려져 있음, 서열번호: 47로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 47의 아미노산 29-450); CD28 (서열번호: 48로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 48의 아미노산 19-152); 수용체 2를 함유하는 면역글로불린-유사 도메인(ILDR2, 서열번호: 49로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 49의 아미노산 21-186), T-세포 면역글로불린 뮤신 패밀리 일원 3 (TIM-3, 또한 CD366로 알려져 있음, 서열번호: 50으로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 50의 아미노산 22-202), 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
결합 폴리펩티드는 또한 예를 들어, 형질전환 성장 인자 베타 수용체(TGFβR)의 엑토도메인일 수 있다. 3개의 인간 수용체 단백질은 TGFβ와 결합하는 것으로 알려져 있다. 이들은 TGFβ 수용체 1형 (TGFβR1, 또한 액티빈 수용체-유사 키나제 5 또는 ALK5로 알려져 있음, 서열번호: 51로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 51의 아미노산 34-126), TGFβ 수용체 2형 (TGFβR2, 서열번호: 52로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 52의 아미노산 23-166), 및 TGFβ 수용체 유형 3 (TGFβR3, 서열번호: 53으로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인: 서열번호: 53의 아미노산 21-787)을 포함한다.
결합 폴리펩티드는 또한 예를 들어, 혈관 내피성 성장 인자 수용체(VEGFR)의 엑토도메인일 수 있다. 혈관 내피성 성장 인자 슈퍼패밀리의 멤버와 결합하는 것으로 알려진 인간 수용체는 비제한적으로, 혈관 내피성 성장 인자 수용체 2 (VEGFR-2, 서열번호: 54로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인, 서열번호: 54의 아미노산 20-764), 혈관 내피성 성장 인자 수용체 3 (VEGFR-3, 또한 FLT4로 알려져 있음, 서열번호: 55로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인, 서열번호: 55의 아미노산 25-775), 및 혈관 내피성 성장 인자 수용체 1 (VEGFR-1, 또한 FLT1로 알려져 있음, 서열번호: 56로서 제시된 예시적인 인간 서열, 엑토도메인, 서열번호: 56의 아미노산 27-758)을 포함한다. VEGFR-2-엑토도메인-Fcγ 단백질은 두개내 인간 다형상 교모세포종의 마우스 모델에서 신생혈관형성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌[Szentirmai, O., 등, J. Neurosurg 108:979-988 (2008)]을 참조한다. VEGF 수용체(아플리베르셉트, 서열번호: 57은, 서열번호: 56의 아미노산 129-230 (VEGFR-1), 서열번호: 54의 아미노산 225-327 (VEGFR-2) 및 인간 IgG1Fc 불변 영역을 함유함)의 리간드 결합 엑토도메인을 포함하는 Fcγ 융합 단백질은 예를 들어 연령-관련 황반 변성과 관련된 안구 신생혈관형성을 예방하기 위해 사용된다. 예를 들어, 문헌[Sawar, S., 등, Dev. Opthalmol. 55:282-294 (2016)]을 참조한다.
변형된 J-사슬
특정 구현예에서, 본원에 제공된 오량체 IgM-유래된 결합 분자의 J-사슬은 예를 들어 이종 모이어티, 또는 둘 이상의 이종 모이어티의 도입에 의해, 그것의 결합 파트너(들)에 조립 및 결합하는 오량체 IgM-유도 결합 분자의 능력을 방해하지 않으면서 변형될 수 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 번호 9,951,134 및 10,400,038, 미국 특허 출원 공개 번호 US-2019-0185570 및 US-2018-0265596(이들 각각은 그 전체가 본원에 인용되어 포함됨)]을 참조한다. 따라서, 본원에 제공된 오량체 IgM-유래된 결합 분자는 J-사슬 또는 그의 단편에 도입된 이종성 모이어티, 또는 2개 이상의 이종성 모이어티를 포함하는 변형된 J-사슬 또는 그의 기능적 단편을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서 변형된 J-사슬에 혼입되는 이종성 모이어티는 J-사슬에 프레임 내에서 융합되거나 또는 J-사슬과 화학적으로 접합된 펩티드 또는 폴리펩티드 서열일 수 있다. 특정 구현예에서 변형된 J-사슬에 혼입되는 이종성 모이어티는 J-사슬에 접합된 화학적 모이어티일 수 있다. J-사슬에 부착될 이종성 모이어티는 비제한적으로, 결합 모이어티 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 예를 들어, 단일 사슬 Fv (scFv) 분자, 오량체 IgM-유래된 결합 분자의 반감지를 증가시킬 수 있는 안정화 펩티드, 또는 화학적 모이어티 예컨대 중합체 또는 세포독소를 포하할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 J-사슬은 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드(소형 펩티드 포함)를 포함할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 J-사슬와 연관된 항원 결합 도메인은 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다. 특정 구현예에서 항원 결합 도메인은 예를 들어 낙타과 또는 콘드릭토이드(condricthoid) 항체로부터 유래된 scFv 결합 도메인 또는 단일-사슬 결합 도메인일 수 있다. 항원 결합 도메인은 J-사슬 기능 또는 연관된 IgM 또는 IgA 결합 분자의 기능을 방해하지 않으면서 항원 결합 도메인의 그의 결합 파트너에의 결합을 허용하는 임의의 위치에서 J-사슬 내로 도입될 수 있다. 삽입 위치는 비제한적으로, J-사슬의 3차원 구조를 기준으로 접근가능한 C-말단 또는 그 부근에서, N-말단 또는 그 부근에서, 또는 내부 위치에서를 포함한다. 특정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 서열 번호: 15의 시스테인 잔기 92와 101 사이에서 서열번호: 15의 성숙한 인간 J-사슬에 도입될 수 있다. 추가 구현예에서, 항원 결합 도메인은 글리코실화 부위 또는 그 부근에서 서열번호: 15의 인간 J-사슬에 도입될 수 있다. 추가 구현예에서, 항원 결합 도메인은 N-말단 또는 C-말단으로부터 약 10개의 아미노산 잔기 내에서 서열번호: 15의 인간 J-사슬에 도입될 수 있다.
혈청 반감기를 변경하는 J-사슬 돌연변이를 갖는 오량체 IgM-유래된 결합 분자
본 개시내용은 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편을 포함하는 IgM-유래된 오량체 결합 분자를 제공하고, 결합 분자는 IgM 항체 또는 IgM-유래된 결합 분자에 대해 전형적으로 관찰된 것에 비해 향상된 혈청 반감기를 갖는다. 본원에 제공된 오량체 IgM-유래된 결합 분자는 5개의 2가 IgM-유래된 결합 단위 또는 그의 변이체 또는 다량체화 단편 및 J-사슬의 기능적 변이체 및/또는 유도체 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. J-사슬의 "기능적 변이체, 유도체, 또는 단편"이란 오량체를 형성하기 위해 5개의 IgM-유래된 결합 단위와 회합할 수 있게 남아있는 J-사슬 변이체, 유도체, 또는 단편을 의미한다. 제공된 IgM-유래된 결합 분자의 각각의 결합 단위는 2 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체를 포함하고, 불변 영역은 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 결합 폴리펩티드에 융합된다. 본원에 제공된 바와 같이, 변이체 및/또는 유도체 J-사슬 또는 그의 기능적 단편은 J-사슬 또는 그의 기능적 단편, 변이체, 및/또는 유도체를 포함하는 IgM-유래된 결합 분자의 혈청 반감기에 영향을 줄 수 있는 하나 이상의 단일 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함할 수 있다. 용어 "하나 이상의 단일 아미노산 치환, 삽입 및 결실"은 J-사슬 또는 그의 기능적 단편, 변이체 및/또는 유도체 아미노산 서열의 각각의 아미노산이 개별적으로 치환될 수 있거나, 결실될 수 있거나, 또는 그에 인접하여 삽입된 단일 아미노산을 가질 수 있지만, J-사슬 또는 그의 기능적 단편, 변이체 및/또는 유도체는 IgM-유래 오량체 결합 분자를 형성하기 위해 IgM 중쇄 또는 IgM 유래 중쇄와 조립하는 기능을 여전히 수행할 수 있어야 함을 의미한다. 특정 구현예에서 본원에 제공된 J-사슬 또는 그의 기능적 단편, 변이체, 및/또는 유도체는 have 단일 아미노산 치환, 삽입 또는 결실, 2개의 단일 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실의 조합 (예를 들어, 2개의 단일 아미노산 치환 또는 1개의 단일 아미노산 치환 및 1개의 단일 아미노산 삽입 또는 결실), 3개의 단일 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실의 조합, 4개의 단일 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실 이상의 조합을 가질 수 있고, 1, 2, 3, 4, 또는 그 초과 개의 단일 아미노산 치환, 삽입 또는 결실은 J-사슬 또는 그의 기능적 단편, 변이체, 및/또는 유도체를 포함하는 IgM-유래된 결합 분자의 혈청 반감기에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 제공된 IgM-유래된 결합 분자는 J-사슬 또는 그의 기능적 단편, 변이체, 및/또는 유도체에서 하나 이상의 단일 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 제외하고 동일한 참조 IgM-유래된 결합 분자에 비해 동물에게 투여 시 증가된 혈청 반감기를 나타내고, 제공된 결합 분자 및 참조 결합 분자 둘 모두는 동일한 동물 종에게 동일한 방식으로 투여된다. 본원에 제공된 IgM-유래된 결합 분자의 혈청 반감기를 개선할 수 있는 변형된 또는 변이체 J-사슬이 본원에서 개시되어 있을 뿐만 아니라 그러한 J-사슬을 제조하고 사용하는 방법이, 문헌[PCT 공개 번호 WO2019/169314, 그 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨]에 개시되어 있다.
특정 구현예에서, IgM-유래된 결합 분자의 혈청 반감기 예를 들어, α 반감기, β 반감기, 또는 전반적으로 반감기는, 참조 결합 분자에 비해 적어도 0.1-배, 적어도 0.5-배, 적어도 1-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 20-배, 적어도 30-배, 적어도 40-배, 적어도 50-배, 적어도 60-배, 적어도 70-배, 적어도 80-배, 적어도 90-배, 적어도 100-배, 적어도 500-배, 적어도 1000-배 또는 그 초과까지 증가될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 IgM-유래된 결합 분자의 J-사슬은 성숙한 인간 J-사슬 (서열번호: 15)의 아미노산 Y102에 상응하는 아미노산 위치 에서 아미노산 치환을 포함한다. "야생형 인간 J-사슬의 아미노산 Y102에 상응하는 아미노산"이란 인간 J-사슬에서 Y102와 상동성인 임의의 종의 J-사슬의 서열에서 아미노산을 의미한다. 서열번호: 15에서 Y102에 상응하는 위치는 적어도 43개의 다른 종의 J-사슬 아미노산 서열에서 보존된다. 미국 특허 번호 9,951,134(이는 본원에 참조로 포함됨)의 도 4를 참조한다. 이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, 이 돌연변이는 특정 면역글로불린 수용체 예를 들어, Fcαμ 수용체 및/또는 중합체성 Ig 수용체(돼지 수용체)의 결합에 영향을 미치는 것으로 믿는다. 특정 구현예에서, 서열번호: 15의 Y102는 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. 특정 구현예에서, 서열번호: 15의 Y102는 알라닌(A), 세린(S) 또는 아르기닌(R)으로 치환될 수 있다. 특정 구현예에서, 서열번호: 15의 Y102는 알라닌으로 치환될 수 있다. 일 구현예에서 J-사슬 또는 그의 기능적 단편, 변이체, 및/또는 유도체는 변이체 인간 J-사슬이고, 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 IgM-유래된 결합 분자의 J-사슬 또는 그의 기능적 단편, 변이체, 및/또는 유도체는 성숙한 인간 J-사슬 (서열번호: 15)의 아미노산 N49 또는 아미노산 S51에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함하고, S51은 트레오닌(T)로 치환되지 않거나 또는 J-사슬은 인간 J-사슬 (서열번호: 15)의 아미노산 N49 및 S51 둘 모두에 상응하는 아미노산 위치 에서 아미노산 치환을 포함한다. 또, "야생형 인간 J-사슬의 서열번호: 15의 S51에 상응하는 아미노산의 서열번호: 15의 아미노산 N49에 상응하는 아미노산"이란, 인간 J-사슬에서 N49 및/또는 S51과 상동성인 임의의 종의 J-사슬의 서열에서의 아미노산을 의미한다. 서열번호: 15에서 N49 및 S51에 상응하는 위치는 적어도 43개의 다른 종의 J-사슬 아미노산 서열에서 보존된다. PCT 공개 번호 WO2015/153912(이는 본원에 참조로 포함됨)의 도 4를 참조한다. 이론에 의해 구속되기를 바라지 않지만, 서열번호:15의 I50에 상응하는 아미노산과 함께 서열번호:15의 N49 및 S51에 상응하는 아미노산은 J-사슬에 N-연결된 글리코실화 모티프를 포함하고, N49 또는 S51 에서의 돌연변이 (S51 에서의 트레오닌 치환을 제외)는 이 모티프에서의 글리코실화를 방지할 수 있는 것으로 여겨진다. 특정 구현예에서, 서열번호: 15의 N49에 상응하는 위치의 아스파라긴은 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. 특정 구현예에서, 서열번호: 15의 N49에 상응하는 위치의 아스파라긴은 알라닌(A), 글리신(G), 트레오닌(T), 세린(S) 또는 아스파르트산(D)으로 치환될 수 있다. 특정 구현예에서 서열번호: 15의 N49에 상응하는 위치는 알라닌(A)로 치환될 수 있다. 특정 구현예에서 J-사슬은 변이체 인간 J-사슬이고, 아미노산 서열 서열번호: 17을 포함한다.
특정 구현예에서, 서열번호: 15의 S51에 상응하는 위치의 세린은 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. 특정 구현예에서, 서열번호: 15의 S51에 상응하는 위치의 세린은 알라닌(A) 또는 글리신(G)로 치환될 수 있다. 특정 구현예에서 서열번호: 15의 S51에 상응하는 위치는 알라닌(A)로 치환될 수 있다. 특정 구현예에서 J-사슬 또는 그의 기능적 단편, 변이체, 및/또는 유도체는 변이체 인간 J-사슬이고, 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 개선된 혈청 반감기를 갖는 IgM-유래된 결합 분자는 추가로 참조 결합 분자에 대해 다른 변형된 약동학적 파라미터 예를 들어, 증가된 피크 혈장 농도 (Cmax), 증가된 곡선하 면적 (AUC), 감소된 청소능 시간, 또는 이들의 임의의 조합을 나타낸다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 IgM-유래된 결합 분자의 J-사슬 또는 그의 기능적 단편, 변이체, 및/또는 유도체는 예를 들어, 미국 특허 번호 9,951,134에 제공된 바와 같이 변형된 J-사슬일 수 있다. 특정 구현예에서 변형된 J-사슬은 추가로 이종성 폴리펩티드를 포함하고, 이종성 폴리펩티드는 J-사슬 또는 그의 기능적 단편, 변이체, 및/또는 유도체에 직접적으로 또는 간접적으로 융합된다. 특정 구현예에서, 이종성 폴리펩티드는 펩티드 링커 예를 들어, 적어도 5개의 아미노산이지만 25개 이하의 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커를 통해 J-사슬 또는 그의 기능적 단편, 변이체, 및/또는 유도체에 융합된다. 특정 구현예에서, 펩티드 링커는 GGGGS (서열번호: 19), GGGGSGGGGS (서열번호: 20), GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 21), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 22), 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 23)로 이루어진다. 이종성 폴리펩티드는 J-사슬 또는 그의 기능적 단편, 변이체, 및/또는 유도체의 N-말단, J-사슬 또는 그의 기능적 단편, 변이체, 및/또는 유도체의 C-말단에 융합될 수 있거나, 또는 이종성 폴리펩티드는 J-사슬 또는 그의 기능적 단편, 변이체, 및/또는 유도체의 N-말단 및 C-말단 둘 모두에 용합될 수 있다. 특정 구현예에서, 이종성 폴리펩티드는 결합 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 이종성 폴리펩티드의 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 단편 예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일-사슬 Fv (scFv) 단편, 디설파이드-연결된 Fv (sdFv) 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
특정 구현예에서, 변형된 J-사슬에 융합된 이종성 폴리펩티드는 본원에 제공된 하나 이상의 결합 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 J-사슬에 융합된 이종성 폴리펩티드는 다량체 결합 분자의 흡수, 분포, 대사 및/또는 배출 (ADME)에 영향을 주는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 변형된 J-사슬에 융합하기 위한 예시적인 이종성 폴리펩티드는 예를 들어, 미국 특허 번호 9,951,134 및 10,400,038, 미국 특허 출원 공개 번호 US-2019-0185570 및 US-2018-0265596에 개시되어 있고, 이들 각각은 그 전체가 본원에 인용되어 포함된다.
일 구현예에서, 변형된 J-사슬에 융합된 이종성 폴리펩티드는 본원에 제공된 결합 분자를 특정 세포, 조직, 또는 기관에 표적화할 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 변형된 J-사슬을 포함하는 오량체 결합 분자는 VEGF에 결합하고 억제하기 위해 상기에 기재된 바와 같은 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 10개의 VEGF-R2 수용체 엑토도메인 결합 폴리펩티드, 및 눈을 표적으로 하는 폴리펩티드 예를 들어, 하이알루론산 결합 펩티드(HABP) 예를 들어, 종양 괴사 인자-유도성 유전자 6 단백질의 LINK 도메인 예를 들어, 서열번호: 58의 아미노산 36-129를 포함하는 변형된 J-사슬을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ghosh, JG 등, Nature Comm. 8:14837 (2017)]을 참조한다. 그와 같은 다량체 결합 분자는 퇴행성 안구 질환 예를 들어, 연령 관련 황반 변성를 치류하기 위해 사용될 수 있다.
조직 표적화의 또 다른 예는 활막 내피 표적화 펩티드(SvETP, CKSTHDRLC, 서열번호: 59)로 활막을 표적화하는 것이다. 예를 들어, 문헌[Wythe, SE 등, Ann. Rheum Dis. 72:129-135 (2013)]를 참조한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 다량체 결합 분자의 변형된 J-사슬에 융합된 이종성 폴리펩티드는 TGF-β에 결합하고 그를 억제하여 미세환경에서 종양-유도된 면역억제를 차단하기 위해 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 10개의, 본원에 기재된 TGF-β-수용체 엑토도메인 결합 폴리펩티드를 포함하는 다량체 결합 분자에서 면역 체크포인트 차단을 표적으로 하는 scFv 항체 단편 예를 들어, PD-L1일 수 있다. 예를 들어, Knudson, KM, 등, Oncoimmunology 7:1426519; DOI:10.1080/2162402X.2018.1426519 (2018)을 참조한다. 다양한 항-PD-L1 항체는 당해 기술에 알려져 있다. 예시적인 항-PD-L1 항체는 예를 들어, PCT 공개 번호 WO/2017/196867에 기재되어 있고, 이는 그 전체가 참조로 포함되었다.
PD-L1-결합 폴리펩티드를 포함하는 육량체 및 오량체 IgM-유래된 결합 분자
특정 구현예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 10 또는 12개의 IgM-유래된 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편을 포함하고, IgM-유래된 중쇄 불변 영역의 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 또는 12는 PD-L1 단백질 예를 들어, 인간 PD-L1 단백질의 V-형 및 C2-형 엑토도메인을 포함하는 결합 폴리펩티드 예를 들어, 아미노산 서열 서열번호: 9를 포함하는 결합 폴리펩티드에 융합된다.
특정 구현예에서, IgM-유래된 중쇄 불변 영역은 인간 IgM 불변 영역의 야생형 Cμ2, Cμ3, Cμ4, 및 tp 도메인을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서 본원에 제공된 결합 분자는 서열번호: 10의 아미노산 19 내지 587을 포함하는 폴리펩티드의 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 또는 12개의 카피를 포함한다. 결합 분자의 성분 폴리펩티드의 전구체는 추가로 단백질의 분비를 용이하게 하기 위해 신호 펩티드를 포함할 수 있고, 예를 들어, 폴리펩티드는 아미노산 서열 서열번호: 10을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, IgM-유래된 중쇄 불변 영역은 변형된 인간 IgM-유래된 불변 영역을 포함하고, 변형은 결합 분자의 CDC 활성을 감소시키거나 제거하고, IgM-유래된 중쇄 불변 영역은 Cμ3 도메인에서 P311A 및 P313S 아미노산 치환을 갖는 인간 IgM 불변 영역의 Cμ2, Cμ3, Cμ4 및 tp 도메인을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서 본원에 제공된 결합 분자는 서열번호: 11의 아미노산 19 내지 587을 포함하는 폴리펩티드의 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 또는 12개의 카피를 포함한다. 결합 분자의 성분 폴리펩티드의 전구체는 추가로 단백질의 분비를 용이하게 하기 위해 신호 펩티드를 포함할 수 있고, 예를 들어, 폴리펩티드는 아미노산 서열 서열번호: 11을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, IgM-유래된 중쇄 불변 영역은 변형된 IgG 힌지 영역, 및 인간 IgM 불변 영역의 야생형 Cμ3, Cμ4, 및 tp 도메인을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서 본원에 제공된 결합 분자는 서열번호: 12의 아미노산 19 내지 493을 포함하는 폴리펩티드의 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 또는 12개의 카피를 포함한다. 결합 분자의 성분 폴리펩티드의 전구체는 추가로 단백질의 분비를 용이하게 하기 위해 신호 펩티드를 포함할 수 있고, 예를 들어, 폴리펩티드는 아미노산 서열 서열번호: 12를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, IgM-유래된 중쇄 불변 영역은 변형된 IgG 힌지 영역 및 변형된 인간 IgM-유래된 불변 영역을 포함하고, 변형은 변형된 IgG 힌지 영역, 및 Cμ3 도메인에서 P311A 및 P313S 아미노산 치환을 갖는 인간 IgM 불변 영역의 Cμ3, Cμ4 및 tp 도메인을 포함하여 결합 분자의 CDC 활성을 감소시키거나 제거한다. 예를 들어, 특정 구현예에서 본원에 제공된 결합 분자는 서열번호: 13의 아미노산 19 내지 493을 포함하는 폴리펩티드의 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 또는 12개의 카피를 포함한다. 결합 분자의 성분 폴리펩티드의 전구체는 추가로 단백질의 분비를 용이하게 하기 위해 신호 펩티드를 포함할 수 있고, 예를 들어, 폴리펩티드는 아미노산 서열 서열번호: 13을 포함할 수 있다.
PD-L1 결합 폴리펩티드를 포함하는 결합 분자가 오량체인 경우, 결합 분자는 추가로 J-사슬, 또는 기능적 단편, 변이체, 또는 그의 유도체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 결합 분자는 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 인간 J-사슬, 또는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 J-사슬을 포함하고, 이는 결합 분자 예를 들어, 서열번호: 16의 아미노산 서열, 서열번호: 17, 또는 서열번호: 18을 포함하는 변이체 인간 J-사슬의 혈정 반감기에 영향을 미치고 예를 들어, 그를 증가시키거나 연장시킨다. 특정 구현예에서 결합 분자는 서열번호: 11의 아미노산 19 내지 587을 포함하는 아미노산 서열의 10개의 카피 또는 서열번호: 13의 아미노산 19 내지 493을 포함하는 아미노산 서열의 10개의 카피, 및 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 변이체 J-사슬을 포함한다.
본원에 제공된 PD-L1-결합 폴리펩티드를 포함하는 육량체 및 오량체 IgM-유래된 결합 분자는 예를 들어, T-세포 상에서 발현된 결합 파트너, PD-1의 다수의 카피에 결합하여, PD-1을 통해 신호 전달에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 이들 결합 분자는 PD-1의 효능제 신호 전달로서 기능할 수 있다. 그와 같은 결합 분자는 예를 들어, 자가면역 장애 및/또는 염증성 장애를 치료하는 데, 또는 이식 거부의 방지하는 데 유용할 수 있다. 단량체성 또는 이량체성 PD-L1 엑토도메인-IgG fc 융합 단백질에 의한 PD-1의 참여는 T-세포 수용체-매개된 림프구 증식 및 사이토카인 분비를 억제하는 것으로 입증되었다. 예를 들어, 문헌[Freeman, G. J. 등, J. Exp. Med. 192:1027-1034 (2000)]를 참조한다. 본원에 제공된 다량체 결합 분자는 단량체성 또는 이량체성 PD-L1 엑토도메인 기반 결합 분자 예를 들어, IgG Fc 영역에 융합된 PD-L1 엑토도메인을 포함하는 결합 분자의 동등 (예를 들어, 몰 당량 또는 중량 동등) 양보다 더 높은 효능으로 예를 들어, 5-배, 10-배, 20-배, 30-배, 40-배, 50-배, 60-배, 70-배, 80-배, 90-배, 100-배, 500-배 또는 1000-배 더 높은 효능으로 PD-1 효능제로서 기능할 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 숙주 세포
본 개시내용은 추가로 본원에서 기재된 바와 같은 다량체 결합 분자의 폴리펩티드 서브유닛을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 예를 들어, 단리된, 재조합, 및/또는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 제공한다. "폴리펩티드 서브유닛"이란, 독립적으로 번역될 수 있는 결합 분자, 결합 단위, 또는 IgM- 또는 IgA-유래된 중쇄 융합 단백질의 일부를 의미하다. 그 예는 비제한적으로, 본원에서 기재된 바와 같이 결합 폴리펩티드 또는 그의 단편에 융합된 IgA 또는 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체, J 사슬, 분비 성분, 또는 임의의 변이체 및/또는 그의 유도체를 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드 서브유닛은 본원에서 기재된 바와 같은 결합 폴리펩티드에 융합된 IgM 또는 IgM-유사 중쇄 불변 영역 또는 다량체화 단편 및/또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서 폴리뉴클레오티드는 결합 폴리펩티드의 C-말단에 융합된 인간 IgM 또는 IgM-유사 불변 영역 또는 다량체화 단편 및/또는 그의 변이체를 포함하는 폴리펩티드 서브유닛을 인코딩할 수 있다.
간단히 말해서, 본원에 제공된 다량체 결합 분자의 폴리펩티드 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열을 기존 분자로부터 합성 또는 증폭시키고, 발현시 벡터가 전장 폴리펩티드 서브유닛을 산출하도록 적절한 배향 및 인프레임으로 하나 이상의 벡터 내로 삽입할 수 있다. 이러한 목적에 유용한 벡터는 당업계에 공지되어 있다. 이러한 벡터는 또한 인핸서 및 원하는 사슬의 발현을 달성하는데 필요한 다른 서열을 포함할 수 있다. 다중 벡터 또는 단일 벡터가 사용될 수 있고, J-사슬 또는 그의 기능적 단편, 변이체 및/또는 유도체를 추가로 인코딩할 수 있다. 이 벡터 또는 이들 벡터는 숙주 세포 내로 형질감염될 수 있고, 이어서 본원에 제공된 IgM- 또는 IgA-유래 융합 단백질 및 그의 J-사슬 또는 기능적 단편, 변이체, 및/또는 유도체가 발현되고, 다량체 결합 분자가 조립되고, 정제된다. 발현시, 사슬은 본원에 제공된 완전 작용성 다량체 결합 분자를 형성한다. 이어서, 완전히 조립된 다량체 결합 분자는 표준 방법에 의해 정제될 수 있다. 발현 및 정제 공정은 필요한 경우 상업적 규모로 수행될 수 있다.
본 개시내용은 추가로 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공하고, 2개 이상의 폴리뉴클레오티드는 집합적으로 본원에 제공된 다량체 결합 분자를 인코딩할 수 있다. 특정 구현예에서 조성물은 결합 폴리펩티드 또는 그의 단편에 융합된 IgA 또는 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 J-사슬 또는 그의 기능적 단편, 변이체, 및/또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서 본원에 제공된 조성물을 구성하는 폴리뉴클레오티드 2개의 별도의 벡터 예를 들어, 발현 벡터에 위치할 수 있다. 그와 같은 벡터는 본 개시내용에 의해 제공된다. 특정 구현예에서 본원에 제공된 조성물을 구성하는 폴리뉴클레오티드중 2개 이상은 단일 벡터 예를 들어, 발현 벡터에 위치할 수 있다. 그와 같은 벡터는 본 개시내용에 의해 제공된다.
본 개시내용은 추가로 본원에 제공된 다량체 결합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 임의의 서브유닛, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 조성물, 또는 벡터 또는 본원에 제공된 다량체 결합 분자, 또는 그의 임의의 서브유닛을 집합적으로 인코딩하는 2, 3, 또는 그 초과 개의 벡터를 포함하는, 숙주 세포 예를 들어, 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 제공한다.
관련된 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 제공된 다량체 결합 분자를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본원에 제공된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 다량체 결합 분자를 회수하는 단계를 포함한다.
사용 방법
본 개시내용은 추가로 치료가 필요한 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 대상체에게 본원에 제공된 다량체 결합 분자의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. "치료적으로 효과적인 용량 또는 양" 또는 "유효량"이란, 투여될 때 대상체의 치료에 대해 양성 면역치료적 반응을 일으키는 다량체 결합 분자의 양을 의미한다.
질환 또는 장애의 치료를 위한 조성물의 효과적인 용량은 투여 수단, 표적 부위, 대상체의 생리적 상태, 대상체가 인간 또는 동물인지 여부, 투여된 다른 약물, 및 처리가 예방적 또는 치료적인지 여부를 포함하는 많은 상이한 인자에 따라 변한다. 일반적으로, 대상체는 인간이고, 그러나 형질전환 포유동물을 포함하는 비-인간 포유동물이 또한 치료될 수 있다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 당업자에게 알려진 일상적인 방법을 사용하여 적정될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 치료가 필요한 대상체에서 자가면역 장애, 염증성 장애, 또는 이들의 조합을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체에게 본원에 제공된 다량체 결합 분자의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체에 대한 본원에 제공된 다량체 결합 분자의 투여는 동일한 결합 파트너에 결합하는 단량체성 또는 이량체성 결합 분자의 당량의 투여 보다 더 큰 효능을 초래한다. 특정 구현예에서 단량체성 또는 이량체성 결합 분자는 본원에 제공된 다량체 결합 분자와 동일한 결합 폴리펩티드를 포함하다". "당량"은 예를 들어, 총 밀리그램의 분자량에 의해 측정된 양, 또는 대안적으로, 몰 당량(예를 들어, 동등한 수의 분자가 투여되는 경우)을 의미한다.
특정 구현예에서, 자가면역 질환은 예를 들어, 관절염 예를 들어, 류마티스성 관절염, 골관절염, 또는 강직 척추염, 다발성 경화증 (MS), 염증성 장 질환 (IBD) 예를 들어, 크론병 또는 궤양성 대장염, 또는 전신 홍반성 낭창 (SLE)일 수 있다. 특정 구현예에서 염증성 질환 또는 장애는 예를 들어, 관절염 예를 들어, 류마티스성 관절염, 또는 골관절염, 또는 건선성 관절염, 라임병, SLE, MS, 쇼그렌 증후군, 천식, 염증성 장 질환, 허혈, 죽상경화증, 또는 뇌졸중일 수 있다.
다른 구현예에서, 본 개시내용은 이식 수령체에서 이식 거부를 방지하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체에게 본원에 제공된 다량체 결합 분자의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체에 대한 본원에 제공된 다량체 결합 분자의 투여는 동일한 결합 파트너에 결합하는 단량체성 또는 이량체성 결합 폴리펩티드의 당량의 투여 보다 더 큰 효능을 초래한다. 특정 구현예에서 단량체성 또는 이량체성 결합 분자는 본원에 제공된 다량체 결합 분자와 동일한 결합 폴리펩티드를 포함한다. "당량"은 예를 들어, 총 밀리그램의 분자량에 의해 측정된 양, 또는 대안적으로, 몰 당량(예를 들어, 동등한 수의 분자가 투여되는 경우)을 의미한다.
치료될 대상체는 치료가 필요한 임의의 동물 예를 들어, 포유동물일 수 있고, 특정 구현예에서, 대상체는 인간 대상체이다.
그의 가장 간단한 형태에서, 대상체에게 투여되는 제제는 통상의 투여 형태로 투여되는 본원에 제공된 다량체 결합 분자이며, 이는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 약제학적 부형제, 담체 또는 희석제와 조합될 수 있다.
본 개시내용의 다량체 결합 분자는 임의의 적합한 방법 예를 들어, 비경구로, 심실내로, 경구로, 흡입에 의해 스프레이, 국소적으로, 직장으로, 비강으로, 협측으로, 질로 또는 이식된 저장소를 통해 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활막내, 흉골내, 척추강내, 간내, 병소내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
약제학적 조성물 및 투여 방법
본원에 제공된 다량체 결합 분자를 제조하고 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법은 본 개시내용의 관점에서 당업자에게 널리 공지되어 있거나 또는 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 투여 경로는 예를 들어 경구, 비경구, 흡입 또는 국소 투여일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 비경구는 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장, 또는 질 투여를 포함한다. 이들 투여 형태가 적합한 형태로 고려되지만, 투여를 위한 형태의 또 다른 예는 주사, 특히 정맥내, 또는 동맥내 주사 또는 점적을 위한 용액일 것이다. 적합한 약제학적 조성물은 완충액 (예를 들어, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충액), 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트), 선택적으로 안정화제 제제 (예를 들어, 인간 알부민), 등을 포함할 수 있다.
본원에서 논의된 바와 같이, 본원에 제공된 다량체 결합 분자는 이를 필요로 하는 대상체의 치료를 위한 제약상 유효량으로 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 개시된 다량체 결합 분자는 투여를 용이하게 하고 활성제의 안정성을 촉진하도록 제형화될 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 약제학적 조성물은 제약상 허용되는 비독성 멸균 담체, 예컨대 생리 식염수, 비독성 완충제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 다량체 결합 분자의 제약상 유효량은 표적에 대한 효과적인 결합을 달성하고 치료 이익을 달성하기에 충분한 양을 의미한다. 적합한 제형은 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980)에 기재되어 있다.
본원에 제공된 특정 약제학적 조성물은 예를 들어, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하는 허용가능한 투여 형태로 경구로 투여될 수 있다. 특정 약제학적 조성물은 또한 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 그와 같은 조성물은 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제, 생체이용률을 향상시키기 위한 흡수 촉진제, 및/또는 다른 종래의 가용화 또는 분산제를 이용하여 염수 중 용액으로서 제조될 수 있다.
단일 투여 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 다량체 결합 분자의 양은 예를 들어 치료되는 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 조성물은 단일 용량, 다중 용량으로서 또는 설정된 기간에 걸쳐 주입으로 투여될 수 있다. 투여 레지멘은 또한 최적의 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 또는 예방 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다.
본 개시내용의 범위에 따라, 본원에 제공된 다량체 결합 분자는 치료 효과를 생성하기에 충분한 양으로 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에 제공된 다량체 결합 분자는 공지된 기술에 따라 본 개시내용의 다량체 결합 분자를 통상적인 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 조합함으로써 제조된 통상적인 투여 형태로 대상체에게 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제의 형태 및 특성은 조합되는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 다른 널리 공지된 변수에 의해 좌우될 수 있다.
본 개시내용은 또한 질환 또는 장애 예를 들어, 자가면역 질환, 염증성 질환을 치료하거나 예방하거나 관리하거나 이식 거부를 방지하기 위한 약제?? 제조에서의, 본원에 제공된 다량체 결합 분자의 용도를 제공한다.
본 개시내용은, 달리 명시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양물, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 종래의 기술을 이용한다. 그와 같은 기술은 문헌에서 충분히 설명된다. 예를 들어, 문헌[Green and Sambrook, ed. (2012) Molecular Cloning A Laboratory Manual (4th ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook 등, ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover and B.D. Hames, eds., (1995) DNA Cloning 2d Edition (IRL Press), Volumes 1-4; Gait, ed. (1990) Oligonucleotide Synthesis (IRL Press); Mullis 등 미국 특허 번호 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1985) Nucleic Acid Hybridization (IRL Press); Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation (IRL Press); Freshney (2016) Culture Of Animal Cells, 7th Edition (Wiley-Blackwell); Woodward, J., Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1985); Perbal (1988) A Practical Guide To Molecular Cloning; 2d Edition (Wiley-Interscience); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); S.C. Makrides (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells (Elsevier Science); Methods in Enzymology, Vols. 151-155 (Academic Press, Inc., N.Y.); Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds.; 및 Ausubel 등 (1995) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons)]를 참조한다.
항체 공학의 일반적인 원리는 예를 들어, Strohl, W.R., 및 L.M. Strohl (2012), Therapeutic Antibody Engineering (Woodhead Publishing)에 제시된다. 단백질 공학의 일반적인 원리 예를 들어, Park 및 Cochran, eds. (2009), Protein Engineering and Design (CDC Press)에 제시된다. 면역학의 일반적인 원리는 예를 들어 하기에 제시된다: Abbas and Lichtman (2017) Cellular and Molecular Immunology 9th Edition (Elsevier). Additionally, standard methods in immunology known in the art followed, 예를 들어, in Current Protocols in Immunology (Wiley Online Library); Wild, D. (2013), The Immunoassay Handbook 4th Edition (Elsevier Science); Greenfield, ed. (2013), Antibodies, a Laboratory Manual, 2d Edition (Cold Spring Harbor Press); 및 Ossipow and Fischer, eds., (2014), Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Humana Press).
모든 상기에 인용된 참조문헌, 뿐만 아니라 본원에 인용된 모든 참조문헌은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다
하기 실시예는 예시로서 제공되고 제한하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 다가 PD-L1-IgM 융합 단백질의 작제
PD-L1-IgM 융합 단백질 서브유닛을 인코딩하는 2개의 DNA 작제물을 상업적 판매자에 의해 작제하였다. 도 3a 및 도 3b에는 개략도가 도시되어 있다.
제1 작제물은 보체-매개 세포독성을 감소시키거나 제거하기 위해 Cμ3 도메인에서 P311A 및 P313S 아미노산 치환으로 변형된 인간 IgM 불변 영역의 Cμ2, Cμ3, Cμ4, 및 테일피스 (tp) 도메인을 코딩하는 DNA에 융합된, 인간 PD-L1의 신호 펩티드, V1 및 C2 도메인(본원에서 서열번호: 8로서 제시된 UniProtKB/Swiss-Prot: Q9NZQ7.1의 아미노산 1 내지 238)을 코딩하는 DNA를 포함한다(P PCT 공개 번호 WO 2018/187702 참조, 이는 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨). 작제물에 의해 인코딩된 전구체 융합 단백질 아미노산 서열은 본원에서 서열 번호: 11로서 제시되고, 신호 펩타이드("PD-L1-IgM")의 절단에 따른 작제물에 의해서 인코딩된 성숙 융합 단백질의 아미노산 서열은 본원에 서열번호: 11의 아미노산 19 내지 587로서 제시된다. 결합 분자의 육량체 형태의 개략도가 도 3a에 도시되어 있다.
제2 작제물은 변이체 인간 IgG2 힌지 영역 (서열번호: 5)을 코딩하는 DNA에 융합되고 상기와 같은 Cμ3 도메인(서열번호: 6으로서 제시된 힌지-변형된 Cμ3, Cμ4, tp 아미노산 서열)에서 P311A 및 P313S 아미노산 치환으로 변형된 인간 IgM 불변 영역의 Cμ3, Cμ4, 및 테일피스 (tp) 도메인을 코딩하는 DNA에 융합된 인간 PD-L1의 신호 펩티드, V1 및 C2 도메인(서열번호: 8로서 제시된 UniProtKB/Swiss-Prot: Q9NZQ7.1의 아미노산 1 내지 238)을 코딩하는 DNA을 포함한다. 작제물에 의해 인코딩된 전구체 융합 단백질 아미노산 서열은 본원에서 서열번호: 13으로서 제시되고, 신호 펩타이드("PD-L1-H-IgM")의 절단에 따른 작제물에 의해서 인코딩된 성숙 융합 단백질의 아미노산 서열은 본원에 서열번호: 13의 아미노산 19 내지 493으로서 제시된다. 결합 분자의 육량체 형태의 개략도가 도 3b에 도시되어 있다.
생성된 DNA 작제물을 사용하여 표준 방법을 사용하여 Expi293 세포 (ThermoFisher)를 일시적으로 형질감염시켰다. DNA 작제물을 단독으로 형질감염시켜 육량체 단백질을 생성시키거나, 야생형 인간 J-사슬로 공동형질감염시켜 오량체 단백질을 생성시킨다. 다량체 융합 단백질은 제조자의 권고에 따라 포획 선택 IgM 친화성 매트릭스 (BAC, Thermo Fisher Catalog #2890.05)를 사용하여 정제하였다. 생성된 단백질을 전술한 바와 같이 비환원성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅에 의해 적절한 발현 및 조립에 대해 평가하였다(참고 예를 들어, PCT 공개 번호 WO/2018/017888).
인간 IgG1 Fc 영역 ("PD-L1-Fc")에 융합된 인간 PD-L1의 엑토도메인을 포함하는 정제된 융합 단백질은 R&D 시스템 (Cat. # 156-B7)으로부터 구매했다. IgG-Fc 작제물의 개략도는 도 3c에 도시된다.
실시예 2: PD-L1-IgM 및 PD-L1-H-IgM의 활성화에 의한 PD-1-발현 T-세포
PD-1-발현 T-세포를 활성화시키기 위한 PD-L1-IgM 및 PD- L1-H-lgM 융합 단백질의 육량체 및 오량체 버전의 능력을 하기와 같이 평가하였다. PD-1을 통한 활성화시 광을 생성하는 리포터 주르카트(Jurkat) T-세포를 DiscoverX (PathHunter® PD-1 Assay, Cat. # 93-1104C19)에서 구매하고 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 이들 세포에서, 전장 PD-1 수용체는 그의 C-말단에 융합된 작은 β-gal 단편으로 조작되고, SHP-1의 SH2-도메인은 상보적인 β-gal 단편 (EA)으로 조작된다. 이들 작제물은 저켓 세포에서 안정하게 발현된다. 이들 세포의 표면 상의 PD-1의 PD-L1 참여 시, PD-1 융합 단백질은 인산화되어 SHP-1 융합 단백질의 동원을 유도하여 활성 β-gal 효소를 초래한다. 이 활성 효소는 기질을 가수분해하여 수용체 활성의 척도로서 화학발광을 생성한다.
이들 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 구입하거나 제조한 단량체, 오량체 및 육량체 작제물과 접촉시켰다. 조작된 PD-1 및 SHP-1 (DiscoverX)을 갖는 주르카트 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 1시간 동안 PD-L1 융합 단백질과 혼합하였다. PD-1의 결합 및 활성화는 PD-L1의 세포내 도메인에 SHP1의 회합을 초래하였고, 이는 β-갈락토시다제의 공여체 및 수용체 성분을 함께 가져왔다. β-갈락토시다제 활성은 어두운 곳에서 RT에서 3시간 동안 화학발광 기질의 인큐베이션 후 측정되었다. 결과를 도 4 및 표 1에 나타낸다.
Figure pct00003
모든 IgM-기반 융합 단백질은 IgG 융합 단백질에 비해 개선된 활성화 EC50을 가졌다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
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Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
본 개시내용의 폭 및 범위는 전술한 예시적인 구현예 중 임의의 것에 의해 제한되어서는 안되며, 다음의 청구항들 및 이들의 등가물들에 따라서만 정의되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> IGM BIOSCIENCES, INC. <120> MULTIVALENT IGM- AND IGA-FC-BASED BINDING MOLECULES <130> 09789.021WO1 <140> <141> <150> 62/749,429 <151> 2018-10-23 <160> 60 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 453 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn 1 5 10 15 Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp 20 25 30 Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser 35 40 45 Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln 65 70 75 80 Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn 85 90 95 Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys 100 105 110 Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg 115 120 125 Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile 130 135 140 Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr 145 150 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Val Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala 50 55 60 Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp 85 90 95 His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro 100 105 110 Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala 115 120 125 Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp 130 135 140 Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly 145 150 155 160 Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala 165 170 175 Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn 180 185 190 Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser 195 200 205 Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg 210 215 220 Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg 225 230 235 240 Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp 245 250 255 Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg 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Thr Arg Gln 50 55 60 Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn Ile Ser Glu Ser His Pro 65 70 75 80 Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp 85 90 95 Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val Thr His Thr Asp Leu 100 105 110 Ala Ser Ser Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg Pro Lys Gly Val Ala Leu 115 120 125 His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn 130 135 140 Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro 145 150 155 160 Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg Gly Gln Pro Leu Ser Pro 165 170 175 Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gln Ala Pro Gly 180 185 190 Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn 195 200 205 Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala His Glu Ala Leu Pro Asn 210 215 220 Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu 225 230 235 240 Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr 245 250 255 <210> 8 <211> 290 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Arg Ile 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Claims (62)

  1. 2, 5, 또는 6개의 2가 결합 단위 또는 그의 변이체 또는 단편을 포함하는 다량체 결합 분자로서,
    각각의 결합 단위는 2개의 IgA 또는 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체를 포함하되, 이들 각각은 세포의 표면 상에 발현된 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드 또는 그의 단편에 융합되고, 상기 결합 폴리펩티드는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편이 아니고, 그리고 상기 결합 파트너에 대한 결합 폴리펩티드의 결합은 세포에서 신호 전달을 조절하고;
    결합 폴리펩티드의 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11 또는 12개는 동일한 결합 파트너에 결합하고 그 신호 전달을 조절하고; 그리고
    상기 결합 분자는 동일한 결합 파트너에 결합하는 1개 또는 2개의 결합 폴리펩티드를 갖는 1가 또는 2가 결합 분자의 당량보다 더 높은 효능으로 세포에서 신호 전달을 유도하거나 억제할 수 있는, 다량체 결합 분자.
  2. 2, 5, 또는 6개의 2가 결합 단위 또는 그의 변이체 또는 단편을 포함하는 다량체 결합 분자로서,
    각각의 결합 단위는 2개의 IgA 또는 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체를 포함하되, 이들 각각은 결합 폴리펩티드에 융합되고, 상기 결합 폴리펩티드의 적어도 3개는 리간드 또는 그의 수용체 결합 단편을 포함하는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 수용체 엑토도메인을 포함하되, 상기 수용체 엑토도메인은 항체 또는 항체의 항원-결합 단편이 아니고, 그리고 상기 리간드에 대한 수용체 엑토도메인의 결합은 상기 수용체를 발현시키는 세포에서 신호 전단을 조절할 수 있고;
    상기 수용체 엑토도메인의 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11 또는 12개는 동일한 리간드에 결합하고; 그리고
    상기 결합 분자는 동일한 리간드에 결합하는 1 또는 2개의 수용체 엑토도메인을 갖는 단량체성 또는 이량체성 결합 분자의 당량보다 더 높은 효능으로 신호 전달을 조절할 수 있는, 다량체 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 결합 단위는 2개의 IgA 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체를 포함하되, 이들 각각은 IgA Cα3 도메인 및 IgA 테일피스 도메인을 포함하고, 그리고 상기 다량체 결합 분자는 J-사슬 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체를 추가로 포함하는, 다량체 결합 분자.
  4. 제3항에 있어서, 각각의 IgA 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체는 IgA Cα3 및 IgA 테일피스 도메인에 대해 N-말단에 위치한 IgA Cα2 도메인을 추가로 포함하는, 다량체 결합 분자.
  5. 제4항에 있어서, 서열번호: 24의 아미노산 125 내지 353, 또는 서열번호: 25의 아미노산 113 내지 340을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 각각의 IgA 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체는 IgA Cα2 도메인에 대해 N-말단에 위치한 IgA 힌지 영역을 추가로 포함하는, 다량체 결합 분자.
  7. 제6항에 있어서, 서열번호: 24의 아미노산 102 내지 353, 또는 서열번호: 25의 아미노산 102 내지 340을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 결합 단위는 2개의 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체를 포함하되, 이들 각각은 IgM Cμ4 도메인 및 IgM 테일피스 도메인을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  9. 제8항에 있어서, 각각의 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체는 IgM Cμ4 및 IgM 테일피스 도메인에 대해 N-말단에 위치한 IgM Cμ3 도메인을 추가로 포함하는, 다량체 결합 분자.
  10. 제9항에 있어서, 각각의 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체는 IgM Cμ3 도메인에 대해 N-말단에 위치한 IgM Cμ2 도메인을 추가로 포함하는, 다량체 결합 분자.
  11. 제10항에 있어서, 서열번호: 3을 포함하는 인간 IgM 불변 영역의 다량체화 단편을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  12. 제10항에 있어서, 서열번호: 4를 포함하는 인간 IgM 불변 영역의 다량체화 변이체 단편을 포함하고, 상기 다량체 결합 분자는 서열번호: 3의 인간 IgM 불변 영역의 야생형 다량체화 단편을 포함하는 상응하는 결합 분자에 비해 감소된 보체-의존적 세포독성 (CDC) 활성을 갖는, 다량체 결합 분자.
  13. 제9항에 있어서, 각각의 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체는 IgM Cμ3 도메인에 대해 N-말단에 위치한 IgG 힌지 영역 또는 그의 기능적 변이체를 추가로 포함하는, 다량체 결합 분자.
  14. 제13항에 있어서, Cμ3, Cμ4, 및 TP 도메인을 포함하는 인간 IgM 불변 영역의 다량체화 단편에 융합된 변이체 인간 IgG1 힌지 영역을 포함하되, 상기 다량체화 힌지-IgM 불변 영역 단편은 서열번호: 6을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  15. 제13항에 있어서, Cμ3, Cμ4, 및 TP 도메인을 포함하는 인간 IgM 불변 영역의 다량체화 단편에 융합된 변이체 인간 IgG1 힌지 영역을 포함하되, 상기 다량체화 힌지-IgM 불변 영역 단편은 서열번호: 7을 포함하고, 그리고 상기 다량체 결합 분자는 서열번호: 6의 다량체화 힌지-IgM 단편을 포함하는 상응하는 결합 분자에 비해 감소된 CDC 활성을 갖는, 다량체 결합 분자.
  16. 제8항 내지 제15 중 어느 한 항에 있어서, 오량체이고, 그리고 J-사슬 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체를 추가로 포함하는, 다량체 결합 분자.
  17. 제16항에 있어서, 상기 J-사슬 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체는 다량체 결합 분자의 혈청 반감기에 영향을 줄 수 있는 야생형 J-사슬에 비해 하나 이상의 단일 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함하는 변이체 J-사슬이고; 그리고 상기 다량체 결합 분자는 하나 이상의 단일 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 제외하고는 동일하고, 동일한 방식으로 동일한 동물 종에 투여되는 참조 다량체 결합 분자에 비해 동물에게 투여 시 증가된 혈청 반감기를 나타내는, 다량체 결합 분자.
  18. 제17항에 있어서, 상기 J-사슬 또는 그의 기능적 단편은 야생형 인간 J-사슬 (서열번호: 15)의 아미노산 Y102에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  19. 제18항에 있어서, 상기 서열번호: 15의 Y102에 상응하는 아미노산은 알라닌(A), 세린(S), 또는 아르기닌(R)로 치환되는, 다량체 결합 분자.
  20. 제19항에 있어서, 상기 서열번호: 15의 Y102에 상응하는 아미노산은 알라닌(A)로 치환되는, 다량체 결합 분자.
  21. 제20항에 있어서, 상기 J-사슬은 변이체 인간 J-사슬이고, 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  22. 제17항에 있어서, 상기 J-사슬 또는 그의 기능적 단편은 인간 J-사슬(서열번호: 15)의 아미노산 N49, 아미노산 S51, 또는 N49와 S51 둘 모두에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함하고, 서열번호: 15의 위치 S51에 상응하는 단일 아미노산 치환은 트레오닌(T) 치환이 아닌, 다량체 결합 분자.
  23. 제22항에 있어서, 상기 서열번호: 15의 N49에 상응하는 위치는 알라닌(A), 글리신(G), 트레오닌(T), 세린(S) 또는 아스파르트산(D)로 치환되는, 다량체 결합 분자.
  24. 제23항에 있어서, 상기 서열번호: 15의 N49에 상응하는 위치는 알라닌(A)로 치환되는, 다량체 결합 분자.
  25. 제24항에 있어서, 상기 J-사슬은 변이체 인간 J-사슬이고 아미노산 서열 서열번호: 17을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  26. 제22항에 있어서, 상기 서열번호: 15의 S51에 상응하는 위치는 알라닌(A) 또는 글리신(G)로 치환되는, 다량체 결합 분자.
  27. 제26항에 있어서, 상기 서열번호: 15의 S51에 상응하는 위치는 알라닌(A)로 치환되는, 다량체 결합 분자.
  28. 제27항에 있어서, 상기 J-사슬은 변이체 인간 J-사슬이고 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  29. 제3항 내지 제7항 또는 제16항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 J-사슬 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체는 이종성 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 상기 이종성 폴리펩티드는 J-사슬 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체에 직접적으로 또는 간접적으로 융합되는, 다량체 결합 분자.
  30. 제29항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 J-사슬 또는 그의 단편에 융합되는, 다량체 결합 분자.
  31. 제30항에 있어서, 상기 펩티드 링커는 적어도 5개의 아미노산을 포함하지만, 25개 이하의 아미노산을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  32. 제31에 있어서, 상기 펩티드 링커는 GGGGS (서열번호: 19), GGGGSGGGGS (서열번호: 20), GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 21), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 22), 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 23)로 이루어지는, 다량체 결합 분자.
  33. 제29항 내지 제32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩티드는 J-사슬 또는 그의 단편 또는 변이체의 N-말단, J-사슬 또는 그의 단편 또는 변이체의 C-말단에 융합되거나, 또는 J-사슬 또는 그의 단편 또는 변이체의 N-말단 및 C-말단 둘 모두에 융합되는, 다량체 결합 분자.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩티드는 다량체 결합 분자의 흡수, 분포, 대사 및/또는 배출 (ADME)에 영향을 미칠 수 있는, 다량체 결합 분자.
  35. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩티드는 항원 결합 도메인을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  36. 제35항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩티드의 항원 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 다량체 결합 분자.
  37. 제36항에 있어서, 상기 항원-결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일-사슬 Fv (scFv) 단편, 디설파이드-연결된 Fv (sdFv) 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  38. 제37항에 있어서, 상기 항원-결합 단편은 scFv 단편인, 다량체 결합 분자.
  39. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 4개의 동일한 결합 폴리펩티드를 포함하는, 다량체 결합 분자.
  40. 제8항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 오량체이고 10개의 동일한 결합 폴리펩티드를 포함하는, 다량체 결합 분자.
  41. 제8항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 육량체이고, 12개의 동일한 결합 폴리펩티드를 포함하는, 다량체 결합 분자.
  42. 제1항 또는 제3항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 결합 폴리펩티드는 리간드 또는 그의 수용체 결합 단편, 사이토카인 또는 그의 수용체 결합 단편, 성장 인자 또는 그의 수용체 결합 단편, 신경전달물질 또는 그의 수용체 결합 단편, 펩티드 또는 단백질 호르몬 또는 그의 수용체 결합 단편, 면역 체크포인트 조절제 리간드 또는 그의 수용체 결합 단편, 또는 세포외 기질 단백질의 수용체 결합 단편인, 다량체 결합 분자.
  43. 제42항에 있어서, 상기 리간드 또는 그의 수용체 결합 단편은 케모카인, 보체 단백질, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 계열 리간드, 면역 체크포인트 조절제 리간드, 표피 성장 인자 (EGF), 인터페론, 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 (TNFSF) 리간드, 혈관 내피성 성장 인자 (VEGF) 계열 리간드, 형질전환 성장 인자-β 슈퍼패밀리 (TGFβsf) 리간드, 그의 임의의 수용체 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  44. 제43항에 있어서, 상기 결합 폴리펩티드는 TNFSF 리간드를 포함하고, 그리고 상기 TNFSF 리간드는 TRAIL, OX40 리간드, CD40 리간드, 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체 리간드(GITRL), 4-1BB 리간드, 그의 임의의 수용체 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  45. 제42항에 있어서, 상기 결합 폴리펩티드는 면역 체크포인트 조절제 리간드 단백질 또는 그의 수용체 결합 단편을 포함하고 상기 면역 체크포인트 조절 단백질은 CD86 또는 그의 수용체 결합 단편, CD80 또는 그의 수용체 결합 단편, PD-L1 또는 그의 수용체 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  46. 제45항에 있어서, 상기 결합 폴리펩티드는 인간 PD-L1의 수용체 결합 단편을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  47. 제46항에 있어서, 상기 결합 폴리펩티드는 인간 PD-L1의 V-형 도메인을 함유하는 서열번호: 8의 아미노산 19 내지 127을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  48. 제47항에 있어서, 상기 결합 폴리펩티드는 인간 PD-L1의 V-형 및 C2-형 도메인을 함유하는 서열번호: 9를 포함하는, 다량체 결합 분자.
  49. 제48항에 있어서, 아미노산 서열 서열번호: 11 또는 서열번호: 13을 포함하는 폴리펩티드의 10 또는 12개의 카피를 포함하는, 다량체 결합 분자.
  50. 제49항에 있어서, 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 변이체 J-사슬을 추가로 포함하는, 다량체 결합 분자.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1의 효능제인, 다량체 결합 분자.
  52. 제1항 또는 제3항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 파트너는 세포-표면 수용체 단백질 또는 면역 체크포인트 조절제인, 다량체 결합 분자.
  53. 제2항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용체 엑토도메인은 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 수용체(TNFrSF)의 리간드 결합 단편, 면역 체크포인트 조절제 수용체의 리간드 결합 단편, TGFβ 수용체의 리간드 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  54. 제53항에 있어서, 상기 TNFrSF 수용체 단편은 수용체-4를 함유하는 사멸 도메인(DR4), 수용체-5를 함유하는 사멸 도메인(DR5), OX-40, CD40, 4-1BB, 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체(GITR), 또는 이들의 임의의 조합의 리간드 결합 단편을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  55. 제53항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 조절제 수용체 엑토도메인은 PD-1의 리간드 결합 단편, CTLA4의 리간드 결합 단편, LAG3의 리간드 결합 단편, CD28의 리간드 결합 단편, 수용체 2를 함유하는 면역글로불린-유사 도메인(ILDR2)의 리간드 결합 단편, T-세포 면역글로불린 뮤신 패밀리 일원 3 (TIM-3)의 리간드 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  56. 제53항에 있어서, 상기 TGFβ 수용체는 TGFβR-1, TGFβR-2, TGFβR3, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 다량체 결합 분자.
  57. 제1항 내지 항56 중 어느 한 항의 다량체 결합 분자의 서브유닛을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 이들 각각의 서브유닛은 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드 또는 그의 단편, 또는 리간드에 특이적으로 결합하는 수용체 엑토도메인에 융합된 IgA 또는 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 다량체화 단편 또는 변이체를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  58. 제57항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  59. 제58항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  60. 제59항에 있어서, 제16항 내지 제38항 중 어느 한 항의 J-사슬 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 숙주 세포.
  61. 치료가 필요한 대상체에서 자가면역 장애, 염증성 장애, 또는 이들의 조합을 치료하는 방법으로서, 제45항 내지 제55항 중 어느 한 항의 다량체 결합 분자의 유효량을 상기 대상체에게 투여하되, 상기 다량체 결합 분자는 동일한 결합 파트너에 결합하는 단량체성 또는 이량체성 결합 분자의 당량보다 더 큰 효능을 나타내는, 방법.
  62. 이식 수령체에서 이식 거부를 방지하는 방법으로서, 제45항 내지 제55항 중 어느 한 항의 다량체 결합 분자의 유효량을 상기 대상체에게 투여하되, 상기 다량체 결합 분자는 동일한 결합 파트너에 결합하는 단량체성 또는 이량체성 결합 분자의 당량보다 더 큰 효능을 나타내는, 방법.
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