JP2000515731A

JP2000515731A - ６量体融合タンパク質およびその使用

Info

Publication number: JP2000515731A
Application number: JP10501910A
Authority: JP
Inventors: チャイキン，マージェリー・アン; リン，サリー・ドリーン・パトリシア; スウィート，レイモンド・ホイットニー; トルネー，アルムセッジド
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1996-06-14
Filing date: 1997-06-13
Publication date: 2000-11-28
Also published as: WO1997047732A2; WO1997047732A3; AU3804397A; EP0975355A2; CA2257861A1

Abstract

(57)【要約】ＩｇＡ抗体由来の尾部を用いて得られる２量体結合タンパク質を含有する６量体融合タンパク質を記載する。この融合タンパク質は治療薬およびワクチンにおいて有用であるが、結合親和性が低いため、その誘導される結合タンパク質が満足のいくものでない用途に、またはマルチバレンシーが望ましい用途に、特に適している。これらの用途は診断、結合アッセイおよびスクリーニングアッセイを包含する。

Description

【発明の詳細な説明】６量体融合タンパク質およびその使用関連出願本願は1996年６月14日出願の米国仮特許出願番号60/019,934、1997年２月19日出願の出願番号60/043,948および1997年２月21日出願の出願番号60/038,915の利益を主張する。発明の背景ＩｇＭおよびＩｇＡは同種オリゴマー構造を形成する２種のヒト抗体である。このうち、断然広く研究されているのはＩｇＭである。ＩｇＭ構造の古典的見解は、別のタンパク質の単一コピーと一緒になっている５量体としてのものであり、そのＪ−鎖がその組み立ておよび輸出の間にＩｇＭと結合するようになる。このＪ−鎖は、Ｊ−鎖のシステイン残基と、重鎖の規定Ｃ−末端定常領域からのショート１８アミノ酸拡張部（μｔｐと称される）のシステイン残基との間にジスルフィド結合を形成することでＩｇＭと共有結合することができる。このシステイン残基がＪ−鎖との結合におけるＩｇＭ５量体の形成に不可欠であることは明らかである[A.C.Davisら、EMBO J.,8(9):2519-2526(1 989)]。しかし、Ｊ−鎖のない、６量体形態のＩｇＭが過去２０年間にわたって記載かつ特徴付けられており、最近ではその生物化学および生物学的活性の可能性についてさらに詳細に特徴付けられている[Brewerら、Immunology Today,15.: 165-168(1994)の報文を参照のこと]。オリゴマーＩｇＧタンパク質の産生は、ＤＮＡ組換え技法により１８アミノ酸ＩｇＭ尾部セグメント（μｔｐ）をＩｇＧ１ −４タンパク質のＣγ３領域のαｔｐ対応Ｃ−末端に添加することにより達成された[R.I.F.SmithおよびS.L.Morrison，Biotechnology,12:683-688(1994);R.I.F .Smithら、J.Immunol.,154:2226-2236(1995)]。ヒトＩｇＡもまた、μｔｐとある程度の配列相同性を有する１８アミノ酸尾部セグメント（αｔｐ）を有する。ヒトには、別個の配列をコードする２つのα定常領域遺伝子座があるが、α１とα２領域の尾部はほとんど類似しているか、またはある場合には同一であると報告されている[Sequences of Proteins of Immuno logical Interest,fifth edition,EA Kabatら、Vol.1,U.S.Department of Healt h and Human Services,NIH publication no.91-3242,(1991)]。しかしながら、ＩｇＭと異なり、ＩｇＡは、大抵、ＩｇＧサブクラスに類似する、単量体抗体として、または１分子のＪ−鎖を加えた２量体抗体として生じる[MesteckyおよびK ilian、Methodsin Enzymology,116:37-75(1985);T.B.Tomasi、Immun.Today,13:4 16-418(1992)]。ＩｇＡのより大きなオリゴマー／凝集体が報告されている[Mest eckyおよびKilian、前掲]が、これらはＩｇＡと相互作用する他のタンパク質を含む複合混合物中のほとんど特徴付けされていない成分である。組換えＩｇＡをＪ−鎖の存在および不存在下で発現させた[Bmggemannら、J.Exp.Med.,166:1351- 1361(1987);Mortonら、J.Immunol.,151:4743-4752(1993);Carayannopoulosら、P roc.Natl Acad Sci,USA ,91:8348-8352(1994);Terskikhら、Mol.Immunol.,31:131 3-1319(1994)]。Ｊ−鎖の不存在下で産生されるＩｇＡタンパク質は、非還元ＳＤＳ／ＰＡＧＥによれば単量体または２量体形態であり、溶液中では２量体のようである。ある実験（Carayarmopoulosら、前掲）では、Ｊ−鎖との共同発現によりＪ−鎖とジスルフィド結合したＩｇＡ２量体の形成が得られた。免疫グロブリンスーパーファミリーの分子の一の構成員である、ＣＤ２８（ＩｇＳＦ）[A.F.WilliamsおよびA.N.Barclay、Annu.Rev.Immunol.,6:381-405(1988 )]は、胸腺細胞および脾臓、リンパ節および末梢血管中の末梢Ｔ細胞を含め、Ｔ −連結細胞の表面で発現される４４ｋＤａの同種２量体糖タンパク質である。ＣＤ２８は２種の異なるカウンターレセプターＣＤ８０（Ｂ７およびＢ７.１とも称される）[P.S.Linsleyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87(13):5031-5035(1990); G.J.Freemanら、J.Exp.Med.,174(3):625-631(1991)]および抗原提示細胞（ＡＰＣ）で発現される、ＣＤ８６（Ｂ７.２およびＢ７０とも称される）[M.Azumaら、Nature,366(6450):76-79(1993);G.J.Freemanら、J.Exp.Med.,178(6):2185-219 2(1993);G.J.Freemanら、Science,262(5135):909-911(1993)］と相互作用し、細胞質ドメインを介するＰＩ３−キナーゼの結合[F.Pagesら、Nature,369(6478):327-329(1994);P .H.Steinら、Molecul.& Cell.Biol.,14(5):3392-3402(1994)]および他のシグナル化経路［K.E.Truittら、J.Immunol.,155:4702-4710(1995);J.A.Nunesら、J.Bi ol.Chem. ,271(3):1591-1598(1996);H.Schweiderら、Eur.J.Immunol.,25:1044-10 50(1995)］を通して、Ｔ細胞の活性化を維持するための共同刺激シグナルをデリバリーする。ＣＤ８０［P.S.Linsleyら、J.Exp.Med.,174(3):561-569(1991)］およびＣＤ８６［Azumaら、前掲;Freemanら、1993、前掲;Freemanら、1993、前掲, ］はまた共に、活性化ＣＤ８⁺およびＣＤ４⁺Ｔ細胞上に一時的かつ低レセプター密度で発現された、ＣＤ２８の相同体、ＣＴＬＡ−４を認識する[J.F.Brunetら、Nature,328(6127):267-270(1987)]。ＣＤ８０およびＣＤ８６に対して特定のＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質または抗体を用いて、ＣＤ２８のＣＤ８０またはＣＤ８６カウンターレセプターとの相互作用を拮抗することで、インビトロにおけるＴ細胞活性化が阻害され、インビボにおける体液および細胞性免疫応答が抑制され、移植片拒絶反応が阻害され、インビボにおける自己免疫疾患の進行が阻害される[J.A.Bluestone,Immunity,2 :555-559(1995);Harlanら、Clin.Immunol.and Immunopath.,75(2):99-111(1995 )を参照のこと]。すなわち、ＣＤ２８は免疫抑制剤を開発するための標的である。小型分子のアンタゴニストを同定するには、合成化合物、天然物質およびペプチドをスクリーニングするための迅速かつ再現可能なアッセイが望ましい。特に、細胞を基礎とする検定の他の成分による干渉からレセプターおよびそのカウンターレセプターを分離し、付加的にはオートメーションに適用可能な、タンパク質を基礎とする検定が望ましい。ＣＤ２８と両方のカウンターレセプターとの相互作用の親和性は極めて低く[P.S.Linsleyら、Immunity,1:793-801(1994)]、可溶性ＣＤ８０−Ｉｇ融合タンパク質と固定されたＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質との結合ではＫｄは概算で２００ｎＭである[P.S.Linsleyら、J.Exp.Med.,173(3 ):721-730(1991)]。親和性が低いため、多くの化合物をスクリーニングするのに敏感に反応する感受性タンパク質結合検定の開発が妨げられている。必要なものは、スクリーニングおよび診断検定、治療薬およびワクチンにて用いるための、結合タンパク質、特に低親和性の結合タンパク質の親和力を増大させる方法である。発明の要約一の態様にて、本発明は、その６量体融合タンパク質を誘導するタンパク質と比較して結合活性の増大した融合タンパク質およびその製法を提供するものである。この融合タンパク質は結合検定にて特に有用であり、容易に精製することができる。本発明の６量体融合タンパク質は、２量体結合タンパク質およびＩｇＡ抗体の重鎖のＣ−末端の尾部の活性により特徴付けられる尾部（αｔｐ）を有する。一の具体例において、結合タンパク質は、本来的に２量体の結合タンパク質またはその機能的フラグメントである。もう一つ別の具体例において、結合タンパク質を組換え操作して２量体の形態とする。これは選択された結合タンパク質の細胞外ドメインを含有するタンパク質フラグメントをＦｃフラグメントに融合することで行うことが好ましい。これらの結合タンパク質は、αｔｐが与えられると、同種または異種−６量体を構成する。さらに別の態様において、本発明は、本発明の安定した６量体融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。さらなる態様において、本発明は、上記のポリヌクレオチド配列および選択された宿主細胞中における融合タンパク質の発現を制御する配列を有してなるベクターを提供する。さらに別の態様において、本発明は、上記ベクターを含有する組換え宿主細胞を提供する。さらなる態様において、本発明は、本発明の安定した６量体融合タンパク質を含有する宿主細胞を供給し、その安定した６量体融合タンパク質を回収し、その回収されたタンパク質を精製することにより、安定した６量体融合タンパク質の産生および精製方法を提供する。融合タンパク質の鎖は、好ましくは、宿主細胞中にて同時産生されて構成される。さらに別の態様において、本発明は、安定した６量体融合タンパク質または本発明の安定した６量体誘導タンパク質をコードするＤＮＡ配列と、医薬上許容される担体とを有する医薬上許容される組成物を提供する。もう一つ別の態様において、本発明は、本発明の６量体融合タンパク質のリガンドについてのスクリーニング法を提供する。また、６量体結合タンパク質／リガンドの相互作用の阻害剤についての検定も提供する。本発明の別の態様および利点はさらに以下の詳細な記載に開示する。図面の簡単な記載図１は本発明の６量体ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐタンパク質の模式図である。ＣＤ８０細胞外ドメイン、ＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインおよびαｔｐセグメントに対応する領域を図示する。その図式中の「Ｓ」なる文字はシステイン残基の間の推定ジスルフィド結合の位置を示す。図２は本発明のＣＤ８０−Ｉｇαｔｐタンパク質の発現構築物を示すプラスチド地図である。該プラスチドは大きさが７１６７個の塩基対である。時計回りで残基１で開始し；「ｃｍｖｐｒｏ」は下流にあるＣＤ８０−Ｉｇαｔｐコーディング配列を転写するための主要後期ＣＭＶプロモーターであり；「ＣＤ８０」はヒトＣＤ８０のシグナルペプチドおよび細胞外ドメインをコード化し；「Ｆｃ」はヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコード化し；「αｔｐ」はヒトαｔｐセグメントをコード化し；「ＢＧＨ」はウシ成長ホルモン遺伝子から由来のポリアデニル化シグナル領域であり；「ベータグロビン」はマウス主要ｂ−グロビンプロモーターであり；「ｄｈｆｒ」はマウスｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）タンパク質をコード化し；「ＳＶ４０」はｓｖ初期ポリアデニル化領域であり；および「ｏｒｉ」および「ａｍｐ」は、各々、一般的クローニングプラスミドｐＢＲ３２２の細菌の複製起点およびベータラクタマーゼ遺伝子である。ＣＤ８６−ＩｇαｔｐおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇαｔｐタンパク質を発現させるための、対応するプラスミドＣＤ８６ＦｃαｔｐｌｉｎｋおよびＣＴＬＡ４Ｆｃαｔｐｌｉｎｋを構築した(図５および６を参照のこと)。図３Ａ−３Ｈは図２に示されるＣＤ８０Ｆｃαｔｐｌｉｎｋプラスミド［配列番号：１］の完全ＤＮＡ配列である。図４Ａ−４ＤはベクターＣＤ８０−Ｆｃαｔｐｌｉｎｋ中のＣＤ８０−Ｉｇα ｔｐ領域についてのＤＮＡおよびコードされるタンパク質［配列番号：２および３］である。太字領域は図２についての制限部位、および開始コドン、成熟プロセッシング部位、ヒンジ領域、およびＣ−末端αｔｐセグメントを示す。図５Ａ−５ＢはベクターＣＤ８６Ｆｃαｔｐｌｉｎｋ中のＣＤ８６の細胞外ドメインについてのＤＮＡおよびコードされるタンパク質配列［配列番号：４および５］である。ＫｐｎＩおよびＥａｇＩ部位の外部の配列はＣＤ８０Ｆｃαｔｐｌｉｎｋに関しては同じである(図３Ａ−３Ｈおよび４Ａ−４Ｈを参照のこと)。図６Ａ−６ＣはベクターＣＴＬＡ４−Ｆｃαｔｐｌｉｎｋ中のＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインおよびＣＭＶプロモーターについてのＤＮＡおよびコードされるタンパク質配列［配列番号：６および７］である。ＥａｇＩ部位の５’ないし塩基５１４および３’配列はＣＤ８０Ｆｃαｔｐｌｉｎｋに関しては同じである。図７はＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムのＣＤ８０−Ｉｇαｔｐのクロマトグラフィーについての特性を示す。約４５分で溶出している最初のピークは６量体タンパク質複合体であり、一方では第２ピークは単量体ＣＤ８０−Ｉｇについて観察される位置に移動している。挿入図は還元（Ｒ）および非還元条件下でＳＤＳ／ＰＡＧＥ上の精製ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐタンパク質のクマシー染色パターンを示す。図８は６量体／（６量体）₂平衡に合致するようにモデルされたＣＤ８０−Ｉｇαｔｐタンパク質の平均沈降速度（主要パネル）および沈降速度（挿入図）の分析的遠心分離を示すチャートである。上のグラフは残りの平均的沈降遠心分離を示す。図９はＥＬＩＳＡフォーマットにおけるビオチニル化ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐ（標識されたＢ７−ＦｃＡ）の３種の異なる濃度で固定されたＣＤ２８−Ｉｇへの結合を示す線グラフである。結合はｍＡｂＣＤ２８.１でまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇで阻害された。図１０はＥＬＩＳＡフォーマットにおけるビオチニル化ＣＤ８Ｏ−Ｉｇαｔｐ、ＣＤ８６−ＩｇαｔｐおよびＣＤ８０−Ｉｇの固定されたＣＤ２８−Ｉｇへの結合を比較して示す線グラフである。図１１はＥＬＩＳＡフォーマットにおけるビオチニル化ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐ、ＣＤ８６−ＩｇαｔｐおよびＣＤ８０−Ｉｇの固定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇへの結合を比較して示す線グラフである。図１２は、ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐその物、ＣＤ８０−Ｉｇ、ＣＴＬＡ４−ＩｇおよびＣＤ２８.２ｍＡｂによる、固定されたＣＤ２８−Ｉｇ（２００ｍｇ／ｍｌで被覆）へのビオチニル化ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐ結合の競合を示す線グラフである。図１３ＡはＣＤ８０−Ｉｇαｔｐの野生型および変異体固定されたＣＤ２８− ｍｕＩｇ２ａタンパク質への結合を示す線グラフである。図１３ＢはＣＤ８６−Ｉｇαｔｐの野生型および変異体固定されたＣＤ２８− ｍｕＩｇ２ａタンパク質への結合を示す線グラフである。図１３Ｃはウサギポリクローナル抗血清の野生型および変異体固定されたＣＤ２８−ｍｕＩｇ２ａタンパク質への結合を示す線グラフである。図１４は、表面プラスモン共鳴により測定された、ＣＤ８０−ＩｇおよびＣＤ８０−Ｉｇαｔｐのバイオセンサーチップに固定されたＣＤ２８−Ｉｇへの結合を連続して示すチャートである。図１５は、表面プラスモン共鳴により測定された、ＣＤ８０−ＩｇαｔｐおよびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐのバイオセンサーチップに固定されたＣＤ２８−Ｉｇへの結合を示すチャートである。図１６Ａおよび１６Ｂは、各々、ＣＤ８０−ＩｇαｔｐおよびＣＤ８６−Ｉｇ αｔｐの、この相互作用を阻害するＣＤ２８モノクローナル抗体の存在または不存在下でその表面にヒトＣＤ２８を発現する細胞への結合を示す線グラフである。図１７は、単量体および６量体のＣＤ８０（各々、標識されたＢ７.１−ＩｇおよびＢ７.１−ＩｇＡ）およびＣＤ８６（各々、標識されたＢ７.２−ＩｇおよびＢ７.２−ＩｇＡ）Ｉｇ融合タンパク質で処理されたＰＣＤ２８.１細胞によるＩＬ−２産生のレベルを示す棒グラフである。該タンパク質は（１）溶液中にて単独で、（２）ヤギ抗ヒト抗体（ＧＡＨ）に単独で固定されて、または（３）固定されたＣＤ３ｍＡｂと一緒に固定されて用いられた。対照はＧＡＨ単独か、ＣＤ３ｍＡｂおよびＣＤ２８ＩｇＭｍＡｂ２４８.２３.２と一緒であった。ＩＬ−２レベルを標体として既知量のＩＬ−２を用いるＣＴＬＬ−２バイオアッセイにより測定した(挿入図)。図１８は図１７に記載されるように処理されたＣＤ２７.ＣＤ２８ｗｔ細胞によるＩＬ−２産生のレベルを示す棒チャートである。図１９は図１７に記載されるように刺激されたＰＣＤ２８.１細胞中のＩＬ− ２プロモーター活性を示す棒チャートである。ＩＬ−２プロモーター活性は、ＩＬ−２プロモーターの調整下でレセプター遺伝子として供するβ−ガラクトシダーゼ活性の誘発により測定された。図２０Ａおよび２０Ｂは、各々、ＩＬ−２プロモーターの誘発、およびＣＤ８０−Ｉｇαｔｐ、ＣＤ８６−ＩｇαｔｐまたはＣＤ８０−Ｉｇと共にインキュベーションされたＣＤ２８発現細胞によるＩＬ−２産生を示す棒グラフである。図２０Ｃは、ＣＤ３に固定された抗体により誘発されるレベルと比較した、可溶性ＣＤ８０−ＩｇαｔｐおよびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐで誘発されたＩＬ−２産生のレベルを示す棒グラフである。図２１は、ＢＭ−３４試験セットでの個々の化合物による固定されたＣＤ２８ −Ｉｇへのビオチニル化ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐ結合の阻害を示す棒チャートである。％阻害範囲をその区域の阻害を示す化合物の数に対してプロットする。図２２は、挿入図に示される固定されたＥＰＯγ−Ｉｇタンパク質に対して結合活性を有するＥｐｏレセプター抗体１Ｃ８のキメラ優動体（本明細書中、標識された「抗−ＥＰＯγ−ＩｇＧ₁」）および同じ抗体のαｔｐ構築物（標識された「抗−ＥＰＯγ−ＩｇＧ₁αｔｐ」）のＳｕｐｅｒｏｓｅ６クロマトグラフィーの特性を示す。発明の詳細な記載本発明は治療用および免疫原性組成物に有用な６量体融合タンパク質を提供する。本発明の６量体融合タンパク質は、そのタンパク質を誘導する結合タンパク質が、結合親和性／活性が低いために満足いくものではない用途に、およびマルチバランスが望ましい他の用途に特に適している。これらの用途は診断、結合検定、スクリーニング検定およびレセプター交差連結に基づく細胞応答を包含する。さらにこれらの融合タンパク質の産生および精製のための組成物および方法も提供される。本発明はさらには、ＩｇＡ尾部（αｔｐ）またはその機能的等価物を有する選択された結合タンパク質を提供することで、安定した６量体融合タンパク質を提供する方法を提供する。本発明者らは、天然に存する単量体または２量体のＩｇＡから由来のαｔｐを添加することで安定した６量体の形成能を有する融合タンパク質が得られることを見出した。 I．融合タンパク質本明細書にて用いる場合、本発明の６量体融合タンパク質は、そのカルボキシ末端に、ＩｇＡ抗体の重鎖のＣ−末端からの尾部（αｔｐ）の活性を有することで特徴付けられる尾部を有する２量体結合タンパク質を含有する。この尾部は、２量体結合タンパク質の各単量体に結合すると、その結果、安定した６量体の形成能を有する融合タンパク質を提供する。すなわち、本発明の６量体融合タンパク質は、溶液（例えば、リン酸緩衝セイライン）中、室温で認識できる程のいずれの分解作用も受けることはない。特に好ましい具体例において、本発明の融合タンパク質は同種６量体である。しかし、所望により、２種の異なる融合タンパク質を有してなる異種６量体を構築してもよい。本発明において有用な結合タンパク質は、十分な長さのタンパク質およびその十分な長さのタンパク質の結合能により特徴付けられるフラグメント、すなわち、選択された結合タンパク質のカウンター−レセプターまたは他のリガンドとの結合能を有するフラグメントを包含する。かかる結合タンパク質は生物学的活性のために最初から２量体化しているタンパク質またはタンパク質複合体から誘導してもよく、または本明細書に記載されているように遺伝子工学的に処理されていてもよい。適当な天然に存する２量体結合タンパク質の例は、リンカーを用いてまたは用いることなく、αｔｐの各ポリペプチド鎖のカルボキシル末端への付加がαｔｐ鎖の近位で可能であるような位置付けられるカルボキシル末端を有するタンパク質である。当業者であればそのようなネイティブな２量体タンパク質または２量体タンパク質複合体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＤまたはＩｇＥ抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ₂フラグメント、Ｉｇ−Ｆｃフラグメント、Ｉｇ融合タンパク質およびＴ細胞レセプター、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４のα／β鎖、ＣＤ８α／β異種２量体およびα／α同種２量体、ならびにインテグリンタンパク質および種々のサイトカインレセプター（例えば、ＩＬ３、ＩＬ５など）のα／β 鎖などの細胞表面タンパク質の細胞外ドメインを含む、タンパク質を容易に選択することができる。これらの結合タンパク質は種々市販されており入手可能である。また、これらの配列は化学的に合成することもできる。前記したように、選択された結合タンパク質を２量体に改変してもよい。例えば、選択された単量体結合タンパク質の結合ドメインを有してなるタンパク質フラグメントを、２量体を形成するＩｇ−Ｆｃフラグメントに結合させてもよい。結合タンパク質は、免疫グロブリンスーパージンファミリーの表面タンパク質およびそのリガンドより選択されることが望ましい。例えば、今のところ好ましい具体例において、結合タンパク質はＣＴＬＡ−４（その細胞外ドメインは単量体または２量体として発現されうる）およびそのカウンター−レセプターＣＤ８０およびＣＤ８６より選択される。しかし、他の結合タンパク質を含め、他のタンパク質も当業者に知られており、本発明の６量体融合タンパク質の構築に用いてもよい。現在のところ本発明の好ましい具体例は６量体免疫グロブリン融合タンパク質を提供するものであるが、本発明はそのように限定されるものではない。例えば、結合タンパク質は、一般に、修飾してその活性を改変することができる。例えば、改変された変異形のＩＬ４は、そのレセプターに対して高親和性を保持するが、通常のアゴニスト活性を欠き、ＩＬ−４介在機能のアンタゴニストとして供すると記載されている[例えば、N.Kruseら、EMBOJ.,11:3237-3244(1992) およびWO96/04388(Feb.15,1996)を参照のこと]。そのような変異体は、ＩＬ４機能のアンタゴニストとして供し、本発明の６量体ＩＬ４−Ｉｇ融合タンパク質において有用であろう。２量体結合タンパク質を構築するために用いられるタンパク質フラグメントは、選択された結合タンパク質の細胞外ドメインの少なくとも１個のフラグメントを含有する。機能的に結合活性であるために、この細胞外フラグメントは、当業者が容易に決定することのできる、結合に必要な配列を有していることが好ましい。真核細胞産生系を使用する、一の好ましい具体例において、タンパク質フラグメントはまた、選択される結合タンパク質に対してネイティブな輸出リーダー配列を有する。しかし、当業者であれば、タンパク質の輸出能を有する他の輸出リーダー配列と置き換えることもできる。標的がＣＤ２８である一の代表的な具体例において、タンパク質フラグメントはネイティブなリーダー配列およびＣＤ８０またはＣＤ８６より由来の細胞外ドメインである。そのフラグメントはＣＤ８０などのタンパク質[P.S.Linsleyら、J.Exp.Med.,173(3):721-730(1991);Trun ehら、Mol.Immunol.,33(3):321-334(1996);J.E.Ellisら、J.Immunol.,56:2700-2 709(1996)]、およびＣＤ８６などのタンパク質[P.S.Linsleyら、Immunity,1:793 -801(1994);J.E.Ellisら、前掲;P.S.Linsleyら、J.Exp.Med.,174:561-569(1991) ]より得ることができる。標的がＣＤ８０またはＣＤ８６である他の具体例において、タンパク質フラグメントは、ネイティブなリーダー配列およびＣＴＬＡ− ４またはＣＤ２８からの細胞外ドメインである。６量体融合タンパク質を構築するのに用いられるＦｃフラグメントは、ＩｇＡを除く、いずれの抗体サブクラスからのものであってもよい。すなわち、ＦｃフラグメントはＩｇＧ、ＩｇＤまたはＩｇＥサブクラスから誘導することができる。ＦｃフラグメントがＩｇＧ抗体から誘導される場合、いずれのヒトイソ型、すなわち、ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃およびＩｇＧ₄を選択してもよい。さらには、親のＩｇＧ抗体を変異させ、補体またはＩｇ−Ｆｃレセプターへの結合を減少させることもできる[例えば、A.R.Duncanら、Nature,332:563-564(1988);A.R.Du ncanおよびG.Winter、Nature,332:738(1988);M.-L.Alegreら、J.Immunol.,148:3 461-3468(1992); M-H Taoら、J.Exp.Med,178:661-667(1993);V.Xuら、J.Biol.Chem.,269:3469-347 4(1994)を参照のこと]。Ｉｇ−ＦｃフラグメントがＩｇＭより誘導される場合、それはヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３／ＣＨ４配列を含有することが望ましいが、それは天然に存在する１８個のアミノ酸尾部（μｔｐ）以外のフラグメントである。所望により、ＦｃフラグメントのＩｇＧ₁ＣＨ３ドメインのＣ−末端を常套手段により修飾し、尾部セグメント（すなわち、本発明のペプチド）のクローニングを都合よく行うために制限酵素を含めるようにしてもよい。かかる修飾は以下の実施例において詳細に記載されており、当業者によく知られている。本発明の融合タンパク質を構築するのに用いられるペプチドはＩｇＡ抗体の重鎖のＣ−末端に位置する尾部から誘導される。好ましい具体例において、このペプチドは長さが１８個の残基であり、ヒトＩｇＡ１重鎖のαｔｐセグメントまたはその機能的等価物である。一の特に適当なペプチドは： PTHVNVSVVMAEVDGTCY［配列番号：３］である。所望により、このペプチドを修飾し、残基５−７（ＮＶＳ）の１または２個のアミノ酸を変換することによりグリコシル化部位を除去してもよい。例えば、Ｎ（アスパラギン）をＱ（グルタミン）に変換してもよく、および／またはＳ（セリン）をＡ（アラニン）に変換してもよい。加えて、ヒトＩｇＡＣＨ３ドメインの約４個までのアミノ酸残基を保持してもよい。また、ヒトＩｇＡ１αｔｐの機能的等価物を選択してもよい。適当な機能的等価物は、例えば、ゴリラＩｇＧ１、ヒトＩｇＡ２、ウサギＩｇＡおよびマウスＩｇＡを包含する。そのような機能的等価物はまた、グリコシル化部位を除去することにより修飾することもできる。本明細書に記載されているように、このペプチドを結合タンパク質（例えば、Ｉｇ−Ｆｃフラグメント）に直接または間接的に連結し、安定した６量体を組み立てる能力を有する本発明のタンパク質が得られる。融合蛋白はリンカー配列を含んでいてもよい。かかるリンカーは結合蛋白（例えば、Ｉｇ−Ｆｃフラグメント）とαｔｐペプチドとの間に存在していてもよい。好ましくは、このリンカーは、約１個ないし２０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、より好ましくは、約１個ないし１２個のアミノ酸残基の長さである。当業者は、他の適当または望ましいリンカーを容易に選択できる。現在あまり好ましくないものであっても、当業者は、上記の好ましいアミノ酸配列のリンカーのかわりに他のリンカーを用いることもできる。本発明融合蛋白についての、現在のところ好ましい３つの具体例、ＣＤ８０− Ｉｇαｔｐ、ＣＤ８６−ＩｇαｔｐおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇαｔｐをここに説明する。これらの蛋白は、それぞれＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６(Ｂ７．２，Ｂ７０)、およびＣＴＬＡ−４表面糖蛋白の元来のリーダーおよび細胞外ドメインを含み、それらはヒトＩｇＧ₁（Ｆｃフラグメント）の重鎖のヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３領域に連結されており、ヒトＩｇＡ１（αｔｐ）由来のショートテイルピースセグメント（short tail piece segment）において終結する。本発明六量体蛋白の別の例はＩｇＧ抗体であり、該抗体中、αｔｐは重鎖のカルボキシ末端に直接結合しており、軽鎖はこの重鎖とペアーになっている。本発明のαｔｐ六量体抗体おおびＩｇ融合蛋白は、本発明六量体が市販クロマトグラフィー支持体により容易に精製され、より効果的に発現されるという点で、ＩｇＭ抗体およびＩｇＭ融合蛋白よりも有利である。これらの構築物を、既知方法を用いて製造することができる。本発明のこれらの典型的な融合蛋白の構築の詳細な説明を、後で実施例において行う。簡単に説明すると、二量体結合蛋白の各鎖を選択または構築する。例えば、１の好ましい結合蛋白は、ヒトＩｇＧ抗体から選択されるＩｇ−Ｆｃフラグメントに融合した、元来のリーダーおよび細胞外ドメインを含む組み換え免疫グロブリンである。所望により、コーディング配列のサイレント変異を用いて慣用的な制限エンドヌクレアーゼ部位を結合蛋白のＣ−末端付近（例えば、Ｆｃ領域）に導入し、ついで、テイルピースセグメントをコードするこの部位中に合成オリゴヌクレオチドを組み込むことによりαｔｐを付加する。テイルピースセグメントをヒトα−１のそれに合致させる。テイルピースは、六量体を形成する能力のある融合蛋白を提供し、得られる構築物は本発明の六量体融合蛋白である。典型的な本発明融合構築物であるＣＤ８０−Ｉｇαｔｐに関する予想六量体を図１に図式的に示す。好ましくは、組み換え法を用いて本発明融合蛋白を製造する。望ましくは、核酸配列を融合させ、融合蛋白を適当な宿主細胞においてインビトロで発現させてもよい。別法として、本発明蛋白フラグメントおよびαｔｐフラグメントをコードする核酸配列を別々に発現させ、あるいは同時発現させ、ついで、発現生成物を融合させることにより本発明融合蛋白を製造してもよい。適当には、得られる融合蛋白は六量体を形成する。これらの製造方法を、後でより詳細に説明する。II ．ポリヌクレオチド配列、発現および精製さらに本発明は、本発明融合蛋白をコードするポリヌクレオチド配列を包含する。ＤＮＡコーディング鎖のほかに、本発明核酸配列は、非コーディング鎖であるＤＮＡ（相捕的ＤＮＡを包含）配列およびメッセンジャーＲＮＡ配列を包含する。これらの種々の本発明核酸は、遺伝コードの縮重による変種を包含し、それらも本発明に包含される。当業者は、かかる変種を容易に同定および／または構築できる。さらに、所望により、定量を容易にするためにアッヤイ可能タグを容易に付加することにより、ポリヌクレオチド配列を修飾してもよい。本発明組み換え融合蛋白を製造するために、本発明ＤＮＡ配列を適当な発現系、好ましくは真核系に挿入する。望ましくは、融合蛋白（すなわち、結合蛋白／ αｔｐ）の少なくとも１つの鎖をコードしているポリヌクレオチド配列が本発明融合蛋白の発現を可能にする異種発現制御配列に作動可能に連結されている、組み換えベクターを構築する。例えば、哺乳動物、酵母、細菌、真菌、ショウジョウバエ、およびバキュロウイルスでの発現をはじめとする発現のための多くのタイプの適当な発現ベクターおよび宿主細胞系が当該分野において知られている。これらのベクターの１つまたはそれ以上の適当な宿主細胞中への形質転換は、本発明融合蛋白の発現を引き起こす。多くのタイプの他の適当な発現ベクターも当該分野において知られており、この目的にも使用可能である。かかる製造方法は、宿主細胞による本発明六量体融合蛋白のアッセブリーを可能にする。典型的には、かかる方法はホモ−六量体融合蛋白を生じる。しかしながら、別の具体例においては、異なる融合蛋白（すなわち、結合蛋白／αＴＰ）を同時発現させることにより混合された特異性を有する六量体融合蛋白を製造することもできる。例えば、同一分子上の非競合部位を認識する２つの融合蛋白を同時発現させて、同一分子上の２つの部位に結合しうる六量体を得て、各融合蛋白のみあるいは均一な六量体としてよりも高い結合活性を得ることができる。別法として、２つの融合蛋白を、同一または異なる表面上に提示された（例えば、同一または異なる細胞上に発現された）２つの別々の分子に結合させることもできる。この方法によるトランスフェクションに適した宿主細胞または細胞系は、ヒト２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、サルＣＯＳ−１細胞系、Swiss,Balb-cまたはＮＩＨマウス由来のネズミＬ細胞またはネズミ３Ｔ３細胞のごとき哺乳動物細胞を包含する。適当な哺乳動物宿主細胞および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、および生成物の製造ならびに精製のための方法は当該分野において知られている[例えば、Gething and Sambrook,Nature,293:620 -625(1981)、あるいはまたKaufman et al.,Mol.Cell.Biol.,5(7):1750-1759(198 5)またはHowley et al.,米国特許第４４１９４４６号参照]。別の適当な哺乳動物細胞系はＣＶ−１細胞系である。他の宿主細胞は、Spodoptera frugipedera(Sf9)細胞のごとき昆虫細胞を包含する。かかる宿主細胞の構築および形質転換法はよく知られている[例えば、Mil ler et al.,Genetic Engineering,8:277-298(Plenum Press 1986)およびその中の引用文献参照]。あまり好ましくないが、細菌細胞も本発明ベクターの宿主細胞として利用される。例えば、E.coliの種々の株（例えば、ＨＢ１０１，ＭＣ１０６１）はバイオテクノロジーの分野でよく知られた宿主細胞である。B.subtilis、Pseudomonas 、他のバチルス属等の種々の株をこの方法に使用してもよい。当業者に知られた多くの酵母細胞株も、本発明蛋白の発現のための宿主細胞として利用可能である。他の真菌細胞も発現系として使用できる。よって、本発明は、例えば、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションのごとき慣用的手段により、転写調節配列の制御下にある融合蛋白をコードする組み換えポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの発現ベクターで宿主細胞、好ましくは真核細胞を形質転換することを含む、本発明融合蛋白の製造方法を提供する。ついで、形質転換された宿主細胞を、融合蛋白の発現を可能にする適当な条件下で培養する。ついで、当業者に知られた適当な手段により、発現されアッセンブリーされた融合蛋白を培地から回収、単離、ついで精製する。好ましい具体例において、１つまたはそれ以上の本発明融合蛋白の同時生成後に、宿主細胞により融合蛋白がアッセンブリーされる。別法として、宿主細胞からの回収後に六量体融合蛋白をアッセンブリーさせてもよい。有利には、慣用的方法を用いて本発明融合蛋白を容易に精製する。例えば、プロテインＡおよびプロテインＧに基づく高アフィニティーかつ高容量支持体により本発明六量体Ｉｇ蛋白を容易に精製できる。かかる樹脂は市販されている[Pha rmacia Inc.;Bioprocessing Ltd.]。あまり好ましくないが、六量体融合蛋白を不溶性形態として製造してもよい。例えば、細胞融解後に可溶性形態として蛋白を単離してもよく、あるいは蛋白を塩化グアニジン中に抽出してもよい。 III. 医薬組成物およびその使用方法本発明の融合タンパク質またはそれをコードするＤＮＡ配列を医薬組成物中に処方でき、特定の処方に適した治療または免疫原的摂生法を用いて投与できる。本発明の範囲内の医薬組成物には、所望の生理学活性を有するのに有効量にて本発明のタンパク質を含む医薬組成物が包含される。非経口投与に適した処方には、水−可溶性または水−分散性形態、例えば塩水中の活性化合物の水性溶液を包含する。別に、活性化合物の懸濁液を適当な通常の脂肪親和性担体またはリポソーム中で投与できる。さらに別に、特に、組成物が免疫原としてもちいられる場合、アジュバンドが所望される。所望の場合、活性な医薬成分を組成物に補足できる。組成物中の所望の抗菌、抗敗血症および抗酸化剤は、それらの通常の機能を行い得る。本発明の医薬組成物は、医薬的に使用できる調製物中への活性化合物の処理を容易にする、多数の適当な粘性増化剤、安定化剤、賦形剤および補助剤をさらに含んでいてもよい。好ましくは、これらの調製物ならびに以下に示す調製物を非経口投与用に設計できる。しかしながら、経口または直腸投与用に設計された組成物もまた、本発明の範囲内にあると考える。本明細書において用いる場合、「適当な量」または「効果的な量」なる用語は、以下に示す状態を治療または予防するのに効果的な量を意味する。本発明の融合タンパク質を含む医薬組成物の好ましい量は、体重１ｋｇあたり、約０．１ｍｇより多くの本発明の融合タンパク質(ｍｇ／ｋｇ)、好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇで一般に効果的である。これらの用量を十分な融合タンパク質レベルに達して維持するのに必要な頻度で投与する。好ましい範囲を上記に示したが、特定の状態の治療または予防に効果的な量の決定を当業者が行うことができる。特に、本発明の６量体抗体／αｔｐ融合タンパク質を含む医薬組成物は、細胞表面レセプターの７膜貫通（７ＴＭＲ）クラスに対するアンタゴニストとして有用である。なぜなら、かかるレセプターは、細胞表面上多くのコピーにてしばしば整列されており、かかるレセプターの集合は細胞表面レヤプターの多くの他の型について起こり得るような細胞内シグナル（アゴニズム）を導びかないためである。例えば、本発明の６量体抗体／αｔｐ融合タンパク質を含む医薬組成物の投与は、ケモカインレセプター、７ＴＭＲのサブファミリーを遮断し、好酸球などの標的細胞の走化性および活性化を阻害する。２番目の例は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇαｔｐである。ＣＴＬＡ４−Ｉｇは、ＣＤ２８との相互作用を介し、Ｔ−細胞の刺激を起こすＣＤ８０およびＣＤ８６の有効な阻害剤である。動物モデルにおいて、ＣＴＬＡ４−Ｉｇは、いくつかの自己免疫疾患および移植における有益性が示されている。ＣＴＬＡ４−Ｉｇにより認識されるＣＤ８０およびＣＤ８６抗原は、細胞表面上に多くのコピーで整列しているので、ＣＴＬＡ４−Ｉｇのαｔｐ６量体形態は、標準的なＩｇ融合タンパク質よりも有効なアンタゴニストを提供できる。他の具体例において、本発明のＩｇαｔｐ融合タンパク質を含む本発明の医薬組成物を用いて、補体成分または血液凝集カスケードの成分の除去し、凝固を阻害できる。一の態様において、本発明は、細胞に６量体融合タンパク質ＣＴＬＡ４−Ｉｇ αｔｐを投与することによりＣＤ２８陽性細胞の細胞表面ＣＤ８０−およびＣＤ８６−媒介刺激をアンタゴナイズする方法を提供する。このことを、インビボでこの６量体融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することにより行い得る。他の態様において、本発明は、ＣＤ２８＋Ｔ細胞を刺激する(アゴニスト活性)方法であって、これらの細胞からのIＬ−２産生の刺激されている培養中の細胞に、ＣＤ８０−またはＣＤ８６−６量体融合タンパク質を投与することによる方法を提供する。これらのタンパク質は、単独で、または他のＴ−細胞の刺激剤(例えば、Ｔ−細胞レセプターＣＤ−３レセプターに対する抗体)と組み合わせて、用いることができる。他の具体例において、Ｉｇ−Ｆｃ−含有融合タンパク質を含む本発明の組成物は、Ｆｃドメインの６量体化が補体成分とＦｃレセプターとの相互作用を増強するので、可溶性リガンドのインビボ浄化に有用である。それゆえ、本発明の６量体融合タンパク質に結合するリガンドは、循環から効果的に浄化される。本発明の６量体融合タンパク質はまた、特に凝集が所望の応答を誘導できる場合に、アゴニストとして作用できる。例えば、多数の細胞表面レセプターを介するシグナルトランスダクションに凝集が必須である−レセプターリガンドの多重存在の結果として（例えば、２次細胞の表面上のカウンターレセプター）またはリガンド結合時に誘導される変化を介して、またはその両方による。２次細胞上のカウンターレセプターの認識を介するクロスリンクにより誘導される細胞表面レセプターを介するシグナル化の例は、ＣＤ８０またはＣＤ８６によるＣＤ２８認識である。それゆえ、本発明は、さらにＣＤ２８陽性細胞にＣＤ８０−Ｉｇαｔｐおよび／またはＣＤ８６−Ｉｇαｔｐを投与することによるＣＤ２８陽性細胞を刺激する方法を提供する。そのレセプターへの結合によりシグナルトランスダクションを誘導する可溶性リガンドの例は、ＥＧＦおよび成長ホルモンおよびレセプター２量化となる両者である。これらのレセプターは、抗体結合により誘導される２量化により活性化される[Schreiber et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，78: 7535(1981)，Fuh et al.，Science,256:1677(1992)]。かかるレセプターに対する６量体抗体またはこれらのレセプターの６量体リガンド−Ｉｇ融合タンパク質は、標準的な２量体抗体またはリガンドIg融合タンパク質よりも有効な刺激剤であると考えられる。例えば、本発明の６量体またはサイトカイン−Ｉｇ融合タンパク質を含む医薬組成物は、エリスロポエチン、サイモポイエチンおよび増殖刺激因子などの造血サイトカインのレセプターにおいてシグナルトランスダクションを誘導するのに有用である。また、ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐおよび／またはＣＤ８６−ＩｇαｔｐをＣＴＬＡ４陽性細胞に投与することによるＣＴＬＡ４陽性細胞を抑制する方法が提供される。このことは、インビボで、６量体タンパク質を含む医薬組成物の投与により行い得る。別法として、６量体タンパク質をこれらの細胞からＩＬ−２産性の阻害される培養中のＣＴＬＡ４陽性Ｔ−細胞に添加する。さらに別の態様において、本発明の６量体Ｉｇ−融合タンパク質は、処理する抗体の効率的な、レセプター−媒介取り込みおよび表示または補体成分のタンパク質との有効な相互作用による融合タンパク質プラグメントに対する増強された免疫原としてもまた作用できる。増強された免疫原性は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の効率的な生成および治療予防接種のために所望される。それゆえ、本発明はさらに本発明の医薬組成物を用いる免疫化の方法を提供する。 IV. アッセイ本発明の６量体融合タンパク質は、融合タンパク質の選択リガンドへの結合を測定するインビトロアッセイ、および結合タンパク質に対する天然のまたは合成のリガンドを同定するインビトロアッセイにおいて有用である。かかるリガンドには、天然のリガンドまたは６量体融合タンパク質が由来する結合タンパク質に対するカウンター−レセプターが包含される。例えば、融合タンパク質がＣＤ８０またはＣＤ８６由来である場合、リガンドはＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４であってもよい。別に、リガンドは、天然カウンター−レセプターの誘導体、ペプチド、ペプチド様化合物、または融合タンパク質と相互作用する化学物質であってもよい。６量体融合タンパク質を、例えばイメージング、S．M．Larson et al.，ActaO ncologica ，32(7-8):709-715(1993)；R．DeJager et al.，Seminars in Nuclear Medicine ，23(2):165-179(Apr．1993)参照、を含むインビボアッセイにおいて用いていもよい。別法として、本発明の融合タンパク質を新たなリガンドをスクリーニングするのに用いることができる。かかるアッセイにおける本発明の融合タンパク質の使用は、特に細胞表面または多重リガンドを同定するのによく適する。適当なアッセイ方法は、当業者により容易に決定できる。例えば、選択リガンドが適当な表面に直接的または間接的に（例えば、抗−リガンド抗体を介して）固定される、ＥＬＩＳＡ形式を用いることができる。所望の場合、および選択されるアッセイに応じ、６量体融合タンパク質を適当な表面に固定してもよい。かかる固定表面は周知である。例えば、本発明の６量体融合タンパク質との多重相互作用を促進するために、湿潤性不活性ビーズを用いてもよい。さらに、本発明の方法は、複数の分子が固定化支持系上に含まれるコンビナトリナル技術に容易に適用できる。それゆえ、本発明の融合タンパク質は、１より多くの６量体のサブユニットに適合できる多重形式にて存在する、化学物質およびペプチドに基づくライブラリーのスクリーニングを可能にする。この型の１量体相互作用は通常ｍＭ範囲であり、それゆえ、１量体タンパク質で容易に検出できない。有利には、本発明の６量体融合タンパク質の結合能は、直接結合を可能とする。典型的には、固定化リガンドを含む表面は、融合タンパク質を含む溶液との接触を可能とし、適当な検出系を用いて結合を測定可能とする。適当な検出系には、ストレプトアビジンセイヨウワサビパーオキシダーゼ結合、例えばフルオレセインなどのタグによる直接結合が包含される。他の系は当業者に周知である。本発明は用いる検出系により制限されない。本明細書において記載するアッセイ方法は、本発明の６量体融合タンパク質( それゆえ、それが由来する結合タンパク質)およびそのリガンド間の相互作用の阻害をスクリーニングするのにも有用である。例えば、ＣＤ８０およびＣＤ８６のＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４への結合の阻害剤をスクリーニングできる。好ましい方法において、固定化リガンドと６量体ＣＤ８０−またはＣＤ８６−Ｉｇα ｔｐタンパク質を含む溶液との接触と実質的に同時に、推定阻害剤を含む溶液を固定化組換えＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４タンパク質と接触させる。阻害剤を含む溶液は、例えば、生物の培養物からの上清の抽出物、天然源から集められた生物からの抽出物、化学物質およびそれらの混合物を含む適当な源から得ることができる。他の変法において、阻害剤溶液を、固定化ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４タンパク質へのＣＤ８０−またはＣＤ８６−Ｉｇαｔｐの添加の前、または後に添加してもよい。同様な方法を本発明の他の６量体およびそれらの対応するリガンドを用いて行ってもよい。Ｉｇαｔｐ融合タンパク質の大きなサイズもまた、例えば、蛍光分極、蛍光相関分光測定および異方性分析法などの、溶液中のタンパク質標的の分散または回転による、生物物理学的アッセイ方法にも有利である。これらの実施例は本発明の融合タンパク質の製造および使用のための好ましい方法を説明する。これらの実施例は、単に説明のためであり、本発明の範囲を限定しない。実施例１−典型的なαｔｐＩｇ融合タンパク質の製造および解析以下に、ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐ、ＣＤ８６−Ｉｇαｔｐ、およびＣＴＬＡ４− Ｉｇαｔｐの製造を記載する。さらに、比較のため、ＣＤ８０−ＩｇのＣ−末端を添加したヒトＩｇＭ尾部を含む構築物もまた製造した。ＣＤ８０−Ｉｇｕｔｐと示されるこの構築物は、以下のようにαｔｐ誘導体のアミノ酸配列において相違する：CH3 尾部配列番号:: IgG1 SLSPGK （なし） 9 μtp SLSTGK PTLYNVSLVMSDTAGTCY 25および10 αtp SLSAGK PTHVNVSVVMAEVDGTCY 26および11 Ａ．組換えＩｇの構築：結合タンパク質フラグメント／Ｆｃ融合ＣＤ２８の発現用のpHbactCd28neoベクターはすでに記載されていた[D.Couez et al.，Molecul ．Immunol.，31(1):47-57(1994)]。ＣＤ８０の発現用に、コーディング配列をＰＣＲによりクローニングし、記載されたように[C．A．Fargeas et al.，J ．Exp．Med.，182:667-675(1995)]、pCDLSRα296[Y．Takebe et al. ，Molecul.& Cell ．Biol.，8(1):466-472(1988)]の誘導体[Dr.F.Letourneur,NIH ]中に導入した。ベクタ-COSFcLink[A．Truneh et al.，Mol ．Immunol.，33(3):321-334(1996)] をＣＭＶの主要後期プロモーターの転写制御下、ヒトＩｇ１Ｆｃ領域とＣ−末端で融合したタンパク質の発現用に構築した。このベクター中のｄｈｆｒカセットにより、メトトレキセートに応答する遺伝子増幅の選択が可能となる。天然のリーダーおよびCＤ２８およびＣＤ８０の細胞外ドメインペプチドのコーディング配列を、ＣＤ２８およびＣＤ８０についてすでに記載される[P.S.Linsley et al .，J ．Exp．Med.，174(3):561-569(1991)]のと同様な方法で、ヒンジ領域の開始から始まる、ベクターCOSFcLink中のヒトＩｇ１重鎖Ｆｃ領域上に融合させた。このベクター中のＦｃ領域はヒト血漿白血病細胞系ＡＲＨ−７７[ATCC CRL 1621 ]由来であり、上のヒンジ領域中にアラニンへのシステインの変異を含む(配列番号２７EPKSA、変異に下線を引く)。ＣＤ２８およびＣＤ８０配列を上記したベクターからＰＣＲによりＫｐｎＩ−Ｅａｇフラグメントとしてクローニングし、CO SFcLink中の対応する部位に挿入した。得られたベクターをそれぞれ、CD28FcLin kおよびCD80FcLinkと称する。ＣＤ２８−Ｉｇについて、レセプター／Ｆｃフラグメントの接合点（イムノグロブリン接合点）は配列番号１２--GPSKP/EPKSA-- であり、成熟プロセスされたＮ−末端配列は配列番号１３NKIL-- である。ＣＤ８０−Ｉｇについて、イムノグロブリン接合点は配列番号１４−HF PDq/EPKSA--であり、成熟プロセスされたＮ−末端配列はVIHV--である(図４Ａ− ４Ｄ)。ＣＤ８０中の小文字“ｐ”は、天然のアスパラギンのグルタミンの置換を示す。ＣＤ８６−Ｉｇ、天然のシグナルペプチドＣＤ８６(Ｂ７０)[M.Azuma et al.4 ，Nature,366:76-79(1993)]を含むＣＤ８６の対応する結合タンパク質／Ｆｃ構築物を、上記と本質的に同一の方法を用いて構築した。シグナルおよび細胞外配列は、M．Azuma et al(前掲)により記載される配列に基づく、ヒトＢ−細胞ＲＮＡからの逆転写／ＰＣＲクローニングにより得られた、ＣＤ８６（Ｂ７０）コーディング配列を含むプラスミドからＰＣＲクローニングされた。配列解析は、このクローニングされたＣＤ８６（Ｂ７０）領域とM．Azuma et al(前掲)のものとが同一であることを確証した。Ｆｃ領域の接合点のアミノ酸配列は：配列番号１６--PPPDHepksa--であり、ここで大文字および小文字はそれぞれＣＤ８６およびＦｃ配列を示唆する。成熟プロセスされたＮ−末端配列は配列番号１７LKIQ--（図５Ａ−５Ｂ）である。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＣＴＬＡ４の天然のシグナルペプチド[P．Dariavach et a l.，Eur J Immunol,18:1901-1905(1988);Harper et al.,J Immunol，147:1037-1 044(1991)]を含むヒトＣＴＬＡ４の対応する結合タンパク質／Ｆｃ構築物を、同様な方法で構築した。ＨｕＣ４．３２、ヒトＣＴＬＡ４(Harper et al.，前掲) のｃＤＮＡ配列を含むｐＣＤＭ８プラスミドは、P．Golsteinの研究室(Centred' Immunologie INSERM-CNRS de Marseille-Luminy，13288 Marseille Cedex 9，Fr ance)から提供された。細胞外ドメインのＰＣＲクローニングのため、５’プライマーをｐＣＤＭ８ベクター中に位置させた。[アブベレントクローニングにより、CD80Fclinkと比較してＥｃｏＲＩ部位の上流の約１４０ｂｐの欠失となる( 図６と図３の下を比較)]。ＣＴＬＡ４細胞外ドメインの末端およびヒンジ領域にまたがる接合点におけるアミノ酸配列は：--EPCPDSDAepksa--であり、ここで、大文字および小文字は、それぞれＣＴＬＡ４およびＦｃ配列を示し、下線を引いたアラニン残基は、天然のＣＴＬＡ４配列におけるフェニルアラニンの置換を示す。成熟プロセスされたＮ−末端配列は、配列番号１９MHVA--である(図６Ａ− ６Ｃ)。ＣＴＬＡ４、ＣＤ８０およびＣＤ８６組換えＩｇタンパク質の６量体形態をヒトＩｇＡ１重鎖の１８アミノ酸尾部をコードする配列を上記の発現ベクター中のＣＨ３ドメインのＣ−末端に加えることで作成した。これらの方法を以下に詳しく記載する。Ｂ．６量体融合タンパク質の構築簡便のため、Ｈｉｎｄ III部位をCD80FcLinkのＣＨ３ドメイン中に導入した［ L443のL443のコドンの２番目の塩基からLeu441[EU numbering,E.A.Kabat et al. ，前掲]のコドンの２番目の塩基にまたがる]。Ｈｉｎｄ III部位を以下のオリゴヌクレオチドを用いて標準的なＰＣＲ方法により導入した(例えば、PCR Protoco ls:A Guide to Methods and Applications，Innis et al.，eds，1990)：５’オリゴ(ベクターのヒンジ領域に位置する)：配列番号２０３’オリゴ（ＣＨ３のＣ−末端にまたがる）：配列番号２１ＰＣＲフラグメントを寒天ゲル電気泳動により単離し、Spin Bindカラム(FMC Corp)により精製した。フラグメントをＥａｇＩおよびＸｂａＩで消化し、同様に消化したCD80FcLinkベクター中にクローニングし、コロニーを新たに作成したＨｉｎｄ III部位についてスクリーニングし、ベクターCD80FcLink-Hdを得た。 αｔｐ配列を導入するため、この配列をコードする合成オリゴヌクレオチドリンカーをCD80FcLink-Hd中の新たに作成したＨｉｎｄ III部位およびＸｂａＩ部位間にクローニングした。リンカー配列に相補的なオリゴヌクレオチドは：各リンカー５ｍｇを７０℃にて１０分間変成した。反応物を室温に２０分間冷却した。リンカーの濃度を、Ｈｉｎｄ III／ＸｂａＩで消化した、ゲル精製CD 80FcLink-Hdベクターの１０００ｎｇを用いて５０ないし５ｎｇと滴定した。各ライゲーション条件からのいくつかのコロニーをＰＣＲによりαｔｐリンカーの存在についてスクリーニングし、ＤＮＡ配列決定により確証した。得られたベクター、CD80Fcαtplinkの概略図を図２に示し、完全なＤＮＡ配列を図３Ａ−３Ｈに示す。ベクター配列は実際のプラスミドといくつかの部位において相違していてもよいが、機能的である。他の標準的な哺乳動物発現ベクター (例えば、Stratagene．La Jolla，CAからのpBK-CMV)へのCD80-Ifαtpコーディング領域の導入により適当な結果が得られ、例えばｄｈｆｒ遺伝Ｓにの導入により、適当に、当業者により修飾され得る。 CD86-Igαtpの発現ベクターは、Ｆｃコーディング領域をＣＤ８０−ＩｇαｔｐからのＦｃ−ａｔｐ領域に置き換えることにより対応するＩｇ発現ベクターから得た。CD86FclinkのFｃフラグメントをＥａｇＩ（ヒンジ領域中）およびＸｂａＩ（続くＣＨ３のＣ−末端）での開裂により切り出し、対応するCD80Fcatplin kのフラグメントで置き換え、発現ベクターCD86Fcatplinkを得た。ＣＴＬＡ４− Ｉｇαｔｐの発現ベクターは、C80Fcatplink中のＳｐｅＩ−ＥａｇＩフラグメントを対応するCTLA4Fc1inkからのフラグメントに置き換えることにより得た。ＳｐｅＩ部位はＣＭＶプロモーター領域の塩基４６にある。CD80Fcatplinkと異なる領域中のＣＤ８６およびＣＴＬＡ４構築物の配列を図５および６に示す。同様な方法により、CD28-Igαtpをコードするベクターを、上記のパートＡに記載したCD28Fclinkベクターから開始して製造でき、または、ＣＤ２８細胞外配列の別のバージョンをコードする同様な構築物を製造できる。Ｃ．産生および精製ＣＤ２８−Ｉｇ、ＣＤ８０−ＩｇおよびＣＤ８６−Ｉｇタンパク質を、A.Trun ehら,Mol Immunol，33:321-334(1996)およびI.Karivら，J Immunol，157:29-38( 1996)の記載に従ってＣＨＯ細胞中で産生し、精製した。このセクションのパートＡで前記したベクター構築物を用いて、同様の方法で、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を産生し、精製した。Ｉｇαｔｐ融合タンパク質は、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＴＬＡ４タンパク質の種々の誘導体に対して調製されたウサギポリクローナル抗血清またはヤギ抗ヒトＦｃ抗体を用いて、ＣＯＳ細胞のトランスフェクションのための標準的な方法（例えば、Current Protocols in Molecular Immun ology,F.M.Ausubelら編,1988,John Wiley & Sons，第１巻，第9.1章）およびイムノブロット分析のための標準的な方法(例えば、JR Jacksonら，J.Immunology, 154:3310-3319(1995))に従ってＣＯＳ−７細胞中へのFcatplinkベクターのトランスフェクションにより産生されることを示した。ＣＤ８０−Ｉｇのαｔｐおよびμｔｐ構築物を、それらの発現およびオリゴマー化の効率により比較した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびイムノブロット分析により決定されるように、ＣＤ８０− Ｉｇμｔｐ構築物は、本発明のαｔｐ構築物と同様に発現しなかった(示されない)。αｔｐおよびμｔｐタンパク質を、Prosep Ａ（イギリス国コンセット・カントリー・ダラムのバイオプロセッシング，リミテッド(Ｂioprocessing，Ltd.) ）上での捕獲によりＣＯＳ細胞上清から精製し、それらのオリゴマー化の状態を、Smart System ＨＰＬＣ上で行われる３.２×３０mm Superose ６カラム上での分析用サイズ排除クロマトグラフィーにより試験した。両方のタンパク質は、６量体構造の形態と一致するＩｇＭの分子量範囲で溶離する優性な大きいＭＷ種の類似のプロフィルおよびＣＤ８０−Ｉｇ自体と同一の大きさで溶離した小さなフラクションを示した(示されない)。しかしながら、 αｔｐ構築物における見かけの６量体のフラクションは、μｔｐ構築物について（約６０％）よりも高かった(約８０％)。発現の高いレベルおよびオリゴマー形成の大きな効率は、本発明のαｔｐ構築物がμｔｐ誘導体よりも優れていたことを示した。結果として、ＣＤ８６−ＩｇαｔｐおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇαｔｐタンパク質は、ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐタンパク質について観察されたほぼ同レベルでＣＯＳ細胞中で産生された(０.１−０.２ug／ml)。次いで、ＣＤ８０−およびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐタンパク質を、ＣＨＯ細胞系(A.Trunehら,Mol Immunol,33 :321-334(1996))で５−１０ｍｇ／Ｌのレベルで産生した。この産生レベルは、この系で同一の方法で産生された他の非常に発現されたタンパク質（例えば、抗体）に匹敵する。これらの結果は、高い産生レベルの６量体（５０ｍｇ／Ｌ以上）を有する標準的な増幅ＣＨＯ細胞系の開発が適していることを示す。ＣＨＯ細胞におけるトランスフェクションおよび増幅のための方法は、P.Hensleyら，J.Biol．Chem.，26 9:23949-23958(1994)に開示されている。すなわち、合計３０ugの線形プラスミドＤＮＡ（例えば、ＣＤ８０Fcatplink）を１×１０⁷細胞中への電気穿孔法に付す。該細胞をまず、９６ウエルプレート中の無ヌクレオシド培地中で選択する。３ないし４週間後、増殖陽性ウエルからの培地を、例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に対して指向する抗体を用いるＥＬＩＳＡフォーマットにおいて、発現のためにスクリーンした。最高に発現しているコロニーを拡大し、トランスフェクトされたベクターの増幅のためにメトトレキセートの増加する濃度で選択される。市販のｐＢＫ−ＣＭＶ（上に記載）などのベクターを用いる場合、ｄｈｆｒ遺伝子をこのプラスミド中に導入するかまたは２番目の同時トランスフェクトするプラスミドを提供しメトトレキセート中での増加の選択を可能とすべきである。ＣＨＯ細胞により産生されるタンパク質は、タンパク質Ａアフィニティーおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。ＣＤ８０−Ｉｇ６量体では、ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐ含有の条件付培地（３０リットル）をタンパク質Ａセファロース・ファースト・フローカラム（ファルマシア）上で２０ｍｌ／分でクロマトグラフィーに付した。カラム（５.０ｘ１１．６ｃｍ；２２５ｍｌ）を２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７.５（ＰＢＳ）中に予備平衡処理した。充填した後、カラムを１.８ＬのＰＢＳで基線吸光度にまで洗浄した。ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐを０.１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３.０）で１０ｍｌ／分で溶出させた。溶出液を直ちに１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８.０）で中和した。６０ｍｌシリンジを用いてSterivex GVフィルター（Millipore）で濾過した後、ＣＤ８０−ＩｇαｔｐをＡｍｉｃｏｎ攪拌細胞およびＹＭ１００膜を用いて１.３ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐをドライアイス−エタノール浴を用いて凍結させ、−７０℃で貯蔵した。単量体から６量体を分離するために、１０ｍｌの濃縮ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐを Superdex ２００カラム（２.６ｘ６０ｃｍ；ファルマシア）上に２.５ｍｌ／分でクロマトグラフィーに付した。大部分（約９０％）の２８０ｎｍ吸収物質を含有する最初のピーク（約４５分で溶出）をプールし(２０ｍｌ；０.６ｍｇ／ｍｌ )、前記したように凍結させ、−７０で貯蔵した(図７)。この物質は空隙容量の直後のチログロブリンの位置（〜７０００００Ｄａ）に隣接して溶出した。約５７分にある小さなピークは、「単量体」ＣＤ−８０−Ｉｇに対応する。ピークフラクション中のＣＤ８０−Ｉｇαｔｐの取込みは、還元状態下で操作したクマシー染色ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで観察される単一のバンドにより示される(図７の挿入図のレーンＲ)。該バンドの拡散特性は高度にグリコシル化されたタンパク質の特徴であり、ボリペプチド鎖当たり１０コンセンサスＮ−連結グリコシル化部位を含有するＣＤ８０−Ｉｇαｔｐと考えられる。非還元条件下で、タンパク質はすべて高分子量種として移動する(図７、挿入図のレーンＮＲ)。この優勢なフラクションは、単量体ＣＤ８０−Ｉｇタンパク質（すなわち、Ｉｇ同種２量体）について観察される大きさで移動する少数の種類と共に６量体と一致する分子量で対称ピークとして移動した。Ｎ−末端アミノ酸分析により、ＣＤ８０−Ｉｇの以前の分析と同一であり、第三者により記載されているものと同一であることが明らかにされら[G.J.Freemanら、１７４（３）：６２５−６３１(１９９１)] 。ＣＤ８６−Ｉｇαｔｐタンパクを同様の方法により精製した。ＣＴＬＡ４−Ｉｇαｔｐタンパク質をＣＯＤ細胞で発現させたが、さらに特徴付けを行わなかった。Ｄ．タンパク質の特徴化−分子の大きさ精製の間の前記したサイズ排除クロマトグラフィーは、６個のＣＤ８０−Ｉｇサブユニットを含有する同種６量体種の形成結果と一致した。ＣＨＯ細胞中に産生されるＣＤ８Ｏ−Ｉｇαｔｐタンパク質の大きさおよび同質性もまた分析用超遠心分離により調査した。ＣＤ８０−IｇαｔｐのＰＢＳ（ｐＨ７.４）中の平均沈降データを、図８の下のパネルに示す。サンプルを６０００ｒｐｍで８７時間２５℃でBeckman ＸＬ−Ａ分析用超遠心分離器にて沈降させた。すべてのデータに適合する重量平均分子量は１１２５０００＋／−５０００Ｄａであった。各Ｎ −連結グリコシル化部位について２０００Ｄａであると仮定すれば、８６４０００の６量体の化合物が考えられる。データは〜２ｘ１０^-7ＭのＫ_dで６量体＜− ＞（６量体）₂モデルに適合させることが可能であった。下のパネルの曲線は６量体および（６量体）₂の適合分布のためのものである。これらの２つの曲線の合計は観察されたデータとよく適合している。単量体（１３１ｋＤａ）についての含有物では適合性は改良されなかった。単量体２量体モデルの適合性についての残り（適合観察データ）の分布を図８の上のパネルに示す。残りは小さく、ランダムであり、良好な適合性を示している。分析の記載に関しては、W.Chanら、 Folding and Design，1(2):77−89(1996)を参照のこと。下のペネルの挿入図は吸収モードにて摂取されたタンパク質の速度沈降データのｇ（ｓ^*）分析を示す。データを３００００ｒｐｍ、２２℃で集めた。データは２つの種類、１つは１９.４Ｓで、１つは２６．７Ｓであり、６量体と（６量体）₂種とすることができる。ｇ(ｓ^*)データ分析については、W.F.Stafford、Current Opinion in Biotec hnology，8(1)：14-24（1997）を参照のこと。ＣＤ８０−ＣＤ８６−Ｉｇαｔｐタンパク質の共有結合の大きさおよび程度はＳＤＳ／ＰＡＧＥで試験した。還元条件下、タンパク質はすべて、図７の挿入図のＣＤ８０−Ｉｇαｔｐタンパク質について図示されるように、対応する標準Ｉｇ構築物と略同じ大きさの拡散バンドで移動した。４％ゲルの非還元条件下、Ｉｇαｔｐ構築物は、約１５００００Ｄａ（図示せず）で対応するＩｇ構築物と同時移動する小さな物質とのＩｇＭのサイズ範囲にて極めて広いバンドで移動した。これらの結果はＩｇαｔｐタンパク質の個々のポリペプチド鎖の大部分がシステイン結合を介して共有結合し、ＩｇＭのμ尾部セグメントのシステイン残基の間で記載されているジスルフィド結合を形成していることと一致している[A.C.Dav isら、EMBO J.、8(9):2519-2526(1989)]。高分子量バンドの拡散特性は不完全なジスルフィド結合形成に反映しているが、６量体の形態のＣＤ８０−またはＣＤ８６−Ｉｇαｔｐは１２０個の潜在的なＮ−連結グリコシル化部位を有するためであるとも考えられる。Ｅ．タンパク質キャラクタリゼーション−結合特性いくつかのアッセイフォーマットにおいて、６量体ＣＤ８０−およびＣＤ８６ −Ｉｇαｔｐタンパク質を、多価アレイに存在するときＣＤ２８に対するそれらの著しく高い結合活性によって、対応する標準Ｉｇ融合タンパク質から区別した。 1）ＥＬＩＳＡフォーマットにおける固定化ＣＤ２８−Ｉｇへの結合該アッセイフォーマットにおいて、プレートウェルに吸着されるＣＤ２８タンパク質はまた、ヒトＩｇ融合構築物であるので、アッセイの単純および検出の容易のためにＣＤ８０−Ｉｇαｔｐタンパク質をビオチン化した。ビオチン化は、 Avidin-Biotin Chemistry；Ahandbook，M.D．Savageら、Pierce Chemical Compa ny (1992)に記載のように行った。該タンパク質のいくつかの調製物において、ビオチン／ＣＤ８０−Ｉｇ単量体のモル比は、約１０：１であった。被覆後に該アッセイの全工程を室温で行った。９６ウェルマイクロタイタープレート（Immunlon 4，Dynatech Laboratories ）のウェルを１００μｌ／ウェルの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．４中においてＣＤ２８−Ｉｇ（１、２または４μｇ／ｍｌ）で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。ウェルをＰＢＳ（リン酸緩衝化セーライン）で洗浄し、ＰＢＳ中０．５％ゼラチンで１時間ブロックした。さらにＰＢＳ洗浄後、ビオチン化ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐをウェル中で直接、最終用量０．１ｍｌにおいて１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳで連続的に希釈し、１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳで洗浄し、結合したＣＤ８０−Ｉｇαｔｐタンパク質を、１：２０００希釈の０．１ｍｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたストレプトアビジン（Southern Biotech））を添加し１時間インキュベート後、洗浄し、１００μｌＡＢＴＳ基質(Kierkegaa rd and Perry Laboraories Inc.，Maryland)で発色させ、４０５ｎｍで吸光度を測定することによって測定した。いくつかのケースでは、吸光度測定前に１％ＳＤＳを加えることによって、呈色反応を停止させた。ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐ結合対加えたタンパク質の濃度のプロットを図９に示す。該図において、「ＣＤ２８ −Ｆｃ」、「ＣＴＬＡ４−Ｆｃ」および「Ｂ７−ＦｃＡ」は、各々、ＣＤ２８− Ｉｇ、ＣＴＬＡ４−ＩｇおよびＣＤ８０−Ｉｇαｔｐを示す。これらの曲線（図９）は、ビオチン化ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐの濃度依存性結合がＣＤ２８．１ＭＡｂ（ＣＤ８０およびＣＤ２８の結合を阻害するヒトＣＤ２８に対するネズミＭＡｂ；Nunesら、Int．Immunol.，5:311-315(1993)）またはＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質にこでは、ＣＴＬＡ４−Ｆｃとして標識された）の同時添加によって阻害された。同じ条件下で、ビオチン化ＣＤ８０−Ｉｇ自体は、わずかな結合および非常に高い濃度を示した（図１０）。同じフォーマットにおいて、ビオチン化ＣＤ８６−Ｉｇαｔｐはまた、ＣＤ２８−Ｉｇへの良好な結合を示した（図１０）。３つのビオチン化タンパク質全てが、この相互作用のより高い親和性のために予想されるとおり、固定化ＣＴＬＡ４−Ｉｇへの良好な結合を示し（図１１）［ P.S．Linsleyら、Immunity 1:793-801(1994)、および下記の実施例のパート４を参照］、結合のランクオーダーは、固定化ＣＤ２８−Ｉｇで観察されたのと同じであった。（１）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、（２）ＣＤ２８．２［Nunesら、1993，前掲］、ＣＤ８０のＣＤ２８への結合を阻害するヒトＣＤ２８に対するネズミＭＡｂ、（３）非標識化ＣＤ８０−およびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐタンパク質、および（４）単量体ＣＤ８０−Ｉｇ融合タンパク質の予想される非常に弱い阻害との結合の予想される序列的な競合によって、結合反応の特異性を証明した。１例を図１２に示す。要するに、マイクロタイターウェルを２μｇ／ｍｌＣＤ２８−Ｉｇで被覆し、ビオチン化ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐを５０μｇ／ｍｌの濃度で加え、直ちに、指定された量の非標識化ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐ（Ｂ７ＦｃＡ）、ＣＤ８０−Ｉｇ（Ｂ７Ｉｇ）、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＭＡｂＣＤ２８．２を添加した。５０μｇ／ｍｌでビオチン化ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐは、約５０％飽和のＯＤ₄₀₅を与える（図９参照）。ＣＤ８０−Ｉｇは、ブロッキング結合において能率がＣＤ８０−Ｉｇαｔｐよりも非常に劣っており、固定化ＣＤ２８−Ｉｇタンパク質に対するＣＤ８０− Ｉｇタンパク質の予想されたより低い親和性／結合活性と一致した。対照は、予想された結果を与えた−すなわち、ＣＤ２８．２ＭＡｂがＣＤ２８の結合部位をブロックし、同様に、ＣＴＬＡ４−ＩｇがＣＤ８０−Ｉｇαｔｐの結合部位をブロックした。他のアッセイフォーマットが可能である。第２の例は、Ｉｇ領域をヒトＩｇＧ１の代わりにマウスＩｇ２ａから得る以外はＣＤ２８−Ｉｇと類似の方法で構築されたＣＤ２８−ｍｕＩｇ融合タンパク質を利用する。より詳細には、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ領域をヒンジ配列におけるＥａｇＩ部位で開始するマウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域で置き換える以外は、ＣｏｓＣＤ２８ＦｃＬｉｎｋベクター（前記）に匹敵するベクタ−ＣｏｓＣＤ２８ｍＦｃ２ａＬｉｎｋを用いて該タンパク質を発現させた［I．Karivら、J．Immunol.，157:29-38(1996)に記載されている］。得られるハイブリッドヒンジ領域のアミノ酸配列は：配列番号：２４−−ＧＰＳＫＰｅｐｋｓａｇＩＫＰ--（ここに、大文字はＣＤ２８配列の末端に対応し、小文字はヒトＩｇＧ₁ヒンジ領域由来の残基であり、下線を付した小文字はＥａｇＩを生じるように導入された２残基置換であり、太字はネズミＩｇＧ２ａヒンジ領域の開始を示す）である。ＣＤ２８−ｍｕＩｇタンパク質は、ヤギ抗−マウスＦｃ抗体を用いて、直接的にウエル中に固定化し、次いで、ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐ結合を前記と同様に行った。より詳細には、野生型または変異型ＣＤ２８配列を含有するＣＤ２８−ｍｕＩｇタンパク質は、等濃度で、ヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体で被覆した９６ウェルプレート上で捕獲された。該プレートを１ｘＰＢＳで洗浄し、０．５％ゼラチン −ＰＢＳで１時間ブロックし、次いで、ビオチン化ＣＤ８０−またはＣＤ８６− Ｉｇαｔｐのいずれかで４５分間インキュベートした。プレートを洗浄し、Ｉｇ αｔｐ融合タンパク質を前記のように定量化した。該アッセイを用いて、図１３Ａおよび１３Ｂに図解するように、ＣＤ２８における変異のＣＤ８０およびＣＤ８６への結合に対する影響を調べた（I．Karivら、J．Immunol.，157:29-38(1996)）。各変種ＣＤ２８−ｍｕＩｇ２ａタンパク質は、ヤギ抗−マウスＩｇＧで被覆されたウェル上で捕獲され、ビオチン化ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐ（図３Ａ）またはＣＤ８６−Ｉｇ αｔｐ（図１３Ｂ）の結合を測定した。各ＣＤ２８−ｍｕＩｇ２ａタンパク質の等量の捕獲は、ポリクローナルウサギＣＤ２８抗血清の各タンパク質への比較可能な結合によって証明された（図１３Ｃ）。２）バイオセンサーフォーマットにおける固定化ＣＤ２８−Ｉｇへの結合ＣＤ８０−ＩｇαｔｐまたはＣＤ８０−Ｉｇの固定化ＣＤ２８への結合は、他のタンパク質のために記載された同様の手法［K．Johansonら、J．Biol．Chem. ，270:9459-9471(1995),およびその参考文献］に従って、ＢＩＡｃｏｒe機器を用いる表面プラスモン共鳴分析によって比較した。ＣＤ８０−ＩｇおよびＣＤ８０−Ｉｇαｔｐの比較の場合、そのアミンを介する表面への共有結合によって、およそ４０００ＲＵのＣＤ２８−ＩｇをＢＩＡｃｏｒｅＣＭ５センサー表面（BIAcore，Piscataway，NJ）上に固定化した。共有結合は、まず、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミドの０．１Ｍ溶液および０．１Ｍ１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの１：１混合物で表面を活性化することによって行った。次いで、０．０１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．７中におけるＣＤ２８−Ｉｇの溶液５０ｕｇ／ｍｌを表面に流した。次いで、反応しないＮ−ヒドロキシスクシンアミドエステルを１ＭエタノールアミンｐＨ８．５で不活化した。表面を２０ｍＭＨＥＰＥＳ１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２、３ｍＭＥＤＴＡおよび０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０からなるランニングバッファーで平衡化した。ランニングバッファーで希釈したＣＤ８０− ＩｇおよびＣＤ８０−Ｉｇαｔｐ（２０μｇ／ｍｌ）を流速１０μｌ／分で表面に注入した（６０μｌ）。その結果、ＣＤ８０−Ｉｇが非常に迅速にＣＤ２８− Ｉｇ被覆表面から分離される一方で、ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐの分離速度は、約３桁遅いことが示される（図１４）。固定化ＣＤ２８−ＩｇとのＣＤ８０−Ｉｇ αｔｐおよびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐ結合の比較の場合、ＣＤ８０−ＩｇαｔｐおよびｃＤ８６−Ｉｇαｔｐの溶液（５μｇ／ｍｌ）を前記のランニングバッファー中で調製した。試料溶液を１０μ ／分で注入した。試料間で、表面をＧｅｎｔｌｅ溶出バッファー（Pierce Chemi cals，Rockville，ILL）の３０μｌ注入で再生した。その結果、前記のＣＤ８０ −Ｉｇαｔｐのように、ＣＤ８６−ＩｇαｔｐはゆっくりとＣＤ２８−Ｉｇ表面から分離することが示される（図１５）。ＣＤ８６−Ｉｇαｔｐに関するオフ速度は、ＣＤ８０構築物よりも早いことが明らかであり、ＥＬＩＳＡ（前記パート１）における該タンパク質のより弱い結合および細胞結合（下記パート３）フォーマットと一致し、より低い固有の親和性を熱量測定によって測定した（下記パート４）。３）細胞−表面ＣＤ２８を発現する細胞への結合フローサイトメトリーにより、ＣＤ８０−およびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐの両方は、ＣＤ２８陽性細胞への特異的結合を示し（図１６Ａおよび１６Ｂ）、一方、ＣＤ８０−またはＣＤ８６−Ｉｇ自体のとの結合は観察されない（示されない）。このアッセイフォーマットのために非−付着性ＣＤ２８発現細胞（ＰＣＤ２８．１．ｓ２．１）を用いた。ＰＣＤ２８．１．Ｓ２．１細胞は、ヒトＣＤ２８の発現のためのベクター［D.Couezら、Molecular Immunology，31:47-57(1994)］でのＰＥ３０．２細胞［D．Emilieら、Eur．J．Immunol.，19:1619-1624(1989) ］のトランスフェクションによって作成された。全インキュベーションは、氷上で行った。非標識化ＣＤ８０−およびＣＤ８６−ＩｇをＰＢＳｗ／ｏＣａ＋２／Ｍｇ＋２、０．２％ウシ血清アルブミンおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有する結合バッファー中で該細胞とインキュベートした。結合バッファーで２度洗浄後、結合した融合タンパク質をＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート、Southern Biotech）で標識されたヤギ抗−ヒトポリクローナル抗体の１：２０００希釈で検出した。さらに２回、結合バッファーで洗浄後、該細胞を結合バッファー中に再懸濁し、４８８ｎｍレーザーを用いてＦＡＣＳｏｒｔアナライザー（Mecton-Dickinson）で分析した。以前に（「ブロック」曲線、図Ｃ）、または同時に（「競合」曲線、図１６Ａおよび１６Ｂ）２００倍過剰なＣＤ２８モノクローナル抗体２８．１で細胞をインキュベートすることによって、あるいはＣＤ８０およびＣＤ８６融合タンパク質を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇの添加によって（示されない）低い非特異的結合が示された。４）溶液中でのＣＤ２８−ＩｇおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇへの結合他のタンパク質に関して以前に記載された通りに［K.Johansonら、J.Biol.Che m，270:9459-9471(1995)、およびその参考文献]、ＣＤ８０およびＣＤ８６の６量体および標準のＩｇ融合タンパク質の溶液結合特性を等温滴定熱量測定を用いて比較した。ＣＴＬＡ４−Ｉｇへの結合については、以下の表に要約する。表１２つの温度で滴定熱量測定によって測定したＣＤ８０およびＣＤ８６Ｉｇ融合タンパク質のＣＴＬＡ４−Ｉｇ結合特性の直接的な比較Ｋｄにおける誤差は、およそ２のファクターであって、モル結合比における誤差は１０−２０％である。３７℃でのＫｄ値は、M.L.Doyleら、J.Mol．Recognit ion，9:65-74（１９９６）に記載のように、３７℃で直接測定されたか、あるいはファント・ホッフの式を用いて温度差を補正した。濃度は、Ａ）９０,０５９（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）、１２７,０００（ＣＤ８０−Ｉｇ）、８１０,０００（ＣＤ８０− Ｉｇαｔｐ）、１４０,０００（ＣＤ８６−Ｉｇ）および８９０,０００（ＣＤ８６−Ｉｇαｔｐ）の分子質量ならびにＢ）１．２２（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）、１．１０（ＣＤ８０−ＩｇおよびＣＤ８０−Ｉｇαｔｐ）、および１．０３（ＣＤ８６−ＩｇおよびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐ）の計算された吸光率を用いて、２８０ｎｍの吸光度によって測定した。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＣＤ８０−ＩｇおよびＣＤ８６−Ｉｇの分子量は、マススペクトル分析によって決定した。ＣＤ８０−Ｉｇα ｔｐおよびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐの分子質量は、６ｘ各Ｉｇタンパク質プラス１２個の尾部セグメントによって付与される４０,０００Ｄａとして概算した。等温滴定熱量測定による溶液相におけるＣＤ８０−Ｉｇ、ＣＤ８０−Ｉｇα ｔｐ、ＣＤ８６−ＩｇおよびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐ構築物へのＣＴＬＡ４−Ｉｇ結合の直接的な比較は、数回行う。第１に、Ｉｇ対Ｉｇ−αｔｐ構築物の親和性は、溶液中で等価である。予想されるように、このことは、αｔｐ構築物の溶液結合親和性が、ＥＬＩＳＡおよび細胞結合アッセイにおけるように結合活性効果から利益を得ないことを示唆する。第２に、ＩｇおよびＩｇαｔｐ構築物の分子相互作用を伴うエンタルピー変化もまた同じであり、相互作用の分子的細部が同じであるという見解を支持する。第３に、ＣＤ８０およびＣＤ８６Ｉｇ対Ｉｇα ｔｐ構築物へのＣＴＬＡ４−Ｉｇ結合に関する滴定平衡点は、これらの試薬の全Ｉｇ構築物の比較は、ＣＤ８０について約６の比を示し、どちらの構築物においても、ＣＤ８０ドメインに対しておよそ同等の結合活性を示す。対応するＣＤ８０−Ｉｇαｔｐタンパク質のより低い比率は、この調製物におけるいくらかの活性喪失を示す。ＣＤ２８−ＩｇとＣＤ８０−またはＣＤ８６−Ｉｇのいずれかとの相互作用は、熱量測定によって溶液中で検出されず、１ｕＭより弱い相互作用の親和性を示唆した。ＣＴＬＡ４に対する親和性よりも低いＣＤ２８に対するこの親和性は、他の報告と一致する［P.S．Linsleyら、Immunity 1:793-801(1994)］。ＣＤ２８−Ｉｇもまた、ＣＤ８０−またはＣＤ８６−Ｉｇαｔｐへの検出可能な結合を示さず、それは、結合活性効果から利益を得ないαｔｐ構築物の溶液親和性と一致する。実施例２−ＣＤ８０−およびＣＤ８６Ｉｇαｔｐタンパク質に対するアゴニスト活性の実施Ａ．ＩＬ−２レベルの検出に関するＣＴＬＬ−２バイオアッセイＣＤ８０およびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐタンパク質を対応するＣＤ８０およびＣＤ８６−Ｉｇタンパク質と比較して、ヒトＣＤ２８を発現する２つのネズミＴ −細胞ハイブリドーマセルライン、ＰＣＤ２８．１．ｓ２．１およびＤＣＬ２７ＣＤ２８ｗｔ.ｓ２を用いて、ヒトＣＤ２８を発現する細胞を刺激する能力を測定した。ＰＣＤ２８．１．ｓ２．１セルラインを実施例１、パート３に記載した。ＤＣＬ２７ＣＤ２８ｗｔ.ｓ２セルラインは、ＰＣＤ２８．１．ｓ２．１細胞［D．Couezら、Molecular Immunology，31:47-57(1994)］に使用したのと同じＣＤ２８発現ベクターを用いて、ＣＤ２７セルライン［F．Pagesら、Nature，369: 327-329（1994）；F．Pagesら、J．Biol．Chem.，271(16)：9403-9409(1996)］のトランスフェクションによって作成した。これらのセルラインは、対応するＩｇαｔｐ融合タンパク質と比較したＣＤ８０−およびＣＤ８６−Ｉｇでの活性化に対する応答において、ＩＬ−２を生産する能力について試験した。９６−ウェルプレートをＣＤ８０およびＣＤ８６融合タンパク質とともにＣＤ３抗体で、またはＣＤ３抗体なしで被覆した。これは、まず、プレートを予め決定された最適状態に及ばない濃度のハムスター抗−ヒトＣＤ３抗体（ＭＡｂ１４５−２Ｃ１１，Boerhinger−Mannheim Biochemicals）で、またはバッファーのみで２時間室温（ＲＴ）でインキュベートし、ＰＢＳでプレートを洗浄し、ヤギ抗−ヒトＩｇＨ鎖（ＧＡＨ−ＩｇＨｃ、SigmaChemical Co.)を加えてＲＴでさらに２時間インキュベートし、再び洗浄および４℃で１６−１８時間異なる濃度のＣＤ８０またはＣＤ８６融合タンパク質で被覆し、再び洗浄し、最後に、０．２％ＢＳＡ− ＰＢＳで３０分間ブロッキングすることによって行った。Ｔ細胞（１ｘ１０⁵／ウェル）を複製ウェル中の１５０μｌ培地中に加えた。比較のために、可溶性融合タンパク質および２４８．２３．２ＣＤ２８ＭＡｂ（ＩｇＭ）［A．Morretta ，University of Genova，Italy］を非−被覆ウェルに加えた。Ｔ細胞をウェル中で３７℃にて２４時間インキュベートし、上清を回収し、標準的なＣＴＬＬ−２バイオアッセイ[S.M．Gillisら、J．Immunol.，1 20:2027(1978)］においてＩＬ−２レベルに関して評価した。要するに、７５μ ｌ中における１ｘ１０⁴ＩＬ−２依存ＣＴＬＬ−２細胞（ＡＴＣＣ）／ウェルを等量の試験上清に加え、３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を１０μｌの５ｍｇ／ｍｌＭＴＴ（Sigma Chemical Co.）で４時間パルスし、１００ｍｌ１０％ＳＤＳ／０．０１ＮＨＣｌ溶液で１４−１６時間溶解した。ＯＤ₅₇₀の記録を既知濃度のＩＬ−２で細胞を処理することによって求めた標準曲線に基づいてＩＬ−２のｎｇ／ｍｌに変換した。全アッセイにおいて、ＣＤ８０−およびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐタンパク質は、対応する単量体Ｉｇ構築物よりも能率のよいＣＤ２８Ｔ−細胞の刺激剤であった（図１７および１８）。可溶性６量体タンパク質は、ＣＤ３架橋（ＧＡＨ）の不在下でＩＬ−２産生を誘発したが、同じ条件下で、ＣＤ８０−またはＣＤ８６ −Ｉｇ自身では活性が観察されなかった。同様なレベルのＩＬ−２誘発は、低重合体ＣＤ２８ＩｇＭ抗体２４８．２３．２で観察された。６量体ＣＤ８０およびＣＤ８６タンパク質のＧＡＨ抗体での架橋は、架橋剤なしの場合と比較してＩＬ −２応答を増加させたが、依然として、単量体Ｉｇ構築物に関する応答は得られなかった。ＣＤ３抗体の存在下で、６量体と単量体Ｉｇ融合タンパク質間の差は最少であり、約２倍以下であった。Ｂ．ＩＬ−２プロモーター活性の検出のためのフルオレスセインジ−ｂ−Ｄ− ガラクトシダーゼ（ＦＤＧ）アッセイアゴニスト活性の第２アッセイは、ＩＬ−２タンパク質の生産よりもむしろＩＬ−２プロモーター活性の誘発を測定した。前記のＰＣＤ２８．１．Ｓ２．１細胞は、また、ＩＬ−２プロモーターに融合したｌａｃＺを含有する。よって、ＰＣＤ２８．１．Ｓ２．１セルラインは、ＣＤ２８−介在Ｔ細胞シミュレーションにおいてＩＬ−２プロモーター活性を測定するのに便利な系を提供する。Ｔ細胞を、ＣＴＬＬ−２アッセイに関する前記のように活性化し、スピンダウンし、５０μｌの培地＋５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁され、１０μｌの２０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で溶解し、２５μｌの１０ｍＭＦＤＧ（Molecular Probes）、ｂ−ガラクトシダーゼのためのフルオレセイン基質を補足した。ＦＤＧの加水分解は、まず、フルオレセインモノガラクトシダーゼ（ＦＭＧ）、次いで、高蛍光産物フルオレセインを生じる。細胞ライゼートをＦＤＧで６０分間インキュベートし、蛍光レベルをフルオロスキャン(Fluoroscan)（MTX Lab Systems，Inc.）によって測定した。これらのアッセイの結果（図９）は、前記のＩＬ−２生産のものと類似していた。主要な差は、ＩＬ−２の低レベルが単量体Ｉｇタンパク質で観察されたことであった。Ｃ．溶液中におけるＣＤ８０−およびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐタンパク質によるＣＤ２８細胞の刺激前記の実施例（ＡおよびＢの部分）において、ＩｇおよびＩｇαｔｐタンパク質は、マイクロタイターウェルの表面で捕獲するとき、大きな活性を示した。しかしながら、ＣＤ８０−およびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐタンパク質は、また、溶液中の細胞に直接加えたとき、ＣＤ２８細胞を刺激することができたが、対応するＩｇ融合タンパク質では、何の応答も観察されなかった。ＣＤ８０−およびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐは、ＰＣ２８．１．ｓ２．１細胞に加えたとき、ＩＬ−２プロモーター活性（図２０Ａ）およびＩＬ−２生産（図２０Ｂ）の用量依存性の刺激を示した。対照的に、ＣＤ８０−Ｉｇ（図２０Ａおよび２０Ｂ）またはＣＤ８６８−Ｉｇ（示されない）では、何の刺激も観察されなかった。ＩＬ−２プロモーター活性およびＩＬ−２レベルは、リーダーＣＴＬＬ−２細胞の増殖を³Ｈ−チミジン取込みによって測定する以外は、前記のＡおよびＢ部の記載と同様に測定した。Ｃｄ８０−およびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐタンパク質の近似飽和レベル（１マイクロｇ／ｍｌ）での応答レベルは、固定化ＣＤ３抗体を有するＣＤ３の架橋による刺激を観察したものと比較できた（図２０Ｃ）。ＣＤ８０−およびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐに対する応答の特異性は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの添加による完全な阻害によって確認された（示さない）。要約すると、これらのアッセイの結果は、対応する単量体Ｉｇタンパク質ではわずかな活性が観察されるかまたは観察されない条件下で、ＣＤ８０−およびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐタンパク質がアゴニスト活性を有することを示す。実施例３−ＣＤ２８およびＣＤ８０間の相互作用の小型分子アンタゴニストを同定するための化合物スクリーンアッセイＥＬＩＳＡフォーマットを用いて、化学的化合物および天然産物の巨大バンクをスクリーニングすることによって、ＣＤ２８に結合するＣＤ８０およびＣＤ８６結合の小型分子アンタゴニストを同定した。該アッセイは、ビオチン化ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐ（９０μｌ容量中２２２ｎｇ／ｍｇ）の添加後、直ちに試験化合物の希釈物を加えた（１０μｌ）以外は、実施例１、Ｅ．パート１に記載のフォーマットにおけるように行った。化合物は、１００ｘアッセイ濃度でジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)中に溶かし、続いて、５０％ＤＭＳＯ／５０％Ｈ₂Ｏ中で１０Ｘ使用ストックまで希釈した。アッセイは、５％以下の濃度でＤＭＳＯに対して感受性（シグナルの＜１０％変化）ではなかった。１の試験アッセイの結果は、図２１および表１１に要約する。ＢＭ−３４試験セットは、個々の化合物としておよび各複混合物試料において１１個の異なる化合物を有する８８個の複混合物としての２つのフォーマットにおいて９６８の化合物からなる。どちらのＢＭ−３４フォーマットも、９６ウェルプレート中に固定したＣＤ２８−Ｉｇに結合するビオチン化ＣＤ８０−Ｉｇαｔｐの阻害について（各複混合物試料につき２００μｇ／ｍｌおよび個々の化合物につき２０μｇ／ｍｌの濃度で）アッセイした。阻害について７０％または８５％阻害を設定するための結果は、表ＩＩに示される。パーセント阻害範囲は、指示された阻害範囲を示す化合物数に対してプロットする。８０−９０％の阻害範囲における活性を示す化合物の低パーセンテージは、これを迅速なスクリーニングのための適当な限界とする。表ＩＩＣＤ８０−Ｉｇαｔｐスクリーンアッセイ結果ＢＭ−３４試験化合物セットこの表において説明するように、８個の混合物が７０％またはそれ以上の阻害を与えた。２０μｇ／ｍｌにてこれら８個の混合物由来の個々の化合物のアッセイによつてデコンヴォリューションは、比較可能な活性を有する化合物が存在することを確認した。確認できなかった２個の他の混合物は、元の複混合物アッセイにおいて観察された７０％阻害に非常に近い活性を有する１以上の化合物を有した。８５％のより高い阻害を選択することは、１つの複混合物ヒットを与え、個々の化合物のアッセイにおいて確認された。再現性および選択性のさらなる証拠は、７０％阻害より低い混合物由来の８個の化合物だけが、個々にアッセイしたとき、＞７０％阻害を示した。選択性は、さらに、複混合物試料の濃度を１００μｇ／ｍｌまで、および個々の化合物の濃度を１０μｇ／ｍｌまで減少させることによって増加した。これは、それらの平均ＭＷが３００−４００ダルトンなので、約３０μＭ濃度の化合物に相当する。１００μｇ／ｍｌにて、複混合物試料は、より低い平均阻害への所望のシフトを示したが（混合物の９０％が６０％以下の阻害を与えた）、一方、高レベルの阻害で許容されるヒットの割合を保持した（混合物の４％が７０％以上の阻害を与える）。該アッセイの使用によって、ＣＤ８０とＣＤ２８の相互作用の小型分子インヒビターを同定できる。実施例４−マウス／ヒトＩｇＧ１キメラ抗体のαｔｐ−介在低重合ヒトＩｇＧのＦｃ領域のαｔｐ−介在６量体フォーメーションの一般化を試験するために、αｔｐセグメントを、マウスモノクローナル抗体１Ｃ８由来のＨおよびＬ鎖可変領域ならびにヒトカッパおよびＩｇＧ１不変領域を含有するキメラ抗体中に導入した。１Ｃ８は、ヒトＥＰＯ（エリトロポイエチン）レセプターに向けられる。ＣＤ８０ＦｃαｔｐｌｉｎｋのＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩＩフラグメントをキメラ１Ｃ８抗体のＨ鎖を含有するベクターであるＥｐｏＲ（ＣＨ）ＩｇＧ１−ＰＣＮのＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩＩフラグメントで置換することによって、αｔｐ配列を抗体のH鎖に導入して、ベクターＥｐｏＲ（ＣＨ）Ｆｃαｔｐｌｉｎｋを得た。どちらのベクターにおいても、ＣＭＶプロモーターとＮ−末端シグナル配列の開始との間でＥｃｏＲＩ開裂し、ヒトＨ鎖の不変領域２中の保存部位でＳａｃＩＩ開裂する。６量体ｍＡｂの試験試料は、実施例１、Ｃ部分に前記された手法に従って、ＥｐｏＲ（ＣＨ）ＦｃαｔｐｌｉｎｋとＬキメラＬ鎖の発現ベクターとの同時トランスフェクションでＣＯＳ−７細胞中で生産された。最初、５Ｔ１５０フラスコを２個のベクターで同時トランスフェクトし、３００ｍｌの条件付けられた培地を回収した。６量体抗体をプロテインＡ上のアフニティークロマトグラフィーによって精製した。精製は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥを還元することによって分析されるような試料のクーマシー染色による測定によって約９０％であった。ＳＤＳ／ＰＡＧＥの非還元条件下で、抗体は、ＩｇＭのサイズ範囲に移動した（示されない）。さらに、試料を、Smart System HPLC（Pharmacia Biotech，Piscataway NJ）で流される３．２ｘ３０ｍｍ Superose ６カラム上の分析サイズ排除クロマトグラフィーによって特徴付けた。組換えヒトＥＰＯレセプターＩｇ融合タンパク質（ＥＰＯｒ−Ｉｇ）を用いるＥＬＩＳＡにおいてモニターすると、主要なピーク（図２２）は結合活性に対応し、６量体フォーメーション（抗−ＥＰＯｒ−ＩｇＧ₁αｔｐ）と一致したサイズで溶出した。親のキメラ抗体（抗−ＥＰＯｒ−ＩｇＧ₁）は実質的にカラムから遅れて溶出し、図において点線で表される。これらの結果は、ヒトＩｇＧ１不変領域へのαｔｐセグメントの付加が６量体抗体のフォーメーションを導くことを示す。本発明の多数の修飾および変異が前記の明細書に包含され、当業者にとって明白であることが予想される。本発明の組成物および方法に対するかかる修飾および変更は、本明細書に添えられる請求の範囲の範囲に含まれると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 1/04 Ｃ０７Ｋ 1/04 16/46 16/46 19/00 19/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＧ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ (31)優先権主張番号６０／０３８，９１５ (32)優先日平成９年２月21日(1997．2．21) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者スウィート，レイモンド・ホイットニーアメリカ合衆国19004ペンシルベニア州バラ・シンワイド、エッジヒル・ロード108 番 (72)発明者トルネー，アルムセッジドアメリカ合衆国19382ペンシルベニア州ウエスト・チェスター、ストーナム・ドライブ1008番

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）２量体結合タンパク質；および（ｂ）ＩｇＡ抗体の重鎖のＣ−末端由来の尾部の活性を有することで特徴付けられる尾部（αｔｐ）を有してなる６量体融合タンパク質。２．２量体結合タンパク質が、（ａ）ＩｇＧ抗体のＦｃフラグメント、ＩｇＤ抗体のＦｃフラグメント、ＩｇＥ抗体のＦｃフラグメントおよびＩｇＭ抗体のＦｃフラグメント（μｔｐを除く）からなる群より選択されるＩｇ−Ｆｃフラグメントに融合した、選択された単量体結合タンパク質の細胞外ドメインまたはその機能的フラグメントを有してなるタンパク質フラグメント；および（ｂ）天然の２量体結合タンパク質または該２量体タンパク質の結合活性を有するそのタンパク質フラグメントからなる群より選択される請求項１記載の融合タンパク質。３．さらに融合タンパク質の発現およびプロセッシングに適するリーダーを有してなる請求項２記載の融合タンパク質。４．そのタンパク質フラグメントがネイティブリーダーおよびＣＤ８０、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ８６からなる群より選択される細胞外ドメインからなる請求項２記載の融合タンパク質。５．２量体結合タンパク質がＩｇ−Ｆａｂフラグメントであり、重鎖がＩｇ− Ｆｃフラグメントに結合する請求項２記載の融合タンパク質。６．Ｉｇ−ＦｃフラグメントがＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃、ＩｇＧ₄およびＩｇＧ結合変異体からなる群のヒトイソ型より選択されるＩｇＧ抗体に由来する請求項２記載の融合タンパク質。７．Ｉｇ−ＦｃフラグメントがヒトＩｇＧ₁抗体に由来する請求項２記載の融合タンパク質。８．αｔｐがヒトＩｇＡ１、ヒトＩｇＡ２、ウサギＩｇＡ、マウスＩｇＡおよびゴリラＩｇＧからなる群より選択される抗体の尾部である請求項１記載の融合タンパク質。９．αｔｐが配列番号：１０ＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹの配列を有する請求項８記載の融合タンパク質。１０．αｔｐを修飾してＮ−連結のグリコシル化部位を除去した請求項８記載の融合タンパク質。１１．さらに、結合タンパク質とαｔｐの間に位置付けられた、アミノ酸長が１ないし約２０個のリンカーを有する請求項１記載の融合タンパク質。１２．同種６量体である請求項１記載の融合タンパク質。１３．異種６量体である請求項１記載の融合タンパク質。１４．（ａ）２量体結合タンパク質、および（ｂ）ＩｇＡ抗体の重鎖のＣ−末端由来の尾部の生物学的活性を有することにより特徴付けられる尾部（αｔｐ）を有してなる６量体融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。１５．２量体結合タンパク質が、（ａ）ＩｇＧ抗体のＦｃフラグメント、ＩｇＤ抗体のＦｃフラグメント、ＩｇＥ抗体のＦｃフラグメントおよびＩｇＭ抗体のＦｃフラグメント（μｔｐを除く）からなる群より選択されるＩｇ−Ｆｃフラグメントに融合した、選択された単量体結合タンパク質の細胞外ドメインを有してなるタンパク質フラグメント；および（ｂ）天然の２量体結合タンパク質または該タンパク質の結合活性を有するそのフラグメントからなる群より選択される、請求項１４記載のポリヌクレオチド配列。１６．さらに、融合タンパク質の発現およびプロセッシングに適するリーダーを有してなる請求項１５記載のポリヌクレオチド配列。１７．タンパク質フラグメントがネイティブリーダーおよびＣＤ８０、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ８６からなる群より選択される細胞外ドメインを有してなる請求項１５記載のポリヌクレオチド配列。１８．２量体タンパク質がＩｇ−Ｆａｂフラグメントであり、重鎖がそのＩｇ −Ｆｃフラグメントに結合している請求項１５記載のポリヌクレオチド配列。１９．Ｉｇ−ＦｃフラグメントがＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃、ＩｇＧ₄およびＩｇＧ結合変異体からなる群のヒトイソ型より選択されるＩｇＧ抗体に由来する請求項１５記載のポリヌクレオチド配列。２０．Ｉｇ−ＦｃフラグメントがヒトＩｇＧ₁抗体に由来する請求項１５記載のポリヌクレオチド配列。２１．αｔｐがヒトＩｇＡＬヒトＩｇＡ２、ウサギＩｇＡ、マウスＩｇＡおよびゴリラＩｇＧからなる群より選択される抗体の尾部である請求項１４記載のポリヌクレオチド配列。２２．αｔｐが配列番号：１０ＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹの配列を有する請求項２１記載のポリヌクレオチド配列。２３．αｔｐを修飾してＮ−連結のグリコシル化部位を除去した請求項２１記載のポリヌクレオチド配列。２４．さらに、結合タンパク質とαｔｐの間に位置付けられた、アミノ酸長が１ないし約２０個のリンカーを有する請求項１４記載のポリヌクレオチド配列。２５．（ａ）請求項１４に記載のポリヌクレオチド配列；および（ｂ）選択された宿主細胞における融合タンパク質の発現を制御する配列をコードするポリヌクレオチド配列を有してなるベクター。２６．請求項２５に記載のベクターを有してなる組換え宿主細胞。２７．医薬上許容される担体中に請求項１に記載の６量体融合タンパク質を有してなる医薬組成物。２８．医薬上許容される担体中に請求項１４に記載のポリヌクレオチド配列を有してなる医薬組成物。２９．検出可能な標識および請求項１に記載の６量体融合タンパク質を有してなる診断試薬。３０．検出可能な標識および請求項１４に記載のポリヌクレオチド配列を有してなる診断試薬。３１．（ａ）２量体結合タンパク質を得る工程；および（ｂ）その結合タンパク質の各単量体に、ＩｇＡ抗体の重鎖のＣ−末端由来の尾部の生物学的活性を有することにより特徴付けられる尾部（αｔｐ）を結合させる工程からなる６量体融合タンパク質の産生方法。３２．（ａ）請求項２６に記載の選択された宿主細胞を得る工程；（ｂ）安定した６量体融合タンパク質を回収する工程；および（ｃ）その回収された融合タンパク質を精製する工程からなる６量体融合タンパク質の精製方法。３３．融合タンパク質がＩｇＧまたはそのフラグメントを有し、その精製工程が融合タンパク質をタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇカラムに充填する工程からなる、請求項３２記載の方法。３４．請求項１に記載の６量体融合タンパク質に結合するリガンドについてスクリーニングする方法であって、（ａ）６量体融合タンパク質を得る工程；（ｂ）試験サンプルが６量体融合タンパク質と接触できるようにする工程；および（ｃ）融合タンパク質と試験サンプル中のリガンドとの結合を検出する工程からなるスクリーニング方法。３５．融合タンパク質が表面に固定されている請求項３４記載の方法。３６．融合タンパク質が溶液中にある請求項３４記載の方法。３７．融合タンパク質がＣＤ８０−ＩｇαｔｐおよびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐからなる群より選択される、請求項３４記載の方法。３８．選択された結合タンパク質とリガンドの間の相互作用を阻害する化合物についてスクリーニングする方法であって、（ａ）結合タンパク質についての既知リガンドを得る工程；（ｂ）請求項１に記載の６量体融合タンパク質を得る工程；（ｃ）既知リガンドを試験溶液と接触させる工程；（ｄ）既知リガンドを６量体融合タンパク質と接触させる工程；（ｅ）６量体融合タンパク質の結合の阻害を検出する工程；および（ｆ）所望により、その６量体タンパク質に結合する化合物を単離してもよい工程とからなるスクリーニング方法。３９．リガンドをＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４からなる群より選択し、６量体融合タンパク質をＣＤ８０−ＩｇαｔｐおよびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐからなる群より選択する、請求項３８記載の方法。４０．ＣＤ８０−ＩｇαｔｐおよびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐからなる群より選択される６量体融合タンパク質をＣＤ２８陽性細胞に付与する工程からなる、ＣＤ２８陽性細胞の刺激方法。４１．ＣＤ８０−ＩｇαｔｐおよびＣＤ８６−Ｉｇαｔｐからなる群より選択される６量体融合タンパク質をＣＴＬＡ−４陽性細胞に付与する工程からなる、ＣＴＬＡ−４陽性細胞の抑制方法。４２．ＣＤ２８陽性細胞に６量体融合タンパク質ＣＴＬＡ４−Ｉｇαｔｐを付与することにより、該細胞の細胞表面ＣＤ８０−およびＣＤ８６−介在刺激をアンタゴニストする方法。４３．請求項２７に記載の有効量の医薬組成物を動物に投与することからなる動物の免疫化方法。４４．請求項２８に記載の有効量の医薬組成物を動物に投与することからなる動物の免疫化方法。