JP2000502562A - 細胞活性化プロセスおよびそのための試薬 - Google Patents
細胞活性化プロセスおよびそのための試薬Info
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Abstract
(57)【要約】
エフェクター細胞が、2つ以上の異なる細胞質のシグナリング成分を含むキメラレセプターをコードするDNAで形質転換される、細胞活性化プロセスが記載される。活性化細胞は、例えばガンのような疾患の処置における医薬において使用され得る。
Description
【発明の詳細な説明】
細胞活性化プロセスおよびそのための試薬
本発明は、細胞を活性化するプロセス、細胞活性化を達成するためのDNA送達
系、および医療における活性化した細胞の使用に関する。
天然のT細胞レセプターは、抗原結合、膜貫通成分および細胞質成分を含むポ
リペプチド鎖の複合会合体である。正しい状況でのレセプターへの抗体の結合は
、T細胞の活性化、および例えば、抗原提示標的細胞の破壊を導く一連の細胞内
事象を引き起こす。抗原の認識が起こり得る前に、抗原はMHC分子との会合を示
すはずである。
MHCに対するこの要件が、操作されたT細胞によって回避され得る場合、天然
のMHC提示抗原とは違った結合リガンドで活性になることが高度に所望された。
これは、MHCの提示を伴って会合する個体間の可変性を無効にする手段を提供し
、そしてまた、高度に発現される表面抗原の標的化、それによるリンパ球媒介性
治療(例えば、腫瘍治療)の有効性を増大を可能にした。
キメラレセプターは、標的T細胞をその細胞表面で抗原を発現する細胞にする
ように設計されている。このような組換えキメラレセプターは、抗体由来の結合
ドメインおよびT細胞レセプター(「T体」といわれる)由来の細胞内シグナリ
ングドメインを包含するキメラを含む(例えば、発行された国際公開第WO92/105
91号、同第WO92/15322号、同第WO93/19163号、および同第WO95/026861号を参照
のこと)。
当該分野で記載されている組換えキメラレセプターは、リガンド結合成分、膜
貫通成分、および細胞質成分から成っている。しかし、T細胞のこれらの組換え
キメラレセプターとのトランスフェクションは、T細胞がまた、例えば、高レベ
ルのインターロイキン2[II-2]での処置によって同時剌激されなければ、抗原結
合の際のT細胞活性化の受容可能なレベルを生じないということが見出されてい
た。同時刺激の必要性は、主に患者のエクスビボでの処置に適切な方法を作製す
る。これは、長く、そして複雑な手順である。
本発明は、同時刺激剤(例えば、II-2)の添加必要としないエクスビボでの改
善された活性化を達成する、本エクスビボでのアプローチへの変更を提案する。
これはまた、T細胞のインビボでの良好な再配向および活性化を、特に、単一の
型の細胞外相互作用への応答において、有利に提供する。
本質的に、本発明は、キメラレセプターをコードするDNAで形質転換されたエ
フェクター細胞を提供する。キメラレセプターは、天然には連結せず、かつ細胞
の改善された活性を産生するのに協同で作用するために有利に選択される、2つ
以上の異なるシグナリング細胞質成分を含む。このような組換えキメラレセプタ
ーをコードするDNAは、インビボおよび/またはエクスビボで、T細胞または他
のエフェクター細胞に導入され得る。標的細胞への1つ以上のこれらのキメラレ
セプターを発現するエフェクター細胞の後の次の結合は、キメラレセプターにお
けるクラスター形成もしくはキメラレセプターの二量体化、またはキメラレセプ
ターにおけるアロステリック変化、またはレセプタートリガリングの他のメカニ
ズムを含むプロセスにおいてエフェクター細胞の活性化を導く、シグナル形質導
入を誘発する。
従って、本発明の一つの局面によって、本発明者らは、上記の第1の細胞と第
2の細胞と会合した分子との間の細胞外相互作用の1つの型の結果として、細胞
を活性化する方法を提供する。この方法は、2つ以上の異なる細胞質シグナリン
グ成分を含む、1つ以上の組換えキメラレセプターをコードするDNAを含む、第
1の細胞がDNA送達系とともに上記の代の細胞が提供されることを特徴とする。
ここで、上記の細胞質成分は天然には連結されず、そして少なくとも一つは、膜
スパニングポリペプチド由来である。
キメラレセプター(単数または複数)をコードするDNAは、発現される場合、
整えられていて、そして細胞と第2の標的細胞との間の細胞外相互作用において
、シグナルは、細胞質シグナリング成分を介して2つ以上の異なる細胞内シグナ
リングメッセンジャーに形質導入される。
これは、細胞の活性化を生じ、そして標的細胞への生物学的応答を誘発する。
本明細書で使用されるように、細胞活性化は、1つ以上のシグナル形質導入経路
の活性化を意味する。これは、細胞増殖;例えば、前炎症性応答または抗炎症性
応答をともなうサイトカインの発現;細胞溶解活性、異性化、または他のエフェ
クター機能の刺激;抗体の分泌;食細胞活動;腫瘍浸潤の増加および/または増
大する接着によって明らかにされ得る。
細胞質シグナリング成分は、好ましくは、協同で作用し得るように選択される
。これらは「天然には連結されない」。この用語は、天然では、単一のポリペプ
チド鎖上で互いに接続されない細胞質シグナリング成分を示すために本明細書中
で使用される。特に有用なシグナリング成分は、本発明の他の局面との関連にお
いて、明細書中の以後に記載される成分を含む。
細胞質シグナリング成分に加えて、各組換えキメラレセプターは、好ましくは
、標的細胞で細胞表面分子を認識し得る結合成分、および膜貫通成分を含む。こ
れらの成分をコードするDNAは、さらに、一旦、発現されたキメラレセプター(
単数または複数)が、細胞表面膜を指向することを確実にするシグナルペプチド
をコードする。全ての成分は、シグナルDNAコード配列によってコードされ得る
。
あるいは、各細胞質シグナリング成分は、2つ以上の別のDNAコード配列によ
ってコードされ得る。この例において、各DNAコード配列はまた、シグナルペプ
チド、膜貫通成分、および/または結合成分をコードし得る。結合成分は、異な
り得るが、一般的には全てが、同型の細胞外事象に(例えば、標的細胞と会合す
る同一の分子に結合することよって)関係し得る。好ましくは、結合成分は、同
一である。
下文に記載されている適用のいくつかにおいて、例えば、結合成分が抗体また
は抗体フラグメントである場合、キメラレセプターをコードするDNAは、2つの
別のDNAコード配列を含み得る。例えば、結合成分(抗体の場合、例えば、VH成
分)の一部をコードする1つの配列は、シグナルペプチド、膜貫通成分および細
胞質シグナリング成分(単数または複数)、ならびに結合成分(例えば、所定の
実施例におけるVL成分)の残りをコードする第2の配列に結合する。
所望の細胞を活性化するために、キメラレセプターをコードするDNAは、細胞
に送達されるために、第一に必要である。従って、本発明の第2の局面によれば
、本発明者らは、細胞外相互作用の1つの型が可能な組換えキメラレセプターを
コードする上記キャリアDNAと関連するDNAを包含し、そして天然には連結されな
い
2つ以上の異なる細胞質シグナリング成分を包含するDNA送達系を提供する。そ
してここで、少なくとも一つの上記の細胞質成分は、膜スパニングポリペプチド
由来である。
本発明のこの局面において、キメラレセプターは、単一のDNAコード配列(特
に、2つ以上の異なる細胞質シグナリング成分をコードする)によってコードさ
れ得る。従って、1つの好みにおいて、本発明は、組換えキメラレセプターをコ
ードする上記のキャリアDNAと関連するDNAを包含するDNA送達系を提供し、ここ
で、上記のDNAは、リーディングフレームで以下をコードする:
i)シグナルペプチド成分;
ii)標的細胞上で細胞表面分子を認識し得る、結合成分;
iii)膜貫通成分;
iv)天然には連結されない、2つ以上の異なる細胞質シグナリング成分であって
、ここで、少なくとも1つの上記の細胞質成分は、任意に膜スパニングポリペプ
チド由来である;
v)上記のi)からiv)の成分の任意の2つ以上に連結する、1つ以上のスペーサ
ー領域。
組換えキメラレセプターの成分は、シグナリング細胞質成分が、結合成分によ
る標的細胞上での細胞表面分子の認識の結果、1つ以上のメッセンジャー系の活
性化を生じるシグナルを形質導入において機能的であるように作動可能に連結さ
れる。
2つ以上の成分が、1つ以上のスペーサー領域によって連結され得る。スペー
サー領域は、成分が生物学的活性のために正しいコンフォメーションを採択する
ことを促進するために機能し得る。膜貫通成分iii)および結合成分ii)に連結
するスペーサー領域の使用が、特に有利である。
スペーサー領域は、例えば、300までのアミノ酸、および好ましくは20〜100ア
ミノ酸、および最も好ましくは25〜50アミノ酸を含み得る。
スペーサーは、天然に生じる分子の全体または一部分に由来(例えば、CD8、C
D4またはCD28の細胞外領域の全体または一部分;あるいはヒンジ領域を含む抗体
定常領域の全体または一部分に由来)し得る。細胞内シグナリング分子の機能的
部分の間に天然に位置する成分(例えば、ITAMS(活性化モチーフに基づく免疫
レセプターチロシン)の間のスペーサー)の全体または一部分がまた、用いられ
得る。あるいは、スペーサーは、非天然に存在する配列であり得る。
結合成分ii)は、細胞表面分子と相互作用し得る任意の分子であり得、そして
疾患状態に関連する細胞(例えば、ウイルス感染細胞;細菌感染細胞;ガン細胞
(例えば、肺腫瘍細胞で発現されるボンベシンレセプター、ガン胎児性抗原、多
形上皮ムチン、およびCD33);ペプチドホルモン、接着分子、自己免疫性疾患に
存在する炎症性細胞、または自己免疫を生じるT細胞レセプターもしくは抗原に
関連する細胞)上で発現される表面マーカーを認識するために選択され得る。
本発明のキメラレセプターにおける使用に適切な結合成分はまた、分子に関連
した細胞表面への結合に関連する以下のレセプターの全体または一部分を含む;
T細胞レセプター;CD4;CD8;CD28;サイトカインレセプター(例えば、インタ
ーロイキンレセプター、TNFレセプター、またはインターフェロンレセプター(
例えば、γ-INF));コロニー剌激因子(例えば、GMCSF)に対するレセプター
;例えば、 CHおよびCLドメインに関連し得るFab、Fab'、F(ab')2、一本鎖Fv、F
v、およびVHまたはVL成分を含有する抗体およびその抗原結合フラグメント。抗
体またはフラグメントは、マウス、ヒト、キメラまたは操作されたヒト抗体およ
びフラグメントであり得る。本明細書中で用いられる用語、操作されたヒト抗体
またはフラグメントは、一つの抗体(例えば、別のヒトフレームワークに包埋さ
れたマウス抗体)由来の1つ以上のCDRおよび1つ以上のフレームワーク残基を
有する抗体またはフラグメントを意味するために意図される。このような抗体は
、周知であり、例えば国際公開第WO91/09967号に記載されるような多数の方法に
よって調製され得る。
特に有用な結合成分は、Fab'フラグメントまたは、とりわけ、一本鎖Fvフラグ
メントを含む。
結合成分が、一本鎖Fvまたは別の結合鎖を含むVHもしくはVL成分とは違った抗
体または抗体フラグメントである場合、本発明による送達系の別の第2のDNAコ
ード配列を含み、第2の結合鎖をコードすることが必要である。この例において
、細胞質シグナリング成分および抗体またはフラグメントの1つの鎖を含んでい
る
第1のDNA配列は、シグナルペプチドおよび抗体またはフラグメントの第2の鎖
をコードする第2のDNA配列と同時発現され、その結果、抗体結合成分のアセン
ブリが、生じ得る。
膜貫通成分iii)は、T細胞レセプター、CD28、CD8、CD4、サイトカインレセ
プター(例えば、インターロイキンレセプター、TNFレセプター、もしくはイン
ターフェロンレセプター)、またはコロニー刺激因子レセプター(例えば、GMCS
F)のα鎖、β鎖、またはζ鎖全部または一部分のような広範な種々の供給源由
来であり得る。
結合成分および膜貫通成分は、直接または、好ましくは、スペーサー領域によ
って連結され得る。スペーサー領域は、上記の1つ以上の領域であり得る。1つ
以上の領域(例えば、2つの領域)が存在する場合、好ましくは異なる領域(例
えば、CD28の細胞外領域の全体または一部分に連結された抗体ヒンジ領域)が存
在する。
スペーサーおよび膜貫通成分は、それらが遊離のチオール基を有し、それによ
り、多量体化(好ましくは二量体化能力)有するキメラレセプターを提供するよ
うに有利に選択される。この型(特に二量体)のレセプターが、特に好ましく、
そしてCD28成分、天然のT細胞レセプターのζ鎖、および/または抗体ヒンジ配
列を有するものを含む。
膜貫通成分は、直接またはスペーサーのいずれかの手段によって接着された細
胞質成分に天然に連結され得るか、または連結されなくてもよい。
細胞質シグナリング成分iv)は、例えば、1つ以上の細胞内メッセンジャー系
の活性化を生じるシグナルを形質導入し得る。各細胞質成分が、異なるメッセン
ジャー系を活性化することが好ましい。直接的または間接的のいずれかで活性化
され得る細胞内メッセンジャー系は、1つ以上のキナーゼ経路(例えば、チロシ
ンキナーゼ、PKCまたはMAPキナーゼを含む経路;Gタンパク質またはホスホリパ
ーゼ媒介性経路;カルシウム媒介性経路;およびインターロイキン(例えば、NF
ATを含むIL-2)のようなサイトカインの合成を含む経路)、およびcAMP媒介性経
路を含む。
適切な細胞質成分iv)の例は、例えば、ζ鎖、η鎖またはε鎖の全体または一
部分のようなT細胞レセプター;CD28;Fcレセプターのγ鎖;またはサイトカイ
ンレセプター(例えば、インターロイキン、TNFおよびインターフェロンレセプ
ター)由来のシグナリング成分、コロニー剌激因子レセプター(例えば、GMCSF
)、チロシンキナーゼ(例えば、ZAP-70、fyn、lyk、Itkおよびsyk);接着分子
(例えば、LFA-1およびLFA-2、B29、MB-1、CD3δ、CD3γ、CD5またはCD2由来の
ものを含む。シグナリング細胞質成分は、好ましくは細胞質成分を含むITAMであ
る。
細胞質シグナリング成分は、好ましくは、それらが協同で作用するように選択
される。それらは、互いに関連する任意の方向に存在し得る。特に有用な成分は
、CD28のシグナリング成分の全体もしくは一部分か、またはT細胞レセプターの
ζ鎖を含む。
シグナル成分は、本来結合成分と関連し得るものであるか、または他の供給源
由来であり得る。
適切なシグナルペプチド成分i)の例は、免疫グロブリンシグナル配列を含む
。
シグナル成分、結合成分、膜貫通成分、および細胞質成分は、好ましくは、ヒ
ト配列由来であるか、またはヒト配列に基づく。
キメラレセプターの個々の成分のホモログが使用され得、そして本発明は、こ
のような使用を拡張することが理解される。キメラレセプターの成分をコードす
る特定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に関してホモログがキメラレセプター
の特定の成分として同一の機能を本質的に保持することを常に提供する本明細書
中で用いられる用語、ホモログは、1つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸が付
加、欠失、置換、またはそうでなければ化学的に改変されてホモログがキメラレ
セプターの特定の成分として同一の機能を本質的に保持することを常に提供する
、対応する配列を示す。ホモログは、標準の分子生物学的技術および/または化
学的技術(例えば、cDNAまたは遺伝子クローニング)によって取得し得るか、あ
るいは、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発またはオリゴヌクレオチド指向性合
成技術またはギャップオリゴヌクレオチド酵素的切断もしくは酵素的フィルイン
によって得ることができる。
個々の成分のフラグメントがまた、用いられ得、ここで、1つ以上のヌクレオ
チドは、削除されて、フラグメントがキメラレセプターの出発成分としての実質
的に同様な機能を保持することを提供される。
本発明のこの局面および他の局面における使用のためのDNAは、標準的な分子
生物学的手順および/または化学的手順を用いて(例えば、オリゴヌクレオチド
指向性変異誘発またはオリゴヌクレオチド指向性合成技術、ギャップオリゴヌク
レオチドの酵素的切断または酵素的フィルインの使用によって)容易に入手可能
なDNA供給源から得ることができる。このような技術は、Maniatisら、Molecular
Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,New York 1989、および本明細書中
以下の実施例に詳細に記載されている。
本発明のDNA送達系における使用のためのキャリアは、標的細胞および/また
は標的宿主細胞に、エクスビボまたはインビボで、DNAの誘導に適切なベクター
または他のキャリアであり得る。適切なベクターの例は、ウイルスベクター(例
えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、EBV、およびHSV
)および非ウイルスベクター(例えば、リポソームベクターおよびDNA縮合剤に
基づくベクター)である。あるいは、キャリアは抗体であり得る。適切な場合、
ベクターは、レトロウイルスLTRのようなウイルス由来のプロモーター/調節配
列および/または複製機能、AAV反復、SV40およびhCMVプロモーターおよび/ま
たはエンハンサー、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル;EBVおよびB
Kウイルス複製機能をさらに含み得る。組織特異的調節配列(例えば、TCR-αプ
ロモーター、E-セレクチンプロモーター、およびCD2プロモーター)ならびに遺
伝子座制御領域もまた、用いられ得る。
2つ以上のDNA分子がDNA送達系に用いられる場合、それらは、上記と同じかま
たは異なるキャリアに取り込まれ得る。
エクスビボでの使用のために、本発明のDNA送達系は、当該分野で周知の方法
(例えば、トランスフェクション、形質導入、微粒子銃、プロトプラスト融合、
リン酸カルシウム沈降DNA形質転換、エレクトロポーレーション、カチオンリポ
フェクション、または標的化したリポソーム)を用いて標的宿主から取り出され
たエフェクター細胞に導入され得る。次いで、エフェクター細胞は、標準的な技
術を用いて宿主に再導入される。
広範な種々の標的宿主(例えば、哺乳動物、および特にヒト)は、本発明に従
って使用され得る。
適切なエフェクター細胞の例は、免疫系に関連する細胞(例えば、リンパ球(
例えば、細胞傷害性Tリンパ球、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、好
中球、好塩基球、またはTヘルパー細胞);樹状細胞、B細胞、造血幹細胞(ha
emoatopaietic stem cell)、マクロファージ、単核細胞、またはNK細胞)を含
む。細胞傷害性Tリンパ球の使用が、特に好ましい。
本発明によるDNA送達系は、インビボでの投与に特に適切である。キャリアが
、所望のエフェクター細胞にDNAを指向し得る標的された送達系の形態が1つの
好ましい例であり得る。このようなDNAを標的された送達系の特定の例は、DNAを
標的された裸のDNA、DNAをカプセル化および/またはDNAと複合体化する標的さ
れたリポソーム、標的されたレトロウイルス系、ならびにプロタミンおよびポリ
リジン縮合DNAのような標的された縮合DNAを含む。
標的系は、当該分野で周知であり、そして例えば、インビボで標的細胞上に発
現される細胞表面抗原(例えば、CD8;CD16;CD4;CD3;セレクチン(例えば、E
-セレクチン);CD5;CD7;CD34;活性化抗原(例えば、CD69およびIL-2R))に
対する抗体またはそのフラグメントを使用することを含む。あるいは、他のレセ
プター-リガンド相互作用が、例えば、HIVgp160-発現標的細胞を標的するCD4を
標的するために用い得る。
一般的には、DNAを標的する抗体の使用が好ましく、特に、裸のDNAを標的する
抗体、縮合DNAを標的する抗体、および特にリポソームDNAを標的する抗体である
。用いられ得る特定の型のリポソームは、例えばpH感受性リポソームを含む。こ
こで、低いpHで切断されたリンカーは、抗体をリポソームに連結させるために用
いられ得る。細胞膜と融合し、そして本発明に従って組換えキメラレセプターDN
Aを細胞質に直接送達するカチオン性リポソームもまた、用いられ得る。例えば
、ポリエチレングリコールポリマーのような本発明における使用のためのリポソ
ームはまた、それらの表面に接着された親水性基を有し得、それらの半減期の循
環を増大させる。当該分野において、リポソームまたは他のキャリアへの接着の
ための適切な基の多くの例が存在する:例えば、国際公開第91/05546号、同第WO
93
/19738号、同第WO94/20073号、および同第WO94/22429号を参照のこと。抗体また
は他の標的分子は、抗体(例えば、チオールまたはアミンなど)において、およ
びDNAまたはDNA含有物質において従来の容易に入手可能な基および反応性官能基
を用いて、DNA、縮合DNA、またはリポソームに連結され得る。
非標的化送達系もまた用いられ得、そしてDNAのこれらの標的化発現は利点で
あり得る。DNAの標的化発現は、例えば、T細胞特異的プロモーター系(例えば
、ζプロモーターおよびCD2プロモーターおよび遺伝子座制御領域、ならびにペ
ルフォリンプロモーター)を用いて達成され得る。
上記の本発明の局面は、キメラレセプターをコードするための一本鎖DNAの配
列を有利に利用する。しかし、本発明が、キメラレセプターが2つ以上の別のDN
Aコード配列によってコードされるDNA送達系を拡大し得ることが評価される。従
って、一つの例において、第1および第2の別のDNAコード配列は、上記の同じ
リーディングフレームの成分i)〜iv)および必要に応じてv)をそれぞれコード
するが、細胞質シグナリング成分iv)は同一ではない互いに異なる送達系に存在
し得る。2つのDNAコード配列は1つ以上のシグナリング成分をそれぞれコード
し得、第1のDNA上の少なくとも一つの成分が第2のDNAの任意の他のシグナリン
グ成分と異なることを提供する。上記のように、シグナリング成分は、協同で作
用するように有利に選択され、そして、残りの成分は、一本鎖DNAの実施態様に
ついて先に記載された任意のものであり得る。第1のDNAによってコードされる
結合成分iv)は、第2のDNAによってコードされるものと同一であることが好ま
しい。有利には、第1のDNAによってコードされる結合成分が、第2のDNAによっ
てコードされる異なるスペーサー領域によって膜貫通成分から分離される。
送達系は、エクスビボで用いられ得、そして、さらなる局面において、本発明
は、本発明によるDNA送達系でトランスフェクトされたエフェクター細胞を提供
する。エフェクター細胞は、上記のエクスビボでの使用に適している任意のもの
であり得、そして好ましくはT細胞であり、最も好ましくは細胞傷害性T細胞で
ある。
DNA送達系は、薬学的組成物の形態をとり得る。それは、治療組成物または診
断組成物であり得、そして投与に適切な任意の適切な形態で得られ得る。好まし
くは、それは非経口投与に適切な形態(例えば、ボーラス注射または継続的注入
用の注射または注入)である。組成物が注射、または注入用である場合、それは
油性または水性ビヒクル中で懸濁液、溶液、またはエマルジョンの形態でをとり
得、そしてそれは、懸濁剤、保存剤、安定剤、および/または分散剤のような製
剤を有し得る。あるいは、再構成のために適切な無菌溶液を用いる前は、組成物
は、乾燥形態で存在し得る。
組成物が、経口投与に適切である場合、製剤は、有効成分に加えて、添加剤(
例えば、デンプン-例えば、ポテト、メイズ、または小麦のデンプン、またはセ
ルロース誘導体あるいは微結晶性セルロースのようなデンプン誘導体;シリカ;
ラクトースのような種々の糖;炭酸マグネシウムおよび/またはリン酸カルシウ
ム)を含み得る。製剤が経口投与用である場合、それは、患者の消化系によって
良好に許容されることが所望される。この目的のために、粘液形態および樹脂の
製剤を含むことが所望され得る。胃液に不溶性であるカプセルに組成物を処方す
ることによって許容を改善することもまた、所望され得る。制御された放出製剤
中の組成物を含み得ることもまた、好まれ得る。
本発明によるDNA送達系は、医薬に使用され、そして本発明は、ヒトまたは動
物被験体処置の方法を拡大し、その方法は、被験体に上記のDNA送達系の有効量
を投与することを包含する。使用される正確な量は、患者の年齢および状態、疾
患または障害の性質ならびに投与の経路に依存するが、従来の手段を用いて(例
えば、動物実験から得られたデータの推定によって)決定され得る。特に、エク
スビボでの使用のために、要求される多数のトランスフェクトされたエフェクタ
ー細胞は、エクスビボトランスフェクションおよびエフェクター細胞数の範囲の
動物モデルの再導入によって確立され得る。同様に、インビボでの使用のために
必要とされるDNAの質は、DNA濃度の範囲を用いて動物に確立され得る。
本発明によるDNA送達系は、多数の疾患または障害の処置に有用であり得る。
このような疾患または障害は、以下の感染性疾患の一般的な進行(heading)に
記載されたものを含み得る:例えば、HIV感染;炎症性疾患/自己免疫(例えば
、リウマチ性関節炎、骨関節炎、炎症性腸疾患);ガン;アレルギー性/アトピ
ー性疾患(例えば、喘息、湿疹);先天性症(例えば、嚢胞性線維症、鎌形赤血
球
貧血症);皮膚病(例えば、乾癬);神経症(例えば、多発性硬化症);移植(
例えば、器官移植拒絶、移植片対宿主疾患);代謝性/特発性疾患(例えば、糖
尿病)。
本明細書中に記載のキメラレセプターをコードするDNAはまた、本発明の特徴
、特に本明細書中に記載の送達系における使用のための特徴を形成する。
本発明はさらに、以下の非制限の実施例および図で例示される:
図1は、pBluescript SK+にクローン化された組換えキメラレセプター構築物
の線図を示す。
図2は、pBluescript SK+にクローン化された組換えキメラレセプター構築物
の線図を示す。
図3は、組換えキメラレセプター構築物のオリゴヌクレオチド配列を示す。
図4は、hCTMO1/CD8/ζ組換えキメラレセプターのヌクレオチド配列およびア
ミノ酸配列を示す。
図5は、hCTMO1/CD8/ζ-CD28組換えキメラレセプター融合のヌクレオチド配列
およびアミノ酸配列を示す。
図6は、hCTMO1/CD8/CD28組換えキメラレセプターのヌクレオチド配列および
アミノ酸配列を示す。
図7は、CTMO1/G1/ζ組換えキメラレセプターのヌクレオチド配列およびアミ
ノ酸配列を示す。
図8は、hCTMO1/G1/ζ-CD28組換えキメラレセプター融合のヌクレオチド配列
およびアミノ酸配列を示す。
図9は、hCTMO1/h/CD28組換えキメラレセプターのヌクレオチド配列およびア
ミノ酸配列を示す。
図10は、抗イデオタイプ抗体単独または抗CD28抗体との組合せで剌激された場
合の、細胞株TB3.2、3.13および3.24によるIL2産生の棒グラフを示す。
図11は、抗CD28抗体を用いる同時剌激を伴うかまたは伴わずに示される、抗原
発現腫瘍細胞で剌激された場合の、細胞株TB3.13によるIL2の産生の棒グラフを
示す。
図12は、種々の剌激への応答における、HGT1.2およびHGT1.4によるIL-2産生の
棒グラフを示す。
図13は、抗体の種々の組合せとともにインキュベートしたHGT2.4によるIL-2産
生の棒グラフを示す。
図14は、組換えキメラレセプター構築物の略図を示す。
図15は、組換えキメラレセプター構築物の略図を示す。
図16は、組換えキメラレセプター構築物の略図を示す。
図17は、組換えキメラレセプター構築物の略図を示す。
図18は、ジャーカット細胞における、CD28キメラの発現レベルの棒グラフを示
す。
図19は、標的細胞への応答において2つの異なるキメラレセプターを発現する
ジャーカット細胞によるIL-2産生の棒グラフを示す。
図20は、組換えアデノウイルスで感染したCD8+veヒトCTL細胞による標的細胞
の細胞融解を示すグラフを示す。実施例1 キメラレセプター遺伝子の構築
キメラレセプター構築物の各成分を、標準的な技術(PCR Protocols,Innisら
、1990,Academic Press inc.)により、PCRクローニングするかまたはPCRアセン
ブリするかのいずれかを行い、そしてpBluescript SK+(Stratagene)へカセット
形式においてサブクローニングした。図1、2、2bおよび2cを参照のこと。
オリゴヌクレオチドを図3に記載する。
1.1本鎖Fvカセット hCTMO1
遺伝子操作ヒトCTMO1抗体由来のscFvを、以下のように構築した。リーダー配
列およびhCTMO1 VIを、プラスミドpAL 47(国際特許明細書第WO 93/06231号)か
ら、オリゴR6490およびR6516(オリゴ配列を図3に示す)を用いてPCRクローニ
ングした。R6490は、5’NotIおよびHindIII部位を導入し、そしてR6516は、(Gly
4Ser)5リンカーの一部を形成する。hCTMO1 Vhを、プラスミドpAL 52(WO 93/0623
1)からオリゴR6515(リンカーの一部を形成)およびR6514(3’SpeI部位を導入)
を用いてPCRクローニングした。次いで、リーダー/VIおよびVhフラグメントを
、共にPCRスプライシングし、そしてPCR産物をNotIおよびSpeIで制限し、そして
pBluescript SK+へサブクローニングした。hP67.6
WO91/09967に従って遺伝子操作した、別の遺伝子操作ヒト抗体であるhP67.6由
来のscFvを同様に調製し、そしてpBluescript SK+へサブクローニングした。
2.CD8 ヒンジスペーサーカセット
hCTMO1 TCRζキメラレセプターおよびhCTMO1 TCR ζ-CD28融合キメラレセプタ
ー(5'ζの小部分を含む)のためのCD8ヒンジスペーサーを、重複するオリゴ:R
6494、R6495、R6496、およびR6497を用いてPCRアセンブリした。hCTMO1 CD28キ
メラレセプターのためのCD8ヒンジスペーサーを、重複するオリゴ:R6494、R649
5、R6496、およびR6506を用いてPCRアセンブリした。両方のPCR産物を、SpeIお
よびBamHIで制限し、そしてpBluescript SK+へサブクローニングした。
3.ヒトTCRζカセット
ヒトζ膜貫通および細胞内成分を、ヒト白血球cDNA(Clonetech)から、オリゴR
6488(5’BamHI部位を導入)およびR6489(3’EcoRI部位を導入)を用いてPCRク
ローニングした。PCR産物を、BamHIおよびEcoRIで制限し、そしてpBluescript S
K+へサブクローニングした。
4.ヒトCD28カセット
ヒトCD28膜貫通および細胞内成分を、ヒト白血球cDNA(Clonetech)から、オリ
ゴP3240(5’BamHI部位を導入)およびP3241(3’EcoRI部位を導入)を用いてPC
Rクローニングした。PCR産物を、BamHIおよびEcoRIで制限し、そしてpBluescrip
t SK+へサブクローニングした。
5.ヒンジ−CD28カセット
ヒトCD28細胞外、膜透過および細胞内成分を、ヒト白血球cDNA(Clonetech)か
ら、オリゴS0146(5’SpeI部位を導入)およびP3241(3’EcoRI部位を導入)を
用いてPCRクローニングした。S0146はまた、ヒトIgG1ヒンジの234〜243残基を構
成する。PCR反応の産物を、制限酵素SpeIおよびEcoRIで消化し、そしてpBluescr
ipt SK+へサブクローニングした。
6.ζ-CD28融合カセット
天然に存在するStyI部位で始まるζの3'末端およびヒトCD28の細胞内成分をPC
Rアセンブリして、ζ停止コドンを除去し、そしてインフレームの融合タンパク
質が翻訳されるようにした。PCRアセンブリを、重複するオリゴ:P3301、P3302
、P3303、P3304、P3305、およびP3306を用いて行った。PCR産物を、StyIおよびE
coRIで制限し、そしてhCTMO1 TCRζキメラレセプター構築物を含むpBluescript
SK+へサブクローニングし、ζの3'末端を置き換えた。
7.ヒトIgG1スペーサーカセット
ヒトIgG1ヒンジ、CH2およびCH3を、IgG1 cDNA(A.Popplewell)から、オリゴS0
060(5’SpeI部位を導入)およびS0061(3’BamHI部位を構成するL、D、Pお
よびK残基を導入)を用いてPCRクローニングした。PCR産物を、SpeIおよびBamH
Iで制限し、そしてpBluescript SK+へサブクローニングした。
8.h.28 スペーサーカセット
ヒトIgG1ヒンジおよびヒトCD28細胞外成分の一部を、scFv/h/CD28プラスミド
からオリゴT4057およびT4058を用いてPCRクローニングした。T4057は5’SpeI部
位を導入し、およびT4058は3’BamHI部位を構成するL、D、PおよびK残基を
導入する。PCR産物を、SpeIおよびBamHIで制限し、そしてpBluescript SK+へサ
ブクローニングした。
9.CD28 −ζ融合カセット
ヒトCD28膜貫通および細胞内成分を、scFv/h/CD28プラスミドから、オリゴT71
45およびT4060を用いてPCRクローニングした。T7145は3’BamHI部位を構成する
L、D、P、およびK残基を導入する。T4060は、ヒトζ細胞内成分の5'末端に
相補的な3'突出を含む。
ヒトζ細胞内成分を、scFv/G1/ζプラスミドから、オリゴT4387およびS4700を
用いてPCRクローニングした。T4387は、ヒトCD28細胞内成分の3'末端に相補的な
5'突出を含む。S4700は、3’EcoRI部位を導入する。
次いで、CD28膜貫通および細胞内成分を、オリゴT7145およびS4700を用いてζ
細胞内成分へPCRスプライシングした。PCR産物を、BamHIおよびEcoRIで制限し、
そしてpBluescript SK+へサブクローニングした。
10.CD28 −ζ−CD28融合カセット
ヒトζにおけるPstI制限部位を用いて、ζ細胞内成分の3'末端およびζ−CD28
融合カセットからのPstIからEcoRIフラグメント上のCD28細胞内成分を、CD28−
ζ融合カセットへサブクローニングして、ζの3'末端を置き換えた。これにより
、5’BamHI部位および3’EcoRI部位を有するCD28−ζ−CD28融合カセットが生じ
る。上記のカセットの全てを、発現ベクターへクローニングする前に、pBluescr
iptSK+中で完全に配列決定(Applied Biosystems,Taq DyeDeoxy Terminator Cyc
leSequencing、パート番号901497)した。
標準的な分子生物学技術を用いて適切なカセットをアセンブリすることにより
、これらのカセットをアセンブリして、ヒト多型上皮ムチン(PEM)に対して指向
される遺伝子操作ヒト抗体hCTMO1の特異性、またはヒトCD33に対して指向される
hP67.6の特異性を有するキメラレセプターを構築した。以下のキメラレセプター
を構築した;表2および図14〜17を参照のこと。ここで、潜在的なジスルフィド
結合を2つのサブユニットの間の水平線により示す(100%の分子において、全
てのジスルフィド結合が形成されなくてもよい)。
1)scFv/CD8/ ζキメラレセプター(図14)
scFv/CD8/ζキメラレセプターは、ヒトT細胞レセプターζ鎖(TCR)の細胞外、
膜貫通および細胞内成分に連結されたヒトCD8ヒンジの一部の形態における細胞
外スペーサーに連結された1本鎖Fv(scFv)からなる。
scFvは、リーダー配列、および(Gly4Ser)5リンカーを介して遺伝子操作ヒト抗
体の重鎖の可変成分に連結された遺伝子操作ヒト抗体の軽鎖の可変成分からなる
。細胞外スペーサーは、ヒトCD8(Zamoyskaら:Cell 43,153-163,1985)のヒン
ジ領域の98〜142残基からなる。これを、細胞外(一部)、膜貫通および細胞内
領域を含むヒトTCRζの6〜142残基(Weissmanら:PNAS 85,9709-9713,1988.M
oingeonら:Eur.J.Immunol.20,1741-1745,1990)へ連結する。
2)scFv/CD8/CD28 キメラレセプター(図14)
CD8ヒンジ/CD28キメラレセプターは、ヒトCD28の膜貫通および細胞内成分に連
結されたヒトCD8ヒンジの一部の形態における細胞外スペーサーに連結された、s
cFvからなる。
scFvは、リーダー配列、および(Gly4Ser)5リンカーを介して遺伝子操作ヒト抗
体の重鎖の可変成分に連結された遺伝子操作ヒト抗体の軽鎖の可変成分からなる
。細胞外スペーサーは、ヒトCD8(Zamoyskaら:Cell 43,153-163,1985)のヒン
ジ領域の98〜142残基からなる。これを、膜貫通および細胞内成分を含むヒトCD2
8の132〜202残基(Aruffo&Seed:PNAS 84,8573-8577)へ連結する。
3)scFv/CD8/ ζ−CD28融合キメラレセプター(図14)
scFv/CD8/ζ−CD28融合キメラレセプターは、ヒトCD28の細胞内成分に融合さ
れたヒトTCRζの細胞外、膜貫通および細胞内成分に連結されたヒトCD8ヒンジの
一部の形態における細胞外スペーサーに連結された、1本鎖Fvからなる。
1本鎖Fvは、リーダー配列、および(Gly4Ser)5リンカーを介して遺伝子操作ヒ
ト抗体の重鎖の可変成分に連結された遺伝子操作ヒト抗体の軽鎖の可変成分から
なる。細胞外スペーサーは、ヒトCD8(Zamoyskaら:Cell 43,153-163,1985)の
ヒンジ領域の98〜142残基からなる。これを、細胞外(一部)、膜貫通および細
胞内成分を含むヒトTCRζの6〜142残基(Weissmanら:PNAS 85,9709-9713,1988
.Moingeonら:Eur.J.Immunol.20,1741-1745,1990)へ連結する。
これを、ヒトCD28の細胞内成分を含む162〜202残基へ連結する。
4)scFv/G1/ ζキメラレセプター(図15)
scFv/G1/ζキメラレセプターは、ヒトTCRζの膜貫通および細胞内領域に連結
されたヒトIgG1ヒンジ、CH2、およびCH3を含む細胞外スペーサーに連結された1
本鎖Fvからなる。
1本鎖Fvは、リーダー配列、および(Gly4Ser)5リンカーを介して遺伝子操作ヒ
ト抗体の重鎖の可変成分に連結された遺伝子操作ヒト抗体の軽鎖の可変成分から
なる。細胞外スペーサーは、ヒトIgG1ヒンジの234〜243残基、CH2の244〜360残
基、およびCH3の361〜478残基(Kabatら、Sequences of proteins of immunologi
cal interest,1987)からなる。これを、細胞外(一部)、膜貫通、および細胞
内領域を含むヒトTCRζの6〜142残基(Welssmanら:PNAS 85,9709-9713,1988.
Moingeonら:Eur.J.Immunol.20,1741-1745,1990)へ連結する。
5)scFv/G1/ ζ−CD28融合キメラレセプター(図15)
scFv/G1/ζキメラレセプターは、ヒトCD28の細胞内領域に融合されたヒトζの
膜貫通および細胞内領域に連結されたヒトIgG1ヒンジ、CH2、およびCH3を含む細
胞外スペーサーに連結された1本鎖Fvからなる。
1本鎖Fvは、リーダー配列、および(Gly4Ser)5リンカーを介して遺伝子操作ヒ
ト抗体の重鎖の可変成分に連結された遺伝子操作ヒト抗体の軽鎖の可変成分から
なる。細胞外スペーサーは、ヒトIgG1ヒンジの234〜243残基、CH2の244〜360残
基、およびCH3の361〜478残基(Kabatら、Sequences of proteins of immunologi
cal interest,1987)からなる。これを、細胞外(一部)、膜貫通および細胞内
領域を含むヒトTCRζの6〜142残基(Weissmanら:PNAS 85,9709-9713,1988.Mo
ingeonら:Eur.J.Immunol.20,1741-1745,1990)へ連結する。
これを、ヒトCD28の細胞内成分を含む162〜202残基(Aruffo&Seed:PNAS 84,8
573-8577)へ連結する。6)scFv/h/CD28キメラレセプター(図15)
scFv/h/CD28キメラレセプターは、ヒトIgG1ヒンジおよびヒトCD28の膜貫通お
よび細胞内領域に連結されたヒトCD28の細胞外領域の一部からなる細胞外スペー
サーに連結された1本鎖Fvからなる。
1本鎖Fvは、リーダー配列、および(Gly4Ser)5リンカーを介して遺伝子操作ヒ
ト抗体の重鎖の可変成分に連結された遺伝子操作ヒト抗体の軽鎖の可変成分から
なる。細胞外スペーサーは、ヒトIgG1ヒンジの234〜243残基およびヒトCD28の11
8〜134残基からなる。
これを、膜貫通および細胞内領域を含むヒトCD28の135〜202残基(Aruffo&See
d:PNAS 84,8573-8577)へ連結する。
7)scFv/G1/CD28 キメラレセプター(図16)
scFv/G1/CD28キメラレセプターは、ヒトCD28の膜貫通および細胞内領域に連結
されたヒトIgG1ヒンジ、CH2およびCH3を含む細胞外スペーサーに連結された1本
鎖Fvからなる。
1本鎖Fvは、リーダー配列、および(Gly4Ser)5リンカーを介して遺伝子操作ヒ
ト抗体の重鎖の可変成分に連結された遺伝子操作ヒト抗体の軽鎖の可変成分から
なる。細胞外スペーサーは、ヒトIgG1ヒンジの234〜243残基、CH2の244〜360残
基、およびCH3の361〜478残基(Kabatら、Sequences of proteins of immunologi
cal interest,1987)からなる。これを、ヒトCD28の膜貫通および細胞内成分を
含む135〜202残基(AruffoおよびSeed:PNAS 84,8573-8577)へ残基L、D、P、
およびKを介して連結する。
8)scFv/G1/CD28 −ζ融合キメラレセプター(図16)
scFv/G1/ζキメラレセプターは、ヒトζの細胞内領域に融合されたヒトCD28の
膜貫通および細胞内領域に連結されたヒトIgG1ヒンジ、CH2およびCH3を含む細胞
外スペーサーに連結された1本鎖Fvからなる。
1本鎖Fvは、リーダー配列および(Gly4Ser)5リンカーを介して遺伝子操作ヒト
抗体の重鎖の可変成分に連結された遺伝子操作ヒト抗体の軽鎖の可変成分からな
る。細胞外スペーサーは、ヒトIgG1ヒンジの234〜243残基、CH2の244〜360残基
、およびCH3の361〜478残基(Kabatら、Sequences of proteins of immunologica
linterest,1987)からなる。これを、ヒトCD28の膜貫通および細胞内成分を含む
135〜202残基へ残基L、D、P、およびKを介して連結する。
これを、細胞内領域であるヒトTCRζの31〜142残基(Weissmanら:PNAS 85,97
09-9713,1988.Moingeonら:Eur.J.Immunol.20,1741-1745,1990)へ連結す
る。
9)scPv/G1/CD28- ζ-CD28融合キメラレセプター(図16)
scFv/G1/ζキメラレセプターは、CD28の細胞内領域に融合されたヒトζの細胞
内領域に融合されたヒトCD28の膜貫通および細胞内領域に連結されたヒトIgG1ヒ
ンジ、CH2およびCH3を含む細胞外スペーサーに連結された1本鎖Fvからなる。
1本鎖Fvは、リーダー配列、および(Gly4Ser)5リンカーを介して遺伝子操作ヒ
ト抗体の重鎖の可変成分に連結された遺伝子操作ヒト抗体の軽鎖の可変成分から
なる。細胞外スペーサーは、ヒトIgG1ヒンジの234〜243残基、CH2の244〜360残
基、およびCH3の361〜478残基(Kabatら、Sequences of proteins of immunologi
cal interest,1987)からなる。これを、ヒトCD28の膜貫通および細胞内成分を
含む135〜202残基へ残基L、D、P、およびKを介して連結する。
これを、細胞内領域であるヒトTCRζの31〜142残基(Weissmanら:PNAS 85,970
9-9713,1988.Moingeonら:Eur.J.Immunol.20,1741-1745,1990)へ連結す
る。
これを、ヒトCD28の細胞内成分を含む162〜202残基へ連結する。
10)scFv/h.28/ ζキメラレセプター(図17)
scFv/h/CD28キメラレセプターは、ヒトIgG1ヒンジ、ヒトTCRζの膜貫通、およ
び細胞内領域に連結されたヒトCD28の細胞外領域の一部および4アミノ酸残基を
含む細胞外スペーサーに連結された1本鎖Fvからなる。
1本鎖Fvは、リーダー配列、および(Gly4Ser)5リンカーを介して遺伝子操作ヒ
ト抗体の重鎖の可変成分に連結された遺伝子操作ヒト抗体の軽鎖の可変成分から
なる。細胞外スペーサーは、ヒトIgG1ヒンジの234〜243残基およびヒトCD28の11
8〜134残基からなる。これを、膜貫通および細胞内領域を含むヒトTCRζの10〜1
42残基(Weissmanら:PNAS 85,9709-9713,1988.Moingeonら:Eur.J.Immunol
.20,1741-1745,1990)へ残基L、D、P、およびKを介して連結する。
11)scFv/h.28/ ζ−CD28融合キメラレセプター(図17)
scFv/h/CD28キメラレセプターは、ヒトIgG1ヒンジの細胞外領域、ヒトCD28の
細胞内領域へ融合されたヒトζの膜貫通領域および細胞内領域に連結されたヒト
CD28の細胞外領域の一部および4アミノ酸残基からなる細胞外スペーサーに連結
された1本鎖Fvからなる。
1本鎖Fvは、リーダー配列、および(Gly4Ser)5リンカーを介して遺伝子操作ヒ
ト抗体の重鎖の可変成分に連結された遺伝子操作ヒト抗体の軽鎖の可変成分から
なる。細胞外スペーサーは、ヒトIgG1ヒンジの234〜243残基およびヒトCD28の11
8〜134残基からなる。これを、膜貫通および細胞内領域を含むヒトTCRζの10〜1
42残基(Weissmanら:PNAS 85,9709-9713,1988.Moingeonら:Eur.J.Immunol
.20,1741-1745,1990)へ残基L、D、P、およびKを介して連結する。
これを、ヒトCD28の細胞内成分を含む162〜202残基へ連結する。
12)scFv/h.28/CD28 −ζ融合キメラレセプター(図17)
scFv/h/CD28キメラレセプターは、ヒトIgG1ヒンジ、ヒトζの細胞内領域に融
合されたヒトCD28の膜貫通および細胞内領域に連結されたヒトCD28の細胞外領域
の一部および4アミノ酸残基からなる細胞外スペーサーに連結された1本鎖Fvか
らなる。
1本鎖Fvは、リーダー配列および(Gly4Ser)5リンカーを介して遺伝子操作ヒト
抗体の重鎖の可変成分に連結された遺伝子操作ヒト抗体の軽鎖の可変成分からな
る。細胞外スペーサーは、ヒトIgG1ヒンジの234〜243残基およびヒトCD28の118
〜134残基からなる。これを、膜貫通および細胞内成分を含むヒトCD28の135〜20
2残基へ残基L、D、P、およびKを介して連結する。
これを、細胞内領域であるヒトTCRζの31〜142残基(Weissmanら:PNAS 85,97
09-9713,1988.Moingeonら:Eur.J.Immunol.20,1741-1745,1990)へ連結す
る。
表1は、上記の教示および方法に従う類似の方法で作製され得る、多くの好ま
しい組換えキメラレセプターを示す。
表2は、キメラレセプター構築物の詳細および使用した細胞株の学名を示す。実施例2 ジャーカット細胞において発現されたhCTMO1-キメラレセプター構築物の分析
キメラレセプター構築物を、pBluescript SK+から発現ベクターpEE6hCMV.neお
よびpEE6hCMV.gpt(Bebbington(1991),Methods 2、136-145)へHindIIIからEcoR
I制限フラグメントにおいてサブクローニングした。hCTMO1/CD8/ζキメラレセプ
ター構築物を、pEE6hCMV.neへクローニングし、そしてhCTMO1/CD8/CD28およびhC
TMOIζ−CD28融合キメラレセプター構築物を、pEE6hCMVgpt.へクローニングした
。
プラスミドを直線化し、そしてBio-Rad Gene Pulserを用いてRigleyらの方法(
J.Immunol.(1995)154,1136-1145)を使用するエレクトロポレーションによ
り、ジャーカットE6.1細胞(ECACC)へトランスフェクトした。キメラレセプター
発現コロニーを、Neoベクターについては薬物G418(2mg/ml)を含む培地、または
Gtpベクターについてはミコフェノール酸を含む培地のいずれかにおいて記載(Ri
gleyら、前出)されるように選択した。約4週間後、コロニーが観察された。コ
ロニーを、1本鎖Fvの表面発現の分析によりスクリーニングした。抗体
抗イディオタイプ抗体は、hCTMO1で免疫されたウサギ由来の精製抗血清である
。抗Id抗体を、まずプロテインAセファロース上で精製し、ヒトIgGセファロー
スに対して吸着(absorb out)させ、そして最後にhCTMO1でアフィニティー精製し
た。
OKT3はヒトCD3ε(ATCC)の細胞外成分を認識する。これらの実験において使用し
た抗CD28は、ヒトCD28の細胞外成分(Cymbus Bioscience)に対して指向されるラ
ットIgG2bモノクローナル抗体(クローンYTH 913.12)であった。FITC標識ロバ抗
ウサギIgは、ウサギ重鎖および軽鎖(Jackson Research Laboratories)を認識す
る。scFv の表面発現の分析
約5×105細胞を、飽和濃度の抗イディオタイプ(10μg/ml)で染色し、次い
でフルオレセイン結合ロバ抗ウサギ抗体とともにインキュベートした。蛍光を、
FACScan細胞計(Beckton Dickinson)により分析した。抗Id刺激
1×106個のジャーカットトランスフェクタントを、予め飽和濃度の抗イディ
オタイプ抗体をコートした/コートしていない96ウェルプレート(Nunc)において
、非選択培地中で37℃/5%CO2にてインキュベートした。抗CD28およびOKT3の
さらなる刺激を、5μg/mLの最終濃度で溶液へ加えた。18〜20時間後に、細胞
を遠心分離し、そして上清をヒトIL-2(Quantikine kit,R&D Systems)について
分析した。抗原発現細胞刺激
1×106個のジャーカットトランスフェクタントを、96ウェルプレート(Falcon
)において1×105個のMCF-7細胞(P.E.M.抗原発現)とともに37℃/5%CO2にて
一晩インキュベートした。
抗CD28のさらなる刺激を、5μg/mLの最終濃度で溶液中に添加した。18〜20
時間後に、細胞を遠心分離し、そして上清をヒトIL-2(Quantikine kit,R&D Sy
stems)について分析した。結果
T細胞レセプターと抗CD3c抗体との架橋は、ジャーカットE6.1のようなヒトT
細胞株を刺激して、IL-2を含むサイトカインを産生させるために使用され得る。
IL-2の発現は、この細胞株におけるCD28細胞表面分子への抗体の手段による同時
刺激によりさらに増強され得る。従って、これは、T細胞活性化のための同時刺
激体である送達シグナルの能力についてキメラレセプターを評価する簡便なモデ
ル系を提供する。
1.抗CD28抗体での同時剌激による抗原または抗イディオタイプ抗体への応答に おけるhCTMO1 scFv-CD8-TCRζキメラレセプター(プラスミドpTB3)でトランス フェクトされたジャーカットE6.1細胞株によるIL2産生の増強。
細胞株TB 3.2、3.13、および3.24は、CTMO1hscFv/CD8/ζでトランスフェクト
されたジャーカットE6.1由来の安定な細胞株であった。図10は、抗CTMO1イディ
オタイプ抗体単独でまたは抗CD28と組合わせて刺激した場合の、この細胞株によ
るIL2産生を示す。各場合において、抗CD28を用いる同時刺激により、抗CTMO1抗
体単独での刺激と比較してIL2産生の2倍よりも大きい刺激を生じた。この細胞
株と抗CD28単独とのインキュベーションにより、IL2の刺激を生じなかった。
図11は、抗原を発現する腫瘍細胞で刺激された場合の上記の細胞株の一つ(TB3
.13)によるIL2の産生を示す。図10におけるように、これは、抗CD28抗体を用い
る同時刺激を伴っても伴わなくても示され、そしてキメラレセプターの刺激が抗
原により媒介される場合に同時刺激がIL-2産生を増強し得ることを示す。
2.細胞外scfv成分との相互作用においてCD28刺激に類似した応答を生じるよう に設計されたキメラレセプターの構築および試験。
CD28分子を介する同時刺激が、T細胞トランスフェクタントの、腫瘍関連抗原
への応答の増強を生じ得ることが確立されたので、CD28膜貫通および細胞質成分
を組み込んだキメラレセプターが構築された。このhCTMO1/CD8/CD28キメラレセ
プター(pHMF332)(HGT1)を、ジャーカットE6.1細胞へトランスフェクトし、安定
な細胞株を生じた。これらの細胞株のうちの2つ(HGT 1.2および1.4)を、図12に
示すような種々の組合せの抗体刺激の存在下でインキュベートし、そして抗イデ
ィオタイプ抗体を使用してキメラレセプターを刺激した(実験手順については材
料および方法を参照のこと)。
示した細胞株の抗CD3c抗体とのインキュベーションにより、低レベルのIL2産
生が生じた。この刺激は、抗CD28抗体との同時刺激により増強され得る(図12aお
よび12b、5番目の棒グラフ)。
予想されたように抗CD28単独とのインキュベーションにより、IL2産生を生じ
なかった。
抗イディオタイプ抗体単独(キメラCD28レセプターを刺激する)との同様のイ
ンキュベーションにより、IL2産生は生じなかった。しかし、抗CD3と抗CD28との
組合せ刺激との類似により、抗CD3および抗イディオタイプとのインキュベーシ
ョンにより、CD3刺激単独を越える増強されたIL2産生が生じた。これは、キメラ
レセプターが、細胞外scFvの刺激を介して応答して、CD3c媒介活性を同時刺激し
得る細胞内シグナルを生じるように構築され得ることを実証する。
3.同じエフェクター細胞における主要および補助刺激の両方の供給
キメラレセプターと同定されたリガンドまたは抗原との相互作用を介するエフ
ェクター細胞の主要(例えば、TCRζ媒介)および同時(例えば、CD28媒介)刺
激活性化を提供するために、2つの異なるシグナリング成分を組み込んだ融合レ
セプターを構築した。このキメラレセプターhCTMO1/CD8/TCRζ−CD28(pHMF334)
をジャーカットE6.1細胞にトランスフェクトし、そして安定な株を選択した。こ
れらの株の一つ(HGT2.4)を、種々の抗体の組合せとインキュベートし、そしてIL
2産生を測定した(図13を参照のこと)。
抗CD3および抗CD28は、独立して、および組み合わせて、他のトランスフェク
ト細胞株にみられるIL2産生の同様の関連刺激を生じた。しかし、構築物HGT2を
4用いると抗イディオタイプ抗体単独では、抗CD3と抗CD28との組合せで達成さ
れ4たよりも大きいIL2産生レベルが生じた。さらに、単独の抗相互作用により
達成4された刺激は、抗CD3、抗CD28またはそれらの組合せを用いるさらなる同
時刺激によって増強され得なかった。実施例3 ジャーカット細胞において発現される単一遺伝子hP67.6-キメラレセプター構築 物の分析
異なる抗体scFvについてhCTMO1融合レセプターを用いて得た結果を確証するた
め、およびさらなる融合レセプターを評価するために、hP67.6 scFvに基づく多
くの異なるキメラをジャーカット細胞に導入した。
キメラレセプター構築物 hP67.6/G1/ζ(HGT16)、hP67.6/G1/ζ-CD28(HGT17)、
hP67.6/G1/CD28-ζ(HGT21)、hP67.6/G1/CD28-ζ-CD28 HGT26)、hP67.6/h.28/ζ-
CD28(HGT20)、およびhP67.6/h.28/CD28-ζ(HGT22)キメラレセプター構築物を、
実施例2に記載のように、pBluescriptSK+から発現ベクターpEE6hCMV.neにサブ
クローニングした。発現プラスミドを、ジャーカット E6.1にトランスフェクト
し、そしてその細胞表面でキメラレセプターを発現する永久細胞株を、hCTMO1抗
イディオタイプについて記載されるように調製した精製ウサギ抗p67.6イディオ
タイプ抗血清を用いる以外は上記(実施例2)のように同定した。あるいは、細
胞を、FITC(10μg/ml)に結合した精製組換えCD33細胞外ドメインを用いて染
色し、そしてサイトメーター(cytometer)で直接的に分析した。
ウエスタンブロット分析を、各構築物の代表的なクローンについて行い、予測
したサイズのキメラレセプターが発現されることを確証した。約107の細胞を溶
解緩衝液(1%NP40、150mM NaCl、10mM NaF、0.4mM EDTA、1mMバナジン酸Na、1m
g/ml Pefabloc、10μg/ml ペプスタチン、10μg/ml ロイペプチン、20μg/ml
アプロチニン)中で溶解し、そしてサンプルを、β-メルカプトエタノールでの
シスチン残基の還元を伴うかまたは伴わないSDS-PAGEに供した。ウエスタンブロ
ットを、標準的な技術に従って、ウサギ抗P67.6イディオタイプ、続いて西洋ワ
サビ-ペルオキシダーゼ(HRP)結合ロバ抗ウサギIgまたはHRP結合ウサギ抗ヒトF
c抗血清を用いてプローブした。
還元したサンプルおよび還元していないサンプルにおけるキメラレセプターの
見かけの分子量の比較は、細胞株HGT16.1のζ鎖キメラおよひ有GT17.39の融合レ
セプターが、ジスルフィド結合したホモダイマーとして存在することを示した。
HGT14.1のCD28キメラは、約50%がジスルフィド結合したホモダイマーとして存
在し、そして約50%の分子がジスルフィド結合していない。HGT20、HGT21、およ
びHGT22細胞株の融合レセプターの場合は、少なくとも50%の分子が、ジスルフ
ィド結合をしている。
各構築物の独立したトランスフェクタントクローンのパネルを、CD33を発現す
る細胞(HL60細胞)、またはCD33陰性である細胞(例えば、ジャーカット E6.1
)に応答するIL-2産生について分析した。各構築物を発現する多くのクローンを
分析することは重要である。なぜなら、個々のクローンは、キメラレセプターの
発現レベルが実質的に変動するからである。さらに、同様なレベルのレセプタ
ーを発現するクローンでさえ、IL-2を産生する異なる能力を示す。各トランスフ
ェクタントを、同数の標的細胞(例えば、96ウェルプレートの1ウェルあたり105
個の各細胞タイプの細胞)と混合し、そして約20時間同時培養した。次いで、
上清中のIL-2濃度を、Quantikine ヒトIL-2 ELISA(R&D Systems)を用いて測定
した。
構築物HGT16を含む細胞株は、HL60細胞に応答して約200pg/mlまでのレベルのI
L-2を産生し、そしてCD33陰性細胞で刺激した場合、検出可能なIL-2を産生しな
い。融合レセプターHGT17、20、21、22、および26を発現する細胞株もまた、CD3
3陽性標的細胞に特異的に応答してIL-2を産生する。これは、ζ鎖のシグナリン
グ能力が融合タンパク質中でインタクトであることを示す。実際に、細胞表面上
に比較できるレベルで融合レセプターを発現する細胞は、HGT16細胞株よりもHL6
0細胞に応答して、平均してより多くのIL-2を産生する(50%以上〜7倍以上)
。これは、一次シグナルおよび同時刺激性シグナルの両方を提供する能力と一致
する。
CD28シグナリングドメインの機能は、レセプターリガンド結合に応答するCD28
細胞内ドメインへの下流シグナリング成分の動員についてアッセイすることによ
り確証され得る。CD28刺激に応答して、PI3キナーゼの調節(p85)サブユニット
が、CD28細胞内ドメインの配列YMXM(1文字アミノ酸表記)のリン酸化ITAMモチ
ーフと会合することは、十分に考証されている(例えば、Steinら、1994 Mol.Ce
ll.Biol.14: 3392-3402)。CD28はまた、活性化の際、チロシンキナーゼITKと
特異的に会合する(Augustら、1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91: 9347-9351)
。
p85とレセプターキメラとの会合を、以下のように、レセプターの免疫沈降お
よびウエスタンブロッティングによる結合したp85タンパク質の検出により分析
する。約5×107の細胞をPBSで1回洗浄し、10μg/mlのウサギ抗P67.6イディオ
タイプ抗体を含む0.5mlのPBS中で37℃にて0から10分間まで種々の時間で活性化
する。次いで、細胞を氷冷PBSで2回洗浄し、そして上記のように1mlの溶解緩
衝液中で溶解する。溶解物を、Eppendorfマイクロ遠心分離機において15000rpm
で10分間遠心分離し、そして上清を100μlのプロテインA-セファロースビーズ(
Pharmacia)と室温で30分間免疫沈降させた(この免疫沈降の手順はまた、陰
性コントロールとするために抗イディオタイプ抗体で刺激されなかった細胞由来
の抗体定常領域を含むキメラレセプターを免疫沈降させるために役立つ)。次い
で、ビーズを新鮮な溶解緩衝液で3回洗浄し、50μlのSDSローディング緩衝液中
に再懸濁し、そしてSDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングに供する。ブロッ
トを、標準的な技術に従って、マウス抗p85モノクローナル抗体およびHRP結合ウ
サギ抗マウスIgを用いてプローブする。
これは、p85が、融合レセプターと会合し得るが、細胞株HGT16.1のζ鎖キメラ
とは会合し得ないことを示した。従って、p85はCD28と特異的に会合しζとは会
合しないこと、およびCD28シグナリングは融合キメラにおいて保持されることが
確証された。
ITKとCD28細胞内成分との会合を、公開された方法(Augustら、1994 Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 91: 9347-9351)を用いて検出する。実施例4 同一細胞における2つのhP67.6-キメラレセプターの発現。
同一細胞においてζキメラレセプターおよびCD28同時刺激性レセプターキメラ
の両方を発現させるために、CD28レセプターキメラを発現する、安定にトランス
フェクトされたジャーカット細胞株に、hP67.6/G1/ζキメラレセプターをコード
する組換えアデノウイルスを感染させた。
hP67.6/h.28/CD28構築物を、実施例2に記載のように、pEE6hCMV.gptにサブク
ローニングし、そしてジャーカット E6.1細胞にトランスフェクトした。細胞株H
GT14.1は、この構築物を発現するジャーカットトランスフェクタントである。hP
67.6/G1/CD28構築物を、実施例2のように、pEE6hCMV.neにクローニングし、そ
してこの構築物を発現するジャーカットクローンHGT23.11およびHGT23.16を単離
した。トランスフェクトされた細胞の表面上のCD28キメラの発現レベル(実施例
3に記載のようにFITC-CD33を用いてFAC分析により測定した)を図18に示す。
これらのCD28-キメラ細胞株のそれぞれにおいて均一な量のζ鎖キメラhP67.6/
G1/ζを一過性に発現させるために、ζキメラを発現する組換えアデノウイルス
ベクターを以下のように構築した。pHMF342(実施例1および表2)由来のhP67.
6/G1/ζコード配列を、Not1-Kpn1フラグメントとして切り出し、そしてKpn1-Bam
H1アダプターオリゴヌクレオチドの挿入後に、アデノウイルス5型移入ベクター
pAL119(G.Wilkinson(Department of medicine、University of Wales、Cardiff
)により提供された;未公開)のNot1部位とBamH1部位との間に挿入して、pAL119
-342を作製した。このプラスミドにおいて、キメラレセプターコード配列は、hC
MV-MIEプロモーターの調節領域およびポリアデニル化シグナルの制御下で発現さ
れる(WilkinsonおよびAkrigg 1992 Nucl.Acids Res.20:2233-2239)。
hCMV-MIEプロモーターを含む適切な代わりのアデノウイルス移入ベクターには
、pCA3およびpCA4が挙げられる(Hittら、1995 Methods in Molecular Genetics
、K.W.Adolph編 Academic Press,Orlando.)。プロモーターを含まない代わり
のアデノウイルス移入ベクター、例えば、pAC(GerardおよびMeidell 1995 DNA
Cloning:a practical approach(第2版)4巻 GloverおよびHames編、IRL Press
)を、使用し得る。この場合、多くの他の異種プロモーター(例えば、RSV-LTR
プロモーターまたはT細胞特異的プロモーター)の一つを、移入ベクターへの挿
入前に、キメラレセプターコード配列の上流に導入し得る。ポリアデニル化シグ
ナル(例えば、SV40ウイルス由来)およびイントロン(例えば、hCMV-MIE遺伝子
由来(Bebbington(1991)、Methods 2,136-145))のような、さらなるRNAプロ
セッシングシグナルもまた望ましい。
約5μgのpAl119-342を、5μgのpJM17(Microbix Biosystems Inc.、McGro
ryら 1988 Virology 163: 614-617)と共に、アデノウイルス組換え体の構築の
ための標準的な手順(Lowensteinら 1996 Protocols for gene transfer in Neu
roscience、P.R.LowensteinおよびL.W.Enquist編 Wiley and Sons)に従って、
ヒト胎児腎臓細胞株293(ATCC CRL 1573)に、リン酸カルシウム媒介トランスフ
ェクションにより同時トランスフェクトした。これは、hCMV-MIE遺伝子調節領域
の制御下にキメラレセプターcDNAを含む組換えウイルスRAd160を生じた。RAd160
の大量の調製物を、1010pfu/mlより大きな力価で調製し(Lowensteinら、同書)
、少量のアリコートで-70℃にて保存した。
CD28キメラレセプターのコード配列を含む組換えアデノウイルスを、pAL119ま
たは別のアデノウイルス移入ベクターへの所望のコード配列の挿入後、同様の方
法で調製する。
RAd160を、400pfu/細胞までの感染多重度(MOI)で、2μg/mlのDEAE-Dextra
nと共に、ジャーカット E6.1細胞またはCD28レセプターキメラを発現するトラン
スフェクタントに加え、そしてウイルスの存在下で106細胞/mlの細胞濃度にて24
時間インキュベートした。細胞のサンプルに、同様の方法で、関係のないβガラ
クトシダーゼタンパク質を発現する組換えアデノウイルスRAd35(Wilkinsonおよ
びAkrigg 1992 Nucl.Acids Res.20:2233-2239)を感染させ、陰性コントロール
とした。次いで、感染細胞を新鮮な増殖培地で1回洗浄し、さらに6日間培養し
て拡大させ、標的細胞に応答するIL-2産生についてアッセイした。その結果を図
19に示す。RAd160を感染させたジャーカット細胞は、10μg/mlの抗CD28抗体15E
8(Caltag)を用いて同時刺激されない限り、HL-60細胞刺激に応答して本質的に検
出不可能なレベル(10pg/ml未満)のIL-2を産生し、同時刺激されると、ヒトCD3
3を発現しない細胞株(マウスSP2/0細胞株)には応答しないがHL60細胞に特異的
に応答して低レベルのIL-2が導かれる。対照的に、CD28キメラレセプターを発現
するRAd160感染HGT14.1細胞は、抗CD28抗体の非存在下においてさえ、HL60標的
細胞に特異的に応答して顕著なレベルのIL-2を産生する。これは、CD28キメラレ
セプターhP67.6/h.28/CD28は、ζキメラへの不可欠な同時刺激に寄与し得ること
が示される。代わりのCD28キメラレセプター(hP67.6/G1/CD28、23.11、および2
3.16)を発現する細胞株は、14.1と比較して著しく減少したレベルのIL-2産生を
示す。実際に、最も高レベルのこのCD28キメラを発現する細胞株(23.16)は、
検出可能なIL-2を全く産生しない。CD28シグナリング経路は、この細胞株におい
てインタクトであることが示された。なぜなら、23.16において抗CD3抗体を用い
るCD3を通じての刺激は、非常に高レベルのIL-2を生じるからである(結果は示
さない)。従って、hP67/G1/CD28キメラを発現する細胞株におけるシグナリング
の欠損は、ζ鎖シグナリングの妨害に起因するようである。原因となるメカニズ
ムは、ζおよびCD28キメラレセプターにおける同一の細胞外ドメインの使用に関
連するらしい。これはこの2つのレセプターのヘテロダイマー形成を可能にし、
そしてこれはζ鎖シグナリングを妨害するようである。この仮説は、高レベルの
CD28キメラを発現する23.16は、非常に低レベルのCD28キメラを発現する23.11よ
り、ζ鎖シグナリングのより大きな妨害を示すという事実により支持される(図
18)。
この実験は、同一のscFv領域を使用して同一細胞における2つのキメラレセプ
タ一分子を刺激することが可能であることを示す。ここで、一方のキメラレセプ
ター分子は抗原に応答して一次刺激を提供し、そして他方のレセプター分子は、
同時刺激性シグナルを提供する。これは、もし、2つのレセプターが、例えば、
その2つのレセプター上の異なるダイマー形成ドメインを使用することにより、
ヘテロダイマー形成から保護されているならば、抗原を発現する標的細胞に特異
的に応答して、効率的なIL-2産生を導く。さらなる対のダイマー形成ドメインが
共存し得ることが予想される。例えば、scFv/h.28/ζキメラレセプター(実施例
1;図17)は、一次シグナルを提供し得、そしてscFv/G1/CD28レセプター(実施
例1;図16)は、同時刺激性シグナルを提供する。実施例5 抗レセプター抗体を用いたさらなる同時刺激性細胞表面レセプターの同定。
hP67.6 scFv/G1/ζキメラレセプターを発現する5×105個のHGT16.1細胞(実
施例3)を、同数のHL60細胞と共に、ヒトT細胞表面マーカーに対する種々のマ
ウスモノクローナル抗体の存在下で16時間インキュベートした。二価抗体を10μ
g/mlで含ませ、ζ鎖キメラを同時刺激するその能力について試験した。この実
験において使用した抗体は:抗CD2 RPA2.10(Pharmingen)、抗CD3 OKT3(ATCC)、
抗CD4 OKT4(ATCC)、抗CD5 UCHT2(Pharmingen)、抗CD28 15E8(Caltag)、およびコ
ントロール抗体MOPC21(ATCC)であった。インキュベーションの終りに上清中に蓄
積したIL-2を、Quantikine IL-2 ELISA(R&D Systems)により測定した。
結果は、抗CD2、抗CD5、および抗CD28が、HL60標的細胞に応答してHGT16.1細
胞におけるIL-2産生を同時刺激することを示す。従って、CD2、CD5、およびCD28
は、ζ鎖キメラシグナリングと両立し得る同時刺激性レセプターであると確証さ
れる。このように設計した実験より、他の細胞表面分子の同時刺激活性を測定す
ることが可能である。次いで、細胞内ドメインを、実施例1に記載のようにキメ
ラレセプターに含ませ得、そして実施例2、3、および4に記載のように評価し
得る。実施例6 キメラレセプターの初代ヒトCTLへの導入
細胞傷害性T細胞機能の同時刺激についてのアッセイを確立するために、ζ鎖
キメラを、組換えアデノウイルスベクターを用いて初代ヒトT細胞に導入した。
末梢血単核細胞(PBMC)を、製造者の使用説明書に従ってFicoll-Hypaque(Phar
macia)での遠心分離を用いて、健康なボランティアから単離し、そして175-cm2
組織培養フラスコ中で10%FCSを含むRPMI-1640培地において培養した。非接着性
細胞を24時間後に新しい組織培養フラスコに移し、そしてフィトヘマグルチニン
(PHA)を最終濃度2μg/mlまで、そしてヒト組換えIL-2を50ng/mlで加えた。6
日後、CD4陽性細胞を、磁性Dynabeads(Becton-Dickinson)上に固定された抗CD
4抗体を用いて除去して、少なくとも95%がCD8単一陽性である細胞集団(CTL細
胞)を残した。細胞を、遠心分離により洗浄し、そして新鮮な培地+10%FCS中
に106細胞/mlで再懸濁した。
組換えアデノウイルスRAd160(hP67.6/G1/ζキメラレセプターを発現;実施例
4)またはコントロールウイルスRAd35を、400pfu/細胞までの感染多重度(MOI
)で、2μg/mlのDEAE-Dextranと共に細胞に加え、そして24時間インキュベー
トした。次いで、細胞のサンプルを、PBS中の1%グルタルアルデヒドで固定し
、そして感染速度を、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトシド(X-g
al;Promega、製造者の使用説明書に従う)を用いて、βガラクトシダーゼ活性
についてRAd35感染細胞を染色することにより測定した。この方法により、感染
頻度は少なくとも80%であると決定された。感染細胞を、50ng/mlのヒトIL-2を
含む培地において、さらに6日間培養して拡大させた。いくつかの実験において
、2mMの酪酸ナトリウムを感染CTL細胞に加えて、hCMV-MIEプロモーターからの
発現を誘導した。
IL-2および2mMのブチレート中で6日間インキュベートした組換えアデノウイ
ルス感染CD8陽性細胞において、CD33発現腫瘍細胞株HL60に対する細胞溶解活性
を、標準的な6時間の51Cr遊離アッセイを用いて検出した。2×107のHL60標的
細
胞を、25MBqの51Cr(CJS4 Amersham)と共に、T細胞増殖培地において37℃で45
分間インキュベートすることにより標識した。洗浄後、1.5×104の標識されたHL
60細胞を、96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに、RAd感染CD8陽性エ
フェクター細胞の存在下、100〜0.1の範囲の比(エフェクター細胞:標的細胞)
で移す。細胞を、T細胞増殖培地中で6時間インキュベートし、その後、プレー
トを遠心分離し、そして計数のために上清を除去した。細胞溶解を、標的細胞の
界面活性剤処理により放出された51Crの量と比較した、培地に放出された51Crの
4量として表した。例証された実験(図20)において、特異的な溶解は、RAd35
を感染させたCD8陽性細胞ではなくRAd 160感染エフェクター細胞により媒介され
た。特異的な溶解の程度は、E:T比が増加すると共に増加する。
このアッセイは、抗レセプター抗体、同時刺激性サイトカイン、または同時刺
激性キメラレセプターを用いて細胞溶解機能に対する同時刺激の効果を測定する
ために有用である。種々の長さの時間IL2を欠乏させた細胞もまた、同時刺激活
性を評価するために設計されたアッセイの感度を増大させるために使用され得る
。CD28キメラレセプターを、組換えアデノウイルスとRAd160との同時感染により
導入し得る。あるいは、ζおよびCD28シグナルの両方の伝達ドメインを含む融合
レセプターを、単一の組換えアデノウイルスを用いて導入し得る。このアッセイ
においてスクリーニングされ得た抗レセプター抗体は、抗CD2および抗CD5を含む
(実施例5を参照)。実施例7 マクロファージおよび単核細胞における同時刺激活性の分析
ヒト単核細胞を、以下のように末梢血から単離した。PBMCを、上記のように単
離し、そして接着性細胞を、プラスティック組織培養フラスコに24時間定着させ
ることにより入手し、その後、新鮮な培地で十分に洗浄した。
初代マクロファージを、Argysの方法(Argys 1967、J.Immunol.99:744-750
)に従う生理食塩水中の5mlの3%チオグリコレート(Sigma T-9032)のi.p.注
射または3mlのミネラルオイル(ヘビーホワイトオイル(heavy white oil);Sig
ma 400-5)のi.p.注射の5日後に、Wistarラットの腹腔から単離した。腹腔洗
浄を、20mlのRPMI 1640培地+10%FCSおよび3.15%クエン酸ナトリウムを用いて
行った。腹腔洗浄液中の60%以上の細胞は、FITC結合マウス抗ラットマクロファ
ージ抗体ED2(Serotec)を用いたフローサイトメトリーおよび形態学的特徴によ
り規定される単核貪食細胞であった。接着性細胞を、細胞をRPMI 1640培地+10
%FCSにおいてプラスティックフラスコまたは6ウェルプレートに塗布し、そし
て2日間培養することにより富化した。次いで、非接着性細胞を、新鮮な培地を
用いて十分に洗浄することにより除去した。あるいは、マクロファージを、Perc
oll密度遠心分離(LawsonおよびStevenson 1983 Br.J.Cancer 48:227-237)に
より精製した。
単核細胞およびマクロファージを、48時間培養して維持し、そしてこれに組換
えアデノウイルスを200pfu/細胞までのMOIで16時間、2μg/mlのDEAE-Dextran
の存在下で感染させ、その後、ウイルスを新鮮な培地を用いて洗浄することによ
り除去した。80%までのヒト末梢血単核細胞およびラット腹腔マクロファージは
、RAd35を感染させた細胞のX-gal染色を用いて決定した場合、この手順を用いて
感染可能であった。より高濃度のウイルスの使用は、感染細胞の割合を増大させ
たが、細胞生存可能性の顕著な減少を導いた。
組換えアデノウイルスRAd160を使用して、ラットまたはマウスの単核細胞−マ
クロファージ系統の細胞に、ヒトCD33特異的一次刺激を提供し得る。ヒト単核細
胞はCD33抗原を発現するので、ヒト単核細胞貪食細胞におけるキメラレセプター
機能の分析のために、実施例1のように構築されそして組換えアデノウイルスに
挿入された代わりの結合特異性(例えば、hCTMO1scFv含有キメラレセプター)を
使用することがより適切であり得る。さらに、キメラレセプターのζ鎖配列を、
FcRIIIγ鎖(Parkら 1993,J.Clin.Invest.92:2073-2079)の膜貫通および細胞内
ドメインで置換し得る。
RAd160を100pfu/細胞のMOIで感染させたラット腹腔マクロファージは、FITC-C
D33で染色しそしてFACScanフローサイトメーターにより分析することによって測
定した場合、感染48時間後にその表面に高レベルのキメラレセプターを発現した
。
scFvにより認識される特異的な抗原または抗原発現細胞を用いた刺激に対する
、適切なキメラレセプターを発現する単核細胞およびマクロファージの応答を、
標
準的な51Cr遊離アッセイ(実施例6)で測定する。あるいは、貪食作用アッセイ
および細胞性塞栓のアッセイ(LawsonおよびStevenson 1983 Br.J.Cancer 48:22
7-237)またはサイトカインの放出についてのアッセイ(例えば、ヒトTNF ELISA
(R&D Systems)またはラットTNF ELISA(Biosource))を行う。
同時刺激性シグナルを提供する適切なレセプター細胞内ドメインの同定を、特
異的な抗原の供給源、ならびに実施例5に記載のように単核細胞およびマクロフ
ァージ上に存在する個々の細胞表面レセプターに特異的な架橋抗体または天然リ
ガンドと共に、キメラレセプターを発現するマクロファージをインキュベートす
ることにより達成し得る。適切なレセプターには、IL-2レセプター、CSF-1レセ
プター、INF-γレセプター、GM-CSFレセプター、およびTNFレセプターが挙げら
れる。ヒトの単核細胞/マクロファージに使用し得る天然リガンドには、組換え
ヒトIL-2、ヒトCSF-1(M-CSF)、ヒトIFNγ、ヒトGM-CSF、およびヒトTNFα(全て
Genzyme)が挙げられる。ラットまたはマウスマクロファージに使用され得るリ
ガンドには、組換えラットまたはヒトIL-2、ヒトCSF-1(M-CSF)、マウスIFNγ、
マウスGM-CSF、およびマウスTNFα(Genzyme)が挙げられる。選択したレセプタ
ーを架橋し刺激する種特異的抗体は、標準的な技術を使用して惹起され得るか、
または市販の抗体をスクリーニングすることにより同定され得る。
CD33に対するマクロファージの応答を同時刺激する抗体または天然リガンドは
、その細胞内ドメインまたは関連するシグナリング分子(例えば、レセプター関
連チロシンキナーゼ)が、実施例1に記載のような同時刺激性ドメインおよび一
次シグナリングドメインの両方を含むキメラ同時刺激性レセプターまたは融合レ
セプターを産生するために使用され得る、候補のレセプターを同定する。これら
のキメラレセプターにおいて使用され得る細胞内成分は、以下を含む。GM-CSFレ
セプターβ鎖の細胞内ドメインを、ジスルフィド結合したホモダイマーレセプタ
ーの一部として、またはα鎖由来の細胞内成分と組み合わせて使用され得る(Mu
toら 1996,J.Exp.Med.183: 1911-1916)。IFNγレセプターのα鎖およびβ鎖
の細胞内ドメインを、IL-2レセプターの細胞内ドメイン(特に、β鎖およびγ鎖
)を使用し得るように、使用し得る(Bachら、1996,Mol.Cell.Biol.16: 3214-
3221)。1以上の細胞内チロシンキナーゼ成分、例えば、jak1、jak2、およびja
k3
キナーゼ、またはCSF-1レセプターチロシンキナーゼの細胞内ドメインを使用し
得る(CarlbergおよびRohrschneider 1994 Mol.Biol.Cell5: 81-95)。これらの
チロシンキナーゼを使用する場合、それらを含むレセプターは、好ましくは、そ
れらが、scFv成分と標的抗原との結合の際にオリゴマー形成するモノマーとして
細胞表面上に提示されるするように、例えば、チロシンキナーゼ成分とカップリ
ングし、CD8ヒンジ細胞外成分とカップリングし、CD28膜貫通成分(実施例1を
参照)とカップリングしたscFvを用いて、構築される。実施例8 免疫系の他の細胞における同時刺激活性の分析
さらなる免疫細胞タイプ(例えば、CD4陽性T細胞、B細胞、NK細胞、好塩基球
、好中球、造血幹細胞)を、ヒト末梢血、マウスまたはラットの血液または腹腔
、あるいは他の供給源から、公開された手順により単離する(Current Protocol
s in Immunology Coliganら編 John Wiley and Sons)。種々の免疫細胞タイプ
の分化した機能を保持する確立された細胞株(例えば、ヒトNK様細胞株YT2C2(R
ogerら 1996 Cellular Immunol.168: 24-32)もまた使用され得る。一次刺激を
送達し得るキメラレセプター(例えば、上記のhP67.6/G1/ζキメラ)を、単離し
た免疫細胞タイプに、例えば、組換えアデノウイルスRAd160を用いる感染により
導入し、そして細胞表面レセプターの架橋抗体または天然リガンドを使用して、
実施例7に記載のように同時刺激性シグナルを提供し得る細胞表面分子を同定す
る。
次いで、安定な同時刺激性機能を提供する適切な細胞質成分を含むキメラレセ
プターを、実施例1に記載するように構築する。選択した細胞タイプにおけるキ
メラレセプターの機能を、組換えアデノウイルスベクターを使用して分析し得る
。 表2 キメラレセプター構築物および細胞株の命名法 G1は、IgGヒンジCH2CH3スペーサーである。
hは、IgGヒンジ成分+CD28細胞外ドメインの一部のスペーサーである。
h.28は、IgGヒンジ成分プラスCD28細胞外ドメインの一部ならびにアミノ酸残基L
、D、P、およびKのスペーサーである。
発現プラスミドpTB3およびpTB5、pHMF334、351、355、378および364は、TCR zet
a膜貫通ドメインを含む。
発現プラスミドpHMF332、353、376、373、380、および371は、CD28膜貫通ドメイ
ンを含む。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61P 17/06 A61K 31/00 617E
19/02 619A
25/00 625
29/00 625B
31/00 629
35/00 629A
37/08 631
37/06 635
43/00 637E
A61K 31/70 637D
47/48 643
48/00 643C
C12N 5/10 31/70
// C07K 16/18 47/48
48/00
C07K 16/18
C12N 5/00 B
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,S
Z,UG),UA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD
,RU,TJ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ
,BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,
CU,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,G
E,HU,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR
,KZ,KC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,
MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,P
L,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK
,TJ,TM,TR,TT,UA,UG,US,UZ,
VN
(72)発明者 ローソン,アラステアー デイビッド グ
リフィス
イギリス国 エスオー24 0エヌエックス
ハンツ,アレスフォード,チェリトン,
ホルデン ファーム(番地なし)
(72)発明者 ワイアー,アンドリュー ニール チャー
ルズ
イギリス国 アールジー10 9ディーディ
ー バークシャー,トウィフォード,ウィ
ロー ドライブ 7
(72)発明者 フィニー,ヘレン マーガレット
イギリス国 エスエル6 4ディーキュー
バークシャー,メイデンヘッド,クレア
ロード 64
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.第1の細胞と、第2の標的細胞に関連する分子との間の1つの型の細胞外相 互作用の結果として、細胞を活性化する方法であって、該第1の細胞が2つ以上 の異なる細胞質シグナリング成分を含む1つ以上の組換えキメラレセプターをコ ードするDNAを包含するDNA送達系を提供される点で特徴づけられ、ここで、該細 胞質成分は、天然には連結されず、そして少なくとも1つが膜貫通ポリペプチド に由来する、方法。 2.前記細胞質シグナリング成分が、協同で作用し得る、請求項1に記載の方法 。 3.前記DNAが、シグナルペプチド、1つ以上の前記キメラレセプターの結合お よび/または膜貫通成分をさらにコードし、ここで該結合成分が、標的細胞上の 細胞表面分子を認識し得る、請求項1または請求項2に記載の方法。 4.前記シグナルペプチド、膜貫通および細胞質シグナリング成分、および結合 成分の全体または一部分が、単一なDNAコード配列によってコードされる、請求 項3に記載の方法。 5.各細胞質シグナリング成分が、別々のDNAコード配列によってコードされ、 各DNA配列が、シグナルペプチド、膜貫通成分、および結合成分の全体または一 部分をさらにコードする、請求項3に記載の方法。 6.前記DNAが、前記結合成分の一部分をコードし、そしてさらに別のDNAコード 配列が、該結合成分の残りをコードする、請求項4または請求項5に記載の方法 。 7.1つのDNA配列によってコードされる前記結合成分が、任意の他のDNA配列に よってコードされる結合成分と同じ型の細胞外結合事象に関係し得る、請求項5 または請求項6に記載の方法。 8.前記各結合成分が、前記標的細胞に会合する同じ分子に結合する、請求項7 に記載の方法。 9.前記各結合成分が同一である、請求項8に記載の方法。 10.一つ以上の前記組換えキメラレセプターが、ウイルスまたは標的細胞上の 細胞表面分子を認識し得る、請求項1から請求項9のいずれかに記載の方法。 11.キャリアとともにDNAを含むDNA送達系であって、該DNAは、1つの型の細 胞外相互作用をし得、そして、天然には結合しない2つ以上の異なる細胞質シグ ナリング成分を含む組換えキメラレセプターをコードし、ここで、少なくとも1 つの該細胞質成分が、膜貫通ポリペプチドに由来する、DNA送達系。 12.キャリアとともに会合するDNAを含むDNA送達系であって、該DNAは、それ ぞれが同じ1つの型の細胞外相互作用をし得る2つ以上の組換えキメラレセプタ ーをコードし、ここで、該各レセプターは天然には結合しない1つ以上の異なる 細胞質シグナリング成分を含み、そして、少なくとも1つの該細胞質成分が、膜 貫通ポリペプチドに由来する、DNA送達系。 13.請求項11に記載のDNA送達系であって、該DNAが、リーディングフレーム 中に、以下: i)シグナルペプチド成分; ii)標的細胞の細胞表面分子を認識し得る結合成分; iii)膜貫通成分; iv)天然には結合しない2つ以上の異なる細胞質シグナリング成分、ここで、 少なくとも1つの該細胞質成分は、膜貫通ポリペプチドに由来する;および 必要に応じて v)該i)〜iv)成分の任意の2つ以上を結合する1つ以上のスペーサー領域、 をコードする、DNA送達系。 14.請求項11に記載のDNA送達系であって、 該DNAが、1)リーディングフレーム中に以下をコードする第1のDNA: i)シグナルペプチド成分; ii)結合成分の部分; iii)膜貫通成分; iv)天然には結合しない2つ以上の細胞質シグナリング成分、ここで少なくと も1つの該細胞質成分は、膜貫通ポリペプチドに由来する;および 必要に応じて v)該i)〜iv)成分の任意の2つ以上を結合する1つ以上のスペーサー領域; ならびに 2)リーディングフレーム中にシグナルペプチド成分および該第1のDNAによっ てコードされる結合成分ii)のさらなる一部をコードする別の第2のDNA を含み、その結果、該結合成分の部分は、一緒に、標的細胞上の細胞表面分子を 認識し得る、DNA送達系。 15.請求項12に記載のDNA送達系であって、該DNAが、リーディングフレーム 中に以下をそれぞれコードする第1のおよび別の第2のDNA: i)シグナルペプチド成分; ii)標的細胞上の細胞表面分子を認識し得る結合成分; iii)膜貫通成分; iv)天然に結合しない1つ以上の異なる細胞質シグナリング成分、ここで、少 なくとも1つの該細胞質成分は膜貫通ポリペプチドに由来する;および 必要に応じて v)該第1のDNAが、該第2のDNAによってコードされない少なくとも1つのシ グナリング成分iv)をコードする場合、該i)〜iv)成分の任意の2つ以上を結 合する1つ以上のスペーサー領域 を含む、DNA送達系。 16.請求項12に記載のDNA送達系であって、 該DNAが、1)リーディングフレーム中に以下をそれぞれコードする第1のおよ び別の第2のDNA: i)シグナルペプチド成分; ii)結合成分の一部分; iii)膜貫通成分; iv)天然には結合しない1つ以上の異なる細胞質シグナリング成分、ここで、 少なくとも1つの該細胞質成分が、膜貫通ポリペプチドに由来する;および 必要に応じて v)該第1のDNAが、該第2のDNAによってコードされない少なくとも1つのシ グナリング成分をコードする場合、該i)〜iv)成分の任意の2つ以上を結合す る1つ以上のスペーサー領域; ならびに2)それぞれが、リーディングフレーム中にシグナルペプチド成分なら びにそれぞれ該第1のおよび第2のDNAによってコードされる結合成分ii)のさ らなる一部をコードする別の第3のおよび第4のDNA を含み、その結果、該第1のおよび第3のDNAによって提供される結合成分部分 、および第2のおよび第4のDNAによって提供される結合成分部分が、標的細胞 上の細胞表面分子をそれぞれ認識し得る、 DNA送達系。 17.前記各シグナルペプチド成分が、免疫グロブリンシグナル配列である、請 求項13〜16に記載のDNA送達系。 18.前記第1のDNAによってコードされる結合成分が、前記第2のDNAによって コードされる結合成分と同一である、請求項15〜17に記載のDNA送達系。 19.前記結合成分が、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項1 3〜18に記載のDNA送達系。 20.前記抗体またはそのフラグメントが、遺伝子操作されたヒト抗体またはそ の抗原結合フラグメントである、請求項19に記載のDNA送達系。 21.前記結合成分が、1本鎖Fvフラグメントである、請求項18〜20に記載 のDNA送達系。 22.前記結合成分が1本鎖Fab'フラグメントである、請求項18〜20に記載 のDNA送達系。 23.前記膜貫通成分が、T細胞レセプターのα、βまたはζ鎖、CD28、CD8、C D4、サイトカインレセプター、またはコロニー剌激因子レセプターの全体または 一部分に由来する、請求項13〜22のいずれかに記載のDNA送達系。 24.前記膜貫通成分が、CD28の全体または一部分に由来する、請求項23に記 載のDNA送達系。 25.前記細胞質シグナリング成分が、協同で作用し得る、請求項11〜24の いずれかに記載のDNA送達系。 26.前記細胞質シグナリング成分が、T細胞レセプターのζ鎖、η鎖またはε 鎖、CD28、Fcレセプターのγ鎖、サイトカインレセプター、コロニー剌激因子レ セプター、チロシンキナーゼまたは接着分子、B29、MB-1、CD3δ、CD3γ、CD5、 またはCD2の細胞質ドメインの全体または一部に由来する、請求項13〜25の いずれかに記載のDNA送達系。 27.前記細胞質シグナリング成分が、細胞質成分を含むITAMである、請求項2 6に記載のDNA送達系。 28.前記細胞質シグナリング成分が、CD28および/またはT細胞レセプターの ζ鎖の全体または一部分に由来する、請求項26または27に記載のDNA送達系 。 29.前記細胞質シグナリング成分が、互いに関して任意の方向に存在する、請 求項11〜28のいずれかに記載のDNA送達系。 30.前記成分i)〜iv)をコードするDNAが、前記結合成分ii)および前記膜貫 通成分iii)に結合する1つ以上のスペーサー領域をさらにコードする、請求項 13〜29のいずれかに記載のDNA送達系。 31.2つ以上の異なるスペーサー領域が、前記結合成分ii)および前記膜貫通 成分iii)を結合し、両領域が1つのDNA配列によってコードされるか、または、 第1および第2のDNA配列が存在する場合、一方の領域は、該第1のDNAによって コードされ、および他方の異なる領域は、該第2のDNAによってコードされるか のいずれかである、 請求項30に記載のDNA送達系。 32.前記スペーサー領域が選択されて、1つ以上の遊離のチオール基を提供す る、請求項30または請求項31に記載のDNA送達系。 33.前記スペーサー領域が、CD8、CD4またはCD28の細胞外領域の全体または一 部分に由来する、請求項30〜32に記載のDNA送達系。 34.前記スペーサー領域が、抗体定常領域の全体または一部分である、請求項 30または請求項32に記載のDNA送達系。 35.前記スペーサー領域が、CD28の細胞外領域の全体または一部分に結合する 抗体ヒンジ領域の全体または一部分に由来する、請求項30〜32に記載のDNA 送達系。 36.前記キャリアが、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請 求項11〜35のいずれかに記載のDNA送達系。 37.前記非ウイルスベクターが、リポソームベクターである、請求項36に記 載のDNA送達系。 38.前記キャリアが、標的化非ウイルスベクターである、請求項37に記載の DNA送達系。 39.前記標的化ベクターが、抗体標的化リポソームである、請求項38に記載 のDNA送達系。 40.前記標的化ベクターが、抗体標的化縮合DNAである、請求項38に記載のD NA送達系。 41.前記標的化ベクターが、抗体標的化プロタミンまたはポリリジン縮合DNA である、請求項40に記載のDNA送達系。 42.前記標的化ベクターが、抗体標的化裸のDNAである、請求項38に記載のD NA送達系。 43.前記抗体が、抗体全て、またはその抗原結合フラグメントである、請求項 39〜42に記載のDNA送達系。 44.前記抗体が、遺伝子操作されたヒト抗体、またはその抗体結合フラグメン トである、請求項43に記載のDNA送達系。 45.請求項1〜44のいずれかに記載のDNA送達系でトランスフェクトされた 、 エフェクター細胞。 46.リンパ球、樹状細胞、B細胞、造血幹細胞、マクロファージ、単核細胞ま たはNK細胞である、請求項45に記載のエフェクター細胞。 47.細胞傷害性Tリンパ球である、請求項46に記載のエフェクター細胞。 48.感染症疾患、炎症性疾患、ガン、アレルギー性/アトピー性疾患、先天性 疾患、皮膚性疾患、神経性疾患、移植および代謝/特発性疾患の処置における使 用のための、請求項11〜47のいずれかに記載のDNA送達系。 49.慢性関節リウマチ、変形性関節症、炎症性腸疾患、喘息、湿疹、嚢胞性線 維症、鎌型赤血球貧血症、乾癬、多発性硬化症、器官または組織移植拒絶反応、 移植片対宿主疾患、または糖尿病の処置における使用のための、請求項48に記 載のDNA送達系。 50.一つ以上の形成剤とともに、請求項11〜44のいずれかに記載のDNA送 達系を包含する、薬学的組成物。 51.前記形成剤が、懸濁剤、保存剤、安定剤、および/または分散剤である、 請求項50に記載のDNA送達系を包含する薬学的組成物。 52.請求項11〜44のいずれかに記載の送達系における使用のための、組換 えキメラレセプターをコードするDNA。
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