JP2023509952A - 新規４－１ｂｂｌ三量体含有抗原結合分子 - Google Patents

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Abstract

Figure 2023509952000001
本発明は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子、及びがんの治療におけるそれらの使用に関する。
【選択図】図２Ａ－２Ｃ

Description

本発明は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインを含む４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子、及びがんの治療におけるそれらの使用に関する。本発明はさらに、これらの分子を製造する方法、及びこれらを使用する方法に関する。
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、Ｔ細胞によって活性化されることによって発現される誘導性分子として最初に同定された（Ｋｗｏｎ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ，１９８９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６，１９６３－１９６７）。その後の研究は、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、好中球、肥満細胞、樹状細胞（ＤＣ）、並びに内皮細胞及び平滑筋細胞等の非造血起源の細胞を含む多くの他の免疫細胞も４－１ＢＢを発現することを実証した（Ｖｉｎａｙ ａｎｄ Ｋｗｏｎ，２０１１，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８，２８１－２８４）。種々の細胞型において４－１ＢＢの発現は大部分が誘発性であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体のトリガリング、並びに炎症促進性サイトカインの共刺激分子又は受容体を通して誘発されるシグナル伝達等の、様々な刺激性シグナルにより駆動される（Ｄｉｅｈｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６８，３７５５－３７６２；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３，２７５８－２７６７）。
４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ又はＣＤ１３７Ｌ）は１９９３年に同定された（Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３，２６３１－２６４１）。４－１ＢＢＬの発現は、Ｂ細胞、ＤＣ及びマクロファージ等のプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で制限されることが示されている。４－１ＢＢＬの誘導性発現は、αβ及びγδＴ細胞サブセットの両方を含むＴ細胞、並びに内皮細胞に特徴的である（Ｓｈａｏ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｚ，２０１１，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ８９，２１－２９）。
４－１ＢＢ受容体を介した共刺激（例えば、４－１ＢＢＬライゲーションによる）は、Ｔ細胞内の複数のシグナル伝達カスケード（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットの両方）を活性化し、Ｔ細胞活性化を強力に増強する（Ｂａｒｔｋｏｗｉａｋ ａｎｄ Ｃｕｒｒａｎ，２０１５）。ＴＣＲトリガリングと組み合わせて、アゴニスト性４－１ＢＢ特異性抗体は、Ｔ細胞の増殖を増強し、リンホカイン分泌を刺激し、活性化誘導細胞死に対するＴリンパ球の感受性を低下させる（Ｓｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２４４，１９７－２１７）。この機序は、がん免疫療法における最初の概念実証としてさらに進歩した。前臨床モデルでは、担がんマウスにおける４－１ＢＢに対するアゴニスト抗体の投与は、強力な抗腫瘍効果をもたらした（Ｍｅｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ Ｍｅｄ３，６８２－６８５）。その後、証拠の蓄積により、４－１ＢＢは通常、他の免疫調節化合物、化学療法剤、腫瘍特異的ワクチン接種又は放射線療法と組み合わせて投与した場合にのみ抗腫瘍剤としての効力を示すことが示された（Ｂａｒｔｋｏｗｉａｋ ａｎｄ Ｃｕｒｒａｎ，２０１５，Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ５，１１７）。
ＴＮＦＲスーパーファミリーのシグナル伝達は、受容体と係合するために三量体化リガンドの架橋を必要とし、野生型Ｆｃ結合を必要とする４－１ＢＢアゴニスト抗体も同様である（Ｌｉ ａｎｄ Ｒａｖｅｔｃｈ，２０１１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３，１０３０－１０３４）。しかしながら、機能的に活性なＦｃドメインを有する４－１ＢＢ特異的アゴニスト抗体の全身投与は、マウスにおいて機能的Ｆｃ受容体の非存在下で減少又は有意に改善される肝毒性と関連するＣＤ８＋Ｔ細胞の流入をもたらした（Ｄｕｂｒｏｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５９，１２２３－１２３３）。診療所では、Ｆｃコンピテント４－１ＢＢアゴニスト性Ａｂ（ＢＭＳ－６６３５１３）（ＮＣＴ００６１２６６４）がグレード４の肝炎を引き起こし、試験の終了につながった（Ｓｉｍｅｏｎｅ ａｎｄ Ａｓｃｉｅｒｔｏ，２０１２，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ ９，２４１－２４７）。したがって、効果的で安全な４－１ＢＢアゴニストが必要とされている。
プログラム死リガンド１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １：ＰＤ－Ｌ１）は、慢性感染、妊娠、組織同種移植片、自己免疫疾患、及びがんにおける免疫系応答の抑制に関係があるとされているタンパク質である。ＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び単球の表面上に発現される、プログラム死１（ＰＤ－１）として知られる抑制性受容体に結合することにより免疫応答を調節する。ＰＤ－Ｌ１は、別の受容体、Ｂ７－１との相互作用によっても、Ｔ細胞機能を負に制御する。ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１／Ｂ７－１複合体の形成は、Ｔ細胞受容体のシグナル伝達を負に制御し、その後、Ｔ細胞活性化の下方制御、及び抗腫瘍免疫活性の抑制をもたらす。現在、いくつかのＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１抗体が様々な固形がん及びリンパ腫の治療に臨床使用されており、ＰＤ－１経路の遮断は、広範囲の腫瘍型にわたって目覚ましい奏功率を誘発することが示されている。一方、市販されているＰＤ－Ｌ１抗体であるアテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）は、尿路上皮がん、非小細胞肺がん、メルケル細胞がん等の異なる種類のがんに対して承認されている。ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１を標的とする免疫治療薬は、がんにおいて実質的な臨床的進歩を遂げているが、かなりの割合の患者が治療に対して無反応のままとなっている。したがって、腫瘍環境における免疫抵抗性を克服するために、ＰＤ－Ｌ１と共刺激標的を組み合わせた新規薬物候補が依然として必要とされている。
本発明の新規抗原結合分子は、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合ドメインと、共刺激４－１ＢＢＬ三量体を形成することができ、薬学的に有用であるのに十分に安定な部位とを組み合わせたものである。本発明の抗原結合分子は、三量体であり、したがって生物学的に活性なヒト４－１ＢＢリガンドを提供するが、三量体化４－１ＢＢＬエクトドメインの１つは、分子の他の２つの４－１ＢＢＬエクトドメインとは別のポリペプチド上に位置する。抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合ドメインによって標的にされる本発明の抗原結合分子は、腫瘍部位に対する活性が増加しており、天然のヒト４－１ＢＢリガンドを含み、したがって、従来の４－１ＢＢアゴニスト抗体又はより人工的な融合タンパク質と比較して安全性の問題が少ないはずである。
一態様では、本発明は、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結された第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
を含む、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
特定の態様では、本発明は、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、ここで４－１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
さらなる態様では、本発明は、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結された第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号５、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
を含む、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
一態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より詳しくは、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。特定の態様では、本発明は、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進するノブ・イントゥ・ホール修飾を含む、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。具体的な態様では、本発明は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含む、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
別の態様では、本発明は、（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への、特にＦｃγ受容体への結合を減少させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、本明細書において前に定義された４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子に関する。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４及び２３５（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリング）及び／又は３２９（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリング）の位置にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。
一態様では、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能なＦａｂ分子であるものである。別の態様では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能なクロスオーバーＦａｂ分子又はｓｃＦＶ分子である。
一態様では、本発明は、本明細書で前述したように、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な１つのＦａｂドメインを含み、これはＰＤ－Ｌ１に対する一価の結合を含むことを意味する。
さらなる態様では、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＰＤ－Ｌ１）、並びに、（ｉｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＰＤ－Ｌ１）を含む。
さらなる態様では、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＰＤ－Ｌ１）、及び配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＰＤ－Ｌ１）を含む。特定の一態様では、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、配列番号１９のアミノ酸を含む重鎖可変領域（ＶＨＰＤ－Ｌ１）、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＰＤ－Ｌ１）を含む。
さらなる態様では、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで抗原結合分子は、
ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能なＦａｂ分子を含む第１の重鎖及び第１の軽鎖、
定常ドメインと、第１のペプチドリンカーによって互いに接続されており、そのＣ末端において第２のペプチドリンカーによって第２の重鎖又は軽鎖に融合されている４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片と、を含む第２の重鎖、及び
定常ドメインと、そのＣ末端において第３のペプチドリンカーによって第２の軽鎖又は重鎖にそれぞれ融合されている４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片と、を含む第２の軽鎖
を含む。
より具体的には、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、第１のペプチドリンカーによって互いに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のペプチドが、そのＣ末端において第２のペプチドリンカーによって重鎖の一部であるＣＬドメインに融合されており、前記４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドが、そのＣ末端において第３のペプチドリンカーによって軽鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合されている、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。
特定の態様では、本発明は、ペプチドリンカーが（Ｇ４Ｓ）２、すなわち配列番号３６のペプチドリンカーである、上記で定義された４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子に関する。一態様では、全ての場合におけるペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。
さらに、４－１ＢＢＬに隣接するＣＬドメインにおいて、位置１２３のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がアルギニン（Ｒ）によって置換されており、位置１２４のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がリジン（Ｋ）によって置換されており、４－１ＢＢＬに隣接するＣＨ１ドメインにおいて、位置１４７のアミノ酸（ＥＵナンバリング）及び位置２１３のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。
別の態様では、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５及び配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６及び配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む。
１つの特定の態様では、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。さらに特定の態様では、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、配列番号２９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。
本発明の別の態様によれば、本明細書において前に定義された４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードする単離された核酸分子が提供される。本発明はさらに、本発明の単離された核酸を含むベクター、特に発現ベクター、及び本発明の単離された核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施態様では、宿主細胞は、真核生物細胞、特に哺乳動物細胞である。
別の態様では、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を製造するための方法であって、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養すること、及び４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を単離することを含む方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって製造された４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を包含する。
本発明はさらに、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子及び少なくとも１つの薬学的に許容される添加物を含む薬学的組成物を提供する。別の態様では、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子及び少なくとも１つの薬学的に許容される添加物を含み、追加の治療剤、例えば化学療法剤及び／又はがん免疫療法における使用のための他の薬剤をさらに含む薬学的組成物が提供される。さらなる態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体をさらに含む薬学的組成物が提供される。
医薬としての使用のための、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子、又は本発明の薬学的組成物もまた、本発明に包含される。一態様では、疾患の治療を必要とする個体における疾患の治療における使用のための、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物が提供される。特定の実施態様では、がんの治療における使用のための、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子、又は本発明の薬学的組成物が提供される。別の態様では、細胞傷害性Ｔ細胞活性を上方制御又は延長における使用のための、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物が提供される。別の態様では、がんの治療における使用のための本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物が提供され、ここで、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、別の治療剤、例えばがん免疫療法における使用のための化学療法剤及び／若しくは他の薬剤、又はＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用される。一態様では、他の治療剤は、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子と同時に、その前に、又はその後に投与される。
本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の、それを必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造のための、特にがんの治療のための医薬の製造のための使用、並びに個体における疾患を治療する方法であって、本明細書に開示される４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を薬学的に許容される形態で含む組成物の治療的有効量を前記個体に投与することを含む方法も提供される。特定の態様では、疾患はがんである。さらに、がんの治療のための医薬の製造のための本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の使用が提供され、ここで、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、別の治療剤と組み合わせて使用される。さらに、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の有効量を対象に投与することを含む、がんを有する個体を治療するための方法が提供される。がんを有する個体において細胞傷害性Ｔ細胞活性を上方制御又は延長する方法であって、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む方法も提供される。上記の実施態様のいずれかにおいて、個体は、好ましくは、哺乳動物、特にヒトである。
図１は、一価ＰＤ－Ｌ１標的化スプリット三量体４－１ＢＢリガンドＦｃ融合抗原結合分子のアセンブリのための構成要素を示す。図１Ａは、変異Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ（荷電バリアント）を有するヒトＩｇＧ１－ＣＬドメインにＣ末端で融合された二量体４－１ＢＢリガンドを示し、図１Ｂは、変異Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ（荷電バリアント）を有するヒトＩｇＧ１－ＣＨ１ドメインにそのＣ末端で融合された単量体４－１ＢＢリガンドを示す。 図２Ａは、荷電残基を有するＣＨ－ＣＬ交差を含む一価ＰＤ－Ｌ１標的化スプリット三量体４－１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の構造を概略的に示す。濃い黒色の点は、ノブ・イントゥ・ホール修飾を表す。＊は、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおけるアミノ酸修飾（いわゆる荷電バリアント）を表す。この分子はＰＤ－Ｌ１－４－１ＢＢＬと命名される。図２Ｂは、さらなる２＋１フォーマットと呼ばれる一価ＰＤ－Ｌ１及び二価４－１ＢＢ（クローン２０Ｈ４．９）標的化分子の構造を概略的に示す。濃い黒色の点は、ノブ・イントゥ・ホール修飾を表す。この分子は４－１ＢＢｘＰＤ－Ｌ１ ２＋１と命名される。図２Ｃは、さらなる１＋１フォーマットと呼ばれる一価ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢ（クローン２０Ｈ４．９）標的化分子の構造を概略的に示す。濃い黒色の点は、ノブ・イントゥ・ホール修飾を表す。したがって、この分子は４－１ＢＢｘＰＤ－Ｌ１ １＋１と命名される。 図３Ａは、本発明のＰＤ－Ｌ１標的化スプリット三量体４－１ＢＢリガンド含有抗原結合分子の同時結合のためのＳＰＲ実験のセットアップを示している。ＰＤ－Ｌ１－４－１ＢＢＬ（被分析物１）の固定化されたヒト４－１ＢＢ及びヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ（被分析物２）への同時結合を図３Ｂに示す。 図４Ａ及び４Ｂは、２つの独立した実験で測定された、ＰＤ－Ｌ１標的化４－１ＢＢスプリット三量体リガンドＦｃ融合抗原結合分子又は４－１ＢＢｘＰＤ－Ｌ１二特異性抗体の親細胞株ＭＫＮ４５（図４Ａ）又はＰＤ－Ｌ１発現細胞株ＭＫＮ４５－ＰＤ－Ｌ１（図４Ｂ）への結合を示している。ＰＤ－Ｌ１－４－１ＢＢＬ又は対照分子の濃度は、ＰＥ結合二次検出抗体の蛍光強度の幾何平均に対してブロットされている。ブランク対照（例えば、一次はなく、二次のみの検出抗体）のベースライン値を差し引くことにより、全ての値をベースライン補正する。ＰＤ－Ｌ１－４－１ＢＢＬ又は４－１ＢＢ－ＰＤＬ１二重特異性抗体のみがヒトＰＤ－Ｌ１発現ＭＫＮ４５－ｈｕＰＤ－Ｌ１細胞（図４Ｂ）に効率的に結合するが、親細胞株ＭＫＮ４５（図４Ａ）には結合しない。 図５Ａ、５Ｂ、及び５Ｃは、４－１ＢＢ発現レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２におけるＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ発現活性を示す。ＰＤ－Ｌ１－４－１ＢＢＬの機能性を対照に対して試験するために、分子を、ＭＫＮ４５又はヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＫＮ４５細胞株の非存在下又は存在下で、レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦｋＢ－ｌｕｃ２と１：５の比率で６時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、溶解し、検出バッファー中でルシフェリンとともにインキュベートした。ルシフェラーゼ触媒によるルシフェリンの酸化は、放出された光の単位として発光を介して検出された（ｙ軸）。ＰＤ－Ｌ１－４－１ＢＢＬ分子又はその対照の濃度を、６時間のインキュベーションとルシフェラーゼ検出溶液の添加後に測定された放出光（ＲＬＵ）の単位に対してブロットする。ブランク対照（例えば、抗体非添加）のベースライン値を差し引くことにより、全ての値をベースライン補正する。 図５Ｄ及び５Ｅは、４－１ＢＢ発現レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２におけるＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ発現活性を示す。ＰＤ－Ｌ１－４－１ＢＢＬの機能性を対照に対して試験するために、分子を、ＭＫＮ４５又はヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＫＮ４５細胞株の非存在下又は存在下で、レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦｋＢ－ｌｕｃ２と１：５の比率で６時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、溶解し、検出バッファー中でルシフェリンとともにインキュベートした。ルシフェラーゼ触媒によるルシフェリンの酸化は、放出された光の単位として発光を介して検出された（ｙ軸）。ＰＤ－Ｌ１－４－１ＢＢＬ分子又はその対照の濃度を、６時間のインキュベーションとルシフェラーゼ検出溶液の添加後に測定された放出光（ＲＬＵ）の単位に対してブロットする。ブランク対照（例えば、抗体非添加）のベースライン値を差し引くことにより、全ての値をベースライン補正する。
定義
他の意味であると定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は、複数形も含み、その逆に、複数形で使用される用語は、単数形も含む。
本明細書で使用する場合、「抗原結合分子」という用語は、最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片及び足場抗原結合タンパク質である。
「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部又は全てに特異的に結合し、且つ相補性である領域を含む抗原結合分子の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、抗原の特定の部分のみに結合してもよく、この部分は、エピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、例えば、１つ以上の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。
本明細書で使用する場合、「ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメイン」又は「ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な部分」という用語は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合ドメインは、ＰＤ－Ｌ１を介したシグナル伝達を阻害することができる。特定の態様では、抗原結合ドメインは、それが付着している実体（例えば、４－１ＢＢＬ三量体）を標的部位、例えば、ＰＤ－Ｌ１を有する特定の種類の腫瘍細胞に向けることができる。ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、本明細書でさらに定義される抗体及びその断片を含む。抗体又はその断片に関連して、「ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な部分」という用語は、抗原の一部又は全てに特異的に結合し、且つ相補性である領域を含む分子の一部を意味する。特異的抗原結合が可能な部分は例えば、１つ以上の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。具体的には、特異的抗原結合が可能な部分は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
本明細書の「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造を包含し、限定されないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体及び多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含む。
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、実質的に均質な抗体集団、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、一般に少量で存在し得るバリアント抗体（例えば自然発生の突然変異を含むか、又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生するもの）を除いて、同一であり、且つ／又は同じエピトープに結合する集団から得られる抗体を意味する。様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
「単一特異性」抗体という用語は、本明細書で使用する場合、同じ抗原の同じエピトープにそれぞれ結合する１つ以上の結合部位を有する抗体を意味する。「二重特異性」という用語は、抗原結合分子が、少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原結合部位を含み、それぞれが異なる抗原決定基に対して特異的である。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基（特に、２つの別個の細胞で発現する２つの抗原決定基）に同時に結合することができる。
「価数」という用語は、本出願で使用する場合、抗原結合分子内の特定数の結合部位の存在を意味する。したがって、「一価」、「二価」、「四価」及び「六価」という用語は、それぞれ、抗原結合分子中の１個の結合部位、２個の結合部位、４個の結合部位及び６個の結合部位の存在を意味する。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指す。「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧクラス抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖で構成される。Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの重鎖は、可変領域（ＶＨ）（可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）（重鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの軽鎖は、可変領域（ＶＬ）（可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）、続いて軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）（軽鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに分けられてもよく、このいくつかは、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）等のサブタイプにさらに分けられてもよい。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスＦａｂ断片；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の総説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説としては、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。また、国際公開第９３／１６１８５号及び米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。ダイアボディは、二価又は二重特異性であってもよい２つの抗原結合部位を含む抗体断片であり、例えば、ＥＰ４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）に説明されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，マサチューセッツ州ウォルサム；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号Ｂ１を参照されたい）。抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質分解による消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含め、種々の技術によって作られてもよい。
インタクトな抗体のパパイン消化により、２つの同一の抗原結合断片が得られ、これは、それぞれ重鎖及び軽鎖可変ドメインと、さらに、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる。したがって、本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ断片」という用語は、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片と、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含め、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）と、Ｆｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。
「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの可能な鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されており、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）とで構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、クロスＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、クロスＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に次の順序：（ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、（ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、（ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、又は（ｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有し；且つ前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２～５０アミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化されている。さらに、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングによれば、可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、さらに安定化されるであろう。
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ－ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に次の順序：（ａ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１及び（ｂ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有し；ＶＨとＶＬは一緒になって、ある抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、且つ前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。これに加え、これらのｘ－ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングによれば、可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、さらに安定化されるであろう。
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドを用いて連結された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可撓性のためにグリシンが豊富であり、溶解度のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端とを、又はその逆で接続することができる。このタンパク質は、定常領域が除去され、リンカーが導入されているが、元々の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６－９６）に記載されている。これに加え、抗体断片は、ＶＨドメインに特徴的な（すなわち、ＶＬドメインと共に集合させることが可能な）、又はＶＬドメインに特徴的な（すなわち、機能的抗原結合部位にＶＨドメインと共に集合させることが可能な）単鎖ポリペプチドを含み、それによって、完全長抗体の抗原結合特性を与える。
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」は、競合アッセイにおいて、参照分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする抗原結合分子を指し、逆に、参照分子は、競合アッセイにおいて、抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする。
本明細書で使用する場合、「抗原決定基」という用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分－抗原複合体を形成する、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続伸長部又は異なる領域の非連続アミノ酸から構成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に認めることができる。特に断らない限り、本明細書において抗原として有用なタンパク質は、哺乳動物、例えば、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含め、任意の脊椎動物源由来の任意の天然形態のタンパク質であってもよい。特定の実施態様では、抗原は、ヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、この用語は「完全長」の未処理のタンパク質と、細胞内でのプロセシングにより得られる任意の形態のタンパク質とを包含する。この用語はまた、天然に存在するタンパク質バリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントを包含する。
「ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な」という用語は、抗原結合分子がＰＤ－Ｌ１を標的化するうえで診断剤及び／又は治療剤として有用であるように十分な親和性でＰＤ－Ｌ１に結合することができる抗原結合分子を指す。抗原結合分子としては、限定されるものではないが、抗体、多重特異性抗体、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、及び融合タンパク質が挙げられる。一態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子の無関係な非ＰＤ－Ｌ１タンパク質への結合の程度は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合、抗原結合分子のＰＤ－Ｌ１への結合の約１０％未満である。特に、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合分子は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下又は０．００１ｎＭ以下（例えば１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子は、異なる種に由来するＰＤ－Ｌ１に結合する。特に、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子は、ヒト及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１に結合する。
「特異的結合」とは、結合が抗原について選択的であり、望ましくない又は非特異的な相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合分子が特定の抗原に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は当技術分野で知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））によって測定することができる。一実施態様では、抗原結合分子の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合分子の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する分子は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）である。
「親和性」又は「結合親和性」は、分子の単一の結合部位（例えば、抗体）と、その結合対（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に指定されない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘのその結合対Ｙに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができ、これは解離速度定数と会合速度定数（それぞれｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比が同じである限り、同等の親和性が異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当技術分野で一般的な方法によって測定することができる。親和性を測定する特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「標的細胞抗原」とは、本明細書で使用する場合、標的細胞、例えばＴ細胞又はＢ細胞、がん細胞又は腫瘍間質細胞等の腫瘍内の細胞の表面に提示された抗原決定基を意味する。ある特定の態様では、標的細胞抗原は、がん細胞の表面上の抗原である。一態様では、標的細胞抗原はＰＤ－Ｌ１である。
ＣＤ２７４又はＢ７－Ｈ１としても知られている「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する任意の天然ＰＤ－Ｌ１（特に、「ヒトＰＤ－Ｌ１」）を指す。完全ヒトＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ９ＮＺＱ７（配列番号３７）に示されている。「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」、又は「ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体」、又は「ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体」、又は「アゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１」という用語は、１．０×１０－８ｍｏｌ／Ｌ以下のＫＤ値、一態様においては、１．０×１０－９ｍｏｌ／Ｌ以下のＫＤ値の結合親和性で、ヒトＰＤ－Ｌ１抗原に特異的に結合する抗体を意味する。結合親和性は、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標），ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）などの標準的な結合アッセイを用いて測定される。
本明細書において使用される「Ｔ細胞抗原」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面に提示される抗原決定基を指す。
本明細書において使用される「Ｔ細胞活性化治療剤」は、対象にＴ細胞活性化を誘導することのできる治療剤、特に対象にＴ細胞活性化を誘導するために設計された治療剤を指す。Ｔ細胞活性化治療薬の例には、ＣＤ３などの活性化Ｔ細胞抗原、及びＣＥＡ又は葉酸受容体などの標的細胞抗原に特異的に結合する二重特異性抗体が含まれる。
本明細書において使用される「活性化Ｔ細胞抗原」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球によって発現される抗原決定基を指し、抗原結合分子との相互作用時にＴ細胞活性化を誘導又は増強することができる。具体的には、抗原結合分子のＴ細胞活性化抗原との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達のカスケードをトリガーすることによりＴ細胞活性化を誘導することができる。例示的な活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３である。
特に断らない限り、「ＣＤ３」という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源に由来する任意の天然ＣＤ３を指す。この用語は「完全長」の未処理のＣＤ３と、細胞内でのプロセシングにより得られる任意の形態のＣＤ３とを包含する。この用語は、ＣＤ３の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。一実施態様では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３、特にヒトＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３ε）である。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｐ０７７６６（バージョン１４４）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０００７２４．１に示されている。配列番号５９も参照されたい。カニクイザル［Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］ＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ９５ＬＩ５に示されている。配列番号６０も参照のこと。
「可変ドメイン」又は「可変領域」という用語は、抗原に対する抗原結合分子の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、概して、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために十分であり得る。
本明細書で使用する場合、「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列内で超可変可能であり、抗原結合特異性を決定する、抗原結合可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のそれぞれを意味する。一般的に、抗原結合ドメインは、６個のＣＤＲを含み、ＶＨに３個（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、ＶＬに３個（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）含む。本明細書における例示的なＣＤＲとしては、
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）及び９６－１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）及び９５－１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）及び９３－１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））が挙げられる。
特に指示がない限り、ＣＤＲは、上記Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上記Ｃｈｏｔｈｉａ、上記ＭｃＣａｌｌｕｍ、又は、任意の他の、科学的に受け入れられた命名法に従い決定することができることを理解するであろう。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．はまた、任意の抗体に適用可能な可変領域配列のナンバリングシステムも定義した。当業者は、任意の可変領域配列に対し、配列自体を超える実験データに頼ることなく、「Ｋａｂａｔナンバリング」のこのシステムを明確に割り当てることができる。本明細書で使用する場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，”Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）に記載されるナンバリングシステムを指す。特に明記されない限り、抗体可変領域中の特定のアミノ酸残基の位置のナンバリングに関する言及は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従う。
本明細書で使用する場合、抗原結合分子（例えば、抗体）に関連して「親和性成熟」という用語は、参照抗原結合分子に由来し、例えば突然変異により、参照抗体と同じ抗原に、好ましくは同じエピトープに結合し、抗原に対して、参照抗原結合分子よりも高い親和性を有する抗原結合分子を指す。親和性成熟は、一般に、抗原結合分子の１つ以上のＣＤＲ中の１つ以上のアミノ酸残基の修飾を含む。典型的には、親和性成熟抗原結合分子は、最初の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）中において以下の配列で現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
本明細書の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでいてもよく、又はアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に対して、配列が同一である。
「キメラ」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来する一方、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「ヒト由来の定常領域」又は「ヒト定常領域」という用語は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、若しくはＩｇＧ４のヒト抗体の定常重鎖領域、及び／又は定常軽鎖カッパ若しくはラムダ領域を示す。かかる定常領域は当技術分野で公知であり、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されている（また、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．，ａｎｄ Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（２０００）２１４－２１８；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２（１９７５）２７８５－２７８８も参照されたい）。本明細書で特に明記されない限り、定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ９１－３２４２に記載されるような、ＥＵナンバリングシステム（ＫａｂａｔのＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体に対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体に対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。ある抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合という観点で、本発明に係る特性を作り出すために、定常領域が、元々の抗体の定常領域からさらに修飾されるか、又は変更されているものである。
「ヒト」抗体は、ヒト若しくはヒト細胞により産生された抗体の、又はヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列、或いは他のヒト抗体をコードする配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含む抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域とバリアントＦｃ領域を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかし、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ以上、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後切断を受けることがある。したがって、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現により宿主細胞によって産生された抗体は、完全長重鎖を含んでいてもよく、又は完全長重鎖の切断されたバリアントを含んでいてもよい。これは、重鎖の最終的な２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）である場合に当てはまる。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよく、又は存在していなくてもよい。Ｆｃ領域を含む重鎖のアミノ酸配列は、他に示されない限り、本明細書ではＣ末端グリシン－リジンジペプチドなしで示される。一実施態様では、本発明の抗体に含まれる、本明細書で明記したＦｃ領域を含む重鎖は、追加のＣ末端のグリシン－リシンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む。一実施態様では、本発明の抗体に含まれる、本明細書で明記したＦｃ領域を含む重鎖は、追加のＣ末端のグリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む。本明細書で特に指示がない限り、Ｆｃ領域又は定常領域のアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されている、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵナンバリングシステムに従う。ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から、約３４０位のアミノ酸残基に及ぶ。一実施態様では、炭水化物鎖は、ＣＨ２ドメインに付着している。本明細書のＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメイン又はバリアントＣＨ２ドメインであり得る。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣ末端からＣＨ２ドメインまでひと続きの残基を含む（すなわちＩｇＧのおよそ３４１位のアミノ酸残基からおよそ４４７位のアミノ酸残基まで）。本発明のＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメイン又はバリアントＣＨ３ドメインであってもよい（例えば、その１つの鎖に導入された「隆起」（「ノブ」）を有し、その他の鎖に導入された対応する「空洞」（「ホール」）を有するＣＨ３ドメイン；本明細書に参考として明確に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３３号を参照されたい）。このようなバリアントＣＨ３ドメインは、本明細書に記載の２つの非同一抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進するために使用することができる。
「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載されている。通常、この方法は、隆起がそれに対応する空洞内に位置できるように、第１のポリペプチドの接触面に隆起（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面に対応する空洞を、それぞれ導入することにより、ヘテロ二量体形成を促進し、且つホモ二量体形成を妨害することを含む。隆起は、第１のポリペプチドの接触面からの小さなアミノ酸側鎖をそれより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じ又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により変化させることによって作り出すことができる。特定の実施態様では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうちの１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうち他方の１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。さらなる特定の実施態様では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含む。これら２つのシステイン残基の導入により、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、したがって二量体をさらに安定させる（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。ナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１のＥＵインデックスに従う。
「免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域」には、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子バリアントと、置換、付加又は欠失を生じるが免疫グロブリンのエフェクター機能（例えば抗体依存性細胞傷害）を媒介する能力を実質的に低下させない変更を有するバリアントとが含まれることが意図される。例えば、１つ以上のアミノ酸を、生物学的機能を実質的に損なうことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失させることができる。このようなバリアントは、活性に対する影響が最小となるように、当技術分野で公知の一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６－１０（１９９０）を参照されたい）。
「エフェクター機能」という用語は、抗体のＦｃ領域に帰属可能な生物活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞の活性化が挙げられる。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による結合に続いて、受容体保有細胞を刺激してエフェクター機能を実行するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１を参照されたい）。
「ＴＮＦリガンドファミリーメンバー」又は「ＴＮＦファミリーリガンド」という用語は、炎症促進性サイトカインを指す。サイトカインは、一般に、特にＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、免疫系の刺激及び調整において重要な役割を果たす。現在、１９種のサイトカインが、配列、機能及び構造の類似性に基づいて、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）リガンドスーパーファミリーのメンバーとして同定されている。これらのリガンドは全て、Ｃ末端細胞外ドメイン（エクトドメイン）、Ｎ末端細胞内ドメイン及び単一の膜貫通ドメインを有するＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＮＦ相同ドメイン（ＴＨＤ）として公知のＣ末端細胞外ドメインは、スーパーファミリーメンバー間で２０～３０％のアミノ酸同一性を有し、受容体への結合を担う。ＴＮＦエクトドメインはまた、それらの特異的受容体によって認識される三量体複合体を形成するＴＮＦリガンドを担う。ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、リンホトキシンα（ＬＴＡ又はＴＮＦＳＦ１としても知られている）、ＴＮＦ（ＴＮＦＳＦ２としても知られている）、ＬＴβ（ＴＮＦＳＦ３としても知られている）、ＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ４としても知られている）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４又はＴＮＦＳＦ５としても知られている）、ＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌ、ＣＤ１７８又はＴＮＦＳＦ６としても知られる）、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０又はＴＮＦＳＦ７としても知られている）、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３又はＴＮＦＳＦ８としても知られている）、４－１ＢＢＬ（ＴＮＦＳＦ９としても知られている）、ＴＲＡＩＬ（ＡＰＯ２Ｌ、ＣＤ２５３又はＴＮＦＳＦ１０としても知られている）、ＲＡＮＫＬ（ＣＤ２５４又はＴＮＦＳＦ１１としても知られている）、ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＳＦ１２としても知られている）、ＡＰＲＩＬ（ＣＤ２５６又はＴＮＦＳＦ１３としても知られている）、ＢＡＦＦ（ＣＤ２５７又はＴＮＦＳＦ１３Ｂとしても知られている）、ＬＩＧＨＴ（ＣＤ２５８又はＴＮＦＳＦ１４としても知られている）、ＴＬ１Ａ（ＶＥＧＩ又はＴＮＦＳＦ１５としても知られている）、ＧＩＴＲＬ（ＴＮＦＳＦ１８としても知られている）、ＥＤＡ－Ａ１（エクトジプラスシンＡ１としても知られている）、及びＥＤＡ－Ａ２（エクトジプラスシンＡ２としても知られている）からなる群から選択される。特に断らない限り、この用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の天然ＴＮＦファミリーリガンドを指す。「共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバー」、又は「共刺激ＴＮＦファミリーリガンド」という用語は、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのサブグループを意味し、Ｔ細胞の増殖とサイトカイン産生を共刺激することができる。これらのＴＮＦファミリーリガンドは、それらの対応するＴＮＦ受容体と相互作用するとＴＣＲシグナルを共刺激することができ、それらの受容体との相互作用は、Ｔ細胞活性化をもたらすシグナル伝達カスケードを開始するＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）の動員をもたらす。共刺激ＴＮＦファミリーリガンドは、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ及びＬＩＧＨＴからなる群から選択され、より詳しくは、共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは４－１ＢＢＬである。
本明細書において以前に記載されたように、４－１ＢＢＬは、ＩＩ型膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦリガンドファミリーの１つのメンバーである。配列番号３８のアミノ酸配列を有する完全又は完全長４－１ＢＢＬは、細胞の表面上に三量体を形成することが記載されている。三量体の形成は、４－１ＢＢＬのエクトドメインの特異的モチーフ（ｍｏｔｉｖｅ）によって可能になる。前記モチーフは、本明細書では「三量化領域」と呼ばれる。ヒト４－１ＢＢＬ配列（配列番号３９）のアミノ酸５０～２５４は、４－１ＢＢＬの細胞外ドメインを形成するが、その断片も三量体を形成することができる。本発明の特定の実施態様では、「４－１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片」という用語は、配列番号４（ヒト４－１ＢＢＬのアミノ酸５２－２５４）、配列番号１（ヒト４－１ＢＢＬのアミノ酸７１－２５４）、配列番号３（ヒト４－１ＢＢＬのアミノ酸８０－２５４）及び配列番号２（ヒト４－１ＢＢＬのアミノ酸８５－２５４）から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は配列番号５（ヒト４－１ＢＢＬのアミノ酸７１－２４８）、配列番号８（ヒト４－１ＢＢＬのアミノ酸５２－２４８）、配列番号７（ヒト４－１ＢＢＬのアミノ酸８０－２４８）及び配列番号６（ヒト４－１ＢＢＬのアミノ酸８５－２４８）から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指すだけでなく、三量体化が可能なエクトドメインの他の断片も本明細書に含まれる。
「エクトドメイン」は、細胞外空間（すなわち、標的細胞の外側の空間）に伸長する膜タンパク質のドメインである。エクトドメインは、通常、シグナル伝達をもたらす表面との接触を開始するタンパク質の部分である。したがって、本明細書で定義されるＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、細胞外空間（細胞外ドメイン）に伸長するＴＮＦリガンドタンパク質の部分を指すが、三量体化及び対応するＴＮＦ受容体への結合を担うより短い部分又はその断片も含む。したがって、「ＴＮＦリガンドファミリーメンバー又はその断片のエクトドメイン」という用語は、細胞外ドメインを形成するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの細胞外ドメイン又は依然として受容体に結合することができるその部分（受容体結合ドメイン）を指す。
「ペプチドリンカー」という用語は、１つ以上のアミノ酸、典型的には、約２～２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当技術分野で公知であるか、又は本明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ，（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、式中、「ｎ」は一般に１～１０、典型的には１～４、特に２の数であり、すなわち、ＧＧＧＧＳ（配列番号４０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３６）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４１）、（Ｇ４Ｓ）３又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ又はＧ４（ＳＧ４）２（配列番号４３）、及び（Ｇ４Ｓ）４又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４４）からなる群から選択されるペプチドであるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号４５）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号４６）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号４７）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号４８）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号４９）、ＧＧＳＧ（配列番号５０）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号５１）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号５２）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号５３）も含む。特に目的とするペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）１又はＧＧＧＧＳ（配列番号４０）、（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３６）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号４２）及び（Ｇ４Ｓ）４（配列番号４４）である。
「アミノ酸」という用語は、本明細書中で使用する場合、アラニン（三文字表記：ａｌａ、一文字表記：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む、天然に存在するカルボキシα－アミノ酸の群を示す。
本明細書で使用する場合、「融合ポリペプチド」又は「融合タンパク質」は、抗体断片及び抗体に由来しないペプチドで構成される単鎖ポリペプチドを指す。一態様では、融合ポリペプチドは、抗原結合ドメイン又はＦｃ部分の一部に融合した４－１ＢＢＬの１つ若しくは２つのエクトドメイン、又はその断片から構成される。融合は、ペプチドリンカーを介して抗原結合部分のＮ末端又はＣ末端アミノ酸を前記４－１ＢＢＬ又はその断片のエクトドメインのＣ又はＮ末端アミノ酸に直接連結することによって起こり得る。
「融合した」又は「接続した」とは、構成要素（例えば、上記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのポリペプチド及びエクトドメイン）がペプチド結合によって直接又は１つ以上のペプチドリンカーを介して連結されていることを意味する。
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、これらの配列を整列させ、最大の配列同一性パーセントを達成するために必要に応じてギャップを導入し、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない場合の、該参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当分野の技術の範囲内にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して得ることができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を用いて生成している。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が作成したものであり、ソースコードは、使用者用書類と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、ここで、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルし得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含め、ＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定されており、変わらない。ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（或いは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂに対する、ある特定のアミノ酸配列同一性％を有する又は含む、所与のアミノ酸配列Ａとして記述され得る）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一性マッチとしてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂのアミノ酸残基の合計数である。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％に等しくないことが理解されるだろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるアミノ酸配列同一性％の値は全て、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落に記載されるように得られる。
特定の実施態様では、本明細書で提供されるＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子の結合親和性、及び／又は他の生物学的性質を改善するのが望ましい場合がある。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列バリアントは、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成により調製することができる。そのような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを、最終構築物に到達させるために作ることができる。置換変異誘発の対象となる部位には、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が含まれる。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで表Ｂに与えられており、アミノ酸側鎖クラス（１）～（６）を参照しつつ、以下にさらに記載される。アミノ酸置換は、目的の分子に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
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アミノ酸は共通の側鎖特性に従ってグループ化することができる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うであろう。
「アミノ酸配列バリアント」という用語は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基中にアミノ酸置換が存在する実質的なバリアントを含む。一般的に、さらなる試験のために選択され、得られたバリアント（複数可）は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、且つ／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換型バリアントは、親和性成熟した抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して、簡便に生成され得る。簡潔には、１つ以上のＣＤＲ残基が変異しており、ファージディスプレイされ、特定の生体活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされたバリアント抗原結合分子である。特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、これらの変更が抗原に対する抗原結合分子の結合能を実質的に低下させない限り、１つ以上のＣＤＲ内で生じ得る。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的変更（例えば本明細書において提供される保存的置換）をＣＤＲ内で行うことができる。突然変異誘発を標的とし得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１－１０８５によって記載されるように、「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、残基又は標的残基群（例えば、帯電した残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ）が同定され、中性又は負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置き換えられる。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。これに代えて、又はこれに加えて、抗体と抗原との間の接触点を同定するための、抗原－抗原結合分子複合体の結晶構造。このような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的にしても排除してもよい。バリアントを、所望の特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングしてもよい。
アミノ酸配列挿入には、長さが１残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドに及ぶアミノ末端融合及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が挙げられる。分子の他の挿入バリアントとしては、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の血清半減期を増加させるポリペプチドに対するＮ末端又はＣ末端への融合が挙げられる。
特定の実施態様では、本明細書で提供される４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。該分子のグリコシル化バリアントは、簡便には、１つ以上のグリコシル化部位が生成又は除去されるようにアミノ酸配列を変更することにより得ることができる。４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合において、Ｆｃ領域に付着した炭水化物を変更することができる。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に付着される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに付着したフコースが含まれ得る。いくつかの実施態様では、特定の改善された特性を有するバリアントを作製するために、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子中のオリゴ糖の修飾が行われ得る。一態様では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）付着するフコースを欠いた炭水化物構造を有する４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のバリアントが提供される。このようなフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有していてもよく、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）又は米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のさらなるバリアントは、二分されたオリゴ糖を有するもの、例えば、Ｆｃ領域に付着した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されているものを含む。このようなバリアントは、減少したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有していてもよく、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ）を参照されたい。Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有するバリアントも提供される。このような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有する場合があり、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．）、国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）に記載される。
特定の実施態様では、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のシステイン操作バリアント、例えば、分子の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施態様では、置換された残基は、分子の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能な部位に配置され、その反応性チオール基を用いて抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー－薬物部分にコンジュゲートさせて、イムノコンジュゲートを作製することができる。特定の実施態様では、以下の残基のうちのいずれか１つ以上がシステインで置換されていてもよい。軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）、重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン操作された抗原結合分子は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように作製されてもよい。
特定の態様では、本明細書に提供される４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、当技術分野で公知であり、容易に利用可能である付加的な非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に適した部位としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。抗体に付着するポリマーの数は変化し得て、１つを超えるポリマーが付着する場合、ポリマーは、同じ分子であってもよく、又は異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、その抗体誘導体が限定条件の下での治療に使用されるかどうかを含めた（但しこれらに限定されない）考慮事項に基づいて決定することができる。別の態様では、放射線への曝露によって選択的に加熱することのできる抗体と非タンパク質性部分のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ，Ｎ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２（２００５）１１６００－１１６０５）。放射線は、任意の波長であってよく、限定されないが、通常の細胞に有害ではないが、非タンパク質性部分を、抗体－非タンパク質性部分に近位の細胞が死滅する温度まで加熱する波長を含む。
別の態様では、本明細書に提供される４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のイムノコンジュゲートを得ることができる。「イムノコンジュゲート」は、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、１つ以上の異種分子にコンジュゲートした抗体である。
「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基で構成される。多くは、核酸分子は、塩基配列によって記述され、ここで、前記塩基は、核酸分子の一次構造（線形構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’へと表される。本明細書において、核酸分子という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線形又は環状であってもよい。これに加え、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。さらに、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含むことができる。天然に存在しないヌクレオチドの例としては、誘導体化された糖若しくはリン酸骨格結合を有する修飾ヌクレオチド塩基又は化学的に修飾された残基が挙げられる。核酸分子は、例えば、宿主又は患者において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして適したＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、修飾されていなくてもよく、又は修飾されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体を産生するために対象にｍＲＮＡを注入することができるように、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を高めるように化学修飾されてもよい（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｒｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７、２０１７年６月１２日にオンラインで公開、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６又は欧州特許第２１０１８２３Ｂ１号明細書を参照されたい）。
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ、又はＲＮＡを意図している。例えば、ベクターにおいて含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持されている組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外に、又は天然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの本発明のＲＮＡ転写物、及びポジティブ及びネガティブの鎖形態、二本鎖形態を含む。さらに、本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸には、合成により生成されたこのような分子が含まれる。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーター等の調節エレメントであってもよく、又は調節エレメントを含んでいてもよい。
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドあたり５個までの点突然変異を含んでいてもよいことを除けば、参照配列と同一であることを意図している。言い換えると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列内のヌクレオチドの５％までが、欠失していてもよく、若しくは別のヌクレオチドで置換されていてもよく、又は参照配列内の全ヌクレオチドの５％までが、参照配列内へと挿入されていてもよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置で、又はこれら末端位置の間のどの位置で起こってもよく、参照配列中の残基間に個々に散在してもよいし、又は参照配列内に１つ若しくは複数の連続した群として散在してもよい。実際問題として、特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ－２）などの既知のコンピュータプログラムを用いて慣例的に判定することができる。
「発現カセット」という用語は、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸要素を用いて、組換え又は合成により生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス又は核酸断片に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列の中でも特に、転写される核酸配列とプロモーターとを含む。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び誘導するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語には、自己複製する核酸構造としてのベクターだけでなく、ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターも含まれる。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターによって、安定したｍＲＮＡの多量の転写が可能となる。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機構によって生成される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫も含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含量が親細胞と完全に同じでなくてもよく、変異を含んでもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞でスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する突然変異子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するのに使用できる任意の種類の細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織に含まれる細胞も挙げられる。
ある薬剤の「有効量」は、その薬剤が投与される細胞又は組織において、ある生理学的変化を引き起こすのに必要な量を指す。
薬剤、例えば薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を得るのに必要な用量及び期間での有効な量を指す。薬剤の治療的有効量は、疾患の有害作用を、例えば排除し、低下させ、遅延させ、最小化し、又は防止する。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。特に、個体又は対象は、ヒトである。
「薬学的組成物」という用語は、中に含まれる活性成分の生物活性が有効になるような形態の調製物であり、且つ、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される添加物」は、薬学的組成物中の活性成分以外の成分で、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容される添加物としては、限定されないが、バッファー、安定剤又は防腐剤が挙げられる。
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、適応症、用法、用量、投与、併用療法、当該治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
本明細書で使用する場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために行うことも、臨床病理の過程において行うこともできる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患の状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明の分子は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
本明細書で使用する場合、「がん」という用語は、リンパ腫、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、リンパ球性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、気管支肺胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚又は眼内の黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、膵臓がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、子宮がん、卵管のがん腫、子宮内膜のがん腫、子宮頸部のがん腫、膣のがん腫、外陰部のがん腫、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管がん、腎細胞がん、腎盂のがん腫、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、シュワン細胞腫（ｓｃｈｗａｎｏｍａｓ）、上衣腫（ｅｐｅｎｄｙｍｏｎａｓ）、髄芽細胞腫、髄膜腫、扁平上皮がん腫、下垂体腺腫及びユーイング肉腫、黒色腫、多発性骨髄腫、Ｂ細胞がん（リンパ腫）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、上記のがんのいずれかの難治性バージョンを含む、又は上記のがんの１つ以上の組み合わせ等の増殖性疾患を指す。
「進行」がんとは、元の部位又は器官の外に、局所浸潤又は転移のいずれかによって広がったがんである。したがって、「進行」がんという用語は、局所進行性疾患及び転移性疾患の両方を含む。
「再発」がんは、手術等の初期療法への応答後に、初期部位又は遠位部位のいずれかにおいて再成長したものである。「局所的再発」がんは、治療後に以前に治療されたがんと同じ場所で再発するがんである。「手術可能な」又は「切除可能な」がんは、原発器官に限定され、手術（切除）に適したがんである。「切除不能な（ｎｏｎ－ｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ）」又は「切除不能な（ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ）」がんは、手術によって除去（切除）されることができない。
本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子
本発明は、生産性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率、毒性の低下、及び免疫原性の低下などの特に有利な特性を有する新規４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
第１の態様では、本発明は、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結された第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
を含む、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
さらなる態様では、本明細書において前に定義された４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結された第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドは、ＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに連結しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続された前記４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続された前記４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片のみを含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ－ＣＬ又はＶＬ－ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ－ＣＨ１ドメイン又はＶＨ－ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドは、ＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに連結しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに及びＶＨ又はＶＬに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続された前記ＴＮＦリガンファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。
別の態様では、本明細書において前に定義された４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結された第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドは、ＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに連結しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続された前記４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続された前記４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片のみを含むこと
を特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。
一態様では、４－１ＢＢＬのエクトドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む。より具体的には、４－１ＢＢＬのエクトドメインは、配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む。最も具体的には、４－１ＢＢＬのエクトドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。特に、本明細書において前に定義された４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、４－１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はその断片は全て同一である。
したがって、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な少なくとも１つのＦａｂ分子と、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結された第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドは、ＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに連結しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む４－１ＢＢＬの２つのエクトドメインを含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む前記４－１ＢＢＬの１つのエクトドメインを含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む４－１ＢＢＬの２つのエクトドメインを含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む前記４－１ＢＢＬの１つのエクトドメインのみを含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ－ＣＬ又は含むＶＬ－ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ－ＣＨ１ドメイン又はＶＨ－ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドは、ＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに連結しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに及びＶＨ又はＶＬに接続された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む４－１ＢＢＬの２つのエクトドメインを含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む前記４－１ＢＢＬの１つのエクトドメインを含むこと
を特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。
さらなる態様では、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結された第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号５、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
を含む。
一態様では、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結された第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子は、第１のポリペプチドが配列番号１０のアミノ酸配列を含むこと、第２のポリペプチドが配列番号５のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
を含む。
さらなる態様では、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結された第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子は、第１のポリペプチドが配列番号９のアミノ酸配列を含むこと、第２のポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
を含む。
別の態様では、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ＣＨ１又はＣＬドメインを含む第１のポリペプチド及びＣＬ又はＣＨ１ドメインを含む第２のポリペプチドであって、第２のポリペプチドがＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに連結しており、ここで、抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、第２のポリペプチドが、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続された４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片のみを含むことを特徴とする、該第１のポリペプチド及び該第２のポリペプチドと、
を含む。
一態様では、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ＣＨ１ドメインを含む第１のポリペプチド及びＣＬドメインを含む第２のポリペプチドであって、第２のポリペプチドがＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに連結しており、ここで、抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに及びＣＨ１ドメインに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、第２のポリペプチドが、前記ポリペプチドのＣＬドメインにペプチドリンカーを介して接続された４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、該第１のポリペプチド及び該第２のポリペプチドと、
を含む、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。
別の態様では、本発明は、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結された第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
を含む、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な１つを超える抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結された第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
を含む、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
一態様では、本発明は、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な２つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結された第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
を含む、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
さらなる態様では、本発明は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが抗体又は抗体断片からなる群から選択される、本明細書において前に定義された４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
一態様では、本明細書において前に定義された４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、抗体断片、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、又はａＶＨからなる群から選択される。一態様では、ＰＤ－Ｌ１、ＶＨ及びＶＬドメインに特異的に結合可能な抗原結合ドメイン。
特定の態様では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能なＦａｂ分子又はクロスオーバーＦａｂ分子である、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。特に、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能なＦａｂである。
さらなる態様では、本発明による４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、第１のペプチドリンカーによって互いに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むペプチドは、そのＣ末端で、第２のペプチドリンカーによって重鎖のＣＨ１ドメインに融合され、且つ、前記４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片は、そのＣ末端で、第３のペプチドリンカーによって軽鎖上のＣＬドメインに融合されている。
別の態様では、本発明による４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、第１のペプチドリンカーによって互いに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むペプチドは、そのＣ末端で、第２のペプチドリンカーによって重鎖のＣＬドメインに融合され、且つ、前記４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片は、そのＣ末端で、第３のペプチドリンカーによって軽鎖上のＣＨ１ドメインに融合されている。
さらなる態様では、本発明は、本発明による４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子に関し、ここで、第１のペプチドリンカーによって互いに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むペプチドは、そのＣ末端で、第２のペプチドリンカーによって軽鎖のＣＬドメインに融合され、且つ、前記４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片は、そのＣ末端で、第３のペプチドリンカーによって重鎖のＣＨ１ドメインに融合されている。
特定の態様では、本発明は、ペプチドリンカーが（Ｇ４Ｓ）２である、上記で定義された４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子に関する。一態様では、第１のペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２（配列番号４１）であり、第２のペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２（配列番号４１）であり、第３のペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２（配列番号４１）である。
別の態様では、本明細書において前に定義された４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、安定した会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。
特に、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、（ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能なＦａｂ分子であって、Ｆａｂ重鎖がＣ末端においてＦｃドメイン中のＣＨ２ドメインのＮ末端に融合されているＦａｂ分子、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。
さらなる態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より詳しくは、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン修飾
本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、二量体であり、それぞれのサブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。
Ｆｃドメインは、本発明の抗原結合分子に、標的組織への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、望ましい組織－血液分布比を含め、望ましい薬物動態特性を与える。しかし同時に、Ｆｃ領域は、好ましい抗原保有細胞ではなくＦｃ受容体を発現する細胞に対する、本発明の二重特性抗体の望ましくない標的化の原因となることがある。したがって、特定の態様では、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインは、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。一態様では、ＦｃはＦｃ受容体に実質的に結合せず、及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃドメインはエフェクター機能を誘導しない。エフェクター機能の低下としては、限定されないが、以下のうちの１つ以上が挙げられる：補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低下、ＮＫ細胞への結合の低下、マクロファージへの結合の低下、単球への結合の低下、多形核細胞への結合の低下、アポトーシスを誘導する直接シグナル伝達の低下、樹状細胞の成熟の低下、又は減少したＴ細胞プライミング。
特定の態様では、１つ以上のアミノ酸改変を、本明細書で提供される４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域バリアントを生成することができる。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
特定の態様では、本発明は、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結された第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインであって、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への、特にＦｃγ受容体への結合を減少させる１つ以上のアミノ酸置換を含むＦｃドメインと、
を含む、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
一態様では、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットそれぞれに、同じ１つ以上のアミノ酸変異が存在する。特に、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置（ＥＵナンバリング）にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４及び２３５（ＥＵナンバリング）及び／又は３２９（ＥＵナンバリング）の位置にアミノ酸置換を含む。より詳しくは、ＩｇＧ重鎖中にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、ＥＵナンバリング）を有するＦｃドメインを含む、本発明による三量体ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が提供される。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａは、いわゆるＬＡＬＡ変異を指す。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させ、かかる変異体Ｆｃドメインを調製する方法及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能等のその特性を決定する方法も記載している国際特許出願国際公開第２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される。「ＥＵナンバリング」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１のＥＵインデックスに従うナンバリングを指す。
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低下したＦｃドメインには、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１つ以上が置換されたものも含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体には、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
別の態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下と、エフェクター機能の低下を示す。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８（Ｋａｂａｔナンバリング）にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵナンバリング）を含む、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。かかるＩｇＧ４ Ｆｃドメイン変異体及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号にも記載されている。
変異体Ｆｃドメインは、当技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を用いて、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝的方法は、コードＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含んでいてもよい。正しいヌクレオチド変化は、例えば、スクリーニングによって確認することができる。
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的な装置と組換え発現によって得られ得るＦｃ受容体を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。適切なかかる結合アッセイを本明細書に記載する。或いは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株（例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞）を用いて評価されてもよい。
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体のエフェクター機能は、当技術分野で既知の方法によって測定することができる。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイを本明細書に記載する。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの他の例は、米国特許第５，５００，３６２号、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載される。或いは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．マウンテンビュー、カリフォルニア州）のためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン））。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。これに代えて、又はこれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて評価されてもよい。
いくつかの実施態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が減少する。したがって、Ｆｃドメインがエフェクター機能が低下するように改変されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。本発明の二重特異性抗体がＣ１ｑに結合することができ、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２，１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１，１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３，２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。
特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
一態様では、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結された第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含む。したがって、それらは、典型的には２つの同一でないポリペプチド鎖（「重鎖」）に含まれるＦｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合した異なる部分を含む。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量化によって、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。したがって、組換え生産における４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の収率及び純度を改善するために、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利であろう。
したがって、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も長いタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、前記修飾は、特にＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。
特定の態様では、前記修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方の「ノブ」修飾と、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他方の１つの「ホール」修飾を含む。したがって、特定の態様では、本発明は、ＩｇＧ分子を含む、本明細書に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子に関し、第１の重鎖のＦｃ部分は第１の二量体化モジュールを含み、第２の重鎖のＦｃ部分はＩｇＧ分子の２本の重鎖のヘテロ二量体化を可能にする第２の二量体化モジュールを含み、ノブ・イントゥ・ホールに従って、第１の二量体化モジュールはノブを含み、第２の二量体化モジュールはホールを含む。
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。通常、この方法は、隆起がそれに対応する空洞内に位置できるように、第１のポリペプチドの接触面に隆起（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面に対応する空洞を、それぞれ導入することにより、ヘテロ二量体形成を促進し、且つホモ二量体形成を妨害することを含む。隆起は、第１のポリペプチドの接触面からの小さなアミノ酸側鎖をそれより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じ又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
このように、特定の態様では、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、Ｆｃ領域の第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。
隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により変化させることによって作り出すことができる。
具体的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のスレオニン残基がトリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（のＣＨ３ドメイン）において、位置４０７のチロシン残基がバリン残基と置き換わっている（Ｙ４０７Ｖ）。より詳しくは、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、さらに、位置３６６のスレオニン残基がセリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基がアラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）。より詳しくは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、さらに、位置３５４のセリン残基がシステイン残基と置き換わっており（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、さらに、位置３４９のチロシン残基がシステイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらす。ジスルフィド架橋は、二量体をさらに安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。
代替的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２００９／０８９００４号に記載されるように、静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般的に、この方法は、２つのＦｃドメインサブユニットの接触面に、ホモ二量体生成が静電的に望ましくないが、ヘテロ二量化が静電的に望ましいように、荷電アミノ酸残基による１つ以上のアミノ酸残基の置き換えを含む。
ＣＨ１／ＣＬドメイン内での修飾
正しい対形成をさらに改善するために、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、異なる荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含むことができる。これらの修飾は、交差しているか、又は交差していないＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに導入される。特定の態様では、本発明は、ＣＬドメインの１つにおいて、位置１２３（ＥＵナンバリング）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換されており、位置１２４（ＥＵナンバリング）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、ＣＨ１ドメインの１つにおいて、位置１４７（ＥＵナンバリング）、及び位置２１３（ＥＵナンバリング）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子に関する。
より詳しくは、本発明は、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＬドメインにおいて、位置１２３のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がアルギニン（Ｒ）によって置換されており、位置１２４のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がリジン（Ｋ）によって置換されており、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＨ１ドメインにおいて、位置１４７のアミノ酸（ＥＵナンバリング）及び位置２１３のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子に関する。
したがって、特定の態様では、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）アミノ酸変異Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋを含むＣＬドメインを含む第１のポリペプチド、及びアミノ酸変異Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅを含むＣＨ１ドメインを含む第２のポリペプチドであって、第２のポリペプチドは、ＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに連結しており、抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに及びＣＬドメインに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、第２のポリペプチドが、前記ポリペプチドのＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続された４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、該第１のポリペプチド及び該第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。
一態様では、本発明は、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＬドメインにおいて、位置１２３のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がアルギニン（Ｒ）によって置換されており、位置１２４のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がリジン（Ｋ）によって置換されており、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＨ１ドメインにおいて、位置１４７のアミノ酸（ＥＵナンバリング）及び位置２１３のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。これらの修飾は、例えば誤対合等の望ましくない影響を回避する有利な特性を有するいわゆる荷電残基をもたらす。
特に、ＣＬドメインはアミノ酸変異Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋを含み、ＣＨ１ドメインはアミノ酸変異Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅを含む。
特定の４－１ＢＢＬ三量体を含む抗原結合分子
本発明は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインを含む４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。特定の態様では、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な１つの部分を含み、これは、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が一価であることを意味する。別の態様では、本発明は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な２つの部分を含む４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供し、これは、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が二価であることを意味する。
一態様では、本発明は、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＰＤ－Ｌ１）、並びに、（ｉｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＰＤ－Ｌ１）
を含む。
一態様では、本発明は、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに、（ｉｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
さらなる態様では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
さらなる態様では、本発明は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
さらなる態様では、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、（ｉｉ）配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５及び配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び（ｉｉｉ）配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６及び配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む。
特定の態様では、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメイン、並びに
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結された第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで、抗原結合分子は、第１のポリペプチドが配列番号１０のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが配列番号５のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド、
を含む。
特定の態様では、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、抗原結合分子は、配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む。
別の態様では、本発明は、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、抗原結合分子は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む。
ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本明細書に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又はその断片をコードする単離された核酸分子を提供する。
本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドは、完全な抗原結合分子をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、又は同時発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。一緒に発現するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的な抗原結合分子を形成してもよい。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現すると、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して免疫グロブリンを形成する。
いくつかの態様では、単離された核酸分子は、本明細書中に記載される本発明による４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子全体をコードする。特に、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される本発明による４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子に含まれるポリペプチドをコードする。
一態様では、本発明は、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードする単離された核酸分子であって、（ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインをコードする配列、（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドをコードする配列、及び（ｃ）前記４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸分子に関する。
別の態様では、４－１ＢＢリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、（ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な部分をコードする配列、（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はその２つの断片を含むポリペプチドをコードする配列、及び（ｃ）４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドをコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
特定の態様では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
組換え方法
本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、例えば、固体状態ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）又は組換え産生によって得られてもよい。組換え産生のために、例えば上述したように、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために１つ以上のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され、配列決定され得る。本発明の一態様では、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。当業者によく知られている方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されている技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であってもよく、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターには、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド又はそのポリペプチド断片（すなわちコード領域）が、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合してクローニングされる発現カセットが含まれる。本明細書で使用する場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、（存在する場合には）コード領域の一部と考えられる。但し、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域等の任意の隣接配列はコード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物中に、例えば単一のベクター上に存在していてもよく、又は別個のポリヌクレオチド構築物中に、例えば別個の（異なる）ベクター上に存在していてもよい。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断によって翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離される１つ以上のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド若しくはそのポリペプチド断片又はそのバリアント若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合しているか、又は融合していない異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域には、限定されないが、例えば分泌シグナルペプチド又は異種性機能ドメインなどの特殊なエレメント又はモチーフが含まれる。作動可能な結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、遺伝子産物の発現を制御配列の影響下又は制御下に置くように、１つ以上の制御配列と結合している場合である。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域とそれに結合するプロモーターなど）は、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるＤＮＡテンプレートの能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されているといえる。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する、細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーター以外に、他の転写調節エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を指示するポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。
適切なプロモーター及び他の転写調節領域は本明細書に開示されている。様々な転写調節領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写調節領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば、最初期プロモーターとイントロンＡ）、シミアンウイルス４０（例えば最初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が挙げられる。他の転写調節領域としては、脊椎動物遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギａ－グロビン、及び真核細胞において遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が挙げられる。さらなる適切な転写調節領域としては、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、及び誘発性プロモーター（例えばプロモーター誘発性テトラサイクリン）が挙げられる。同様に、様々な翻訳調節エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終止コドン、並びにウイルス系由来のエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位、すなわちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられる）が挙げられる。また、発現カセットは、例えば複製起点及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の逆位末端配列（ＩＴＲ）などの染色体組み込みエレメントといった他の特徴を含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と結合させることができる。例えば、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の分泌が所望される場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子、又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置することができる。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質は、成長中のタンパク質鎖の粗面小胞体を横切る排出輸送が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが一般に、ポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有し、それが翻訳されたポリペプチドから切断されて分泌又は「成熟」型のポリペプチドを産生することを知っている。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド（例えば免疫グロブリン重鎖若しくは軽鎖シグナルペプチド）、又はその配列と作動可能に結合している、ポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体が使用され得る。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
（例えばヒスチジンタグなど）後の精製を容易にするため又は融合タンパク質の標識化の補助のために使用され得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの中又は両末端に含まれ得る。
本発明のさらなる態様では、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。特定の実施態様では、本発明の１つ以上のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関連して本明細書に記載する特徴のいずれかを単独で、又は組み合わせて組み込んでもよい。一態様では、宿主細胞は、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えばそのようなベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するように操作することが可能な任意の種類の細胞系を指す。抗原結合分子を複製し、発現を補助するのに適した宿主細胞は、当技術分野で周知である。かかる細胞は、適切な場合、特定の発現ベクターを用いてトランスフェクトされるか、又は形質導入されてもよく、大規模発酵機に接種するために大量のベクターを含む細胞を成長させ、臨床用途に十分な量の抗原結合分子を得ることができる。適切な宿主細胞としては、原核微生物（例えば大腸菌）又は種々の真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞等が挙げられる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要とされない場合には、細菌内で産生されてもよい。発現後、ポリペプチドは、適切な画分中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、さらに精製されてもよい。原核生物に加え、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、ポリペプチドをコードするベクターに適切なクローニング又は発現の宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株及び酵母株を含み、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドを産生する。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２，１４０９－１４１４（２００４）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４，２１０－２１５（２００６）を参照されたい。
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株が同定されており、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、これを昆虫細胞と組み合わせて使用してもよい。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。脊椎動物細胞も、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えばＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ３６，５９（１９７７）に、記載されるような２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２３、２４３－２５１（１９８０）に、記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト頸部がん腫細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ３８３，４４－６８（１９８２）に、記載されるもの）、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７，４２１６（１９８０））、骨髄腫細胞株、例えば、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０が挙げられる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も挙げられる。一実施態様では、宿主細胞は、真核細胞であり、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現させる標準的な技術は、当技術分野で公知である。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンであるように、免疫グロブリン鎖の他方も発現するように操作することができる。
一態様では、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子、又はそのポリペプチド断片を製造する方法であって、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を発現するのに適した条件下で、本明細書において提供するように、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することとを含む、方法を提供する。
本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子において、構成要素（標的細胞抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの部分、４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む１つのポリペプチド、及び前記４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド）は、互いに遺伝的に融合されていない。ポリペプチドは、その構成要素（ＴＮＦリガンドファミリーメンバー又はその断片の２つのエクトドメイン、及びＣＨ又はＣＬ等の他の構成要素）が直接又はリンカー配列を介して互いに融合されるように設計される。リンカーの組成及び長さは、当技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。本発明の抗原結合分子の異なる構成要素間のリンカー配列の例は、本明細書中に提供される配列中に見出される。必要に応じて、融合タンパク質の個々の構成要素を切り離すための切断部位を取り込むために、追加的配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列も含めることができる。
特定の実施態様では、抗原結合分子の一部を形成する、標的細胞抗原（例えば、Ｆａｂ断片）に特異的に結合可能な部分は、少なくとも抗原に結合することができる免疫グロブリン可変領域を含む。可変領域は、天然又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成し得、それらに由来し得る。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照されたい）。天然には存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築することができ、（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）組換え的に産生することも、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙへの米国特許第５９６９１０８号を参照されたい）。
任意の動物種の免疫グロブリンを本発明で使用することができる。本発明において有用な非限定的な免疫グロブリンは、マウス、霊長類、又はヒト起源のものであり得る。融合タンパク質がヒトへの使用を意図したものである場合、免疫グロブリンの定常領域がヒト由来であるキメラ形態の免疫グロブリンを使用してもよい。免疫グロブリンのヒト化形態又は完全なヒト形態は、当技術分野で周知の方法に従って調製することもできる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい）。ヒト化は、限定されないが、（ａ）重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するのに重要なもの）を保持しつつ、又は保持せずに、非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲをヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用にとって重要な残基）のみをヒトフレームワーク及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様切片で「クローキング」することを含め、種々の方法によって達成されてもよい。ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ １３，１６１９－１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６，１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２－５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１，６８５１－６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４，６５－９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，１５３４－１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎ ３１（３），１６９－２１７（１９９４）；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，２５－３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフト化を記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８，４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」を記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３，２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングに対する「ガイド選択」アプローチを記載）にさらに記載されている。本発明による特定の免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて作製することができる。ヒト抗体は、一般的に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５、３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０、４５０－４５９（２００８）に記載される。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成し得、そのヒトモノクローナル抗体に由来し得る（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（１９８７年ニューヨークのＭａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）を参照されたい）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによっても調製することができる（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３，１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリー（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８，１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）；及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２－５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２，６２４－６２８（１９９１）を参照されたい）から選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することによって作製され得る。ファージは、典型的には、抗体断片を単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片のいずれかとしてディスプレイする。
特定の態様では、発明の抗原結合分子に含まれるＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な部分（例えば、Ｆａｂ断片）は、例えば、ＰＣＴ公報国際公開第２０１２／０２０００６号（親和性成熟に関する実施例を参照されたい）又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に開示されている方法に従って、高められた結合親和性を有するように操作される。特定の抗原決定基に対する本発明の抗原結合分子の結合能は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の手法、例えば表面プラズモン共鳴技法（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））のいずれかによって測定することができる。競合アッセイを使用して、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の実施態様では、そのような競合抗原結合分子は、参照抗原結合分子によって結合される同じエピトープ（例えば、線状エピトープ又は立体配座エピトープ）に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示の方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。例示的な競合アッセイでは、固定化された抗原を、抗原に結合する第１の標識抗原結合分子と、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合するその能力について試験されている第２の非標識抗原結合分子とを含む溶液中でインキュベートする。第２の抗原結合分子は、ハイブリドーマ上清中に存在していてもよい。対照として、固定化された抗原を、第１の標識抗原結合分子を含むが第２の非標識抗原結合分子を含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第２の抗原結合分子が、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合していることを示している。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。
本明細書に記載されるように調製される本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等の、当技術分野で知られた技術により精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの因子に依存し、当業者に明瞭であろう。親和性クロマトグラフィー精製のために、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体、又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の融合タンパク質を親和性クロマトグラフィー精製するために、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続的なプロテインＡ又はＧ親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、基本的に実施例に記載されるように、抗原結合分子を単離するために使用され得る。４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む任意の様々な周知の分析方法によって決定され得る。例えば、実施例に記載されるように発現される４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、還元型及び非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより示されるように、インタクトであり、適切にアセンブルしたことが示された。
アッセイ
本明細書で提供される抗原結合分子は、当技術分野で公知の様々なアッセイによって、その物理的／化学的性質及び／又は生物活性について同定、スクリーニング、又は特徴付けすることができる。生物活性には、例えば、種々の免疫細胞、特にＴ細胞の活性化及び／又は増殖を増強する能力が含まれ得る。例えば、それらは免疫調節性サイトカインの分泌を増強する。増強される、又は増強され得る他の免疫調節サイトカインは、例えば、ＩＬ２、グランザイムＢなどである。生物活性には、カニクイザル結合交差反応性、並びに異なる細胞型への結合も含まれ得る。ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏでかかる生物活性を有する抗原結合分子も提供される。
１．親和性アッセイ
本明細書において提供される４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）に対する親和性は、実施例に記載の方法に従って、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的装置と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。ＰＤ－Ｌ１に対する４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の親和性もまた、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的な計装、及び、例えば組換え発現により入手可能である、受容体又は標的タンパク質を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な実例及び例示的な実施態様は、実施例４に記載される。一態様によれば、ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００機（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、２５℃で表面プラズモン共鳴によって測定される。
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
本明細書において提供する４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の、対応する受容体を発現する細胞への結合は、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して評価することができる。一態様では、４－１ＢＢを発現する新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を結合アッセイに使用することができる。これらの細胞は、単離直後（ナイーブＰＭＢＣ）又は刺激後（活性化ＰＭＢＣ）に使用される。別の態様では、活性化されたマウス脾細胞（４－１ＢＢを発現している）を使用して、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の４－１ＢＢ発現細胞への結合を実証することができる。
さらなる態様では、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞株を使用して、この標的細胞抗原への抗原結合分子の結合を実証した。
別の態様では、競合アッセイを使用して、ＰＤ－Ｌ１又は４－１ＢＢそれぞれへの結合について、特異的抗体又は抗原結合分子と競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の実施態様では、このような競合抗原結合分子は、特異的抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は特異的抗４－１ＢＢ抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。
３．活性アッセイ
一態様では、ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢに結合する、生物活性を有する４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物活性には、例えば、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に対する４－１ＢＢを介したアゴニストシグナル伝達が含まれ得る。アッセイによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでそのような生物活性を有すると同定された４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子もまた提供される。
特定の態様では、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、そのような生物活性について試験される。本発明の該分子の生物活性を検出するためのアッセイは、実施例３に記載されているものである。さらに、（例えば、ＬＤＨ放出の測定による）細胞溶解、（例えば、カスパーゼ３／７活性の測定による）誘発されたアポトーシス動態、又は（例えば、ＴＵＮＥＬアッセイを用いた）アポトーシスを検出するアッセイが、当技術分野において周知である。さらに、このような複合体の生物活性は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又はδγＴ細胞などの様々なリンパ球サブセットの生残、増殖及びリンホカイン分泌に対するこれらの複合体の作用を評価するか、或いは樹状細胞、単球／マクロファージ又はＢ細胞等の抗原提示細胞の表現型と機能を調節するこれらの能力を評価することによって評価され得る。
薬学的組成物、製剤、及び投与経路
さらなる態様では、本発明は、例えば、以下の治療方法のいずれかで使用するための、本明細書において提供する４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書において提供する４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のいずれか、及び、少なくとも１種の薬学的に許容される添加物を含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書において提供する４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のいずれか、及び例えば後述する少なくとも１種の追加の治療剤を含む。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される添加物に溶解又は分散された治療的有効量の１つ以上の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を含む。「薬学的又は薬理学的に許容される」という語句は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに対して一般に無毒である、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー又は他の有害な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。少なくとも１種の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子、及び必要に応じて追加の有効成分を含有する薬学的組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０により例示されているように、本開示に照らして当業者に既知であろう。特に、組成物は、凍結乾燥された製剤又は水溶液である。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される添加物」としては、当業者に既知であるように、任意の全ての溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば抗細菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、塩、安定剤、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
非経口組成物としては、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内、又は腹腔内注射により投与されるように設計されているものが挙げられる。注射の場合、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液又は生理食塩水バッファー等の、生理的に適合性のバッファー中で製剤化され得る。該溶液は、懸濁剤、安定剤、及び／又は分散剤等の調合剤を含有することができる。或いは、融合タンパク質は、適切なビヒクル、例えば、滅菌した発熱性物質除去水と共に使用前に構成するための、粉末形態であってもよい。滅菌注射可能溶液は、必要な場合には以下に列挙する種々の他の成分と共に、本発明の融合タンパク質を必要な量で、適切な溶媒に組み込むことによって調製される。滅菌性は、例えば、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成され得る。一般的に、分散物は、種々の滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁液又は乳濁液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過した液体媒体から有効成分と任意のさらなる所望な成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合には適切に緩衝されているべきであり、注射する前に、十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。該組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染は、安全なレベルで、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満で最小限に維持されるべきであることが理解される。薬学的に許容される適切な添加剤には、限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー類、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を上げる化合物（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストラン等）を含んでいてもよい。任意選択的に、該懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油注射懸濁液として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に封入されてもよく（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションに封入されてもよい。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセル等の成型物品の形態である。特定の実施態様では、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組み合わせ）の組成物での使用によってもたらされてもよい。
本発明の例示的な薬学的に許容される添加物は、さらに、間質性薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載される。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼ）と組み合わせる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されるものが挙げられ、後者の製剤は、酢酸ヒスチジンバッファーを含む。
前述の組成物に加え、融合タンパク質を、デポ剤として製剤化してもよい。このような長く作用する製剤は、埋め込みによって（例えば、皮下又は筋肉内）、又は筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば、融合タンパク質は、適切なポリマー性又は疎水性物質（例えば、許容可能なオイル中の乳濁液としての）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化することができる。
本発明の融合タンパク質を含む薬学的組成物を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。薬学的組成物は、１種以上の生理的に許容される担体、希釈剤、添加剤、又はタンパク質の薬学的に使用可能な調製物への加工を容易にする補助剤を使用して、従来の方法で製剤化できる。適切な製剤は、選択する投与経路によって変わる。
４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、遊離酸又は塩基、中性又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離の酸又は塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成される酸付加塩、又は塩酸又はリン酸等の無機酸と形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマンデル酸等の有機酸と形成されるものが挙げられる。また、遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化第二鉄等の無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカイン等の有機塩基に由来し得る。医薬塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。
本発明の組成物は、治療される特定の徴候に必要な１種類より多い有効成分も含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。そのような有効成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。
一態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のいずれかと、少なくとも１つの追加の治療剤とを含み得る。一態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のいずれかと、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体とを含み得る。一態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン、及び腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般に、滅菌のものである。滅菌状態は、例えば滅菌濾過膜を通す濾過により容易に達成することができる。
治療方法及び組成物
本明細書で提供される４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のいずれかを治療方法において使用することができる。
治療方法における使用のために、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、良好な医療行為と一致する様式で製剤化され、用量化され、投与され得る。これに関連して考慮すべき要因としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。
一態様では、医薬としての使用のための本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。さらなる態様では、疾患の治療における使用のための、特にがんの治療における使用のための、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。特定の態様では、治療方法における使用のための本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。一態様では、本発明は、疾患の治療を必要とする個体における疾患の治療における使用のための、本明細書に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。特定の態様では、本発明は、治療的有効量の融合タンパク質を個体に投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法における使用のための４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。特定の態様では、治療される疾患はがんである。がんの例としては、乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、唾液腺がん、子宮内膜がん、膵がん及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）が挙げられる。一態様では、がんは固形腫瘍である。いくつかの態様では、がんはすでに進行がんである。したがって、これらのがんの治療に使用するための本明細書に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。治療を必要とする対象、患者又は「個体」は、典型的には哺乳動物であり、より具体的にはヒトである。
別の態様では、感染症の治療、特にウイルス感染症の治療に使用するための、本明細書に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。さらなる態様では、自己免疫疾患（例えば、狼瘡疾患等）の治療において使用するための本明細書に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。
さらなる態様では、本発明は、疾患の治療を必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造又は調製における４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の使用に関する。一態様では、医薬は、疾患を有する個体に、治療的有効量の医薬を投与することを含む、疾患を治療する方法における使用のためのものである。特定の実施態様では、治療される疾患は、増殖性障害、特にがんである。したがって、一態様では、本発明は、がん、特にがんの治療のための医薬の製造又は調製における本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の使用に関する。がんの例としては、乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、唾液腺がん、子宮内膜がん、膵がん及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）が挙げられる。当業者は、場合によっては、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は治癒をもたらし得ないが、部分的恩恵をもたらし得ることを容易に認識し得る。いくつかの態様では、いくらかの恩恵を有する生理的変化も治療的に有益と考えられる。したがって、いくつかの態様では、生理学的変化をもたらす４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の量を、「有効量」、又は「治療的有効量」とみなす。
さらなる態様では、本発明は、個体において疾患を治療するための方法であって、前記個体に治療的有効量の本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を投与することを含む方法を提供する。一態様では、薬学的に許容される形態の本発明の融合タンパク質を含む組成物が前記個体に投与される。特定の態様では、治療される疾患は増殖性障害である。特定の態様では、疾患はがんである。特定の態様では、方法は、さらに、個体に、治療的有効量の少なくとも１つの追加の治療剤（例えば、治療される疾患ががんである場合、抗がん剤）を投与することを含む。上のいずれかの実施態様に係る「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであってもよい。
疾患の予防又は治療に関し、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の（単独での使用又は１種以上の他の追加的治療剤との併用の際の）適切な投与量は、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、融合タンパク質の種類、疾患の重症度及び経過、抗原結合分子が予防又は治療のどちらの目的で投与されるか、従前又は同時の治療的介入、患者の病歴及び融合タンパク質に対する応答、並びに主治医の裁量によって決定されるであろう。投与に責任を持つ施術者はいずれにせよ、組成物中の有効成分の濃度、及び個々の対象での適切な用量を決定する。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投与スケジュールが想定される。
４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば単回又は複数回の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が、患者への投与のための初期候補用量となり得る。典型的な１日投薬量は、上述の因子に依存して、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。数日以上にわたる反復投与に関しては、病状に応じて、治療は一般に疾患症状の望まれる抑制が起こるまで継続されるものとする。融合タンパク質の１つの例示的な投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の例では、用量はまた、投与当たり、約１μｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ／ｋｇ体重、約２００μｇ／ｋｇ体重、約３５０μｇ／ｋｇ体重、約５００μｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５００ｍｇ／ｋｇ体重から約１０００ｍｇ／ｋｇ体重まで、又はもっと多く、又はその間の誘導可能な任意の範囲を含んでいてもよい。本明細書に挙げた数字から導き出せる範囲の例では、上記の数字に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重～約５００ｍｇ／ｋｇ体重等の範囲が投与され得る。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はそれらの任意の組み合わせ）の１つ以上の用量を患者に投与することができる。このような用量を、断続的に、例えば、毎週、又は３週間ごとに投与してもよい（例えば、患者は、約２～約２０回、又は例えば約６回の融合タンパク質の投薬を受ける）。初回の高負荷用量の後、それより少ない用量を１つ以上投与してもよい。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であってもよい。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は一般に、意図する目的を達成するのに有効な量で使用される。疾患症状を治療又は予防するのに使用するため、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又はその薬学的組成物は、治療的有効量で投与又は適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示内容を踏まえると十分に当業者の能力の範囲内である。
全身投与の場合、治療的有効用量は、細胞培養アッセイなどのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイから最初に推定することができる。次いで、細胞培養物で決定されるようなＩＣ５０を含む血中濃度範囲を達成するために、用量を動物モデルにおいて製剤化してもよい。このような情報を使用し、ヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定することができる。
初期投与量は、ｉｎ ｖｉｖｏデータ、例えば動物モデルから、当技術分野で周知の技術を用いて推定することもできる。当業者は、動物のデータに基づきヒトへの投与を速やかに最適化することができる。
投与の量及び間隔は、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の、治療効果を維持するのに十分な血漿レベルを提供するために個別に調整される。注射による投与のための患者への通常の投与量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５～１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療に有効な血漿レベルは、各日に複数回用量を投与することによって達成されてもよい。血漿中のレベルは、例えば、ＨＰＬＣによって測定されてもよい。
局所投与又は選択的取り込みの場合、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
本明細書に記載される４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の治療的に有効な用量は一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療的効果を提供する。融合タンパク質の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物実験を使用し、ＬＤ５０（集団の５０％が致死に至る用量）及びＥＤ５０（集団の５０％が治療的に有効である用量）を決定することができる。毒性作用と治療効果の用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。大きな治療指数を示す４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が好ましい。一実施態様では、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータを、ヒトでの使用に適した投薬範囲を配合する際に使用することができる。投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないか、全くない状態で、ＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、様々な要素、例えば、使用される剤形、利用される投与経路、対象の病状等に応じて、この範囲内で変動し得る。実際の製剤、投与経路及び投薬量は、患者の症状という観点で個々の医師によって選択されてもよい（例えば、その全体が本明細書に参考として組み込まれる、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５のＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照されたい）。
本発明の融合タンパク質で治療される患者の主治医は、毒性、臓器不全等に起因して、どのように、いつ投与を中止するか、中断するか、又は調整するかを知っている。逆に、主治医は、臨床応答が十分でなかった場合には、治療レベルを上げるように調整する（毒性は予め排除）ことも知っているであろう。対象となる障害の管理における投与量の大きさは、治療される病状の重症度、投与経路などによって変わる。症状の重症度は、例えば、部分的には、標準的な予後評価方法によって評価されてもよい。さらに、用量及び恐らくは投薬頻度も、個々の患者の年齢、体重及び応答応じて変化するであろう。
他の薬剤及び治療
本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は治療法における１つ以上の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１つの追加の治療剤と共投与され得る。「治療剤」という用語は、このような治療が必要な個体において、症状又は疾患を治療するために投与することが可能な任意の薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療される特定の徴候に適した任意の有効成分を含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。特定の実施態様では、追加の治療剤は、別の抗がん剤である。
このような他の薬剤は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組み合わせた状態で存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の量、障害又は治療の種類、及び上述した他の要因によって決まる。一般に、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、本明細書に記載されているのと同じ投薬量及び投与経路で、又は本明細書に記載の投薬量の約１％～９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投薬量及び経路で使用される。
上記のかかる併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じ又は別個の組成物に含まれる場合）、及び別個の投与を含み、その場合、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の投与は、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又は後に、起こり得る。
したがって、一態様では、がんの治療における使用のための、本明細書に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用される。一態様では、抗ＴＡ／抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン、及び腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。
さらなる態様では、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用され、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子と同時に、その前に、又はその後に投与される。
さらなる態様では、がんの治療のための医薬の製造のための４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の使用が提供され、ここで、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用される。がんの例としては、乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、唾液腺がん、子宮内膜がん、膵がん及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）が挙げられる。
さらなる態様では、本発明は、個体におけるがんを治療するための方法であって、治療的有効量の本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子及び有効量のＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体を前記個体に投与することを含む方法を提供する。がんの例としては、乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、唾液腺がん、子宮内膜がん、膵がん及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）が挙げられる。
製造品
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に貼られているか又は付随しているラベル又は添付文書とを備える。適切な容器としては、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどが挙げられる。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、状態の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子である。
ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される状態を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）本発明の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を含む組成物が中に収容されている第１の容器；及び（ｂ）さらなる細胞傷害性又はその他の治療剤を含む組成物が中に収容されている第２の容器を備え得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに備えてもよい。
代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー（例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液）を収容する第２（又は第３）の容器をさらに備えてもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含め、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに備えてもよい。
Figure 2023509952000003
Figure 2023509952000004
Figure 2023509952000005
Figure 2023509952000006
Figure 2023509952000007
Figure 2023509952000008
Figure 2023509952000009
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に与えられる。抗体鎖のアミノ酸は、上に定義したようなＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））によるＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、参照される。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記の一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様を実施できることが理解される。
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されているように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を製造者の指示書に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ９１－３２４２に示されている。
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定によって決定した。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを使用したＰＣＲによって生成されたか、又はＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，ドイツ）によって、合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から自動遺伝子合成によって合成した。正確な遺伝子配列が利用できない場合においては、最も近い相同体の配列に基づきオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織に由来するＲＮＡから、ＲＴ－ＰＣＲにより遺伝子を単離した。単一の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／配列決定ベクター内へとクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって測定した。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にするために、適切な制限部位を有する遺伝子セグメントを設計した。全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする、５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
細胞培養技術
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００）、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．、Ｄａｓｓｏ，Ｍ．、Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．及びＹａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（編集），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されているように、標準的な細胞培養技術を使用した。
タンパク質精製
標準的なプロトコルを参照して、濾過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔に述べると、抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出はｐＨ２．８で達成され、その直後に試料を中和した。凝集したタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、ＰＢＳ中、又は２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中、単量体抗体から分離させた。単量体抗体画分をプールし、（必要な場合）例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を使用して濃縮し、－２０℃又は－８０℃で凍結保存した。これらの試料の一部が、例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析によるその後のタンパク質解析及び分析的特徴付けのために提供された。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造元の説明書により使用した。特に、１０％若しくは４～１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化剤ランニングバッファー添加剤を含む）又はＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用した。
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。簡潔に述べると、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００システムの３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）におけるＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに、又はＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ－Ｓｙｓｔｅｍの２×ＰＢＳにおけるＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶離したタンパク質をＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって定量した。ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ １５１－１９０１を標準物質として供した。
実施例１
ＰＤ－Ｌ１標的化４－１ＢＢリガンド三量体含有抗原結合分子の生成及び産生
１．１．ＰＤ－Ｌ１標的化４－１ＢＢリガンド三量体含有抗原結合分子の生成及び産生
ＰＤ－Ｌ１に特異的な抗原結合ドメインをコードする重鎖ＤＮＡ配列及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖のどちらかとフレーム内でサブクローニングした。
ヒト４－１ＢＢリガンドのエクトドメイン（アミノ酸７１－２４８）の一部をコードするＤＮＡ配列を、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースのＰ４１２７３配列に従って合成した。
（Ｇ４Ｓ）２リンカーによって分離され、ヒトＩｇＧ１－ＣＬドメインに融合された、４－１ＢＢリガンドの２つのエクトドメインを含むポリペプチドを、図１Ａに示すようにクローニングした：ヒト４－１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４－１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ。
４－１ＢＢリガンドの１つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１－ＣＨドメインに融合されたポリペプチドを、図１Ｂに示すようにクローニングした：ヒト４－１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＨ。
正しい対形成を改善するために以下の変異を交差ＣＨ－ＣＬに導入した。二量体４－１ＢＢリガンドに融合したヒトＣＬドメインにおいて、変異Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋを導入した。単量体４－１ＢＢリガンドに融合したヒトＣＨ１ドメインにおいて、変異Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅを、国際特許出願国際公開第２０１５／１５０４４７号に記載されているようにクローニングした。
ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖のいずれかとフレーム内でサブクローニングした。抗ＰＤ－Ｌ１クローン（クローンＹＷ２４３．５５．Ｓ７０）は、国際公開第２０１０／０７７６３４号に開示されている。
Ｆｃドメインにおいて、国際特許出願国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を導入して、Ｆｃγ受容体への結合を消失させた。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む二量体リガンド－Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合物、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む標的化抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆｃホール鎖及び抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖の組み合わせにより、組み立てられた三量体４－１ＢＢリガンドとＰＤ－Ｌ１結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にした（図２）。
表１は、ＣＨ１－ＣＬクロスオーバーと４－１ＢＢＬに融合したＣＨ１及びＣＬドメインの荷電残基を含む一価抗ＰＤ－Ｌ１スプリット三量体４－１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のアミノ酸配列を示す。この分子はＰＤ－Ｌ１－４－１ＢＢＬと呼ばれる。
Figure 2023509952000010
表２は、非標的化対照分子ＤＰ４７スプリット三量体４－１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のアミノ酸配列を示す。
Figure 2023509952000011
二重特異性構築物は、ポリエチレンイミンを使用して、ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１：１（「ベクター４－１ＢＢＬ Ｆｃ－ノブ鎖」：「ベクター４－１ＢＢＬ軽鎖」：「ベクターＦｃ－ホール鎖」：「ベクター軽鎖」）でトランスフェクトした。
産生は、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞を使用して振盪フラスコ中で行った。ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞、又はＣＨＯ ＥＢＮＡ細胞を一過性トランスフェクションすることにより、抗体及び二重特異性抗体を生成した。細胞を遠心分離にかけて、培地を、予め暖めたＣＤ ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，カタログ番号１０７４３０２９）に交換した。ＣＤ ＣＨＯ培地中で発現ベクターを混合し、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，カタログ番号２３９６６－１）を添加し、溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞（２Ｍｉｏ／ｍＬ）をベクター／ＰＥＩ溶液と混合して、フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気の振盪インキュベーター内で、３時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、補充物（全体積の８０％）を含むＥｘｃｅｌｌ培地を添加した（Ｗ．Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ａ．Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ＤＯＩ：１０．１００７／９７８－３－６４２－５４０５０－９；２０１４）。トランスフェクションの１日後に、補充物（Ｆｅｅｄ、全体積の１２％）を添加した。７日後に、遠心分離、及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により細胞上清を回収し、後述の標準的な方法により、回収した上清を精製した。
標準的なプロトコルを参照して、濾過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、Ｆｃ含有タンパク質は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（平衡化バッファー：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；溶出バッファー：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）によって細胞培養上清から精製した。溶出はｐＨ３．０で達成され、その直後に試料をｐＨ中和した。遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５（物品番号：ＵＦＣ９０３０９６）によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３に従ったアミノ酸配列に基づき計算した質量減衰係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を測定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。ランニングバッファー（それぞれ、２５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４，１２５ｍＭ ＮａＣｌ，２００ｍＭ Ｌ－アルギニンモノヒドロクロリド，ｐＨ６．７、又は２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，２５０ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ６．２）中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）を使用して、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより２５℃にて、凝集内容物の測定を実施した。
表３は、ＰＤ－Ｌ１標的化４－１ＢＢリガンド三量体含有抗原結合分子の収率及び最終的な単量体含有量をまとめたものである。
Figure 2023509952000012
１．２．４－１ＢＢに対する二価結合、及びＰＤ－Ｌ１に対する一価結合を有する二重特異性抗体の生成及び産生
比較のために、４－１ＢＢに対する二価又は一価の結合及びＰＤ－Ｌ１に対する一価の結合を有する二重特異性アゴニスト４－１ＢＢ抗体も調製された。
４－１ＢＢに対する二価結合及びＰＤ－Ｌ１に対する一価結合を有する二重特異性アゴニスト４－１ＢＢｘＰＤ－Ｌ１抗体は、国際公開第２０２０／００７８１７（Ａ１）号に記載されているように、いわゆるヘッドツーヘッド（Ｈ２Ｈ）２＋１フォーマットで産生されている。
構築物の第１の重鎖ＨＣ１は、以下の構成要素から構成される。抗４－１ＢＢバインダー（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１、続いてＦｃホール。第２の重鎖ＨＣ２は、抗ＰＤ－Ｌ１バインダー（交差Ｆａｂフォーマット内のクローンＹＷ２４３．５５．Ｓ７０）のＶＬＣＨ１、続いて、抗４－１ＢＢ（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１、そしてＦｃノブで構成された。ＰＤ－Ｌ１バインダーのＹＷ２４３．５５．Ｓ７０は、国際公開第２０１０／０７７６３４号に記載されている。４－１ＢＢバインダーに関して、クローン２０Ｈ４．９のＶＨ及びＶＬ配列を米国特許第７，２８８，６３８Ｂ２号又は同第７，６５９，３８４Ｂ２号に従い入手した。２つの重鎖を組み合わせることでヘテロ二量体の生成が可能となり、このヘテロ二量体は、１つのＰＤ－Ｌ１結合交差Ｆａｂ、及び２つの４－１ＢＢ結合Ｆａｂを含む（図２Ｂ）。４－１ＢＢに対する一価結合を有する別のヘテロ二量体を、抗４－１ＢＢバインダー（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１、続いてＦｃホールを含む第１の重鎖ＨＣ１、及び、抗ＰＤ－Ｌ１バインダー（交差Ｆａｂフォーマット内のクローンＹＷ２４３．５５．Ｓ７０）のＶＬＣＨ１、続いてＦｃノブを含む第２の重鎖ＨＣ２から構築した（図２Ｃ）。
正しい対形成を改善するために、以下の変異を、抗４－１ＢＢ Ｆａｂ分子のＣＨ－ＣＬに導入した。ＣＬにＥ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ、並びにＣＨ１にＫ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。抗ＰＤ－Ｌ１バインダーの第２の軽鎖ＬＣ２は、ＶＨＣＬ（交差Ｆａｂ）で構成されている。第１の重鎖ＨＣ１（Ｆｃホール重鎖）にＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を導入し、第２の重鎖ＨＣ２（Ｆｃノブ重鎖）にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗを導入することにより、ノブ・イントゥ・ホール技術を適用し、ヘテロ二量体の生成を可能にした。
さらに、国際特許出願国際公開第２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載の方法に従って、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を導入して、Ｆｃγ受容体への結合を消失させた。
２＋１フォーマットの４－１ＢＢｘＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖、それぞれが配列番号５６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、及び配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
１＋１フォーマットの４－１ＢＢｘＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
実施例２
表面プラズモン共鳴によるＰＤ－Ｌ１標的化４－１ＢＢリガンド三量体含有抗原結合分子の機能的特性評価
４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子の調製
ヒト４－１ＢＢのエクトドメイン（Ｑ０７０１１によるヒト４－１ＢＢのアミノ酸２４－１８６、配列番号３３）をコードするＤＮＡ配列を、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとフレーム内でサブクローニングした。抗原エクトドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃとの間に、ＡｃＴＥＶプロテアーゼ切断部位を導入した。抗原－ＦｃノブのＣ末端に、指示したビオチン化のためのＡｖｉタグを導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む抗原Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含むＦｃホール鎖とを組み合わせることにより、４－１ＢＢエクトドメイン含有鎖の単一コピーを含むヘテロ二量体の生成が可能となり、Ｆｃ結合抗原の単量体形態が作製される。表５は、抗原Ｆｃ融合構築物のアミノ酸配列を示す。
Figure 2023509952000013
４－１ＢＢ－Ｆｃ融合分子をコードする全ての配列を、ＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含むプラスミドベクターにクローニングした。さらに、ベクターは、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含んでいる。
ビオチン化単量体抗原／Ｆｃ融合分子を調製するために、指数関数的に増殖する懸濁液のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、融合タンパク質の２つの成分（ノブ鎖及びホール鎖）並びにビオチン化反応に必要な酵素であるＢｉｒＡをコードする３つのベクターでコトランスフェクトした。対応するベクターを２：１：０．０５の比率（「抗原ＥＣＤ－ＡｃＴＥＶ－Ｆｃノブ」：「Ｆｃホール」：「ＢｉｒＡ」）で使用した。
５００ｍｌの振盪フラスコ内でのタンパク質産生のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｇで５分間遠心分離し、予熱したＣＤ ＣＨＯ培地で上清を置き換えた。発現ベクターを、２００μｇのベクターＤＮＡを含有する２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地に再懸濁した。５４０μｌのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を加えた後、該溶液を１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞をＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合して、５００ｍＬ震盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内で、３時間３７℃でインキュベートした。インキュベート後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭバルプロ酸と補充物を含む７％Ｆｅｅｄ１とを培養物に加えた。７日間の培養後、細胞を２１０ｇで１５分間スピンダウンすることによって細胞上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、アジ化ナトリウムを最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）まで補充し、４℃に保った。
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを使用する親和性クロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。親和性クロマトグラフィーのために、４０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ７．５で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清を充填した。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有するバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄することによって除去した。２０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ３．０に対して作製した塩化ナトリウム（０から５００ｍＭ）の線形ｐＨ勾配を使用して、結合タンパク質を溶出した。次いで、カラムを１０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ３．０で洗浄した。
収集された画分のｐＨは、１／４０（ｖ／ｖ）の２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加えることによって調整した。このタンパク質を濃縮し、濾過した後、２ｍＭ ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ（組換えヒトＰＤ－Ｌ１／Ｂ７－Ｈ１ Ｆｃキメラタンパク質、１５６－Ｂ７－１００：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は市販されており、ＰＤ－Ｌ１に対する結合の測定に使用された。
同時結合の決定
ヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）とヒトＰＤ－Ｌ１に同時に結合する能力を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験は、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００５％界面活性剤Ｐ２０，Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で２５℃にて実施した。ヒト４－１ＢＢ－Ｆｃ（ｋｉｈ）タンパク質は、アミンカップリングによりＣＭ５チップのフローセルに直接結合した。約９００ＲＵの固定化レベルを使用した。
ＰＤ－Ｌ１標的化三量体スプリット４－１ＢＢＬ構築物を１５０ｎＭの濃度範囲で、フローセルに１０μＬ／分の流量で９０秒間通過させ、解離を０秒に設定した。第２の被分析物としてヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ（組換えヒトＰＤ－Ｌ１／Ｂ７－Ｈ１ Ｆｃキメラタンパク質、１５６－Ｂ７－１００：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、フローセルに２００ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流量で９０秒間にわたって注入した（図３Ａ）。解離を２４０秒間監視した。タンパク質が全く固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって、バルク屈折率の差を補正した。
図３Ｂに見られるように、ＰＤ－Ｌ１標的化４－１ＢＢＬは、ヒトＰＤ－Ｌ１とヒト４－１ＢＢに同時に結合することができる。
実施例３
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによるＰＤ－Ｌ１標的化４－１ＢＢリガンド三量体含有抗原結合分子の機能的特性評価３．１．ヒトＰＤ－Ｌ１発現細胞株への結合
まず、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現する細胞株を生成した。ヒトＰＤ－Ｌ１をコードする完全長ｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。製造者のプロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５３３８１００）を使用してプラスミドをＭＫＮ４５（ＤＳＭＺ ４０９）細胞中にトランスフェクトした。安定してトランスフェクトされたＰＤ－Ｌ１陽性ＰＤ－Ｌ１細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号１６０００－０４４、ロット９４１２７３、γ線照射マイコプラズマ非含有、熱不活化）、及び、２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンジペプチド（Ｇｌｕｔａ－ＭＡＸ－Ｉ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号３５０５０－０３８）並びに、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ，カタログ番号１０８４３５５５００１）及び１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧｉｂｃｏ，カタログ番号Ａ１１１３８－０２）のいずれかで補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号４２４０１－０４２）中で維持した。結合アッセイのために、ＭＫＮ４５細胞及びＭＫＮ４５－ｈｕＰＤ－Ｌ１を回収し、ＤＰＢＳ（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ，＃１４１９０－１３６）で洗浄し、固定可能な生存能染料ｅＦ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃６５－０８６３－１８）を含有するＤＰＢＳ内で、３０分間４℃で染色した。細胞を洗浄し、３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃３８３０）に、３×１０４細胞／ウェルで播種した。細胞を遠心分離にかけ（３５０×ｇ、５分）、上清を取り除き、滴定濃度の、ＰＤ－Ｌ１－４－１ＢＢＬ又は対照（開始濃度３００ｎＭ）を含有する１０μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファー（２％のＦＢＳ、５ｎＭのＥＤＴＡ、７．５ｍＭのアジ化ナトリウムを補充したＤＰＢＳ）中に再懸濁した。細胞を３０分間４℃でインキュベートした後、８０μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄した。２．５μｇ／ｍＬの、ＰＥ抱合体化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異性ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１０９－１１６－０９８）を含有する１０μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファー中で、３０分間４℃で細胞を再懸濁した。細胞を８０μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄した後、少なくとも１５分間、１％ホルムアルデヒドを含有する３０μＬ／ウェルのＤＰＢＳ中で固定した。同日、又は翌日に、細胞を５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｘ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して取得した。
図４Ａ及び４Ｂに示すように、ＰＤ－Ｌ１－４－１ＢＢＬ構築物（黒い三角形と線）（但しＰＤ－Ｌ１を標的としない対照ではない）は、ヒトＰＤ－Ｌ１発現ＭＫＮ４５－ｈｕＰＤ－Ｌ１細胞に効率的に結合するが、親細胞株ＭＫＮ４５には結合しない。適合するＥＣ５０値及び曲線下面積の値を表５に示す。
示されているのは、ＰＤ－Ｌ１－４－１ＢＢＬの親細胞株ＭＫＮ４５及びＰＤ－Ｌ１を発現する細胞株ＭＫＮ４５－ＰＤ－Ｌ１への結合である。ＰＤ－Ｌ１－４－１ＢＢＬ又は対照分子の濃度は、ＰＥ結合二次検出抗体の蛍光強度の幾何平均に対してブロットされている。ブランク対照（例えば、一次はなく、二次のみの検出抗体）のベースライン値を差し引くことにより、全ての値をベースライン補正する。ＰＤ－Ｌ１－４－１ＢＢＬは、ヒトＰＤ－Ｌ１発現ＭＫＮ４５－ｈｕＰＤ－Ｌ１細胞に効率的に結合するが（図４Ｂ）、親細胞株ＭＫＮ４５には結合しない（図４Ａ）。二重特異性４－１ＢＢｘＰＤＬ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１－４－１ＢＢＬとしてヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＫＮ４５－ｈｕＰＤ－Ｌ１細胞に対してさらに強い結合を示した。
Figure 2023509952000014
３．２ ヒト４－１ＢＢ及びＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するレポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２における、ＮＦ－κＢの活性化
４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）受容体の、そのリガンド（４－１ＢＢＬ）へのアゴニスト結合は、核因子κＢ（ＮＦｋＢ）の活性化を介する４－１ＢＢ下流シグナル伝達を誘発し、ＣＤ８ Ｔ細胞の生残及び活性を促進する（Ｌｅｅ ＨＷ，Ｐａｒｋ ＳＪ，Ｃｈｏｉ ＢＫ，Ｋｉｍ ＨＨ，Ｎａｍ ＫＯ，Ｋｗｏｎ ＢＳ．４－１ＢＢ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ＣＤ８（＋）Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｃｌ－ｘ（Ｌ）ａｎｄ Ｂｆｌ－１．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２；１６９：４８８２－４８８８）。２＋１Ｈ２Ｈ抗４－１ＢＢと抗ＰＤ－Ｌ１ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ二重特異性抗体により媒介されるこのＮＦκＢ－活性化を監視するため、Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２レポーター細胞株をＰｒｏｍｅｇａ（Ｇｅｒｍａｎｙ）より購入した。細胞を前述のとおりに培養した。アッセイのために、細胞を回収し、１０％（体積／体積）ＦＢＳ及び１％（体積／体積）ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉを補充したアッセイ培地である、ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。２×１０３のＪｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２レポーター細胞を含有する１０μｌを、蓋付きの滅菌白色３８４ウェル平底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ番号：３８２６）の各ウェルに移した。滴定された濃度のＰＤ－Ｌ１－４－１ＢＢＬ抗体又は対照分子を含有する１０μＬのアッセイ培地を添加した。最後に、１０μＬの、アッセイ培地のみ、又は１×１０４の細胞の、ヒトＰＤ－Ｌ１でトランスフェクトされた親ＭＫＮ４５又はＭＫＮ４５細胞を含有するアッセイ培地を供給し、プレートを６時間、３７℃及び５％ＣＯ２で、細胞インキュベーター内でインキュベートした。６μｌの新たに解凍したＯｎｅ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ検出溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号：Ｅ６１１０）を各ウェルに添加し、Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダー（５００ｍｓの積分時間、全波長にてフィルター収集なし）を用いて速やかに、ルミネセンス発光を測定した。
図５Ａから５Ｄに示すように、ＰＤ－Ｌ１発現細胞の非存在下においては、ＰＤ－Ｌ１－４－１ＢＢＬは、Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２レポーター細胞株内で強力なヒト４－１ＢＢ受容体の活性化を誘発することはできず、２つの独立した実験においてＮＦκＢの活性化、及びそれ故、ルシフェラーゼ発現をもたらした。ヒトＰＤ－Ｌ１発現ＭＫＮ４５細胞の存在下で、ＰＤ－Ｌ１－４－１ＢＢＬの架橋は、Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦｋＢ－ｌｕｃ２レポーター細胞株におけるＮＦｋＢ活性化ルシフェラーゼ活性の強力な増加をもたらし、これは、非標的化対照ＤＰ４７－４－１ＢＢＬによって媒介される活性化を上回っていた。二重特異性４－１ＢＢｘＰＤＬ１抗体は、同様の活性をもたすが、それでもわずかに低い活性をもたらす。さらに、抗ヒト４－１ＢＢクローン２０Ｈ４．９は、ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡとして、最近このクローンについて報告されている超アゴニスト活性を示す若干のベースライン活性を誘導した（Ｓｕｎ Ｋ Ｈｏ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０２０，１９（４），１０４０－１０５１）。ＥＣ５０値と活性化曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を表６に示す。
Figure 2023509952000015

Claims (30)

  1. ４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
    （ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
    （ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結された第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
    （ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含む、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
  2. ４－１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
  3. （ａ）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
    （ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結された第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号５、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
    （ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
    を含む、請求項１又は２に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
  4. Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進するノブ・イントゥ・ホール修飾を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
  5. Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合、特にＦｃγ受容体への結合を減少させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
  6. Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項１～５のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
  7. ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能なＦａｂ分子である、請求項１～６のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
  8. ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＰＤ－Ｌ１）、並びに、（ｉｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＰＤ－Ｌ１）を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
  9. ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＰＤ－Ｌ１）、及び配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＰＤ－Ｌ１）を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
  10. ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＰＤ－Ｌ１）、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＰＤ－Ｌ１）を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
  11. 抗原結合分子が、
    ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能なＦａｂ分子を含む第１の重鎖及び第１の軽鎖、
    定常ドメインと、第１のペプチドリンカーによって互いに接続されており、そのＣ末端において第２のペプチドリンカーによって第２の重鎖又は軽鎖に融合されている４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片と、を含む第２の重鎖、及び
    定常ドメインと、そのＣ末端において第３のペプチドリンカーによって第２の軽鎖又は重鎖にそれぞれ融合されている前記４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片と、を含む第２の軽鎖
    を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
  12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、第１のペプチドリンカーによって互いに接続された４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のペプチドが、そのＣ末端において第２のペプチドリンカーによって重鎖の一部であるＣＬドメインに融合されており、前記４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドが、そのＣ末端において第３のペプチドリンカーによって軽鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合されている、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
  13. 抗原結合分子が、
    （ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
    （ｉｉ）配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５及び配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
    （ｉｉｉ）配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６及び配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
    を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
  14. 抗原結合分子が、配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
  15. 抗原結合分子が、配列番号２９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
  16. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードする単離された核酸分子。
  17. 請求項１６に記載の単離された核酸分子を含むベクター、特に発現ベクター。
  18. 請求項１６に記載の核酸又は請求項１７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  19. ４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の発現に適した条件下で請求項１８に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を製造する方法。
  20. 抗体を宿主細胞から回収することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 請求項１９に記載の方法によって製造された４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
  22. 請求項１～１５、又は２１のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子と、少なくとも１つの薬学的に許容される添加物とを含む薬学的組成物。
  23. 追加の治療剤をさらに含む、請求項２２に記載の薬学的組成物。
  24. 医薬としての使用のための、請求項１～１５のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子、又は請求項２２若しくは２３に記載の薬学的組成物。
  25. がんの治療における使用のための、請求項１～１５のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子、又は請求項２２若しくは２３に記載の薬学的組成物。
  26. ４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が、別の治療剤と組み合わせて使用される、請求項２５に記載の使用のための、請求項１～１５のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子、又は請求項２２若しくは２３に記載の薬学的組成物。
  27. がんの治療のための医薬の製造のための、請求項１～１５のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の使用。
  28. ４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が、別の治療剤と組み合わせて使用される、がんの治療のための医薬の製造のための、請求項１～１５のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の使用。
  29. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又は請求項２２若しくは２３に記載の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法。
  30. がんを有する個体において細胞傷害性Ｔ細胞活性を上方制御又は延長する方法であって、請求項１～１５のいずれか一項に記載の４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又は請求項２２に記載の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、方法。
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