BR112021012101A2

BR112021012101A2 - Moléculas de ligação ao antígeno agonístico cd28 biespecífico, um ou mais polinucleotídeos isolados, um ou mais vetores, célula hospedeira, método de produção de uma molécula, composição farmacêutica, uso da molécula e método de inibição do crescimento de células tumorais

Info

Publication number: BR112021012101A2
Application number: BR112021012101-3A
Authority: BR
Inventors: Guy Georges; Jean-Baptiste Pierre Vallier; Tanja Fauti; Thomas Hofer; Ralf Hosse; Christian Klein; Ekkehard Moessner; Johannes Sam; Pablo Umaña; Jenny Tosca THOM; Stephan GASSER
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2021-09-08
Also published as: JP2023021958A; CL2023001092A1; CL2021001603A1; CA3123493A1; JP2022514343A; CO2021008696A2; MY198034A; CN113286821A; CR20210326A; US20200199234A1; JP2024020215A; KR20210108981A; TW202039567A; WO2020127618A1; US11608376B2; MA54513A; PE20211696A1; CL2023001091A1; IL283811A; US20230416365A1

Abstract

moléculas de ligação ao antígeno agonístico cd28 biespecífico, um ou mais polinucleotídeos isolados, um ou mais vetores, célula hospedeira, método de produção de uma molécula, composição farmacêutica, uso da molécula e método de inibição do crescimento de células tumorais. a presente invenção refere-se a moléculas de ligação ao antígeno agonístico biespecífico direcionadas a tumor caracterizadas por ligação monovalente a cd28, métodos para sua produção, composições farmacêuticas contendo esses anticorpos e métodos de uso das mesmas.

Description

“MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, UM OU MAIS POLINUCLEOTÍDEOS ISOLADOS, UM OU MAIS VETORES, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA MOLÉCULA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DA MOLÉCULA E MÉTODO DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE CÉLULAS TUMORAIS”

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a moléculas de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecíficas direcionadas a tumor caracterizadas por ligação monovalente a CD28, métodos para sua produção, composições farmacêuticas contendo essas moléculas e seu uso como imunomoduladores no tratamento de câncer.

ANTECEDENTES

[0002] A imunoterapia contra o câncer está se tornando uma opção de terapia cada vez mais eficaz, que pode resultar em respostas dramáticas e duráveis em tipos de câncer, como melanoma, câncer de pulmão de células não pequenas e carcinoma de células renais. Isso é principalmente impulsionado pelo sucesso de vários bloqueios de ponto de verificação imunológico, incluindo anti-PD-1 (por exemplo, Keytruda, Merck; Opdivo, BMS), anti-CTLA-4 (por exemplo, Yervoy, BMS) e anti-PD-L1 (por exemplo, Tecentriq, Roche). É provável que esses agentes sirvam como padrão de tratamento para muitos tipos de câncer, ou como a espinha dorsal das terapias combinadas; no entanto, apenas uma fração dos pacientes (<25%) se beneficia dessas terapias. Além disso, vários cânceres (câncer de próstata, câncer colorretal, câncer pancreático, sarcomas, câncer de mama não triplo negativo etc.) apresentam resistência primária a esses imunomoduladores. Vários relatórios indicam que a ausência de células T antitumorais pré-existentes contribui para a ausência ou má resposta de alguns pacientes. Em resumo, apesar dos impressionantes efeitos anticâncer das imunoterapias existentes, há uma clara necessidade médica de abordar uma grande população de pacientes com câncer e de desenvolver terapias que visem induzir e aumentar as novas respostas de células T específicas de tumor.

[0003] CD28 é o membro fundador de uma subfamília de moléculas coestimulatórias caracterizadas por domínios pareados da superfamília de imunoglobulinas V-set (IgSF) anexados a domínios transmembranares únicos e domínios citoplasmáticos que contêm motivos de sinalização críticos (Carreno e Collins, 2002). Outros membros da subfamília incluem ICOS, CTLA-4, PD1, PD1H, TIGIT e BTLA (Chen e Flies, 2013). A expressão de CD28 é restrita a células T e prevalente em todos os subconjuntos com experiência em antígeno, incluindo aqueles que expressam PD-1 ou CTLA-4. CD28 e CTLA-4 são altamente homólogos e competem pela ligação às mesmas moléculas B7 CD80 e CD86, que são expressas em células dendríticas, células B, macrófagos e células tumorais (Linsley et al., 1990). A maior afinidade de CTLA-4 para a família de ligantes B7 permite que CTLA-4 supere o CD28 para a ligação do ligante e suprima as respostas das células T efetoras (Engelhardt et al., 2006). Em contrapartida, PD-1 demonstrou inibir a sinalização de CD28 desfosforilando em parte o domínio citoplasmático de CD28 (Hui et al., 2017). A ligação de CD28 por CD80 ou CD86 na superfície de células apresentadoras de antígenos profissionais é estritamente necessária para o priming funcional de novo de células T intocadas, expansão clonal subsequente, produção de citocinas, lise de células-alvo e formação de memória de longa duração. A ligação de ligantes CD28 também promove a expressão de receptores coestimuladores induzíveis, como OX-40, ICOS, e 4- 1BB (revisado em Acuto e Michel, 2003). Após a ligação do CD28, um homodímero ligado por dissulfeto, o motivo YMNM proximal da membrana e o motivo PYAP distal demonstraram complexar com várias quinases e proteínas adaptadoras (Boomer e Green, 2010). Esses motivos são importantes para a indução da transcrição de IL2, que é mediada pela ativação dependente de

CD28 dos fatores de transcrição da família NFAT, AP-1 e NFκB (Fraser et al.,

1991) (June et al., 1987) (Thompson et al., 1989). No entanto, outros locais mal caracterizados para fosforilação e ubiquitinação são encontrados dentro do domínio citoplasmático de CD28. Conforme revisado por (Esensten et al.,

2016), as vias iniciadas pelo CD28 têm papéis essenciais na promoção da proliferação e função efetiva de células T convencionais.

A ligação de CD28 também promove a função anti-inflamatória das células T reguladoras.

CD28 co-estimula as células T aumentando em parte os sinais do receptor de células

T, mas também mostrou-se mediar eventos de sinalização únicos (Acuto e

Michel, 2003; Boomer e Green, 2010; June et al., 1987). Os sinais ativados especificamente por CD28 controlam muitos aspectos importantes da função das células T, incluindo fosforilação e outras modificações pós-tradução de proteínas a jusante (por exemplo, fosforilação mediada por PI3K), mudanças transcricionais (por exemplo, expressão de Bcl-xL), alterações epigenéticas

(por exemplo, IL-2), remodelação do citoesqueleto (por exemplo, orientação do centro de organização dos microtúbulos) e alterações na taxa glicolítica (por exemplo, fluxo glicolítico). Camundongos deficientes em CD28 apresentam respostas reduzidas a patógenos infecciosos, antígenos de aloenxerto, doença do enxerto contra hospedeiro, hipersensibilidade de contato e asma (Acuto e

Michel, 2003). A falta de coestimulação mediada por CD28 resulta na redução da proliferação de células T in vitro e in vivo, em inibição severa da formação do centro germinativo e troca de classe de isótopos de imunoglobulina, redução da diferenciação de células T auxiliares (Th) e expressão de Th2- tipo de citocinas.

As respostas de células T CD8+ citotóxicas dependentes de CD4 também são afetadas.

É importante ressaltar que as células T virgens deficientes em CD28 mostraram uma resposta proliferativa reduzida,

particularmente em concentrações de antígeno mais baixas.

Um crescente corpo de literatura apoia a ideia de que o envolvimento de CD28 nas células T tem potencial antitumoral. Evidências recentes demonstram que os efeitos anticâncer dos inibidores de checkpoint PD-L1/PD-1 e CTLA-4 dependem de CD28 (Kamphorst et al., 2017; Tai et al., 2007). Estudos clínicos investigando os efeitos terapêuticos do bloqueio de CTLA-4 e PD-1 têm mostrado resultados excepcionalmente promissores em pacientes com melanoma avançado e outros tipos de câncer. Além disso, a infusão de células T geneticamente modificadas que expressam receptores de células T quiméricos artificiais que compreendem um domínio de reconhecimento de antígeno extracelular fundido aos domínios de sinalização de TCR intracelular (CD3z) e domínios coestimuladores intracelulares (domínios CD28 e/ou 4-1BB) mostrou altas taxas e durabilidade de resposta em cânceres de células B e outros tipos de câncer.

[0004] Os anticorpos agonísticos de CD28 podem ser divididos em duas categorias: (i) anticorpos superagonísticos CD28 e (ii) anticorpos agonísticos convencionais CD28. Normalmente, para a ativação de células T virgens, tanto o engajamento do receptor do antígeno da célula T (TCR, sinal 1) quanto a sinalização coestimulatória pelo CD28 (sinal 2) é necessária. Os superagonistas de CD28 (CD28SA) são anticorpos monoclonais específicos para CD28, que são capazes de ativar autonomamente células T sem envolvimento evidente do receptor de células T (Hünig, 2012). Em roedores, o CD28SA ativa células T convencionais e regulatórias. Os anticorpos CD28SA são terapeuticamente eficazes em vários modelos de autoimunidade, inflamação e transplante. No entanto, um estudo de fase I do anticorpo humano CD28SA TGN1412 resultou em uma tempestade de citocinas com risco de vida em 2006. Estudos de acompanhamento sugeriram que a toxicidade foi causada por erros de dosagem devido a diferenças na responsividade de CD28 de células T humanas e células T de modelos animais pré-clínicos. O TGN1412 está sendo reavaliado em um estudo aberto de escalonamento de dose multicêntrico em pacientes com AR e pacientes com malignidades sólidas avançadas metastáticas ou irressecáveis. Os anticorpos agonísticos convencionais de CD28, como o clone 9,3, mimetizam os ligantes naturais de CD28 e só são capazes de aumentar a ativação de células T na presença de um sinal de receptor de células T (sinal 1). Os insights publicados indicam que o epítopo de ligação do anticorpo tem um grande impacto sobre se o anticorpo agonista é um superagonista ou um agonista convencional (Beyersdorf et al., 2005). O TGN1412 superagonístico se liga a um motivo lateral de CD28, enquanto a molécula agonística convencional 9,3 se liga perto do epítopo de ligação ao ligante. Como consequência dos diferentes epítopos de ligação, os anticorpos superagonísticos e agonísticos convencionais diferem em sua capacidade de formar complexos lineares de moléculas de CD28 na superfície das células T. Precisamente, o TGN1412 é capaz de formar matrizes lineares de CD28 de maneira eficiente, o que presumivelmente leva a componentes de sinalização agregados que são suficientes para ultrapassar o limite de ativação de células T. O agonista convencional 9,3, por outro lado, leva a complexos que não são lineares em estrutura. Uma tentativa de converter ligantes agonísticos convencionais com base no clone 9,3 foi publicada anteriormente (Otz et al., 2009) com o uso de um anticorpo de cadeia única biespecífico recombinante direcionado a um proteoglicano associado ao melanoma e CD28.

Foi relatado que o anticorpo biespecífico de cadeia única relatado exerce atividade “supra-agonística”, apesar do uso de um ligante agonístico de CD28 convencional 9,3, com base na tendência intrínseca dos anticorpos biespecíficos de cadeia única de formar construtos multiméricos.

[0005] Foi constatado que uma melhor ativação de células T é alcançada quando quantidades limitantes de anticorpos biespecíficos anti-CD3, isto é, anticorpos biespecíficos de células T (TCBs), como CEA-TCB, são combinados com moléculas anti-CD28 agonísticas. Dado que CD28 é expresso na linha de base nas células T em várias indicações de tumor (Lavin et al., 2017; Tirosh et al., 2016, Zheng et al., 2017) e a ativação da sinalização de CD28 aumenta os sinais do receptor de células T, a combinação de uma molécula de TCB com uma molécula de CD28 direcionada ao tumor espera-se que atue sinergicamente para induzir respostas antitumorais fortes e de longa duração. Assim, aqui foram descritas novas moléculas de CD28 agonísticas direcionadas a tumor que exibem sinergia com TCBs e requerem monovalência de ligação de CD28 para dependência de alvo tumoral estrita na presença de sinais de TCB.

IMUNOTERAPIA DE TUMORES SÓLIDOS

[0006] O tratamento de tumores sólidos é um desafio contínuo, com poucos avanços observados nos últimos anos. Tipicamente, o tratamento será uma combinação de cirurgia e quimioterapia e/ou radioterapia. Embora algumas novas modalidades de tratamento tenham sido desenvolvidas recentemente, ainda há necessidade de mais melhorias, para aumentar as taxas de sobrevida dos pacientes que sofrem de tumores sólidos, e melhorar sua qualidade de vida. Os tumores sólidos raramente expressam um antígeno específico do tumor. Para a maioria dos tumores sólidos, é mais comum encontrar um antígeno associado ao tumor (TAA) que é enriquecido em tumores, mas também expresso em níveis muito baixos em tecidos normais. O TAA é apresentado preferencialmente na superfície da célula tumoral sólida ou em uma célula do estroma tumoral. Esse é o caso de muitos TAAs frequentemente direcionados para tumores sólidos, incluindo Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP), Antígeno Carcinoembrionário (CEA), Receptor Alfa de Folato (FolR1), Proteoglicano de Sulfato de Condroitina Associado ao Melanoma (MCSP), Receptor de Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR), Receptor 2 do Fator de Crescimento Epidérmico Humano (HER2) e p95HER2.

Adicionalmente, TAAs incluem HER3, EpCAM, TPBG (5T4), mesotelina, MUC1 e PSMA. A molécula de ligação biespecífica ao antígeno CD28 agonístico que compreende um domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um antígeno associado ao tumor será, portanto, direcionada principalmente para a superfície do tumor ou microambiente tumoral e irá ativar especificamente as células T na proximidade do tumor, enquanto uma ativação sistêmica pode ser evitada.

JUSTIFICATIVA PARA DIRECIONAR O AGONISMO DE CD28 PARA MALIGNIDADES DE

CÉLULAS B

[0007] O linfoma não-Hodgkin (LNH) é uma das principais causas de morte por câncer nos Estados Unidos e na Europa. O linfoma folicular (FL) tem curso indolente e evolução lenta, com sobrevida mediana de 8 a 10 anos; pacientes em estágios clínicos avançados geralmente não são curáveis. Da mesma forma, em 2% a 3% dos pacientes por ano, o fenótipo da FL pode se transformar em um linfoma agressivo de grandes células, um evento crítico no curso da doença e que está associado ao aumento da mortalidade relacionada ao linfoma. Linfoma de células do manto e linfoma difuso de grandes células B (DLBCL) são mais agressivos e, se não tratados, apresentam sobrevida média de apenas 6 meses. A falta de resultados curativos para muitos pacientes com subtipos de NHL indolente e agressivo continua sendo uma necessidade médica não atendida, apesar dos avanços significativos na imunoterapia que estenderam os tempos de sobrevida livre de progressão. Durante os últimos anos, foi observada sobrevida prolongada significativa em DLBCL, particularmente com a adição do anticorpo monoclonal anti-CD20, rituximabe (Rituxan®, MabThera®) a regimes quimioterápicos citotóxicos intensivos. No entanto, apesar do tratamento convencional para DLBCL não tratado previamente ser curativo na intenção, a maioria dos pacientes eventualmente terá recaída. Da mesma forma, a FL avançada permanece amplamente incurável pelo SoC atual e é caracterizada por reincidências repetidas e remissões progressivamente mais curtas. Atualmente, muitos anticorpos monoclonais de nova geração estão em diferentes fases de avaliação pré- clínica e clínica para melhorar ainda mais a evolução dos pacientes com LNH e superar os mecanismos de resistência ao rituximabe. Quimioterapia de alta dose com suporte de células-tronco autólogas ou transplante de células-tronco alogênicas fornece uma opção curativa para apenas uma minoria (10%) dos pacientes com DLBCL recidivante/refratário (r/r) e está associada a mortalidade substancial relacionada ao tratamento. Outras abordagens para o tratamento do LNH atualmente em desenvolvimento incluem compostos direcionados a moléculas como venetoclax e inibidores de BET. Novos agentes recentemente aprovados incluem lenalidomida, idelalisibe e copanlisibe. A terapia de células T com receptor de antígeno quimérico (CAR) foi aprovada para o tratamento de formas agressivas de r/r B-NHL, mas esta terapia está disponível apenas em ambientes limitados e pode ser associada a eventos neurológicos fatais e síndrome de liberação de citocinas (CRS). Construtos de anticorpos biespecíficos que redirecionam a lise de células citotóxicas para células B malignas estão atualmente em desenvolvimento e têm demonstrado eficácia muito promissora contra NHL. Tratamentos sem quimioterapia são previstos para o futuro do NHL e provavelmente serão baseados em anticorpos biespecíficos ou células T receptoras de antígenos quiméricos (células T CAR).

Um agonista de CD28 direcionado contra um antígeno de superfície de células B em combinação com imunoterapia deve aumentar as taxas de sobrevivência e/ou cura para pacientes com neoplasias de células B, sem comprometer sua qualidade de vida.

ANTÍGENOS DE SUPERFÍCIE DE CÉLULAS B COMO UM ALVO PARA MALIGNIDADES DE CÉLULAS B

[0008] TAAs relacionados a doenças malignas de células B são antígenos de superfície de células B. O antígeno CD19 humano é uma glicoproteína transmembranar de 95 KDa pertencente à superfamília das imunoglobulinas. CD19 é classificado como uma proteína transmembrana do tipo I, com um único domínio transmembrana, um terminal C citoplasmático e um terminal N extracelular. Em células normais, é a proteína mais ubíqua expressa na linhagem de linfócitos B. A expressão de CD19 é mantida em células da linhagem B que sofreram transformação neoplásica, portanto o CD19 é útil no diagnóstico de leucemias e linfomas por meio de anticorpos monoclonais (mAbs) e citometria de fluxo, assim como o antígeno CD20. Como as leucemias e linfomas da linhagem B raramente perdem a expressão de CD19, e por não ser expresso na célula-tronco pluripotente, tornou-se alvo de uma variedade de agentes imunoterápicos, incluindo imunotoxinas. CD79 é o componente de sinalização do receptor de células B que consiste em um heterodímero covalente contendo CD79a (Igα, mb-1) e CD79b (Igβ, B29).

CD79a e CD79b cada um contém um domínio de imunoglobulina extracelular (Ig), um domínio transmembrana e um domínio de sinalização intracelular, um domínio de motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptor (ITAM), como outras proteínas de sinalização, como CD3 ou receptor Fcativador.

CD79a e CD79b são, portanto, proteínas transmembrana que compõem as subunidades de sinalização do receptor de células B (BCR). CD79b é uma proteína de 39 KDa expressa exclusivamente em células B e, em cooperação com CD79a, inicia a cascata de transdução de sinal a jusante do BCR, que leva à internalização do complexo BCR, sua translocação para os endossomos e apresentação do antígeno. Em células B, o agrupamento de BCR induzido por antígeno desencadeia a fosforilação da tirosina do ITAM de CD79a e CD79b por quinases Src. Isso leva ao recrutamento e ativação de uma série de moléculas efetoras pertencentes à cascata de sinalização do BCR, incluindo as mais notáveis SYK e BLNK. Mais a jusante, o recrutamento de PLCg2, Btk, e

ERK facilita o fluxo de cálcio e ativa as células B, que estão então prontas para receber sinais coativadores adicionais que irão conduzir sua proliferação e diferenciação em células de memória ou efetoras. Durante esse processo, as células B tornam-se APCs robustas e liberam citocinas que podem influenciar no resultado e na qualidade da resposta imune. Além de seu papel na sinalização BCR, as subunidades CD79 também são essenciais para o transporte e exibição de Ig ligada à membrana do retículo endoplasmático para a superfície celular. A expressão de superfície média de CD79b em NHLs é similar àquela em células B normais, mas com um intervalo maior. Dada a expressão de CD79b, é benéfico produzir anticorpos terapêuticos para o antígeno CD79b que criam mínima ou nenhuma antigenicidade quando administrados a pacientes, especialmente para tratamento crônico.

[0009] Foi constatado que uma melhor ativação de células T é alcançada quando quantidades limitantes de anticorpos biespecíficos anti- CD3, isto é, anticorpos biespecíficos de células T (TCBs), como, por exemplo, um anticorpo biespecífico CD20/CD3, são combinados com moléculas anti-CD28 agonísticas. Dado que o CD28 é expresso na linha de base nas células T em várias indicações de tumor (Lavin et al., 2017; Tirosh et al., 2016, Zheng et al., 2017) e a ativação da sinalização de CD28 aumenta os sinais do receptor de células T, a combinação de anticorpos biespecíficos de células T com moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonísticas biespecíficas que alvejam um antígeno de superfície de células B, espera-se que atuem sinergicamente para induzir respostas antitumorais fortes e de longa duração. Assim, aqui descreveram-se novas moléculas agonísticas biespecíficas de ligação ao antígeno CD28 direcionadas a um antígeno de superfície de células B que apresentam sinergia com TCBs e requerem monovalência de ligação de CD28 para dependência estrita de alvo tumoral na presença de sinais TCB.

IMUNOTERAPIA EM MIELOMA MÚLTIPLO

[0010] Afetando aproximadamente 75.000 novos pacientes todos os anos na UE e nos EUA, o mieloma múltiplo (MM) é uma das neoplasias hematológicas mais comuns, permanecendo com grande necessidade médica não atendida. O mieloma múltiplo é caracterizado por células plasmáticas terminalmente diferenciadas que secretam imunoglobulinas monoclonais não funcionais. Em curto prazo, os fármacos imunomoduladores como lenalidomida e pomalidomida e inibidores de proteassoma como carfilzomibe ou bortezomibe podem permanecer na cadeia principal da terapia de 1ª linha para mieloma múltiplo (Moreau et al, 2016). No entanto, esses fármacos não visam especificamente as células tumorais doentes, por exemplo, células plasmáticas doentes (PC). Esforços têm sido feitos no sentido de esgotar seletivamente as células plasmáticas no mieloma múltiplo. A falta de proteínas de superfície que marcam especificamente as células plasmáticas tem dificultado o desenvolvimento de anticorpos ou terapias celulares para o mieloma múltiplo.

Até o momento, existem poucos casos de produtos biológicos bem-sucedidos, incluindo daratumumabe (anti-CD38) e elotuzumabe (anti-CD319), com a ressalva de que ambos os antígenos também são expressos em outros tecidos normais, incluindo linhagens hematopoiéticas e células efetoras imunes, que podem limitar seu uso clínico de longo prazo. O antígeno de maturação de células B (BCMA), uma glicoproteína transmembrana da superfamília 17 do receptor do fator de necrose tumoral (TNFRSF17), é expresso em níveis significativamente mais elevados em todas as células MM do paciente, mas não em outros tecidos normais, exceto nas células plasmáticas normais. As células T do receptor de antígeno quimérico BCMA (CAR) já demonstraram atividade clínica significativa em pacientes com RRMM que se submeteram a pelo menos três tratamentos anteriores, incluindo um inibidor de proteassoma e um agente imunomodulador. Modalidades adicionais, incluindo o conjugado anticorpo-fármaco anti-BCMA, também alcançaram respostas clínicas significativas em pacientes que falharam pelo menos três linhas de terapia anteriores, incluindo um anticorpo anti-CD38, um inibidor de proteassoma e um agente imunomodulador (Cho et al, 2018). Um desafio, por exemplo, da terapia direcionada a BCMA ou CD38 reside na presença de níveis elevados de BCMA ou CD38 solúvel no soro de pacientes com MM, o que pode reduzir a quantidade de fármaco ativo no paciente. Uma alternativa pode ser novos alvos, como o receptor acoplado à proteína G da classe C do grupo 5 membro D (GPRC5D), que é diferencialmente expresso por células plasmáticas em mieloma múltiplo versus células plasmáticas de doadores saudáveis, e não tem forma solúvel. Foi relatado que GPRC5D está associado a prognóstico e carga tumoral em pacientes com mieloma múltiplo (Atamaniuk, J. et al., 2012; e Cohen, Y., et al., 2013). GPRC5D é um receptor órfão sem ligante (ou ligantes) conhecido e biologia amplamente desconhecida em homens em geral e especificamente no câncer. O gene que codifica GPRC5D, que é mapeado no cromossomo 12p13.3, contém três exons e abrange cerca de 9,6 kb (Brauner- Osborne, H. et al. 2001). O grande primeiro exon codifica o domínio de sete transmembranas. Foi demonstrado que GPRC5D está envolvido na formação de queratina em folículos capilares em animais (Gao, Y. et al., 2016, e Inoue, S. et al., 2004). O documento WO 2018/017786 A2 revela anticorpos específicos de GPRC5D ou fragmentos de ligação ao antígeno.

JUSTIFICATIVA PARA DIRECIONAR O AGONISMO DE CD28 PARA CÉLULAS

PLASMÁTICAS DOENTES NO MIELOMA MÚLTIPLO

[0011] O agonismo de CD28 no Mieloma Múltiplo pode exercer diferentes funções biológicas nas respectivas células plasmáticas de MM imunológicas. Embora se espere que a coativação de células T via CD28 conduza as respostas antitumorais, o agonismo de CD28 nas células MM media a sinalização pró-sobrevivência por meio da regulação de PI3K/Akt,

FoxO3a, e Bimm que, por sua vez, é descrito como indutor de resistência quimioterápica em mieloma múltiplo (Murray ME et al, 2014). A superexpressão de CD28 em células plasmáticas de mieloma múltiplo recém-diagnosticado é descrita para se correlacionar com o pior resultado clínico (Bahlis et al., 2007).

No entanto, enquanto a ativação de CD28 aumenta a sobrevivência das células do mieloma, sua ativação inibe a proliferação das células do mieloma. Agonizar o CD28 na presença de uma forte resposta mediada por células imunes, como uma ativação biespecífica de células T de células T, pode aumentar ainda mais as respostas antitumorais eficientes. Aqui, forneceram-se moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que se ligam especificamente a um antígeno de superfície celular de mieloma múltiplo humano (MM).

Particularmente, as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno agonístico CD28 de acordo com a invenção que alvejam os TAAs selecionados de BCMA, CD38 e GPRC5D e CD28 expressos em células T têm a potência para tratar mieloma múltiplo como agente único ou em combinação com outros agentes, como células T anticorpos biespecíficos (TCBs) direcionados a um antígeno de superfície celular MM humano.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0012] A presente invenção descreve moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonísticas biespecíficas direcionadas a tumor que alcançam uma ativação de células T dependente de tumor e morte de células tumorais sem a necessidade de formar multímeros. As moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno CD28 da presente invenção são caracterizadas por ligação monovalente a CD28 e por compreenderem pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica aa antígeno associado a um tumor (como Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP) ou Antígeno Carcinoembrionário (CEA), CD19 ou GPRC5D). Ademais, as mesmas apresentam um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora. A reticulação mediada pelo receptor Fc é assim anulada e a ativação específica do tumor é alcançada por reticulação através da ligação do pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a um tumor ao seu antígeno.

[0013] Dessa forma, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico caracterizada pela ligação monovalente a CD28, que compreende

[0014] (a) um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28,

[0015] (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e

[0016] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[0017] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, conforme definido abaixo, em que o domínio Fc é um IgG, particularmente um domínio Fc de IgG1 ou um domínio Fc de IgG4. Em um aspecto particular, o domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável é um domínio Fc de IgG1. Em um aspecto, o domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A e L235A (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um aspecto, o domínio Fc é da subclasse IgG1 humana e compreende as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (numeração de acordo com o índice de EU de Kabat).

[0018] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, conforme definido no presente documento anteriormente, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende

[0019] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada CDR-H1 de SEQ ID NO: 36, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 37, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 38, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve CDR-L1 de SEQ ID NO: 39, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 40 e uma CDR- L3 de SEQ ID NO: 41; ou

[0020] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma CDR-H1 de SEQ ID NO: 20, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 21, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 22, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma CDR-L1 de SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 24 e uma CDR-L3 de SEQ ID NO: 25.

[0021] Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma CDR-H1 de SEQ ID NO: 36, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 37, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 38, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma CDR-L1 de SEQ ID NO: 39, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 40 e uma CDR-L3 de SEQ ID NO: 41.

[0022] Em um outro aspecto, os domínios de ligação ao antígeno capazes de ligação específica a CD28 da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico compreendem uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma CDR-H1 de SEQ ID NO: 20, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 21, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 22, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma CDR-L1 de SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 24 e uma CDR-L3 de SEQ ID NO: 25.

[0023] Além disso, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, conforme definido no presente documento antes, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.

[0024] Em um outro aspecto, uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico é fornecida, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 51, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 61.

[0025] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende

[0026] (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[0027] (b) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, ou

[0028] (c) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:51 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:61, ou

[0029] (d) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[0030] (e) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[0031] (f) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:59, ou

[0032] (g) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, ou

[0033] (h) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:43 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, ou

[0034] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[0035] (j) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:59, ou

[0036] (k) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27.

[0037] Em um aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e uma cadeia leve região variável (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54.

[0038] Em um outro aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 e uma cadeia leve região variável (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.

[0039] Em um aspecto particular adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e uma cadeia leve região variável (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.

[0040] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a Antígeno Carcinoembriogênico (CEA).

[0041] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, conforme descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA compreende

[0042] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:188, uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:189, e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:190, e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:191, uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:192 e uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:193; ou

[0043] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:180, uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:181, e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:182, e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:183, uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:184 e uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:185; ou

[0044] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:127, uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:128, e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:129, e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:130, uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:131 e uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:132, ou

[0045] (iv) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:507, uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:508, e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:509, e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:510, uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:511 e uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:512.

[0046] Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA compreende uma região variável da cadeia pesada (VHCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 133, e uma região variável da cadeia leve

(VLCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 134. Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:186 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:187.

[0047] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA compreende

[0048] (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:194 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:195, ou

[0049] (b) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:196 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:197, ou

[0050] (c) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:198 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:199, ou

[0051] (d) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:200 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:201, ou

[0052] (e) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:202 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:203, ou

[0053] (f) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:204 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:205, ou

[0054] (g) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:206 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:207, ou

[0055] (h) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:208 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:209, ou

[0056] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:210 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:211, ou

[0057] (j) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:212 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:213.

[0058] Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:200 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:201.

[0059] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a Proteína de

Ativação de Fibroblasto (FAP). Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico conforme descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a FAP compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:12, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:13, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14, e uma região variável de cadeia leve

(VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:15, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:16, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:17, ou (b) uma região variável de cadeia pesada

(VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, e uma região variável de cadeia leve (VLFAP)

que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO:7, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO:8, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO:9. Em particular, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a FAP compreende uma região variável de cadeia pesada

(VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (ii) CDR-H2 que compreende o amino sequência de ácido da SEQ ID NO: 13, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 e uma região variável da cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a FAP compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18, e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:19, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10, e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:11. Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19.

[0060] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica à molécula de adesão a células epiteliais (EpCAM). Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, como descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a EpCAM compreende uma região variável de cadeia pesada (VHEpCAM) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:515, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:516, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:517 e uma região variável de cadeia leve (VLEpCAM) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:518, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:519, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:520. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a EpCAM compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VHEpCAM) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 521, e uma região variável de cadeia leve (VLEpCAM) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 522.

Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a EpCAM compreende uma região variável de cadeia pesada (VHEpCAM) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:521 e uma região variável de cadeia leve (VLEpCAM) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:522.

[0061] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a HER3. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, como descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a HER3 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHHER3) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:523, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:524, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:525 e uma região variável de cadeia leve (VLHER3) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:526, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:527, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:528. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a HER3 compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VHHER3) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 529, e uma região variável de cadeia leve (VLHER3) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 530. Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a HER3 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHHER3) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:529 e uma região variável de cadeia leve (VLHER3) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:530.

[0062] Em ainda um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD30. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, como descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD30 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD30) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:531, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:532, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:533 e uma região variável de cadeia leve (VLCD30) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:534, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:535, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:536. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD30 compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD30) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 537, e uma região variável de cadeia leve (VLCD30) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 538. Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD30 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD30) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:537 e uma região variável de cadeia leve (VLCD30) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:538.

[0063] Ademais, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a TBPG. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico,

como descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a TBPG compreende uma região variável de cadeia pesada (VHTBPG) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:539, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:540, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:541 e uma região variável de cadeia leve (VLTBPG) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:542, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:543, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:544. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a TBPG compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VHTBPG) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 545, e uma região variável de cadeia leve (VLTBPG) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 546.

Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a TBPG compreende uma região variável de cadeia pesada (VHTBPG) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:545 e uma região variável de cadeia leve (VLTBPG) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:546.

[0064] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico caracterizado por ligação monovalente a CD28, que compreende (a) um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28, (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno de superfície celular de Mieloma Múltiplo (MM), e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora. Em um aspecto, o antígeno de superfície celular de Mieloma Múltiplo (MM) selecionado do grupo que consiste em CD38, BCMA e GPRC5D.

[0065] Dessa forma, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a GPRC5D. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico conforme descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a GPRC5D compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VHGPRC5D) que compreende (i) CDR- H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:563, (ii) CDR- H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:564, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:565, e uma região variável de cadeia leve (VLGPRC5D) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:566, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:567, e (vi) CDR- L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:568, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHGPRC5D) que compreende (i) CDR- H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:579, (ii) CDR- H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:580, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:581, e uma região variável de cadeia leve (VLGPRC5D) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:582, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:583, e (vi) CDR-

L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:584. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a GPRC5D compreende uma região variável de cadeia pesada (VHGPRC5D) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 569, e uma região variável de cadeia leve (VLGPRC5D) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 570. Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a GPRC5D compreende uma região variável de cadeia pesada (VHGPRC5D) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:569 e uma região variável de cadeia leve (VLGPRC5D) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:570.

[0066] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD38. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, como descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD38 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD38) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:547, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:548, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:549 e uma região variável de cadeia leve (VLCD38) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:550, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:551, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:552. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD38 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD38) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 553, e uma região variável de cadeia leve (VLCD38) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 554. Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD38 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD38) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:553 e uma região variável de cadeia leve (VLCD38) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:554.

[0067] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a BCMA. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, como descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a BCMA compreende uma região variável de cadeia pesada (VHBCMA) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:555, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:556, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:557 e uma região variável de cadeia leve (VLBCMA) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:558, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:559, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:560. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a BCMA compreende uma região variável de cadeia pesada (VHBCMA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 559, e uma região variável de cadeia leve (VLBCMA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 560. Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a BCMA compreende uma região variável de cadeia pesada (VHBCMA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:561 e uma região variável de cadeia leve (VLBCMA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:562.

[0068] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico caracterizado por ligação monovalente a CD28, que compreende (a) um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28, (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno de superfície celular, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora. Em um aspecto, o antígeno de superfície de célula B selecionado do grupo que consiste em CD19, CD79b, CD20, CD22 e CD37.

[0069] Dessa forma, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD19. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico conforme descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD19 compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:406, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:407, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:408, e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:409, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:410, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:411, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:414, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:415, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:416, e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:417, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:418, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:419. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD19 compreende (a) uma região variável de cadeia pesada

(VHCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 98% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:412, e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 98% ou 100%

idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:413, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 98% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:420, e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 98% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:421. Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:412 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:413.

[0070] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD79b. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, como descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD79b compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD79b) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:422, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:423, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:424 e uma região variável de cadeia leve (VLCD79b) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:425, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:426, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:427. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD79b compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD79b) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 428, e uma região variável de cadeia leve (VLCD79b) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 429. Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD79b compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD79b) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:428 e uma região variável de cadeia leve (VLCD79b) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:429.

[0071] Em um aspecto adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como definido no presente documento antes, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 é um fragmento Fab ou um fragmento crossFab.

[0072] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[0073] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[0074] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e

[0075] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[0076] Em um aspecto adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[0077] (a) um primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[0078] (b) um segundo fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e

[0079] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora,

[0080] em que o primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N- terminal da cadeia pesada de Fab do segundo fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, que, por sua vez, é fundido em seu C-terminal ao N-terminal de uma das subunidades de domínio Fc.

[0081] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como revelado no presente documento antes, que compreende

[0082] (a) um primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[0083] (b) um segundo e um terceiro fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e

[0084] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora,

[0085] em que o primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N- terminal da cadeia pesada de Fab do segundo fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, que, por sua vez, é fundido em seu C-terminal ao N-terminal da primeira subunidade de domínio Fc, e o terceiro fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N-terminal da segunda subunidade de domínio Fc.

[0086] Em um aspecto adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[0087] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[0088] (b) um domínio VH e VL capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e

[0089] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora,

[0090] em que o fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 é fundido em seu C-terminal ao N-terminal da primeira subunidade de domínio Fc, e em que um dentre o domínio VH e VL capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é fundido através de um ligante peptídico ao C-terminal da primeira subunidade de domínio Fc e o outro dentre o domínio VH e VL capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é fundido através de um ligante peptídico ao C-terminal da segunda subunidade de domínio Fc.

[0091] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um ou mais polinucleotídeos isolados que codificam molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico da invenção. A invenção fornece ainda um ou mais vetores, particularmente vetores de expressão, que compreendem o polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) isolado da invenção, e uma célula hospedeira que compreende o polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) isolado ou o vetor de expressão (ou vetores de expressão) da invenção. Em alguns aspectos, a célula hospedeira é uma célula eucariótica, particularmente uma célula de mamífero. Em um outro aspecto, é fornecido um método de produção de uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico conforme descrito no presente documento que compreende cultivar a célula hospedeira da invenção sob condições adequadas para a expressão da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico. Opcionalmente, o método também compreende recuperar molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico. A invenção também abrange uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico produzida por meio do método da invenção.

[0092] A invenção fornece ainda uma composição farmacêutica que compreende uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico da invenção e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto, a composição farmacêutica é para uso no tratamento de câncer.

[0093] Também se encontram abrangidos pela invenção métodos de uso da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico e da composição farmacêutica da invenção. Em um aspecto, a invenção fornece a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico ou uma composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso como um medicamento. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico conforme descrito no presente documento para uso para (a) melhorar ativação celular ou (b) melhorar funções efetoras de células T. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico ou uma composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso no tratamento de uma doença. Em um aspecto específico, a doença é câncer. Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico ou composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso no tratamento de câncer, em que a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico é administrada em combinação com a agente quimioterápico, radioterapia e/ou outros agentes para uso em imunoterapia contra câncer. Em um aspecto adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico ou uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, em que a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico é administrada em combinação com um anticorpo biespecífico anti-CD3 de ativação de células T. Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico ou uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, em que a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico é administrada em combinação com um anticorpo anti-PD-L1 ou um anticorpo anti-PD-1.

[0094] Também é fornecido o uso de uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico de acordo com a invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença; bem como um método de tratamento de uma doença em um indivíduo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico de acordo com a invenção ou uma composição que compreende a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico de acordo com a invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto específico, a doença é câncer.

Em um aspecto, é fornecido um método para (a) melhorar a ativação celular ou (b) melhorar funções efetoras de células T em um indivíduo, que compreende administrar uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico de acordo com a invenção ou uma composição que compreende a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico de acordo com a invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável ao dito indivíduo.

Em um outro aspecto, é fornecido o uso de uma molécula de ligação ao antígeno agonístico

CD28 biespecífico de acordo com a invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença, em que o tratamento compreende coadministração com um agente quimioterápico, radioterapia e/ou outros agentes para uso em imunoterapia contra câncer.

Em um aspecto adicional, é fornecido um método de tratamento de uma doença em um indivíduo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação ao antígeno agonístico

CD28 biespecífico de acordo com a invenção ou uma composição que compreende a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico de acordo com a invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável, em que o método compreende coadministração com um agente quimioterápico,

radioterapia e/ou outros agentes para uso em imunoterapia contra câncer.

Em um aspecto adicional, é fornecido um método de tratamento de uma doença em um indivíduo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico de acordo com a invenção ou uma composição que compreende a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico de acordo com a invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável, em que o método compreende coadministração de um anticorpo biespecífico anti-CD3 de ativação de células T.

Em um outro aspecto, é fornecido um método de tratamento de uma doença em um indivíduo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico de acordo com a invenção ou uma composição que compreende a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico de acordo com a invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável, em que o método compreende coadministração de um anticorpo anti-PD-L1 ou um anticorpo anti-PD-1.

Também é fornecido um método de inibição do crescimento de células tumorais em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico de acordo com a invenção, ou coadministração uma composição que compreende a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico de acordo com a invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável, para inibir o crescimento das células tumorais. Em qualquer um dos aspectos acima, o indivíduo é, de preferência, um mamífero, particularmente um ser humano.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0095] Nas Figuras 1A a 1L, são mostradas ilustrações esquemáticas das moléculas conforme descritas. A Figura 1A mostra o anticorpo CD28 agonístico CD28(SA) em sua isoforma huIgG4 (TGN1412).

[0096] A Figura 1B ilustra o anticorpo agonístico CD28(SA) como o isótipo hu IgG1 PGLALA (“Fc silencioso”).

[0097] Moléculas de ligação ao antígeno biespecífico FAP-CD28 no formato 1+1, formato 1+2, formato 2+2 e formato 1+4 são mostrados nas Figuras 1C, 1D, 1E e 1F, respectivamente.

[0098] Moléculas de ligação ao antígeno biespecífico CEA-CD28 no formato 1+2, formato 2+2 e formato 1+1 são mostrados nas Figuras 1G, 1H e 1J, respectivamente.

[0099] A Figura 1I mostra uma ilustração esquemática das variantes do anticorpo agonístico CD28 como isótipo monovalente hu IgG1 PGLALA (“Fc silencioso”).

[00100] A Figura 1K mostra uma molécula de ligação ao antígeno FAP-CD28 biespecífico no formato 1+1, em que o domínio de ligação ao antígeno FAP é representado como domínios VH e VL, cada um fundido a um terminal C das subunidades de domínio Fc.

[00101] A Figura 1L ilustra uma molécula de ligação ao antígeno FAP-CD28 biespecífico no formato 2+1, em que o domínio de ligação ao antígeno CD28 é representado como crossFab que é fundido em seu C- terminal ao N-terminal de uma das cadeias pesadas do anticorpo FAP “bivalente”.

[00102] A Figura 1M mostra outra molécula de ligação ao antígeno FAP-CD28 biespecífico em formato 1+1, em que o domínio de ligação ao antígeno CD28 é representado como crossFab que é fundido em seu C- terminal ao N-terminal do fragmento Fab que se liga a FAP.

[00103] A Figura 1N ilustra uma molécula de ligação ao antígeno triespecífico FAP-CEA-CD28 no formato 1+1+1, em que o domínio de ligação ao antígeno CD28 é representado como Fab que é fundido no C- terminal de ambas as cadeias leve e pesada ao N-terminal de ambas as cadeias leve e pesada do domínio de ligação ao antígeno anti-FAP na cadeia de knob Fc huIgG1 PG-LALA e em que o fragmento CrossFab anti-CEA faz parte da cadeia de buraco huIgG1 PG-LALA Fc.

[00104] As Figuras 2A, 2B, 2C, 2D e 2E se referem à ligação de anticorpos agonísticos CD28 e moléculas de ligação ao antígeno FAP-CD28 a CD28 humano ou FAP humano nas células. É mostrada a ligação de CD28 (SA) na isoforma IgG4 vs. hu IgG1 PGLALA isotipo ti CD28 humano na Figura 2A e a ligação de diferentes moléculas FAP-CD28 a CD28 humano (Figura 2B) e FAP humano (Figura 2C) nas células. Intensidades médias de fluorescência de ligação de diferentes anticorpos agonísticos de CD28 ou moléculas direcionadas anti-DP47 a células CHO que expressam CD28 humano (linha celular parental CHO-k1 ATCC n° CCL-61, modificada para superexpressar CD28 humano de forma estável) ou células 3T3 que expressam FAP humano (NIH/linha celular 3T3 (ATCC CRL-1658)) foi avaliada por citometria de fluxo. São retratados triplicados técnicos com SEM. Uma comparação de moléculas de ligação ao antígeno FAP (4B9) -CD28 (SA) (Moléculas D, E e F conforme descrito no Exemplo 1) é mostrada na Figura 2D (ligação a CD28 humano) e Figura 2E (ligação a FAP humano).

[00105] As Figuras 2F e 2G mostram a ligação de diferentes formatos de moléculas de ligação ao antígeno FAP-CD28 com ligação monovalente a CD28 e FAP, respectivamente. São mostradas as curvas para FAP-CD28 CTF 1+1 (P1AE2236, Molécula I), FAP-CD28 1+1 (P1AD4492, Molécula C), FAP-CD28 H2T 1+1 (P1AE2021, Molécula H) e os dois compostos FAP-CD28 (SA) 1+2 (P1AD9011, Molécula E) e DP47 como referência. São mostradas as intensidades médias de fluorescência de ligação dos anticorpos FAP-CD28 ou anticorpo anti-DP47 (controle negativo) a células CHO que expressam CD28 humano (linha celular parental CHO-k1 ATCC n° CCL-61, modificada para superexpressar CD28 humano de forma estável) (Figura 2F) ou células 3T3 que expressam FAP humana (linha celular NIH/3T3 (ATCC CRL-1658)) (Figura 2G), avaliada por citometria de fluxo. São mostrados triplicados técnicos com SEM. As Figuras 2H e 2I mostram a ligação de FAP-CD28 2 + 1 (P1AE5231, Molécula G) a CD28 e FAP, respectivamente.

[00106] O alinhamento dos domínios variáveis de CD28 (SA) e dos mesmos variantes é mostrado nas Figuras 3A a 3D. O alinhamento do domínio VH de CD28(SA) e suas variantes, a fim de remover a cisteína 50 e reduzir a afinidade dos ligantes anti-CD28 resultantes em diferentes graus, é mostrado nas Figuras 3A e 3B. De nota, em VH variantes i e j, as CDRs de CD28 (SA) foram enxertadas de uma estrutura IGHV1-2 em uma estrutura IGHV3-23 (Figura 3B). Nas Figuras 3C e 3D, é mostrado o alinhamento do domínio VL de CD28(SA) e suas variantes, a fim de reduzir a afinidade dos ligantes anti-CD28 resultantes em diferentes graus. Na variante t, as CDRs foram enxertadas na sequência estrutural da sequência VL do trastuzumabe (Herceptin).

[00107] Nas Figuras 4A a 4C, é mostrada a ligação de variantes de anticorpos agonísticos de CD28 com afinidade reduzida em formatos de IgG monoespecíficos monovalentes de sobrenadantes para CD28 humano em células. Intensidades de fluorescência médias de ligação a células CHO que expressam CD28 humano (linha celular parental CHO-k1 ATCC n° CCL-61, modificada para superexpressar CD28 humano de forma estável) em comparação com o controle negativo (anti-DP47) e o TGN1412 original, foram avaliados por fluxo citometria. As curvas de ligação das variantes 1-10 são mostradas na Figura 4A, as das variantes 11 a 22 na Figura 4B e as das variantes 23 a 31 na Figura 4C. São retratados duplicados técnicos com SD.

[00108] Nas Figuras 4D e 4E, é mostrada a ligação de variantes de anticorpo agonístico de CD28 biespecífico direcionado a FAP no formato huIgG1 PG-LALA 1+1 com variantes de anticorpo agonístico de CD28 com afinidade reduzida selecionadas para CD28 humano em células. As curvas de ligação dos construtos biespecíficos 1+1 com as variantes 8, 11, 12, 15, 16 e 17 são mostradas na Figura 4D, enquanto as curvas de ligação dos construtos biespecíficos 1+1 com as variantes 19, 23, 25, 27 e 29 são mostrados na Figura 4E. Os ligantes selecionados foram escolhidos com base nas afinidades para a produção em um formato 1+1, biespecífico direcionado a FAP. Nas Figuras 4F e 4G, é mostrada a ligação das mesmas variantes de anticorpo agonístico de CD28 biespecífico direcionado a FAP no formato huIgG1 PG-LALA 1+1 a FAP humano. São fornecidas intensidades médias de fluorescência de ligação a células CHO que expressam CD28 humano (linha celular parental CHO-k1 ATCC n° CCL-61, modificada para superexpressar CD28 humano de forma estável) ou a células 3T3 que expressam FAP humano (linha celular NIH/3T3 (ATCC CRL- 1658)) em comparação ao controle negativo (anti-DP47) e ao TGN1412 (Molécula A), avaliado por citometria de fluxo. São mostrados triplicados técnicos com SEM.

[00109] A potência in vitro de variantes de anticorpos agonísticos de CD28 biespecíficos direcionados a FAP selecionados no formato huIgG1 PG-LALA 1+1 é ilustrada nas Figuras 4H, 4I e 4J. As células T PBMC foram incubadas com células de melanoma MV3 que expressam MCSP e FAP por 5 dias na presença de concentração limite de MCSP-TCB (5 pM, P1AD2189) e concentração crescente de construtos FAP-CD28 com os ligantes variantes de CD28 indicados. Na Figura 4H, é mostrada a diluição de CFSE como medida para a proliferação de células T de células T CD8, avaliada por citometria de fluxo. As barras de erro mostram SEM, os gráficos representam triplicados técnicos de resultados representativos de 2 doadores.

Na Figura 4I, é mostrada a correlação de KD (nM) da variante de ligante CD28 em relação à potência por área sob a curva de (a) como% do clone parental TGN1412 (CD28(SA)). Na Figura 4J, é mostrada a morte da célula alvo em 90h.

[00110] As Figuras 5A a 5D se referem ao estabelecimento de pré-cultura de alta densidade (HD) e modo de ação de CD28(SA). As células T PBMC foram pré-cultivadas em alta densidade (HD) por 2 dias ou usadas frescas do isolamento de PBMC e estimuladas com concentrações crescentes de CD28(SA). É representada a diluição de CFSE como proxy para a proliferação de células T após 5 dias de estimulação com CD28(SA) (Molécula A, P1AE1975) (Figura 5A) e secreção de citocina após 2 dias (Figura 5A) de estimulação. A Figura 5C mostra a porcentagem de expressão de FcγRIIb em monócitos PBMC e células B antes e após 2 dias de pré-cultura de PBMC HD, avaliada por citometria de fluxo. Figura 5D: PBMCs pré- cultivadas HD foram co-cultivadas com CD28(SA) por 5 dias na presença ou ausência de um anticorpo bloqueador de FcγRIIb ou controle de isotipo e a porcentagem de diluição de CFSE de células T CD4 foi avaliada por citometria de fluxo. Os gráficos são representativos de pelo menos 6 doadores (Figura 5A, 5B) e 2 doadores (Figura 5C, 5D), cada um avaliado em experimentos independentes. Os gráficos mostram triplicados técnicos. Barras de erro indicam SEM. A análise estatística foi realizada pelo teste t de student. ***: p<0,001. O superagonismo de CD28 (SA) IgG4 depende da reticulação com FcγRIIb.

[00111] Nas Figuras 6A e 6B, é mostrada a proliferação de células T, isto é, a diluição CFSE de células T CD4 após 5 dias de estimulação com Fc original de tipo selvagem IgG4 CD28 (SA) (P1AE1975) ou CD28 (SA) com a mutação P329G-LALA (P1AD9289). As células T foram pré-cultivadas em alta densidade por 2 dias. Os gráficos são representativos de pelo menos 3 experimentos independentes. Triplicados técnicos são mostrados. O silenciamento de Fc elimina o superagonismo em TGN1412. Adicionar uma fração de direcionamento de tumor a TGN1412 silenciado por Fc restaura o superagonismo, que é então dependente da presença do tumor-alvo.

[00112] Nas Figuras 7A, 7B, 7C e 7D, uma comparação de agonistas de CD28 direcionados a FAP em diferentes formatos (2+2 e 1+2) e com ligantes superagonísticos (CD28(SA)) e ligantes agonísticos convencionais (9,3, CD28(CA)) é mostrada. Os agonistas de CD28 direcionados a FAP com ligantes agonísticos de CD28 convencionais não funcionam como superagonistas. As células T PBMC foram co-cultivadas com células 3T3-huFAP (FAP presente) na presença de concentrações crescentes dos formatos FAP-CD28 com ligantes superagonísticos (SA, Figura 7A) ou ligantes agonísticos convencionais (9,3, Figura 7B) por 5 dias. A proliferação de células T é mostrada. As células T PBMC foram, então, também co- cultivadas com células 3T3 WT (FAP ausente) na presença de concentrações crescentes dos formatos FAP-CD28 com ligantes superagonísticos (SA, Figura

7C) ou ligantes agonísticos convencionais (9,3, Figura 7D) por 5 dias. É representada a diluição de CFSE como medida para a proliferação de células T de células T CD8, avaliada por citometria de fluxo no dia 5 após a estimulação.

Os gráficos mostram dados cumulativos de 3 doadores em 3 experimentos independentes. Barras de erro mostram SEM. Na mesma configuração experimental, também as citocinas foram medidas a partir dos sobrenadantes após 2 dias de co-cultura. Os valores são fornecidos na Figura 7E.

[00113] A capacidade de FAP-CD28 em vários formatos com ligantes CD28(SA) superagonísticos ou ligantes agonísticos convencionais (CD28(CA)) para induzir a morte de células de melanoma RFP-MV3 que expressam FAP foi avaliada ao longo de 90h por imagem de células vivas com o uso da tecnologia IncuCyte. Todas as moléculas, incluindo o FAP-TCB (P1AD4645), foram usadas a 10 nM. As Figuras 8A, 8B e 8C mostram resultados representativos de três doadores com triplicados técnicos, respectivamente. A Figura 8D mostra os resultados cumulativos expressos como área sob a curva (AUC) em t = 90h de 3 doadores de 3 experimentos independentes. As caixas exibem os percentuais 25-75, pastilhas exibem o mínimo e o máximo. A análise estatística foi realizada por ANOVA pareada de 1 fator. ***: p<0,001, ns: não significativo.

[00114] Uma comparação de agonistas de CD28 direcionados a CEA em diferentes formatos com ligantes agonísticos superagonísticos e convencionais é mostrada em Figuras 9A e 9B. A capacidade de CEA-CD28 em vários formatos com ligantes CD28(SA) superagonísticos ou ligantes agonísticos convencionais (CD28(CA)) para induzir a morte de células de câncer gástrico RFP+ MKN45 que expressam CEA foi avaliada ao longo de 90h por imagem de células vivas com o uso da tecnologia IncuCyte. Todas as moléculas incluindo o CEACAM5-TCB (P1AD5299) foram usadas a 10 nM. A Figura 9A mostra resultados representativos de um doador com triplicados técnicos. A Figura 9B mostra a análise estatística de triplicados técnicos expressos como área sob a curva (AUC) em t = 90h de 1 doador em 1 experimento. As caixas exibem os percentuais 25-75, pastilhas exibem o mínimo e o máximo. A análise estatística foi realizada por ANOVA pareada de 1 fator. ***: p<0,001. É mostrado que os agonistas de CD28 direcionados a CEA com ligantes agonísticos de CD28 convencionais não se comportam de forma superagonista.

[00115] Nas Figuras 10A, 10B e 10C, mostra-se que os agonistas de CD28 direcionados com ligantes monovalentes superagonísticos não são funcionalmente superagonísticos. As células T PBMC foram co- cultivadas por 5 dias com células 3T3-huFAP na presença de concentrações crescentes de FAP-CD28 com ligantes CD28 bivalentes (P1AD9011, círculos fechados) ou FAP-CD28 com monovalência para ligação de CD28 (P1AD4492, círculos abertos). Na Figura 10A, a diluição de CFSE de células T CD8 é mostrada. Ademais, a ativação das células T foi avaliada pela detecção dos marcadores de ativação CD69 (Figura 10B) e CD25 (Figura 10C) por citometria de fluxo. A intensidade média de fluorescência (MFI) das colorações de CD69 e CD25 são mostradas 5 dias após a estimulação. São mostrados triplicados técnicos de 1 doador, as barras de erro indicam SEM. É mostrado que o superagonismo do tipo TGN1412 requer ligação de CD28 multivalente.

[00116] As Figuras 11A e 11B mostram que, se combinadas com anticorpos biespecíficos de células T (TCBs), as funções efetoras mediadas por TCB são suportadas pela ligação monovalente e bivalente de CD28 de moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonísticas direcionadas a FAP com potência comparável, mas a monovalência de ligante de CD28 é necessária para manter a dependência de alvo tumoral de Agonistas de CD28 na presença de TCBs. Na Figura 11A, para a presença de FAP, as células T PBMC foram incubadas com células de melanoma MV3 que expressam MCSP-

e FAP por 90h na presença de uma concentração limite combinada de MCSP- TCB (5 pM, P1AD2189) e concentração crescente (faixa de 0-10 nM) de FAP- CD28 (SA) com bivalente ou ligação monovalente a CD28, respectivamente. É representada a morte de células-alvo em 90h, conforme avaliado por imagem de células vivas com o uso da tecnologia IncuCyte. Na Figura 11B, células T PBMC foram co-cultivadas por 90h com células de câncer gástrico MKN45 expressando CEA FAP-negativas (FAP ausente) na presença de concentrações limitantes de CEACAM5-TCB (10 pM, P1AD5299) em combinação e concentração crescente (faixa 0-10 nM) de FAP-CD28 com ligação bivalente ou monovalente de CD28, respectivamente. É representada a morte de células-alvo em 90h, conforme avaliado por IncuCyte. Os dados mostram a morte de células alvo MKN45 ao longo do tempo, de 1 doador em 1 experimento, triplicados técnicos, barras de erro indicam SEM.

[00117] Nas Figuras 12A e 12B, é mostrado que FAP- CD28(SA) com ligação bivalente a CD28 perde a dependência de FAP quando combinado com células T biespecíficas. Na Figura 12A, nenhum TCB está presente. As células T PBMC foram co-cultivadas com CEA expressando MKN45 e 3T3-huFAP (condição “FAP presente”, círculos fechados) ou 3T3-WT (condição “FAP ausente”, círculos abertos), respectivamente, na presença de concentrações crescentes de FAP-CD28 (SA) 2+1. A combinação com TCB é mostrada na Figura 12B. As células T PBMC foram co-cultivadas com CEA expressando MKN45 e 3T3-huFAP (condição “FAP presente”, círculos fechados) ou 3T3-WT (condição “FAP ausente”, círculos abertos), respectivamente, na presença de concentrações limitantes de CEACAM5-TCB (10 pM, P1AD5299) e concentrações crescentes de FAP-CD28 2+1 SA. É mostrada a proliferação de células T CD8 após 5 dias de estimulação. Os dados são representativos de 2 experiências independentes com 2 doadores.

Os resultados de um doador são mostrados, os pontos de dados representam triplicados técnicos, as barras de erro indicam SEM.

[00118] As Figuras 13A, 13B e 13C mostram a funcionalidade de moléculas de ligação ao antígeno FAP-CD28(SA) com ligação monovalente a CD28 em diferentes formatos. A molécula C é um formato FAP-CD28(SA) clássico 1+1 (P1AD4492), a Molécula H é um formato FAP-CD28(SA) 1+1 “cabeça a cauda” (H2T) (P1AE2021), a Molécula I é um formato FAP-CD28(SA) 1+1 com fusão C-terminal do ligante FAP (P1AE2236) e a Molécula G é um formato FAP-CD28 (SA) 2+1 (P1AD5231). Como referência, foi usada a molécula de ligação ao antígeno CD28 bivalente (P1AD9011). As células T PBMC foram incubadas com células de melanoma MV3 que expressam MCSP e FAP na presença de concentração limite de MCSP-TCB (5 pM, P1AD2189) e concentração crescente (faixa de 0-10 nM) de FAP-CD28 nos formatos dados. É representada a diluição de CFSE como medida para a proliferação de células T de células T CD8 (Figura 13A) e CD4 (Figura 13B) após 5 dias, avaliada por citometria de fluxo. Figura 13C: É mostrado a morte de células MV3 ao longo de 84 horas na presença de 5 pM MCSP-TCB sozinho em comparação com a combinação de 5 pM MCSP-TCB e concentrações crescentes de FAP-CD28 nos vários formatos. A morte foi avaliada por imagens de células vivas usando o sistema IncuCyte. Todas as moléculas foram capazes de suportar funções efetoras mediadas por TCB. Os gráficos representam dados cumulativos de 3 experimentos independentes e 4 doadores 10 pM MCSP-TCB; E:T 20; Estatísticas: ANOVA Bidirecional. As estrelas indicam a concentração mais baixa na qual o complemento é significativo sobre o TCB sozinho: *p≤0,05, **p≤0,01; ***p≤0,001. Barras de erro indicam SEM.

[00119] A morte de células alvo do formato CEA-CD28 1+1 em combinação com TCB é mostrada na Figura 14. As células T PBMC foram co-cultivadas por 90h com células de câncer gástrico MKN45 que expressam

CEA na presença de concentrações limitantes de CEACAM5-TCB (10 pM, P1AD5299) em combinação com 2 nM de CEA-CD28 (P1AE3127) ou CD28 não direcionado (P1AD8944). Os dados mostram a morte de células alvo MKN45 ao longo do tempo, de 1 doador em 1 experimento. A morte foi avaliada por imagens de células vivas usando o sistema IncuCyte. É mostrado que apenas a combinação leva à morte das células-alvo, na concentração dada as moléculas sozinhas não induzem a morte. CEA-CD28 sinergiza com CEACAM5-TCB.

[00120] Na Figura 15, é mostrado que CEA-CD28 aumenta CEA-TCB e CEACAM5-TCB e reduz o limiar de expressão de CEA para TCBs induzir T ativação celular. As células T PBMC foram incubadas com concentrações crescentes de CEA-TCB (P1AD4646) ou CEACAM5-TCB (P1AD5299) e concentrações fixas de CEA-CD28 (P1AE3127) na presença de linhas de células alvo com diferentes níveis de expressão de CEA: (i) MKN45 (alta expressão, aprox. 400000 sítios de ligação de CEA/célula), (ii) Lovo (expressão média, aproximadamente 60000 sítios de ligação de CEA/célula), (iii) HT-29 (baixa expressão, aprox. 6000 sítios de ligação de CEA/célula). A proliferação de células T foi avaliada como proxy da ativação de células T por citometria de fluxo.

[00121] A ligação de variantes de ligante de CD28 com afinidade reduzida selecionada em um formato 1+1 monovalente direcionado a CEA biespecífico para CD28 nas células é mostrada na Figura 16. A intensidade média de fluorescência de ligação dos anticorpos CEA-CD28 ou anticorpo anti-DP47 (controle negativo) a células CHO que expressam CD28 humano (linha celular parental CHO-k1 ATCC n° CCL-61, modificada para superexpressar CD28 humano de forma estável) foi avaliada por fluxo citometria. São mostrados triplicados técnicos com SEM.

[00122] As Figuras 17A, 17B e 17C mostram a funcionalidade de variantes de ligante de CD28 com afinidade reduzida selecionadas em um formato 1+1 monovalente direcionado a CEA biespecífico.

As células T PBMC foram co-cultivadas com células de câncer gástrico MKN45 que expressam CEA na presença de concentrações limitantes de CEACAM5- TCB (10 pM, P1AD5299) em combinação com 2 nM das moléculas 1+1 CEA- CD28 com as variantes do ligante CD28. A proliferação de células T CD8 (Figura 17A) e a proliferação de células T CD4 (Figura 17B) foram avaliadas por diluição de CFSE por citometria de fluxo após 5 dias de co-cultura. A morte das células alvo foi avaliada após 90 horas de incubação (Figura 17C). Os dados mostram a morte de células alvo MKN45 ao longo do tempo, de 1 doador em 1 experimento. Todas as moléculas foram capazes de suportar funções efetoras mediadas por CEACAM5-TCB.

[00123] A Figura 18 mostra a ligação de variantes de CEA humanizado (A5B7) huIgG1 P329G LALA a MKN-45 em comparação com a ligação do anticorpo A5B7 murino parental. Os anticorpos foram detectados com um anticorpo secundário marcado com fluorescência e a fluorescência foi medida por citometria de fluxo.

[00124] As Figuras 19A a 19C são ilustrações esquemáticas das proteínas recombinantes exibindo diferentes domínios da proteína CEACAM5 que foram usadas como antígenos na campanha de exibição de fago. A Figura 19A mostra a construção NABA-avi-His que consiste nos 4 domínios similares a Ig N, A1, B e A2. A Figura 19B mostra a construção N(A2B2)A-avi-His e a Figura 19C ilustra a construção NA(B2)A-avi-His.

[00125] As Figuras 20A e 20B mostram as sequências VH e VL, respectivamente, do anticorpo CEA humanizado A5H1EL1D em que as posições randomizadas são marcadas com X.

[00126] Os desenhos esquemáticos dos vetores de fago das bibliotecas de maturação de afinidade são mostrados na Figura 21A (biblioteca de maturação de afinidade CDRH1/H2), Figura 21A (biblioteca de maturação de afinidade CDRL1/H2) e Figura 21A (biblioteca de amplificação CDRH3/CDRL3).

[00127] As Figuras 22A e 22B mostram um alinhamento das sequências de aminoácidos VH (Figura 22A) e sequências de aminoácidos VL (Figura 22B) das variantes de anticorpo CEA humanizado maturado por afinidade (A5H1EL1D).

[00128] Nas Figuras 23A a 23D ilustrações esquemáticas de moléculas de ligação ao antígeno CEA/CD28 biespecífico conforme descrito no Exemplo 11 são mostradas.

[00129] A Figura 23A mostra uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica CEA-CD28 no formato 1+1, em que o domínio CEA de ligação ao antígeno é representado como crossFab (troca VH/VL) e no fragmento Fab contendo o domínio de ligação ao antígeno CD28 lá são modificações carregadas a fim de apoiar o emparelhamento correto das cadeias leves. O domínio Fc tem modificações “knob into hole” e as mutações P329G LALA para anular a ligação aos receptores Fc. Na Figura 23B, o domínio de ligação ao antígeno CD28 é representado como crossFab (troca VH/VL) e o fragmento Fab com o domínio de ligação ao antígeno CEA compreende as modificações carregadas.

[00130] A Figura 23C ilustra uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica CEA-CD28 no formato 2+1, em que o domínio de ligação ao antígeno CD28 é representado como crossFab e dois fragmentos Fab com domínios CEA de ligação ao antígeno são fundidos um ao outro através da cadeia pesada (cabeça com cauda).

[00131] A Figura 23D ilustra uma molécula de ligação ao antígeno CEA-CD28 biespecífico no formato 2+1, em que o domínio de ligação ao antígeno CD28 é representado como crossFab que é fundido em seu C-

terminal ao N-terminal de uma das cadeias pesadas do anticorpo CEA “bivalente” (formato “clássico”).

[00132] Na Figura 24 é mostrado que o clone P002.139 anti- CEA maturado por afinidade mostra ligação melhorada a CEACAM5 em células MV3 que expressam CEA. É mostrada a ligação de anticorpos biespecíficos CEA-CD28 que transportam o clone P002.139 anti-CEA maturado por afinidade ou o clone parental A5H1EL1D. A intensidade média de fluorescência de ligação dos anticorpos biespecíficos CEA-CD28 ou anticorpo anti-DP47 (controle negativo) a células MV3 geneticamente modificadas para expressar CEACAM5 humano foi avaliada por citometria de fluxo. São mostrados duplicados técnicos com SEM. O gráfico é representativo de 3 experimentos independentes.

[00133] Nas Figuras 25A e 25B, mostra-se que o clone P002.139 anti-CEA maturado por afinidade mostra funcionalidade melhorada em um ensaio repórter IL-2. É mostrada a leitura de luminescência após 6h de co-incubação de células MKN45, células repórter IL-2 com 5 nM CEA-TCB e CEA-CD28 carregando o clone maturado por afinidade P002.139 ou o clone parental A5H1EL1D. A Figura 25A mostra resposta à dose. A linha pontilhada indica luminescência alcançada por CEA-TCB sozinho. Na Figura 25B, os valores da Área sob a curva calculados a partir dos dados representados na Figura 25A são mostrados. São fornecidos duplicados técnicos com SEM. O gráfico é representativo de 3 experimentos independentes.

[00134] A Figura 26 mostra o projeto de estudo de um estudo de eficácia com anticorpos biespecíficos CEA-CD28 (comparação de diferentes clones CEA) em combinação com CEA TCB em Xenoenxerto MKN45 em camundongos humanizados. São mostrados o desenho e os diferentes grupos de tratamento.

[00135] As Figuras 27A a 27E mostram resultados do estudo de eficácia com a combinação CEA-CD28 e CEA TCB no Xenoenxerto MKN45 em camundongos humanizados. É mostrado o volume médio do tumor (Figura 27A) ou o crescimento de tumores em camundongos individuais para os quatro grupos de tratamento, conforme representado no eixo y (Figura 27B a 27E). A Figura 27B mostra o crescimento do tumor para cada camundongo individual no grupo de veículo, Figura 27C dos camundongos tratados com CEA TCB sozinho, Figura 27D de camundongos tratados com CEA TCB e CEA (T84.66) -CD28 (SA_Variante 15) e Figura 27E de camundongos tratados com CEA TCB e CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA_Variante 15). Pode-se observar que há aumento da regressão tumoral mediada por TCB na presença de ambos os anticorpos biespecíficos CEA-CD28.

[00136] A Figura 28 mostra o projeto de estudo de um estudo de eficácia com anticorpos biespecíficos CEA-CD28 (comparação de diferentes clones Cd28) em combinação com CEACAM5 TCB em Xenoenxerto BXPC3 em camundongos humanizados. São mostrados o desenho e os diferentes grupos de tratamento.

[00137] A Figura 29 mostra a cinética de crescimento do tumor (média, +SEM) para todos os grupos de tratamento, os valores de TGI correspondentes de cada braço de tratamento são mostrados na Tabela 33 (Exemplo 13.2).

[00138] Os ados Immuno-PD ex vivo são mostrados nas Figuras 30A a 30D. A Figura 30A mostra gráficos de pontos representativos (CD3 contra CD45 e CD4 contra CD8) das suspensões de células únicas de tumor coradas de cada braço de tratamento. O resumo da infiltração de células T CD3, CD8 e CD4 está representado na Figura 30B (CD3), Figura 30C (CD8) e Figura 30D (CD4), respectivamente.

[00139] A Figura 31 mostra o projeto de estudo de um estudo de eficácia com anticorpo biespecífico CEA-CD28 (CEA (A5H1EL1D) -

CD28 (SA_Variante 8)) em combinação com CEA TCB em Xenoenxerto MKN45 em camundongos humanizados. São mostrados o desenho e os diferentes grupos de tratamento.

[00140] A Figura 32 mostra a cinética de crescimento do tumor (média, +SEM) para todos os grupos de tratamento, os valores de TGI correspondentes de cada braço de tratamento são mostrados na Tabela 35 (Exemplo 13.3).

[00141] Os dados Immuno-PD ex vivo são mostrados nas Figuras 33A e 33B. A Figura 33A mostra gráficos de pontos representativos das suspensões de células únicas de tumor coradas de cada braço de tratamento. O resumo da infiltração de células T CD3+ é descrito na Figura 33B.

[00142] Nas Figuras 34A a 34D ilustrações esquemáticas de moléculas de ligação ao antígeno CD28 biespecífico conforme descrito no Exemplo 14 são mostradas.

[00143] A Figura 34A mostra uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica EpCAM-CD28 no formato 1+1, em que o domínio de ligação ao antígeno CD28 é representado como crossFab (troca VH/VL) e no fragmento Fab contendo o domínio de ligação ao antígeno EpCAM têm modificações carregadas a fim de apoiar o emparelhamento correto das cadeias leves. O domínio Fc tem modificações “knob into hole” e as mutações P329G LALA para anular a ligação aos receptores Fc.

[00144] Na Figura 34B, o Fab com o domínio de ligação ao antígeno CD28 compreende modificações carregadas e o Fab com o domínio de ligação ao antígeno HER3 é representado como crossFab (troca VH/VL).

[00145] A Figura 34C ilustra uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica CD30-CD28 no formato 1+1, em que a molécula Fab contendo o domínio de ligação ao antígeno CD28 compreende modificações carregadas e o Fab contendo o domínio de ligação ao antígeno CD30 é representado como crossFab (troca VH/VL).

[00146] A Figura 34D ilustra uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica TPBG-CD28 no formato 1+1, em que a molécula Fab contendo o domínio de ligação ao antígeno CD28 compreende modificações carregadas e o Fab contendo o domínio de ligação ao antígeno TPBG (5T4) é representado como crossFab (troca VH/VL).

[00147] As Figuras 35A a 35C se referem à caracterização funcional de moléculas de ligação ao antígeno biespecífico EpCAM-CD28. Na Figura 35A, é mostrado que EpCAM-CD28 (Molécula 14A) se liga a CD28 humano em células CHO-k1 que expressam CD28, avaliada por citometria de fluxo. A ligação a EpCAM em células HT29, avaliada por citometria de fluxo, é mostrada na Figura 35B. O anti-DP47 serviu como controle negativo para a ligação inespecífica de compostos de anticorpos às células. Os pontos representam meios de duplicatas técnicas. Na Figura 35C, é mostrado que EpCAM-CD28 (P1AE9051) aumenta as respostas das células T ao estímulo anti-CD3 no ensaio do repórter IL-2. É mostrada a ativação da célula repórter IL-2 medida por leitura de luminescência após 6 horas de co-incubação com HT-29 na presença de concentrações subótimas de IgG anti-CD3 (10 nM) e concentrações crescentes de EpCAM-CD28. Os pontos representam meios de duplicatas técnicas.

[00148] As Figuras 36A a 36C se referem à caracterização funcional de moléculas de ligação ao antígeno biespecífico HER3-CD28. Na Figura 36A, é mostrado que HER3-CD28 (P1AF0151) se liga a CD28 humano em células CHO-k1 que expressam CD28, avaliada por citometria de fluxo. A ligação de HER3-CD28 a HER3 em células T-47D, avaliada por citometria de fluxo, é mostrada na Figura 36B. O anti-DP47 serviu como controle negativo para a ligação inespecífica de compostos de anticorpos às células. Os pontos são meios de duplicatas técnicas. Na Figura 36C, é mostrado que HER3-CD28 (P1AF0151) aumenta as respostas das células T ao estímulo anti-CD3 no ensaio do repórter IL-2. É mostrada a ativação da célula repórter IL-2 medida por leitura de luminescência após 6 horas de co-incubação com células T-47D na presença de concentrações subótimas de IgG anti-CD3 clone OKT3 (10 nM) e concentrações crescentes de EpCAM-HER3-CD28. Os pontos representam meios de duplicatas técnicas.

[00149] Nas Figuras 37A a 37C, são mostradas ilustrações esquemáticas de moléculas de ligação ao antígeno CD28 biespecíficas direcionadas a um antígeno de superfície celular de Mieloma Múltiplo (MM), conforme descrito no Exemplo 16.

[00150] A Figura 37A mostra uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica GPRC5D-CD28 no formato 1+1, em que o domínio CD28 de ligação ao antígeno é representado como crossFab (troca VH/VL) e no fragmento Fab contendo o domínio de ligação ao antígeno CPRC5D lá são modificações carregadas a fim de apoiar o emparelhamento correto das cadeias leves. O domínio Fc tem modificações “knob into hole” e as mutações P329G LALA para anular a ligação aos receptores Fc.

[00151] Na Figura 37B, o Fab com o domínio de ligação ao antígeno CD28 compreende modificações carregadas e o Fab com o domínio de ligação ao antígeno CD38 é representado como crossFab (troca VH/VL).

[00152] A Figura 37C ilustra uma molécula de ligação ao antígeno biespecífico BCMA-CD28 em formato 1+1, em que a molécula Fab que carrega o domínio de ligação ao antígeno CD28 é representada como crossFab (troca VH/VL) e o Fab que carrega o domínio de ligação ao antígeno BCMA compreende modificações carregadas.

[00153] A Figura 37D ilustra o anticorpo biespecífico anti- GPRC5D/anti-CD3 (GPRC5D TCB) em formato 2+1, em que as moléculas Fab que carregam o domínio de ligação ao antígeno GPCR5D compreendem modificações carregadas e o Fab que carrega o domínio de ligação ao antígeno CD3 está representado como crossFab (troca VH/VL).

[00154] As Figuras 38A a 38F se referem à ligação de moléculas de ligação de antígeno biespecíficas direcionadas a CD28 e um antígeno de superfície celular de Mieloma Múltiplo (MM) a células (Exemplo

17.1). É mostrada a ligação de moléculas de ligação de antígeno biespecífico a CD28 humano em células CHO huCD28 cl45 (Figuras 38A e 38E), a CD38 humano em células OCI-Ly18 (Figura 38B), BCMA humano (antígeno de maturação de células B, Figura 38C) em células IM-9 e para GPRC5D humano em células CHO huGPRC5D L2 (Figuras 38D e 38F) expressas nas linhas celulares indicadas. São representados valores de fluorescência mediana relativa (MFI) de duplicatas com SD. Os valores de EC50 de ligação foram calculados por GraphPadPrism e estão incluídos na Tabela 38.

[00155] A ativação de células T de moléculas de ligação ao antígeno biespecífico direcionadas a CD28 e um antígeno de superfície celular de mieloma múltiplo (MM) conforme avaliado no ensaio repórter IL-2 é mostrado nas Figuras 39A a 39F. É mostrado o ensaio de células repórter IL2 após 5 e 22 horas de incubação, conforme determinado por luminescência. As células efetoras do repórter IL2 e as células alvo que expressam GPRC5D foram incubadas em uma proporção efetor para alvo (E:T) de 5:1. GPRC5D- TCB foi adicionado a uma concentração de ensaio final fixa de 1 nM, as moléculas de ligação ao antígeno biespecífico CD28 direcionadas a MM indicadas foram tituladas como indicado. Curvas de dose-resposta representativas são representadas para CD38-CD28 na Figura 39A (após 5 horas de incubação) e Figura 39B (após 22 horas), para BCMA-CD28 na Figura 39C (após 5 horas) e Figura 39D (após 22 horas) e para GPRC5D- CD28 na Figura 39E (após 5 horas) e Figura 39F (após 22 horas de incubação).

[00156] As Figuras 40A a 40C mostram o aumento da lise mediada por células T da linha celular NCI-H929 de MM que expressa GPRC5D na presença de 0,2 nM das moléculas biespecíficas CD28 indicadas CD38-CD28 (Figura 40A), BCMA-CD28 (Figura 40B) e GPRC5D-CD28 (Figura 40C). A lise foi determinada após a co-incubação de células T-pan humanas e células-alvo de tumor MM em uma razão E:T final de 1:1 por 22 horas. São retratados duplicados técnicos com SD. Os valores de EC50 e os valores da área sob os valores da curva de lise das células tumorais foram calculados por GraphPadPrism e são representados na Tabela 39.

[00157] A Figura 41A mostra uma ilustração esquemática de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica de CD19-CD28 no formato 1+1, conforme descrito no Exemplo 18, em que no Fab que compreende o domínio de ligação ao antígeno CD19 os domínios VH e VL são trocados entre si (crossfab VH/VL) e em que no Fab que compreende o domínio de ligação ao antígeno CD28 certos aminoácidos no domínio CH1 e CL são trocados (variantes de carga) para permitir um melhor emparelhamento com a cadeia leve. A Figura 41B mostra uma molécula correspondente em que o domínio de ligação ao antígeno CD19 foi substituído por um domínio de ligação ao antígeno CD79b (crossfab anti-CD79b).

[00158] A Figura 42 se refere à determinação de parâmetros cinéticos e termodinâmicos de CD79b (polatuzumabe) no construto CD79b (huMA79b.v28)-CD28 (v15) 1+1. CD79b-His recombinante solúvel foi capturado no chip CM5 através de um anticorpo anti-penta-His e CD79b bi- específico (huMA79b.v28) - CD28 (v15) 1+1 foi usado como analito. As linhas suaves representam um ajuste global dos dados para um modo de interação 1:1.

[00159] Na Figura 43A, são mostradas as intensidades médias de fluorescência (MFI) de ligação de CD19-CD28 variante 15 (P1AE9040) a quatro linhas de células B diferentes que expressam níveis diferentes de CD19. A ligação foi avaliada por citometria de fluxo. São mostrados duplicados técnicos com SEM. Na Figura 43B, a coloração FACS para CD19 das quatro diferentes linhas de células B (MFI) é representada.

[00160] A ligação de CD19-CD28 com diferentes afinidades de CD28 para CD19 e CD28 humano nas células é mostrada nas Figuras 44A e 44B. As intensidades médias de fluorescência (MFI) de ligação a células CHOk1-CD28 (Figura 44A) e de ligação a CD19 em células B Nalm6 (Figura 44B) são mostradas. Pontos representam duplicados técnicos com SEM. Os valores EC50 correspondentes são mostrados na Tabela 42 (CHOk1-CD28) e na Tabela 43 (Nalm6) do Exemplo 20. A ligação foi avaliada por citometria de fluxo.

[00161] Nas Figuras 45A a 45D, mostra-se que o CD19- CD28v15 aumenta o CD20-TCB no ensaio do repórter IL-2 na presença de diferentes linhas de células B. É mostrada a ativação da célula repórter IL-2 medida por leitura de luminescência (LUM) após 6 horas de co-incubação com diferentes linhas de células B na presença de concentrações subótimas de CD20-TCB e concentrações crescentes de CD19-CD28v15. Pontos representam duplicados técnicos com SEM. A concentração subótima de CD20-TCB difere com as linhas de células alvo: 10 nM para Nalm6, 0,05 nM para RCK8, WSU DLCL2 e Z138.

[00162] A Figura 46 ilustra que CD19-CD28 com várias afinidades CD28 aumenta a T ativação celular mediada por CD20-TCB. É mostrada a ativação da célula repórter IL-2 medida por leitura de luminescência (LUM) após 6 horas de co-incubação com células Nalm6 B na presença de concentrações subótimas de CD20-TCB (10 nM) e concentrações crescentes de CD19-CD28v15. Pontos representam duplicados técnicos com SEM.

[00163] O status de ativação de células T derivadas de PBMC após co-cultura com células alvo que expressam CD20 (Nalm6) (razão E:T 5:1) e CD19-CD28 na ausência ou presença de CD20-TCB foi avaliado. A atividade de CD19-CD28 na ausência ou presença de sinais de TCR é mostrada na Figura 47. É mostrada a expressão de CD69 de células T CD4 derivadas de PBMC após 48h de co-incubação com células Nalm6, aumentando as concentrações de CD19-CD28v15 na presença ou ausência de CD20-TCB 10 nM. Pontos representam triplicados técnicos com SEM.

[00164] Nas Figuras 48A a 48D, é ilustrado que o CD19- CD28 sozinho não induz a secreção de citocinas em PBMCs. É mostrada a liberação de citocinas em PBMCs inteiros após 48 horas de co-cultura com moléculas de CD19-CD28 na presença ou ausência de CD20-TCB. As barras representam a média +SEM de triplicados técnicos. Os dados são representativos de 2 doadores. A secreção de citocinas foi avaliada por Ensaio Bio-Plex Pro Human Cytokine 17-plex. São mostrados IFN (Figura 48A), IL-2 (Figura 48B), IL-10 (Figura 48C), e TNF (Figura 48D).

[00165] Nas Figuras 49A e 49B, os dados funcionais relacionados com CD79b-CD28 são mostrados para aumentar o CD20-TCB no ensaio do repórter IL-2 na presença de células B Z138. Na Figura 49A, as intensidades médias de fluorescência (MFI) de ligação a CD79b em células B Z138 são mostradas. Na Figura 49B, mostra-se que o CD79b-CD28 aumenta o CD20-TCB no ensaio do repórter IL-2 na presença de células B Z138. É mostrada a ativação da célula repórter IL-2 medida por leitura de luminescência (LUM) após 6 horas de co-incubação com diferentes linhas de células B na presença de concentrações subótimas de CD20-TCB e concentrações crescentes de CD79b-CD28. Pontos representam duplicados técnicos com SEM.

[00166] A Figura 50 mostra o projeto de estudo de um estudo de eficácia com anticorpos biespecíficos CD19-CD28 (comparação de dois diferentes clones Cd28) em Xenoenxerto NALM6 em camundongos humanizados. São mostrados o desenho e os diferentes grupos de tratamento.

[00167] As Figuras 51A a 51D mostram resultados do estudo de eficácia com CD19-CD28 no Xenoenxerto NALM6 em camundongos humanizados. É mostrado o volume médio do tumor (Figura 51A) ou o crescimento de tumores em camundongos individuais para os três grupos de tratamento, conforme representado no eixo y (Figura 51B a 51D). A Figura 51B mostra o crescimento do tumor para cada camundongo individual no grupo de veículo, a Figura 51C dos camundongos tratados com CD19-CD28 (variante 15) e a Figura 51D de camundongos tratados com CD19-CD28 (variante 8). Pode ser visto que CD19-CD28 (variante 8) como um único agente induziu inibição do crescimento tumoral mais forte em comparação com CD19- CD28 (variante 15).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES

[00168] Salvo indicação em contrário, os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que os geralmente usados na técnica à qual esta invenção pertence. Para fins de interpretação deste relatório descritivo, as seguintes definições serão aplicadas e, sempre que apropriado, os termos usados no singular também incluirão o plural e vice-versa.

[00169] Como usado no presente documento, o termo “molécula de ligação ao antígeno” se refere, no seu sentido mais amplo, a uma molécula que se liga especificamente a um determinante antigênico. Exemplos de moléculas de ligação ao antígeno são anticorpos, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), fragmentos de anticorpos e proteínas de ligação ao antígeno de arcabouço.

[00170] Como usado no presente documento, o termo “domínio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor” ou “fração capaz de ligação específica a um antígeno associado ao tumor” se refere a uma molécula de polipeptídeo que se liga especificamente a um determinante antigênico. Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno é capaz de ativar a sinalização através de seu antígeno de célula alvo. Em um aspecto particular, o domínio de ligação ao antígeno é capaz de direcionar a entidade à qual está ligado (por exemplo, o anticorpo CD28) para um sítio alvo, por exemplo, para um tipo específico de célula tumoral ou estroma tumoral contendo o determinante antigênico. Os domínios de ligação ao antígeno que se ligam especificamente ao PD1 ou ao LAG3 incluem anticorpos e fragmentos dos mesmos, conforme definido no presente documento adicionalmente. Além disso, os domínios de ligação ao antígeno capazes de ligação específica a um antígeno de célula alvo incluem proteínas de ligação ao antígeno estruturadas, conforme definido adicionalmente no presente documento, por exemplo, domínios de ligação que são baseados em proteínas de repetição projetadas ou domínios de repetição projetados (consulte, por exemplo, o documento WO 2002/020565).

[00171] Em relação a uma molécula de ligação ao antígeno, ou seja, um anticorpo ou fragmento do mesmo, o termo “domínio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno da célula alvo” se refere à parte da molécula que compreende a área que se liga especificamente e é complementar à parte ou tudo de um antígeno. Um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação ao antígeno específica pode ser fornecido, por exemplo, por um ou mais domínios variáveis de anticorpo (também chamados de regiões variáveis de anticorpo). Particularmente, um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica ao antígeno compreende uma região variável da cadeia leve de anticorpo (VL) e uma região variável da cadeia pesada de anticorpo (VH). Em outro aspecto, o “domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado ao tumor” também pode ser um fragmento Fab ou um fragmento crossFab. Em outro aspecto, o “domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado ao tumor” também pode ser um fragmento Fab ou um fragmento crossFab. Conforme usado no presente documento, os termos “primeiro”, “segundo” ou “terceiro” com respeito aos domínios de ligação ao antígeno, etc., são usados por conveniência de distinguir quando há mais de um de cada tipo de fração. O uso desses termos não se destina a conferir uma ordem ou orientação específica da metade, a menos que explicitamente declarado.

[00172] Como usado no presente documento, o termo “domínio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno de superfície de célula B” ou “fração capaz de ligação específica a um antígeno de superfície de célula B” se refere a uma molécula de polipeptídeo que se liga especificamente a um determinante antigênico na superfície de célula B. Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno é capaz de ativar a sinalização através de seu antígeno de célula alvo. Em um aspecto particular, o domínio de ligação ao antígeno é capaz de direcionar a entidade à qual está ligado (por exemplo, o agonista de CD28) para um sítio alvo, por exemplo, na célula B. Os domínios de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a uma superfície de célula B incluem anticorpos e fragmentos dos mesmos, conforme definido no presente documento adicionalmente. Além disso, os domínios de ligação ao antígeno capazes de ligação específica a um antígeno de superfície de célula B incluem proteínas de ligação ao antígeno estruturadas, conforme definido adicionalmente no presente documento, por exemplo, domínios de ligação que são baseados em proteínas de repetição projetadas ou domínios de repetição projetados (consulte, por exemplo, o documento WO 2002/020565).

[00173] O termo “domínio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno de superfície celular de mieloma múltiplo (MM)” ou “fração capaz de ligação específica a um antígeno de superfície celular de mieloma múltiplo (MM)” se refere a uma molécula de polipeptídeo que se liga especificamente a um determinante antigênico em célula de Mieloma Múltiplo (MM). Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno é capaz de ativar a sinalização através de seu antígeno de célula alvo. Em um aspecto particular, o domínio de ligação ao antígeno é capaz de direcionar a entidade à qual está ligado (por exemplo, o agonista de CD28) para um sítio alvo, por exemplo, na célula MM. Os domínios de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a uma superfície de célula de Mieloma Múltiplo (MM) incluem anticorpos e fragmentos dos mesmos, conforme definido no presente documento adicionalmente. Além disso, os domínios de ligação ao antígeno capazes de ligação específica a um antígeno de superfície de célula B incluem proteínas de ligação ao antígeno estruturadas, conforme definido adicionalmente no presente documento, por exemplo, domínios de ligação que são baseados em proteínas de repetição projetadas ou domínios de repetição projetados (consulte, por exemplo, o documento WO 2002/020565).

[00174] O termo “anticorpo” é usado no presente documento no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpos, incluindo, mas não se limitando a, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos monoespecíficos e multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpo desde que exibam a atividade de ligação ao antígeno desejada.

[00175] O termo “anticorpo monoclonal”, conforme usado no presente documento, se refere a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo,

exceto para possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou surgindo durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estando presentes em quantidades menores. Em contraste a preparações de anticorpo policlonal, que normalmente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante em um antígeno.

[00176] O termo anticorpo “monoespecífico”, conforme usado no presente documento, denota um anticorpo que tem um ou mais sítios de ligação, cada um dos quais se liga ao mesmo epítopo do mesmo antígeno.

O termo “biespecífico” significa que a molécula de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a pelo menos dois determinantes antigênicos distintos. Normalmente, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende dois sítios de ligação ao antígeno, cada um dos quais é específico para um determinante antigênico diferente. No entanto, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífico pode também compreender sítio de ligação ao antígeno adicionais que se ligam a outros determinantes antigênicos. Em certos aspectos, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica é capaz de simultaneamente ligar dois determinantes antigênicos, particularmente dois determinantes antigênicos expressos em duas células distintas ou na mesma célula. O termo “biespecífico” de acordo com a presente invenção, portanto, também pode incluir uma molécula triespecífica, por exemplo, uma molécula biespecífica que compreende um anticorpo CD28 e dois domínios de ligação ao antígeno direcionados a dois antígenos de células alvo diferentes.

[00177] O termo “valente”, conforme usado no presente pedido, denota a presença de um número especificado de sítios de ligação específicos para um determinante antigênico distinto em uma molécula de ligação ao antígeno que são específicos para um determinante antigênico distinto. Como tal, os termos “bivalente”, “tetravalente” e “hexavalente” denotam a presença de dois sítios de ligação, quatro sítios de ligação e seis sítios de ligação, respectivamente, em uma molécula de ligação ao antígeno. Em aspectos particulares da invenção, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas de acordo com a invenção podem ser monovalentes para um certo determinante antigênico, o que significa que elas têm somente um sítio de ligação para o referido determinante antigênico ou podem ser bivalentes ou tetravalentes para um certo determinante antigênico, o que significa que elas têm dois sítios de ligação ou quatro sítios de ligação, respectivamente, para o referido determinante antigênico.

[00178] Os termos “anticorpo de comprimento total”, “anticorpo intacto” e “anticorpo completo” são usados no presente documento de forma intercambiável para se referirem a um anticorpo tendo uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura de anticorpo nativo. “Anticorpos nativos” se referem às moléculas de imunoglobulina de ocorrência natural com estruturas variáveis. Por exemplo, anticorpos nativos da classe IgG são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150000 daltons, compostas por duas cadeias leves e duas cadeias pesadas que são ligadas por dissulfureto.

Do N-terminal ao C-terminal, cada cadeia pesada tem uma região variável (VH), também chamada de domínio variável pesado ou domínio variável de cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3), também chamados de região constante de cadeia pesada. Similarmente, do N- terminal ao C-terminal, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também chamada de domínio variável leve ou um domínio variável de cadeia leve, seguido por um domínio constante de cadeia leve (CL), também chamado de região constante de cadeia leve. A cadeia pesada de um anticorpo pode ser atribuída a um de cinco tipos, denominados α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) ou μ (IgM), alguns dos quais podem ser divididos em subtipos, por exemplo γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1 (IgA1) e α2 (IgA2). A cadeia leve de um anticorpo pode ser atribuída a um dentre dois tipos, denominados capa (κ) e lambda (λ), com base na sequência de aminoácidos do seu domínio constante.

[00179] Um “fragmento de anticorpo” se refere a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga.

Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, sem limitação Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; diacorpos, triacorpos, tetracorpos, fragmentos de crossFab; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples (por exemplo, scFv); e anticorpos de domínio único. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpo, consulte Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Para uma revisão de fragmentos scFv, consulte, por exemplo, Plückthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova York, páginas 269-315 (1994); consulte também o documento WO 93/16185; e Patentes nº US 5.571.894 e 5.587.458. Para discussão de fragmentos Fab e F(ab’)2 que compreendem resíduos de epítopo de ligação ao receptor de recuperação e que tem semivida in vivo aumentada, consulte a Patente nº US 5.869.046. Diacorpos são fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos, consulte, por exemplo, EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al. Nat Med 9, 129-134 (2003); e Hollinger e outros, Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos são também descritos em Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo que compreendem toda ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada ou toda ou uma porção do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; consulte, por exemplo, a Patente nº US 6.248.516 B1). Os fragmentos de anticorpos podem ser preparados por várias técnicas, incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como a produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coli ou fago), conforme descrito no presente documento.

[00180] A digestão com papaína de anticorpos intactos produz dois fragmentos idênticos de ligação ao antígeno, chamados fragmentos “Fab” contendo cada um dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve e também o domínio constante de cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) de cadeia pesada. Conforme usado no presente documento, assim, o termo “fragmento Fab” se refere a um fragmento de anticorpo que compreende um fragmento de cadeia leve que compreende um domínio de cadeia leve variável (VL) e um domínio constante de uma cadeia leve (CL) e um domínio de cadeia pesada variável (VH) e um primeiro domínio constante (CH1) de uma cadeia pesada. Os fragmentos Fab’ diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no carbóxi-terminal do domínio CH1 de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo.

Fab’-SH são fragmentos Fab’ em que o resíduo (ou resíduos) de cisteína dos domínios constantes contém um grupo tiol livre. O tratamento com pepsina origina um fragmento F(ab’)2 que tem dois sítios de combinação ao antígeno (dois fragmentos Fab) e uma parte da região Fc.

[00181] O termo “fragmento crossFab” ou “fragmento xFab” ou “fragmento Fab reticulado” se refere a um fragmento Fab, em que as regiões variáveis ou as regiões constantes da cadeia pesada e leve são trocadas. Duas composições de cadeia diferentes de uma molécula de Fab reticulado são possíveis e compreendidas nos anticorpos biespecíficos da invenção: Por um lado, as regiões variáveis da cadeia pesada e leve de Fab são trocadas, ou seja, a molécula de Fab reticulado compreende uma cadeia peptídica composta pela região varável de cadeia leve (VL) e pela região constante de cadeia pesada (CH1) e um cadeia peptídica composta pelo domínio variável de cadeia pesada (VH) e pelo domínio constante de cadeia leve (CL). Essa molécula de Fab reticulado também é referida como CrossFab (VLVH). Por outro lado, quando as regiões constantes de cadeia pesada e leve de Fab são trocadas, a molécula de Fab reticulado compreende uma cadeia peptídica composta pelo domínio variável de cadeia pesada (VH) e pelo domínio constante de cadeia leve (CL) e uma cadeia peptídica composta pelo domínio variável de cadeia leve (VL) e pelo domínio constante da cadeia pesada (CH1). Esta molécula de Fab reticulado também é referida como CrossFab (CLCH1).

[00182] Um “fragmento Fab de cadeia simples” ou “scFab” é um polipeptídeo que consiste em um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH), um domínio constante de anticorpo 1 (CH1), um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL), um domínio constante da cadeia leve de anticorpo (CL) e um ligante, em que os referidos domínios de anticorpo e o referido ligante têm uma das seguintes ordens na direção do N-terminal para o C-terminal: a) VH-CH1-ligante-VL-CL, b) VL-CL-ligante-VH-CH1, c) VH-CL- ligante-VL-CH1 ou d) VL-CH1-ligante-VH-CL; e em que o referido ligante é um polipeptídeo de pelo menos 30 aminoácidos, de preferência, entre 32 e 50 aminoácidos. Os referidos fragmentos Fab de cadeia simples são estabilizados através da ligação dissulfeto natural entre o domínio CL e o domínio CH1.

Adicionalmente, essas moléculas de Fab de cadeia simples podem ser ainda estabilizadas por geração de ligações dissulfeto intercadeia através da inserção de resíduos de cisteína (por exemplo, posição 44 na cadeia pesada variável e posição 100 na cadeia leve variável de acordo com a numeração de Kabat).

[00183] Um “fragmento Fab reticulado de cadeia simples” ou

“x-scFab” é um polipeptídeo que consiste em um domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo, um domínio constante de anticorpo 1 (CH1), um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL), um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL) e um ligante, em que os referidos domínios de anticorpo e o referido ligante têm uma das seguintes ordens na direção N- terminal para C-terminal: a) VH-CL-ligante-VL-CH1 e b) VL-CH1-ligante-VH-CL; em que VH e VL formam em conjunto um domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um antígeno e em que o referido ligante é um polipeptídeo de pelo menos 30 aminoácidos. Adicionalmente, essas moléculas de x-scFab de cadeia simples podem ser ainda estabilizadas por geração de ligações dissulfeto intercadeia através da inserção de resíduos de cisteína (por exemplo, posição 44 na cadeia pesada variável e posição 100 na cadeia leve variável de acordo com a numeração de Kabat).

[00184] Um “fragmento variável de cadeia simples (scFv)” é uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (VL) de um anticorpo, conectada a um peptídeo ligante curto de dez a cerca de 25 aminoácidos. O ligante é geralmente rico em glicina para flexibilidade, bem como serina ou treonina para solubilidade, e pode conectar os N-terminais da VH com os C-terminais da VL, ou vice-versa. Essa proteína retém a especificidade do anticorpo original, apesar da remoção das regiões constantes e da introdução do ligante. Os anticorpos scFv são, por exemplo, descritos em Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96). Adicionalmente, os fragmentos de anticorpo compreendem polipeptídeos de cadeia simples com as características de um domínio VH, a saber, capazes de se reunirem com um domínio VL, ou de um domínio VL, a saber, capazes de se reunirem com um domínio VH a um sítio funcional de ligação ao antígeno e, desse modo, fornecendo a propriedade de ligação ao antígeno de anticorpos de comprimento total.

[00185] “Proteínas de suporte (scaffold) de ligação ao antígeno” são conhecidas na técnica, por exemplo, fibronectina e proteínas de repetição de anquirina (DARPins) têm sido usadas como suportes alternativos para domínios de ligação ao antígeno, consulte, por exemplo, Gebauer e Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.

Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009) e Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008).

Em um aspecto da invenção, uma proteína de suporte de ligação ao antígeno é selecionada a partir do grupo que consiste em CTLA-4 (Evibody), Lipocalinas (Anticalin), uma molécula derivada da Proteína A, como o domínio Z da Proteína A (Afficorpo), um Domínio A (Avímero/Maxicorpo), uma transferrina sérica (trans-corpo); uma proteína repetida de anquirina (DARPin), um domínio variável de cadeia leve ou cadeia pesada de anticorpo (anticorpo de domínio único, sdAb), um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (nanocorpo, aVH), fragmentos VNAR, uma fibronectina (AdNectin) um domínio de lectina do tipo C (Tetranectina); um domínio variável de um novo receptor de antígeno beta-lactamase (fragmentos VNAR), uma gama-cristalina ou ubiquitina humana (moléculas de Affilin); um domínio do tipo kunitz de inibidores de proteases humanas, microcorpos, como as proteínas da família knottina, aptâmmeros de peptídeo e fibronectina (adnectina). CTLA-4 (Antígeno 4 Associado ao Linfócito T Citotóxico) é um receptor da família CD28 expresso principalmente em células T CD4+. Seu domínio extracelular tem uma dobra Ig semelhante a um domínio variável. As alças (loops) correspondentes às CDRs de anticorpos podem ser substituídas por sequência heteróloga para conferir diferentes propriedades de ligação. As moléculas de CTLA-4 manipuladas para terem diferentes especificidades de ligação são também conhecidas como Evibodies (por exemplo, US7166697B1). Os Evicorpos estão em torno do mesmo tamanho que a região variável isolada de um anticorpo (por exemplo, um anticorpo de domínio). Para detalhes adicionais, consulte Journal of

Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001). As lipocalinas são uma família de proteínas extracelulares que transportam pequenas moléculas hidrofóbicas,

como esteroides, bilinas, retinoides e lipídios.

As mesmas têm uma estrutura secundária de folha-beta rígida com um número de alças na extremidade aberta da estrutura cônica que pode ser projetada para se ligar a diferentes antígenos alvo.

As anticalinas têm entre 160 e 180 aminoácidos de tamanho e são derivadas de lipocalinas.

Para mais detalhes, consulte Biochim Biophys

Acta 1482:337-350 (2000), US7250297B1 e US20070224633. Um anticorpo é um suporte derivado da Proteína A de Staphylococcus aureus que pode ser modificado para se ligar ao antígeno.

O domínio consiste em um feixe de três hélices de aproximadamente 58 aminoácidos.

Bibliotecas foram geradas por randomização de resíduos de superfície.

Para mais detalhes, consulte Protein

Eng.

Des.

Sel. 2004, 17, 455-462 e EP 1641818A1. Os Avímeros são proteínas de múltiplos domínios derivadas da família de suportes do domínio A.

Os domínios nativos de aproximadamente 35 aminoácidos adotam uma estrutura ligada por dissulfeto definida.

A diversidade é gerada pelo embaralhamento da variação natural exibida pela família dos domínios A.

Para mais detalhes,

consulte Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005) e Expert Opinion on

Investigational Drugs 16(6), 909-917 (junho de 2007). Uma transferrina é uma glicoproteína de transporte de soro monomérica.

As transferinas podem ser manipuladas para se ligarem a diferentes antígenos alvo através da inserção de sequências de peptídeos em uma alça de superfície permissiva.

Exemplos de suportes de transferrina modificados incluem o Trans-corpo.

Para mais detalhes, consulte J.

Biol.

Chem 274, 24066-24073 (1999). As Proteínas de

Repetição de Anquirina Modificadas (DARPins) são derivadas da Anquirina, que é uma família de proteínas que mediam a ligação de proteínas membranares integrais ao citoesqueleto.

Uma única repetição de anquirina é um motivo de 33 resíduos que consiste em duas hélices alfa e uma volta beta.

As mesmas podem ser manipuladas para ligar diferentes antígenos alvo ao randomizar resíduos na primeira alfa-hélice e uma volta beta de cada repetição.

Sua interface de ligação pode ser aumentada pelo aumento do número de módulos (um método de maturação por afinidade). Para mais detalhes, consulte J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) e J.

Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) e US20040132028A1. Um anticorpo de domínio único é um fragmento de anticorpo que consiste em um único domínio de anticorpo variável monomérico. Os primeiros domínios únicos foram derivados do domínio variável de cadeia pesada do anticorpo a partir dos camelídeos (nanocorpos ou fragmentos VHH). Além disso, o termo anticorpo de domínio único inclui um domínio variável de cadeia pesada humano autônomo (aVH) ou fragmentos VNAR derivados de tubarões. A fibronectina é um suporte que pode ser manipulado para se ligar ao antígeno. As adnectinas consistem em uma espinha dorsal da sequência natural de aminoácidos do 10º domínio das 15 unidades de repetição da fibronectina humana tipo III (FN3). Três alças em uma extremidade do sanduíche β podem ser manipuladas para permitir que uma Adnectina reconheça especificamente um alvo terapêutico de interesse.

Para mais detalhes, consulte Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 (2005), US20080139791, WO2005056764 e US6818418B1. Os aptâmeros peptídicos são moléculas de reconhecimento combinatório que consistem em uma proteína de suporte constante, normalmente tiorredoxina (TrxA) que contém uma alça peptídica variável restringida inserida no sítio ativo. Para mais detalhes, consulte Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005). Microcorpos são derivados de microproteínas de ocorrência natural de 25-50 aminoácidos de comprimento que contêm 3-4 pontes de cisteína - exemplos de microproteínas incluem KalataBI e conotoxina e knottinas. As microproteínas têm uma alça que pode ser manipulada para incluir até 25 aminoácidos sem afetar a dobra total da microproteína. Para mais detalhes de domínios de knottina projetados, consulte WO2008098796.

[00186] Uma “molécula de ligação ao antígeno que se liga ao mesmo epítopo” como uma molécula de referência se refere a uma molécula de ligação ao antígeno que bloqueia a ligação da molécula de referência ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais, e inversamente, a molécula de referência bloqueia a ligação da molécula de ligação ao antígeno ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais.

[00187] Mais particularmente, o termo “domínio de ligação ao antígeno” se refere à parte de uma molécula de ligação ao antígeno que compreende a área que se liga especificamente a e é complementar a parte ou a totalidade de um antígeno. Quando um antígeno é grande, uma molécula de ligação ao antígeno pode se ligar somente a uma parte particular do antígeno, parte a qual é denominada epítopo. Um domínio de ligação ao antígeno pode ser fornecido, por exemplo, por um ou mais domínios variáveis (também denominados regiões variáveis). De preferência, um domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH).

[00188] Como usado no presente documento, o termo “determinante antigênico” é um sinônimo de “antígeno” e “epítopo” e se refere a um sítio (por exemplo, um trecho contínuo de aminoácidos ou uma configuração conformacional composta por diferentes regiões de aminoácidos não contínuos) em uma macromolécula polipeptídica a qual uma fração de ligação ao antígeno se liga, formando um complexo antígeno-fração de ligação ao antígeno. Determinantes antigênicos úteis podem ser encontrados, por exemplo, nas superfícies de células tumorais, nas superfícies de células infectadas por vírus, nas superfícies de outras células doentes, nas superfícies de células imunes, livres em soro sanguíneo e/ou na matriz extracelular (ECM).

As proteínas úteis como antígenos no presente documento podem ser qualquer forma nativa das proteínas de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, seres humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário. Em uma modalidade particular, o antígeno é uma proteína humana. Quando é feita referência no presente documento a uma proteína específica, o termo engloba a proteína não processada “de comprimento total”, assim como qualquer forma da proteína que resulta a partir do processamento na célula. O termo também abrange variantes de ocorrência natural da proteína, por exemplo, variantes de splicing ou variantes alélicas.

[00189] Por “ligação específica” entende-se que a ligação é seletiva para o antígeno e pode ser discriminada de interações indesejadas ou não específicas. A capacidade de uma molécula de ligação ao antígeno se ligar a um antígeno específico pode ser medida através de um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) ou outras técnicas familiares a um técnico no assunto, por exemplo, técnica de Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR) (analisada em um instrumento BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), e ensaios de ligação tradicionais (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Em uma modalidade, a extensão da ligação de uma molécula de ligação ao antígeno a uma proteína não relacionada é menos do que cerca de 10% da ligação da molécula de ligação ao antígeno ao antígeno conforme medido, por exemplo, por SPR. Em certas modalidades, uma molécula que se liga ao antígeno tem uma constante de dissociação (Kd) de ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ou ≤ 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M).

[00190] “Afinidade” ou “afinidade de ligação” se refere à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Salvo indicação em contrário, conforme usado no presente documento, “afinidade de ligação” se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X por seu parceiro Y geralmente pode ser representada pela constante de dissociação (Kd), que é a razão das constantes de taxas de dissociação e associação (koff e kon, respectivamente). Assim, afinidades equivalentes podem compreender constantes de taxas diferentes, desde que a razão das constantes de taxas permaneça a mesma. A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos no presente documento. Um método particular para medir a afinidade é a Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR).

[00191] Um “antígeno associado a tumor” ou TAA, conforme usado no presente documento, se refere a um determinante antigênico apresentado na superfície de uma célula alvo, por exemplo, uma célula em um tumor, como uma célula cancerosa, uma célula do estroma tumoral, um linfócito maligno B ou uma célula de melanoma. Em certos aspectos, o antígeno da célula alvo é um antígeno na superfície de uma célula tumoral. Em um aspecto, TAA é selecionado do grupo que consiste em Proteína de Ativação de Fibroblasto (FAP), Antígeno Carcinoembriogênico (CEA), receptor alfa de Folato (FolR1), Proteoglicano de Sulfato de Condroitina Associado ao Melanoma (MCSP), Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR), Receptor 2 do Fator de Crescimento Epidérmico Humano (HER2), p95HER2, EpCAM, HER3, CD30 ou TPBG (5T4), CD19, CD79b, CD20, CD22, CD37, CD38, BCMA e GPRC5D. Em um aspecto particular, TAA é selecionado do grupo que consiste em Proteína de Ativação de Fibroblasto (FAP), Antígeno

Carcinoembriogênico (CEA), Receptor alfa de Folato (FolR1), Proteoglicano de Sulfato de Condroitina Associado ao Melanoma (MCSP), Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR), Receptor 2 do Fator de Crescimento Epidérmico Humano (HER2) e p95HER2. Em um outro aspecto particular, TAA é selecionado do grupo que consiste em Proteína de Ativação de Fibroblasto (FAP), Antígeno Carcinoembriogênico (CEA), EpCAM, HER3, CD30 ou TPBG (5T4). Em um aspecto particular, o antígeno associado a tumor é Proteína de Ativação de Fibroblasto (FAP) ou Antígeno Carcinoembriogênico (CEA). Em um aspecto, TAA é um antígeno de superfície de célula B selecionado do grupo que consiste em CD19, CD79b, CD20, CD22 e CD37, em particular CD19 e CD79b. Em um aspecto, TAA é um antígeno de superfície celular de Mieloma Múltiplo (MM) selecionado do grupo que consiste em CD38, BCMA e GPRC5D.

[00192] O termo “Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP)”, também conhecido como Prolil endopeptidase FAP ou Seprase (EC

3.4.21), se refere a qualquer FAP nativa de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, humanos) primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolguss) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. O termo abrange FAP não processada de “comprimento total”, bem como qualquer forma de FAP que resulte a partir do processamento na célula. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de FAP, por exemplo, variantes de splicing ou variantes alélicas. Em uma modalidade, a molécula de ligação ao antígeno da invenção é capaz de ligação específica à FAP humana, de camundongo e/ou cynomolgus. A sequência de aminoácidos de FAP humana é mostrada no nº de acesso Q12884 (versão 149, SEQ ID NO:2) da UniProt (www.uniprot.org) ou RefSeq NP_004451.2 do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/). O domínio extracelular (ECD) de FAP humana se estende da posição de aminoácido 26 a 760. A sequência de aminoácidos de um ECD de FAP humana com cauda de His é mostrada na SEQ ID NO:135. A sequência de aminoácidos da FAP de camundongo é mostrada no nº de acesso da UniProt P97321 (versão 126, SEQ ID NO:136) ou RefSeq do NCBI NP_032012.1. O domínio extracelular (ECD) de FAP de camundongo se estende da posição de aminoácidos 26 a

761. A SEQ ID NO:137 mostra a sequência de aminoácidos de um ECD de FAP de camundongo com cauda de His. A SEQ ID NO:138 mostra a sequência de aminoácidos de um ECD de FAP de cynomolgus com cauda de His. De preferência, uma molécula de ligação à anti-FAP da invenção se liga ao domínio extracelular de FAP.

[00193] O termo “antígeno carcinoembroínico (CEA)”, também conhecido como molécula de adesão celular relacionada ao antígeno carcinoembrionário 5 (CEACAM5), se refere a qualquer CEA nativo de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, humanos) primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. A sequência de aminoácidos do CEA humano é mostrada no n° de acesso UniProt. P06731 (versão 151, SEQ ID NO: 3). CEA há muito foi identificado como um antígeno associado a tumor (Gold e Freedman, J Exp Med., 121:439-462, 1965; Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002). Originalmente classificado como uma proteína expressa apenas no tecido fetal, o CEA foi agora identificado em vários tecidos adultos normais. Esses tecidos são principalmente de origem epitelial, incluindo células dos tratos gastrointestinal, respiratório e urogenital e células do cólon, colo do útero, glândulas sudoríparas e próstata (Nap et al., Tumour Biol., 9(2-3):145-53, 1988; Nap et al., Cancer Res., 52(8):2329-23339, 1992). Os tumores de origem epitelial, assim como suas metástases, contêm CEA como antígeno associado ao tumor. Embora a presença de CEA em si não indique transformação em uma célula cancerosa, a distribuição de CEA é indicativa. No tecido normal, o

CEA é geralmente expresso na superfície apical da célula (Hammarström S., Semin Cancer Biol. 9 (2): 67-81 (1999)), tornando o mesmo inacessível ao anticorpo na corrente sanguínea. Em contraste com o tecido normal, o CEA tende a ser expresso em toda a superfície das células cancerosas (Hammarström S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)). Essa mudança no padrão de expressão torna o CEA acessível à ligação do anticorpo em células cancerosas. Além disso, a expressão de CEA aumenta em células cancerosas.

Ademais, o aumento da expressão do CEA promove aumento das aderências intercelulares, o que pode levar à metástase (Marshall J., Semin Oncol., 30(a Suppl. 8):30-6, 2003). A prevalência da expressão de CEA em várias entidades tumorais é geralmente muito alta. Em concordância com os dados publicados, as próprias análises realizadas em amostras de tecido confirmaram sua alta prevalência, com aproximadamente 95% no carcinoma colorretal (CCR), 90% no câncer pancreático, 80% no câncer gástrico, 60% no câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC, quando é co-expresso com HER3), e 40% em câncer de mama; baixa expressão foi encontrada em câncer de pulmão de pequenas células e glioblastoma.

[00194] CEA é facilmente clivado da superfície celular e liberado na corrente sanguínea dos tumores, diretamente ou por meio dos vasos linfáticos. Por causa dessa propriedade, o nível de CEA sérico tem sido usado como um marcador clínico para o diagnóstico de câncer e triagem para recorrência de cânceres, particularmente câncer colorretal (Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992; Chau I., et al., J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004; Flamini et al., Clin Cancer Res; 12(23):6985-6988, 2006).

[00195] O termo “molécula de adesão de células epiteliais (EpCAM)” se refere a qualquer EpCAM nativa de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos),

primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolguss) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que de outra forma indicado. O termo abrange EpCAM não processada de “comprimento total”, bem como qualquer forma de EpCAM que resulte a partir do processamento na célula. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de EpCAM, por exemplo, variantes de splicing ou variantes alélicas. Em uma modalidade, a molécula de ligação ao antígeno da invenção é capaz de ligação específica à EpCAM humano, de camundongo e/ou cynomolgus. A sequência de aminoácidos de EpCAM humano é mostrada no nº de acesso P16422 (versão 167, SEQ ID NO:68) da UniProt (www.uniprot.org) ou RefSeq NP_002345.2 do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/). A sequência de aminoácidos de FAP de camundongo é mostrada no nº de acesso Q99JW5 (versão 111, SEQ ID NO:75) da UniProt (www.uniprot.org) ou RefSeq NP_032558.2 do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Molécula de adesão de células epiteliais (EpCAM) - também conhecida como transdutor de sinal de cálcio associado ao tumor 1 (TACSTD1), 17-1A e CD326 - é uma glicoproteína transmembrana tipo I ~ 40 kDa que é frequentemente superexpressada em cânceres de origem epitelial e por tronco de câncer células e é, portanto, uma molécula de interesse significativo para terapia e diagnóstico. O domínio extracelular EpCAM pode ser clivado para produzir a molécula de domínio extracelular solúvel EpEX e a molécula intracelular EpICD. Foi demonstrado que o EpICD se associa a outras proteínas para formar um complexo nuclear que regula positivamente a expressão de genes que promovem a proliferação celular. EpCAM também pode estar envolvida na transição de células epiteliais para células mesenquimais (EMT), e pode contribuir para a formação de grandes metástases.

[00196] “CD30” ou “TNFRSF8” é um membro da superfamília de receptores do fator de necrose tumoral. É caracteristicamente expressa em certas neoplasias hematopoiéticas, incluindo linfoma anaplásico de grandes células e linfoma de Hodgkin, entre outros. A expressão variável de CD30 em células linfoides normais e malignas tem direcionado esforços de pesquisa na compreensão da patogênese da suprarregulação de CD30, sua contribuição para a linfomagenese por meio de mecanismos antiapoptóticos e seu efeito na sobrevida celular. Dada a restrição do CD30 a certos tipos de tumor, a extensão lógica disso foi tentar explorar o mesmo como um alvo terapêutico. O CD30 é um receptor glicoproteico transmembranar de 120 kD pertencente à superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR), com domínios intracelulares, transmembranares e extracelulares e a sequência de aminoácidos do CD30 humano é mostrada no número de acesso UniProt.

P28908 (SEQ ID NO: 472).

[00197] O termo “TPBG” se refere à glicoproteína de trofoblasto, também conhecida como “5T4”. TBPG é uma glicoproteína transmembrana rica em leucina envolvida na adesão celular. Em adultos, essa proteína é altamente expressa em muitas células tumorais e está associada a um mau resultado clínico em vários tipos de câncer. Refere-se a qualquer TPBG nativo de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. A sequência de aminoácidos da TOBG humana é mostrada na UniProt Q13641 (SEQ ID NO: 473).

[00198] O termo “FolR1” se refere ao receptor de folato alfa e foi identificado como um potencial alvo prognóstico e terapêutico em uma série de cânceres. Refere-se a qualquer FolR1 nativo de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. A sequência de aminoácidos do FolR1 humano é mostrada no UniProt número de acesso P15328 (SEQ ID NO: 139), o FolR1 murino tem a sequência de aminoácidos do UniProt no. P35846 (SEQ ID NO: 140) e cynomolgus FolR1 tem a sequência de aminoácidos como mostrado no UniProt número de acesso no. G7PR14 (SEQ ID NO: 141). FolR1 é uma proteína N-glicosilada expressa na membrana plasmática das células. O FolR1 tem alta afinidade pelo ácido fólico e por vários derivados reduzidos do ácido fólico e medeia a liberação do folato fisiológico, 5-metiltetraidrofolato, para o interior das células. FOLR1 é um alvo desejável para a terapia contra o câncer direcionado por FOLR1, pois é superexpresso na grande maioria dos cânceres de ovário, bem como em muitos cânceres uterinos, endometriais, pancreáticos, renais, pulmonares e de mama, enquanto a expressão de FOLR1 em tecidos normais é restrito à membrana apical das células epiteliais nos túbulos proximais dos rins, pneumócitos alveolares do pulmão, bexiga, testículos, plexo coroide e tireoide.

Estudos recentes identificaram que a expressão de FolR1 é particularmente elevada em cânceres de mama triplo-negativos (Necela et al. PloS One 2015, 10 (3), e0127133).

[00199] O termo “Proteoglicano de sulfato de condroitina associado ao melanoma (MCSP)”, também conhecido como Proteoglicano de Sulfato de Condroitina 4 (CSPG4) se refere a qualquer MCSP nativo de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos) primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário. A sequência de aminoácidos do MCSP humano é mostrada no n° de acesso UniProt. Q6UVK1 (versão 103, SEQ ID NO: 142). MCSP é um proteoglicano de condroitina sulfato de membrana integral altamente glicosilado que consiste em um componente de glicoproteína de 280 kDa ligada a N e um componente de proteoglicano de sulfato de condroitina de 450 kDa expresso na membrana celular (Ross et al., Arch. Biochem. Biophys. 1983, 225:370-38).

MCSP é mais amplamente distribuído em várias células normais e transformadas. Em particular, MCSP é encontrado em quase todas as células basais da epiderme. MCSP é diferencialmente expresso em células de melanoma, e foi encontrado para ser expresso em mais de 90% dos nevos benignos e lesões de melanoma analisadas. Verificou-se também que MCSP é expresso em tumores de origem não melanocítica, incluindo carcinoma basocelular, vários tumores de origem na crista neural, e em carcinomas de mama.

[00200] O termo “Receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR)”, também denominado proto-oncogene c-ErbB-1 ou receptor tirosina-proteína quinase erbB-1, se refere a qualquer EGFR nativo de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos) primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário. A sequência de aminoácidos do EGFR humano é mostrada no n° de acesso UniProt. P00533 (versão 211, SEQ ID NO: 143). O proto-oncogene “HER2”, (receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano) codifica uma proteína tirosina quinase (p185HER2) que está relacionada a e é algo homóloga ao receptor do fator de crescimento epidérmico humano. O HER2 também é conhecido na área como c-erbB-2, e às vezes pelo nome de homólogo do rato, neu. A amplificação e/ou superexpressão de HER2 está associada a múltiplas malignidades humanas e parece estar totalmente envolvida na progressão de 25-30% dos cânceres de mama e ovário humanos.

Ademais, a extensão da amplificação é inversamente correlacionada com o tempo médio de sobrevida do paciente observado (Slamon, D. J. et al., Science 244:707-712 (1989)). A sequência de aminoácidos do HER2 humano é mostrada no n° de acesso UniProt. P04626 (versão 230, SEQ ID NO: 144). O termo “p95HER2”, como usado no presente documento, se refere a um fragmento do terminal carboxi (CTF) da proteína do receptor HER2, que também é conhecido como “611-CTF” ou “100-115 kDa p95HER2”. O fragmento p95HER2 é gerado na célula através da iniciação da tradução do mRNA de HER2 na posição de códon 611 da molécula de HER2 de comprimento completo (Anido et al, EMBO J 25; 3234-44 (2006)). Tem um peso molecular de 100 a 115 kDa e é expresso na membrana celular, em que pode formar homodímeros mantidos por ligações dissulfeto intermoleculares (Pedersen et al., Mol Cell Biol 29, 3319-31 (2009)). Uma sequência exemplificadora de p95HER2 humano é fornecida na SEQ ID NO: 145.

[00201] “HER3” ou “ErbB3” (receptor 3 do fator de crescimento epidérmico humano), como os outros membros da família da tirosina quinase do receptor ErbB, consiste em um domínio extracelular, um domínio transmembrana e um domínio intracelular. O domínio extracelular contém quatro subdomínios (I-IV). Os subdomínios I e III são ricos em leucina e estão principalmente envolvidos na ligação do ligante. Os subdomínios II e IV são ricos em cisteína e provavelmente contribuem para a conformação e estabilidade das proteínas através da formação de ligações dissulfeto. O subdomínio II também contém a alça de dimerização necessária para a formação do dímero. O domínio citoplasmático contém um segmento justamembrana, um domínio quinase e um domínio C-terminal. Embora nenhuma evidência tenha sido encontrada de que a superexpressão de ErbB3, ativação constitutiva ou mutação por si só seja oncogênica, https://en.wikipedia.org/wiki/ERBB3 - cite_note-pmid8632008-18 a proteína como parceira de heterodimerização, mais criticamente com ErbB2, está implicada no crescimento, proliferação, resistência quimioterápica e promoção de invasão e metástase. ErbB3 está associado à resistência terapêutica direcionada em vários tipos de câncer. A sequência de aminoácidos do HER3 humano é mostrada no n° de acesso UniProt. P21860 (versão 224, SEQ ID NO: 471).

[00202] Um “antígeno de superfície de célula B”, conforme usado no presente documento, se refere a um determinante antigênico apresentado na superfície de um linfócito B, particularmente um linfócito B maligno (nesse caso, o antígeno também é referido como “antígeno de superfície de célula B maligno”). Vários antígenos de superfície de células B são interessantes em termos de imunoterapia de neoplasias malignas hematológicas. Em um aspecto, o antígeno de superfície de célula B é selecionado do grupo que consiste em CD19, CD79b, CD20, CD22 e CD37.

[00203] O termo “CD19” se refere ao antígeno de linfócito B CD19, também conhecido como antígeno de superfície de linfócito B B4 ou antígeno de superfície de célula T Leu-12 e inclui qualquer CD19 nativo de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos) primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário. A sequência de aminoácidos do CD19 humano é mostrada no n° de acesso UniProt P15391 (versão 160, SEQ ID NO: 434). O termo abrange o CD19 humano não processado de “comprimento total”, bem como qualquer forma de CD19 humano que resulte do processamento na célula, desde que o anticorpo, conforme relatado no presente documento, se ligue ao mesmo.

CD19 é um receptor de superfície celular estruturalmente distinto expresso na superfície de células B humanas, incluindo, sem limitação, células pré-B, células B em desenvolvimento inicial (isto é, células B imaturas), células B maduras por meio de diferenciação terminal em plasma células e células B malignas. CD19 é expresso pela maioria das leucemias linfoblásticas agudas pré-B (LLA), linfomas não-Hodgkin, leucemias linfocíticas crônicas de células B (CLL), leucemias pró-linfocíticas, leucemias de células pilosas, leucemias linfocíticas agudas comuns e algumas leucemias linfoblásticas nulas agudas. A expressão de CD19 em células plasmáticas sugere ainda que pode ser expresso em tumores de células B diferenciados, como mieloma múltiplo.

Portanto, o antígeno CD19 é alvo de imunoterapia no tratamento de linfoma não-Hodgkin, leucemia linfocítica crônica e/ou leucemia linfoblástica aguda.

[00204] “CD79b” se refere à cadeia beta de proteína associada ao complexo receptor de antígeno de célula B, também conhecida como Ig-beta ou glicoproteína B29 específica de célula B, e inclui qualquer CD79b nativo de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário. A sequência de aminoácidos do CD79b humano é mostrada no n° de acesso UniProt P40259 (versão 180, SEQ ID NO: 435).

CD79b é uma proteína de 39 KDa expressa exclusivamente em células B e, em cooperação com CD79a, inicia a cascata de transdução de sinal a jusante do BCR, que leva à internalização do complexo BCR, sua translocação para os endossomos e apresentação do antígeno. CD79 (composto de subunidades CD79a e CD79b) é um componente de transdução de sinal heterodimérico do receptor de células B, ubiquamente expresso em linfomas de células B maduras e colocado na superfície celular pelos primeiros progenitores de células B comprometidos antes da expressão da imunoglobulina μ. O termo “CD79b” abrange CD79b não processado de “comprimento total”, bem como qualquer forma de CD79b que resulte do processamento na célula. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de CD79b, por exemplo, variantes de splicing ou variantes alélicas.

[00205] “CD20” se refere ao antígeno de linfócito B CD20, também conhecido como antígeno de superfície de linfócito B B1 ou antígeno de superfície de Leucócito Leu-16 e inclui qualquer CD20 nativo de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos) primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário. A sequência de aminoácidos do CD20 humano é mostrada no n° de acesso UniProt P11836 (versão 149, SEQ ID NO: 436). CD20 é uma proteína transmembrana hidrofóbica com um peso molecular de aproximadamente 35 kD expressa em linfócitos pré-B e B maduros. O gene humano correspondente é 4 domínios que abrangem a membrana, subfamília A, membro 1, também conhecido como MS4A1. Esse gene codifica um membro da família de genes 4A que abrange a membrana. Membros dessa família nascente de proteínas são caracterizados por características estruturais comuns e limites de splice íntron/exon similares e exibem padrões de expressão únicos entre células hematopoiéticas e tecidos não linfoides. Esse gene codifica a molécula de superfície do linfócito B, que desempenha um papel no desenvolvimento e diferenciação das células B em células plasmáticas. Esse membro da família está localizado em 11q12, entre um agrupamento de membros da família. O splicing alternativo desse gene resulta em duas variantes de transcrição que codificam a mesma proteína. O termo “CD20” abrange CD20 não processado de “comprimento total”, bem como qualquer forma de CD20 que resulte do processamento na célula. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de CD20, por exemplo, variantes de splicing ou variantes alélicas.

[00206] “CD22” se refere ao receptor de células B CD22, também conhecido como molécula de adesão de células de linfócitos B ou SIGLEC2, e inclui qualquer CD22 nativo de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. A sequência de aminoácidos do CD22 humano é mostrada no n° de acesso UniProt P20273

(versão 209, SEQ ID NO: 437). CD22 é uma molécula pertencente à família SIGLEC de lectinas e é encontrada na superfície de células B maduras e em menor extensão em algumas células B imaturas. CD22 é assim uma fosfoglicoproteína de superfície celular restrita a células B de 130-150 kDa e é capaz de modular sinais mediados pelo receptor de antígeno de linfócitos B (BCR), bem como a geração de sinais independentes de BCR. O termo “CD22” abrange CD22 não processado de “comprimento total”, bem como qualquer forma de CD22 que resulte do processamento na célula. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de CD22, por exemplo, variantes de splicing ou variantes alélicas.

[00207] “CD37” se refere ao antígeno leucocitário CD37, também conhecido como Tetraspanin-26 (Tspan-26), e inclui qualquer CD37 nativo de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, humanos) primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário. A sequência de aminoácidos do CD37 humano é mostrada no n° de acesso UniProt P11049 (versão 162, SEQ ID NO: 438). A expressão do CD37 é restrita às células do sistema imune, com maior abundância nas células B maduras, e menor expressão nas células T e mieloides. A glicoproteína CD37 é membro da superfamília transmembrana 4 e controla a resposta imune humoral e celular. O termo “CD37” abrange CD37 não processado de “comprimento total”, bem como qualquer forma de CD37 que resulte do processamento na célula. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de CD37, por exemplo, variantes de splicing ou variantes alélicas.

[00208] Um “antígeno de superfície celular de Mieloma Múltiplo (MM)” conforme usado no presente documento, se refere a um determinante antigênico apresentado na superfície de uma célula de Mieloma

Múltiplo (MM). Vários antígenos de superfície celular de MM são interessantes em termos de imunoterapia do mieloma múltiplo. Em um aspecto, o antígeno de superfície celular de MM selecionado do grupo que consiste em CD38, BCMA e GPRC5D.

[00209] O termo “CD38”, também conhecido como agrupamento de diferenciação 38 ou ADP ribose hidrolase cíclica, é uma glicoproteína encontrada na superfície de várias células do sistema imunológico (leucócitos), incluindo CD4+, CD8+, linfócitos B e células natural killer. CD38 também atua na adesão celular, transdução de sinais e sinalização de cálcio. Em condições normais, o CD38 é expresso em níveis relativamente baixos nas células mieloides e linfoides e em alguns tecidos não hematopoiéticos. Em contraste, células plasmáticas normais e células de mieloma múltiplo (MM) têm altos níveis de expressão de CD38, o que torna o CD38 um alvo interessante para o direcionamento de moléculas de superfície celular em MM. CD38, conforme usado no presente documento, se refere a qualquer proteína CD38 de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. A sequência de aminoácidos da CD38 humana é mostrada na UniProt (www.uniprot.org). P28907 (SEQ ID NO: 474).

[00210] O termo “BCMA” se refere ao antígeno de maturação de células B, também denominado membro da superfamília 17 do fator de necrose tumoral (TNFRS17), e é uma proteína transmembrana do tipo III sem um peptídeo sinal e contendo domínios extracelulares ricos em cisteína.

BCMA é expresso em níveis significativamente mais elevados em todas as células MM dos pacientes, mas não em outros tecidos normais, exceto nas células plasmáticas normais. BCMA, juntamente com dois receptores do fator celular de ativação da superfamília TNFR (BAFF-R) e ativador transmembrana e modulador de cálcio e interator de ligante de ciclofilina (TACI), regulam criticamente a proliferação e sobrevivência de células B, bem como a maturação e diferenciação em células plasmáticas. Esses três receptores funcionalmente relacionados suportam a sobrevivência de longo prazo das células B em diferentes estágios de desenvolvimento, ligando-se a BAFF e/ou APRIL, seus ligantes cognatos. BCMA, conforme usado no presente documento, se refere a qualquer proteína BCMA de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. A sequência de aminoácidos do BCMA humano é mostrada na UniProt (www.uniprot.org). Q02223 (SEQ ID NO: 475).

[00211] O termo “GPRC5D” se refere ao membro D do grupo 5 do receptor acoplado à proteína G, um alvo identificado a partir de células plasmáticas em mieloma múltiplo com o uso de sequenciamento de RNA. Foi relatado que GPRC5D está associado a mau prognóstico e carga tumoral em pacientes com mieloma múltiplo. GPRC5D se refere a qualquer proteína GPRC5D de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. A sequência de aminoácidos da GPRC5D humana é mostrada na UniProt (www.uniprot.org). Q9NZD1 (SEQ ID NO: 476).

[00212] O termo “CD28” (Agrupamento de Diferenciação 28, Tp44) se refere a qualquer proteína CD28 de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), exceto quando indicado. O CD28 é expresso nas células T e fornece sinais coestimulatórios necessários para a ativação celular e sobrevivência. A estimulação de células T através de CD28 além do receptor de células T (TCR) pode fornecer um sinal potente para a produção de várias interleucinas. CD28 é o receptor para as proteínas CD80 (B7.1) e CD86 (B7.2) e é o único receptor B7 expresso constitutivamente em células T virgens. A sequência de aminoácidos da CD28 humana é mostrada na UniProt (www.uniprot.org). P10747 (SEQ ID NO: 1).

[00213] Um “anticorpo agonístico” se refere a um anticorpo que compreende uma função agonística contra um determinado receptor. Em geral, quando um ligante (fator) agonista se liga a um receptor, a estrutura terciária da proteína receptora muda, e o receptor é ativado (quando o receptor é uma proteína de membrana, um sinal de crescimento celular ou tal geralmente é transduzido). Se o receptor for do tipo formador de dímero, um anticorpo agonístico pode dimerizar o receptor em uma distância e ângulo apropriados, agindo assim de forma semelhante a um ligante. Um anticorpo antirreceptor apropriado pode mimetizar a dimerização de receptores realizada por ligantes e, assim, pode se tornar um anticorpo agonístico.

[00214] Uma “molécula de ligação ao antígeno agonística de CD28” ou “molécula de ligação ao antígeno agonística convencional de CD28” é uma molécula de ligação ao antígeno que imita os ligantes naturais CD28 (CD80 ou CD86) em seu papel de aumentar a ativação celular de T na presença de um Sinal do receptor de células T (“sinal 2”). Uma célula T precisa de dois sinais para se tornar totalmente ativada. Em condições fisiológicas, o “sinal 1” surge da interação de moléculas de receptor de células T (TCR) com complexos de peptídeo/complexo principal de histocompatibilidade (MHC) em células apresentadoras de antígeno (APCs) e “sinal 2” é fornecido pelo engajamento de um receptor coestimulador, por exemplo, CD28. Uma molécula de ligação ao antígeno agonística de CD28 é capaz de coestimular células T (sinal 2). Também é capaz de induzir a proliferação de células T e secreção de citocinas em combinação com uma molécula com especificidade para o complexo TCR, porém a molécula agonística de ligação ao antígeno de CD28 não é capaz de ativar totalmente células T sem estimulação adicional do TCR.

No entanto, existe uma subclasse de moléculas de ligação ao antígeno específicas de CD28, as chamadas moléculas de ligação ao antígeno superagonista de CD28. Uma “molécula de ligação ao antígeno superagonística CD28” é uma molécula de ligação ao antígeno CD28 que é capaz de ativar totalmente as células T sem estimulação adicional do TCR.

Uma molécula de ligação ao antígeno superagonística CD28 é capaz de induzir a proliferação de células T e secreção de citocinas sem prévia ativação celular (sinal 1).

[00215] O termo “domínio variável” ou “região variável” se refere ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvida em ligar a molécula de ligação ao antígeno ao antígeno. Os domínios variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas similares, em que com cada domínio compreende quatro regiões de estrutura (FRs) conservadas e três regiões hipervariáveis (HVRs). Consulte, por exemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6ª ed., W.H. Freeman e Co., página 91 (2007). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno.

[00216] O termo “região hipervariável” ou “HVR”, conforme usado no presente documento, se refere a cada uma das regiões de um domínio variável de ligação ao antígeno que são hipervariáveis em sequência e que determinam a especificidade de ligação ao antígeno, por exemplo, “regiões determinantes de complementaridade” (“CDRs”). Geralmente, os domínios de ligação ao antígeno compreendem seis HVRs: três na VH (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) e três na VL (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). CDRs exemplares deste documento incluem:

[00217] (a) loops hipervariáveis que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));

[00218] (b) CDRs que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); e

[00219] (c) contatos ao antígeno que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) e 93-101 (H3) (MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)).

[00220] Salvo indicação em contrário, as CDRs são determinadas de acordo com Kabat et al., supra. Um técnico no assunto entenderá que as designações de CDR também podem ser determinadas de acordo com Chothia, supra, McCallum, supra, ou qualquer outra nomenclatura aceita cientificamente. Kabat et al. também definiu um sistema de numeração para sequências de regiões variáveis que é aplicável a qualquer anticorpo. Um versado na técnica pode atribuir inequivocamente esse sistema de “numeração de Kabat” a qualquer sequência de região variável, sem depender de quaisquer dados experimentais além da própria sequência. Conforme usado no presente documento, a “numeração de Kabat” se refere ao sistema de numeração estabelecido por Kabat et al., Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983). Salvo indicação em contrário, as referências à numeração de posições de resíduos de aminoácidos específicos em uma região variável de anticorpo estão de acordo com o sistema de numeração de Kabat.

[00221] Conforme usado no presente documento, o termo “afinidade maturada” no contexto de moléculas de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpos) se refere a uma molécula de ligação ao antígeno que é derivada de uma molécula de ligação ao antígeno de referência, por exemplo, por mutação, se liga ao mesmo antígeno, preferencialmente liga-se ao mesmo epítopo, como o anticorpo de referência; e tem uma afinidade maior para o antígeno do que a molécula de ligação ao antígeno de referência. A maturação de afinidade geralmente envolve a modificação de um ou mais resíduos de aminoácidos em uma ou mais CDRs da molécula de ligação ao antígeno.

Tipicamente, a molécula de ligação ao antígeno com afinidade maturada liga- se ao mesmo epítopo que a molécula de ligação ao antígeno de referência inicial.

[00222] “Região estrutural” ou “FR” se referem aos resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos de região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável consiste geralmente em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Por conseguinte, as sequências de HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência na VH (ou VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3- H3(L3)-FR4.

[00223] Uma “estrutura humana aceitadora”, para os fins descritos no presente documento, é uma estrutura que compreende a sequência de aminoácidos de uma estrutura do domínio variável de cadeia leve (VL) ou uma estrutura do domínio variável de cadeia pesada (VH) derivada de uma estrutura de imunoglobulina humana ou de uma estrutura de consenso humana, conforme definido abaixo. Uma estrutura humana aceitadora “derivada de” uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humana pode compreender a mesma sequência de aminoácidos da mesma, ou pode conter alterações na sequência de aminoácidos. Em algumas modalidades, o número de alterações de aminoácidos são 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, ou 2 ou menos. Em algumas modalidades, a estrutura aceitadora humana de VL é idêntica em sequência à sequência de estrutura de imunoglobulina humana de VL ou sequência de estrutura de consenso humana.

[00224] O termo anticorpo “quimérico” se refere a um anticorpo em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma fonte ou espécie em particular, enquanto o restante da cadeia pesada e/ou leve é derivado a partir de uma diferente fonte ou espécie.

[00225] A “classe” de um anticorpo se refere ao tipo de domínio constante ou região constante possuída pela sua cadeia pesada.

Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias dessas podem ser ainda divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados,,,, e , respectivamente.

[00226] Um anticorpo “humanizado” se refere a um anticorpo quimérico que compreende resíduos de aminoácidos de HVRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanas. Em certas modalidades, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um e normalmente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem àquelas de um anticorpo não humano e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode compreender opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, se refere a um anticorpo que passou por humanização. Outras formas de “anticorpos humanizados” abrangidas pela presente invenção são aquelas em que a região constante foi adicionalmente modificada ou alterada da do anticorpo original para gerar as propriedades de acordo com a invenção, especialmente em relação à ligação ao C1q e/ou ligação ao receptor Fc (FcR).

[00227] Um anticorpo “humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por um ser humano ou uma célula humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências codificadoras de anticorpos humanos. Essa definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação ao antígeno não humanos.

[00228] O termo “domínio CH1” denota a parte de um polipeptídeo de cadeia pesada de anticorpo que se estende aproximadamente da posição EU 118 até a posição EU 215 (sistema de numeração EU de acordo com Kabat). Em um aspecto, um domínio CH1 tem a sequência de aminoácidos de ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKV (SEQ ID NO: 477). Normalmente, um segmento tendo a sequência de aminoácidos de EPKSC (SEQ ID NO: 480) segue para ligar o domínio CH1 à região de dobradiça.

[00229] O termo “região de dobradiça” denota a parte de um polipeptídeo de cadeia pesada de anticorpo que une em uma cadeia pesada de anticorpo de tipo selvagem o domínio CH1 e o domínio CH2, por exemplo, de cerca da posição 216 a cerca da posição 230 de acordo com o sistema numérico da EU de Kabat, ou de cerca da posição 226 a cerca da posição 230 de acordo com o sistema numérico da EU de Kabat. As regiões de dobradiça de outras subclasses de IgG podem ser determinadas alinhando-se com os resíduos de cisteína da região de dobradiça da sequência da subclasse de IgG1. A região de dobradiça é normalmente uma molécula dimérica constituída por dois polipeptídeos com sequência de aminoácidos idêntica. A região de dobradiça geralmente compreende até 25 resíduos de aminoácidos e é flexível, permitindo que os sítios de ligação ao alvo associados se movam independentemente. A região de dobradiça pode ser subdividida em três domínios: o domínio de dobradiça superior, intermediário e inferior (consulte, por exemplo, Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083).

[00230] Em um aspecto, a região da dobradiça tem a sequência de aminoácidos DKTHTCPXCP (SEQ ID NO: 481), em que X é S ou P. Em um aspecto, a região da dobradiça tem a sequência de aminoácidos HTCPXCP (SEQ ID NO: 482), em que X é S ou P. Em um aspecto, a região da dobradiça tem a sequência de aminoácidos CPXCP (SEQ ID NO: 483), em que X é S ou P.

[00231] O termo “domínio Fc” ou “região Fc” é usado no presente documento para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de anticorpo que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Uma região Fc da IgG compreende um domínio CH2 da IgG e um CH3 da IgG.

[00232] O “domínio CH2” de uma região Fc da IgG humana geralmente se estende de um resíduo de aminoácidos na posição 231 EU até um resíduo de aminoácidos na posição 340 EU (sistema de numeração EU de acordo com Kabat). Em um aspecto, um domínio CH2 tem a sequência de aminoácidos de APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHEDP

EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQESTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAK (SEQ ID NO: 478). O domínio CH2 é único por não estar intimamente associado a outro domínio. Em vez disso, duas cadeias de carboidratos ramificadas ligadas a N são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma região Fc nativa intacta. Especula-se que o carboidrato pode fornecer um substituto para o emparelhamento domínio- domínio e ajudar a estabilizar o domínio CH2. Burton, Mol. Immunol. 22 (1985)

161-206. Em uma modalidade, uma cadeia de carboidratos é ligada ao domínio CH2. O domínio CH2 no presente documento pode ser um domínio CH2 de sequência nativa ou domínio CH2 variante.

[00233] O “domínio CH3” compreende o trecho de resíduos C-terminal para um domínio CH2 em uma região Fc denota a parte de um polipeptídeo de cadeia pesada de anticorpo que se estende aproximadamente da posição EU 341 à posição EU 446 (sistema de numeração EU de acordo com Kabat). Em um aspecto, o domínio CH3 tem a sequência de aminoácidos de GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE

WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG (SEQ ID NO: 479). A região CH3 no presente documento pode ser um domínio CH3 de sequência nativa ou um domínio CH3 variante (por exemplo, um domínio CH3 com uma protuberância introduzida (“knob”) em uma cadeia dos mesmos e um “buraco” (“hole”) introduzido correspondente na outra cadeia dos mesmos; consulte a Patente dos EUA de nº 5.821.333, expressamente incorporada aqui por referência).

Tais domínios CH3 variantes podem ser usados para promover a heterodimerização de duas cadeias pesadas de anticorpo não idênticas, conforme descrito no presente documento. Em uma modalidade, uma região Fc de cadeia pesada da IgG humana se estende de Cys226, ou de Pro230, até o carboxila-terminal da cadeia pesada. No entanto, a lisina C-terminal (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que especificado no presente documento de outro modo, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também designado por índice de EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

[00234] A tecnologia “knobs-into-holes” é descrita, por exemplo, nos documentos dos EUA 5.731.168; US 7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) e Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001).

Geralmente, o método envolve introduzir uma protuberância (“knob”) na interface de um primeiro polipeptídeo e um buraco (“hole”) correspondente na interface de um segundo polipeptídeo, de tal modo que a protuberância possa ser posicionada no buraco de modo a promover a formação de heterodímeros e impedir a formação de homodímeros. As protuberâncias são construídas substituindo pequenas cadeias laterais de aminoácidos da interface do primeiro polipeptídeo com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano).

Cavidades compensadoras de tamanho idêntico ou semelhante às protuberâncias são criados na interface do segundo polipeptídeo pela substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos por outras menores (por exemplo, alanina ou treonina). A protuberância e o buraco podem ser feitos alterando o ácido nucleico que codifica os polipeptídeos, por exemplo, por mutagênese específica do sítio ou por síntese de peptídeos. Em uma modalidade específica, uma modificação de protuberância compreende a substituição de aminoácidos T366W em uma das duas subunidades do domínio Fc, e a modificação de buraco compreende as substituições de aminoácidos T366S, L368A e Y407V na outra das duas subunidades do domínio Fc. Em uma modalidade específica adicional, a subunidade do domínio Fc que compreende a modificação de protuberância compreende adicionalmente a substituição de aminoácidos S354C e a subunidade do domínio Fc que compreende a modificação de buraco compreende adicionalmente a substituição de aminoácidos Y349C. A introdução desses dois resíduos de cisteína resulta na formação de uma ponte dissulfeto entre as duas subunidades da região Fc, estabilizando ainda mais o dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

[00235] Uma “região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina” pretende incluir variantes alélicas de ocorrência natural da região Fc de uma imunoglobulina, bem como variantes com alterações que produzem substituições, adições ou eliminações, mas que não diminuem substancialmente a capacidade de a imunoglobulina mediar as funções efetoras (como citotoxicidade celular dependente de anticorpo). Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser eliminados do N-terminal ou C-terminal da região Fc de uma imunoglobulina sem perda substancial da função biológica.

Tais variantes podem ser selecionadas de acordo com regras gerais conhecidas na técnica, de modo a terem um efeito mínimo na atividade (consulte, por exemplo, Bowie, J. U. et al., Science 247: 1306-10 (1990)).

[00236] O termo “domínio Fc de tipo selvagem” denota uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de um domínio Fc encontrada na natureza. Os domínios Fc humanos de tipo selvagem incluem uma região Fc de IgG1 humana nativa (alotipos não A e A), região Fc de IgG2 humana nativa, região Fc de IgG3 humana nativa e região Fc de IgG4 humana nativa, bem como variantes de ocorrência natural disso. As regiões Fc de tipo selvagem são denotadas em SEQ ID NO: 484 (IgG1, alótipo caucasiano), SEQ ID NO: 485 (IgG1, alótipo afro-americano), SEQ ID NO: 486 (IgG2), SEQ ID NO: 487 (IgG3) e SEQ ID NO: 488 (IgG4).

[00237] O termo “domínio Fc (humano) variante” denota uma sequência de aminoácidos que difere daquele de um “tipo selvagem” (humano) de domínio Fc sequência de aminoácidos em virtude de pelo menos uma “mutação de aminoácidos”. Em um aspecto, a região Fc variante tem pelo menos uma mutação de aminoácido em comparação com uma região Fc nativa, por exemplo, de cerca de uma a cerca de dez mutações de aminoácido, e em um aspecto de cerca de uma a cerca de cinco mutações de aminoácido em uma região Fc nativa. Em um aspecto, a (variante) região Fc tem pelo menos cerca de 95% de homologia com uma região Fc de tipo selvagem.

[00238] O termo “função efetora” se refere àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação a C1q e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação ao receptor de Fc, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), fagocitose de células dependente de anticorpos (ADCP), secreção de citocinas, captação de antígeno mediada por complexo imune por células apresentadoras de antígenos, regulação negativa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de células B) e ativação de células B.

[00239] As funções efetoras dependentes de ligação ao receptor Fc podem ser mediadas pela interação da região Fc de um anticorpo com receptores Fc (FcRs), que são receptores de superfície celular especializados em células hematopoiéticas. Os receptores Fc pertencem à superfamília das imunoglobulinas e mostraram mediar tanto a remoção de patógenos revestidos com anticorpos por fagocitose de complexos imunes, quanto a lise de eritrócitos e vários outros alvos celulares (por exemplo, células tumorais) revestidos com o anticorpo correspondente, por meio de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) (consulte, por exemplo, Van de Winkel, JG e Anderson, CL, J. Leukoc. 49 (1991), 511-524). Os FcRs são definidos por sua especificidade para os isotipos de imunoglobulina: Os receptores Fc para anticorpos IgG são referidos como FcγR. A ligação ao receptor Fc é descrita, por exemplo, em Ravetch, JV e Kinet, JP, Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492, Capel, PJ, et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; e Gessner, JE, et al., Ann. Hematol. 76 (1998), 231-248.

[00240] A reticulação de receptores para a região Fc de anticorpos IgG (FcγR) desencadeia uma ampla variedade de funções efetoras, incluindo fagocitose, citotoxicidade de células dependente de anticorpos e liberação de mediadores inflamatórios, bem como a remoção de complexos imunes e regulação da produção de anticorpos. Em humanos, três classes de FcγR foram caracterizadas, que são:

[00241] - FcRI (CD64) se liga a IgG monomérica com alta afinidade e é expresso em macrófagos, monócitos, neutrófilos e eosinófilos. A modificação na região Fc da IgG em pelo menos um dos resíduos de aminoácidos E233-G236, P238, D265, N297, A327 e P329 (numeração de acordo com o índice de EU de Kabat) reduz a ligação a FcγRI. Resíduos de IgG2 nas posições 233-236, substituídos em IgG1 e IgG4, reduziram a ligação a FcγRI em 10³ vezes e eliminaram a resposta de monócitos humanos a glóbulos vermelhos sensibilizados com anticorpos (Armor, KL, et al., Eur. J.

Immunol. 29 (1999) 2613–2624).

[00242] -FcRII (CD32) se liga a IgG complexada com afinidade média a baixa e é amplamente expresso. Esse receptor pode ser dividido em dois subtipos, FcRIIA e FcRIIB. FcRIIA é encontrado em muitas células envolvidas na morte (por exemplo, macrófagos, monócitos, neutrófilos) e parece ser capaz de ativar o processo de morte. O FcγRIIB parece desempenhar um papel nos processos inibitórios e é encontrado nas células B, macrófagos e nos mastócitos e eosinófilos. Nas células B, o mesmo parece funcionar para suprimir a produção adicional de imunoglobulina e a mudança do isotipo para, por exemplo, a classe IgE. Em macrófagos, o FcγRIIB atua inibindo a fagocitose conforme mediada por FcγRIIA. Em eosinófilos e mastócitos, a forma B pode ajudar a suprimir a ativação dessas células por meio da ligação de IgE a seu receptor separado. A ligação reduzida para FcγRIIA é encontrada, por exemplo, para anticorpos que compreendem uma região Fc da IgG com mutações em pelo menos um dos resíduos de aminoácidos E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 e K414 (numeração de acordo com o índice de EU de Kabat).

[00243] - FcRIII (CD16) se liga a IgG com afinidade média a baixa e existe como dois tipos. FcRIIIA é encontrado em células NK, macrófagos, eosinófilos e alguns monócitos e células T e media ADCC.

FcγRIIIB é altamente expresso em neutrófilos. Ligação reduzida para FcRIIIA é encontrada, por exemplo, para anticorpos que compreendem uma região Fc da IgG com mutação em pelo menos um dos resíduos de aminoácidos E233- G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 e D376 (numeração de acordo com o índice de EU de Kabat).

[00244] O mapeamento dos sítios de ligação em IgG1 humana para receptores Fc, os sítios de mutação acima mencionados e métodos para medir a ligação a FcγRI e FcγRIIA são descritos em Shields, RL, et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604.

[00245] O termo “ADCC” ou “citotoxicidade celular dependente de anticorpo” é um mecanismo imunológico que leva à lise de células alvo revestidas de anticorpo por células imunes efetoras. As células alvo são células às quais anticorpos ou derivados dos mesmos que compreendem uma região Fc se ligam especificamente, geralmente através da parte da proteína que é N-terminal da região Fc. Conforme usado no presente documento, o termo “ADCC reduzido” é definido como uma redução no número de células alvo que são lisadas em um determinado tempo, a uma dada concentração de anticorpo no meio que circunda as células alvo, pelo mecanismo de ADCC definido acima, e/ou um aumento na concentração de anticorpo no meio que envolve as células alvo, necessário para atingir a lise de um determinado número de células alvo em um determinado tempo, pelo mecanismo de ADCC. A redução no ADCC é relativa ao ADCC mediado pelo mesmo anticorpo produzido pelo mesmo tipo de células hospedeiras, com o uso dos mesmos métodos de produção, purificação, formulação e armazenamento padrão (que são conhecidos pelos especialistas na técnica), mas que tem não foi manipulado. Por exemplo, a redução no ADCC mediada por um anticorpo que compreende em seu domínio Fc uma substituição de aminoácido que reduz ADCC, é relativa ao ADCC mediado pelo mesmo anticorpo sem esta substituição de aminoácido no domínio Fc. Os ensaios adequados para medir ADCC são bem conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, publicação n° PCT WO 2006/082515 ou publicação n° PCT WO 2012/130831). Por exemplo, a capacidade do anticorpo de induzir as etapas iniciais que medeiam ADCC é investigada medindo sua ligação a células que expressam receptores Fcγ, como células que expressam de forma recombinante FcγRI e/ou FcγRIIA ou células NK (que expressam essencialmente FcγRIIIA). Em particular, a ligação a FcγR em células NK é medida.

[00246] Um “receptor Fc ativador” é um receptor Fc que, após o envolvimento de uma região Fc de um anticorpo, desencadeia eventos de sinalização que estimulam a célula portadora de receptor para realizar funções efetoras. Receptores Fc ativadores incluem FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) e FcαRI (CD89). Um receptor Fc ativador particular é FcγRIIIa humano (consulte nº de acesso UniProt P08637, versão 141).

[00247] Um “ectodomínio” é o domínio de uma proteína de membrana que se estende para o espaço extracelular (ou seja, o espaço fora da célula alvo). Os ectodomínios são geralmente as partes das proteínas que iniciam o contato com as superfícies, o que leva à transdução do sinal.

[00248] O termo “ligante peptídico” se refere a um peptídeo que compreende um ou mais aminoácidos, normalmente cerca de 2 a 20 aminoácidos. Os ligantes peptídicos são conhecidos na técnica ou são descritos no presente documento. Os peptídeos ligantes não imunogênicos adequados são, por exemplo, ligantes peptídicos (G4S)n, (SG4)n ou G4(SG4)n,

em que “n” é geralmente um número entre 1 e 5, normalmente entre 2 e 4, em particular 2, ou seja, os peptídeos selecionados a partir do grupo que consiste em GGGGS (SEQ ID NO:146), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:147), SGGGGSGGGG (SEQ ID NO:148) w GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO:149), mas também inclui as sequências GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:150), (G4S)3 (SEQ ID NO:151), (G4S)4 (SEQ ID NO:152), GSGSGSGS (SEQ ID NO:153), GSGSGNGS (SEQ ID NO:154), GGSGSGSG (SEQ ID NO:155), GGSGSG (SEQ ID NO:156), GGSG (SEQ ID NO:157), GGSGNGSG (SEQ ID NO:158), GGNGSGSG (SEQ ID NO:159) e GGNGSG (SEQ ID NO:160). Os ligantes peptídicos de interesse particular são (G4S) (SEQ ID NO:146), (G4S)2 ou GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:147), (G4S)3 (SEQ ID NO:151) e (G4S)4 (SEQ ID NO:152).

[00249] O termo “aminoácido”, conforme usado neste pedido, indica o grupo de carbóxi α-aminoácidos de ocorrência natural que compreende alanina (código de três letras: ala, código de uma letra: A), arginina (arg, R), asparagina (asn, N), ácido aspártico (asp, D), cisteina (cys, C), glutamina (gln, Q), ácido glutâmico (glu, E), glicina (gly, G), histidina (his, H), isoleucina (ile, I), leucina (leu, L), lisina (lys, K), metionina (met, M), fenilalanina (phe, F), prolina (pro, P), serina (ser, S), treonina (thr, T), triptofano (trp, W), tirosina (tyr, Y), e valina (val, V).

[00250] Por “fundido” ou “conectado” entende-se que os componentes (por exemplo, um polipeptídeo e um ectodomínio do referido membro da família de ligantes TNF) estão ligados por ligações peptídicas, diretamente ou por meio de um ou mais ligantes peptídicos.

[00251] “Porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos” em relação a uma sequência polipeptídica (proteína) de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica de referência, após o alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para alcançar a porcentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação da porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, usando software de computador disponível publicamente, como software BLAST, BLAST-2, ALIGN, SAWI ou Megalign (DNASTAR). Os versados na técnica podem determinar os parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências sendo comparadas. Para os fins deste documento, no entanto, os valores percentuais de identidade de sequência de aminoácidos são gerados com o uso do programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2.

O programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2 foi de autoria da Genentech, Inc., e o código-fonte foi arquivado com a documentação do usuário no Copyright Office dos EUA, Washington D.C., 20559, onde está registrado sob o Registro de Direitos Autorais no US TXU510087. O programa ALIGN-2 está disponível publicamente na Genentech, Inc., sul de São Francisco, Califórnia, EUA, ou pode ser compilado a partir do código-fonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, incluindo o digital UNIX V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam. Em situações em que ALIGN-2 é empregado para comparações de sequência de aminoácidos, a porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos de uma determinada sequência de aminoácidos A para, com ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B (que pode alternativamente ser expressa como uma determinada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende uma certa porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos para, com ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B) é calculada da seguinte forma: 100 vezes a fração X/Y, em que X é o número de resíduos de aminoácidos marcados como compatibilidades idênticas pelo programa de alinhamento de sequência ALIGN-2 no alinhamento desse programa de A e B, e em que Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Será apreciado que, quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos de A para B não será igual à porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos de B para A. Exceto se especificamente indicado de outra forma, todos os valores da porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos usados no presente documento são obtidos conforme descrito no parágrafo imediatamente anterior com o uso do programa de computador ALIGN-2.

[00252] Em certas modalidades, as variantes de sequências de aminoácidos das moléculas de ligação ao antígeno CD28 fornecidas no presente documento são contempladas. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas das moléculas de ligação ao antígeno CD28. As variantes da sequência de aminoácidos das moléculas de ligação ao antígeno CD28 podem ser preparadas por meio da introdução de modificações apropriadas na sequência de nucleotídeos que codifica as moléculas ou por síntese de peptídeos. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar ao construto final, contanto que o construto final possua as características desejadas, por exemplo, ligação ao antígeno. Os sítios de interesse para a mutagênese substitucional incluem HVRs e Estruturas (FRs). As substituições conservativas são fornecidas na Tabela B sob o título “Substituições Preferenciais” e ainda descritas abaixo em referência às classes de cadeia lateral de aminoácidos (1) a (6). As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas na molécula de interesse e os produtos rastreados quanto a uma atividade desejada, por exemplo, ligação ao antígeno retida/melhorada, imunogenicidade diminuída ou ADCC ou CDC melhoradas.

TABELA A Resíduo Substituições Substituições Original Exemplificadoras Preferenciais Ala (A) Val; Leu; Ile Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu Leu (L) Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu

[00253] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com propriedades comuns de cadeia lateral:

[00254] (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

[00255] (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

[00256] (3) ácidos: Asp, Glu;

[00257] (4) básicos: His, Lys, Arg;

[00258] (5) resíduos que influenciam na orientação de cadeia: Gly, Pro;

[00259] (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

[00260] As substituições não conservativas implicarão a troca de um membro de uma destas classes por outra classe.

[00261] O termo “variantes de sequência de aminoácidos” inclui variantes substanciais em que existem substituições de aminoácidos em um ou mais resíduos da região hipervariável de uma molécula de ligação ao antígeno parental (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano).

Geralmente, a variante (ou variantes) resultante selecionada para melhor estudo terá modificações (por exemplo, melhorias) em certas propriedades biológicas (por exemplo, afinidade aumentada, imunogenicidade reduzida) em relação à molécula de ligação ao antígeno e/ou terá substancialmente retido certas propriedades biológicas da molécula de ligação ao antígeno parental.

Uma variante substitucional exemplar é um anticorpo amadurecido por afinidade, que pode ser gerado convenientemente, por exemplo, usando técnicas de maturação de afinidade à base de exibição em fagos, como aquelas descritas no presente documento. Em suma, um ou mais resíduos HVR são mutados e as moléculas de ligação ao antígeno variantes são exibidas no fago e rastreadas quanto a uma atividade biológica particular (por exemplo, afinidade de ligação). Em certas modalidades, substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs, desde que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade da molécula de ligação ao antígeno se ligar ao antígeno. Por exemplo, as alterações conservativas (por exemplo, substituições conservativas, conforme fornecidas no presente documento) que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas em HVRs. Um método útil para identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que pode ser direcionado para mutagênese é chamado “mutagênese de varredura de alanina”, conforme descrito por Cunningham e Wells, (1989), Science, 244:1081-1085. Nesse método, um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados, como Arg, Asp, His, Lys e Glu) são identificados e substituídos por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada. Substituições adicionais podem ser introduzidas nos locais de aminoácidos demonstrando sensibilidade funcional às substituições iniciais.

Alternativa ou adicionalmente, uma estrutura cristalina de um complexo molécula de ligação ao antígeno-antígeno para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser direcionados ou eliminados como candidatos para substituição.

Variantes podem ser rastreadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.

[00262] As inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões de terminal amino e/ou carboxila variando em comprimento de um resíduo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intrassequência de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções incluem moléculas de ligação ao antígeno CD28 com uma fusão ao terminal N ou C de um polipeptídeo que aumenta a meia-vida sérica das moléculas de ligação ao antígeno CD28.

[00263] Em certas modalidades, as moléculas de ligação ao antígeno CD28 fornecidas no presente documento são alteradas para aumentar ou diminuir a extensão a qual o anticorpo é glicosilado. As variantes de glicosilação das moléculas podem ser convenientemente obtidas alterando a sequência de aminoácidos de tal modo que um ou mais sítios de glicosilação sejam criados ou removidos. Quando a molécula de ligação a ICOS agonística compreende um domínio Fc, o carboidrato ligado ao mesmo pode ser alterado.

Os anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos normalmente compreendem um oligossacarídeo biantenário ramificado que é geralmente ligado por uma ligação N a Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Vide, por exemplo, Wright et al., TIBTECH, 15:26-32 (1997). O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetilglicosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GlcNAc na “haste” da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em algumas modalidades, modificações do oligossacarídeo em moléculas de ligação a ICOS agonísticas podem ser realizadas a fim de criar variantes com certas propriedades melhoradas. Em um aspecto, variantes de moléculas de ligação a ICOS agonísticas são fornecidas com uma estrutura de carboidrato que carece de fucose ligada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Tais variantes de fucosilação podem ter uma função ADCC melhorada, consulte, por exemplo, a Publicação de Patente dos EUA de nº 2003/0157108 (Presta, L.) ou US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Outras variantes das moléculas de ligação ao antígeno CD28 da invenção incluem aquelas com oligossacarídeos bissectados, por exemplo, em que um oligossacarídeo biantenário ligado à região Fc é bissectado por GlcNAc. Tais variantes podem ter fucosilação reduzida e/ou função ADCC melhorada, consulte, por exemplo, WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); Patente n° US 6.602.684 (Umana et al.); e US 2005/0123546 (Umana et al.). Também são fornecidas variantes com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc.

Tais variantes de anticorpo podem ter função de CDC melhorada e são descritas, por exemplo, nos documentos WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); e WO 1999/22764 (Raju, S.).

[00264] Em certas modalidades, pode ser desejável criar variantes modificadas de cisteína das moléculas de ligação ao antígeno CD28 da invenção, por exemplo, “tioMAbs”, em que um ou mais resíduos da molécula são substituídos por resíduos de cisteína. Em modalidades particulares, os resíduos substituídos ocorrem em sítios acessíveis da molécula. Por meio da substituição desses resíduos por cisteína, grupos tiol reativos são então posicionados em sítios acessíveis do anticorpo e podem ser usados para conjugar o anticorpo a outras frações, como frações de fármacos ou frações de ligante-fármaco, para criar um imunoconjugado. Em certas modalidades, qualquer um ou mais dos seguintes resíduos podem ser substituídos por cisteína: V205 (numeração de Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração EU) da região Fc de cadeia pesada. As moléculas de ligação ao antígeno manipuladas com cisteína podem ser geradas como descrito, por exemplo, na Patente dos EUA de nº 7.521.541.

[00265] Em certos aspectos, as moléculas de ligação ao antígeno CD28 fornecidas no presente documento podem ser ainda modificadas para conter frações não proteicas adicionais que são conhecidas na técnica e prontamente disponíveis. As frações adequadas para derivatização do anticorpo incluem, sem limitação, polímeros solúveis em água.

Exemplos não limitantes de polímeros solúveis em água incluem, sem limitação polietilenoglicol (PEG), copolímeros de etilenoglicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3- dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios) e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona)polietilenoglicol, homopolímeros de propropilenoglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico e misturas dos mesmos. O propionaldeído de polietilenoglicol pode apresentar vantagens na fabricação devido à sua estabilidade em água. O polímero pode ter qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros ligados ao anticorpo pode variar e, se mais de um polímero estiver ligado, eles podem ser as mesmas moléculas ou diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para derivatização pode ser determinado com base em considerações, incluindo, sem limitação, propriedades ou funções particulares do anticorpo a ser melhorado, se o derivado de anticorpo biespecífico será usado em uma terapia sob condições definidas, etc. Em outro aspecto, são fornecidos conjugados de um anticorpo e uma fração não proteica que pode ser seletivamente aquecida por exposição à radiação. Em uma modalidade, a porção não proteinácea é um nanotubo de carbono (Kam, N.W. et al., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 102 (2005) 11600-11605). A radiação pode ter qualquer comprimento de onda e inclui, sem limitação, comprimentos de onda que não prejudicam as células comuns, mas que aquecem a porção não proteica a uma temperatura à qual as células proximais da porção não proteica de anticorpo são mortas. Em um outro aspecto, imunoconjugados das moléculas de ligação ao antígeno CD28 fornecidos no presente documento podem ser obtidos. Um “imunoconjugado” é um anticorpo conjugado com uma ou mais moléculas heterólogas, incluindo, sem limitação, um agente citotóxico.

[00266] O termo “polinucleotídeo” se refere a uma molécula ou construto de ácido nucleico isolada, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA), RNA derivado de vírus ou DNA plasmidial (pDNA). Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação fosfodiéster convencional ou uma ligação não convencional (por exemplo, uma ligação amida, como encontrada em ácidos nucleicos peptídicos (PNA). O termo “molécula de ácido nucleico” se refere a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, fragmentos de DNA ou RNA, presentes em um polinucleotídeo. Cada nucleotídeo é composto de uma base, especificamente uma base de purina ou pirimidina (ou seja, citosina (C), guanina (G), adenina (A), timina (T) ou uracila (U)), um açúcar (ou seja, desoxirribose ou ribose) e um grupo fosfato. Frequentemente, a molécula de ácido nucleico é descrita pela sequência de bases, em que as referidas bases representam a estrutura primária (estrutura linear) de uma molécula de ácido nucleico. A sequência de bases é normalmente representada de 5’ a 3’. No presente documento, o termo molécula de ácido nucleico abrange ácido desoxirribonucleico (DNA), incluindo, por exemplo, DNA complementar (cDNA) e DNA genômico, ácido ribonucleico (RNA), em particular RNA mensageiro (mRNA), formas sintéticas de DNA ou RNA e polímeros mistos que compreende duas ou mais dessas moléculas. A molécula de ácido nucleico pode ser linear ou circular. Além disso, o termo molécula de ácido nucleico inclui cadeias senso e antissenso, bem como formas de fita simples e fita dupla. Além disso, a molécula de ácido nucleico descrita no presente documento pode conter nucleotídeos de ocorrência natural ou de ocorrência não natural. Exemplos de nucleotídeos de ocorrência não natural incluem bases nucleotídicas modificadas com açúcares derivados ou ligações da espinha dorsal de fosfato ou resíduos quimicamente modificados. Moléculas de ácido nucleico também abrangem moléculas de DNA e RNA que são adequadas como um vetor para expressão direta de um anticorpo da invenção in vitro e/ou in vivo, por exemplo, em um hospedeiro ou paciente. Tais vetores de DNA (por exemplo, cDNA) ou RNA (por exemplo, mRNA), podem ser modificados ou não modificados. Por exemplo, o mRNA pode ser modificado quimicamente para intensificar a estabilidade do vetor de RNA e/ou expressão da molécula codificada de modo que o mRNA possa ser injetado em um sujeito para gerar o anticorpo in vivo (consulte, por exemplo, Stadler et al. (2017) Nature Medicine 23:815-817 ou EP 2 101 823 B1).

[00267] Por molécula de ácido nucleico “isolada” ou polinucleotídeo entende-se uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA, que foi removida do seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo contido em um vetor é considerado isolado para os fins da presente invenção. Outros exemplos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeo recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeo purificados (parcial ou substancialmente) em solução. Um polinucleotídeo isolado inclui uma molécula polinucleotídica contida em células que normalmente contêm a molécula polinucleotídica, mas a molécula polinucleotídica está presente extracromossomicamente ou em uma localização cromossômica que é diferente da sua localização cromossômica natural. As moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vivo ou in vitro da presente invenção, assim como formas de cadeia positiva e negativa, e formas de cadeia dupla.

Polinucleotídeos isolados ou ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção incluem ainda tais moléculas produzidas sinteticamente. Além disso, um polinucleotídeo ou um ácido nucleico pode ser ou pode incluir um elemento regulador, como um promotor, sítio de ligação ao ribossoma ou um terminador de transcrição.

[00268] Por um ácido nucleico ou polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos pelo menos, por exemplo, 95% “idêntica” a uma sequência de nucleotídeos de referência da presente invenção, pretende-se que a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo seja idêntica à sequência de referência, exceto que a sequência de polinucleotídeos pode incluir até cinco mutações pontuais por cada 100 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de referência. Em outras palavras, para obter um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos de referência, até 5% dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser deletados ou substituídos por outro nucleotídeo, ou um número de nucleotídeos até 5% do total de nucleotídeos na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Essas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições terminais 5’ ou 3’ da sequência de nucleotídeos de referência ou em qualquer lugar entre essas posições terminais, intercaladas individualmente entre os resíduos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. Por uma questão prática, se qualquer sequência de polinucleotídeo particular é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de nucleotídeo da presente invenção, pode ser determinado convencionalmente usando programas de computador conhecidos, como os discutidos acima para polipeptídeos (por exemplo, ALIGN-2).

[00269] O termo “cassete de expressão” se refere a um polinucleotídeo gerado de forma recombinante ou sintética, com uma série de elementos de ácido nucleico especificados que permitem a transcrição de um ácido nucleico particular em uma célula alvo. O cassete de expressão recombinante pode ser incorporado em um plasmídeo, cromossoma, DNA mitocondrial, DNA plastídico, vírus ou fragmento de ácido nucleico.

Normalmente, a porção do cassete de expressão recombinante de um vetor de expressão inclui, entre outras sequências, uma sequência de ácido nucleico a ser transcrita e um promotor. Em certas modalidades, o cassete de expressão da invenção compreende sequências de polinucleotídeos que codificam moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção ou fragmentos das mesmas.

[00270] O termo “vetor” ou “vetor de expressão” é sinônimo de “construto de expressão” e se refere a uma molécula de DNA que é usada para introduzir e dirigir a expressão de um gene específico ao qual está operacionalmente associado em uma célula alvo. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico de autorreplicação, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual foi introduzido. O vetor de expressão da presente invenção compreende um cassete de expressão. Os vetores de expressão permitem a transcrição de grandes quantidades de mRNA estável. Uma vez que o vetor de expressão está dentro da célula alvo, a molécula ou proteína de ácido ribonucleico que são codificadas pelo gene são produzidas pela maquinaria de transcrição e/ou tradução celular. Em uma modalidade, o vetor de expressão da invenção compreende um cassete de expressão que compreende sequências de polinucleotídeos que codificam moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção ou fragmentos das mesmas.

[00271] Os termos “célula hospedeira”, “linha de células hospedeiras”, e “cultura de células hospedeiras” são usados de forma intercambiável e se referem às células hospedeiras nas quais o ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e a progênie derivada da mesma sem ter em conta o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica no conteúdo de ácido nucleico a uma célula parental, mas pode conter mutações. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como rastreada ou selecionada na célula originalmente transformada é incluída no presente documento. Uma célula hospedeira é qualquer tipo de sistema celular que pode ser usado para gerar as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção. As células hospedeiras incluem células cultivadas, por exemplo, células cultivadas de mamíferos, como células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de murganho P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, células de levedura, células de inseto e células de plantas, para citar somente algumas, mas também células compreendidas em um animal transgênico, planta transgênica ou planta cultivada ou tecido animal.

[00272] Uma “quantidade eficaz” de um agente se refere à quantidade que é necessária para resultar em uma alteração fisiológica na célula ou tecido ao qual é administrada.

[00273] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de um agente, por exemplo, uma composição farmacêutica, se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente, por exemplo, elimina, diminui, retarda, minimiza ou previne efeitos adversos de uma doença.

[00274] Um “indivíduo” ou “sujeito” é um mamífero.

Mamíferos incluem, sem limitação, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, humanos e primatas não humanos, como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Particularmente, o indivíduo ou sujeito é um ser humano.

[00275] O termo “composição farmacêutica” se refere a uma preparação que está em tal forma que permite que a atividade biológica de um ingrediente ativo contida seja eficaz e que não contenha componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um indivíduo ao qual a formulação seria administrada.

[00276] Um “excipiente coprocessamento aceitável” se refere a um ingrediente em uma composição farmacêutica, além de um ingrediente ativo, que não é tóxico a um indivíduo. Um excipiente coprocessamento aceitável inclui, sem limitação, um tampão, um estabilizador ou um conservante.

[00277] O termo “bula” é usado para referir-se a instruções normalmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia combinada, contraindicações e/ou advertências relativas ao uso de tais produtos terapêuticos.

[00278] Conforme usado no presente documento, “tratamento” (e variações gramaticais dos mesmos, como “tratar” ou “tratando”) se refere à intervenção clínica na tentativa de alterar o curso natural do indivíduo a ser tratado e pode ser realizado para profilaxia ou durante o curso de patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem, sem limitação, prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção da metástase, diminuição da taxa de progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença e remissão ou melhor prognóstico. Em algumas modalidades, as moléculas da invenção são usadas para atrasar o desenvolvimento de uma doença ou para retardar a progressão de uma doença.

[00279] O termo “tratamento de combinação” ou “coadministração”, conforme observado no presente documento, abrange a administração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos nas mesmas formulações ou em formulações separadas) e administração separada, em cujo caso, a administração de um anticorpo como aqui relatado pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após a administração do agente ou agentes terapêuticos adicionais, de preferência um anticorpo ou anticorpos.

[00280] Por “distúrbio proliferativo de células B” entende-se uma doença em que o número de células B em um paciente é aumentado em comparação com o número de células B em um indivíduo saudável, e particularmente em que o aumento no número de células B é o causa ou marca registrada da doença.

[00281] O termo “câncer hematológico” se refere a ou descreve a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento/proliferação celular desregulada. Assim, o termo câncer,

conforme utilizado no presente documento, refere-se a doenças proliferativas, como carcinoma, linfomas (por exemplo, linfoma de Hodgkin e não Hodgkin), blastoma, sarcoma e leucemia. Em particular, o termo câncer se refere a um distúrbio proliferativo de células B. Em um aspecto, o câncer é selecionado do grupo que consiste em linfoma não-Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfoma de células do manto (MCL), linfoma de zona marginal (MZL), mieloma múltiplo (MM) e linfoma de Hodgkin (HL).

[00282] O termo “câncer” se refere a ou descreve a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento/proliferação celular desregulada. Assim, o termo câncer, conforme utilizado no presente documento, refere-se a doenças proliferativas, como carcinoma, linfomas (por exemplo, linfoma de Hodgkin e não Hodgkin), blastoma, sarcoma e leucemia. Em particular, o termo câncer inclui leucemias linfocíticas, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP), câncer de pulmão de células bronquíolo-alviolar, câncer ósseo, câncer de pâncreas, câncer de pele, câncer de cabeça ou pescoço, cutâneo ou melanoma intraocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de mama, câncer uterino, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, doença de Hodgkin, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma dos tecidos moles, câncer da uretra, câncer do pênis, câncer da próstata, câncer da bexiga, câncer do rim ou ureter, carcinoma de células renais, carcinoma renal pelve, mesotelioma, câncer hepatocelular, câncer biliar, neoplasias do sistema nervoso central (SNC), tumores do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependymonas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma pituitário e sarcoma de Ewings, incluindo versões refratárias de qualquer um dos cânceres acima, ou uma combinação de um ou mais dos cânceres acima. Em um aspecto, o câncer é um tumor sólido. Em um outro aspecto, o câncer é um câncer hematológico, principalmente a leucemia, mais particularmente a leucemia linfoblástica aguda (LLA) ou a leucemia mieloide aguda (AML).

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CD28 AGONÍSTICO BIESPECÍFICO DA

INVENÇÃO

[00283] A invenção fornece novas moléculas agonísticas biespecíficas de ligação ao antígeno CD28 com propriedades particularmente vantajosas, como produtibilidade, estabilidade, afinidade de ligação, atividade biológica, eficiência de direcionamento, toxicidade reduzida, uma faixa de dosagem estendida que pode ser dada a um paciente e, portanto, uma eficácia possivelmente aumentada. As novas moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreendem um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora (Fc silencioso) e, assim, a reticulação inespecífica via receptores Fc é evitada. Em vez disso, os mesmos compreendem pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a um tumor, como Proteína de Ativação de Fibroblasto (FAP) ou Antígeno Carcinoembriogênico (CEA) que causa reticulação no sítio do tumor.

Assim, a ativação de células T específicas de tumor é alcançada.

[00284] No presente documento é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico com ligação monovalente a CD28, que compreende

[00285] (a) um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28,

[00286] (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e

[00287] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00288] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, conforme definido no presente documento antes, em que o domínio Fc é um IgG, particularmente um domínio Fc de IgG1 ou um domínio Fc de IgG4. Em um aspecto particular, o domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável é um domínio Fc de IgG1. O domínio Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou reduz ou elimina a função efetora. Em um aspecto, o domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A e L235A (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um aspecto, o domínio Fc é da subclasse IgG1 humana e compreende as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (numeração de acordo com o índice de EU de Kabat). Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que a molécula de ligação ao antígeno compreende um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável, em que a primeira subunidade compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:176 e a segunda subunidade compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:177.

[00289] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, conforme definido no presente documento anteriormente, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende

[00290] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada CDR-H1 de SEQ ID NO: 20, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 21, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 22, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve CDR-L1 de SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 24 e uma CDR- L3 de SEQ ID NO: 25; ou

[00291] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma CDR-H1 de SEQ ID NO: 36, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 37, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 38, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma CDR-L1 de SEQ ID NO: 39, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 40 e uma CDR-L3 de SEQ ID NO: 41.

[00292] Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma CDR-H1 de SEQ ID NO: 36, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 37, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 38, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma CDR-L1 de SEQ ID NO: 39, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 40 e uma CDR-L3 de SEQ ID NO: 41.

[00293] Em um outro aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma CDR-H1 de SEQ ID NO: 20, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 21, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 22, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma CDR-L1 de

SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 24 e uma CDR-L3 de SEQ ID NO: 25.

[00294] Além disso, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, conforme definido no presente documento antes, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.

[00295] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende

[00296] (a) as CDRs da região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e as CDRs da região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00297] (b) as CDRs da região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e as CDRs da região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, ou

[00298] (c) as CDRs da região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:51 e as CDRs da região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:61, ou

[00299] (d) as CDRs da região variável de cadeia pesada

(VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e as CDRs da região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00300] (e) as CDRs da região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e as CDRs da região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00301] (f) as CDRs da região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e as CDRs da região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:59, ou

[00302] (g) as CDRs da região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e as CDRs da região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, ou

[00303] (h) as CDRs da região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:43 e as CDRs da região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, ou

[00304] (i) as CDRs da região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e as CDRs da região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00305] (j) as CDRs da região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e as CDRs da região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:59, ou

[00306] (k) as CDRs da região variável de cadeia pesada

(VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e as CDRs da região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, ou

[00307] Em um aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende as CDRs da região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e as CDRs da cadeia leve região variável (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54.

Em um outro aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma CDR-H1 de SEQ ID NO: 489, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 490, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 491, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma CDR-L1 de SEQ ID NO: 492, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 493 e uma CDR-L3 de SEQ ID NO: 494.

[00308] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende as CDRs da região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 e as CDRs da cadeia leve região variável (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.

Em um outro aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma CDR-H1 de SEQ ID NO: 495, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 496, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 497, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma CDR-L1 de SEQ ID NO: 498, uma CDR-L2 de

SEQ ID NO: 499 e uma CDR-L3 de SEQ ID NO: 500.

[00309] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende as CDRs da região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e as CDRs da cadeia leve região variável (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.

Em um outro aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma CDR-H1 de SEQ ID NO: 501, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 502, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 503, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma CDR-L1 de SEQ ID NO: 504, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 505 e uma CDR-L3 de SEQ ID NO: 506.

[00310] Em um outro aspecto, uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico é fornecida, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 51, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 61.

[00311] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende

[00312] (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00313] (b) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, ou

[00314] (c) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:51 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:61, ou

[00315] (d) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00316] (e) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00317] (f) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:59, ou

[00318] (g) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, ou

[00319] (h) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:43 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, ou

[00320] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00321] (j) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:59, ou

[00322] (k) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27.

[00323] Em um aspecto, uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonística biespecífica é fornecida, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 se liga a CD28 com uma afinidade reduzida em comparação com um domínio de ligação ao antígeno que compreende uma região variável da cadeia pesada (VHCD28) que compreende o amino sequência de ácido da SEQ ID NO: 26 e uma região variável da cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27. A afinidade é medida por citometria de fluxo como ligação a células CHO que expressam CD28. Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 se liga a CD28 com uma afinidade reduzida em comparação com um domínio de ligação ao antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:26 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:27 compreende a CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 da região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:47 e a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:54. Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 com afinidade reduzida em comparação com um domínio de ligação ao antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:26 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:27 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:47, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:54.

[00324] Em um aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e uma cadeia leve região variável (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54.

[00325] Em um outro aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 e uma cadeia leve região variável (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.

[00326] Em um aspecto particular adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e uma cadeia leve região variável (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CD28 AGONÍSTICO BIESPECÍFICO

DIRECIONADO A CEA

[00327] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a Antígeno Carcinoembriogênico (CEA).

[00328] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, conforme descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA compreende

[00329] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:188, uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:189, e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:190, e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:191, uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:192 e uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:193; ou

[00330] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:180, uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:181, e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:182, e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:183, uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:184 e uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:185; ou

[00331] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:127, uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:128, e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:129, e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:130, uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:131 e uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:132, ou

[00332] (iv) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:507, uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:508, e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:509, e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:510, uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:511 e uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:512.

[00333] Em um aspecto particular, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 188, uma CDR-H2 que compreende o amino sequência de ácido da SEQ ID NO: 189, e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 190 e uma região variável da cadeia leve (VLCEA) que compreende uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 191, uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 192, e uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 193.

[00334] Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA compreende uma região variável da cadeia pesada (VHCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 133, e uma região variável da cadeia leve (VLCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 134. Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:133 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:134.

[00335] Em um outro aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA compreende uma região variável da cadeia pesada (VHCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 186, e uma região variável da cadeia leve (VLCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 187. Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:186 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:187.

[00336] Em um outro aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA compreende uma região variável da cadeia pesada (VHCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 513, e uma região variável da cadeia leve (VLCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 514. Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:513 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:514.

[00337] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA compreende

[00338] (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:194 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:195, ou

[00339] (b) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA)

que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:196 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:197, ou

[00340] (c) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:198 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:199, ou

[00341] (d) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:200 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:201, ou

[00342] (e) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:202 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:203, ou

[00343] (f) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:204 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:205, ou

[00344] (g) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:206 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:207, ou

[00345] (h) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:208 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:209, ou

[00346] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA)

que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:210 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:211, ou

[00347] (j) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:212 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:213.

[00348] Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:200 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:201.

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CEA AGONÍSTICO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD28

[00349] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a Proteína de Ativação de Fibroblasto (FAP).

[00350] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, conforme descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a FAP compreende

[00351] (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:12, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:13, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14, e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:15, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:16 e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:17, ou

[00352] (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:7, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8 e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9.

[00353] Em particular, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (ii) CDR-H2 que compreende o amino sequência de ácido da SEQ ID NO: 13, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 e uma região variável da cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a FAP compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18, e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:19, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10, e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:11. Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19.

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO EPCAM AGONÍSTICO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD28

[00354] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica à molécula de adesão a células epiteliais (EpCAM).

[00355] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, como descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a EpCAM compreende uma região variável de cadeia pesada (VHEpCAM) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:515, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:516, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:517 e uma região variável de cadeia leve (VLEpCAM) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:518, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:519, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:520. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a EpCAM compreende uma região variável de cadeia pesada (VHEpCAM) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 521, e uma região variável de cadeia leve (VLEpCAM) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 522. Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a EpCAM compreende uma região variável de cadeia pesada (VHEpCAM) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:521 e uma região variável de cadeia leve (VLEpCAM) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:522.

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO HER3 AGONÍSTICO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD28

[00356] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a HER3.

[00357] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, como descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a HER3 compreende uma região variável de cadeia pesada (V HHER3) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:523, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:524, e (iii) CDR- H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:525 e uma região variável de cadeia leve (V LHER3) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:526, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:527, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:528. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a HER3 compreende uma região variável de cadeia pesada (V HHER3) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 529, e uma região variável de cadeia leve (VLHER3) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 530. Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a HER3 compreende uma região variável de cadeia pesada (V HHER3) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:529 e uma região variável de cadeia leve (VLHER3) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:530.

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CD30 AGONÍSTICO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD28

[00358] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD30.

[00359] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, como descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD30 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD30) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:531, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:532, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:533 e uma região variável de cadeia leve (VLCD30) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:534, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:535, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:536. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD30 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD30) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 537, e uma região variável de cadeia leve (VLCD30) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 538. Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD30 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD30) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:537 e uma região variável de cadeia leve (VLCD30) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:538.

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO TBPG (5T4) AGONÍSTICO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD28

[00360] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a TBPG (5T4).

[00361] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico conforme descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a TBPG compreende uma região variável de cadeia pesada (VHTBPG) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:539, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:540, e (iii) CDR- H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:541, e uma região variável de cadeia leve (VLTBPG) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:542, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:543, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:544.Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a TBPG compreende uma região variável de cadeia pesada (VHTBPG) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:545, e uma região variável de cadeia leve (V LTBPG) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:546. Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a TBPG compreende uma região variável de cadeia pesada (VHTBPG) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:545 e uma região variável de cadeia leve (V LTBPG) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:546.

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO MM AGONÍSTICO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD28

[00362] A invenção também fornece novas moléculas agonísticas biespecíficas de ligação ao antígeno CD28 que são particularmente úteis no tratamento de mieloma múltiplo. As moléculas compreendem pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno de superfície celular de Mieloma Múltiplo (MM) que ocasiona reticulação na presença de células que expressam antígeno de superfície celular MM e um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora (Fc silencioso).

Assim, a reticulação inespecífica via receptores Fc é evitada e a ativação celular específica na presença de células que expressam o antígeno da superfície da célula MM é alcançada.

[00363] Assim, no presente documento é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico que compreende um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28, um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno de superfície celular de Mieloma Múltiplo (MM), e um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora. Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico conforme descrito no presente documento é caracterizada por ligação monovalente a CD28. Em um aspecto adicional, a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico conforme descrito no presente documento é caracterizada por ligação monovalente ao antígeno de superfície celular de Mieloma Múltiplo (MM).

[00364] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, conforme definido no presente documento antes, em que o domínio Fc é um IgG, particularmente um domínio Fc de IgG1 ou um domínio Fc de IgG4. Em um aspecto particular, o domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável é um domínio Fc de IgG1. O domínio Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou reduz ou elimina a função efetora. Em um aspecto, o domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A e L235A (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um aspecto, o domínio Fc é da subclasse IgG1 humana e compreende as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (numeração de acordo com o índice de EU de Kabat).

[00365] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como definido no presente documento antes, em que o antígeno de superfície de célula de MM é selecionado do grupo que consiste em CD38, BCMA e GPRC5D.

[00366] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD38.

[00367] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, como descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD38 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD38) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:547, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:548, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:549 e uma região variável de cadeia leve (VLCD38) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:550, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:551, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:552. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD38 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD38) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 553, e uma região variável de cadeia leve (VLCD38) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 554. Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD38 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD38) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:553 e uma região variável de cadeia leve (VLCD38) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:554.

[00368] Em ainda um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a BCMA.

[00369] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, como descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a BCMA compreende uma região variável de cadeia pesada

(VHBCMA) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:555, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:556, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:557 e uma região variável de cadeia leve (VLBCMA) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:558, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:559, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:560. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a BCMA compreende uma região variável de cadeia pesada (VHBCMA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 561, e uma região variável de cadeia leve (VLBCMA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 562. Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a BCMA compreende uma região variável de cadeia pesada (VHBCMA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:561 e uma região variável de cadeia leve (VLBCMA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:562.

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO GPRC5D AGONÍSTICO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD28

[00370] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a GPRC5D.

[00371] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, como descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a GPRC5D compreende uma região variável de cadeia pesada (V HGPRC5D) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:563, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:564, e (iii) CDR- H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:565 e uma região variável de cadeia leve (V LGPRC5D) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:566, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:567, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:568.

[00372] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a GPRC5D compreende uma região variável de cadeia pesada (VHGPRC5D) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO:569, SEQ ID NO:571, SEQ ID NO:572 e SEQ ID NO:573, e uma região variável de cadeia leve (V LGPRC5D) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO:570, SEQ ID NO:574, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:576, SEQ ID NO:577 e SEQ ID NO:578.

[00373] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a GPRC5D compreende uma região variável de cadeia pesada (VHGPRC5D) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96 %, 97%,

98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 569, e uma região variável de cadeia leve (VLGPRC5D) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 570. Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a GPRC5D compreende uma região variável de cadeia pesada (V HGPRC5D) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:569 e uma região variável de cadeia leve (VLGPRC5D) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:570.

[00374] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, como descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a GPRC5D compreende uma região variável de cadeia pesada (V HGPRC5D) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:579, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:580, e (iii) CDR- H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:581 e uma região variável de cadeia leve (V LGPRC5D) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:582, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:583, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:584.

[00375] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a GPRC5D compreende uma região variável de cadeia pesada (VHGPRC5D) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 585, SEQ ID NO: 586, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 588,

SEQ ID NO: 589 e SEQ ID NO:590, e uma região variável de cadeia leve (V LGPRC5D) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 591, SEQ ID NO: 592, SEQ ID NO: 593, SEQ ID NO: 594 e SEQ ID NO: 595.

[00376] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a GPRC5D compreende

[00377] (a) uma região variável de cadeia pesada (V HGPRC5D) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:569 e uma região variável de cadeia leve (VLGPRC5D) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:570, ou

[00378] (b) uma região variável de cadeia pesada (V HGPRC5D) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:573 e uma região variável de cadeia leve (VLGPRC5D) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:576, ou

[00379] (c) uma região variável de cadeia pesada (V HGPRC5D) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:569 e uma região variável de cadeia leve (VLGPRC5D) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:572, ou

[00380] (d) uma região variável de cadeia pesada (V HGPRC5D) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:586 e uma região variável de cadeia leve (VLGPRC5D) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:593, ou

[00381] (e) uma região variável de cadeia pesada (V HGPRC5D) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:587 e uma região variável de cadeia leve (VLGPRC5D) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:592.

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CD28 AGONÍSTICO BIESPECÍFICO MONOVALENTES PARA LIGAÇÃO A CD28 E MONOVALENTES PARA LIGAÇÃO AO ANTÍGENO ASSOCIADO AO TUMOR (FORMATO 1+1)

[00382] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00383] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00384] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e

[00385] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00386] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00387] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00388] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CEA, e

[00389] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00390] Em um aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 87 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88 (Molécula M).

[00391] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00392] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00393] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a FAP, e

[00394] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00395] Em um aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 67 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 68 (Molécula C).

[00396] Em um aspecto adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00397] (a) um primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00398] (b) um segundo fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e

[00399] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora,

[00400] em que o primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N- terminal da cadeia pesada de Fab do segundo fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, que, por sua vez, é fundido em seu C-terminal ao N-terminal de uma das subunidades de domínio Fc.

[00401] Em um aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77, uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78, uma primeira cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 75, e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79 (Molécula H).

[00402] Em um aspecto adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00403] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00404] (b) um domínio VH e VL capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e

[00405] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora,

[00406] em que o fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 é fundido em seu C-terminal ao N-terminal da primeira subunidade de domínio Fc, e em que um dentre o domínio VH e VL capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é fundido através de um ligante peptídico ao C-terminal da primeira subunidade de domínio Fc e o outro dentre o domínio VH e VL capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é fundido através de um ligante peptídico ao C-terminal da segunda subunidade de domínio Fc.

[00407] Em um aspecto, o ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:151 e SEQ ID NO:152. Mais particularmente, o ligante peptídico compreende a SEQ ID NO:152.

[00408] Em um aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende uma cadeia leve que compreende uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, uma primeira cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72, e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 (Molécula I).

[00409] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00410] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00411] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54,

[00412] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00413] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00414] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e

[00415] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00416] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00417] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00418] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00419] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28)

que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00420] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00421] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CEA, e que compreende

[00422] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:186 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:187, ou

[00423] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:200 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:201, ou

[00424] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:513 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:514,

[00425] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00426] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID

NO: 352, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 351, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 353 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 354 (Molécula 11A). Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 352, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 351, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 355 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 356 (Molécula 11B).

Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 352, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 351, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 357 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 358 (Molécula 11C). Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 352, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 351, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 359 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 354 (Molécula 11D). Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 370, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 369, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO: 353 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 356 (Molécula 11I). Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 370, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 369, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO: 359 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 354 (Molécula 11J). Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 370, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 369, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO: 357 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 358 (Molécula 11K). Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 370, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 369, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO: 359 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 356 (Molécula 11L). Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 376,

uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 375, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 357 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 358 (Molécula 11R).

Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 376, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 375, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 355 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 356 (Molécula 11S). Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 376, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 375, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 355 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 354 (Molécula 11T).

[00427] Em um aspecto particular, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 376, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 375, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 355 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 356 (Molécula 11S).

Em um outro aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 352, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 351, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 355 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 356 (Molécula 11B).

[00428] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00429] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28,

[00430] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e

[00431] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00432] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00433] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28,

[00434] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CEA, e

[00435] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00436] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00437] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00438] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00439] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00440] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00441] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CEA que compreende

[00442] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:186 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:187, ou

[00443] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:200 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:201, ou

[00444] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:513 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:514,

[00445] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00446] Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 361, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 360, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 362 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 363 (Molécula 11E). Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 361, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 360, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 364 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 365 (Molécula 11F). Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 361, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 360, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 366 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 367 (Molécula 11G).

Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 361, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 360, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 368 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 363 (Molécula 11H). Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 372, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 368 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 363 (Molécula 11M). Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 372, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 366 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 367 (Molécula 11N). Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 372, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 364 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 365 (Molécula 11O).

[00447] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00448] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00449] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a EpCAM, e

[00450] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00451] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00452] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00453] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00454] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00455] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00456] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a EpCAM que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:521 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:522,

[00457] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00458] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00459] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28,

[00460] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a EpCAM, e

[00461] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00462] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00463] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00464] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00465] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00466] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00467] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a EpCAM que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:521 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:522,

[00468] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00469] Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 367, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 366, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 390 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 391 (Molécula 14A).

[00470] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00471] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00472] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a HER3, e

[00473] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00474] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00475] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00476] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00477] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00478] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00479] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a HER3 que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHHER3) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:529 e uma região variável de cadeia leve (VLHER3) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:530,

[00480] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00481] Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 357, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 358, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 392 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 393 (Molécula 14B).

[00482] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00483] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28,

[00484] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a HER3, e

[00485] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00486] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00487] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00488] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00489] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00490] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00491] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a HER3 que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHHER3) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:529 e uma região variável de cadeia leve (VLHER3) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:530,

[00492] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00493] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00494] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00495] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD30, e

[00496] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00497] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00498] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00499] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00500] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00501] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00502] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD30 que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD30) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:537 e uma região variável de cadeia leve (VLCD30) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:538,

[00503] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00504] Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 357, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 358, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 394 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 395 (Molécula 14C).

[00505] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00506] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28,

[00507] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD30, e

[00508] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00509] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00510] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00511] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00512] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00513] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00514] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD30 que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD30) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:537 e uma região variável de cadeia leve (VLCD30) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:538,

[00515] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00516] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00517] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00518] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a TPBG, e

[00519] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00520] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00521] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00522] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00523] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00524] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00525] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a TPBG que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHTPBG) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:545 e uma região variável de cadeia leve (VLTPBG) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:546,

[00526] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00527] Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 357, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 358, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 396 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 397 (Molécula 14D).

[00528] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00529] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28,

[00530] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a TPBG, e

[00531] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00532] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00533] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00534] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00535] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00536] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00537] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a TPBG que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHTPBG) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:545 e uma região variável de cadeia leve (VLTPBG) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:546,

[00538] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00539] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00540] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00541] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD38, e

[00542] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00543] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00544] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00545] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28)

que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00546] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00547] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00548] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD38 que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD38) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:553 e uma região variável de cadeia leve (VLCD38) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:554,

[00549] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00550] Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 357, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 358, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 400 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 401 (Molécula 16C).

[00551] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00552] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28,

[00553] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD38, e

[00554] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00555] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00556] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00557] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00558] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00559] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00560] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a

CD38 que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD38) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:553 e uma região variável de cadeia leve (VLCD38) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:554,

[00561] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00562] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00563] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00564] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a BCMA, e

[00565] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00566] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00567] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00568] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00569] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00570] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00571] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a BCMA que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHBCMA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:561 e uma região variável de cadeia leve (VLBCMA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:562,

[00572] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00573] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00574] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28,

[00575] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a BCMA, e

[00576] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00577] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00578] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00579] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00580] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00581] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00582] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a BCMA que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHBCMA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:561 e uma região variável de cadeia leve (VLBCMA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:562,

[00583] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00584] Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 367, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 366, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 402 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 403 (Molécula 16D).

[00585] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00586] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00587] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a GPRC5D, e

[00588] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00589] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00590] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00591] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00592] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00593] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00594] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a GPRC5D que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHGPRC5D) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:569 e uma região variável de cadeia leve (VLGPRC5D) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:570,

[00595] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00596] Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 365, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 364, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 398 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 399 (Molécula 16B).

[00597] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00598] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28,

[00599] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a GPRC5D, e

[00600] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00601] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00602] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00603] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00604] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00605] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00606] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a GPRC5D que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHGPRC5D) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:569 e uma região variável de cadeia leve (VLGPRC5D) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:570,

[00607] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00608] Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 367, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 366, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 398 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 399 (Molécula 16A).

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CD28 AGONÍSTICO BIESPECÍFICO BIVALENTES PARA LIGAÇÃO A CD28 E MONOVALENTES PARA LIGAÇÃO AO ANTÍGENO ASSOCIADO AO TUMOR (FORMATO 1+2)

[00609] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como revelado no presente documento antes, que compreende

[00610] (a) um primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00611] (b) um segundo e um terceiro fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e

[00612] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora,

[00613] em que o primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N- terminal da cadeia pesada de Fab do segundo fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, que, por sua vez, é fundido em seu C-terminal ao N-terminal da primeira subunidade de domínio Fc, e o terceiro fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N-terminal da segunda subunidade de domínio Fc.

[00614] Em um aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende duas cadeias leves, em que cada uma compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78, a cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77, uma primeira cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 75, e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76 (Molécula G).

[00615] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00616] (a) um primeiro fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00617] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00618] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00619] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00620] (b) um segundo e um terceiro fragmento Fab capaz de ligação específica a um fragmento capaz de ligação específica a CEA que compreende

[00621] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:186 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:187, ou

[00622] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:200 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:201, ou

[00623] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:513 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:514,

[00624] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00625] Em um aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende duas cadeias leves, em que cada uma compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 361, a cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 368, uma primeira cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 362, e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 373 (Molécula 11P).

[00626] Em um aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende duas cadeias leves, em que cada uma compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 361, a cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 368, uma primeira cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 360, e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 374 (Molécula 11Q).

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CD28 AGONÍSTICAS DIRECIONADAS A FAP E

CEA

[00627] No presente documento também é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico com ligação monovalente a CD28, que compreende

[00628] (a) um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28,

[00629] (b) um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um primeiro antígeno associado a tumor, e

[00630] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora, caracterizado em que compreende adicionalmente um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um segundo antígeno associado a tumor.

[00631] Em um aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico triespecífico com ligação monovalente a CD28, que compreende

[00632] (a) um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28,

[00633] (b) um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA e um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a FAP,

[00634] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00635] Em um aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 87, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 388 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 389 (Molécula Y).

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO

DIRECIONADAS A ANTÍGENO DE SUPERFÍCIE DE CÉLULA B

[00636] A invenção fornece novas moléculas agonísticas biespecíficas de ligação ao antígeno CD28 com propriedades particularmente vantajosas, como produtibilidade, estabilidade, afinidade de ligação, atividade biológica, eficiência de direcionamento, toxicidade reduzida, uma faixa de dosagem estendida que pode ser dada a um paciente e, portanto, uma eficácia possivelmente aumentada. As novas moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico compreendem um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora (Fc silencioso) e, assim, a reticulação inespecífica via receptores Fc é evitada. Em vez disso, eles compreendem pelo menos um domínio de ligação de antígeno capaz de ligação específica a um antígeno de superfície de célula B, como CD19 ou CD79b, que causa a reticulação na presença de células B que expressam CD19 ou CD79b. Assim, a ativação de células T específicas na presença de células B que expressam CD19 ou CD79b é alcançada.

[00637] No presente documento é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico que compreende um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28, um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno de superfície de células B e um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora. Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico conforme descrito no presente documento é caracterizada por ligação monovalente a CD28. Em um aspecto adicional, a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico conforme descrito no presente documento é caracterizada por ligação monovalente ao antígeno de superfície de células B.

[00638] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, conforme definido no presente documento antes, em que o domínio Fc é um IgG, particularmente um domínio Fc de IgG1 ou um domínio Fc de IgG4. Em um aspecto particular, o domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável é um domínio Fc de IgG1. O domínio Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou reduz ou elimina a função efetora. Em um aspecto, o domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A e L235A (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um aspecto, o domínio Fc é da subclasse IgG1 humana e compreende as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (numeração de acordo com o índice de EU de Kabat).

[00639] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, conforme definido no presente documento anteriormente, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende

[00640] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada CDR-H1 de SEQ ID NO: 20, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 21, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 22, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve CDR-L1 de SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 24 e uma CDR- L3 de SEQ ID NO: 25; ou

[00641] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma CDR-H1 de SEQ ID NO: 36, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 37, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 38, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma CDR-L1 de SEQ ID NO: 39, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 40 e uma CDR-L3 de SEQ ID NO: 41.

[00642] Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma CDR-H1 de SEQ ID NO: 20, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 21, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 22, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma CDR-L1 de SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 24 e uma CDR-L3 de SEQ ID NO: 25.

Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico

CD28 biespecífico, conforme definido no presente documento antes, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27. Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27.

[00643] Em um outro aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma CDR-H1 de SEQ ID NO: 28, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 29, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 30, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma CDR-L1 de SEQ ID NO: 31, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 32 e uma CDR-L3 de SEQ ID NO: 33. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, conforme definido no presente documento antes, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou

100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35. Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:35.

[00644] Em um outro aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma CDR-H1 de SEQ ID NO: 36, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 37, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 38, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma CDR-L1 de SEQ ID NO: 39, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 40 e uma CDR-L3 de SEQ ID NO: 41.

[00645] Em um outro aspecto, uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico é fornecida, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 51, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 61.

[00646] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende

[00647] (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00648] (b) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, ou

[00649] (c) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:51 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:61, ou

[00650] (d) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00651] (e) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00652] (f) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:59, ou

[00653] (g) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, ou

[00654] (h) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:43 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, ou

[00655] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00656] (j) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:59, ou

[00657] (k) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27.

[00658] Em um aspecto, a molécula agonística biespecífica de ligação ao antígeno CD28 compreende um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 que compreende uma região variável da cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46 e uma região variável da cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53, ou uma região variável da cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 e uma região variável da cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54, ou uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28)

que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, ou uma variável de cadeia pesada região (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42 e uma região variável da cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27. Em um aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 e uma cadeia leve região variável (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53. Em um outro aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e uma cadeia leve região variável (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54. Em um aspecto particular adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e uma cadeia leve região variável (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27. Em ainda um outro aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e uma cadeia leve região variável (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.

[00659] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno de superfície de células B é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD19.

[00660] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico conforme descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD19 compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:406, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:407, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:408, e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:409, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:410, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:411, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:414, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:415, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:416, e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:417, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:418, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:419. Particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD19 compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 98% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:412, e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 98% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:413, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 98% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:420, e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 98% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:421. Em um aspecto particular, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:412 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:413.

[00661] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno de superfície de células B é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD79b.

[00662] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, como descrito no presente documento, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD79b compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD79b) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:422, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:423, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:424 e uma região variável de cadeia leve (VLCD79b) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:425, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:426, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:427. Em particular, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD79b compreende uma região variável da cadeia pesada (VHCD79b) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 98% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 428, e uma região variável da cadeia leve (VLCD79b) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 98% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 429. Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD79b compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD79b) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:428 e uma região variável de cadeia leve (VLCD79b) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:429.

[00663] Em um aspecto adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como definido no presente documento antes, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 é um fragmento Fab ou um fragmento crossFab. Em um aspecto particular, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 é um fragmento Fab e o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno de superfície de células B é um fragmento crossFab.

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CD28 AGONÍSTICO BIESPECÍFICO MONOVALENTES PARA LIGAÇÃO A CD28 E MONOVALENTES PARA LIGAÇÃO A UM ANTÍGENO DE SUPERFÍCIE DE CÉLULAS B (FORMATO 1+1)

[00664] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00665] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00666] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a um antígeno de superfície de células B, e

[00667] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00668] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00669] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00670] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD19, e

[00671] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00672] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00673] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00674] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00675] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00676] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00677] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD19 que compreende

[00678] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:412 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:413, ou

[00679] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:420 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:421,

[00680] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00681] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 118, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 430 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 431 (Molécula 18A).

[00682] Em um aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 116, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 430 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 431 (Molécula 18B).

[00683] Em um outro aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 122, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 114, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 430 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 431 (Molécula 18C).

[00684] Em um aspecto adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 114, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 430 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 431 (Molécula 18D).

[00685] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 123, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 118, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 430 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 431 (Molécula 18E).

[00686] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00687] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28,

[00688] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD19, e

[00689] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00690] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00691] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00692] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00693] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00694] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28)

que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00695] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD19 que compreende

[00696] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:412 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:413, ou

[00697] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:420 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:421,

[00698] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00699] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00700] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00701] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD79b, e

[00702] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00703] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00704] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00705] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00706] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00707] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00708] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD79b que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD79b) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:428 e uma região variável de cadeia leve (VLCD79b) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:429,

[00709] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00710] Em um aspecto particular, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico que compreende uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 116, uma segunda cadeia pesada cadeia que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 432 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 433 (Molécula 18F).

[00711] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00712] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28,

[00713] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD19, e

[00714] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00715] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como descrito no presente documento, que compreende

[00716] (a) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a CD28 que compreende

[00717] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00718] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00719] (iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27,

[00720] (b) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD79b que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD79b) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:428 e uma região variável de cadeia leve (VLCD79b) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:429,

[00721] e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CD28 AGONÍSTICO BIESPECÍFICO MONOVALENTES PARA LIGAÇÃO A CD28 E BIVALENTES PARA LIGAÇÃO A UM ANTÍGENO DE SUPERFÍCIE DE CÉLULAS B (FORMATO 1+2)

[00722] Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico é caracterizada por ligação bivalente ao antígeno de superfície de células B.

[00723] Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico como revelado no presente documento antes, que compreende

[00724] (a) um primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00725] (b) um segundo e um terceiro fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno de superfície de células B, e

[00726] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora,

[00727] em que o primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N- terminal da cadeia pesada de Fab do segundo fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, que, por sua vez, é fundido em seu C-terminal ao N-terminal da primeira subunidade de domínio Fc, e o terceiro fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N-terminal da segunda subunidade de domínio Fc.

MODIFICAÇÕES DO DOMÍNIO FC QUE REDUZ LIGAÇÃO AO RECEPTOR FC E/OU FUNÇÃO EFETORA

[00728] O domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico da invenção consiste em um par de cadeias polipeptídicas que compreendem domínios de cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina. Por exemplo, o domínio Fc de uma molécula de imunoglobulina G (IgG) é um dímero, em que cada subunidade do mesmo compreende os domínios constantes de cadeia pesada de IgG CH2 e CH3. As duas subunidades de o domínio Fc são capazes de associação estável entre si.

O domínio Fc confere propriedades farmacocinéticas favoráveis às moléculas de ligação ao antígeno da invenção, incluindo uma semi-vida longa no soro que contribui para uma boa acumulação no tecido alvo e uma razão de distribuição tecido-sangue favorável. Por outro lado, pode, no entanto, conduzir a direcionamento indesejável dos anticorpos biespecíficos da invenção para células que expressam receptores Fc em vez de para as células portadoras de antígeno preferenciais.

[00729] Consequentemente, o domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico da invenção exibe afinidade de ligação reduzida a um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc de IgG1 nativo. Em um aspecto, o Fc não se liga substancialmente a um receptor Fc e/ou não induz função efetora. Em um aspecto particular, o receptor Fc é um receptor Fcγ. Em um aspecto, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em um aspecto específico, o receptor Fc é um receptor Fcγ ativador humano, mais especificamente FcγRIIIa, FcγRI ou FcγRIIa humano, mais especificamente FcγRIIIa humano. Em um aspecto, o domínio Fc não induz função efetora. A função efetora reduzida pode incluir, sem limitação, um ou mais dos seguintes: citotoxicidade dependente de complemento (CDC) reduzida, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) reduzida, fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) reduzida, secreção de citocina reduzida, captação de antígeno mediada por complexo imune reduzida por células apresentadoras de antígeno, ligação a células NK reduzida, ligação a macrófagos reduzida, ligação a monócitos reduzida, ligação a células polimorfonucleares reduzida, apoptose induzida por sinalização direta reduzida, maturação de células dendríticas reduzida ou iniciação de células T reduzida.

[00730] Em certos aspectos, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo fornecido no presente documento, gerando assim uma variante da região Fc. A variante da região Fc pode compreender uma sequência de região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4) que compreende uma modificação de aminoácidos (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos.

[00731] Em um aspecto particular, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno, em que a região Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a ligação a um receptor Fc, em particular, na direção de receptor Fcγ. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo, em que a região Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos e em que o ADCC induzido pelo anticorpo é reduzido a 0-20% do ADCC induzido por um anticorpo que compreende a região Fc de IgG1 humano de tipo selvagem.

[00732] Em um aspecto, o domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno da invenção compreende uma ou mais mutações de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc e/ou função efetora. Tipicamente, a mesma mutação de um ou mais aminoácidos está presente em cada uma das duas subunidades do domínio Fc. Em particular, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácidos a uma posição de E233, L234, L235, N297, P331 e P329 (numeração EU). Em particular, o domínio Fc compreende substituições de aminoácido nas posições 234 e 235 (numeração EU) e/ou 329 (numeração EU) das cadeias pesadas de IgG. Mais particularmente, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno de acordo com a invenção que compreende um domínio Fc com as substituições de aminoácido L234A, L235A e P329G (“P329G LALA”, numeração EU) nas cadeias pesadas de IgG. As substituições de aminoácidos L234A e L235A se referem à chamada mutação LALA. A combinação “P329G LALA” de substituições de aminoácidos quase completamente abole a ligação ao receptor Fcγ de um domínio Fc de IgG1 humano e é descrita na Publicação de Pedido de Patente Internacional n° WO 2012/130831 A1 que também descreve métodos de preparação de tais domínios Fc mutantes e métodos para determinar suas propriedades, como ligação ao receptor Fc ou funções efetoras.

[00733] Os domínios Fc com ligação ao receptor Fc reduzida e/ou função efetora também incluem aqueles com substituição de um ou mais dos resíduos do domínio Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente n° US

6.737.056). Tais mutantes Fc incluem mutantes Fc com substituições em duas ou mais posições de aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o denominado mutante Fc “DANA” com substituição dos resíduos 265 e 297 por alanina (Patente n° US 7.332.581).

[00734] Em um outro aspecto, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG4. Os anticorpos IgG4 exibem afinidade de ligação reduzida aos receptores Fc e funções efetoras reduzidas em comparação com os anticorpos IgG1. Em um aspecto mais específico, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG4 que compreende uma substituição de aminoácidos na posição S228 (numeração de Kabat), particularmente a substituição de aminoácidos S228P.

Em um aspecto mais específico, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG4 que compreende as substituições de aminoácidos L235E e S228P e P329G (numeração EU). Tais mutantes de domínio Fc de IgG4 e suas propriedades de ligação ao receptor Fcγ também são descritos no documento WO 2012/130831.

[00735] Os domínios Fc mutantes podem ser preparados por deleção, substituição, inserção ou modificação de aminoácidos com o uso de métodos genéticos ou químicos bem conhecidos na técnica. Os métodos genéticos podem incluir mutagênese -específica sítio da sequência de DNA codificadora, PCR, síntese de genes e similares. As alterações corretas de nucleotídeos podem ser verificadas, por exemplo, por sequenciamento.

[00736] A ligação aos receptores Fc pode ser facilmente determinada, por exemplo, por ELISA, ou por ressonância plasmônica de superfície (SPR) com o uso de instrumentação padrão, como um instrumento BIAcore (GE Healthcare), e os receptores Fc como podem ser obtidos por expressão recombinante. Alternativamente, a afinidade de ligação dos domínios Fc ou antígenos de ativação celular que compreendem um domínio

Fc para receptores Fc pode ser avaliada com o uso de linhas de células que expressam receptores Fc particulares, como células NK humanas expressando o receptor FcγIIIa.

[00737] A função efetora de um domínio Fc, ou moléculas de ligação ao antígeno da invenção que compreende um domínio Fc, pode ser medida por métodos conhecidos na técnica. Um ensaio adequado para medir ADCC é descrito no presente documento. Outros exemplos de ensaios in vitro para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Patente n° US 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059- 7063 (1986) e Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); Patente n° US 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). Alternativamente, métodos de ensaios não radioativos podem ser empregados (consulte, por exemplo, ensaio de citotoxicidade não radioativo ACTI™ para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA) e ensaio de citotoxicidade não radioativo CytoTox 96® (Promega, Madison), WI)).

Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal como o divulgado em Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).

[00738] Em alguns aspectos, a ligação do domínio Fc a um componente do complemento, especificamente a C1q, é reduzida.

Consequentemente, em alguns aspectos em que o domínio Fc é projetado para ter função efetiva reduzida, a dita função efetora reduzida inclui CDC reduzido.

Os ensaios de ligação de C1q podem ser realizados para determinar se os anticorpos biespecíficos da invenção são capazes de se ligar a C1q e, portanto, têm atividade de CDC. Consulte, por exemplo, ELISA de ligação a C1q e C3c nos documentos WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC pode ser realizado (consulte, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); e Cragg e Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

[00739] Em um aspecto particular, o domínio Fc que exibe afinidade de ligação reduzida a um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc de IgG1 nativo, é um domínio Fc de IgG1 humano que compreende as substituições de aminoácido L234A, L235A e opcionalmente P329G, ou um domínio Fc de IgG4 humano que compreende as substituições de aminoácido S228P, L235E e opcionalmente P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Mais particularmente, é um domínio Fc de IgG1 humano que compreende as substituições de aminoácido L234A, L235A e P329G (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

MODIFICAÇÕES DO DOMÍNIO FC PROMOVENDO A HETERODIMERIZAÇÃO

[00740] As moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico da invenção compreendem diferentes sítios de ligação ao antígeno, fundidos a uma ou outra das duas subunidades do domínio Fc, portanto, as duas subunidades do domínio Fc podem ser compreendidas em duas cadeias de polipeptídeos não idênticas. A coexpressão recombinante desses polipeptídeos e a dimerização subsequente conduz a várias combinações possíveis dos dois polipeptídeos. Para melhorar o rendimento e a pureza das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção na produção recombinante, será assim vantajoso introduzir no domínio Fc das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção uma modificação que promove a associação dos polipeptídeos desejados.

[00741] Consequentemente, em aspectos particulares, a invenção se refere à molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico com ligação monovalente a CD28 que compreende (a) um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28, (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora, em que o domínio Fc compreende uma modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc. O sítio da interação proteína-proteína mais extensa entre as duas subunidades de um domínio Fc da IgG humana está no domínio CH3 do domínio Fc. Assim, em um aspecto, a dita modificação está no domínio CH3 do domínio Fc.

[00742] Em um aspecto específico, a modificação é uma modificação chamada “protuberâncias-em-buracos” (knob-into-hole), que compreende uma modificação “protuberância” (knob) em uma das duas subunidades do domínio Fc e uma modificação “buraco” (hole) na outra das duas subunidades do domínio Fc. Dessa forma, a invenção se refere à molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico com ligação monovalente a CD28 que compreende (a) um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28, (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora, em que a primeira subunidade do domínio Fc compreende protuberâncias e a segunda subunidade do domínio Fc compreende buracos de acordo com o método de protuberâncias- em-buracos. Em um aspecto particular, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos S354C e T366W (numeração

EU) e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos Y349C, T366S e Y407V (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[00743] A tecnologia “protuberâncias-em-buracos” é descrita, por exemplo, nos documentos US 5.731.168; 7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) e Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). Geralmente, o método envolve introduzir uma protuberância (“knob”) na interface de um primeiro polipeptídeo e um buraco (“hole”) correspondente na interface de um segundo polipeptídeo, de tal modo que a protuberância possa ser posicionada no buraco de modo a promover a formação de heterodímeros e impedir a formação de homodímeros. As protuberâncias são construídas substituindo pequenas cadeias laterais de aminoácidos da interface do primeiro polipeptídeo com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). Cavidades compensadoras de tamanho idêntico ou semelhante às protuberâncias são criados na interface do segundo polipeptídeo pela substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos por outras menores (por exemplo, alanina ou treonina).

[00744] Consequentemente, em um aspecto, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção, um resíduo de aminoácidos é substituído por um resíduo de aminoácidos com um volume de cadeia lateral maior, gerando assim uma protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade que é posicionável em uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade, e no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc, um resíduo de aminoácidos é substituído por um resíduo de aminoácidos tendo um volume de cadeia lateral menor, gerando assim uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade dentro da qual a protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade é posicionável. A protuberância e o buraco podem ser feitos por meio da alteração do ácido nucleico que codifica os polipeptídeos, por exemplo, por mutagênese sítio-específica ou por síntese de peptídeos. Em um aspecto específico, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc, o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de triptofano (T366W) e, no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc, o resíduo de tirosina na posição 407 é substituído por um resíduo de valina (Y407V). Em um aspecto, na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de serina (T366S) e o resíduo de leucina na posição 368 é substituído por um resíduo de alanina (L368A).

[00745] Ainda em um outro aspecto, na primeira subunidade do domínio Fc, adicionalmente o resíduo de serina na posição 354 é substituído por um resíduo de cisteína (S354C), e na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente o resíduo de tirosina na posição 349 é substituído por um resíduo de cisteína (Y349C). A introdução desses dois resíduos de cisteína conduz à formação de uma ponte dissulfeto entre as duas subunidades do domínio Fc, estabilizando ainda mais o dímero (Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15). Em um aspecto particular, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos S354C e T366W (numeração EU) e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos Y349C, T366S e Y407V (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[00746] Em um aspecto alternativo, uma associação promotora de modificações da primeira e segunda subunidades do domínio Fc compreende uma modificação que media efeitos de direção eletrostática, por exemplo, conforme descrito na publicação PCT WO 2009/089004. Geralmente, esse método envolve a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos na interface das duas subunidades do domínio Fc por resíduos de aminoácidos carregados, de modo que a formação de homodímeros se torne eletrostaticamente desfavorável, mas a heterodimerização seja eletrostaticamente favorável.

[00747] O C-terminal da cadeia pesada da molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico, conforme relatado no presente documento, pode ser um C-terminal completo terminando com os resíduos de aminoácidos PGK. O C-terminal da cadeia pesada pode ser um C- terminal encurtado no qual um ou dois dos resíduos de aminoácidos do C- terminal foram removidos. Em um aspecto preferencial, o C-terminal da cadeia pesada é um C-terminal encurtado terminando P. Em um aspecto preferencial, o C-terminal da cadeia pesada é um C-terminal encurtado terminando PG. Em um aspecto de todos os aspectos conforme relatado no presente documento, uma molécula de ligação ao antígeno CD28 que compreende uma cadeia pesada incluindo um domínio CH3 C-terminal, como especificado no presente documento, compreende o dipeptídeo glicina-lisina C-terminal (G446 e K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um aspecto de todos os aspectos conforme relatado no presente documento, uma molécula de ligação ao antígeno CD28 que compreende uma cadeia pesada incluindo um domínio CH3 C-terminal, como especificado no presente documento, compreende o resíduo glicina C-terminal (G446, numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

MODIFICAÇÕES NOS DOMÍNIOS FAB

[00748] Em um aspecto, a invenção se refere a uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico caracterizado por ligação monovalente a CD28 que compreende (a) um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28, (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora, em que o pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um fragmento Fab e um fragmento Fab ou os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL são trocados de acordo com a tecnologia Crossmab.

[00749] Anticorpos multiespecíficos com uma substituição/troca de domínio em um braço de ligação (CrossMabVH-VL ou CrossMabCH-CL) são descritos em detalhe em WO2009/080252 e Schaefer, W. et al., PNAS, 108 (2011)11187-1191. Os mesmos claramente reduzem os subprodutos causados pela incompatibilidade de uma cadeia leve contra um primeiro antígeno com a cadeia pesada incorreta contra o segundo antígeno (comparado a abordagens sem tal troca de domínio).

[00750] Em um aspecto, a invenção se refere a uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico caracterizado por ligação monovalente a CD28 que compreende (a) um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28, (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora, em que nos fragmentos Fab capazes de ligação específica a um antígeno associado a tumor, os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro de modo que o domínio CH1 seja parte da cadeia leve e o domínio CL seja parte da cadeia pesada.

[00751] Em um outro aspecto, e para melhorar ainda mais o emparelhamento correto, a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico caracterizada por ligação monovalente a CD28 que compreende (a) um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28, (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora, pode conter diferentes substituições de aminoácidos carregados (os chamados “resíduos carregados”). Essas modificações são introduzidas nos domínios CH1 e CL reticulados ou não reticulados. Em um aspecto particular, a invenção se refere a uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico, em que, em um dos domínios CL, o aminoácido na posição 123 (numeração EU) foi substituído por arginina (R) e em que o aminoácido na posição 124 (numeração EU) foi substituído por lisina (K) e em que, em um dos domínios CH1, os aminoácidos na posição 147 (numeração EU) e na posição 213 (numeração EU) foram substituídos por ácido glutâmico (E). Em um aspecto particular, no domínio CL do fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28, o aminoácido na posição 123 (numeração EU) foi substituído por arginina (R) e o aminoácido na posição 124 (numeração EU) foi substituído por lisina (K) e no domínio CH1 do fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 os aminoácidos na posição 147 (numeração EU) e na posição 213 (numeração EU) foram substituídos por ácido glutâmico (E).

POLINUCLEOTÍDEOS

[00752] A invenção fornece ainda polinucleotídeos isolados que codificam uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico como descrito no presente documento ou um fragmento da mesma. O um ou mais polinucleotídeos isolados que codificam a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico da invenção podem ser expressos como um único polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação ao antígeno inteira ou como polinucleotídeos múltiplos (por exemplo, dois ou mais) que são coexpressos. Os polipeptídeos codificados por polinucleotídeo que são coexpressos podem associar através de, por exemplo, ligações dissulfeto ou outros meios para formar uma molécula de ligação ao antígeno funcional. Por exemplo, a porção da cadeia leve de uma imunoglobulina pode ser codificada por um polinucleotídeo separado da porção de cadeia pesada da imunoglobulina. Quando coexpressos, os polipeptídeos da cadeia pesada irão se associar aos polipeptídeos de cadeia leve para formar a imunoglobulina. Em alguns aspectos, o polinucleotídeo isolado codifica toda a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico de acordo com a invenção, conforme descrito no presente documento. Em outros aspectos, o polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo compreendido na molécula de ligação ao antígeno CD28 biespecífico de acordo com a invenção, conforme descrito no presente documento. Em certos aspectos, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é DNA.

Em outros aspectos, um polinucleotídeo da presente invenção é RNA, por exemplo, na forma de RNA mensageiro (mRNA). O RNA da presente invenção pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla.

B. MÉTODOS RECOMBINANTES

[00753] As moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico da invenção podem ser obtidas, por exemplo, por síntese de peptídeo em estado sólido (por exemplo, síntese em fase sólida de Merrifield) ou produção recombinante. Para a produção recombinante, um ou mais polinucleotídeos que codificam a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico ou fragmentos polipeptídicos da mesma, por exemplo, como descrito acima, são isolados e inseridos em um ou mais vetores para posterior clonagem e/ou expressão em uma célula hospedeira.

Tal polinucleotídeo pode ser facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais.

Em um aspecto da invenção, é fornecido um vetor, de preferência um vetor de expressão, que compreende um ou mais dos polinucleotídeos da invenção.

Os métodos que são bem conhecidos pelos técnicos no assunto podem ser usados para construir vetores de expressão contendo a sequência de codificação do anticorpo (fragmento) juntamente com sinais de controle transcricionais/translacionais apropriados.

Esses métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação/recombinação genética in vivo.

Vide, por exemplo, as técnicas descritas em Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY

MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); e Ausubel et al.,

CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing

Associates e Wiley Interscience, N.Y. (1989). O vetor de expressão pode ser parte de um plasmídeo, vírus ou pode ser um fragmento de ácido nucleico.

O vetor de expressão inclui um cassete de expressão no qual o polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou fragmentos de polipeptídeos da mesma (ou seja, a região de codificação) é clonado em associação operável com um promotor e/ou outros elementos de controle de transcrição ou tradução.

Conforme usado no presente documento, uma “região de codificação” é uma porção de ácido nucleico que consiste em códons traduzidos em aminoácidos.

Embora um

“códon de parada” (TAG, TGA ou TAA) não seja traduzido em um aminoácido,

ele pode ser considerado parte de uma região de codificação, se presente, mas quaisquer sequências de flanqueamento, por exemplo, promotores, sítios de ligação a ribossomos, terminadores transcricionais, íntrons, regiões 5’ e 3’ não traduzidas e similares, não fazem parte de uma região de codificação.

Duas ou mais regiões de codificação podem estar presentes em um único construto de polinucleotídeo, por exemplo, em um único vetor, ou em construtos de polinucleotídeo separados, por exemplo, em vetores separados (diferentes).

Além disso, qualquer vetor pode conter uma única região de codificação, ou pode compreender duas ou mais regiões de codificação, por exemplo, um vetor da presente invenção pode codificar um ou mais polipeptídeos, que são pós- ou cotraducionais separados nas proteínas finais por meio de clivagem proteolítica. Além disso, um vetor, polinucleotídeo ou ácido nucleico da invenção pode codificar regiões de codificação heterólogas, fundidas ou não fundidas a um polinucleotídeo que codifica o anticorpo da invenção ou fragmentos de polipeptídeos da mesma, ou variantes ou derivados da mesma.

As regiões de codificação heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos especializados, como um peptídeo sinal secretor ou um domínio funcional heterólogo. Uma associação operável é quando uma região de codificação para um produto gênico, por exemplo, um polipeptídeo, está associada a uma ou mais sequências reguladoras de tal modo a colocar a expressão do produto gênico sob a influência ou controle da(s) sequência(s) reguladora(s). Dois fragmentos de DNA (como uma região de codificação de polipeptídeos e um promotor associado a ela) são “operativamente associados”, se a indução da função do promotor resultar na transcrição do mRNA que codifica o produto gênico desejado, e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interferir na capacidade das sequências reguladoras de expressão de dirigir a expressão do produto gênico ou interferir na capacidade do molde de DNA de ser transcrito. Assim, uma região promotora seria operacionalmente associada a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição desse ácido nucleico. O promotor pode ser um promotor específico para células que dirige a transcrição substancial do DNA apenas em células predeterminadas.

Outros elementos de controle da transcrição, além de um promotor, por exemplo, intensificadores, operadores, repressores e sinais de terminação de transcrição, podem ser operacionalmente associados ao polinucleotídeo para direcionar a transcrição específica para células.

[00754] Promotores adequados e outras regiões de controle de transcrição são revelados no presente documento. Uma variedade de regiões de controle de transcrição é conhecida pelos técnicos no assunto.

Estes incluem, sem limitação, regiões de controle de transcrição, que funcionam em células de vertebrados, como, mas não se limitando a, segmentos promotores e intensicadores de citomegalovírus (por exemplo, o promotor precoce imediato, em conjunto com o íntron-A), vírus símio 40 (por exemplo o promotor precoce) e retrovírus (como, por exemplo, vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle de transcrição incluem aquelas derivadas de genes de vertebrados, como actina, proteína de choque térmico, hormônio de crescimento bovino e β-globina de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a expressão de genes em células eucarióticas. As regiões de controle de transcrição adequadas adicionais incluem promotores e intensificadores específicos de tecido, bem como promotores induzíveis (por exemplo, promotores de tetraciclinas induzíveis). Da mesma forma, uma variedade de elementos de controle de tradução é conhecida por aqueles técnicos no assunto. Estes incluem, sem limitação, sítios de ligação a ribossomos, códons de iniciação e terminação de tradução e elementos derivados de sistemas virais (particularmente um sítio de entrada interna do ribossomo, ou IRES, também referido como uma sequência CITE).

O cassete de expressão também pode incluir outras características, como uma origem de replicação e/ou elementos de integração cromossômica, como repetições terminais longas (LTRs) retrovirais ou repetições terminais invertidas (ITRs) virais adeno-associadas (AAV).

[00755] As regiões de codificação de polinucleotídeos e ácido nucleicos da presente invenção podem ser associadas a regiões de codificação adicionais que codificam peptídeos secretores ou de sinal, que dirigem a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, se a secreção do anticorpo ou fragmentos de polipeptídeo do mesmo for desejada, o DNA que codifica uma sequência sinal pode ser colocado a montante do ácido nucleico que codifica o anticorpo da invenção ou fragmentos de polipeptídeo do mesmo. De acordo com a hipótese de sinal, as proteínas segregadas por células de mamíferos têm um peptídeo sinal ou sequência líder secretora que é clivada da proteína madura assim que a exportação da cadeia de proteína em crescimento através do retículo endoplasmático rugoso foi iniciada. Os técnicos no assunto estão cientes de que os polipeptídeos secretados por células de vertebrados geralmente têm um peptídeo sinal fundido ao N-terminal do polipeptídeo, que é clivado do polipeptídeo traduzido para produzir uma forma secretada ou “madura” do polipeptídeo. Em certas modalidades, o peptídeo sinal nativo, por exemplo, uma cadeia pesada de imunoglobulina ou peptídeo de sinal de cadeia leve é usado, ou um derivado funcional dessa sequência que retém a capacidade de dirigir a secreção do polipeptídeo que está operacionalmente associado a ele.

Alternativamente, um peptídeo sinal heterólogo de mamífero, ou um derivado funcional do mesmo, pode ser usado. Por exemplo, a sequência líder do tipo selvagem pode ser substituída pela sequência líder do ativador do plasminogênio de tecido humano (TPA) ou β-glucuronidase de camundongo.

[00756] O DNA que codifica uma sequência de proteína curta que pode ser usada para facilitar a purificação posterior (por exemplo, um marcador de histidina) ou auxiliar na marcação da molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico pode ser incluído dentro ou nas extremidades do polinucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção ou fragmentos polipeptídicos do mesmo.

[00757] Em um outro aspecto da invenção, é fornecida uma célula hospedeira que compreende um ou mais polinucleotídeos da invenção.

Em certas modalidades, é fornecida uma célula hospedeira que compreende um ou mais vetores da invenção. Os polinucleotídeos e vetores podem incorporar qualquer uma das características, individualmente ou em combinação, descritas no presente documento em relação aos polinucleotídeos e vetores, respectivamente. Em um aspecto, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada ou transfectada com) um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica (parte de) um anticorpo da invenção da invenção. Conforme usado no presente documento, o termo “célula hospedeira” se refere a qualquer tipo de sistema celular que pode ser modificado para gerar as proteínas de fusão da invenção ou fragmentos das mesmas. As células hospedeiras adequadas para a replicação e para o suporte da expressão de moléculas de ligação ao antígeno são bem conhecidas na técnica. Tais células podem ser transfectadas ou transduzidas conforme apropriado com o vetor de expressão particular e grandes quantidades de células contendo vetor podem ser cultivadas para semear fermentadores em grande escala para obter quantidades suficientes da molécula de ligação ao antígeno para aplicações clínicas. As células hospedeiras adequadas incluem micro-organismos procarióticos, como E. coli, ou várias células eucarióticas, como células de ovário de hamster chinês (CHO), células de inseto ou similares. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação não é necessária. Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado a partir da pasta celular bacteriana em uma fração solúvel e pode ser ainda purificado. Além de procariotos, micróbios eucarióticos, como fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores que codificam polipeptídeos, incluindo fungos e cepas de levedura cujas vias de glicosilação foram

“humanizadas”, resultando na produção de um polipeptídeo com um padrão de glicosilação parcialmente ou totalmente humano. Vide Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), e Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006).

[00758] As células hospedeiras adequadas para a expressão de polipeptídeos (glicosilados) também são derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e insetos. Foram identificadas numerosas cepas de baculovirais que podem ser usadas em conjunto com células de inseto, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. As culturas de células vegetais também podem ser usadas como hospedeiros. Vide, por exemplo, as Patentes n° US n.º 5.959.177, 6.040.498,

6.420.548, 7.125.978 e 6.417.429 (descrevendo a tecnologia PLANTIBODIESTM para produzir anticorpos em plantas transgênicas). As células de vertebrados podem também ser usadas como hospedeiras. Por exemplo, linhas de células de mamífero que são adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhas de células hospedeiras de mamífero úteis são a linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linha de rim embrionário humano (células 293 ou 293, como descrito, por exemplo, em Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK); células de Sertoli de camundongo (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células renais caninas (MDCK), células de fígado de rato búfalo (BRL 3A); células de pulmão humano (W138), células de fígado humano (Hep G2), células de tumor mamário de camundongo (MMT 060562), células TRI (como descrito, por exemplo, em Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC-5 e células FS4. Outras linhas de células hospedeiras de mamífero úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO-dhfr (Urlaub et al., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)); e linhas de células de mieloma, como NS0, P3X63 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhas de células hospedeiras de mamífero adequadas para a produção de anticorpos, consulte, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), páginas 255-268 (2003). As células hospedeiras incluem células cultivadas, por exemplo, células cultivadas de mamífero, células de levedura, células de inseto, células bacterianas e células vegetais, para citar apenas algumas, mas também células compreendidas em um animal transgênico, planta transgênica ou planta cultivada ou tecido animal. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula eucariótica, de preferência uma célula de mamífero, como uma célula de ovário de hamster chinês (CHO), uma célula de rim embrionário humano (HEK) ou uma célula linfoide (por exemplo, Y0, NS0, célula Sp20). As tecnologias padrão são conhecidas na técnica para expressar genes estranhos nestes sistemas. As células que expressam um polipeptídeo que compreende a cadeia pesada ou leve de uma imunoglobulina, podem ser manipuladas de modo a também expressarem a outra das cadeias de imunoglobulina de modo que o produto expresso seja uma imunoglobulina que tem uma cadeia pesada e uma cadeia leve.

[00759] Em um aspecto, é fornecido um método para produzir uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico da invenção ou fragmentos de polipeptídeo da mesma, em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira que compreende polinucleotídeos que codificam o anticorpo da invenção ou fragmentos de polipeptídeo do mesmo, conforme fornecido no presente documento, sob condições adequadas para a expressão do anticorpo da invenção ou fragmentos de polipeptídeo do mesmo, e recuperar o anticorpo da invenção ou fragmentos de polipeptídeo da mesma a partir da célula hospedeira (ou meio de cultura da célula hospedeira).

[00760] Em certos aspectos, as frações capazes de ligação específica a um antígeno de célula alvo (por exemplo, fragmentos Fab) que fazem parte da molécula de ligação ao antígeno compreendem pelo menos uma região variável de imunoglobulina capaz de se ligar a um antígeno. As regiões variáveis podem fazer parte de e ser derivadas de anticorpos de ocorrência natural ou não natural e fragmentos dos mesmos. Os métodos para produzir anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais são bem conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Harlow e Lane, “Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Os anticorpos de ocorrência não natural podem ser construídos com o uso da síntese de peptídeo em fase sólida, podem ser produzidos de forma recombinante (por exemplo, como descrito na patente n° US 4.186.567) ou podem ser obtidos, por exemplo, por meio do rastreio de bibliotecas combinatórias que compreendem cadeias pesadas variáveis e luz variável correntes (consulte, por exemplo, a patente n° US 5.969.108 por McCafferty).

[00761] Qualquer espécie animal de imunoglobulina pode ser usada na invenção. As imunoglobulinas não limitantes úteis na presente invenção podem ser de origem murina, primata ou humana. Se a proteína de fusão se destina ao uso humano, uma forma quimérica de imunoglobulina pode ser usada em que as regiões constantes da imunoglobulina são de um ser humano. Uma forma humanizada ou totalmente humana da imunoglobulina também pode ser preparada de acordo com métodos bem conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Patente n° US 5.565.332 de Winter). A humanização pode ser alcançada por vários métodos, incluindo, sem limitação, (a) enxertar CDRs não humanas (por exemplo, anticorpo do doador) na estrutura e regiões constantes humanas (por exemplo, anticorpo receptor) com ou sem retenção de resíduos de estrutura crítica (por exemplo, aqueles que são importantes para reter boas funções de afinidade de ligação ou anticorpos do antígeno), (b) enxertar apenas as regiões não humanas determinantes de especificidade (SDRs ou a-CDRs; os resíduos críticos para a interação anticorpo-antígeno) em regiões constantes e estruturais humanas, ou (c)

transplantar todos os domínios variáveis não humanos, mas “ocultar” os mesmos com uma seção similar à humana por substituição de resíduos de superfície.

Anticorpos humanizados e métodos para produzi-los são revisados,

por exemplo, em Almagro e Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), e são ainda descritos, por exemplo, em Riechmann et al., Nature 332, 323-329

(1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989);

Patentes n° US 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 e 7.087.409; Jones et al.,

Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855

(1984); Morrison e Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al.,

Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994);

Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (descrevendo enxerto de SDR (a-

CDR)); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (descrevendo “resurfacing”);

Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (descrevendo “embaralhamento

FR”); e Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) e Klimka et al., Br J Cancer

83, 252-260 (2000) (descrevendo a abordagem “seção guiada” a embaralhamento de FR). Imunoglobulinas particulares de acordo com a invenção são imunoglobulinas humanas.

Os anticorpos humanos e as regiões variáveis humanas podem ser produzidos com o uso de várias técnicas conhecidas na técnica.

Os anticorpos humanos são descritos geralmente em van Dijk e van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) e Lonberg,

Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). As regiões variáveis humanas podem fazer parte de e ser derivadas de anticorpos monoclonais humanos produzidos pelo método de hibridoma (consulte, por exemplo, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Marcel Dekker, Inc.,

Nova York, 1987)). Os anticorpos humanos e as regiões variáveis humanas também podem ser preparados pela administração de um imunógeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta ao desafio antigênico (consulte, por exemplo, Lonberg, Nat Biotech 23, 1117- 1125(2005). Anticorpos humanos e regiões variáveis humanas também podem ser gerados isolando sequências de região variável de clone Fv selecionadas de bibliotecas de exibição de fago derivadas de humanos (consulte, por exemplo, Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); e McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)). Os fagos apresentam normalmente fragmentos de anticorpo, tanto como fragmentos Fv de cadeia única (scFv) ou como fragmentos Fab.

[00762] Em certos aspectos, as moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico são projetadas para ter afinidade de ligação aumentada de acordo com, por exemplo, os métodos revelados na publicação PCT WO 2012/020006 (consulte Exemplos relacionados à maturação de afinidade) ou Publicação de Pedido de Patente n° US 2004/0132066. A capacidade de as moléculas de ligação ao antígeno da invenção se ligarem a um determinante antigênico específico pode ser medida através de um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) ou outras técnicas familiares para um versado na técnica, por exemplo, técnica de ressonância plasmônica de superfície (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), e ensaios de ligação tradicionais (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Os ensaios de competição podem ser usados para identificar uma molécula de ligação ao antígeno que compete com um anticorpo de referência pela ligação a um antígeno particular. Em certas modalidades, tal molécula de ligação ao antígeno competidor se liga ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou conformacional) que é ligado pela molécula de ligação ao antígeno de referência. Métodos exemplares detalhados para mapear um epítopo ao qual uma molécula de ligação ao antígeno se liga são fornecidos em Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” em Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). Em um ensaio de competição exemplificador, o antígeno imobilizado é incubado em uma solução que compreende uma primeira molécula de ligação ao antígeno marcada que se liga ao antígeno e uma segunda molécula de ligação ao antígeno não marcada que está sendo testada quanto à sua capacidade de competir com a primeira molécula de ligação ao antígeno para ligação ao antígeno. A segunda molécula de ligação ao antígeno pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como controle, o antígeno imobilizado é incubado em uma solução que compreende a primeira molécula de ligação ao antígeno marcada, mas não a segunda molécula de ligação ao antígeno não marcada. Após a incubação sob condições permissivas para a ligação do primeiro anticorpo ao antígeno, o excesso de anticorpo não ligado é removido e a quantidade de marcador associada ao antígeno imobilizado é medida. Se a quantidade de marcador associada ao antígeno imobilizado é substancialmente reduzida na amostra de teste em relação à amostra de controle, então isso indica que a segunda molécula de ligação ao antígeno está competindo com a primeira molécula de ligação ao antígeno pela ligação ao antígeno. Consulte Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).

[00763] As moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico da invenção preparadas conforme descrito no presente documento podem ser purificadas por técnicas conhecidas na técnica, como cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia de troca iônica, eletroforese em gel, cromatografia de afinidade, cromatografia por exclusão de tamanho e similares. As condições reais usadas para purificar uma proteína particular dependerão, em parte, de fatores, como carga líquida, hidrofobicidade, hidrofilia, etc., e serão evidentes para os técnicos no assunto.

Para purificação por cromatografia de afinidade, um anticorpo, ligante, receptor ou antígeno podem ser usados ao qual a molécula de ligação ao antígeno se liga. Por exemplo, para purificação por cromatografia de afinidade de moléculas de ligação ao antígeno da invenção, uma matriz com proteína A ou proteína G pode ser usada. A cromatografia de afinidade sequencial de proteína A ou G e a cromatografia por exclusão de tamanho podem ser usadas para isolar uma molécula de ligação ao antígeno essencialmente conforme descrito nos Exemplos. A pureza da molécula de ligação ao antígeno CD28 ou fragmentos da mesma pode ser determinada por qualquer um de uma variedade de métodos analíticos bem conhecidos, incluindo eletroforese em gel, cromatografia líquida de alta pressão e similares. Por exemplo, a molécula de ligação ao antígeno CD28 expressa conforme descrito nos Exemplos mostrou estar intacta e adequadamente montada conforme demonstrado por SDS- PAGE redutor e não redutor.

ENSAIOS

[00764] As moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico fornecidas no presente documento podem ser identificadas, rastreadas ou caracterizadas por suas propriedades físicas/químicas e/ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos na técnica.

1. ENSAIOS DE AFINIDADE

[00765] A afinidade da molécula de ligação ao antígeno fornecida no presente documento para o alvo correspondente pode ser determinada de acordo com os métodos estabelecidos nos Exemplos por ressonância plasmônica de superfície (SPR), com o uso de instrumentação padrão, como um instrumento Proteon (Bio-rad) e receptores ou proteínas alvo,

como podem ser obtidas por expressão recombinante. A afinidade da molécula de ligação do antígeno contendo trímero de ligante da família TNF para o antígeno da célula alvo também pode ser determinada por ressonância plasmônica de superfície (SPR), com o uso de instrumentação padrão, como um instrumento Proteon (Bio-rad), e receptores ou proteínas alvo, como pode ser obtido por expressão recombinante. Uma modalidade ilustrativa e exemplificativa específica para medir a afinidade de ligação é descrita no Exemplo 4. De acordo com um aspecto, KD é medida por ressonância plasmônica de superfície com o uso de uma máquina Proteon® (Bio-Rad) em 25 °C.

2. ENSAIOS DE LIGAÇÃO E OUTROS ENSAIOS

[00766] A ligação da molécula de ligação ao antígeno biespecífico fornecida no presente documento às células que expressam o receptor correspondente pode ser avaliada com o uso de linhas celulares que expressam o receptor particular ou antígeno alvo, por exemplo, por citometria de fluxo (FACS). Em um aspecto, células CHO que expressam CD28 humano (linha celular parental CHO-k1 ATCC n° CCL-61, modificada para superexpressar CD28 humano de forma estável) são usadas no ensaio de ligação.

[00767] Em um aspecto adicional, as linhas de células cancerosas que expressam o antígeno da célula alvo, por exemplo FAP ou CEA, CD19 ou CD79b, foram usadas para demonstrar a ligação das moléculas de ligação do antígeno biespecífico ao antígeno da célula alvo.

3. ENSAIOS DE ATIVIDADE

[00768] Em um aspecto, são fornecidos os ensaios para identificar moléculas de ligação ao antígeno CD28 com atividade biológica. A atividade biológica pode incluir, e. Proliferação de células T e secreção de citocinas conforme medido com o método conforme descrito no Exemplo 6 ou morte de células tumorais conforme medido no Exemplo 7. Anticorpos que têm tal atividade biológica in vivo e/ou in vitro são também fornecidos.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, FORMULAÇÕES E VIAS DE ADMINISTRAÇÃO

[00769] Em um aspecto adicional, a invenção fornece composições farmacêuticas que compreende qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico fornecidas no presente documento, por exemplo, para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos abaixo. Em uma modalidade, uma composição farmacêutica compreende uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico fornecida no presente documento e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Em um outro aspecto, uma composição farmacêutica compreende uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico fornecida no presente documento e pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, conforme descrito abaixo.

[00770] As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas dissolvidas ou dispersas em um excipiente farmaceuticamente aceitável. As frases “farmaceuticamente ou farmacologicamente aceitável” se referem a entidades moleculares e composições que geralmente não são tóxicas para os destinatários nas dosagens e concentrações empregadas, ou seja, não produzem uma reação adversa, alérgica ou outra reação adversa quando administradas a um animal, como, por exemplo, um humano, conforme apropriado. A preparação de uma composição farmacêutica que contém pelo menos uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico e, opcionalmente, um ingrediente ativo adicional será conhecida dos peritos na técnica à luz da presente divulgação, como exemplificado por Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, aqui incorporada a título de referência. Em particular,

as composições são formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Conforme usado no presente documento, “excipiente farmaceuticamente aceitável” inclui todos e quaisquer solventes, tampões, meios de dispersão, revestimentos, surfactantes, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, sais, estabilizadores e combinações dos mesmos, como seria conhecido para um versado na técnica.

[00771] As composições parenterais incluem aquelas concebidas para administração por injeção, por exemplo, injeção subcutânea, intradérmica, intralesional, intravenosa, intra-arterial intramuscular, intratecal ou intraperitoneal. Para injeção, as moléculas de ligação ao antígeno contendo trímero de ligante da família TNF da invenção podem ser formuladas em soluções aquosas, de preferência em tampões fisiologicamente compatíveis, como solução de Hanks, solução de Ringer ou tampão salino fisiológico. A solução pode conter agentes de formulação, como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico pode estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril sem pirogênio, antes do uso. As soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando as proteínas de fusão da invenção na quantidade requerida no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados abaixo, conforme necessário. A esterilidade pode ser prontamente realizada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando os vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e/ou os outros ingredientes. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções, suspensões ou emulsões injetáveis estéreis, os métodos preferenciais de preparação são técnicas de secagem a vácuo ou de liofilização que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de um meio líquido filtrado previamente filtrado estéril do mesmo.

O meio líquido deve ser adequadamente tamponado se necessário e o diluente líquido primeiro tornado isotônico antes da injeção com solução salina ou glicose suficientes.

A composição deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento, e preservada contra a ação contaminante de micro-organismos, como bactérias e fungos.

Será entendido que a contaminação com endotoxina deve ser mantida minimamente a um nível seguro, por exemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína.

Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, sem limitação: tampões,

como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto de octadecildimetilbenzilamônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio;

cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos, como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-

cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas;

polímeros hidrofílicos, como polivinilpirrolidona; aminoácidos, como glicina,

glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos,

dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas;

agentes quelantes, como EDTA; açúcares, como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn e proteína); e/ou tensoativos não iônicos, como polietilenoglicol (PEG). As suspensões aquosas para injeção podem conter compostos que aumentam a viscosidade da suspensão, como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol, dextrano ou similares.

Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizantes ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas. Adicionalmente, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosas apropriadas. Solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos, como óleo de gergelim, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, como reforços de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas.

[00772] Os ingredientes ativos podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de liberação de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são reveladas em Remington’s Pharmaceutical Sciences (18ª Ed. Mack Printing Company, 1990). Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o polipeptídeo, matrizes essas que estão na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Em modalidades particulares, a absorção prolongada de uma composição injetável pode ser alcançada pelo uso nas composições de agentes que retardam a absorção, como, por exemplo, monoestearato de alumínio, gelatina ou combinações dos mesmos. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis exemplares no presente documento incluem ainda agentes de dispersão de fármacos instersticiais, como glicoproteínas de hialuronidase neutra-ativa solúvel (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas humanas de hialuronidase PH-20 solúvel, como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Certos exemplos de sHASEGPs e métodos de uso, incluindo rHuPH20, são descritos nas Publicações de Patente n° US 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, um sHASEGP é combinado com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais, como condroitinases. Exemplos de formulações de anticorpos liofilizados são descritos na Patente n° US 6.267.958. As formulações de anticorpo aquosas incluem aquelas descritas na Patente dos EUA de nº

6.171.586 e WO2006/044908, as últimas formulações incluindo um tampão de acetato de histidina. Além das composições descritas anteriormente, as moléculas de ligação ao antígeno CD28 biespecíficas também podem ser formuladas como uma preparação de depósito. Tais formulações de atuação prolongada podem ser administradas por implantação (por exemplo, subcutânea ou intramuscularmente) ou por injeção intramuscular. Assim, por exemplo, a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico pode ser formulada com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados moderadamente solúveis, por exemplo, como um sal moderadamente solúvel.

[00773] As composições farmacêuticas que compreende a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico da invenção podem ser fabricadas por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, emulsificação, encapsulação, aprisionamento ou liofilização. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de maneira convencional com o uso de um ou mais carreadores, diluentes, excipientes ou auxiliares fisiologicamente aceitáveis que facilitam o processamento das proteínas em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. A formulação adequada depende da via de administração escolhida. A molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico da invenção pode ser formulada em uma composição em uma forma de ácido ou base livre, neutra ou sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis são sais que retêm substancialmente a atividade biológica do ácido ou base livre. Esses incluem os sais de adição de ácido, por exemplo, aqueles formados com os grupos amino livres de uma composição proteica, ou que são formados com ácidos inorgânicos, como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos, como ácido acético, oxálico, tartárico ou mandélico. Os sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas, como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico; ou bases orgânicas, como isopropilamina, trimetilamina, histidina ou procaína. Os sais farmacêuticos tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos e outros solventes próticos do que as formas de base livre correspondentes. A composição deste documento também pode conter mais de um ingrediente ativo conforme necessário para a indicação particular sendo tratada, de preferência aqueles com atividades complementares que não afetam adversamente uns aos outros. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido. As formulações a serem usadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser prontamente realizada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis.

G. MÉTODOS TERAPÊUTICOS E COMPOSIÇÕES

[00774] Qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico fornecidas no presente documento pode ser usada em métodos terapêuticos, isoladamente ou em combinação.

[00775] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico para uso como medicamento.

Em outros aspectos, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico para uso no tratamento do câncer. Em certos aspectos, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico para uso em um método de tratamento. Em certos aspectos, é fornecida no presente documento uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico para uso em um método de tratamento de um indivíduo com câncer, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz da molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico. Em uma dessas modalidades, o método compreende ainda administrar ao paciente uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo.

[00776] Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico para uso no tratamento de um distúrbio proliferativo de células B. Em aspectos particulares, a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico é para uso no tratamento de um distúrbio proliferativo de células B selecionado do grupo que consiste em linfoma não-Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfoma de células do manto (MCL), linfoma de zona marginal (MZL), mieloma múltiplo (MM) e linfoma de Hodgkin (HL). Em um aspecto particular, o câncer de células B é o linfoma não-Hodgkin ou leucemia linfoblástica aguda. Em certos aspectos, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico para uso em um método de tratamento. Em certos aspectos, é fornecida no presente documento uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico para uso em um método de tratamento de um indivíduo com câncer, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz da molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico. Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico para uso em um método de tratamento de um indivíduo que tem distúrbio proliferativo de células B, em particular, um distúrbio proliferativo de células B selecionado do grupo que consiste em linfoma não-Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfoma de células do manto (MCL), linfoma de zona marginal (MZL), Mieloma múltiplo (MM) e linfoma de Hodgkin (LH), que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico. Em uma dessas modalidades, o método compreende ainda administrar ao paciente uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo.

[00777] Em aspectos adicionais, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico conforme descrito no presente documento para uso em imunoterapia contra câncer. Em outras modalidades, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico para uso em um método de imunoterapia contra câncer. Um “paciente” de acordo com qualquer um dos aspectos acima é de preferência um ser humano.

[00778] Em um aspecto adicional, é fornecido no presente documento o uso de uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico conforme descrito no presente documento na fabricação ou preparação de um medicamento. Em uma modalidade, o medicamento é para tratamento de câncer. Em um aspecto adicional, o medicamento é para uso em um método de tratamento de câncer, que compreende a administração a um indivíduo com câncer de uma quantidade eficaz do medicamento. Em um desses aspectos, o método compreende ainda a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, como descrito abaixo. Em um outro aspecto, o medicamento é para tratamento de um distúrbio proliferativo de células B. Em um aspecto adicional, o medicamento é para uso em um método de tratamento de câncer ou um distúrbio proliferativo de células B que compreende a administração a um indivíduo com câncer de uma quantidade eficaz do medicamento.

[00779] Em um aspecto adicional, é fornecido no presente documento um método para o tratamento de um câncer. Em um aspecto, o método compreende a administração a um indivíduo que tem câncer de uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico. Em um desses aspectos, o método compreende ainda a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, conforme descrito abaixo. Um “paciente”, de acordo com qualquer um dos aspectos acima, pode ser um mamífero, de preferência, um ser humano.

[00780] Em um aspecto adicional, são fornecidas no presente documento formulações farmacêuticas que compreendem qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico conforme relatado no presente documento, por exemplo, para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos acima. Em um aspecto, uma formulação farmacêutica compreende qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico conforme relatado no presente documento e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em um outro aspecto, uma formulação farmacêutica compreende qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico, conforme relatado no presente documento e pelo menos um agente terapêutico adicional.

[00781] As moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico, conforme relatado no presente documento, podem ser usadas sozinhas ou em combinação com outros agentes em uma terapia. Por exemplo, uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, conforme relatado no presente documento, pode ser coadministrada com pelo menos um agente terapêutico adicional.

[00782] Tais terapias de combinação observadas acima abrangem a administração combinada (quando dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos nas mesmas formulações ou em formulações separadas) e administração separada, em cujo caso, a administração do anticorpo, conforme relatado no presente documento, pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou depois da administração do agente ou agentes terapêuticos adicionais. Em um aspecto, a administração da molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico e a administração de um agente terapêutico adicional ocorre dentro de cerca de um mês, ou dentro de cerca de uma, duas ou três semanas, ou dentro de cerca de um, dois, três, quatro, cinco ou seis dias, uma da outra.

[00783] Uma molécula de ligação ao antígeno, conforme relatado no presente documento (e qualquer agente terapêutico adicional), pode ser administrada por qualquer meio adequado, incluindo parenteral, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser por qualquer via adequada, por exemplo, através de injeções, como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica. Vários esquemas de dosagem incluindo, entre outros, administrações únicas ou múltiplas ao longo de vários períodos de tempo, administração em bolus e infusão de pulsos, são contemplados no presente documento.

[00784] Moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonísticas biespecíficas, conforme descrito no presente documento, seriam formuladas, dosadas e administradas de uma forma consistente com as boas práticas médicas. Os fatores a serem considerados neste contexto incluem o distúrbio específico sendo tratado, o mamífero específico sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o sítio de liberação do agente, o método de administração, o agendamento da administração, e outros fatores conhecidos pelos médicos. A molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico não precisa ser, mas é opcionalmente formulada com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. Essas são geralmente usadas nas mesmas dosagens e com vias de administração descritas no presente documento, ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente documento, ou em qualquer dosagem e por qualquer via que seja empírica/clinicamente determinada como apropriada.

[00785] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico como descrito no presente documento (quando usado sozinho ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, do tipo de anticorpo, da gravidade e do curso da doença, se o anticorpo é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, história clínica do paciente e resposta ao anticorpo e a critério do médico assistente. A molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico adequadamente administrada ao paciente de uma vez ou durante uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 µg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,5 mg/kg - 10 mg/kg) da molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico podem ser uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 µg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento seria geralmente mantido até que ocorra a supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplar do anticorpo estaria na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Assim, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação das mesmas) podem ser administradas ao paciente. Tais doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, a cada semana ou a cada três semanas (por exemplo, de modo que o paciente receba de cerca de duas a cerca de vinte ou, por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo). Pode ser administrada uma dose de carga inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.

OUTROS AGENTES E TRATAMENTOS

[00786] As moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico da invenção podem ser administradas em combinação com um ou mais outros agentes em terapia. Por exemplo, uma molécula de ligação ao antígeno da invenção pode ser coadministrada com pelo menos um agente terapêutico adicional. O termo “agente terapêutico” abrange qualquer agente que possa ser administrado para tratar um sintoma ou doença em um indivíduo que necessite de tal tratamento. Tal agente terapêutico adicional pode compreender quaisquer ingredientes ativos adequados para a indicação particular sendo tratada, de preferência, aqueles com atividades complementares que não afetam adversamente uns aos outros. Em certas modalidades, um agente terapêutico adicional é outro agente anticâncer, por exemplo, um disruptor de microtúbulos, um antimetabólito, um inibidor da topoisomerase, um intercalador de DNA, um agente alquilante, uma terapia hormonal, um inibidor da quinase, um antagonista de receptor, um ativador de apoptose de células tumorais, ou um agente antiangiogênico. Em certos aspectos, um agente terapêutico adicional é um agente imunomodulador, um agente citostático, um inibidor de adesão celular, um agente citotóxico ou citostático, um ativador de apoptose celular ou um agente que aumenta a sensibilidade das células a indutores apoptóticos.

[00787] Assim, são fornecidas moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico da invenção ou composições farmacêuticas que compreendem as mesmas para uso no tratamento de câncer, em que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é administrada em combinação com um agente quimioterapêutico, radiação e/ou outros agentes para uso na imunoterapia contra o câncer.

[00788] Tais outros agentes estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido. A quantidade eficaz de tais agentes depende da quantidade de proteína de fusão usada, do tipo de distúrbio ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou o anticorpo da invenção são geralmente usados nas mesmas dosagens e com as vias de administração, conforme descritas neste documento, ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas aqui, ou em qualquer dosagem e por qualquer via que seja empiricamente/clinicamente determinada como apropriada. Tais terapias de combinação observadas acima englobam a administração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos são incluídos na mesma ou em composições separadas) e administração separada, em cujo caso, a administração da molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou anticorpo da invenção pode ocorrer antes de, simultaneamente e/ou após a administração do agente terapêutico adicional e/ou adjuvante.

[00789] Em um aspecto adicional, é fornecida a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico, conforme descrito no presente documento anteriormente, para uso no tratamento de câncer, em que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é administrada em combinação com outro imunomodulador. O termo imunomodulador” se refere a qualquer substância, incluindo um anticorpo monoclonal que afeta o sistema imunológico. As moléculas da invenção podem ser consideradas imunomoduladoras. Os imunomoduladores podem ser usados como agentes antineoplásicos para o tratamento de câncer. Em um aspecto, os imunomoduladores incluem, sem limitação, anticorpos anti-CTLA4 (por exemplo, ipilimumabe), anticorpos anti-PD1 (por exemplo, nivolumabe ou pembrolizumabe), anticorpos PD-L1 (por exemplo, atezolizumabe, avelumabe ou durvalumabe), anticorpos OX-40, anticorpos 4-1BB e anticorpos GITR. Tais terapias de combinação observadas acima abrangem a administração combinada (onde dois ou mais agentes terapêuticos são incluídos nas mesmas ou em composições separadas) e administração separada, em cujo caso, a administração da molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após a administração do agente terapêutico adicional e/ou adjuvante.

COMBINAÇÃO COM ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DE CÉLULAS T

[00790] Em um aspecto, as moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico da invenção podem ser administradas em combinação com anticorpos biespecíficos anti-CD3 ativadores de células T.

Em um aspecto, o anticorpo biespecífico anti-CD3 de ativação de células T específico para um antígeno associado a um tumor é um anticorpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 ou um anticorpo biespecífico anti-MCSP/anti-CD3. Em um aspecto particular, o anticorpo biespecífico anti-CD3 de ativação de células T específico para um antígeno associado a um tumor é um anticorpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3.

[00791] Em um aspecto, uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor (TAA) selecionado do grupo que consiste em Proteína de

Ativação de Fibroblasto (FAP), Antígeno Carcinoembriogênico (CEA), Receptor alfa de folato (FolR1), Proteoglicano de Sulfato de Condroitina Associado ao Melanoma (MCSP), Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR), Receptor 2 do Fator de Crescimento Epidérmico Humano (HER2) e p95HER2 é adequado para administração em combinação com um anticorpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3. Em um outro aspecto particular, TAA é selecionado do grupo que consiste em Proteína de Ativação de Fibroblasto (FAP), Antígeno Carcinoembriogênico (CEA), EpCAM, HER3, CD30 ou TPBG (5T4).

[00792] Em um aspecto particular, o anticorpo biespecífico anti-CD3 para uso na combinação compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD3) que compreende sequência de CDR-H1 de SEQ ID NO:439, sequência de CDR-H2 de SEQ ID NO:440 e sequência de CDR-H3 de SEQ ID NO:441; e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD3) que compreende sequência de CDR-L1 de SEQ ID NO:442, sequência de CDR-L2 de SEQ ID NO:443 e sequência de CDR-L3 de SEQ ID NO:444. Mais particularmente, o anti-CD3 biespecífico compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD3) que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:445 e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD3) que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:446. Em um outro aspecto, o anticorpo biespecífico anti-CD3 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD3) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 445 e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD3) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 446.

[00793] Em um outro aspecto, o anticorpo biespecífico anti- CD3 para uso na combinação compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD3) que compreende sequência de CDR-H1 de SEQ ID NO:596, sequência de CDR-H2 de SEQ ID NO:597 e sequência de CDR-H3 de SEQ ID NO:598; e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD3) que compreende sequência de CDR-L1 de SEQ ID NO:599, sequência de CDR-L2 de SEQ ID NO:600 e sequência de CDR-L3 de SEQ ID NO:601. Mais particularmente, o anti-CD3 biespecífico compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD3) que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:602 e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD3) que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:603. Em um outro aspecto, o anticorpo biespecífico anti-CD20/anti-CD3 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD3) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 602 e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD3) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 603.

[00794] Em um outro aspecto, o anticorpo biespecífico anti- CD3 para uso na combinação compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD3) que compreende sequência de CDR-H1 de SEQ ID NO:604, sequência de CDR-H2 de SEQ ID NO:605 e sequência de CDR-H3 de SEQ ID NO:606; e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD3) que compreende sequência de CDR-L1 de SEQ ID NO:607, sequência de CDR-L2 de SEQ ID NO:608 e sequência de CDR-L3 de SEQ ID NO:609. Mais particularmente, o anti-CD3 biespecífico compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD3) que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:610 e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD3) que é pelo menos 90%, 95%,

96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:611. Em um outro aspecto, o anticorpo biespecífico anti-CD20/anti-CD3 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD3) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 610 e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD3) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 611.

[00795] Em um aspecto particular, o anticorpo biespecífico compreende anti-CEA/anti-CD3 um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID NO: 161, um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID NO: 162, um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID NO: 163, e um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID NO: 164. Em uma modalidade particular adicional, o anticorpo biespecífico compreende uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 161, uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 162, uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 163 e uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 164 (CEA CD3 TCB).

[00796] Em um outro aspecto particular, o anticorpo biespecífico compreende anti-CEA/anti-CD3 um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID NO: 165, um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID NO: 166, um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID NO: 167, e um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID NO: 168. Em uma modalidade particular adicional, o anticorpo biespecífico compreende uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 165, uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 166, uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 167 e uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 168 (CEACAM5 CD3 TCB).

[00797] Anticorpos biespecíficos particulares são descritos adicionalmente na publicação n° PCT WO 2014/131712 A1. Em um aspecto adicional, o anticorpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 também pode compreender um engajador de células T biespecífico (BiTE®). Em um aspecto adicional, o anticorpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 é um anticorpo biespecífico conforme descrito no documento WO 2007/071426 ou WO 2014/131712.

[00798] Em um outro aspecto, a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico da invenção que compreende um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno de superfície de células B pode ser administrada em combinação com anticorpos biespecíficos anti-CD3 ativadores de células T. Em um aspecto, o anticorpo biespecífico anti-CD3 de ativação de células T é específico para um antígeno de superfície de células B, em particular, é um anticorpo biespecífico anti- CD20/anti-CD3.

[00799] Os anticorpos biespecíficos anti-CD20/anti-CD3, conforme usado no presente documento, são anticorpos biespecíficos que compreendem um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga a CD3 e um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga a CD20. Dessa forma, o anticorpo biespecífico anti-CD20/anti-CD3 como usado no presente documento compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD3) e uma região variável de cadeia leve (VLCD3), e um segundo domínio de ligação ao antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD20) e uma região variável de cadeia leve (VLCD20).

[00800] Em um aspecto particular, o anticorpo biespecífico anti-CD20/anti-CD3 para uso na combinação compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD3) que compreende sequência de CDR-H1 de SEQ ID NO:439, sequência de CDR-H2 de SEQ ID NO:440 e sequência de CDR-H3 de SEQ ID NO:441; e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD3) que compreende sequência de CDR-L1 de SEQ ID NO:442, sequência de CDR-L2 de SEQ ID NO:443 e sequência de CDR-L3 de SEQ ID NO:444. Mais particularmente, o anti-CD20/anti-CD3 biespecífico compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD3) que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:445 e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD3) que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:446. Em um outro aspecto, o anticorpo biespecífico anti-CD20/anti-CD3 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD3) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 445 e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD3) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 446.

[00801] Em um aspecto, o anticorpo que se liga especificamente a CD3 é um anticorpo de comprimento total. Em um aspecto, o anticorpo que se liga especificamente a CD3 é um anticorpo da classe IgG humana, particularmente um anticorpo da classe IgG1 humana. Em um aspecto, o anticorpo que se liga especificamente a CD3 é um fragmento de anticorpo, particularmente uma molécula Fab ou uma molécula scFv, mais particularmente uma molécula Fab. Em um aspecto particular, o anticorpo que se liga especificamente a CD3 é uma molécula de Fab cruzada em que os domínios variáveis ou os domínios constantes da cadeia pesada e leve de Fab são trocados (isto é, substituídos uns pelos outros). Em um aspecto, o anticorpo que se liga especificamente a CD3 é um anticorpo humanizado.

[00802] Em um outro aspecto, o anticorpo biespecífico anti- CD20/anti-CD3 compreende um segundo domínio de ligação ao antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD20) que compreende sequência de CDR-H1 de SEQ ID NO:447, sequência de CDR-H2 de SEQ ID NO:448 e sequência de CDR-H3 de SEQ ID NO:449; e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD20) que compreende sequência de CDR-L1 de SEQ ID NO:450, sequência de CDR-L2 de SEQ ID NO:451 e sequência de CDR-L3 de SEQ ID NO:452. Mais particularmente, o anti-CD20/anti-CD3 biespecífico compreende um segundo domínio de ligação ao antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD20) que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:453 e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD20) que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:454. Em um outro aspecto, o anticorpo biespecífico anti-CD20/anti- CD3 compreende um segundo domínio de ligação ao antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD20) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 453 e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD20) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 454.

[00803] Em outro aspecto particular, o anticorpo biespecífico anti-CD20/anti-CD3 compreende um terceiro domínio de ligação ao antígeno que se liga ao CD20. Em particular, o anticorpo biespecífico anti-CD20/anti- CD3 compreende um terceiro domínio de ligação ao antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD20) que compreende sequência de CDR-H1 de SEQ ID NO:447, sequência de CDR-H2 de SEQ ID NO:448 e sequência de CDR-H3 de SEQ ID NO:449; e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD20) que compreende sequência de CDR-L1 de SEQ ID NO:450, sequência de CDR-L2 de SEQ ID NO:451 e sequência de CDR-L3 de SEQ ID

NO:452. Mais particularmente, o anti-CD20/anti-CD3 biespecífico compreende um terceiro domínio de ligação ao antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD20) que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:453 e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD20) que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:454. Em um aspecto particular, o anti-CD20/anti-CD3 biespecífico compreende um terceiro domínio de ligação ao antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD20) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:453 e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD20) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:454.

[00804] Em um aspecto adicional, o anticorpo biespecífico anti-CD20/anti-CD3 é um anticorpo biespecífico, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab cruzada em que os domínios variáveis ou os domínios constantes da cadeia pesada e leve do Fab são trocados, e o segundo e o terceiro, se presentes, o domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional.

[00805] Em um outro aspecto, o anticorpo biespecífico anti- CD20/anti-CD3 é anticorpo biespecífico, em que (i) o segundo domínio de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N- terminal da cadeia pesada de Fab do primeiro domínio de ligação ao antígeno, o primeiro domínio de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc, e o terceiro domínio de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N-terminal da segunda subunidade do domínio Fc, ou (ii) o primeiro domínio de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N-terminal da cadeia pesada de Fab do segundo domínio de ligação ao antígeno, o segundo domínio de ligação ao antígeno é fundido no C-

terminal da cadeia pesada de Fab ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc, e o terceiro domínio de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N-terminal da segunda subunidade do domínio Fc.

[00806] As moléculas Fab podem ser fundidas para o domínio Fc ou entre si diretamente ou por meio de um ligante peptídico, que compreende um ou mais aminoácidos, normalmente cerca de 2-20 aminoácidos. Os ligantes peptídicos são conhecidos na técnica e são descritos no presente documento. Em um aspecto, o dito ligante peptídico é (G4S)2 (SEQ ID NO:147). Outro tal ligante adequado compreende a sequência (G4S)4 (SEQ ID NO:152). Além disso, os ligantes podem compreender (uma porção de) uma região de dobradiça de imunoglobulina. Particularmente, quando uma molécula Fab é fundida ao N-terminal de uma subunidade de domínio Fc, a mesma pode ser fundida através de uma região de dobradiça de imunoglobulina ou uma porção da mesma, com ou sem um ligante peptídico adicional. Em um aspecto adicional, o anticorpo biespecífico anti-CD20/anti-CD3 compreende um domínio Fc que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor Fc e/ou função efetora. Em particular, o anticorpo biespecífico anti-CD20/anti-CD3 compreende um domínio Fc de IgG1 que compreende as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G.

[00807] Em um aspecto particular, o anticorpo biespecífico compreende anti-CD20/anti-CD3 um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID NO: 455, um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID NO: 456, um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID NO: 457, e um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID NO: 458. Em uma modalidade particular adicional, o anticorpo biespecífico compreende uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 455, uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 456, uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 457 e uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 458 (CD20 TCB).

[00808] Anticorpos biespecíficos particulares são descritos na publicação n° PCT WO 2016/020309 A1 ou WO 2015/095392 A1. Em um aspecto adicional, o anticorpo biespecífico anti-CD20/anti-CD3 também pode compreender um engajador de células T biespecífico (BiTE®). Em um aspecto adicional, o anticorpo biespecífico anti-CD20/anti-CD3 é XmAb®13676. Em um outro aspecto, o anticorpo biespecífico é REGN1979. Em um outro aspecto, o anticorpo biespecífico é FBTA05 (Lymphomun).

[00809] Em um outro aspecto da invenção, a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico da invenção é para uso em um método para tratar ou atrasar a progressão de câncer, em que a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico é usada em combinação com um anticorpo biespecífico anti-CD20/anti-CD3 e, além disso, os mesmos são combinados com um agente de bloqueio da interação PD-L1/PD-1. Um agente que bloqueia a interação PD-L1/PD-1 é um antagonista de ligação a PD-L1 ou um antagonista de ligação a PD-1. Em particular, o agente que bloqueia a interação PD-L1/PD-1 é um anticorpo anti-PD-L1 ou um anticorpo anti-PD-1.

[00810] Em um outro aspecto, a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico da invenção que compreende um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno de superfície de células MM pode ser administrada em combinação com anticorpos biespecíficos anti-CD3 ativadores de células T. Em um aspecto, o anticorpo biespecífico anti-CD3 de ativação de células T é específico para um antígeno de superfície de células MM, em particular, é um anticorpo biespecífico anti-GPRC5D/anti-CD3.

[00811] Em um aspecto particular, o anticorpo biespecífico compreende anti-GPRC5D/anti-CD3 um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID NO: 398, um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID NO: 399, um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID NO: 404, e um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID NO: 405. Em um aspecto particular adicional, o anticorpo biespecífico compreende uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 398, uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 399, uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 404 e uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 405 (GPRC5D CD3 TCB).

[00812] Em um outro aspecto, é fornecido um produto de combinação que compreende uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico conforme descrito no presente documento e um anticorpo biespecífico anti-CD3 de ativação de células T. Em um aspecto, o anticorpo biespecífico anti-CD3 de ativação de células T específico para um antígeno associado a um tumor é um anticorpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 ou um anticorpo biespecífico anti-MCSP/anti-CD3. Em um aspecto particular, o anticorpo biespecífico anti-CD3 de ativação de células T específico para um antígeno associado a um tumor é um anticorpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3.

Em um outro aspecto, o anticorpo biespecífico anti-CD3 de ativação de células T específico para um antígeno associado a tumor é um anticorpo biespecífico anti-CD20/anti-CD3. Em um aspecto adicional, o anticorpo biespecífico anti- CD3 de ativação de células T específico para um antígeno associado a tumor é um anticorpo biespecífico anti-GPRC5D/anti-CD3.

COMBINAÇÃO COM AGENTES QUE BLOQUEIAM A INTERAÇÃO PD-L1/PD-1

[00813] Em um aspecto, as moléculas de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico da invenção podem ser administradas em combinação com agentes que bloqueiam a interação PD-L1/PD-1, como um antagonista de ligação a PD-L1 ou um antagonista de ligação a PD-1, em particular um anticorpo anti-PD-L1 ou um anticorpo anti-PD-1.

[00814] Em um aspecto, o agente que bloqueia a interação PD-L1/PD-1 é um anticorpo anti-PD-L1. O termo “PD-L1”, também conhecido como CD274 ou B7-H1, se refere a qualquer PD-L1 nativo de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, seres humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), em particular a “PD-L1 humano”. A sequência de aminoácidos da PD-L1 humana completa é mostrada na UniProt (www.uniprot.org). Q9NZQ7 (SEQ ID NO: 459). O termo “antagonista de ligação ao PD-L1” se refere a uma molécula que diminui, bloqueia, inibe, revoga ou interfere na transdução de sinal resultante da interação do PD-L1 com um ou mais de seus parceiros de ligação, como PD-1, B7-1. Em alguns aspectos, um antagonista de ligação PD-L1 é uma molécula que inibe a ligação de PD-L1 aos seus parceiros de ligação. Em um aspecto específico, o antagonista de ligação a PD-L1 inibe a ligação da PD-L1 de PD-1 e/ou B7-1. Em alguns aspectos, os antagonistas de ligação a PD-L1 incluem anticorpos anti-PD-L1, fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, imunoadesinas, proteínas de fusão, oligopeptídeos e outras moléculas que diminuem, bloqueiam, inibem, anulam ou interferem na transdução de sinal que resulta da interação de PD-L1 com um ou mais dos seus parceiros de ligação, como PD-1, B7-1. Em um aspecto, um antagonista de ligação a PD-L1 reduz o sinal coestimulador negativo mediado por ou através de proteínas de superfície celular expresso em sinalização mediada por linfócitos T por através de PD-L1 de modo a tornar uma célula T disfuncional menos disfuncional (por exemplo, melhorando as respostas efetoras a reconhecimento de antígeno). Em particular, um antagonista de ligação PD-L1 é um anticorpo anti-PD-L1. O termo “anticorpo anti-PD-L1” ou “anticorpo que se liga a PD-L1 humano” ou “anticorpo que se liga especificamente a PD-L1 humano” ou “anti-PD-L1 antagonista” se refere a um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno PD-L1 humano com uma afinidade de ligação de valor KD de 1,0x 10-8 mol/l ou menos, em um aspecto de um valor KD de 1,0x10-9 mol/l ou menos. A afinidade de ligação é determinada com um ensaio de ligação convencional, como a técnica de ressonância plasmônica de superfície (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Suécia). Em um aspecto particular, o agente que bloqueia a interação PD-L1/PD-1 é um anticorpo anti-PD-L1. Em um aspecto específico, o anticorpo anti-PD-L1 é selecionado do grupo que consiste em atezolizumabe (MPDL3280A, RG7446), durvalumabe (MEDI4736), avelumabe (MSB0010718C) e MDX-1105. Em um aspecto específico, um anticorpo anti- PD-L1 é YW243.55.S70 descrito no presente documento. Em ainda um outro aspecto específico, um anticorpo anti-PD-L1 é MDX-1105 descrito no presente documento. Em ainda um outro aspecto específico, um anticorpo anti-PD-L1 é MEDI4736 (durvalumabe). Em ainda um outro aspecto, um anticorpo anti-PD- L1 é MSB0010718C (avelumabe). Mais particularmente, o agente que bloqueia a interação PD-L1/PD-1 é o atezolizumabe (MPDL3280A). Em outro aspecto, o agente que bloqueia a interação PD-L1/PD-1 é um anticorpo anti-PD-L1 que compreende um domínio variável de cadeia pesada VH(PDL-1) da SEQ ID NO:460 e um domínio variável de cadeia leve VL(PDL-1) da SEQ ID NO:461.

Em outro aspecto, o agente que bloqueia a interação PD-L1/PD-1 é um anticorpo anti-PD-L1 que compreende um domínio variável de cadeia pesada VH(PDL-1) da SEQ ID NO:462 e um domínio variável de cadeia leve VL(PDL- 1) da SEQ ID NO:463.

[00815] O termo “PD-1”, também conhecido como CD279, PD1 ou proteína de morte celular programada 1, se refere a qualquer PD-L1 nativa de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, como primatas

(por exemplo, seres humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), em particular, à proteína humana PD-1 com a sequência de aminoácidos conforme consta no número de acesso UniProt (www.uniprot.org). Q15116 (SEQ ID NO: 464). O termo “antagonista de ligação ao PD-1” se refere a uma molécula que inibe a ligação do PD-1 aos seus parceiros de ligação ao ligante.

Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PD-1 inibe a ligação ao PD-1 a PD-

L1. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PD-1 inibe a ligação ao PD-1 a PD-L2. Em algumas modalidades, o PD-1 que se liga ao antagonista inibe a ligação de PD-1 a PD-L1 e PD-L2. Em particular, um antagonista de ligação PD-L1 é um anticorpo anti-PD-L1. O termo “anticorpo anti-P1” ou

“anticorpo que se liga a PD1 humano” ou “anticorpo que se liga especificamente a PD1 humano” ou “anti-PD1 antagonista” se refere a um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno PD1 humano com uma afinidade de ligação de valor KD de 1,0x 10-8 mol/l ou menos, em um aspecto de um valor KD de 1,0x10-9 mol/l ou menos.

A afinidade de ligação é determinada com um ensaio de ligação convencional, como a técnica de ressonância plasmônica de superfície (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala,

Suécia). Em um aspecto, o agente que bloqueia a interação PD-L1/PD-1 é um anticorpo anti-PD1. Em um aspecto específico, o anticorpo anti-PD-1 é selecionado do grupo que consiste em MDX 1106 (nivolumabe), MK-3475

(pembrolizumabe), CT-011 (pidilizumabe), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001,

REGN2810, e BGB-108, em particular de pembrolizumabe e nivolumabe.

Em outro aspecto, o agente que bloqueia a interação PD-L1/PD-1 é um anticorpo anti-PD1 que compreende um domínio variável de cadeia pesada VH(PD1) da

SEQ ID NO:465 e um domínio variável de cadeia leve VL(PD1) da SEQ ID NO:466. Em outro aspecto, o agente que bloqueia a interação PD-L1/PD-1 é um anticorpo anti-PD1 que compreende um domínio variável de cadeia pesada

VH(PD1) da SEQ ID NO:467 e um domínio variável de cadeia leve VL(PD1) da SEQ ID NO:468.

[00816] Em um outro aspecto, é fornecido um produto de combinação que compreende uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico conforme descrito no presente documento e um agente que bloqueia a interação PD-L1/PD-1 como um antagonista de ligação a PD-L1 ou um antagonista de ligação a PD-1, em particular um anticorpo anti-PD-L1 ou um anticorpo anti-PD-1.

[00817] Tais terapias de combinação observadas acima abrangem a administração combinada (quando dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos nas mesmas formulações ou em formulações separadas) e administração separada, em cujo caso, a administração do agente terapêutico pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou depois da administração do agente ou agentes terapêuticos adicionais. Em uma modalidade, a administração do agonista de agente terapêutico e administração de um agente terapêutico adicional ocorre dentro de cerca de um mês, ou dentro de cerca de uma, duas ou três semanas, ou dentro de cerca de um, dois, três, quatro, cinco ou seis dias, uma da outra.

ARTIGOS DE FABRICAÇÃO

[00818] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dos distúrbios descritos acima. O artigo de fabricação compreende um recipiente, um rótulo ou bula no recipiente ou associado ao mesmo.

Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas de solução IV, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é por si só ou combinada com outra composição eficaz para tratar, prevenir e/ou diagnosticar a condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco com uma tampa que é perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico da invenção. O rótulo ou a bula indicam que a composição é usada para tratar a condição de escolha.

Além disso, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida nele, em que a composição compreende uma molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico da invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um outro agente citotóxico ou, senão, terapêutico. O artigo de fabricação nessa modalidade da invenção pode ainda compreender uma bula indicando que as composições podem ser usadas para tratar uma condição particular. Alternativa ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode compreender ainda um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

TABELA B (SEQUÊNCIAS):

SEQ Nome Sequência ID NO: 1 hu CD28 nº UniProt P10747, versão 1 2 hu FAP nº UniProt Q12884, versão 168 3 hu CEA n° de acesso UniProt P06731 4 FAP (28H1) CDR-H1 SHAMS

SEQ Nome Sequência ID NO: 5 FAP (28H1) CDR-H2 AIWASGEQYYADSVKG 6 FAP (28H1) CDR-H3 GWLGNFDY 7 FAP (28H1) CDR-L1 RASQSVSRSYLA 8 FAP (28H1) CDR-L2 GASTRAT 9 FAP (28H1) CDR-L3 QQGQVIPPT 10 FAP(28H1) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS

SHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT

AVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSS 11 FAP(28H1) VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSR

SYLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDR FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQ

VIPPTFGQGTKVEIK 12 FAP(4B9) CDR-H1 SYAMS 13 FAP(4B9) CDR-H2 AIIGSGASTYYADSVKG 14 FAP(4B9) CDR-H3 GWFGGFNY 15 FAP(4B9) CDR-L1 RASQSVTSSYLA 16 FAP(4B9) CDR-L2 VGSRRAT 17 FAP(4B9) CDR-L3 QQGIMLPPT 18 FAP(4B9) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS

SYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT

SEQ Nome Sequência ID NO:

AVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS 19 FAP(4B9) VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTS

SYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPD RFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQG

IMLPPTFGQGTKVEIK 20 CD28(SA) CDR-H1 SYYIH 21 CD28(SA) CDR-H2 CIYPGNVNTNYNEKFKD 22 CD28(SA) CDR-H3 SHYGLDWNFDV 23 CD28(SA) CDR-L1 HASQNIYVWLN 24 CD28(SA) CDR-L2 KASNLHT 25 CD28(SA) CDR-L3 QQGQTYPYT 26 CD28(SA) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT

SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS 27 CD28(SA) VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV

WLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQ

TYPYTFGGGTKVEIK 28 CD28(mAb 9,3) DYGVH CDR-H1 29 CD28(mAb 9,3) VIWAGGGTNYNSALMS

SEQ Nome Sequência ID NO: CDR-H2 30 CD28(mAb 9,3) DKGYSYYYSMDY CDR-H3 31 CD28(mAb 9,3) RASESVEYYVTSLMQ CDR-L1 32 CD28(mAb 9,3) AASNVES CDR-L2 33 CD28(mAb 9,3) QQSRKVPYT CDR-L3 34 CD28(mAb 9,3) VH EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSD

YGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYN SALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTA

VYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSS 35 CD28(mAb 9,3) VL DIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYY

VTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGV PARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFC

QQSRKVPYTFGGGTKLEIK 36 CD28 CDR-H1 SYYIH consenso 37 CD28 CDR-H2 SIYPX1X2X3X4TNYNEKFKD, em que consenso X1 é G ou R X2 é N ou D X3 é V ou G

SEQ Nome Sequência ID NO: X4 é N ou Q ou A 38 CD28 CDR-H3 SHYGX5DX6NFDV, em que consenso X5 é L ou A X6 é W ou H ou Y ou F 39 CD28 CDR-L1 X7ASQX8IX9X10X11LN, em que consenso X7 é H ou R X8 é N ou G X9 é Y ou S X10 é V ou N X11 é W ou H ou F ou Y 40 CD28 CDR-L2 X12X13SX14LX15X16, em que consenso X12 é K ou Y X13 é A ou T X14 é N ou S X15 é H ou Y X16 é T ou S 41 CD28 CDR-L3 QQX17QTYPYT, em que consenso X17 é G ou A 42 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT

SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNY CD28 VH variante a

NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS 43 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT CD28 VH variante b

SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNY

SEQ Nome Sequência ID NO:

NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

AVYFCTRSHYGLDHNFDVWGQGTTVTVSS 44 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT

SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNY CD28 VH variante c

NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

AVYFCTRSHYGADHNFDVWGQGTTVTVSS 45 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT

SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPRDGQTNY CD28 VH variante d

NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

AVYFCTRSHYGLDYNFDVWGQGTTVTVSS 46 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT

SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNY CD28 VH variante e

NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS 47 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT

SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNY CD28 VH variante f

NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

AVYFCTRSHYGLDFNFDVWGQGTTVTVSS 48 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT

SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPRNVQTNY CD28 VH variante g

NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

AVYFCTRSHYGLDHNFDVWGQGTTVTVSS 49 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT CD28 VH variante h

SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPRDVQTNY

SEQ Nome Sequência ID NO:

NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

AVYFCTRSHYGLDHNFDVWGQGTTVTVSS 50 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT

SYYIHWVRQAPGKGLEWVASIYPGNVNTRY CD28 VH variante i

ADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDT

AVYYCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS 51 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT

SYYIHWVRQAPGKGLEWVASIYPGNVATRY CD28 VH variante j

ADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDT

AVYYCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS 52 CD28 VL variante k DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV

HLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAQT

YPYTFGGGTKVEIK 53 CD28 VL variante l DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV

FLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQT

YPYTFGGGTKVEIK 54 CD28 VL variante m DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV

YLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQT

YPYTFGGGTKVEIK 55 CD28 VL variante n DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISN

YLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRF

SEQ Nome Sequência ID NO:

SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQT

YPYTFGGGTKVEIK 56 CD28 VL variante o DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV

WLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQ

TYPYTFGGGTKVEIK 57 CD28 VL variante p DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISN

YLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQT

YPYTFGGGTKVEIK 58 CD28 VL variante q DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISN

HLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQT

YPYTFGGGTKVEIK 59 CD28 VL variante r DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGIYV

YLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQT

YPYTFGGGTKVEIK 60 CD28 VL variante s DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISV

YLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQT

YPYTFGGGTKVEIK 61 CD28 VL variante t DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIYV

WLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLYSGVPSR

SEQ Nome Sequência ID NO:

FSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQ

TYPYTFGQGTKLEIK 62 CD28(SA) cadeia DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV leve WLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSR

FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQ TYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA

DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 63 CD28(SA) hu IgG4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT cadeia pesada SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY

NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNT KVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEV QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ Nome Sequência ID NO: 64 CD28(SA) hu IgG1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT PGLALA cadeia SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY pesada NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 65 VL-CD28(SA)- DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV CL”RK” WLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSR

FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQ TYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRK LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA

DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 66 CD28(SA) hu IgG1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT PGLALA Fc knob SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY

NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

SEQ Nome Sequência ID NO:

AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 67 FAP(4B9) VL-CH hu EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTS IgG1 PGLALA Fc SYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPD hole RFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQG

IMLPPTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPRE PQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF

SEQ Nome Sequência ID NO:

LVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN

HYTQKSLSLSP 68 FAP(4B9) VH- EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS Ckappa SYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYY

ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL

SSPVTKSFNRGEC 69 CD28(SA) VHCH- QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT VHCH Fc knob SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY FAP(4B9) VH NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

PGLALA AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLVQS GAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWV RQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDR ATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTR SHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE

SEQ Nome Sequência ID NO:

PKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLR LSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQ

GTLVTVSS 70 CD28(SA) VHCH- QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT VHCH Fc hole SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY FAP(4B9) VL NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

PGLALA AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLVQS GAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWV RQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDR ATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTR SHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPS

SEQ Nome Sequência ID NO:

VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE PKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTIS KAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSC AVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERAT LSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLIN VGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEP

EDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIK 71 CD28(SA) VHCH- Fc QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT knob FAP(4B9) VH SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY

NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY

SEQ Nome Sequência ID NO:

RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQ PGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG KGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGG

FNYWGQGTLVTVSS 72 CD28(SA) VHCH- Fc QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT hole FAP(4B9) VL SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY

NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKN QVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS

SEQ Nome Sequência ID NO:

GGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSP GERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQA PRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTI SRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEI

K 73 CD28(SA) VHCH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT “EE”- Fc PGLALA SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY FAP(4B9) VHCL NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQ PGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG KGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGG FNYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQ

SEQ Nome Sequência ID NO:

LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA

DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 74 FAP(4B9) VLCH1 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTS

SYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPD RFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQG IMLPPTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS

LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD 75 CD28(SA) VLCH1- DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV FAP(4B9) VHCH1 WLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSR “EE”- Fc knob FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQ

PGLALA TYPYTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDG GGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS AIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPA

SEQ Nome Sequência ID NO:

PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP CRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL

SP 76 FAP(4B9) VHCH1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS “EE”- Fc hole SYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYY

PGLALA ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD EKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEK TISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSL SCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSC

SVMHEALHNHYTQKSLSLSP 77 CD28(SA) VHCL QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT

SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY

SEQ Nome Sequência ID NO:

NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH

QGLSSPVTKSFNRGEC 78 FAP(4B9) VLCL “RK” EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTS

SYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPD RFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQG IMLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDR KLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA

DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 79 Fc hole PGLALA DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL

MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQ PREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL

HNHYTQKSLSLSP 80 Fc knob –FAP(4B9) DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL

VH MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ

SEQ Nome Sequência ID NO:

DWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIG SGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLV

TVSS 81 CD28(SA) VHCH1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT “EE”- Fc PGLALA SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY

CEA VHCL NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS

SEQ Nome Sequência ID NO:

GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQ PGRSLRLSCAASGFTVSSYWMHWVRQAPG KGLEWVGFIRNKANGGTTEYAASVKGRFTIS RDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG LRFYFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR

GEC 82 CEAVLCH1 QAVLTQPASLSASPGASASLTCTLRRGINVG

AYSIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQG SGVSSRFSASKDASANAGILLISGLQSEDEA DYYCMIWHSGASAVFGGGTKLTVLSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK

KVEPKSC 83 CD28(SA) VHCH1- QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT Fc knob CEA VH SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY

NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS

SEQ Nome Sequência ID NO:

VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQ PGRSLRLSCAASGFTVSSYWMHWVRQAPG KGLEWVGFIRNKANGGTTEYAASVKGRFTIS RDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG

LRFYFDYWGQGTTVTVSS 84 CD28(SA) VHCH1- QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT Fc hole CEA VL SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY

NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKN QVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY

SEQ Nome Sequência ID NO:

KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPASLSASP GASASLTCTLRRGINVGAYSIYWYQQKPGSP PQYLLRYKSDSDKQQGSGVSSRFSASKDAS ANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWHSGASAV

FGGGTKLTVL 85 CD28(SA) VHCH1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT “EE”- Fc hole SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY

PGLALA HYRF NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKN QVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSP 86 Fc knob PGLALA DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL

MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ

SEQ Nome Sequência ID NO:

DWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL

HNHYTQKSLSLSP 87 CEA VL-CH1 hu QAVLTQPASLSASPGASASLTCTLRRGINVG IgG1 PGLALA Fc AYSIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQG hole SGVSSRFSASKDASANAGILLISGLQSEDEA

DYYCMIWHSGASAVFGGGTKLTVLSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKT ISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLS CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCS

VMHEALHNHYTQKSLSLSP 88 CEAVH-CL EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVS

SYWMHWVRQAPGKGLEWVGFIRNKANGGT TEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVS SASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN

SEQ Nome Sequência ID NO:

NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT

HQGLSSPVTKSFNRGEC 89 CD28(mAb 9,3) DIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYY cadeia leve VTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGV

PARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFC QQSRKVPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN

RGEC 90 CD28(mAb 9,3) hu EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSD IgG1 PGLALA cadeia YGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYN pesada SALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTA

VYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

SEQ Nome Sequência ID NO:

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 91 CD28(mAb 9,3) hu EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSD IgG cadeia leve “RK” YGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYN

SALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTA VYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 92 CD28(mAb 9,3) hu DIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYY IgG1 PGLALA Fc VTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGV knob “EE” PARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFC

QQSRKVPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFP PSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC

SEQ Nome Sequência ID NO: 93 CD28(mAb 9,3) EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSD VHCH-VHCH Fc YGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYN knob FAP(4B9) VH SALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTA

PGLALA VYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVKLQQS GPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWV RQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSR KSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCAR DKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLR LSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV

SEQ Nome Sequência ID NO:

SAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQ

GTLVTVSS 94 CD28(mAb 9,3) EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSD VHCH-VHCH Fc hole YGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYN FAP(4B9) VL SALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTA

PGLALA VYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVKLQQS GPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWV RQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSR KSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCAR DKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTIS KAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSC AVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV

SEQ Nome Sequência ID NO:

MHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERAT LSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLIN VGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEP

EDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIK 95 CD28(mAb 9,3) EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSD VHCH- Fc knob YGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYN FAP(4B9) VH SALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTA

VYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQ PGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG KGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGG FNYWGQGTLVTVSS

SEQ Nome Sequência ID NO: 96 CD28(mAb 9,3) EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSD VHCH- Fc hole YGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYN FAP(4B9) VL SALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTA

VYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKN QVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSP GERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQA PRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTI SRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEI

K 97 CD28(mAb 9,3) EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSD VHCH “EE”- Fc YGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYN PGLALA FAP(4B9) SALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTA

VHCL VYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED

SEQ Nome Sequência ID NO:

YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQ PGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG KGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGG FNYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA

DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 98 CD28(mAb 9,3) DIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYY VLCL “RK” VTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGV

PARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFC QQSRKVPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFP PSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN

SEQ Nome Sequência ID NO:

RGEC 99 FAP(4B9) VLCH1 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTS

LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 100 CD28(mAb 9,3) DIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYY VLCH1- FAP(4B9) VTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGV VHCH1 “EE”- Fc PARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFC knob PGLALA QQSRKVPYTFGGGTKLEIKSSASTKGPSVFP

LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCDGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPG GSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL EWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT

SEQ Nome Sequência ID NO:

KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK

SLSLSP 101 CD28(mAb 9,3) EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSD

VHCL YGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYN SALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTA VYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSS ASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH

QGLSSPVTKSFNRGEC 102 CD28(mAb 9,3) EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSD VHCH1 “EE”- Fc YGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYN

PGLALA CEA VHCL SALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTA VYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA

SEQ Nome Sequência ID NO:

PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQ PGRSLRLSCAASGFTVSSYWMHWVRQAPG KGLEWVGFIRNKANGGTTEYAASVKGRFTIS RDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG LRFYFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR

GEC 103 CD28(mAb 9,3) EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSD VHCH1- Fc knob YGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYN

CEA VH SALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTA VYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN

SEQ Nome Sequência ID NO:

QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQ PGRSLRLSCAASGFTVSSYWMHWVRQAPG KGLEWVGFIRNKANGGTTEYAASVKGRFTIS RDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG

LRFYFDYWGQGTTVTVSS 104 CD28(mAb 9,3) EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSD VHCH1- Fc hole YGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYN

CEA VL SALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTA VYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKN QVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPASLSASP GASASLTCTLRRGINVGAYSIYWYQQKPGSP

SEQ Nome Sequência ID NO:

PQYLLRYKSDSDKQQGSGVSSRFSASKDAS ANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWHSGASAV

FGGGTKLTVL 105 CD28(mAb 9,3) EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSD VHCH1 “EE”- Fc hole YGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYN

PGLALA HYRF SALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTA VYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKN QVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 106 CD28(mAb 9,3) DIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYY VLCL “RK” VTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGV

SEQ Nome Sequência ID NO:

RGEC 107 CD28(SA) VHCH1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT “EE” Fc hole SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY PGLALA FAP(4B9) NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT VH – CEA(Medi-565) AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS

VHCL ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQ PGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG KGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGG FNYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCA ASGFTVSSYWMHWVRQAPGKGLEWVGFIR NKANGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYL QMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWG

SEQ Nome Sequência ID NO:

QGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK

VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 108 CD28(SA) VHCH1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT “EE” Fc knob SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY PGLALA FAP(4B9) NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

VL AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKN QVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSP GERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQA PRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTI SRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEI

K 109 CEA VLCH1 QAVLTQPASLSASPGASASLTCTLRRGINVG

SEQ Nome Sequência ID NO:

KVEPKSC 110 CD28(SA) VHCH1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT Fc hole PGLALA SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY FAP(4B9) VH – CEA NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

VH AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQ PGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG KGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRD

SEQ Nome Sequência ID NO:

NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGG FNYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCA ASGFTVSSYWMHWVRQAPGKGLEWVGFIR NKANGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYL QMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWG

QGTTVTVSS 111 CD28(SA) VHCH1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT Fc knob PGLALA SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY FAP(4B9) VL – CEA NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

VL AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKN QVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSP GERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQA PRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTI

SEQ Nome Sequência ID NO:

SRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEI KGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQP ASLSASPGASASLTCTLRRGINVGAYSIYWY QQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQGSGVSSR FSASKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMI

WHSGASAVFGGGTKLTVL 112 VH (CD28 SA) CH1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (EE)- Fc knob SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY

PGLALA NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 113 VH (CD28 variante g) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT CH1 (EE) - Fc knob SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPRNVQTNY

PGLALA NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT AVYFCTRSHYGLDHNFDVWGQGTTVTVSSA

SEQ Nome Sequência ID NO:

STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQV SLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF

SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 114 VH (CD28 variante f) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT CH1 (EE) - Fc knob SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNY

PGLALA NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT AVYFCTRSHYGLDFNFDVWGQGTTVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQV SLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF

SEQ Nome Sequência ID NO:

SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 115 VH (CD28 variante j) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT CH1 (EE) - Fc knob SYYIHWVRQAPGKGLEWVASIYPGNVATRY

PGLALA ADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDT AVYYCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 116 VH (CD28 variante e) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT CH1 (EE)- Fc knob SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNY

PGLALA NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED

SEQ Nome Sequência ID NO:

PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 117 VH (CD28 variante b) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT CH1 (EE) - Fc knob SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNY

PGLALA NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT AVYFCTRSHYGLDHNFDVWGQGTTVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQV SLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF

SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 118 VH (CD28 variante a) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT CH1 (EE) - Fc knob SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNY

PGLALA NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS

SEQ Nome Sequência ID NO:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 119 VH (CD28 variante i) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT CH1 (EE) - Fc knob SYYIHWVRQAPGKGLEWVASIYPGNVNTRY

SEQ Nome Sequência ID NO:

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 120 VL (CD28 variante DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV k)-CL (RK) HLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRF

SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAQT YPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY

EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 121 VL (CD28 variante l)- DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV CL (RK) FLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRF

SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQT YPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY

EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 122 VL (CD28 variante DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV m)-CL (RK) YLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRF

EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 123 VL (CD28 variante r)- DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGIYV CL (RK) YLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRF

SEQ Nome Sequência ID NO:

EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 124 VL (CD28 variante DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISV s)-CL (RK) YLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRF

EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 125 VL (CD28 variante t)- DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIYV CL (RK) WLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLYSGVPSR

FSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQ TYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRK LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA

DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 126 Fc hole PGLALA, DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL

HYRF MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQ PREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGF

SEQ Nome Sequência ID NO:

YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL

HNRFTQKSLSLSP 127 CEA CDR-H1 SYWMH 128 CEA CDR-H2 FIRNKANGGTTEYAASVKG 129 CEA CDR-H3 DRGLRFYFDY 130 CEA CDR-L1 TLRRGINVGAYSIY 131 CEA CDR-L2 YKSDSDKQQGSGV 132 CEA CDR-L3 MIWHSGASAV 133 CEA VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVS

SYWMHWVRQAPGKGLEWVGFIRNKANGGT TEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVS

S 134 CEA VL QAVLTQPASLSASPGASASLTCTLRRGINVG

AYSIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQG SGVSSRFSASKDASANAGILLISGLQSEDEA

DYYCMIWHSGASAVFGGGTKLTVL 135 FAP ECD humano RPSRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKTF marcado com His FPNWISGQEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTI

LSNRTMKSVNASNYGLSPDRQFVYLESDYS KLWRYSYTATYYIYDLSNGEFVRGNELPRPI QYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGDPP

SEQ Nome Sequência ID NO:

FQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLATKYAL WWSPNGKFLAYAEFNDTDIPVIAYSYYGDE QYPRTINIPYPKAGAKNPVVRIFIIDTTYPAYV GPQEVPVPAMIASSDYYFSWLTWVTDERVC LQWLKRVQNVSVLSICDFREDWQTWDCPKT QEHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSYDAISYYK IFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAIN IFRVTQDSLFYSSNEFEEYPGRRNIYRISIGS YPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSDYAKY YALVCYGPGIPISTLHDGRTDQEIKILEENKEL ENALKNIQLPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQ FDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWI SYLASKEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVY RKLGVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIW GWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVS SWEYYASVYTERFMGLPTKDDNLEHYKNST VMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSA QIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLST NHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHH

HHH 136 FAP de camundongo n° de acesso UniProt P97321 137 FAP ECD de RPSRVYKPEGNTKRALTLKDILNGTFSYKTY camundongo FPNWISEQEYLHQSEDDNIVFYNIETRESYIIL marcado com His SNSTMKSVNATDYGLSPDRQFVYLESDYSK

LWRYSYTATYYIYDLQNGEFVRGYELPRPIQ

SEQ Nome Sequência ID NO:

YLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGDPPF QITYTGRENRIFNGIPDWVYEEEMLATKYAL WWSPDGKFLAYVEFNDSDIPIIAYSYYGDGQ YPRTINIPYPKAGAKNPVVRVFIVDTTYPHHV GPMEVPVPEMIASSDYYFSWLTWVSSERVC LQWLKRVQNVSVLSICDFREDWHAWECPK NQEHVEESRTGWAGGFFVSTPAFSQDATSY YKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWE AIYIFRVTQDSLFYSSNEFEGYPGRRNIYRISI GNSPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSYKA KYYALVCYGPGLPISTLHDGRTDQEIQVLEE NKELENSLRNIQLPKVEIKKLKDGGLTFWYK MILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVKSV FAVNWITYLASKEGIVIALVDGRGTAFQGDKF LHAVYRKLGVYEVEDQLTAVRKFIEMGFIDE ERIAIWGWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIA VAPVSSWEYYASIYSERFMGLPTKDDNLEH YKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHF QNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGIL SGRSQNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKK

KGHHHHHH 138 FAP ECD de RPPRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKTF cynomolgus marcado FPNWISGQEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTI com His LSNRTMKSVNASNYGLSPDRQFVYLESDYS

KLWRYSYTATYYIYDLSNGEFVRGNELPRPI

SEQ Nome Sequência ID NO:

QYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGDPP FQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLATKYAL WWSPNGKFLAYAEFNDTDIPVIAYSYYGDE QYPRTINIPYPKAGAKNPFVRIFIIDTTYPAYV GPQEVPVPAMIASSDYYFSWLTWVTDERVC LQWLKRVQNVSVLSICDFREDWQTWDCPKT QEHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSYDAISYYK IFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAIN IFRVTQDSLFYSSNEFEDYPGRRNIYRISIGS YPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSDYAKY YALVCYGPGIPISTLHDGRTDQEIKILEENKEL ENALKNIQLPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQ FDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWI SYLASKEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVY RKLGVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIW GWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVS SWEYYASVYTERFMGLPTKDDNLEHYKNST VMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSA QIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLST NHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHH

HHH 139 FolR1 humano n° de acesso UniProt P15328 140 FolR1 murino n° de acesso UniProt P35846 141 FolR1 de n° de acesso UniProt G7PR14

SEQ Nome Sequência ID NO: cynomolgus 142 MCSP humano n° de acesso UniProt Q6UVK1 143 EGFR humano n° de acesso UniProt P00533 144 HER2 humano n° de acesso UniProt P04626 145 p95 HER2 MPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDK

GCPAEQRASPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGI LIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGA MPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVY KGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEIL DEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQ LMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQI AKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHV KITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKWMAL ESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAK PYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMI MVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDP QRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDM GDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMV HHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRS PLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPT HDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCS PQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAG ATLERPKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENP EYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWD

SEQ Nome Sequência ID NO:

QDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVP

V 146 Ligante peptídico GGGGS (G4S) 147 Ligante peptídico GGGGSGGGGS (G4S)2 148 Ligante peptídico SGGGGSGGGG (SG4)2 149 Ligante peptídico GGGGSGGGGSGGGG G4(SG4)2 150 Ligante peptídico GSPGSSSSGS 151 (G4S)3 ligante GGGGSGGGGSGGGGS peptídico 152 (G4S)4 ligante GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS peptídico 153 Ligante peptídico GSGSGSGS 154 Ligante peptídico GSGSGNGS 155 Ligante peptídico GGSGSGSG 156 Ligante peptídico GGSGSG 157 Ligante peptídico GGSG 158 Ligante peptídico GGSGNGSG

SEQ Nome Sequência ID NO: 159 Ligante peptídico GGNGSGSG 160 Ligante peptídico GGNGSG 161 Cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGT „CEA 2F1” YVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSR (CEA TCB) FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYY

TYPLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA

DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 162 Cadeia Leve QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTT humanizada SNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTP CD3 CH2527 ARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCAL (Crossfab, VL-CH1) WYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPL (CEA TCB) APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW

NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP

SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 163 CEA CH1A1A 98/99 — QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT CD3 CH2527 EFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEAT humanizado YVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDD (Crossfab VH-Ck)— TAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTV Fc(knob) SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV P329GLALA KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS (CEA TCB) SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS

NTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLL

SEQ Nome Sequência ID NO:

ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMN WVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADS VKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS ASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEA AGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCR DELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 164 CEA CH1A1A 98/99 (VH- QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT CH1)—Fc(hole) EFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEAT P329GLALA YVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDD (CEA TCB) TAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTV

SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN

SEQ Nome Sequência ID NO:

STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT KNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 165 CD3 VH-CL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (CEACAM5 TCB) TYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYA

TYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT LVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA

CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 166 CEA humanizado QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIK VH-CH1(EE)-Fc DTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSK (hole, P329G LALA) YVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSED (CEACAM5 TCB) TAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVS

SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVE DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALG APIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTK

SEQ Nome Sequência ID NO:

NQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQG

NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 167 CEA humanizado QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIK VH-CH1(EE)-CD3 DTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSK VL-CH1-Fc (knob, YVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSED P329G LALA) TAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVS (CEACAM5 TCB) SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVE

DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQ EPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYAN WVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSG SLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSN LWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT

SEQ Nome Sequência ID NO:

QKSLSLSP 168 CEA humanizado EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIF VL-CL(RK) GVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGI (CEACAM5 TCB) PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQ

QTNEDPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPS DRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG

EC 169 antígeno à base de QLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGY CEACAM5 Hu N(A2- SWYKGERVDGNRQIVGYAIGTQQATPGPAN B2)A-avi-His SGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKS

DLVNEEATGQFHVYPELPKPFITSNNSNPVE DEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVS PRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQN KLSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRP GVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHT QELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRTT VKTITVSALSPVVAKPQIKASKTTVTGDKDSV NLTCSTNDTGISIRWFFKNQSLPSSERMKLS QGNITLSINPVKREDAGTYWCEVFNPISKNQ SDPIMLNVNYNALPQENLINVDGSGLNDIFEA

QKIEWHEARAHHHHHH 170 CEA (A5B7)- CDR- DYYMN

SEQ Nome Sequência ID NO: H1 171 CEA (A5B7)- CDR- FIGNKANGYTTEYSASVKG H2 172 CEA (A5B7)- CDR- DRGLRFYFDY H3 173 CEA (A5B7)- CDR- RASSSVTYIH L1 174 CEA (A5B7)- CDR- ATSNLAS L2 175 CEA (A5B7)- CDR- QHWSSKPPT L3 176 IgG1 Fc knob APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC

PGLALA VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS

LSP 177 IgG1 Fc hole APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC

PGLALA VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLP

SEQ Nome Sequência ID NO:

PSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL

SP 178 CEA (A5B7) VH EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFT (parental) DYYMNWVRQPPGKALEWLGFIGNKANGYT

TEYSASVKGRFTISRDKSQSILYLQMNTLRA EDSATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTLTVS

S 179 CEA (A5B7) VL QTVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVTYI (parental) HWYQQKPGSSPKSWIYATSNLASGVPARFS

GSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQHWSS

KPPTFGGGTKLEIK 180 CEA (A5H1EL1D)- GFTFTDYYMN CDR-H1 181 CEA (A5H1EL1D)- FIGNKANAYTTEYSASVKG CDR-H2 182 CEA (A5H1EL1D)- DRGLRFYFDY CDR-H3 183 CEA (A5H1EL1D)- RASSSVTYIH CDR-L1 184 CEA (A5H1EL1D)- ATSNLAS CDR-L2

SEQ Nome Sequência ID NO: 185 CEA (A5H1EL1D)- QHWSSKPPT CDR-L3 186 CEA (A5H1EL1D) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT VH (3-23A5-1E) DYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYT

TEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRA EDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVS

S 187 CEA (A5H1EL1D) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI (A5-L1D) HWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFS

GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSK

PPTFGQGTKLEIK 188 CEA (A5H1EL1D aff. GFX1FX2DYX3MN, em que mat.) CDR-H1 X1 é T ou Y, consenso X2 é T ou S, e X3 é Y ou A ou E 189 CEA (A5H1EL1D aff. X4IX5NKANAYTTEYSASVKG, em que mat.) CDR-H2 X4 é F ou V, consenso X5 é G ou S 190 CEA (A5H1EL1D aff. DRGX6RFX7FDY, em que mat.) CDR-H3 X6 é L ou I, consenso X7 é Y ou G ou Q ou S 191 CEA (A5H1EL1D aff. X8ASSSVTYIH, em que mat.) CDR-L1 X8 é R ou H consenso

SEQ Nome Sequência ID NO: 192 CEA (A5H1EL1D aff. ATSNLAS mat.) CDR-L2 consenso 193 CEA (A5H1EL1D aff. QHWSSX9X10PT, em que mat.) CDR-L3 X9 é K ou V ou Q ou I, consenso X10 é P ou S 194 CEA (P006.038) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT

DYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYT TEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRA EDTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVS

S 195 CEA (P006.038) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI

HWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFS GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSV

PPTFGQGTKLEIK 196 CEA (P005.097) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT

DYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYT TEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRA EDTATYYCTRDRGLRFSFDYWGQGTTVTVS

S 197 CEA (P005.097) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI

HWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFS GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSS QPPTFGQGTKLEIK

SEQ Nome Sequência ID NO: 198 CEA (P005.103) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT

DYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYT TEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRA EDTATYYCTRDRGIRFYFDYWGQGTTVTVS

S 199 CEA (P005.103) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI

HWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFS GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSI

SPTFGQGTKLEIK 200 CEA (P002.139) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFT

DYAMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTT EYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAE

DTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 201 CEA (P002.139) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASSSVTYI

HWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFS GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSK

PPTFGQGTKLEIK 202 CEA (P001.177) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFT

DYYMNWVRQAPGKGLEWLGFISNKANAYTT EYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAE

DTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 203 CEA (P001.177) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI

HWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFS GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSK

SEQ Nome Sequência ID NO:

PPTFGQGTKLEIK 204 CEA (P005.102) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT

DYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYT TEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRA EDTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVS

S 205 CEA (P005.102) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI

HWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFS GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSK

SPTFGQGTKLEIK 206 CEA (P005.102 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFT combo1) VH DYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTT

EYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAE

DTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVSS 207 CEA (P005.102 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI combo1) VL HWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFS

GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSK

SPTFGQGTKLEIK 208 CEA (P005.102 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFS combo2) VH DYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTT

EYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAE

DTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVSS 209 CEA (P005.102 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI combo2) VL HWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFS

SEQ Nome Sequência ID NO:

GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSK

SPTFGQGTKLEIK 210 CEA (P005.103 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT combo1) VH DYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYT

TEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRA EDTATYYCTRDRGIRFSFDYWGQGTTVTVS

S 211 CEA (P005.103 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI combo1) VL HWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFS

GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSI

SPTFGQGTKLEIK 212 CEA (P005.103 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFT combo2) VH DYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTT

EYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAE

DTATYYCTRDRGIRFSFDYWGQGTTVTVSS 213 CEA (P005.103 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI combo2) VL HWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFS

GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSI

SPTFGQGTKLEIK 214 CEA (P006.038 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFT combo1) VH DYAMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTT

EYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAE

DTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVSS 215 CEA (P006.038 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI

SEQ Nome Sequência ID NO: combo1) VL HWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFS

GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSV

PPTFGQGTKLEIK 216 CEA (P006.038 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS combo2) VH DYEMNWVRQAPGKGLEWLGFISNKANAYTT

EYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAE

DTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVSS 217 CEA (P006.038 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI combo2) VL HWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFS

GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSV

PPTFGQGTKLEIK 218 IGHV3-23-02 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS

SYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTY YGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE

DTAVYYCAK 219 IGHV3-15*01 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS

NAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDGGT TDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKT

EDTAVYYCTT 220 3-23A5-1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT

DYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYT TEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVS S

SEQ Nome Sequência ID NO: 221 3-23A5-2 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT

DYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYT TYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVS

S 222 3-23A5-3 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT

DYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKGYTTE YSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED

TAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 223 3-23A5-4 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT

DYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYT TEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVS

S 224 3-23A5-1A EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT (all_backmutations) DYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANGYT

TEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRA EDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVS

S 225 3-23A5-1C (A93T) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT

DYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYT TEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVS S

SEQ Nome Sequência ID NO: 226 3-23A5-1D (K73) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT

DYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYT TEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVS

S 227 3-15A5-1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFT

DYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYT TEYSASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKT EDTAVYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVS

S 228 3-15A5-2 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFT

DYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYT TEYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKT EDTAVYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVS

S 229 3-15A5-3 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFT

DYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGGT TDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKT EDTAVYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVS

S 230 IGKV3-11 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSS

YLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARF SGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSN WP

SEQ Nome Sequência ID NO: 231 A5-L1 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI

HWYQQKPGQAPRLLIYATSNLASGIPARFSG SGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKP

PTFGQGTKLEIK 232 A5-L2 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSS

YIHWYQQKPGQAPRLLIYATSNLASGIPARF SGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSS

KPPTFGQGTKLEIK 233 A5-L3 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI

HWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFS GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSK

PPTFGQGTKLEIK 234 A5-L4 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI

HWYQQKPGQAPRLLIYATSNLASGIPARFSG SGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSKP

PTFGQGTKLEIK 235 A5-L1A QTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI (all_backmutations) HWYQQKPGSSPKSWIYATSNLASGIPARFS

GSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSS

KPPTFGQGTKLEIK 236 A5-L1B (Q1T2) QTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI

HWYQQKPGQAPRLLIYATSNLASGIPARFSG SGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKP PTFGQGTKLEIK

SEQ Nome Sequência ID NO: 237 A5-L1C (FR2) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI

HWYQQKPGSSPKSWIYATSNLASGIPARFS GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSK

PPTFGQGTKLEIK 238 NABA-avi-His consulte Tabela 15 239 N(A2B2)A-avi-His consulte Tabela 15 240 NA(B2)A-avi-His consulte Tabela 15 241 A5H1EL1D_H1_rev_ consulte Tabela 16

TN 242 A5H1EL1D_H2_for_ consulte Tabela 16

TN 243 LMB3 longo consulte Tabela 16 244 HCDR3-rev-constant consulte Tabela 16 245 A5H1EL1D_L1_rev_ consulte Tabela 17

TN 246 A5H1EL1D_L2_for_T consulte Tabela 17

N 247 A5H1EL1D consulte Tabela 18 _L3_for_TN 248 A5H1EL1D consulte Tabela 18 _H3_rev_TN 249 LCDR3-rev-constant consulte Tabela 18

SEQ Nome Sequência ID NO:

250 amplificação de consulte Tabela 18

HCDR3

251 CEA (P006.038)- consulte Tabela 22

CDR-H1

252 CEA (P006.038)- consulte Tabela 22

CDR-H2

253 CEA (P006.038)- consulte Tabela 22

CDR-H3

254 CEA (P006.038)- consulte Tabela 23

CDR-L1

255 CEA (P006.038)- consulte Tabela 23

CDR-L2

256 CEA (P006.038)- consulte Tabela 23

CDR-L3

257 CEA (P005.097)- consulte Tabela 22

CDR-H1

258 CEA (P005.097)- consulte Tabela 22

CDR-H2

259 CEA (P005.097)- consulte Tabela 22

CDR-H3

260 CEA (P005.097)- consulte Tabela 23 CDR-L1

SEQ Nome Sequência ID NO:

261 CEA (P005.097)- consulte Tabela 23

CDR-L2

262 CEA (P005.097)- consulte Tabela 23

CDR-L3

263 CEA (P005.103)- consulte Tabela 22

CDR-H1

264 CEA (P005.103)- consulte Tabela 22

CDR-H2

265 CEA (P005.103)- consulte Tabela 22

CDR-H3

266 CEA (P005.103)- consulte Tabela 23

CDR-L1

267 CEA (P005.103)- consulte Tabela 23

CDR-L2

268 CEA (P005.103)- consulte Tabela 23

CDR-L3

269 CEA (P002.139)- consulte Tabela 22

CDR-H1

270 CEA (P002.139)- consulte Tabela 22

CDR-H2

271 CEA (P002.139)- consulte Tabela 22 CDR-H3

SEQ Nome Sequência ID NO:

272 CEA (P002.139)- consulte Tabela 23

CDR-L1

273 CEA (P002.139)- consulte Tabela 23

CDR-L2

274 CEA (P002.139)- consulte Tabela 23

CDR-L3

275 CEA (P001.177)- consulte Tabela 22

CDR-H1

276 CEA (P001.177)- consulte Tabela 22

CDR-H2

277 CEA (P001.177)- consulte Tabela 22

CDR-H3

278 CEA (P001.177)- consulte Tabela 23

CDR-L1

279 CEA (P001.177)- consulte Tabela 23

CDR-L2

280 CEA (P001.177)- consulte Tabela 23

CDR-L3

281 CEA (P005.102)- consulte Tabela 22

CDR-H1

282 CEA (P005.102)- consulte Tabela 22 CDR-H2

SEQ Nome Sequência ID NO:

283 CEA (P005.102)- consulte Tabela 22

CDR-H3

284 CEA (P005.102)- consulte Tabela 23

CDR-L1

285 CEA (P005.102)- consulte Tabela 23

CDR-L2

286 CEA (P005.102)- consulte Tabela 23

CDR-L3

287 CEA (P005.102- consulte Tabela 22 combo1)- CDR-H1

288 CEA (P005.102- consulte Tabela 22 combo1)- CDR-H2

289 CEA (P005.102- consulte Tabela 22 combo1)- CDR-H3

290 CEA (P005.102- consulte Tabela 23 combo1)- CDR-L1

291 CEA (P005.102- consulte Tabela 23 combo1)- CDR-L2

292 CEA (P005.102- consulte Tabela 23 combo1)- CDR-L3

293 CEA (P005.102- consulte Tabela 22 combo2)- CDR-H1

SEQ Nome Sequência ID NO:

294 CEA (P005.102- consulte Tabela 22 combo2)- CDR-H2

295 CEA (P005.102- consulte Tabela 22 combo2)- CDR-H3

296 CEA (P005.102- consulte Tabela 23 combo2)- CDR-L1

297 CEA (P005.102- consulte Tabela 23 combo2)- CDR-L2

298 CEA (P005.102- consulte Tabela 23 combo2)- CDR-L3

299 CEA (P005.103- consulte Tabela 22 combo1)- CDR-H1

300 CEA (P005.103- consulte Tabela 22 combo1)- CDR-H2

301 CEA (P005.103- consulte Tabela 22 combo1)- CDR-H3

302 CEA (P005.103- consulte Tabela 23 combo1)- CDR-L1

303 CEA (P005.103- consulte Tabela 23 combo1)- CDR-L2

304 CEA (P005.103- consulte Tabela 23 combo1)- CDR-L3

SEQ Nome Sequência ID NO:

305 CEA (P005.103- consulte Tabela 22 combo2)- CDR-H1

306 CEA (P005.103- consulte Tabela 22 combo2)- CDR-H2

307 CEA (P005.103- consulte Tabela 22 combo2)- CDR-H3

308 CEA (P005.103- consulte Tabela 23 combo2)- CDR-L1

309 CEA (P005.103- consulte Tabela 23 combo2)- CDR-L2

310 CEA (P005.103- consulte Tabela 23 combo2)- CDR-L3

311 CEA (P006.038- consulte Tabela 22 combo1)- CDR-H1

312 CEA (P006.038- consulte Tabela 22 combo1)- CDR-H2

313 CEA (P006.038- consulte Tabela 22 combo1)- CDR-H3

314 CEA (P006.038- consulte Tabela 23 combo1)- CDR-L1

315 CEA (P006.038- consulte Tabela 23 combo1)- CDR-L2

SEQ Nome Sequência ID NO: 316 CEA (P006.038- consulte Tabela 23 combo1)- CDR-L3 317 CEA (P006.038- consulte Tabela 22 combo2)- CDR-H1 318 CEA (P006.038- consulte Tabela 22 combo2)- CDR-H2 319 CEA (P006.038- consulte Tabela 22 combo2)- CDR-H3 320 CEA (P006.038- consulte Tabela 23 combo2)- CDR-L1 321 CEA (P006.038- consulte Tabela 23 combo2)- CDR-L2 322 CEA (P006.038- consulte Tabela 23 combo2)- CDR-L3 323 VL CEA (A5H1EL1D) consulte Tabela 24 -CH1- Fc hole

PGLALA 324 VH CEA consulte Tabela 24 (A5H1EL1D) - CL 325 VL CEA (P006.038) - consulte Tabela 24 CH1- Fc hole

PGLALA

SEQ Nome Sequência ID NO: 326 VH CEA (P006.038) - consulte Tabela 24

CL 327 VL CEA (P005.097) - consulte Tabela 24 CH1- Fc hole

PGLALA 328 VH CEA (P005.097) - consulte Tabela 24

CL 329 VL CEA (P005.103) - consulte Tabela 24 CH1- Fc hole

PGLALA 330 VH CEA (P005.103) - consulte Tabela 24

CL 331 VL CEA (P002.139) - consulte Tabela 24 CH1- Fc hole

PGLALA 332 VH CEA (P002.139) - consulte Tabela 24

CL 333 VL CEA (P001.177) - consulte Tabela 24 CH1- Fc hole

PGLALA 334 VH CEA (P001.177) - consulte Tabela 24

CL 335 VL CEA (P005.102) - consulte Tabela 24

SEQ Nome Sequência ID NO: CH1- Fc hole

PGLALA 336 VH CEA (P005.102) - consulte Tabela 24

CL 337 VL CEA (P005.102 consulte Tabela 24 combo1) -CH1- Fc hole PGLALA 338 VH CEA (P005.102 consulte Tabela 24 combo1) - CL 339 VL CEA (P005.102 consulte Tabela 24 combo2) -CH1- Fc hole PGLALA 340 VH CEA (P005.102 consulte Tabela 24 combo2) - CL 341 VL CEA (P005.103 consulte Tabela 24 combo1) -CH1- Fc hole PGLALA 342 VH CEA (P005.103 consulte Tabela 24 combo1) - CL 343 VL CEA (P005.103 consulte Tabela 24 combo2) -CH1- Fc hole PGLALA 344 VH CEA (P005.103 consulte Tabela 24

SEQ Nome Sequência ID NO: combo2) - CL 345 VL CEA (P006.038 consulte Tabela 24 combo1) -CH1- Fc hole PGLALA 346 VH CEA (P006.038 consulte Tabela 24 combo1) - CL 347 VL CEA (P006.038 consulte Tabela 24 combo2) -CH1- Fc hole PGLALA 348 VH CEA (P006.038 consulte Tabela 24 combo2) - CL 349 VH CD28 consulte Tabela 24 (SA_Variante 15) – CH1- Fc knob

PGLALA 350 VL CD28 consulte Tabela 24 (SA_Varainte 15) -

CL 351 CEA(A5H1EL1D) VL- EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI CH1 hu IgG1 Fc hole HWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFS

PGLALA GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSK PPTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL

SEQ Nome Sequência ID NO:

TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQ VCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT

QKSLSLSP 352 CEA(A5H1EL1D) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT VH-Ckappa DYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYT

TEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRA EDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVS SASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT

HQGLSSPVTKSFNRGEC 353 CD28(SA) hu IgG1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT VH-CH1 “EE” Fc SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY knob PGLALA NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT

SEQ Nome Sequência ID NO:

KVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 354 CD28(SA) hu IgG1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV VL-Ck “RK” WLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSR

DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 355 CD28(SA_Variante QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT 8) hu IgG1 VH-CH1 SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNY “EE” Fc knob NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

PGLALA AVYFCTRSHYGLDFNFDVWGQGTTVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR

SEQ Nome Sequência ID NO:

VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQV SLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF

SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 356 CD28(SA_Variante DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV 8) hu IgG1 VL-Ck YLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRF “RK” SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQT

YPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY

EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 357 CD28(SA_Variante QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT 15) hu IgG1 VH-CH1 SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNY “EE” Fc knob NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

PGLALA AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY

SEQ Nome Sequência ID NO:

KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 358 CD28(SA_Variante DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV 15) hu IgG1 VL-Ck FLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRF “RK” SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQT

EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 359 CD28(SA_Variante QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT 29) hu IgG1 VH-CH1 SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNY “EE” Fc knob NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

PGLALA AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP

SEQ Nome Sequência ID NO: 360 CEA(A5H1EL1D) hu EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT IgG1 VH-CH1 “EE” DYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYT Fc hole PGLALA TEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRA

EDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVE DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALG APIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTK NQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQG

NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 361 CEA(A5H1EL1D) hu EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI IgG1 VL-Ck “RK” HWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFS

GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSK PPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE

KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 362 CD28(SA) VL-CH1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV hu IgG1 Fc knob WLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSR

PGLALA FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQ

SEQ Nome Sequência ID NO:

TYPYTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN

HYTQKSLSLSP 363 CD28(SA) VH- QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT Ckappa SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY

QGLSSPVTKSFNRGEC 364 CD28(SA_Variante DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV 8) VL-CH1 hu IgG1 YLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRF Fc knob PGLALA SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQT

YPYTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA

SEQ Nome Sequência ID NO:

LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN

HYTQKSLSLSP 365 CD28(SA_Variante QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT 8) VH-Ckappa SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNY

NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT AVYFCTRSHYGLDFNFDVWGQGTTVTVSSA SVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ

GLSSPVTKSFNRGEC 366 CD28(SA_Variante DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV 15) VL-CH1 hu IgG1 FLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRF Fc knob PGLALA SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQT

YPYTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT

SEQ Nome Sequência ID NO:

HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN

HYTQKSLSLSP 367 CD28(SA_Variante QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT 15) VH-Ckappa SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNY

QGLSSPVTKSFNRGEC 368 CD28(SA_Variante QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT 29) VH-Ckappa SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNY

NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ Nome Sequência ID NO: 369 CEA(T84.66) VL- EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIF CH1 hu IgG1 Fc hole GVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGI

PGLALA PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQ QTNEDPYTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQ PREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL

HNHYTQKSLSLSP 370 CEA(T84.66) VH- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIK Ckappa DTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSK

YVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVS SASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT

HQGLSSPVTKSFNRGEC 371 CEA(T84.66) hu QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIK IgG1 VH-CH1 “EE” DTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSK

SEQ Nome Sequência ID NO: Fc hole PGLALA YVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSED

TAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVE DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALG APIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTK NQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQG

NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 372 CEA(T84.66) hu EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIF IgG1 VL-Ck “RK” GVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGI

PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQ QTNEDPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPS DRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG

EC 373 CEA(A5H1EL1D) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT VH-CH1-VH-CH1 DYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYT “EE” hu IgG1 Fc hole TEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRA

PGLALA EDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVS

SEQ Nome Sequência ID NO:

SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVE DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLE SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMN WVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSAS VKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATY YCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEK VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKT ISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLS CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCS

VMHEALHNHYTQKSLSLSP 374 CD28(SA) VL-CH1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV CEA(A5H1EL1D) WLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSR VH-CH1 “EE” hu FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQ IgG1 Fc knob TYPYTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPS

PGLALA SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS

SEQ Nome Sequência ID NO:

LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDG GGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLG FIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTL YLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYW GQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL

SLSP 375 CEA(P002.139) VL- EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYI CH1 hu IgG1 Fc hole HWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFS

PGLALA GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSK PPTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT

SEQ Nome Sequência ID NO:

PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQ VCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT

QKSLSLSP 376 CEA(P002.139) VH- EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT Ckappa DYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYT

HQGLSSPVTKSFNRGEC 377 CD28 (SA_Variante DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV 8) hu IgG1 cadeia YLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRF leve SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQT

YPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY

EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 378 CD28(SA_Variante QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT 8) hu IgG1 PGLALA SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNY

SEQ Nome Sequência ID NO: cadeia pesada NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

AVYFCTRSHYGLDFNFDVWGQGTTVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS

CSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 379 CD28 (SA_Variante DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV 11) hu IgG1 cadeia WLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSR leve FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQ

TYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA

DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 380 CD28(SA_Variante QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT 11) hu IgG1 PGLALA SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNY cadeia pesada NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

AVYFCTRSHYGLDFNFDVWGQGTTVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY

SEQ Nome Sequência ID NO:

FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS

CSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 381 CD28 (SA_Variante DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV 15) hu IgG1 cadeia FLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRF leve SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQT

EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 382 CD28(SA_Variante QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT 15) hu IgG1 PGLALA SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNY cadeia pesada NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS

SEQ Nome Sequência ID NO:

VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 383 CD28 (SA_Variante DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGIYV 27) hu IgG1 cadeia YLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRF leve SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQT

EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 384 CD28(SA_Variante QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT 27) hu IgG1 PGLALA SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNY cadeia pesada NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA

SEQ Nome Sequência ID NO:

PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 385 CD28 (SA_Variante DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV 29) hu IgG1 cadeia WLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSR leve FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQ

DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 386 CD28(SA_Variante QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT 29) hu IgG1 PGLALA SYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNY cadeia pesada NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT

SEQ Nome Sequência ID NO:

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 387 Avi tag GLNDIFEAQKIEWHE 388 CD28 VHCH1 “EE”- QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (G4S)2- FAP (4B9)- SYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY VHCH1 “EE” – Fc NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT knob PGLALA AVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLES GGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSW VRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA KGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPK SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSP

SEQ Nome Sequência ID NO: 389 CD28 VLCL “RK”- DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYV (G4S)2- FAP (4B9)- WLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSR VLCL “RK” FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQ

TYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRK LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERAT LSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLIN VGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEP EDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKRTVA APSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS

SPVTKSFNRGEC 390 EpCAM(MT201) hu EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS IgG1 VH-CH1 “EE” SYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKY Fc hole PGLALA YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED

TAVYYCAKDMGWGSGWRPYYYYGMDVWG QGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP

SEQ Nome Sequência ID NO:

REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLP PSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL

SP 391 EpCAM(MT201) VL- ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSISS Ckappa “RK” YLNWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDR

FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQSY DIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRK LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA

DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 392 Her3 VL-CH1 hu DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLN IgG1 Fc hole SGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRE

PGLALA SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVY YCQSDYSYPYTFGQGTKLEIKSSASTKGPSV FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISK AKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCA

SEQ Nome Sequência ID NO:

VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV

MHEALHNHYTQKSLSLSP 393 HER3 VH-Ckappa QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFR

SSYISWVRQAPGQGLEWMGWIYAGTGSPS YNQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSD DTAVYYCARHRDYYSNSLTYWGQGTLVTVS SASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT

HQGLSSPVTKSFNRGEC 394 CD30 VL-CH1 hu DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDF IgG1 Fc hole DGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESG

PGLALA IPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC QQSNEDPWTFGGGTKLEIKSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM

SEQ Nome Sequência ID NO:

HEALHNHYTQKSLSLSP 395 CD30 VH-Ckappa QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTD

YYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYN EKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTA VYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAASVA APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS

SPVTKSFNRGEC 396 TPBG VL-CH1 hu DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISN IgG1 Fc hole YLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQIGVPSRF

PGLALA SGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQQANS FPLTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPRE PQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSP

SEQ Nome Sequência ID NO: 397 TPBG VH-Ckappa EVHLLESGGGLVHPGGSLRLSCAASGFTFR

SDAMHWVRQAPGKGLEWVSGVSGSGGSP YYADSVKGRFTISRDDSKTTLYLQMNSLRAE DTAVYYCATGGSIAGSYYYYPMDVWGQGTT VTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC

EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 398 GPRC5D (5E11) hu EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS IgG1 VH-CH1 “EE” KYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTY Fc hole PGLALA YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED

TAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD EKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEK TISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSL SCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSC

SVMHEALHNHYTQKSLSLSP 399 GPRC5D (5E11)VL- EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSIS Ckappa “RK” GINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGIP

SEQ Nome Sequência ID NO:

DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ TRESPLTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSD RKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE

C 400 CD38 VL-CH1 hu EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSS IgG1 Fc hole YLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARF

PGLALA SGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSN WPPTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPRE PQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN

HYTQKSLSLSP 401 CD38 VH-Ckappa EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFN

SFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTV

SEQ Nome Sequência ID NO:

SSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV

THQGLSSPVTKSFNRGEC 402 BCMA hu IgG1 VH- EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS CH1 “EE” Fc hole SYAMNWVRQAPGKGLEWVSAITASGGSTY

PGLALA YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCARYWPMSLWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDE KVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKT ISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLS CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCS

VMHEALHNHYTQKSLSLSP 403 BCMA VL-Ckappa EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSA “RK” YYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRATGIPD

RFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY ERWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD RKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK

SEQ Nome Sequência ID NO:

ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE

C 404 GPRC5D (5E11) VH- EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS CH1(EE)-CD3 VL- KYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTY CH1-Fc (knob, YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED P329G LALA) TAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSSAST (GPRC5D TCB) KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFP

EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD EKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSL TVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQE KPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLG GKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVF GGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSP

SEQ Nome Sequência ID NO: 405 CD3 VH-CL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFS (GPRC5D TCB) SYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYA

TYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCVRHTTFPSSYVSYYGYWGQGTL VTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC

EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 406 CD19 (8B8-2B11) DYIMH CDR-H1 407 CD19 (8B8-2B11) YINPYNDGSKYTEKFQG CDR-H2 408 CD19 (8B8-2B11) GTYYYGPQLFDY CDR-H3 409 CD19 (8B8-2B11) KSSQSLETSTGTTYLN CDR-L1 410 CD19 (8B8-2B11) RVSKRFS CDR-L2 411 CD19 (8B8-2B11) LQLLEDPYT CDR-L3 412 CD19 (8B8-2B11) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT

VH DYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSK YTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDD

SEQ Nome Sequência ID NO:

TAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVS

S 413 CD19 (8B8-2B11) VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETS

TGTTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCL

QLLEDPYTFGQGTKLEIK 414 CD19 (8B8-018) DYIMH CDR-H1 415 CD19 (8B8-018) YINPYNDGSKYTEKFQG CDR-H2 416 CD19 (8B8-018) GTYYYGSALFDY CDR-H3 417 CD19 (8B8-018) KSSQSLENPNGNTYLN CDR-L1 418 CD19 (8B8-018) RVSKRFS CDR-L2 419 CD19 (8B8-018) LQLTHVPYT CDR-L3 420 CD19 (8B8-018) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT

DYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSK YTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDD TAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVS S

SEQ Nome Sequência ID NO: 421 CD19 (8B8-018) VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLEN

PNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVY

YCLQLTHVPYTFGQGTKLEIK 422 CD79b SYWIE (huMA79b.v28) CDR-H1 423 CD79b EILPGGGDTNYNEIFKG (huMA79b.v28) CDR-H2 424 CD79b RVPIRLDY (huMA79b.v28) CDR-H3 425 CD79b KASQSVDYEGDSFLN (huMA79b.v28) CDR-L1 426 CD79b AASNLES (huMA79b.v28) CDR-L2 427 CD79b QQSNEDPLT (huMA79b.v28) CDR-L3 428 CD79b EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFS

SEQ Nome Sequência ID NO: (huMA79b.v28) VH SYWIEWVRQAPGKGLEWIGEILPGGGDTNY

NEIFKGRATFSADTSKNTAYLQMNSLRAEDT

AVYYCTRRVPIRLDYWGQGTLVTVSS 429 CD79b DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDY (huMA79b.v28) VL EGDSFLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESG

VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC

QQSNEDPLTFGQGTKVEIK 430 VL (CD19 2B11) - DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETS CH1 Fc hole TGTTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGV

PGLALA PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCL QLLEDPYTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQ PREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL

HNHYTQKSLSLSP 431 VH (CD19 2B11) CL QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT

DYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSK

SEQ Nome Sequência ID NO:

YTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDD TAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVS SASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT

HQGLSSPVTKSFNRGEC 432 VL (huMA79b.v28) - DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDY CH1 Fc hole EGDSFLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESG

PGLALA VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSNEDPLTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM

HEALHNHYTQKSLSLSP 433 VH (huMA79b.v28) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFS

CL SYWIEWVRQAPGKGLEWIGEILPGGGDTNY NEIFKGRATFSADTSKNTAYLQMNSLRAEDT AVYYCTRRVPIRLDYWGQGTLVTVSSASVA

SEQ Nome Sequência ID NO:

APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS

SPVTKSFNRGEC 434 CD19 humano n° de acesso UniProt P15391 435 CD79b humano n° de acesso UniProt P40259 436 CD20 humano n° de acesso UniProt P11836 437 CD22 humano n° de acesso UniProt P20273 438 CD37 humano n° de acesso UniProt P11049 439 CD3-HCDR1 TYAMN 440 CD3-HCDR2 RIRSKYNNYATYYADSVKG 441 CD3-HCDR3 HGNFGNSYVSWFAY 442 CD3-LCDR1 GSSTGAVTTSNYAN 443 CD3-LCDR2 GTNKRAP 444 CD3-LCDR3 ALWYSNLWV 445 CD3 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS

TYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYA TYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT

LVTVSS 446 CD3 VL QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTT

SNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTP

SEQ Nome Sequência ID NO:

ARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCAL

WYSNLWVFGGGTKLTVL 447 CD20-HCDR1 YSWIN 448 CD20-HCDR2 RIFPGDGDTDYNGKFK 449 CD20-HCDR3 NVFDGYWLVY 450 CD20-LCDR1 RSSKSLLHSNGITYLY 451 CD20-LCDR2 QMSNLVS 452 CD20-LCDR3 AQNLELPYT 453 CD20 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFS

YSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTD YNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED

TAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSS 454 CD20 VL DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHS

NGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCA

QNLELPYTFGGGTKVEIK 455 CD20 VH-CH1(EE)- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFS CD3 VL-CH1-Fc YSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTD (knob, P329G LALA) YNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED

TAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT

SEQ Nome Sequência ID NO:

KVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQE PSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANW VQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGS LLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNL WVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT

QKSLSLSP 456 CD20 VH-CH1(EE)- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFS Fc (hole, P329G YSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTD LALA) YNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED

TAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED

SEQ Nome Sequência ID NO:

PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKN QVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 457 CD20 VL-CL(RK) DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHS

NGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCA QNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG

EC 458 CD3 VH-CL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS

TYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYA TYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT LVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA

CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 459 PD-L1 humano n° de acesso UniProt Q9NZQ7 460 VH (PD-L1) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS

SEQ Nome Sequência ID NO:

DSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTY YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAED

TAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS 461 VL (PD-L1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVST

AVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLY

HPATFGQGTKVEIK 462 VH (PD-L1) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS

RYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKY YVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED TAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTV

SS 463 VL (PD-L1) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSS

SYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDR FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYG

SLPWTFGQGTKVEIK 464 PD-1 humano Uniprot Q15116 465 VH (PD-1) QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFT

NYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGT NFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFD DTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTV

SS 466 VL (PD-1) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVST

SGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESG

SEQ Nome Sequência ID NO:

VPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC

QHSRDLPLTFGGGTKVEIK 467 VH (PD-1) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFS

NSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRY YADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAED

TAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS 468 VL (PD-1) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSS

YLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARF SGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSN

WPRTFGQGTKVEIK 469 EpCAM humano nº UniProt P16422 470 EpCAM murino nº UniProt Q99JW5 471 HER3 humano nº UniProt P21860 472 CD30 humano nº UniProt P28908 473 TBPG humano nº UniProt Q13641 474 CD38 humano nº UniProt P28907 475 BCMA humano nº UniProt Q02223 476 GPRC5D humano nº UniProt Q9NZD1 477 domínio CH1 de IgG ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD

YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKV

SEQ Nome Sequência ID NO: 478 domínio CH2 de IgG APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC

VWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQESTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCK

VSNKALPAPIEKTISKAK 479 domínio CH3 de IgG GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK

GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH

EALHNHYTQKSLSLSPG 480 conector CH1 EPKSC 481 Dobradiça inteira DKTHTCPXCP em que X é S ou P 482 Dobradiça média HTCPXCP em que X é S ou P 483 Dobradiça curta CPXCP em que X é S ou P 484 IgG1, alotipo ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD caucasiano YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG

LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ Nome Sequência ID NO: 485 IgG1, alotipo afro- ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD americano YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG

LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 486 IgG2 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD

YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNT KVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVS VLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKT ISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPP MLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS

VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 487 IgG3 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVK

DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSN

SEQ Nome Sequência ID NO:

TKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDT PPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDT PPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHN

RFTQKSLSLSPGK 488 IgG4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD

YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNT KVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEV QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFS

CSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 489 CD28(variante 8) SYYIH CDR-H1 490 CD28(variante 8) SIYPGNVQTNYNEKFKD

SEQ Nome Sequência ID NO:

CDR-H2

491 CD28(variante 8) SHYGLDWNFDV

CDR-H3

492 CD28(variante 8) HASQNIYVYLN

CDR-L1

493 CD28(variante 8) KASNLHT

CDR-L2

494 CD28(variante 8) QQGQTYPYT

CDR-L3

495 CD28(variante 15) SYYIH

CDR-H1

496 CD28(variante 15) SIYPGNVQTNYNEKFKD

CDR-H2

497 CD28(variante 15) SHYGLDWNFDV

CDR-H3

498 CD28(variante 15) HASQNIYVFLN

CDR-L1

499 CD28(variante 15) KASNLHT

CDR-L2

500 CD28(variante 15) QQGQTYPYT

CDR-L3

501 CD28(variante 29) SYYIH

SEQ Nome Sequência ID NO:

CDR-H1

502 CD28(variante 29) SIYPGNVNTNYNEKFKD

CDR-H2

503 CD28(variante 29) SHYGLDWNFDV

CDR-H3

504 CD28(variante 29) HASQNIYVWLN

CDR-L1

505 CD28(variante 29) KASNLHT

CDR-L2

506 CD28(variante 29) QQGQTYPYT

CDR-L3

507 CEA (T84.66-LCHA)- DTYMH

CDR-H1

508 CEA (T84.66-LCHA)- RIDPANGNSKYVPKFQG

CDR-H2

509 CEA (T84.66-LCHA)- FGYYVSDYAMAY

CDR-H3

510 CEA (T84.66-LCHA)- RAGESVDIFGVGFLH

CDR-L1

511 CEA (T84.66-LCHA)- RASNRAT

CDR-L2

512 CEA (T84.66-LCHA)- QQTNEDPYT

SEQ Nome Sequência ID NO: CDR-L3 513 CEA (T84.66-LCHA) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIK

VH DTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSK YVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVS

S 514 CEA (T84.66-LCHA) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIF

VL GVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGI PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQ

QTNEDPYTFGQGTKLEIK 515 EpCAM (MT201)- SYGMH CDR-H1 516 EpCAM (MT201)- VISYDGSNKYYADSVKG CDR-H2 517 EpCAM (MT201)- DMGWGSGWRPYYYYGM CDR-H3 518 EpCAM (MT201)- RTSQSISSYLN CDR-L1 519 EpCAM (MT201)- WASTRES CDR-L2 520 EpCAM (MT201)- QQSYDIPYT CDR-L3 521 EpCAM (MT201) VH EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS

SEQ Nome Sequência ID NO:

SYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKDMGWGSGWRPYYYYGMDVWG

QGTTVTVSS 522 EpCAM (MT201) VL ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSISS

YLNWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQSY

DIPYTFGQGTKLEIK 523 HER3- CDR-H1 SSYIS 524 HER3- CDR-H2 WIYAGTGSPSYNQKLQG 525 HER3- CDR-H3 HRDYYSNSL 526 HER3- CDR-L1 KSSQSVLNSGNQKNYLT 527 HER3- CDR-L2 WASTRES 528 HER3- CDR-L3 QSDYSYPYT 529 HER3 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFR

SSYISWVRQAPGQGLEWMGWIYAGTGSPS YNQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSD DTAVYYCARHRDYYSNSLTYWGQGTLVTVS

S 530 HER3 VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLN

SGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVY YCQSDYSYPYTFGQGTKLEIK

SEQ Nome Sequência ID NO: 531 CD30- CDR-H1 DYYIT 532 CD30- CDR-H2 WIYPGSGNTKYNEKFKG 533 CD30- CDR-H3 YGNYWF 534 CD30- CDR-L1 KASQSVDFDGDSYMN 535 CD30- CDR-L2 AASNLES 536 CD30- CDR-L3 QQSNEDPWT 537 CD30 VH QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTD

YYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYN EKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTA

VYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA 538 CD30 VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDF

DGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESG IPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC

QQSNEDPWTFGGGTKLEIK 539 TPBG(FAB091)- SDAMH CDR-H1 540 TPBG(FAB091)- GVSGSGGSPYYADSVKG CDR-H2 541 TPBG(FAB091)- GGSIAGSYYYYPMDV CDR-H3 542 TPBG(FAB091)- QASQDISNYLN CDR-L1

SEQ Nome Sequência ID NO: 543 TPBG(FAB091)- AASTLQI CDR-L2 544 TPBG(FAB091)- QQANSFPLT CDR-L3 545 TPBG(FAB091) VH EVHLLESGGGLVHPGGSLRLSCAASGFTFR

SDAMHWVRQAPGKGLEWVSGVSGSGGSP YYADSVKGRFTISRDDSKTTLYLQMNSLRAE DTAVYYCATGGSIAGSYYYYPMDVWGQGTT

VTVSS 546 TPBG(FAB091) VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISN

YLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQIGVPSRF SGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQQANS

FPLTFGGGTKVEIK 547 CD38- CDR-H1 SFAMS 548 CD38- CDR-H2 AISGSGGGTYYADSVKG 549 CD38- CDR-H3 DKILWFGEPVFDY 550 CD38- CDR-L1 RASQSVSSYLA 551 CD38- CDR-L2 DASNRAT 552 CD38- CDR-L3 QQRSNWPPT 553 CD38 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFN

SFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED

SEQ Nome Sequência ID NO:

TAVYFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTV

SS 554 CD38 VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSS

YLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARF SGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSN

WPPTFGQGTKVEIK 555 BCMA - CDR-H1 SYAMN 556 BCMA - CDR-H2 AITASGGSTYYADSVKG 557 BCMA - CDR-H3 YWPMSL 558 BCMA - CDR-L1 RASQSVSAYYLA 559 BCMA - CDR-L2 DASIRAT 560 BCMA - CDR-L3 QQYERWPLT 561 BCMA VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS

SYAMNWVRQAPGKGLEWVSAITASGGSTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED

TAVYYCARYWPMSLWGQGTLVTVSS 562 BCMA VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSA

YYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRATGIPD RFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY

ERWPLTFGQGTKVEIK 563 GPRC5D (5E11) - KYAMA CDR-H1

SEQ Nome Sequência ID NO: 564 GPRC5D (5E11) - SISTGGVNTYYADSVKG CDR-H2 565 GPRC5D (5E11) - HTGDYFDY CDR-H3 566 GPRC5D (5E11) - RASQSVSISGINLMN CDR-L1 567 GPRC5D (5E11) - HASILAS CDR-L2 568 GPRC5D (5E11) - QQTRESPLT CDR-L3 569 GPRC5D (5E11) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VH1c KYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTY

YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED

TAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSS 570 GPRC5D (5E11) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSIS VL2b GINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGIP

DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ

TRESPLTFGQGTRLEIK 571 GPRC5D (5E11) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VH1a KYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTY

YRDSVKARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED

TAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSS 572 GPRC5D (5E11) ELQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS

SEQ Nome Sequência ID NO: VH1b KYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTY

YRDSVKARFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAED

TAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSS 573 GPRC5D (5E11) ELQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VH1d KYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTY

YADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAED

TAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSS 574 GPRC5D (5E11) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVSIS VL1a GINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGVP

DRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ

TRESPLTFGQGTRLEIK 575 GPRC5D (5E11) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVSIS VL1c GINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGVP

DRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ

TRESPLTFGQGTRLEIK 576 GPRC5D (5E11) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSIS VL2a GINLMNWYQQKPGQQPRLLIYHASILASGIP

DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ

TRESPLTFGQGTRLEIK 577 GPRC5D (5E11) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSI VL3a SGINLMNWYQQKPGKQPKLLIYHASILASGV

PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ

QTRESPLTFGQGTRLEIK 578 GPRC5D (5E11) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSI

SEQ Nome Sequência ID NO: VL3b SGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGV

PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ

QTRESPLTFGQGTRLEIK 579 GPRC5D (5F11) - NYGMA CDR-H1 580 GPRC5D (5F11) - SISTGGGNTYYRDSVKG CDR-H2 581 GPRC5D (5F11) - HDRGGLY CDR-H3 582 GPRC5D (5F11) - RSSKSLLHSNGITYVY CDR-L1 583 GPRC5D (5F11) - RMSNRAS CDR-L2 584 GPRC5D (5F11) - GQLLENPYT CDR-L3 585 GPRC5D (5F11) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFS VH1a NYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTY

YRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED

TAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS 586 GPRC5D (5F11) EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFS VH1b NYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTY

YRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS

SEQ Nome Sequência ID NO: 587 GPRC5D (5F11) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFS VH1c NYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTY

YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED

TAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS 588 GPRC5D (5F11) EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFS VH1d NYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTY

YADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAED

TAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS 589 GPRC5D (5F11) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFS VH2b NYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTY

YRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAED

TAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS 590 GPRC5D (5F11) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFS VH2d NYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTY

YADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAED

TAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS 591 GPRC5D (5F11) DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHS VL1a NGITYVYWYLQKPGQSPQVLIYRMSNLASG

VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYH

CGQLLENPYTFGQGTKLEIK 592 GPRC5D (5F11) DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHS VL1b NGITYVYWYLQKPGKSPQVLIYRMSNLASGV

PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHC GQLLENPYTFGQGTKLEIK

SEQ Nome Sequência ID NO: 593 GPRC5D (5F11) DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHS VL2a NGITYVYWYLQKPGQSPQLLIYRMSNRASG

VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYH

CGQLLENPYTFGQGTKLEIK 594 GPRC5D (5F11) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSKSLLHS VL2b NGITYVYWYQQKPGQPPKLLIYRMSNLASG

VPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYHC

GQLLENPYTFGQGTKLEIK 595 GPRC5D (5F11) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASKSLLHS VL2c NGITYVYWYQQKPGQAPRLLIYRMSNLASGI

PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYHCG

QLLENPYTFGQGTKLEIK 596 CD3 (Cl22) CDR-H1 SYAMN 597 CD3 (Cl22) CDR-H2 RIRSKYNNYATYYADSVKG 598 CD3 (Cl22) CDR-H3 HTTFPSSYVSYYGY 599 CD3 (Cl22) CDR-L1 GSSTGAVTTSNYAN 600 CD3 (Cl22) CDR-L2 GTNKRAP 601 CD3 (Cl22) CDR-L3 ALWYSNLWV 602 CD3 (Cl22) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFS

SYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYA TYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCVRHTTFPSSYVSYYGYWGQGTL VTVSS

SEQ Nome Sequência ID NO: 603 CD3 (Cl22) VL QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTT

SNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTP ARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCAL

WYSNLWVFGGGTKLTVL 604 CD3 (V9) CDR-H1 GYSFTGYTMN 605 CD3 (V9) CDR-H2 LINPYKGVSTYNQKFKD 606 CD3 (V9) CDR-H3 SGYYGDSDWYFDV 607 CD3 (V9) CDR-L1 RASQDIRNYLN 608 CD3 (V9) CDR-L2 YTSRLES 609 CD3 (V9) CDR-L3 QQGNTLPWT 610 CD3 (V9) VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFT

GYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTY NQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDT AVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTV

SS 611 CD3 (V9) VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRN

YLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRF SGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNT LPWTFGQGTKVEIK

[00819] Informações gerais sobre as sequências nucleotídicas das cadeias leves e pesadas das imunoglobulinas humanas são fornecidas em: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda,

MD (1991). Os aminoácidos das cadeias de anticorpos são numerados e referidos de acordo com os sistemas de numeração de acordo com Kabat (Kabat, EA, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) como definido acima.

[00820] Os parágrafos (paras) numerados seguintes descrevem aspectos da presente invenção:

[00821] 1. Uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico caracterizada pela ligação monovalente a CD28, que compreende

[00822] (a) um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28,

[00823] (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e

[00824] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00825] 2. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico do parágrafo 1, em que o domínio Fc é um IgG, particularmente um domínio Fc de IgG1 ou um domínio Fc de IgG4.

[00826] 3. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de acordo com o parágrafo 1 ou 2, em que o domínio Fc é de subclasse de IgG1 humana e compreende as mutações de aminoácido L234A, L235A e P329G (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[00827] 4. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 3, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende

[00828] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada CDR-H1 de SEQ ID NO: 20, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 21, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 22, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve CDR-L1 de SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 24 e uma CDR- L3 de SEQ ID NO: 25; ou

[00829] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma CDR-H1 de SEQ ID NO: 36, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 37, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 38, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma CDR-L1 de SEQ ID NO: 39, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 40 e uma CDR-L3 de SEQ ID NO: 41.

[00830] 5. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 4, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma CDR-H1 de SEQ ID NO: 20, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 21, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 22, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma CDR-L1 de SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 24 e uma CDR-L3 de SEQ ID NO: 25.

[00831] 6. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 5, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:26, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%

idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:27.

[00832] 7. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 4, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50 e SEQ ID NO:51, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60 e SEQ ID NO:60.

[00833] 8. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 4 ou 7, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende

[00834] (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00835] (b) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, ou

[00836] (c) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:51 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:61, ou

[00837] (d) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00838] (e) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00839] (f) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:59, ou

[00840] (g) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, ou

[00841] (h) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:43 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, ou

[00842] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00843] (j) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:59, ou

[00844] (k) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27.

[00845] 9. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 8, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a Antígeno Carcinoembrionário (CEA).

[00846] 10. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 9, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA compreender uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:127, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:128, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:129, e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:130, (v) CDR -L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:131, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:132.

[00847] 11. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 10, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:133, e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:134.

[00848] 12. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 8, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica à Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP).

[00849] 13. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 8 ou 12, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica ao FAP compreende

[00850] (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:12, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:13, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14, e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:15, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:16 e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:17, ou

[00851] (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:7, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8 e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9.

[00852] 14. A molécula de ligação ao antígeno agonístico

CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 8 ou 12 ou 13, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica ao FAP compreende

[00853] (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18, e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:19, ou

[00854] (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10, e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:11.

[00855] 15. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 8 ou 12 a 14, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18, e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:19.

[00856] 16. A molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico de qualquer um dos parágrafos 1 a 15, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 é um fragmento Fab ou um fragmento crossFab.

[00857] 17. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 16, que compreende

[00858] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a

CD28,

[00859] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e

[00860] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00861] 18. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 16, que compreende

[00862] (a) um primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00863] (b) um segundo fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e

[00864] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora,

[00865] em que o primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N- terminal da cadeia pesada de Fab do segundo fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, que, por sua vez, é fundido em seu C-terminal ao N-terminal de uma das subunidades de domínio Fc.

[00866] 19. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 16, que compreende

[00867] (a) um primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00868] (b) um segundo e um terceiro fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e

[00869] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora,

[00870] em que o primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N- terminal da cadeia pesada de Fab do segundo fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, que, por sua vez, é fundido em seu C-terminal ao N-terminal da primeira subunidade de domínio Fc, e o terceiro fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N-terminal da segunda subunidade de domínio Fc.

[00871] 20. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 16, que compreende

[00872] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00873] (b) um domínio VH e VL capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e

[00874] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora,

[00875] em que o fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 é fundido em seu C-terminal ao N-terminal da primeira subunidade de domínio Fc, e em que um dentre o domínio VH e VL capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é fundido através de um ligante peptídico ao C-terminal da primeira subunidade de domínio Fc e o outro dentre o domínio VH e VL capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é fundido através de um ligante peptídico ao C-terminal da segunda subunidade de domínio Fc.

[00876] 21. Um polinucleotídeo isolado que codifica a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 20.

[00877] 22. Um célula hospedeira que compreende o polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 21.

[00878] 23. Um método de produção da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 20 que compreende cultivar a célula hospedeira da reivindicação 22 sob condições adequadas para a expressão da molécula de ligação ao antígeno biespecífico.

[00879] 24. Uma composição farmacêutica que compreende a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 20, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00880] 25. A composição farmacêutica, de acordo com o parágrafo 24, para uso no tratamento de câncer.

[00881] 26. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 20, ou a composição farmacêutica, de acordo com o parágrafo 24, para uso como um medicamento.

[00882] 27. A molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífica, de qualquer um dos parágrafos 1 a 20, ou a composição farmacêutica, de acordo com o parágrafo 24, para uso no tratamento do câncer.

[00883] 28. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 20, para uso no tratamento de câncer, em que a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico é administrada em combinação com um agente quimioterápico, radioterapia e/ou outros agentes para uso em imunoterapia contra o câncer.

[00884] 29. Uso da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 20, ou a composição farmacêutica, do parágrafo 24, na fabricação de um medicamento para o tratamento do câncer.

[00885] 30. Um método de inibição do crescimento de células tumorais em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 20, ou a composição farmacêutica, do parágrafo 24, para inibir o crescimento das células tumorais.

[00886] 31. Um método de tratamento de câncer que compreende administrar ao indivíduo a quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 1 a 20, ou a composição farmacêutica do parágrafo 24.

[00887] 32. Uma molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico que compreende um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28, um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno de superfície de células B e um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00888] 33. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico do parágrafo 32, caracterizada por ligação monovalente a CD28.

[00889] 34. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico do parágrafo 32, caracterizada ainda por ligação monovalente ao antígeno de superfície de células B.

[00890] 35. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 34, em que o domínio Fc é de subclasse de IgG1 humana e compreende as mutações de aminoácido L234A, L235A e P329G (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[00891] 36. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 35, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende

[00892] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada CDR-H1 de SEQ ID NO: 20, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 21, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 22, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve CDR-L1 de SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 24 e uma CDR- L3 de SEQ ID NO: 25; ou

[00893] (ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma CDR-H1 de SEQ ID NO: 36, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 37, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 38, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma CDR-L1 de SEQ ID NO: 39, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 40 e uma CDR-L3 de SEQ ID NO: 41.

[00894] 37. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 36, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma CDR-H1 de SEQ ID NO: 20, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 21, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 22, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma CDR-L1 de SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 24 e uma CDR-L3 de SEQ ID NO: 25.

[00895] 38. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 37, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:26, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:27.

[00896] 39. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 36, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50 e SEQ ID NO:51, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60 e SEQ ID NO:61.

[00897] 40. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 36 ou 39, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreende

[00898] (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00899] (b) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, ou

[00900] (c) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:51 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:61, ou

[00901] (d) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:48 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00902] (e) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:48 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, ou

[00903] (f) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:48 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:59, ou

[00904] (g) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:48 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, ou

[00905] (h) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:43 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, ou

[00906] (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, ou

[00907] (j) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:59, ou

[00908] (k) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27.

[00909] 41. A molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 36 ou 39 ou 40, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 que compreende uma região variável da cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46 e uma região variável da cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53, ou uma região variável da cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 e uma região variável da cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54, ou uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, ou uma variável de cadeia pesada região (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 e uma região variável da cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9.

[00910] 42. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 41, em que o antígeno de superfície de células B é selecionado do grupo que consiste em CD19, CD79b, CD20, CD22 e CD37.

[00911] 43. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 42, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno de superfície de células B é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD19.

[00912] 44. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 43, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica ao CD19 compreende

[00913] (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:406, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:407, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:408, e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:409, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:410 e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:411, ou

[00914] (b) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:414, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:415, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:416, e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:417, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO:418 e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:419.

[00915] 45. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 44, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica ao CD19 compreende

[00916] (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 98% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:412, e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 98% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:413, ou

[00917] (b) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 98% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:420, e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 98% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:421.

[00918] 46. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 45, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:412, e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:413.

[00919] 47. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 43, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno de superfície de células B é um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD79b.

[00920] 48. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 43 ou 47, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD79b compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD79b) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:422, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:423, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:424, e uma região variável de cadeia leve (VLCD79b) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:425, (v) CDR -L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:426, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:427.

[00921] 49. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 43 ou 47 ou 48, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD79b compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD79b) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 98% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:428, e uma região variável de cadeia leve (VLCD79b) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 98% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:429.

[00922] 50. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 49, que compreende

[00923] (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00924] (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a um antígeno de superfície de células B, e

[00925] (c) domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00926] 51. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 49, que compreende

[00927] (a) um primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00928] (b) um segundo fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno de superfície de células B, e

[00929] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora,

[00930] em que o primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N- terminal da cadeia pesada de Fab do segundo fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, que, por sua vez, é fundido em seu C-terminal ao N-terminal de uma das subunidades de domínio Fc.

[00931] 52. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 49, que compreende

[00932] (a) um primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28,

[00933] (b) um segundo e um terceiro fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno de superfície de células B, e

[00934] (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora,

[00935] em que o primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N- terminal da cadeia pesada de Fab do segundo fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, que, por sua vez, é fundido em seu C-terminal ao N-terminal da primeira subunidade de domínio Fc, e o terceiro fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N-terminal da segunda subunidade de domínio Fc.

[00936] 53. Uma composição farmacêutica que compreende a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 52, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00937] 54. Um polinucleotídeo isolado que codifica a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 52.

[00938] 55. Um vetor que compreende o polinucleotídeo do parágrafo 54.

[00939] 56. Uma célula hospedeira que compreende o vetor do parágrafo 55 ou o polinucleotídeo do parágrafo 54.

[00940] 57. Um método de produção da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 52 que compreende cultivar a célula hospedeira do parágrafo 25 sob condições adequadas para a expressão da molécula de ligação ao antígeno biespecífico.

[00941] 58. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 52, ou a composição farmacêutica, de acordo com o parágrafo 53, para uso como um medicamento.

[00942] 59. A molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífica, de qualquer um dos parágrafos 32 a 52, ou a composição farmacêutica, de acordo com o parágrafo 53, para uso no tratamento do câncer.

[00943] 60. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 52 para uso no tratamento de câncer, em que a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico é para uso em combinação com um agente quimioterápico, radioterapia e/ou outros agentes para uso em imunoterapia contra câncer.

[00944] 60. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 52 para uso no tratamento de câncer, em que a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico é para uso em combinação com um anticorpo biespecífico anti-CD3 de ativação de células T.

[00945] 61. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 52 para uso no tratamento de câncer, em que a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico é para uso em combinação com um anticorpo biespecífico anti- CD20/anti-CD3.

[00946] 62. A molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 52 para uso no tratamento de câncer, em que a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico é para uso em combinação com um agente que bloqueia interação PD-L1/PD-1.

[00947] 63. Uso da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 52, ou a composição farmacêutica, do parágrafo 53, na fabricação de um medicamento para o tratamento do câncer.

[00948] 64. Um método de inibição do crescimento de células tumorais em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 52, ou a composição farmacêutica, do parágrafo 53, para inibir o crescimento das células tumorais.

[00949] 65. Um método de tratamento de câncer que compreende administrar ao indivíduo a quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, de qualquer um dos parágrafos 32 a 52, ou a composição farmacêutica do parágrafo 53.

EXEMPLOS

[00950] A seguir estão exemplos de métodos e composições da invenção. Entende-se que várias outras modalidades podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima.

TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE

[00951] Métodos padrão foram usados para manipular DNA conforme descrito em Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989. Os reagentes biológicos moleculares foram usados de acordo com as instruções do fabricante. Informações gerais sobre as sequências de nucleotídeos das cadeias leves e pesadas das imunoglobulinas humanas são fornecidas em: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed., Publicação NIH de nº 91-3242.

S EQUENCIAMENTO DE DNA

[00952] As sequências de DNA foram determinadas por sequenciamento de fita dupla.

S ÍNTESE DE G ENES

[00953] Os segmentos gênicos desejados, quando necessários, foram gerados por PCR com o uso de modelos apropriados ou foram sintetizados na Geneart AG (Regensburg, Alemanha) ou Genscript (Nova Jersey, EUA) a partir de oligonucleotídeos sintéticos e produtos de PCR por síntese automática de genes. Os segmentos de genes flanqueados por sítios de clivagem de endonuclease de restrição singulares foram clonados em vetores de clonagem/sequenciamento padrão. O DNA do plasmídeo foi purificado a partir de bactérias transformadas e a concentração determinada por espectroscopia UV. As sequências de DNA dos fragmentos de genes subclonados foram confirmadas por sequenciamento de DNA. Os segmentos de genes foram projetados com sítios de restrição adequados para permitir a subclonagem nos respectivos vetores de expressão. Todos os construtos foram projetados com uma sequência de DNA da extremidade 5’ que codifica para um peptídeo líder que direciona proteínas para secreção em células eucarióticas.

TÉCNICAS DE CULTURA DE CÉLULAS

[00954] Foram usadas técnicas de cultura de células padrão como descrito em Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. e Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.

P URIFICAÇÃO DE P ROTEÍNA

[00955] As proteínas foram purificadas a partir de sobrenadantes da cultura de células filtradas, referindo-se a protocolos padrão. Em suma, os anticorpos foram aplicados a uma coluna de Proteína

A Sepharose (GE healthcare) e lavados com PBS. A eluição de anticorpos foi alcançada a pH 2,8, seguida de neutralização imediata da amostra. A proteína agregada foi separada dos anticorpos monoméricos por cromatografia por exclusão por tamanho (Superdex 200, GE Healthcare) em PBS ou em histidina a 20 mM, NaCl a 150 mM, pH 6,0. As frações de anticorpos monoméricos foram agrupadas, concentradas (se necessário) usando, por exemplo, um concentrador centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO), congeladas e armazenadas a -20 °C ou -80 °C. Parte das amostras foi fornecida para análises de proteínas subsequentes e caracterização analítica, por exemplo, por SDS-PAGE, cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) ou espectrometria de massa.

SDS-PAGE

[00956] O sistema em gel pré-moldado NuPAGE®(Invitrogen) foi usado de acordo com as instruções do fabricante.

Em particular, foram usados geis pré-moldados NuPAGE® Novex® Bis- TRIS a 10% ou 4-12% (pH 6,4) e um NuPAGE® MES (geis reduzidos, com aditivo tampão de corrida Antioxidante NuPAGE®) ou tampão de corrida MOPS (geis não reduzidos).

CROMATOGRAFIA ANALÍTICA POR E XCLUSÃO DE T AMANHO

[00957] Cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) para a determinação da agregação e estado oligomérico dos anticorpos foi realizada por cromatografia HPLC. Em suma, os anticorpos purificados da proteína A foram aplicados a uma coluna Tosoh TSKgel G3000SW em NaCl a 300 mM, KH2PO 4/K2HPO 4 a 50 mM, pH 7,5, em um sistema Agilent HPLC 1100 ou a uma coluna Superdex 200 (GE Healthcare) em 2 x PBS em um sistema de HPLC Dionex. A proteína eluída foi quantificada por absorvância UV e integração de áreas de pico. A Norma de Filtração de Gel BioRad 151-1901 serviu como padrão.

E SPECTROMETRIA DE MASSA

[00958] Essa seção descreve a caracterização dos anticorpos multiespecíficos com a troca VH/VL (CrossMabs VH/VL) com ênfase na sua montagem correta. As estruturas primárias esperadas foram analisadas por espectrometria de massa de ionização por eletroaspersão (ESI-MS) dos CrossMabs intactos desglicosilados e CrossMabs digeridos com desglicosilados/digeridos com plasmina ou alternativamente desglicosilados/limitados por LysC.

[00959] Os CrossMabs VH/VL foram desglicosilados com N-Glicosidase F em um tampão fosfato ou Tris a 37 °C durante 17 horas a uma concentração de proteína de 1 mg/ml. A plasmina ou digestões limitadas de LysC (Roche) foram realizadas com 100 µg de CrossMabs VH/VL desglicosilados em um tampão Tris pH 8 à temperatura ambiente durante 120 horas e a 37 °C durante 40 minutos, respectivamente. Antes da espectrometria de massa, as amostras foram dessalinizadas por HPLC em uma coluna Sephadex G25 (GE Healthcare). A massa total foi determinada por meio de ESI-MS em um sistema maXis 4G UHR-QTOF MS (Bruker Daltonik) equipado com uma fonte TriVersa NanoMate (Advion).

DETERMINAÇÃO DE LIGAÇÃO E AFINIDADE DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS AOS RESPECTIVOS ANTÍGENOS COM O USO DE RESSONÂNCIA PLASMÔNICA DE SUPERFÍCIE (SPR) (BIACORE)

[00960] A ligação dos anticorpos gerados aos respectivos antígenos é investigada por ressonância plasmônica de superfície com o uso de um instrumento BIACORE (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suécia). Resumidamente, para medições de afinidade IgG de Cabra-Anti- Humano, os anticorpos JIR 109-005-098 são imobilizados em um chip CM5 via acoplamento de amina para apresentação dos anticorpos contra o respectivo antígeno. A ligação é medida em tampão HBS (HBS-P (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 a 0,005%, ph 7,4), 25 °C (ou alternativamente a 37 °C). O antígeno (R&D Systems ou purificado internamente) foi adicionado em várias concentrações na solução. A associação foi medida por uma injeção de antígeno de 80 segundos a 3 minutos; a dissociação foi medida lavando a superfície do chip com tampão HBS durante 3-10 minutos e um valor KD foi estimado com o uso de um modelo de ligação Langmuir 1:1. Os dados de controle negativo (por exemplo, curvas de tampão) são subtraídos das curvas de amostra para correção da deriva da linha de base intrínseca do sistema e para redução do sinal de ruído. O respectivo Software de Avaliação Biacore é usado para análise de diagramas de sensores e para o cálculo de dados de afinidade.

EXEMPLO 1

GERAÇÃO E PRODUÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A ANTÍGENOS BIESPECÍFICOS DIRECIONADOS A CD28 E PROTEÍNA DE ATIVAÇÃO DE FIBROBLASTOS (FAP) OU ANTÍGENO CARCINOEMBRIONÁRIO (CEA)

1.1 CLONAGEM DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD28 E PROTEÍNA DE ATIVAÇÃO DE FIBROBLASTOS (FAP) OU ANTÍGENO CARCINOEMBRIONÁRIO (CEA) CLONAGEM DO ANTÍGENO:

[00961] Um fragmento de DNA que codifica o domínio extracelular (aminoácidos 1 a 134 da proteína maturada) de CD28 humano (Uniprot: P10747) foi inserido no quadro em dois vetores receptores mamíferos diferentes a montante de um fragmento que codifica um fragmento Fc de IgG1 hum que serve como tag de purificação e solubilidade. Um dos vetores de expressão continha as mutações “hole” na região Fc, o outro as mutações “knob”, bem como uma tag avi C-terminal (GLNDIFEAQKIEWHE, SEQ ID NO: 387) permitindo biotinilação específica durante a coexpressão com biotina ligase Bir A. Além disso, ambos os fragmentos Fc continham as mutações PG- LALA. Ambos os vetores foram cotransfectados em combinação com um plasmídeo que codifica para a biotina ligase BirA a fim de obter uma construção CD28-Fc dimérica com um avi-tag biotinilado monovalente na extremidade C- terminal da cadeia Fc-knob.

[00962] Os domínios variáveis do clone FAP 4B9, um ligante CEA e os clones CD28 SA e mAb 9,3 foram usados para a geração de vários construtos de CD28 direcionados a tumor. A geração e preparação do clone FAP 4B9 são reveladas no documento WO 2012/020006 A2, que é incorporado no presente documento a título de referência. O clone CEA usado nas moléculas é descrito no documento WO 2007/071422 e o anticorpo superagonístico CD28 (SA) com um VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e um VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 é descrito no documento WO 2006/050949.

Uma descrição do anticorpo mAb 9,3 pode ser encontrada em Tan et al., J.

Immunology 2002, 169, 1119-1125. Para a geração dos respectivos plasmídeos de expressão, as sequências dos respectivos domínios variáveis foram usadas e subclonadas em estrutura com as respectivas regiões constantes que estão pré-inseridas no respectivo vetor de expressão de mamífero receptor. Uma descrição esquemática das moléculas resultantes é mostrada nas Figuras 1A a 1M. Quando indicado, as mutações Pro329Gly, Leu234Ala e Leu235Ala (PG-LALA) foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas de IgG1 humana para anular a ligação aos receptores Fc gama. Para a geração de anticorpos biespecíficos assimétricos, os fragmentos Fc continham as mutações “knob” ou “hole” para evitar o pareamento incorreto das cadeias pesadas. A fim de evitar o pareamento incorreto de cadeias leves em construtos de anticorpos bi e multiespecíficos, a troca de domínios VH/VL ou CH1/Ckappa foi introduzida em uma fração de ligação (tecnologia CrossFab). Em outra fração de ligação, cargas foram introduzidas nos domínios CH1 e Ckappa.

[00963] As seguintes moléculas foram clonadas, uma ilustração esquemática das mesmas é mostrada nas Figuras 1A a 1M:

[00964] Molécula A: anticorpo CD28(SA) (hu IgG4), TGN1412, CD28 (SA) em um isotipo de IgG4 humano (Figura 1A), compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:62 e SEQ ID NO:63 (P1AE1975).

[00965] Molécula B: anticorpo CD28(SA) (PG-LALA), CD28 (SA) em um isotipo de huIgG1 PG-LALA (Figura 1B) compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:62 e SEQ ID NO:64 (P1AD9289).

[00966] Molécula C: FAP(4B9)-CD28(SA) formato 1+1, molécula biespecífica de huIgG1 PG-LALA CrossFab com modificações carregadas no fragmento Fab de CD28(SA) (knob) e troca VH/VL no fragmento Fab de FAP(4B9) (hole) (Figura 1C) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, 66, 67 e 68 (P1AD4492).

[00967] Molécula D: FAP(4B9)-CD28(SA) formato 1+4, construto anti-CD28 (SA) tetravalente biespecífico e anti-FAP huIgG1 PG-LALA monovalente. Os domínios VH e VL do clone de FAP 4B9 foram fundidos à extremidade C-terminal das respectivas cadeias do domínio Fc (VH: cadeia knob, VL: cadeia hole) (Figura 1F). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, 69 e 70 (P1AD9018).

[00968] Molécula E: FAP(4B9)-CD28(SA) formato 1+2,

construto anti-CD28 (SA) bivalente biespecífico e anti-FAP huIgG1 PG-LALA monovalente. Os domínios VH e VL do clone de FAP 4B9 foram fundidos à extremidade C-terminal das respectivas cadeias do domínio Fc (VH: cadeia knob, VL: cadeia hole) (Figura 1D). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, 71 e 72 (P1AD9011).

[00969] Molécula F: FAP(4B9)-CD28(SA) 2+2, construto anti- CD28 (SA) bivalente biespecífico e anti-FAP huIgG1 PG-LALA CrossFab bivalente, modificações carregadas nos fragmentos Fab anti-CD28, fusão VH dos fragmentos anti-FAP CrossFab com troca de CH1/Ckappa à extremidade C-terminal do fragmento Fc (Figura 1E). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, 73 e 74 (P1AD4493).

[00970] Molécula G: FAP (4B9)-CD28 (SA) 2+1, construto anti-CD28 (SA) monovalente biespecífico e anti-FAP huIgG1 PG-LALA CrossFab bivalente, “orientação clássica”, troca VH/VL no fragmento CrossFab anti-CD28, modificação carregada em fragmentos Fab anti-FAP (Figura 1L). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 75, 76, 77 e 78 (P1AD5231).

[00971] Molécula H: FAP(4B9) - CD28(SA) C-01, 1+1 molécula CrossFab anti-CD28 (SA) monovalente biespecífico e anti-FAP huIgG1 PG-LALA monovalente, “head-to-tail”, troca VH/VL no fragmento CrossFab anti-CD28, modificação carregada em aglutinante anti-FAP (Figura 1M). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 75, 77, 78 e 79 (P1AE2021).

[00972] Molécula I: FAP(4B9) - CD28(SA) C-04, 1+1 construto anti-CD28 (SA) monovalente biespecífico e anti-FAP huIgG1 PG- LALA monovalente. Os domínios VH e VL do aglutinante FAP 4B9 foram fundidos à extremidade C-terminal das respectivas cadeias do fragmento Fc (VH: cadeia knob, VL: cadeia hole) (Figura 1K). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 62, 72 e 80 (P1AE2236).

[00973] Molécula J: CEA-CD28(SA) 2+2, construto CrossFab anti-CD28 (SA) bivalente biespecífico e anti-CEA huIgG1 PG-LALA bivalente, modificações carregadas nos fragmentos Fab anti-CD28, fusão VH do fragmento CrossFab anti-CEA com troca de CH1/Ckappa à extremidade C- terminal do fragmento Fc (Figura 1H). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, 81 e 82 (P1AE1195).

[00974] Molécula K: CEA-CD28(SA) 1+2, construto anti- CD28 (SA) bivalente biespecífico e anti-CEA huIgG1 PG-LALA monovalente.

Os domínios VH e VL do aglutinante CEA foram fundidos à extremidade C- terminal das respectivas cadeias do fragmento Fc (VH: cadeia knob, VL: cadeia hole) (Figura 1G). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, 83 e 84 (P1AE1194).

[00975] Molécula L: construto IgG CD28 monovalente (SA), anti-CD28 (SA) huIgG1 PG-LALA monovalente, em que a cadeia pesada de CD28 é expressa como uma cadeia Fc “hole” em combinação com um fragmento Fc (knob) (Figura 1I). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, 85 e 86 (P1AD8944).

[00976] Molécula M: CEA-CD28(SA) formato 1+1, molécula CrossFab de huIgG1 PG-LALA biespecífica com modificações carregadas no fragmento Fab de CD28(SA) (knob) e troca VH/VL no fragmento crossFab de CEA (hole) (Figura 1J) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, 66, 87 e 88 (P1AE3127).

[00977] Molécula N: clone mab 9,3 (PG-LALA), mAb9,3 em isotipo de PG-LALA de IgG1 humano (como na Figura 1B). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 89 e 90 (P1AD5142).

[00978] Molécula O: FAP(4B9) - CD28(mAb9,3) C-03, construto CrossFab huIgG1 PG-LALA biespecífico com modificações carregadas no fragmento Fab de mAb9,3 (knob) e troca VH/VL no fragmento anti-FAP (hole) (como na Figura 1C). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 67, 68, 91 e 92 (P1AE2238).

[00979] Molécula P: FAP(4B9)-CD28(mAb9,3) 1+4, construto anti-CD28 mAb9,3 e anti-FAP huIgG1 PG-LALA tetravalente biespecífico. Os domínios VH e VL do aglutinante FAP são fundidos à extremidade C-terminal das respectivas cadeias do fragmento Fc (VH: cadeia knob, VL: cadeia hole) (como na Figura 1F). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, 93 e 94 (P1AD8969).

[00980] Molécula Q: FAP(4B9)-CD28(mAb9,3) 1+2, construto anti-CD28 mAb9,3 bivalente biespecífico e anti-FAP huIgG1 PG- LALA monovalente. Os domínios VH e VL do aglutinante FAP foram fundidos à extremidade C-terminal das respectivas cadeias do fragmento Fc (VH: cadeia knob, VL: cadeia hole) (como na Figura 1D). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, 95 e 96 (P1AD8962).

[00981] Molécula R: FAP(4B9)-CD28(mAb9,3) 2+2, construto CrossFab anti-CD28 mAb9,3 bivalente biespecífico e anti-FAP huIgG1 PG- LALA bivalente, modificações carregadas no fragmento FAP de mAb9,3, fusão VH do fragmento Fab anti-FAP com troca CrossFab CH1/Ckappa à extremidade C-terminal do fragmento Fc (como na Figura 1E). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, 98 e 99 (P1AD8968).

[00982] Molécula S: FAP (4B9)-CD28 (mAb9,3) 2+1, construto anti-CD28 (mAb9,3) monovalente biespecífico e anti-FAP huIgG1 PG-LALA CrossFab bivalente, “orientação clássica”, troca VH/VL no fragmento CrossFab anti-CD28(mAb9,3), modificação carregada em fragmentos Fab anti-

FAP (como na Figura 1L). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 76, 77, 100 e 101 (P1AD5560).

[00983] Molécula T: FAP(4B9) - CD28(mAb9,3) C-02, construto CrossFab anti-CD28 (mAb9,3) monovalente biespecífico e anti-FAP huIgG1 PG-LALA monovalente, “head-to-tail”, troca VH/VL no fragmento CrossFab de anti-CD28 (mAb9,3), modificação carregada no fragmento anti- FAP (como na Figura 1M). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 78, 79, 100 e 101 (P1AE2022).

[00984] Molécula U: FAP(4B9) - CD28(mAb9,3) C-05, construto anti-CD28 (mAb9,3) monovalente biespecífico e anti-FAP huIgG1 PG-LALA monovalente. Os domínios VH e VL do aglutinante FAP 4B9 foram fundidos à extremidade C-terminal das respectivas cadeias do fragmento Fc (VH: cadeia Fc knob, VL: cadeia Fc hole) (como na Figura 1K). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, 89 e 96 (P1AE2237).

[00985] Molécula V: CEA-CD28(mAb9,3) 2+2, construto CrossFab anti-CD28 (mAb9,3) bivalente biespecífico e anti-CEA huIgG1 PG- LALA bivalente, modificações carregadas no fragmento Fab de mAb9,3, fusão VH do fragmento CrossFab anti-CEA com troca de CH1/Ckappa à extremidade C-terminal do fragmento Fc (como na Figura 1H). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 82, 89 e 102 (P1AE1193).

[00986] Molécula W: CEA-CD28(mAb9,3) 1+2, construto anti-CD28 (mAb9,3) bivalente biespecífico e anti-CEA huIgG1 PG-LALA monovalente. Os domínios VH e VL do aglutinante CEA foram fundidos à extremidade C-terminal das respectivas cadeias do fragmento Fc (VH: cadeia knob, VL: cadeia hole) (como na Figura 1G). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, 103 e 104 (P1AE1192).

[00987] Molécula X: IgG CD28 monovalente (mAb9,3), em que a cadeia pesada de CD28 é expressa como uma cadeia Fc “hole” em combinação com um fragmento Fc (knob) (como na Figura 1I). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 86, 105 e 106 (P1AD8938).

[00988] Ademais, uma molécula triespecífica foi preparada:

[00989] Molécula Y, FAP (4B9)-CD28(TGN1412)-CEA 1+1+1, construto CrossFab anti-CD28 (TGN1412) monovalente triespecífico, anti-FAP monovalente e anti-CEA huIgG1 PG-LALA monovalente, troca VH/VL no fragmento CrossFab anti-CEA (hole), modificações carregadas no fragmento Fab anti-FAP (knob) e no fragmento anti-CD28 (knob) (como na Figura 1N). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 87, 88, 388 e 389 (P1AE4064).

1.2 PRODUÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADAS A CD28 E PROTEÍNA DE ATIVAÇÃO DE FIBROBLASTOS (FAP) OU ANTÍGENO CARCINOEMBRIONÁRIO (CEA)

[00990] A expressão das moléculas acima mencionadas é conduzida por um promotor MPSV quimérico ou um promotor CMV. A poliadenilação é conduzida por uma sequência de sinal poliA sintética localizada na extremidade 3’ do CDS. Além disso, cada vetor contém uma sequência EBV OriP para replicação autossômica.

[00991] Para a produção dos construtos C a W, células HEK293-EBNA que crescem em suspensão foram co-transfectadas com os respectivos vetores de expressão com o uso de polietilenimina como reagente de transfecção. Os anticorpos e anticorpos biespecíficos foram gerados por transfecção transitória de células HEK293 EBNA. As células foram centrifugadas e o meio substituído por meio CD CHO pré-aquecido. Os vetores de expressão foram misturados em meio CD CHO, PEI foi adicionado, a solução agitada em vórtice e incubada por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, as células foram misturadas com a solução de DNA/PEI, transferidas para frasco agitador e incubadas por 3 horas a 37 ° C em incubadora com atmosfera de 5% de CO2. Após a incubação, meio Excell com suplementos foi adicionado (Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, Editores: Weichang Zhou, Anne Kantardjieff). Um dia após os suplementos de transfecção (Ração) foram adicionados (Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, Editores: Weichang Zhou, Anne Kantardjieff). Os sobrenadantes celulares foram colhidos após 7 dias por centrifugação e filtração subsequente (filtro de 0,2 μm) e purificados por métodos padrão.

[00992] Os construtos A, B e X foram preparados pela Evitria com o uso de seu sistema de vetor proprietário com técnicas de clonagem convencionais (não baseadas em PCR) e com o uso de células CHO K1 adaptadas a suspensão (originalmente recebidas de ATCC e adaptadas para crescimento livre de soro em cultura em suspensão em Evitria). Para a produção, a Evitria usou seus meios proprietários sem componentes de animais e sem soro (eviGrow e eviMake2) e seu reagente de transfecção exclusivo (eviFect). O sobrenadante foi colhido por centrifugação e filtração subsequente (filtro de 0,2 μm) e purificado por métodos padrão.

1.3 PURIFICAÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADAS A CD28 E PROTEÍNA DE ATIVAÇÃO DE FIBROBLASTOS (FAP) OU ANTÍGENO CARCINOEMBRIONÁRIO (CEA)

[00993] As proteínas foram purificadas a partir de sobrenadantes da cultura de células filtradas, referindo-se a protocolos padrão.

Em resumo, proteínas contendo Fc foram purificadas a partir de sobrenadantes de cultura de células por cromatografia de afinidade usando Proteína A. A eluição foi alcançada em pH 3,0 seguida por neutralização imediata da amostra. A proteína foi concentrada e a proteína agregada foi separada da proteína monomérica por cromatografia de exclusão de tamanho em histidina 20 mM, cloreto de sódio 140 mM, pH 6,0.

1.4 DADOS ANALÍTICOS DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS OU TRIESPECÍFICOS DIRECIONADOS A CD28 E PROTEÍNA DE ATIVAÇÃO DE FIBROBLASTOS (FAP) OU ANTÍGENO CARCINOEMBRIONÁRIO (CEA)

[00994] A concentração de proteína de construtos purificados foi determinada medindo a densidade óptica (OD) a 280 nm, com uso do coeficiente de extinção de massa calculado com base na sequência de aminoácidos de acordo com Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423.

Pureza e peso molecular das proteínas foram analisados por CE-SDS na presença e ausência de um agente redutor com o uso de um LabChipGXII (Perkin Elmer). A determinação do teor de agregado foi realizada por cromatografia de HPLC a 25 °C com o uso de coluna analítica de exclusão de tamanho (TSKgel G3000 SW XL ou UP-SW3000) equilibrada em tampão de corrida (K2HPO4 25 mM, NaCl 125 mM, mono-hidrocloreto de L-arginina 200 mM, pH 6,7 ou KH2PO4, 200 mM, KCl 250 mM, pH 6,2 respectivamente). Um resumo dos parâmetros de purificação de todas as moléculas é fornecido na Tabela 1.

TABELA 1: RESUMO DA PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE MOLÉCULAS BIESPECÍFICAS OU TRIESPECÍFICAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CD28 SEC Analítico Rendimento Pureza medida por Molécula Descrição (HMW/Monômero/LMW) [mg/l] CE-SDS [%] [%] CD28(SA) A 257 0 / 100 / 0 84,25 (IgG4 hu) CD28(SA) B 390 0 / 97,3 / 2,7 84 IgG1 hu (PG-LALA) FAP(4B9)-CD28(SA) C 19,5 0,64 / 97,28 / 2,07 98,75 1+1 FAP(4B9)- D 1,75 3,53 / 96,48 / 0 n.d. CD28(TGN1412) 1+4 FAP(4B9)-CD28(SA) E 0,38 0,8 / 95,48 / 3,72 93,58 1+2

SEC Analítico Rendimento Pureza medida por Molécula Descrição (HMW/Monômero/LMW) [mg/l] CE-SDS [%] [%] FAP(4B9)-CD28(SA) F 18,2 1,4 / 98,6 / 0 91,42 2+2 FAP (4B9)-CD28 (SA) G 2,66 3,79 / 94,02 / 2,19 64 2+1 FAP(4B9) - CD28(SA) H 10,6 0 / 100 / 0 99,38 C-01 FAP(4B9) - CD28(SA) I 5,55 4,12 / 81,17 / 14,71 96,5 C-04 J CEA-CD28(SA) 2+2 6,25 1 / 99 / 0 n.d.

K CEA-CD28(SA) 1+2 5,8 0,5 / 99,5 / 0 64 IgG1 CD28 L 38,5 0,2 / 99,6 / 0,2 99,3 monovalente (SA) M CEA-CD28(SA) 1+1 14,3 0 / 100 / 0 99,18 CD28 (mAb 9,3) N 22,06 0 /100 / 0 88 IgG1 hu (PG-LALA) FAP(4B9) - O 2,14 0 / 100 / 0 97,4 CD28(mAb9,3) C-03 FAP(4B9)- P 7,6 1,2 / 98,8 / 0 97,6 CD28(mAb9,3) 1+4 FAP(4B9)- Q 16. 1 / 98,5 / 0,5 97,16 CD28(mAb9,3) 1+2 FAP(4B9)- R 3,9 0 / 95,5 / 4,5 87 CD28(mAb9,3) 2+2 FAP (4B9)-CD28 S 2,63 2,1 / 96,3 / 1,6 90,55 (mAb9,3) 2+1 FAP(4B9) - T 2,3 0 / 100 / 0 100 CD28(mAb9,3) C-02 FAP(4B9) - U 23,78 0,68 / 97,82 / 1,5 96,1 CD28(mAb9,3) C-05 CEA-CD28(mAb9,3) V 3,1 0 / 100 / 0 100 2+2 CEA-CD28(mAb9,3) W 2,25 0 / 100 / 0 92,8 1+2 IgG1 monovalente X 20,2 1,4 / 98,6 / 0 97,7 CD28 (mAb9,3) FAP(4B9)- Y CD28(TGN1412)-CEA 1,57 0 /100 / 0 100 1+1+1

EXEMPLO 2

ANÁLISE DE LIGAÇÃO E CINÉTICA DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A ANTÍGENOS BIESPECÍFICOS DIRECIONADOS A CD28 E PROTEÍNA DE ATIVAÇÃO DE FIBROBLASTOS (FAP) OU ANTÍGENO CARCINOEMBRIONÁRIO (CEA)

2.1 LIGAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DIRECIONADOS A CD28 E PROTEÍNA DE ATIVAÇÃO DE FIBROBLASTOS (FAP) A FAP- OU CEA- E A CÉLULAS QUE EXPRESSAM CD28

[00995] A ligação de moléculas biespecíficas FAP-CD28 foi testada com o uso de proteína ativadora de fibroblastos humanos (huFAP) que expressa células 3T3-huFAP (clone 19). Essa linha celular foi gerada pela transfecção da linha celular NIH/3T3 de fibroblasto embrionário de camundongo (ATCC CRL-1658) com o vetor de expressão pETR4921 para expressar huFAP sob seleção de 1,5 μg/ml de puromicina. A ligação a CD28 humano foi testada com células CHO que expressam CD28 humano (linha celular parental CHO-k1 ATCC n° CCL-61, modificada para superexpressar CD28 humano de forma estável). A ligação a CEACAM5 humano foi testada com células MKN45 que expressam CEA (linha de células de câncer gástrico, DSMZ n° ACC 409).

[00996] Para avaliar a ligação, as células foram colhidas, contadas, verificadas quanto à viabilidade e ressuspensas a 2,5E5/ml em tampão FACS (eBioscience, Cat n° 00-4222-26). 5x104 células foram incubadas em placas de 96 poços de fundo redondo durante 2 h a 4 °C com concentrações crescentes dos construtos CD28 direcionados a FAP (1 pM-100 nM). Então, as células foram lavadas três vezes com tampão FACS frio, incubadas por mais 60 min a 4 °C com PE de cabra anti-humano conjugado com PE (Jackson ImmunoReserach, Cat n° 109-116-098), lavado uma vez com tampão FACS frio, centrifugado e ressuspenso em 100 1 de tampão FACS.

Para monitorar as interações de ligação inespecíficas entre construtos e células, um IgG anti-DP47 foi incluído como controle negativo. A ligação foi avaliada por citometria de fluxo com um FACS Fortessa (BD, Software FACS Diva). As curvas de ligação foram obtidas com o uso de GraphPadPrism6.

[00997] As moléculas FAP-CD28 foram capazes de se ligar tanto ao FAP humano quanto a CD28 humano em células de uma maneira dependente da concentração (Figuras 2B e 2C para certos exemplos). Como esperado, nenhuma ligação foi detectada com o IgG anti-DP47, indicando que a detecção da ligação é devida à ligação específica de CD28 e FAP pelas respectivas frações de direcionamento.

[00998] As moléculas de CEA-CD28 também foram capazes de se ligar tanto a CEA humano quanto a CD28 humano nas células.

2.2 ANÁLISE CINÉTICA DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS OU TRIESPECÍFICOS DIRECIONADOS A CD28 E CEA

[00999] A afinidade (KD) de ambas as frações de ligação dos anticorpos biespecíficos ou triespecíficos que compreendem anti-CEA (Medi- 565) e anti-CD28 foi medida por SPR com o uso de um instrumento ProteOn XPR36 (Biorad) a 25 °C com antígeno huCD28-Fc biotinilado e Hu N (A2-B2) A-avi-His biotinilado imobilizado em um chip NLC por captura de neutravidina.

[001000] Para a geração de um antígeno baseado em CEACAM5 que contém o epítopo para CEA (Medi-565), foi gerada uma proteína quimérica que consiste em dois domínios CEACAM1 e dois CEACAM5 Ig. Com base na sequência do CEACAM1, o segundo e o terceiro domínio do CEACAM1 foram substituídos pelos domínios A2 e B2 do CEACAM5. Um avi-tag C-terminal e His tag foram fundidos para biotinilação e purificação sítio-específicas. A proteína resultante foi nomeada Hu N(A2-B2)A- avi-His (SEQ ID NO: 169).

[001001] Imobilização de antígenos recombinantes (ligante): Os antígenos foram diluídos com PBST (fosfato 10 mM, cloreto de sódio 150 mM pH 7,4, Tween 20 a 0,005%) para 10 μg/ml, então, injetados a 30 μl/minuto em tempos de contato variáveis, para atingir níveis de imobilização de cerca de 400, 800, e 1600 unidades de resposta (RU) na orientação vertical. Injeção de analitos: Para medições de cinética única, a direção da injeção foi alterada para orientação horizontal, séries de diluição dupla do anticorpo biespecífico anti- CD28 direcionado a CEA biespecífico purificado (variando os intervalos de concentração entre 50 e 3,125 nM) foram injetadas simultaneamente a 50 μl/min ao longo de canais separados 1-5, com tempos de associação de 150s e tempos de dissociação de 450s. O tampão (PBST) foi injetado ao longo do sexto canal para fornecer um espaço em branco “em linha” para referência. As constantes de taxa de associação (kon) e as constantes de taxa de dissociação (koff) foram calculadas com o uso de um modelo de ligação Langmuir simples um-para-um no software ProteOn Manager v3.1, ajustando simultaneamente os sensorgramas de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (KD) pode ser calculada como a razão koff/kon. Os valores KD calculados de um anticorpo biespecífico compreendendo um domínio de ligação ao antígeno anti-CD28 e um domínio de ligação ao antígeno anti-CEA (Molécula M) estão em linha com os valores medidos dos respectivos construtos monoespecíficos. Os dados cinéticos e termodinâmicos estão resumidos na Tabela 2 abaixo.

TABELA 2: ANÁLISE CINÉTICA E TERMODINÂMICA DE CEA-CD28 (SA) 1+1 (MOLÉCULA M) Fração de ligação kon (1/(s*M) koff (1/s) KD (nM) Anti-CEA 4.13 exp5 1.2 exp-4 0.29

3.13 exp5 3.76 exp-4 1,2 Anti-CD28 (TGN1412)

EXEMPLO 3 GERAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE VARIANTES DE CD28 (SA) DESPROVIDAS DE

PONTOS DE ACESSO E COM AFINIDADE REDUZIDA

3.1 REMOÇÃO DE UM RESÍDUO DE CISTEÍNA NÃO EMPARELHADO, RESÍDUOS DE TRIPTOFANO, UM SÍTIO DE DESAMIDAÇÃO E GERAÇÃO DE VARIANTES DE CD28 (SA)

COM AFINIDADE REDUZIDA

[001002] Como parte de nossa caracterização detalhada do ligante, foi realizada uma análise computacional das sequências de domínio variável de CD28 (SA). Essa análise revelou uma cisteína não pareada na região CDR2 de VH (posição 50, numeração de Kabat), resíduos de triptofano em CDR3 de VH (posição 100a, numeração de Kabat) e CDR1 de VL (posição 32, numeração de Kabat) e um sítio de desamidação de asparagina potencial em CDR2 de VH (posição 56, numeração de Kabat). Embora a oxidação do triptofano seja um processo bastante lento e possa ser evitado pela adição de compostos redutores, a presença de cisteínas desemparelhadas em um domínio variável de anticorpo pode ser crítica. As cisteínas livres são reativas e podem formar ligações estáveis com outras cisteínas desemparelhadas de outras proteínas ou componentes da célula ou meio. Como consequência, isso pode levar a um produto heterogêneo e instável com modificações desconhecidas que são potencialmente imunogênicas e, portanto, podem representar um risco para os pacientes. Além disso, a desamidação da asparagina e a formação resultante de iso-aspartato e succinimida podem afetar a estabilidade in vitro e as funções biológicas in vivo. Uma análise da estrutura cristalina do ligante murino parental 5.11A revelou que C50 não está envolvido na ligação a CD28 humano e, portanto, pode ser substituído por um aminoácido similar, como a serina, sem afetar a afinidade para o CD28 (Tabela 6, variante 29). Ambos os resíduos de triptofano, bem como asparagina na posição 50, no entanto, estão próximos ou envolvidos na interface de ligação e uma substituição por um aminoácido similar pode, portanto, levar a uma redução da afinidade de ligação. Nesse exemplo, pretendemos particularmente reduzir a afinidade de CD28 (SA) para CD28 humano devido ao seguinte motivo: A afinidade de CD28 (SA) está na faixa de 1-2 nM com uma meia-vida de ligação de cerca de 32 minutos. Essa forte afinidade pode levar a um efeito coletor em tecido contendo grandes quantidades de células que expressam CD28, como sangue e tecido linfático, quando injetadas por via intravenosa em pacientes. Como consequência, o direcionamento sítio-específico do composto por meio do(s) componente(s) de direcionamento FAP e/ou CEA pode ser reduzido e a eficácia do construto pode ser diminuída. A fim de minimizar tal efeito, várias variantes de VH e VL foram geradas a fim de reduzir as afinidades em diferentes graus (Figuras 3A e 3C). Além das posições mencionadas anteriormente que representam pontos críticos de estabilidade em potencial, resíduos adicionais envolvidos direta ou indiretamente na ligação a CD28 humano foram substituídos pelo aminoácido da linha germinativa murina original ou por um aminoácido similar. Além disso, as CDRs de CD28 (SA) VL e VH também foram enxertadas nas respectivas sequências estruturais de trastuzumabe (Figuras 3B e 3D). Várias combinações de variantes de VH e VL foram então expressas como construtos similares a IgG anti-CD28 de um braço monovalente e a ligação foi caracterizada por SPR.

3.2 ANÁLISE DAS CONSTANTES DE TAXA DE DISSOCIAÇÃO (KOFF) DE VARIANTES ANTI- CD28 DE UM BRAÇO REDUZIDAS POR SPR

[001003] A fim de caracterizar as variantes do ligante anti- CD28 em uma primeira etapa, todos os ligantes foram expressos como construtos similares a IgG de um braço monovalentes (Figura 4A). Esse formato foi escolhido para caracterizar a ligação a CD28 em um modelo 1:1. 5 dias após a transfecção em células HEK, o sobrenadante foi colhido e a titulação dos construtos expressos foi determinada.

[001004] A taxa de dissociação das variantes de ligante anti- CD28 foi determinada por ressonância plasmônica de superfície (SPR) com o uso de um instrumento ProteOn XPR36 (Biorad) a 25 °C com antígeno huCD28-Fc biotinilado imobilizado em chips NLC por captura de neutravidina.

Para a imobilização do antígeno recombinante (ligante), huCD28-Fc foi diluído com PBST (solução salina tamponada com fosfato com Tween 20 consistindo em fosfato 10 mM, cloreto de sódio 150 mM pH 7,4, Tween 20 a 0,005%) para concentrações que variam de 100 a 500 nM, então injetado a 25 μl/minuto em tempos de contato variáveis. Isso resultou em níveis de imobilização entre 1000 a 3000 unidades de resposta (RU) na orientação vertical.

[001005] Para medições de cinética de disparo único, a direção da injeção foi alterada para a orientação horizontal. Com base na titulação dos sobrenadantes produzidos, os IgGs monovalentes de um braço foram diluídos com PBST para obter séries de diluição dupla variando de 100 nM a 6,25 nM. A injeção foi realizada simultaneamente a 50 μl/min ao longo de canais separados 1-5, com tempos de associação de 120 s e tempos de dissociação de 300 s. O tampão (PBST) foi injetado ao longo do sexto canal para fornecer um espaço em branco “em linha” para referência. Uma vez que a interação de ligação foi medida com IgGs monovalentes de um braço do sobrenadante sem purificação e caracterização bioquímica, apenas as taxas de desativação da interação proteína:proteína foram usadas para conclusões adicionais. As taxas de desvio foram calculadas com o uso de um modelo de ligação Langmuir simples um-para-um no software ProteOn Manager v3.1 ajustando os sensorgramas de dissociação. Os valores de constantes de taxa de dissociação (koff) de todos os clones são resumidos nas Tabela 3. A comparação das variantes produzidas revelou valores de koff com uma diminuição de até 30 vezes em comparação com a sequência parental.

TABELA 3: RESUMO DE TODAS AS VARIANTES DE ANTI-CD28 MONOVALENTES EXPRESSAS COM VALORES DE CONSTANTES DE TAXA DE DISSOCIAÇÃO (KOFF) Variantes de aglutinante ID de Tapir SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: koff(10-4/M) CD28(SA)_variant_1 P1AE4441 112 65 126 3,0 (parental CD28) CD28(SA)_variant_2 P1AE3058 113 120 126 N/A CD28(SA)_variant_3 P1AE3059 113 121 126 N/A CD28(SA)_variant_4 P1AE3060 113 122 126 N/A CD28(SA)_variant_5 P1AE3061 113 65 126 N/A CD28(SA)_variant_6 P1AE3062 114 120 126 N/A CD28(SA)_variant_7 P1AE3063 114 121 126 100 CD28(SA)_variant_8 P1AE3064 114 122 126 68 CD28(SA)_variant_9 P1AE3065 114 123 126 78 CD28(SA)_variant_10 P1AE3066 114 124 126 N/A CD28(SA)_variant_11 P1AE3067 114 65 126 37 CD28(SA)_variant_12 P1AE3068 115 125 126 2,4 CD28(SA)_variant_13 P1AE3069 115 65 126 1,9 CD28(SA)_variant_14 P1AE3070 116 120 126 100 CD28(SA)_variant_15 P1AE3071 116 121 126 24 CD28(SA)_variant_16 P1AE3072 116 122 126 10 CD28(SA)_variant_17 P1AE3073 116 123 126 14 CD28(SA)_variant_18 P1AE3074 116 124 126 82 CD28(SA)_variant_19 P1AE3075 116 65 126 2,9 CD28(SA)_variant_20 P1AE3076 117 120 126 N/A CD28(SA)_variant_21 P1AE3077 117 121 126 N/A CD28(SA)_variant_22 P1AE3078 117 122 126 61 CD28(SA)_variant_23 P1AE3079 117 65 126 43 CD28(SA)_variant_24 P1AE3080 118 120 126 80 CD28(SA)_variant_25 P1AE3081 118 121 126 3,51 CD28(SA)_variant_26 P1AE3082 118 122 126 9,7 CD28(SA)_variant_27 P1AE3083 118 123 126 14 CD28(SA)_variant_28 P1AE3084 118 124 126 69 CD28(SA)_variant_29 P1AE3085 118 65 126 2,5 CD28(SA)_variant_30 P1AE3086 119 125 126 3,22 CD28(SA)_variant_31 P1AE3087 119 65 126 2,5

[001006] A ligação a CD28 humano foi testada com células CHO que expressam CD28 humano (linha celular parental CHO-k1 ATCC n° CCL-61. Esse ensaio de ligação é descrito no Exemplo 4 abaixo. Os construtos variantes monovalentes de CD28 tipo IgG de um braço mostraram diferenças na ligação, como pode ser visto nas Figuras 4A a 4C.

3.3 PREPARAÇÃO E ANÁLISE CINÉTICA DE VARIANTES DE AFINIDADE ANTI-CD28

DIRECIONADAS A FAP BIESPECÍFICAS

[001007] Com base na análise da taxa de desaceleração e no estudo de ligação em células que expressam CD28, várias combinações de variantes de VH e VL anti-CD28 com diferentes intensidades de ligação foram selecionadas e expressas como moléculas CrossFab biespecíficas huIgG1 PG- LALA direcionadas a FAP (para combinações de SEQ ID NO:s ver Tabela 4).

Os construtos resultantes no formato 1+1 (Figura 4B) foram purificados e uma análise bioquímica foi realizada (Tabela 5).

TABELA 4: RESUMO DE TODAS AS VARIANTES DE ANTI-CD28 DIRECIONADAS A FAP 1+1 BIESPECÍFICAS EXPRESSAS Variantes de aglutinante ID de Tapir SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: NO: NO: NO: FAP (4B9)-CD28 67 68 114 122 P1AE3131 (CD28(SA)_Variante 8) 1+1 FAP (4B9) - CD28 67 68 114 65 P1AE3132 (CD28(SA)_Variante 11) 1+1 FAP (4B9) - CD28 67 68 115 125 P1AE3133 (CD28(SA)_Variante 12) 1+1 FAP (4B9) - CD28 67 68 116 121 P1AE3134 (CD28(SA)_Variante 15) 1+1 FAP (4B9) - CD28 67 68 116 122 P1AE3135 (CD28(SA)_Variante 16) 1+1 FAP (4B9) - CD28 67 68 116 123 P1AE3136 (CD28(SA)_Variante 17) 1+1 FAP (4B9) - CD28 67 68 116 65 P1AE3137 (CD28(SA)_Variante 19) 1+1 FAP (4B9) - CD28 67 68 117 65 P1AE3138 (CD28(SA)_Variante 23) 1+1 FAP (4B9) - CD28 67 68 118 121 P1AE3139 (CD28(SA)_Variante 25) 1+1 FAP (4B9) - CD28 67 68 118 123 P1AE3140 (CD28(SA)_Variante 27) 1+1 FAP (4B9) - CD28 67 68 118 65 P1AE3141 (CD28(SA)_Variante 29) 1+1

TABELA 5: RESUMO DA PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE VARIANTES ANTI-CD28

DIRECIONADOS A FAP SEC Analítico Pureza medida Rendimento ID de TaPIR Moléculas biespecíficas (HMW/Monômero/LMW) por CE-SDS [mg/l] [%] [%] FAP (4B9)-CD28 P1AE3131 11,8 0,1 / 98,5 / 1,4 100 (CD28(SA)_Variante 8) 1+1 FAP (4B9) - CD28 100 P1AE3132 (CD28(SA)_Variante 11) 8,1 0,5 / 97,4 / 2,1 1+1 FAP (4B9) - CD28 100 P1AE3133 (CD28(SA)_Variante 12) 6,1 0 / 100 / 0’ 1+1 FAP (4B9) - CD28 100 P1AE3134 (CD28(SA)_Variante 15) 9,2 0 / 100 / 0 1+1 FAP (4B9) - CD28 P1AE3135 (CD28(SA)_Variante 16) 0,4 0 / 100 / 0 97 1+1 FAP (4B9) - CD28 P1AE3136 (CD28(SA)_Variante 17) 1,35 0 / 78,7 / 21,3 87 1+1 FAP (4B9) - CD28 100 P1AE3137 (CD28(SA)_Variante 19) 2,6 0 / 100 / 0 1+1 FAP (4B9) - CD28 P1AE3138 (CD28(SA)_Variante 23) 15,5 0 / 97,5 / 2,5 98 1+1 FAP (4B9) - CD28 P1AE3139 (CD28(SA)_Variante 25) 5,4 0 / 88,7 / 11,3 100 1+1 FAP (4B9) - CD28 P1AE3140 (CD28(SA)_Variante 27) 9,7 0 / 98,3 / 1,7 96 1+1 FAP (4B9) - CD28 P1AE3141 (CD28(SA)_Variante 29) 1,76 1 / 99 / 0 96,3 1+1

[001008] A afinidade (KD) das moléculas de ligação ao antígeno biespecífico produzidas a CD28 foi medida por SPR com o uso de um instrumento ProteOn XPR36 (Biorad) a 25 °C com antígeno huCD28-Fc biotinilado imobilizado em chips NLC por captura de neutravidina. Imobilização de antígenos recombinantes (ligante): O antígeno foi diluído com PBST (fosfato 10 mM, cloreto de sódio 150 mM pH 7,4, Tween 20 a 0,005%) para 10 μg/ml, então, injetado a 30 μl/minuto em tempos de contato variáveis, para atingir níveis de imobilização de cerca de 200, 400 ou 800 unidades de resposta (RU) na orientação vertical. Injeção de analitos: Para medições de cinética única, a direção da injeção foi alterada para orientação horizontal, séries de diluição dupla de variantes de afinidade anti-CD28 direcionadas a FAP biespecífico purificado (variando os intervalos de concentração entre 50 e 3,125 nM) foram injetadas simultaneamente a 50 μl/min ao longo de canais separados 1-5, com tempos de associação de 150s e tempos de dissociação de 450s. O tampão (PBST) foi injetado ao longo do sexto canal para fornecer um espaço em branco “em linha” para referência. As constantes de taxa de associação (kon) e as constantes de taxa de dissociação (koff) foram calculadas com o uso de um modelo de ligação Langmuir simples um-para-um no software ProteOn Manager v3.1, ajustando simultaneamente os sensorgramas de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (KD) foi calculada como a razão koff/kon. Os clones analisados revelaram valores KD em uma faixa ampla (entre 1 e 25 nM). Os dados cinéticos e termodinâmicos estão resumidos na Tabela 6.

TABELA 6: ANÁLISE CINÉTICA E TERMODINÂMICA DE VARIANTES ANTI-CD28

DIRECIONADAS A FAP EXPRESSAS Molécula biespecífica kon (1/(s*M) koff (1/s) KD (nM) parental 3,79 exp5 3,6 exp-4 1 FAP (4B9)-CD28 (CD28(SA)_Variante 8) 2,19 exp5 5,21 exp-3 23,8 1+1 FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_Variante 2,3 exp5 2,87 exp-3 12,5 11) 1+1 FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_Variante 2,6 1exp5 2,67 exp-4 1 12) 1+1 FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_Variante 2,59 exp5 1,84 exp-3 7,1 15) 1+1 FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_Variante 1,87 exp5 9,94 exp-4 5,3 16) 1+1 FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_Variante 3,38 exp5 1,25 exp-3 3,7 17) 1+1

Molécula biespecífica kon (1/(s*M) koff (1/s) KD (nM) FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_Variante 2,8 exp5 3,04 exp-4 1,1 19) 1+1 FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_Variante 2,11 exp5 3,42 exp-3 16,3 23) 1+1 FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_Variante 2,38 exp5 3,96 exp-4 1,7 25) 1+1 FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_Variante 2,27 exp5 1,21 exp-3 5,4 27) 1+1 FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_Variante 2,72 exp5 3,07 exp-4 1,1 29) 1+1 EXEMPLO 4 LIGAÇÃO DE IGGS AGONÍSTICOS DE CD28 MONOVALENTES E ANTICORPOS AGONÍSTICOS DE CD28 DIRECIONADOS A FAP A CÉLULAS QUE EXPRESSAM CD28 E

QUE EXPRESSAM FAP

[001009] A ligação a CD28 humano foi testada com células CHO que expressam CD28 humano (linha celular parental CHO-k1 ATCC n° CCL-61, modificada para superexpressar CD28 humano de forma estável).

Para avaliar a ligação, as células foram colhidas, contadas, verificadas quanto à viabilidade e ressuspensas a 2,5x105/ml em tampão FACS (eBioscience, Cat n° 00-4222-26). 5x104 células foram incubadas em placas de 96 poços de fundo redondo durante 2 h a 4 °C com concentrações crescentes dos aglutinantes CD28 (1 pM-100 nM). Então, as células foram lavadas três vezes com tampão FACS frio, incubadas por mais 60 min a 4 °C com PE de cabra anti-humano conjugado com PE (Jackson ImmunoReserach, Cat n° 109-116- 098), lavado uma vez com tampão FACS frio, centrifugado e ressuspenso em 100 ul de tampão FACS. Para monitorar as interações de ligação inespecíficas entre construtos e células, um IgG anti-DP47 foi incluído como controle negativo. A ligação foi avaliada por citometria de fluxo com um FACS Fortessa (BD, Software FACS Diva). As curvas de ligação foram obtidas com o uso de GraphPadPrism6.

[001010] Os construtos variantes monovalentes de CD28 tipo IgG de um braço mostraram diferenças na ligação, como pode ser visto nas Figuras 4A a 4C. Ademais, foi determinada a ligação de anticorpos anti-CD28 direcionados a FAP biespecíficos no formato 1+1 a células CHO que expressam CD28 humano. Os valores KD para os diferentes construtos 1+1 com variantes de CD28 selecionadas são mostrados na Tabela 7 abaixo ou nos gráficos correspondentes da Figura 4D e 4E.

TABELA 7: LIGAÇÃO DE CONSTRUTOS 1+1 ANTI-CD28 DIRECIONADOS A FAP A CÉLULAS CHO QUE EXPRESSAM CD28 HUMANO Aglutinante TAPIR KD (nM) TGN1412 P1AD4492 1 variante 8 P1AE3131 23,8 variante 11 P1AE3132 12,5 variante 12 P1AE3133 1 variante 15 P1AE3134 7,1 variante 16 P1AE3135 5,3 variante 17 P1AE3136 3,7 variante 19 P1AE3137 1,1 variante 23 P1AE3138 16,3 variante 25 P1AE3139 1,7 variante 27 P1AE3140 5,4 variante 29 P1AE3141 1,1

[001011] A ligação de anticorpos biespecíficos anti-CD28 direcionados a FAP em formato 1+1 a células 3T3-huFAP que expressam FAP (clone 19) também foi determinada conforme descrito no Exemplo 2.1 e é mostrada nos gráficos correspondentes da Figura 4F e 4G.

EXEMPLO 5 LIGAÇÃO DE ANTICORPOS AGONÍSTICOS CD28 DIRECIONADOS A CEA A CÉLULAS QUE EXPRESSAM CD28

[001012] A ligação a CD28 humano foi testada com células CHO que expressam CD28 humano (a ligação foi avaliada por citometria de fluxo com um FACS Fortessa (BD, Software FACS Diva) conforme descrito no Exemplo 4. As curvas de ligação foram obtidas com o uso de GraphPadPrism6.

As curvas de ligação para os diferentes construtos 1+1 com variantes de CD28 selecionadas são mostradas na Figura 16.

EXEMPLO 6 CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL IN VITRO DE DIRECIONAMENTO DE CD28 E PROTEÍNA DE ATIVAÇÃO DE FIBROBLASTOS (FAP) OU ANTÍGENO CARCINOEMBRIONÁRIO (CEA)

[001013] Vários ensaios in vitro baseados em células foram realizados com PBMCs humanos primários para avaliar a atividade de CD28(SA) e moléculas de ligação ao antígeno CD28 direcionado a FAP biespecífico na presença e ausência de sinais de TCR fornecidos por anticorpos biespecíficos de células T (TCB). Proliferação de células T, secreção de citocinas e morte de células tumorais conforme determinado por citometria de fluxo, citocina ELISA e imagem de células vivas foram obtidas como leituras.

[001014] 1. A atividade do CD28 (SA) IgG4 superagonístico original foi avaliada usando um sistema de pré-cultura de alta densidade descrito anteriormente para restaurar a capacidade de resposta de células T derivadas de sangue periférico em relação ao superagonismo mediado por CD28 (Römer et al., 2011).

[001015] 2. A funcionalidade das moléculas de CD28 direcionadas na ausência de sinais de TCR foi avaliada em um ensaio de co- cultura de PBMC humano primário, em que as moléculas de CD28 direcionadas a FAP ou CEA foram reticuladas por ligação simultânea a CD28 humano em células T e FAP humano, expressas ou em células 3T3-huFAP (linha celular parental ATCC n° CCL-92, modificada para superexpressar estavelmente FAP humano) ou células de melanoma MV3 que expressam MCSP e FAP ou células de câncer gástrico MKN45 que expressam CEA, respectivamente.

[001016] 3. A funcionalidade de moléculas de CD28 direcionadas a FAP na presença de sinais de TCR foi avaliada como descrito acima, com a presença adicional de uma molécula de TCB, reticulada por ligação simultânea a CD3 em células T e, ou CEA humano em células de câncer gástrico MKN45, células de câncer de cólon Lovo, células de câncer de cólon HT-29 ou MCSP, expressas em células de melanoma MV3.

ISOLAMENTO DE PBMC

[001017] As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram preparadas por centrifugação em gradiente de densidade a partir de preparações de linfócitos enriquecidos de sangue heparinizado obtido de Buffy Coat (Blutspende Zürich). 25 ml de sangue (diluído 1: 2 em PBS) foram colocados em camadas sobre 15 ml de lymphoprep (tecnologias STEMCELL, Cat n° 07851) e centrifugados à temperatura ambiente por 25 min a 845xg sem freio. A interfase contendo PBMC foi coletada em tubos de 50 ml com uma pipeta de 10 ml. As células foram lavadas com PBS e centrifugadas 5 min a 611xg. O sobrenadante foi descartado, o pélete ressuspenso em 50 ml de PBS e centrifugado por 5 min a 304xg. A etapa de lavagem foi repetida, centrifugando a 171xg. As células foram ressuspensas em RPMI 1640 Glutamax (contendo soro humano a 5%, piruvato de sódio, NEAA, 2- mercaptoetanol 50 µM, penicilina/estreptomicina) e processadas para posterior análise funcional de acordo com o respectivo protocolo de ensaio.

PRÉ-CULTURA DE ALTA DENSIDADE DE PBMCS E AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T PELO SUPERAGONISTA CD28 CD28(SA)

[001018] Para restaurar a capacidade de resposta das células T humanas ao superagonismo CD28 mediado por TGN1412, as PBMCs foram pré-cultivadas em alta densidade (HD) (Römer et al, 2011) antes de avaliar os efeitos dos anticorpos superagonísticos CD28. Em resumo, as PBMCs foram ajustadas para células 1E7/ml em meio completo (RPMI 1640 Glutamax, soro humano a 5%, piruvato de sódio, NEAA, 2- mercaptoetanol 50 uM, penicilina/estreptomicina) e cultivadas a 1,5 ml/poço em um poço de 24 placas por 48 horas a 37 °C, CO2 a 5%. As células foram, então, novamente colhidas, lavadas em meio completo, centrifugadas a 550xg por 5 min e ajustadas com a densidade celular desejada necessária para a caracterização funcional. Para avaliar a proliferação de células T, PBMCs foram marcadas com CFSE e a diluição de CFSE foi medida como proxy para a proliferação de células T após 5 dias de estimulação. Em resumo, as células foram ajustadas para 2x10 7/ml em PBS e marcadas com corante de proliferação CFSE 2,5 µM (LifeTechnologies, Cat n° 65-0850-84) por 6 minutos a 37 °C, CO2 a 5%.

As células foram lavadas uma vez em meio completo, seguido por 2 etapas de lavagem em PBS. Para estimulação com TGN1412, PBMCs foram ajustadas para 2x10 6/ml em meio completo e 1x10 5/ml células foram distribuídas para cada poço de uma placa de 96 poços de fundo plano e estimuladas com concentrações crescentes de TGN1412 (0,0002 nM a 10 nM, triplicados). A diluição de CFSE foi avaliada por citometria de fluxo.

Resumidamente, as células foram centrifugadas a 550xg por 5 min e lavadas com PBS. A diluição de CFSE foi avaliada por citometria de fluxo.

Resumidamente, as células foram centrifugadas a 550xg por 5 min e lavadas com PBS. A coloração de superfície para CD8 (BV711 anti-CD8a humano, BioLegend n° 301044), CD4 (PE-Cy7 anti-CD4 humano, BioLegend n° 344612) foi realizada de acordo com as indicações dos fornecedores. As células foram então lavadas duas vezes com 150 µl/poço de PBS e ressuspensas em 200 µl/poço de tampão FACS e analisadas usando BD FACS Fortessa. A secreção de citocina foi medida no dia 5 após a ativação via ELISA de citocina (huTNFα, DuoSet n° DY210-05 e huIFNγ, DuoSet n° DY285-05) ou análise multiplex de citocina (ensaio Human Cytokine 17-plex, Bio-Rad n° M5000031YV) de sobrenadantes de cultura.

AVALIAÇÃO IN VITRO DA PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS T E SECREÇÃO DE CITOCINAS POR MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CD28 DIRECIONADO A FAP

BIESPECÍFICO NA AUSÊNCIA E PRESENÇA DE SINAIS TCB

[001019] As células Pan T foram utilizadas como células efetoras e isoladas de PBMCs por MACS, com o uso do Kit de Isolamento de Células Pan T Cell (Miltenyi Biotec) de acordo com as instruções do fabricante.

[001020] Para medir a ativação de células T por moléculas de ligação ao antígeno biespecífico FAP-CD28 na ausência de TCB, células pan T marcadas com CFSE foram co-cultivadas com 3x104/poço de 3T3-huFAP ou células parentais 3T3 sem expressão de FAP (3T3-WT), semeadas no dia anterior em placas de 96 poços de fundo plano. Moléculas de ligação ao antígeno FAP-CD28 biespecíficas foram adicionadas em concentrações crescentes (0,0002 nM - 10 nM, triplicatas).

[001021] Para medir a proliferação de células T na presença de um sinal de TCB, células pan T marcadas com CFSE foram incubadas com 3x104 células MV3 expressando FAP e MCSP/poço, semeadas no dia anterior em placas de 96 poços de fundo plano, aumentando as concentrações de moléculas de ligação ao antígeno FAP-CD28 biespecífico (0,0002 nM - 10 nM, triplicatas) e concentração fixa de MCSP-TCB (5 pM, P1AD2189). Como controles, poços contendo apenas TCB foram incluídos.

[001022] A diluição de CFSE foi avaliada por citometria de fluxo e a secreção de citocina foi medida 5 dias após a ativação via ELISA de citocina (huTNFα, DuoSet n° DY210-05 e huIFNγ, DuoSet n° DY285-05) ou análise multiplex de citocina (ensaio de citocina humana 17-plex, Bio-Rad n° M5000031YV) de sobrenadantes de cultura.

[001023] A preparação do anticorpo biespecífico anti- MCSP/anti-CD3 (MCSP-TCB) usado no experimento é descrita no documento WO 2014/131712 A1.

SUPERAGONISMO DE CD28(SA) REQUER RETICULAÇÃO DE FcRIIb A PRÉ-CULTURA DE ALTA DENSIDADE DE PBMCS RESTAURA O SUPERAGONISMO DE CD28(SA)

[001024] Para entender o mecanismo de ação do CD28(SA), validou-se a pré-cultura de alta densidade (HD) de PBMCs como um protocolo descrito anteriormente para restaurar a capacidade das células T derivadas de PBMC de responder ao superagonismo de CD28 mediado por TGN1412 (Römer et al., 2011). Conforme representado nas Figuras 5A e 5B, CD28 (SA) IgG4 (P1AE1975) induz a proliferação de células T de PBMC (Figura 5A) e produção de citocinas (Figura 5B) de uma maneira dependente da concentração 5 dias após a estimulação apenas em PBMCs submetidos a pré- cultura HD, enquanto novas PBMCs permaneceram sem resposta. Concluiu-se que o protocolo publicado anteriormente para restaurar a capacidade de resposta das células T a CD28 (SA) in vitro (Römer et al., 2011) pode ser reproduzido nas próprias mãos.

A ATIVIDADE SUPERAGONÍSTICA DE CD28(SA) REQUER RETICULAÇÃO VIA FCRIIB - BLOQUEIO DE FCRIIB ELIMINA A FUNCIONALIDADE DE CD28(SA)

[001025] A literatura publicada anteriormente indica que TGN1412 potencialmente depende da reticulação de FcRIIb. Para compreender a ligação entre a pré-cultura HD de PBMCs e a dependência de Fc da funcionalidade de CD28(SA), os níveis de expressão de FcRIIb em PBMCs foram avaliados por citometria de fluxo antes e após a pré-cultura de HD. Conforme representado na Figura 5C, a expressão de FcRIIb estava ausente em monócitos de PBMC frescos, enquanto 96,8% dos monócitos expressavam FcRIIb após 2 dias de pré-cultura de HD. O bloqueio de FcRIIb mediado por anticorpos em subsequentes ensaios de proliferação de células T anulou completamente a proliferação de células T após estimulação com CD28(SA), medida após 5 dias em cultura (Figura 5D). Em uma abordagem alternativa, uma variante silenciada por Fc de CD28(SA) que porta a mutação P329G-LALA (CD28(SA) IgG1 PG-LALA: P1AD9289) não apresentou função superagonística (Figura 6A). Esses dados confirmam que o superagonismo de CD28 mediado por CD28(SA) depende da reticulação via FcγRIIb.

ADICIONAR UMA FRAÇÃO DE DIRECIONAMENTO DE TUMOR PARA O DIRECIONAMENTO DE FAP A FC-SILENCIOSO CD28(SA) RESTAURA O SUPERAGONISMO, QUE É ENTÃO

DEPENDENTE DA PRESENÇA DO TUMOR ALVO

[001026] Dado que o superagonismo de CD28 por TGN1412 depende da reticulação de FcγRIIb, formulou-se a hipótese de que a dependência de FcR pode ser redirecionada para tumores pela introdução de (i) uma mutação P329G-LALA de silenciamento de Fc e (ii) uma fração de direcionamento que reticula um antígeno tumoral expresso na superfície. Para testar esta hipótese, uma fração de direcionamento de FAP foi adicionada como fusão C-terminal a um TGN1412 silenciado por Fc (FAP-CD28 1+2 SA: P1AD9011). Uma vez que a reticulação de FcR não era necessária para essa abordagem, as PBMCs não foram submetidas a pré-cultura de HD. Em vez disso, PBMCs frescas foram co-cultivadas com 3T3-huFAP ou 3T3-WT por 5 dias na presença de concentração crescente de FAP-CD28 (P1AD9011) e a proliferação de células T foi avaliada por diluição CFSE via citometria de fluxo.

Como mostrado na Figura 6B, a introdução da porção de ligação a FAP permitiu a proliferação de células T exclusivamente na presença de FAP.

Concluiu-se que o superagonismo pode ser direcionado seletivamente para antígenos tumorais por silenciamento de Fc e adição de uma fração de direcionamento ao tumor.

ANTICORPOS AGONÍSTICOS CONVENCIONAIS DE CD28 (CLONE 9,3) NÃO SE

COMPORTAM DE FORMA SUPERAGONISTA EM FORMATOS BIESPECÍFICOS DIRECIONADOS A TUMORES

[001027] Dois tipos de anticorpos agonísticos de CD28 foram relatados na literatura: anticorpos CD28 superagonísticos, como o TGN1412,

são capazes de ativar células T autonomamente sem a necessidade de um sinal adicional fornecido pelo TCR.

Esses anticorpos são chamados de superagonistas, devido ao fato de que ultrapassam a funcionalidade dos ligantes agonísticos naturais de CD28, CD80 e CD86, que dependem estritamente da presença de um sinal de TCR para aumentar a função das células T.

Em contraste com os anticorpos superagonísticos, como TGN1412,

os anticorpos agonísticos convencionais, como o clone mab 9,3, não são capazes de ativar células T autonomamente, mas, assim como os ligantes

CD28 naturais, requerem um sinal de TCR adicional para aumentar a atividade das células T.

Para avaliar o efeito de direcionar agonistas de CD28 para antígenos tumorais em mais detalhes, geramos outras moléculas FAP-CD28:

(i) uma molécula superagonística (SA) com 2 frações de ligação a CD28

(TGN1412) e 2 frações de ligação FAP = formato 2+2 SA (P1AD4493), (ii) um agonista convencional (CA) com 2 porções de ligação a CD28 (clone 9,3) e 1 ou 2 porções de ligação FAP, respectivamente: 2+2 CA (P1AD8968), 1+2 CA

(P1AD8962). PBMCs frescas foram co-cultivadas com 3T3-huFAP ou 3T3-WT por 5 dias na presença de concentração crescente das moléculas direcionadas a FAP e a proliferação de células T foi avaliada por diluição de CFSE via citometria de fluxo.

Conforme representado nas Figuras 7A a 7D, apenas ligantes superagonísticos foram capazes de ativar células T.

Além disso, a ativação de células T por meio das construções superagonísticas descritas é estritamente dependente da presença de FAP (Figura 7B), conforme demonstrado pela ausência de ativação de células T na ausência de FAP

(Figura 7D). Em linha com estes dados, também a secreção de citocinas foi observada apenas para construções que albergam os anticorpos superagonísticos CD28(SA), mas não o anticorpo agonístico 9,3 convencional

(Figura 7E). Concluiu-se que apenas os anticorpos CD28 superagonísticos induzem a ativação de células T autônomas em formatos de anticorpos direcionados a tumores biespecíficos, enquanto os mesmos formatos com ligantes 9,3 convencionais não são superagonísticos.

EXEMPLO 7 AVALIAÇÃO IN VITRO DA MORTE DE CÉLULAS TUMORAIS POR MOLÉCULAS CD28

DIRECIONADAS A TUMOR NA AUSÊNCIA OU PRESENÇA DE TCB

[001028] Para avaliar a capacidade das moléculas de ligação ao antígeno biespecífico FAP-CD28 ou CEA-CD28 para atingir a morte de células tumorais ou suportar a morte de células tumorais mediada por TCB, as células pan T purificadas serviram como células efetoras e células MV3 expressando RFP e células MKN45, respectivamente serviram como alvos tumorais.

[001029] Para avaliar a morte de células tumorais MV3, 5000 células alvo MV3 semeadas no dia anterior foram co-cultivadas com 1x105 células T pan por poço em placas de 96 poços de fundo plano (E:T 20:1), na presença de MCSP- 5 pM TCB (P1AD2189) sozinho ou em combinação com a molécula de ligação ao antígeno FAP-CD28 biespecífico 10 nM. Para avaliar a morte de células tumorais MV3, 5000 células alvo MV3 semeadas no dia anterior foram co-cultivadas com 1x105 células T pan por poço em placas de 96 poços de fundo plano (E:T 20:1), na presença de FAP-CD28 2 nM. Para avaliar a morte de células tumorais MKN45, 5000 MKN45 semeadas no dia anterior foram co-cultivadas com 1x105 células T pan por poço em placas de 96 poços de fundo plano, na presença de CEA-CD28 2 nM. A morte das células-alvo foi monitorada ao longo de 90 horas, com o uso do sistema de imagem de células vivas IncuCyte (Essen Biosciences), capturando 4 imagens por poço a cada 3 horas. As contagens de objetos RFP+ por imagem (avaliadas por meio do software IncuCyte ZOOM, Essen Biosciences) ao longo do tempo serviram como proxy para a morte de células-alvo. A morte de células-alvo mediada por anticorpos foi distinguida da morte espontânea de células-alvo monitorando as contagens de células-alvo na presença de células T efetoras sozinhas ao longo do tempo (= controle de linha de base). A morte foi calculada como 100 - x, em que x é o percentual de alvos em relação ao controle da linha de base. As análises estatísticas foram realizadas usando o teste t de Student, comparando as áreas sob as curvas (AUC) de percentual de mortes ao longo do tempo.

FAP-CD28 INDUZ A MORTE DE CÉLULAS ALVO NO FORMATO 1+2, MAS APENAS COM LIGANTES CD28 SUPERAGONÍSTICOS, NÃO COM LIGANTES AGONÍSTICOS CONVENCIONAIS DE CD28

[001030] A capacidade das moléculas FAP-CD28 para induzir a morte de células tumorais foi avaliada. Conforme representado nas Figuras 8A a 8D, a co-cultura de células T derivadas de PBMC com células de melanoma MV3 que expressam FAP na presença de FAP-CD28 ao longo de 90 horas levou à morte de células MV3 exclusivamente por FAP CD28 (SA) em formato 1+2 (P1AD9011) e era comparável à indução de morte alcançada por um TCB direcionado a FAP (7). Nenhuma morte foi observada com FAP-CD28 (SA) no formato 2+2 (P1AD4493), bem como FAP-CD28 com anticorpo 9,3 agonístico CD28 convencional (P1AD8968 & P1AD8962). Concluiu-se que, além da proliferação de células T e secreção de citocinas, um FAP-CD28 no formato 1+2 com ligantes superagonísticos também pode provocar a morte de células-alvo, comparável a um TCB.

CEA-CD28 INDUZ A MORTE DE CÉLULAS ALVO NO FORMATO 1+2 E 2+2, MAS APENAS COM ANTICORPOS SUPERAGONÍSTICOS, NÃO COM ANTICORPOS AGONÍSTICOS CONVENCIONAIS DE CD28

[001031] Em uma abordagem alternativa, usamos moléculas agonísticas de CD28 direcionadas a CEA nos formatos 2+2 SA(P1AE1195), 1+2 SA (P1AE1194), 2+2 CA (P1AE1193) e 2+1 CA (P1AE1192) para avaliar sua capacidade de induzir a morte de células-alvo. As células T PBMC foram co-cultivadas com células MKN45 que expressam CEA na presença de CEA- CD28 nos formatos acima mencionados por 90 h. Ambos os formatos contendo ligantes CD28 superagonísticos foram capazes de induzir a morte de células MKN45 que expressam CEA (Figura 9A e 9B). Especulou-se que a discrepância entre a capacidade de FAP-CD28(SA) 2+2 e CEA-CD28 (SA) 2+2 de matar suas respectivas células alvo está dentro das discrepâncias dos níveis de expressão alvo em células MKN45 vs. MV3. Precisamente, os dados internos confirmaram que os níveis de expressão de FAP de células MV3 são 10x mais baixos do que os níveis de expressão de CEA de células MKN45.

Dessa forma, em células MV3, os sítios de ligação tumoral alvo podem ser limitantes e a morte de células MV3 requer ocupação eficiente de FAP vs.

CD28, o que é vantajoso no formato 1+2 (ou seja, 1 sítio de ligação FAP faz ligações cruzadas com 2 sítios de ligação CD28) em comparação com 2+2 (isto é, 2 sítios de ligação FAP necessários para a reticulação de 2 sítios de ligação CD28).

O SUPERAGONISMO DE CD28 POR LIGANTES TGN1412 DEPENDE DA MULTIVALÊNCIA DO LIGANTE CD28 - LIGANTES MONOVALENTES NÃO SÃO

SUPERAGONÍSTICOS

[001032] Para investigar mais a natureza do superagonismo de CD28, avaliou-se se ligantes monovalentes de CD28 TGN1412 exibem comportamento superagonista em um formato biespecífico direcionado a tumor. As células T PBMC foram co-cultivadas com células 3T3-huFAP e incubadas com concentrações crescentes de FAP-CD28 1+2 SA com bivalência de CD28 (P1AD9011) e FAP-CD28 1+1 SA com monovalência de CD28 (P1AD4492). Conforme exibido na Figura 10A, FAP-CD28 com ligação monovalente a CD28 (P1AD4492) não foi capaz de induzir a proliferação de células T, ao contrário do construto bivalente CD28 (P1AD9011).

Consistentemente, a regulação positiva dos marcadores de ativação de células

T CD69 e CD25 foi observada apenas com a bivalência de CD28 (Figura 10B e 10C, respectivamente). Em conclusão, o superagonismo mediado por TGN1412 não depende apenas de reticulação por meio de receptores Fc, mas também requer multivalência de ligante de CD28.

[001033] Em conclusão, pode ser estabelecido que o superagonismo de CD28 pode ser direcionado especificamente para antígenos tumorais por silenciamento de Fc e introdução de um domínio de ligação de antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor. Além disso, os anticorpos biespecíficos direcionados ao tumor são apenas superagonísticos quando compreendiam ligantes baseados em CD28 (SA) e não quando compreendiam ligantes agonísticos convencionais (clone 9,3).

Além disso, o superagonismo requer multivalência do ligante CD28(SA) e a ligação monovalente de CD28(SA) em construtos biespecíficos anula a ativação de células T superagonísticas.

FAP-CD28 SUPORTA MORTE DE CÉLULAS ALVO MEDIADA POR TCB E REQUER MONOVALÊNCIA DE LIGANTE DE CD28 PARA SUSTENTAR A DEPENDÊNCIA DE ALVO

TUMORAL

[001034] A sinalização de CD28 é bem descrita para aumentar as respostas de células T mediadas por receptor de célula T.

Portanto, os anticorpos biespecíficos de células T (TCBs) são um parceiro de combinação promissor para o agonismo de CD28. Através da combinação de agonismo de CD28 direcionado com TCBs, prevemos melhorar as funções efetoras mediadas por TCB, diminuir o limiar de expressão de CEA para ativação eficiente de células T mediada por TCB, fornecer dicas de sobrevivência e suportar a resistência à supressão de células T via PD-1 e CTLA4.

[001035] Para investigar se os agonistas de CD28 direcionados podem aumentar os TCBs, avaliamos a capacidade de FAP-

CD28(SA) 1+2 (P1AD9011) e FAP-CD28(SA) 1+1 (P1AD4492) para suportar a morte de células alvo mediada por TCB. A co-cultura de células T derivadas de PBMC com células MV3 que coexpressam MCSP e FAP por 5 dias na presença de concentrações crescentes de FAP-CD28 e concentração fixa e limitante de MCSP-TCB (5 pM) levou ao aumento da morte de Células alvo MV3 de uma maneira dependente da concentração de FAP-CD28 (Figura 11A). No entanto, a presença de TCB aboliu a dependência de FAP de FAP- CD28 no formato bivalente de CD28 (P1AD9011), enquanto a dependência de FAP foi mantida no formato monovalente de CD8 (P1AD4492), conforme demonstrado por um aumento dependente da concentração na morte de células alvo mediada por CEACAM5-TCB na presença de células tumorais MKN45 negativas para FAP, expressando CEA, 5 dias após a estimulação (Figura 11B).

[001036] Em uma abordagem alternativa, avaliamos a proliferação de células T induzida por FAP-CD28 1+2 SA (P1AD9011) na presença ou ausência de TCB e na presença ou ausência de FAP, respectivamente. Como mostrado na Figura 12A e no exemplo anterior, FAP- CD28(SA) 2+1 é estritamente dependente da presença de FAP para ativação de células T na ausência de TCBs. Na presença de TCBs, no entanto, como mostrado na Figura 12B, FAP-CD28 (SA) 1+2 induz aumento da ativação de células T mesmo na ausência de FAP.

[001037] A presente hipótese é que o sinal de TCR induzido por TCB leva potencialmente a pré-agrupamento suficiente de componentes de sinalização de TCR, tornando assim a reticulação de superfície de receptores de CD28 em células T por moléculas de CD28 bivalentes suficientes para induzir a coestimulação. Concluiu-se que, para abordagens de combinação de TCB, a monovalência do ligante de CD28 é estritamente necessária para manter a dependência tumor-alvo da molécula de ligação ao antígeno agonista de CD28 direcionada.

A COMPARAÇÃO DE VÁRIOS FORMATOS FAP-CD28 MONOVALENTES REVELA UM CONJUNTO DE VÁRIOS FORMATOS FAP-CD28 FUNCIONAIS, COM A MAIOR POTÊNCIA PARA O FORMATO 1+1 CLÁSSICO

[001038] Para avaliar o impacto do formato de anticorpo específico de FAP-CD28 em sua capacidade de aumentar a ativação de células T mediada por TCB, diferentes formatos de moléculas de ligação ao antígeno FAP-CD28 com ligação monovalente de CD28 foram gerados e estão representados nas Figuras 1C, 1K, 1L e 1M. FAP-CD28 1+2 com bivalência CD28 foi usado como referência. Para avaliar a funcionalidade desses formatos, as células T PBMC foram incubadas com células MV3 que coexpressam MCSP e FAP por 5 dias na presença de concentrações crescentes de formatos FAP-CD28 juntamente com concentração fixa e limitante de MCSP-TCB (5 PM). Todos os formatos foram capazes de aumentar significativamente a proliferação de células T CD8 (Figura 13A), proliferação de células T CD4 (Figura 13B) e morte de células alvo (Figura 13C). Digno de nota, a potência da molécula C (P1AD4492) foi mais alta e comparável à potência do formato de referência CD28 bivalente 1+2 SA (P1AD9011). A ligação a CD28 e FAP de todas as moléculas é mostrada nas Figuras 2F e 2G, respectivamente.

EXEMPLO 8

AVALIAÇÃO IN VITRO DA MORTE DE CÉLULAS TUMORAIS DA COMBINAÇÃO DE MOLÉCULAS CD28 DIRECIONADAS A TUMOR E TCBS DIRECIONADOS A CEA PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DE CÉLULAS T (TCB)

[001039] As moléculas de TCB foram preparadas de acordo com os métodos descritos no documento WO 2014/131712 A1 ou WO 2016/079076 A1. A preparação do anticorpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 (CEA CD3 TCB ou CEA TCB) usada nos experimentos é descrita no Exemplo

3 do documento WO 2014/131712 A1. O CEA CD3 TCB é um anticorpo “2+1 IgG CrossFab” e é composto por duas cadeias pesadas diferentes e duas cadeias leves diferentes. Mutações pontuais no domínio CH3 (“knobs into holes”) foram introduzidas para promover a montagem das duas cadeias pesadas diferentes. A troca dos domínios VH e VL no Fab de ligação a CD3 foi realizada de modo a promover a montagem correta das duas cadeias leves diferentes. 2+1 significa que a molécula tem dois domínios de ligação ao antígeno específicos para CEA e um domínio de ligação ao antígeno específico para CD3. O CEACAM5 CD3 TCB tem o mesmo formato, mas compreende outro ligante CEA e compreende mutações pontuais nos domínios CH e CL do ligante CD3 de modo a suportar o emparelhamento correto das cadeias leves.

CEA CD3 TCB compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:163 e SEQ ID NO:164. CEACAM5 CD TCB compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:165, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:167 e SEQ ID NO:168.

CEA-CD28 SINERGIZA COM CEACAM5-TCB NA MORTE DE CÉLULAS ALVO

[001040] Em uma abordagem alternativa, gerou-se uma molécula de ligação ao antígeno biespecífico CEA-CD28 (SA) 1+1 (Molécula M, P1AE3127) e avaliou-se sua capacidade de aumentar a morte de células alvo mediada por CEACAM5-TCB. Para esse fim, células de câncer colorretal MKN45 que expressam CEA foram co-cultivadas com células T PBMC e CEA- CD28 (Molécula M, P1AE3127) ou CD28 monovalente não direcionado (Molécula L, P1AD8944) na presença ou ausência de CEACAM5-TCB subótimo (10 nM) e a morte de células MKN45 foi avaliada ao longo do tempo.

Como mostrado na Figura 14, apenas a combinação de CEACAM5-TCB e CEA-CD28 levou à morte de células-alvo, enquanto os compostos sozinhos não atingiram a morte de células-alvo, indicando efeitos sinérgicos. Além disso, o CD28 não direcionado em combinação com CEACAM5-TCB também não induziu morte, destacando mais uma vez a necessidade de agonistas monovalentes de CD28 para reticulação e a dependência assim sustentada do tumor alvo.

CEA-CD28 AUMENTA CEA-TCB E CEACAM5-TCB E REDUZ OS LIMITES DE

EXPRESSÃO DE CEA EM CÉLULAS CANCEROSAS PARA TCBS PARA ATIVAR CÉLULAS T

[001041] CEA-TCB e CEACAM5-TCB requerem um certo nível de expressão de CEA em células alvo para ativação de células T e morte de células alvo. Avaliou-se se o CEA-CD28 foi capaz de diminuir o limite de expressão de CEA para TCBs para induzir a morte de células-alvo eficiente. Para esse fim, as células T PBMC foram incubadas com concentrações crescentes de CEA-TCB (P1AD4646) ou CEACAM5-TCB (P1AD5299) e concentrações fixas de CEA-CD28 (Molécula M, P1AE3127) na presença de linhas de células alvo com diferentes níveis de expressão de CEA: (i) MKN45 (alta expressão, aprox. 400000 sítios de ligação de CEA/célula), (ii) Lovo (expressão média, aproximadamente 60000 sítios de ligação de CEA/célula), (iii) HT-29 (baixa expressão, aprox. 6000 sítios de ligação de CEA/célula). A proliferação de células T foi medida como proxy da ativação de células T. Conforme mostrado na Figura 15, CEA-CD28 pode aumentar significativamente a potência de CEA-TCB e CEACAM5- TCB. Mais surpreendentemente, enquanto os TCBs não atingiram a ativação de células T em células HT-29 de baixa expressão de CEA sozinhas, a adição de CEA-CD28 aumentou fortemente a atividade do TCB. Conclui-se que CEA-CD2 aumenta CEA-TCB e CEACAM5-TCB e reduz os limites de expressão de CEA em células cancerosas para TCBs para ativar células T.

EXEMPLO 9

CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL IN VITRO DE VARIANTES COM AFINIDADE REDUZIDA DE CD28(SA)

[001042] Para o ligante CD28(SA) original (TGN1412), foi determinada uma afinidade de KD=1 nM. Ligantes de alta afinidade como este abrigam o risco de estarem sujeitos a efeitos de sumidouro periférico, especialmente se o alvo for altamente expresso no sangue periférico, como é o caso do CD28. A fim de (i) reduzir os efeitos de sumidouro periférico e (ii) reduzir o risco de ativação de células T periféricas por meio da ligação fora do tumor de anticorpos CD28 alvejados por tumor biespecífico para células T, gerou-se uma série de 31 ligantes de CD28 com afinidades reduzidas introduzindo mutações pontuais nos CDRs (consulte o Exemplo 3). As Figuras 4A, 4B e 4C mostram a ligação a CD28 em células CHO do CD28 monoespecífico, IgGs monovalentes de sobrenadantes, confirmando que a adição de mutações pontuais gerou uma ampla gama de ligantes com propriedades de ligação variáveis. Com base nesses dados, uma lista restrita de 11 candidatos foi selecionada para conversão no formato biespecífico FAP- CD28 (consulte o Exemplo 4, Tabela 6) para caracterização adicional. Os ensaios de ligação confirmaram a ligação positiva a FAP nas células (Figuras 4F e 4G), bem como a ligação positiva e variável a CD28 das variantes escolhidas (Figuras 4D e 4E).

VARIANTES DE LIGANTE DE CD28 COM AFINIDADE REDUZIDA SÃO FUNCIONAIS IN VITRO EM UM FORMATO BIESPECÍFICO FAP-CD28

[001043] Para avaliar se as variantes de ligante de CD28 com afinidade reduzida ainda eram funcionais e capazes de suportar funções efetoras mediadas por TCB, avaliou-se a proliferação de células T na combinação de TCB. Para esse fim, as células T PBMC foram co-cultivadas com células MV3 que coexpressam MCSP e FAP durante 5 dias na presença de concentrações crescentes de FAP-CD28 e concentração limitada e fixa de MCSP-TCB (5 pM). Conforme representado na Figura 4H, todas as variantes dos ligantes de CD28 eram funcionais e capazes de aumentar a proliferação de células T mediada por TCB de uma maneira dependente da concentração. De notar, a variante 8 de afinidade mais baixa (P1AE3131) mostra uma redução aproximada de 20 vezes da afinidade em comparação com o clone CD28 parental, mas recupera aproximadamente 86% da sua potência (Figura 4I). Em linha com essas revelações, todas as variantes poderiam aumentar ainda mais a morte mediada por TCB de células alvo MV3 (Figura 4J). Os valores de EC50 correspondentes são mostrados na Tabela 8 abaixo.

TABELA 8: MORTE MEDIADA POR TCB DE CÉLULAS ALVO MV3 POR MOLÉCULAS BIESPECÍFICAS FAP-CD28 DE CÉLULAS ALVO MV3 variante FAP-CD28 TAPIR morte de EC50 (nM) parental P1AD4492 0,98 variante 8 P1AE3131 2,33 variante 11 P1AE3132 1,73 variante 12 P1AE3133 0,98 variante 15 P1AE3134 1,79 variante 29 P1AE3141 1,11

[001044] Com base nesses resultados, as variantes 8 (afinidade mais baixa, 23 nM), 15 (afinidade intermediária: 7,1 nM) e 29 (pontos quentes removidos, quase nenhuma redução de afinidade, KD = 1,1 nM) foram escolhidos para posterior caracterização in vitro e teste in vivo, julgado pela eficácia e melhor bio-distribuição para o tumor.

VARIANTES DE LIGANTE DE CD28 COM AFINIDADE REDUZIDA SÃO FUNCIONAIS IN VITRO EM UM FORMATO BIESPECÍFICO CEA-CD28

[001045] Em uma abordagem alternativa, converteu-se as três variantes selecionadas 8, 15 e 29 em um formato biespecífico direcionado a CEA e avaliou-se sua capacidade de aumentar a ativação de células T mediada por CEACAM5-TCB e a morte de células-alvo. A ligação a CD28 dessas moléculas é mostrada na Figura 16. Para avaliar a funcionalidade,

células T PBMC foram incubadas com concentrações crescentes de CEACAM5-TCB e concentrações fixas de variantes de CEA-CD28 na presença de células alvo MKN45 que expressam CEA. Conforme representado nas Figuras 17A, 17B e 17C, todas as variantes foram capazes de aumentar a proliferação de células T CD8 mediada por TCB após 5 dias (Figura 17A), proliferação de células T CD4 após 5 dias (Figura 17B) e morte de células alvo em 90 h (Figura 17C). Os valores de EC50 correspondentes são resumidos na Tabela 9 abaixo.

TABELA 9: VALORES DE EC50 DE PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS T CD8 E CD4

MEDIADA POR TCB E MORTE DE CÉLULAS ALVO POR VARIANTES BIESPECÍFICAS CEA-CD28 EC50 de anticorpo CEA- EC50 de proliferação proliferação de EC50 de morte [nM] CD28 de CD8 [nM] CD4 [nM] CD28 Parental 0,0013 0,0015 0,002 Variante 8 0,0035 0,0033 0,004 Variante 15 0,0021 0,0016 0,005 Variante 29 0,0013 0,0013 0,004 TCB sozinho 0,046 0,038 0,012 EXEMPLO 10 GERAÇÃO E PRODUÇÃO DE NOVOS ANTICORPOS ANTI-CEA

10.1 GERAÇÃO DE VARIANTES HUMANIZADAS DE ANTICORPO ANTI-CEA A5B7

10.1.1 METODOLOGIA

[001046] O anticorpo anti-CEA A5B7 é, por exemplo, revelado por MJ Banfield et al, Proteins 1997, 29 (2), 161-171 e sua estrutura pode ser encontrada como PDB ID: 1CLO na base de dados estrutural de proteínas PDB (www.rcsb.org, H.M. Berman et al, The Protein Data Bank, Nucleic Acids Research, 2000, 28, 235-242). Esta entrada inclui a sequência de domínio variável de cadeia pesada e leve. Para a identificação de uma estrutura aceitadora humana adequada durante a humanização do ligante anti-CEA A5B7, uma abordagem clássica foi adotada procurando por uma estrutura aceitadora com alta homologia de sequência, enxertando as CDRs nessa estrutura e avaliando quais mutações reversas pode ser considerada. Mais explicitamente, cada diferença de aminoácidos dos frameworks identificados para o anticorpo parental foi avaliada quanto ao impacto na integridade estrutural do aglutinante, e mutações reversas para a sequência parental foram introduzidas sempre que apropriado. A avaliação estrutural foi baseada em modelos de homologia da região Fv do anticorpo parental e das suas versões humanizadas criadas com uma ferramenta de modelagem de homologia de estrutura de anticorpo interna implementada usando o Biovia Discovery Studio Environment, versão 4.5.

10.1.2 ESCOLHA DO FRAMEWORK ACEITADOR E ADAPTAÇÕES DA MESMA

[001047] A estrutura aceitadora foi escolhida conforme descrito na Tabela 10 abaixo: TABELA 10: ESTRUTURA ACEITADORA linha germinativa de região V Escolha da linha germinativa da murina mais próxima região V aceitadora humana A5B7 VH mu-IGHV7-3-02 IGHV3-23-01 ou IGHV3-15-01 A5B7 VL mu-IGKV4-72-01 IGKV3-11-01

[001048] As regiões estruturais pós-CDR3 foram adaptadas da linha germinativa do elemento J humano IGJH6 para a cadeia pesada, e uma sequência similar ao elemento J kapa IGKJ2, para a cadeia leve.

[001049] Com base em considerações estruturais, as mutações reversas da estrutura aceitadora humana para o aminoácido no ligante parental foram introduzidas nas posições 93 e 94 da cadeia pesada.

10.1.3 REGIÕES VH E VL DOS ANTICORPOS CEA HUMANIZADOS RESULTANTES

[001050] Os domínios VH resultantes de anticorpos CEA humanizados podem ser encontrados na Tabela 11 abaixo e os domínios VL resultantes de anticorpos CEA humanizados estão listados na Tabela 12 abaixo.

TABELA 11: SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DOS DOMÍNIOS VH DE ANTICORPOS CEA HUMANIZADOS, COM BASE NA ESTRUTURA ACEITADORA HUMANA IGHV3-23 OU IGHV3-15 Descrição Sequência Seq ID No A5B7 VH EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYM 178 sequência de NWVRQPPGKALEWLGF doador IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSQSILYLQM murino NTLRAEDSATYYCTR

DRGLRFYFDYWGQGTTLTVSS IGHV3-23-02 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAM 218 sequência SWVRQAPGKGLEWVSA aceitadora ISGSGGSTYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN humana SLRAEDTAVYYCAK Variantes humanizadas 3-23A5-1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYM 220

NWVRQAPGKGLEWVGF IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAEDTAVYYCAR

DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 3-23A5-2 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYM 221

NWVRQAPGKGLEWVGF IGNKANGYTTYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM

Descrição Sequência Seq ID No

NSLRAEDTAVYYCAR

DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 3-23A5-3 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYM 222

NWVRQAPGKGLEWVGF IGNKGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNS LRAEDTAVYYCARDR

GLRFYFDYWGQGTTVTVSS 3-23A5-4 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYM 223

SWVRQAPGKGLEWVGF IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAEDTAVYYCAR

DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 3-23A5-1A EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYM 224 (all_backmut NWVRQAPGKGLEWLGF ations) IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQM

NSLRAEDTATYYCTR

DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 3-23A5-1C EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYM 225 (A93T) NWVRQAPGKGLEWVGF

IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAEDTAVYYCTR

DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 3-23A5-1D EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYM 226 (K73) NWVRQAPGKGLEWVGF

Descrição Sequência Seq ID No

IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQM NSLRAEDTAVYYCAR

DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 3-23A5-1E EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYM 186 (G54A) NWVRQAPGKGLEWLGF

IGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQM NSLRAEDTATYYCTR

DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS IGHV3-15*01 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAW 219 sequência MSWVRQAPGKGLEWVGR aceitadora IKSKTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQM humana NSLKTEDTAVYYCTT Variantes humanizadas 3-15A5-1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYM 227

NWVRQAPGKGLEWVGF IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKNTLYLQM NSLKTEDTAVYYCTR

DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 3-15A5-2 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYM 228

NWVRQAPGKGLEWVGF IGNKANGYTTEYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQM NSLKTEDTAVYYCTR

Descrição Sequência Seq ID No

DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 3-15A5-3 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYM 229

NWVRQAPGKGLEWVGF IGNKANGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQM NSLKTEDTAVYYCTR DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS

[001051] Para a cadeia pesada, a variante inicial 3-23A5-1 foi considerada adequada em ensaios de ligação (mas mostrou ligeiramente menos ligação do que o anticorpo murino parental) e foi escolhida como ponto de partida para modificações adicionais. As variantes baseadas em IGHV3-15 mostraram menos atividade de ligação em comparação com a variante humanizada 3-23A5-1.

[001052] A fim de restaurar a atividade de ligação total do anticorpo quimérico parental, foram criadas as variantes 3-23A5-1A, 3- 23A5-1C e 3-23A5-1D. Também foi testado para a variante 3-23A5-1 se o comprimento de CDR-H2 poderia ser adaptado à sequência aceitadora humana, mas esse construto perdeu completamente a atividade de ligação.

Uma vez que um ponto de acesso de desamidação putativo estava presente em CDR-H2 (Asn53-Gly54), alterou-se esse motivo para Asn53- Ala54. Outro possível ponto de acesso Asn73-Ser74 foi retromutado para Lys73-Ser74. Dessa forma, a variante 3-23A5-1E foi criada.

TABELA 12: SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DOS DOMÍNIOS VL DE ANTICORPOS CEA HUMANIZADOS, COM BASE NA ESTRUTURA ACEITADORA HUMANA IGKV3-11.

Descrição Sequência Seq ID No A5B7 VL QTVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVTYIHWYQQ 179 sequência KPGSSPKSWIYAT de doador SNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYC murino QHWSSKPPTFGGG

TKLEIK IGKV3-11 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQ 230 sequência QKPGQAPRLLIYD aceitadora ASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC humana QQRSNWP Variantes humanizad as A5-L1 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQK 231

PGQAPRLLIYAT SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQ HWSSKPPTFGQG

TKLEIK A5-L2 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYIHWYQ 232

QKPGQAPRLLIYA TSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC QHWSSKPPTFGQ GTKLEIK

Descrição Sequência Seq ID No A5-L3 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQK 233

PGQAPRLLIYDA SNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQ HWSSKPPTFGQG

TKLEIK A5-L4 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQK 234

PGQAPRLLIYAT SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQ QWSSKPPTFGQG

TKLEIK A5-L1A QTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQ 235 (all_backm KPGSSPKSWIYAT utations) SNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQ

HWSSKPPTFGQG

TKLEIK A5-L1B QTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQ 236 (Q1T2) KPGQAPRLLIYAT

SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQ HWSSKPPTFGQG

TKLEIK A5-L1C EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQK 237 (FR2) PGSSPKSWIYAT

SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQ HWSSKPPTFGQG

Descrição Sequência Seq ID No

TKLEIK A5-L1D EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQK 187 (46,47) PGQAPRSWIYAT

SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQ HWSSKPPTFGQG TKLEIK

[001053] A cadeia leve foi humanizada com base na estrutura aceitadora IGKV3-11 humana. Na série A5-L1 a A5-L4, aprendeu-se que a variante A5-L1 mostra boa atividade de ligação (mas ligeiramente menos do que o anticorpo parental). A humanização parcial de CDR-L1 (variante A5-L2; posições Kabat 30 e 31) anula totalmente a ligação. Da mesma forma, a humanização de CDR-H2 (variante A5-L3; posições Kabat 50 a 56) também anula totalmente a ligação. A posição 90 (variante A5-L4) mostra uma contribuição significativa para as propriedades de ligação. A histidina nessa posição é importante para a ligação. Dessa forma, a variante A5-L1 foi escolhida para modificações adicionais.

[001054] A série A5-L1A a A5-L1D abordou a questão de quais retromutações são necessárias para restaurar o potencial de ligação total do anticorpo quimérico parental. A variante A5-L1A mostrou que as retromutações nas posições 1, 2 de Kabat, em toda a estrutura 2 e na posição 71 de Kabat não adicionam nenhuma atividade de ligação adicional. As variantes A5-L1B e A5-L1C endereçaram subconjuntos dessas posições e confirmam que não alteram as propriedades de ligação. A variante A5-L1D com retromutações nas posições 46 e 47 de Kabat mostrou a melhor atividade de ligação.

10.1.4 SELEÇÃO DE ANTICORPOS A5B7 HUMANIZADOS

[001055] Com base nas novas variantes de humanização de VH e VL, novos anticorpos CEA foram expressos como anticorpos huIgG1 com um efetor Fc silencioso (P329G; L234, L235A) para anular a ligação a receptores Fc de acordo com o método descrito no documento WO 2012/130831 A1 e sua ligação para CEA expresso em células MKN45 foi testado e comparado com o respectivo anticorpo A5B7 murino parental.

TABELA 13: COMBINAÇÕES DE VH/VL EXPRESSAS COMO ANTICORPOS HUIGG1_LALA_PG A5-L1A A5-L1B A5-L1C A5-L1D 3-23A5-1A P1AE2164 P1AE2165 P1AE2166 P1AE2167 3-23A5-1C - - P1AE2176 P1AE2177 3-23A5-1D P1AE2179 - P1AE2181 P1AE2182

[001056] MKN45 (DSMZ ACC 409) é uma linha de células de adenocarcinoma gástrico humano que expressa CEA. As células foram cultivadas em RPMI avançado + FCS a 2% + Glutamax a 1%. A viabilidade das células MKN-45 foi verificada e as células foram ressuspensas e ajustadas a uma densidade de 1 Mio células/ml. 100 µl dessa suspensão de células (contendo 0,1 Mio células) foram semeados em uma placa de fundo redondo de 96 poços. A placa foi centrifugada durante 4 min a 400xg e o sobrenadante foi removido. Em seguida, 40 µl dos anticorpos diluídos ou tampão FACS foram adicionados às células e incubados durante 30 min a 4 °C. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes com 150 µl de tampão FACS por poço.

Em seguida, 20 µl do anticorpo secundário específico diluído PE anti-Fc humano (109-116-170, Jackson ImmunoResearch) foram adicionados às células. As células foram incubadas durante 30 minutos adicionais a 4 °C. Para remover o anticorpo não ligado, as células foram lavadas novamente duas vezes com 150 µl de tampão FACS por poço. Para fixar as células, 100 µl de tampão FACS contendo PFA a 1% foram adicionados aos poços. Antes da medição, as células foram ressuspensas em 150 µl de tampão FACS. A fluorescência foi medida com o uso de um citômetro de fluxo BD.

[001057] Na Figura 18, curvas de ligação das variantes A5B7 humanizadas são mostradas. Todos os ligantes testados foram capazes de se ligar a células MKN45, mas a capacidade de ligação foi ligeiramente reduzida em comparação com o anticorpo A5B7 parental. O clone P1AE2167 teve a melhor ligação de todas as variantes testadas e foi selecionado para desenvolvimento posterior.

10.1.5 DETERMINAÇÃO DE AFINIDADES DE FRAGMENTOS FAB DE VARIANTES HUMANIZADAS DE CEA-ANTICORPO A5B7 MURINO PARA CEA HUMANO USANDO RESSONÂNCIA PLASMÔNICA DE SUPERFÍCIE (BIACORE)

[001058] As afinidades dos fragmentos Fab das variantes humanizadas do anticorpo A5B7 do CEA murino para o CEA humano foram avaliadas por ressonância plasmônica de superfície com o uso de um instrumento BIACORE T200. Em um chip CM5, CEA humano (hu N (A2-B2) A- avi-His B) foi imobilizado a uma concentração de 40 nM por acoplamento de amina padrão na célula de fluxo 2 por 30s a cerca de 100 RU. Os fragmentos Fab das variantes humanizadas do anticorpo A5B7 de CEA murino foram subsequentemente injetados como analitos em diluições de 3 vezes variando de 500-0,656 nM por um tempo de contato de 120 s, um tempo de dissociação de 250 ou 1000 s e a uma taxa de fluxo de 30 µl/min. A regeneração ao nível de CEA humano (hu N (A2-B2) A-avi-His B) foi alcançada por 2 pulsos de glicina 10 mM/HCl pH 2,0 por 60 s. Os dados foram duplamente referenciados contra a célula de fluxo desimobilizada 1 e uma concentração zero do analito.

Os sensorgramas dos analitos foram ajustados a um modelo de interação Langmuir 1:1 simples. A constante de afinidade [KD] para CCEA humano (domínio A2) está resumida na Tabela 14 abaixo.

TABELA 14: CONSTANTES DE AFINIDADE DE FRAGMENTOS FAB QUE REPRESENTAM DIFERENTES VARIANTES HUMANIZADAS DE ANTICORPO A5B7 DE CEA MURINO PARA CEA HUMANO (DOMÍNIO A2) Afinidade com N(A2- ID de Tapir Nome B2)A-avi-His B humano [M] P1AE0289 CEA (A5B7) Fab (anticorpo murino parental) 5,59 E-10 P1AE4135 Fab derivado de P1AE2164 1,70 E-09 P1AE4136 Fab derivado de P1AE2165 1,25 E-09 P1AE4137 Fab derivado de P1AE2166 1,13 E-08 P1AE4138 Fab derivado de P1AE2167 1,47 E-09 P1AE4139 Fab derivado de P1AE2176 7,58 E-09 P1AE4140 Fab derivado de P1AE2177 7,62 E-09 P1AE4141 Fab derivado de P1AE2179 1,83 E-09 P1AE4142 Fab derivado de P1AE2181 2,64 E-09 P1AE4143 Fab derivado de P1AE2182 2,92 E-09

[001059] As variantes humanizadas do anticorpo CEA murino A5B7 são de afinidades mais baixas do que o anticorpo murino parental. O fragmento Fab P1AE4138, derivado de P1AE2167 (cadeia pesada com variante VH 3-23A5-1A e cadeia leve Ckappa com variante VL A5-L1D) foi escolhido como variante humanizada final. Além disso, uma mutação de glicina para alanina na posição Kabat 54 (G54A) foi introduzida no domínio VH a fim de remover um sítio de desamidação, levando à variante VL 3-23A5-1E. O anticorpo humanizado final (cadeia pesada com VH variante 3-23A5-1E e cadeia leve Ckappa com VL variante A5-L1D) foi denominado A5H1EL1D ou huA5B7.

10.2 GERAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-CEA AMADURECIDOS POR AFINIDADE DERIVADOS DE A5H1EL1D

10.2.1 PREPARAÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ANTÍGENOS PARA

CAMPANHA DE EXIBIÇÃO DE FAGO

[001060] O anticorpo murino A5B7 e seu derivado humanizado A5H1EL1D ligam-se ao domínio A2 de CEACAM5 (CEA) com uma afinidade de cerca de 0,8 e cerca de 2,5 nM, respectivamente. Para a geração de variantes maturadas por afinidade de A5H1EL1D por exibição de fago, foram gerados 3 antígenos solúveis recombinantes diferentes. Cada proteína continha uma tag avi C-terminal para biotinilação sítio-específica e uma his-tag para purificação: A primeira proteína consistia na parte extracelular de CEACAM1 consistindo nos 4 domínios similares a Ig N, A1, B, A2 (NABA-avi- His, SEQ ID NO: 238, Tabela 15). A segunda proteína era uma proteína quimérica consistindo em 2 domínios CEACAM5 e 2 CEACAM1 Ig. Com base na sequência dos quatro domínios de CEACAM1, o DNA que codifica o segundo e terceiro domínio de CEACAM1 (domínios A1 e B) foi substituído pelo DNA que codifica os domínios A2 e B2 de CEACAM5 (N (A2B2) A-avi-His, SEQ ID NO: 239, Tabela 15). A terceira proteína era uma proteína quimérica consistindo em 1 domínio CEACAM5 e 3 CEACAM1 Ig. Com base na sequência dos quatro domínios de CEACAM1, o DNA que codifica o terceiro domínio de CEACAM1 (domínio B) foi substituído pelo DNA que codifica o domínio B2 de CEACAM5 (NA (B2) A-avi-His, SEQ ID NO: 240, Tabela 15).

Uma descrição esquemática dos três construtos é mostrada nas Figuras 19A, 19B e 19C.

TABELA 15: SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DE ANTÍGENOS CEA USADOS Antígeno Sequência SEQ ID

NO NABA-avi- QLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGYSWYKG 238 His ERVDGNRQIVGYAIGT

QQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQ VIKSDLVNEEATGQF HVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAMAFTCEPETQDTT YLWWINNQSLPVSPR LQLSNGNRTLTLLSVTRNDTGPYECEIQNPVSANRSD PVTLNVTYGPDTPTI SPSDTYYRPGANLSLSCYAASNPPAQYSWLINGTFQQ STQELFIPNITVNNS GSYTCHANNSVTGCNRTTVKTIIVTELSPVVAKPQIKA SKTTVTGDKDSVNL TCSTNDTGISIRWFFKNQSLPSSERMKLSQGNITLSIN PVKREDAGTYWCEV FNPISKNQSDPIMLNVNYNALPQENLINVDLEVLFQGP GSGLNDIFEAQKIE WHEARAHHHHHH

Antígeno Sequência SEQ ID

NO N(A2B2)A- QLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGYSWYKG 239 avi-His ERVDGNRQIVGYAIGT

QQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQ VIKSDLVNEEATGQF HVYPELPKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTY LWWVNNQSLPVSPR LQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNKLSVDHSD PVILNVLYGPDDPTI SPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQ HTQELFISNITEKNS GLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSALSPVVAKPQIKA SKTTVTGDKDSVNL TCSTNDTGISIRWFFKNQSLPSSERMKLSQGNITLSIN PVKREDAGTYWCEV FNPISKNQSDPIMLNVNYNALPQENLINVDGSGLNDIF EAQKIEWHEARAHH HHHH

Antígeno Sequência SEQ ID

NO NA(B2)A- QLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGYSWYKG 240 avi-His ERVDGNRQIVGYAIGT

QQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQ VIKSDLVNEEATGQF HVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAMAFTCEPETQDTT YLWWINNQSLPVSPR LQLSNGNRTLTLLSVTRNDTGPYECEIQNPVSANRSD PVTLNVTYGPDDPTI SPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQ HTQELFISNITEKNS GLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSALSPVVAKPQIKA SKTTVTGDKDSVNL TCSTNDTGISIRWFFKNQSLPSSERMKLSQGNITLSIN PVKREDAGTYWCEV FNPISKNQSDPIMLNVNYNALPQENLINVDGSGLNDIF EAQKIEWHEARAHH HHHH

[001061] Os respectivos plasmídeos foram transfectados transitoriamente em células HEK 293, expressando de forma estável a proteína EBNA derivada de EBV (HEK EBNA). Um plasmídeo co-transfectado simultaneamente que codifica a biotina ligase BirA permitiu a biotinilação específica de tag avi in vivo. As proteínas foram purificadas a partir de sobrenadantes de cultura de células filtradas, referindo-se a protocolos padrão, com o uso de cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC)

seguida de filtração em gel. As frações de proteína monomérica foram reunidas, concentradas (se necessário), congeladas e armazenadas a -80 °C.

Parte das amostras foram fornecidas para análises de proteínas subsequentes e caracterização analítica, por exemplo, por SDS-PAGE, cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) ou espectrometria de massa.

10.2.2 SELEÇÃO DE ANTICORPOS DERIVADOS DE A5H1EL1D MATURADOS POR

AFINIDADE

[001062] A humanização do anticorpo A5B7 resultou em uma redução de cerca de 3 a 4 vezes da afinidade para CEA medida por SPR.

Enquanto a afinidade para A5B7 foi de cerca de 0,8 nM, uma afinidade de cerca de 2,5 nM foi medida para A5H1EL1D. Os experimentos de FACS com o uso de linhas celulares com diferentes níveis de expressão de CEA confirmaram essa constatação. A fim de melhorar a afinidade do clone humanizado A5H1EL1D, 3 diferentes bibliotecas de afinidade-maturação foram feitas e usadas para a seleção de clones com afinidades melhoradas por exibição de fago.

10.2.2.1 GERAÇÃO DE BIBLIOTECAS DE MATURAÇÃO DE AFINIDADE A5H1EL1D

[001063] A geração de anticorpos derivados de A5H1EL1D maturados por afinidade foi realizada por exibição de fago com o uso de protocolos padrão (Silacci et al, 2005). Em uma primeira etapa, as sequências de DNA que codificam para VH e VL do clone parental humanizado A5H1EL1D (sequências de aminoácidos SEQ ID Nos: 186 e 187) foram clonadas em um fagomídeo que foi, então, usado como um modelo para randomização. Em uma próxima etapa, três bibliotecas foram geradas para a seleção de clones favoráveis por exibição de fago. As bibliotecas de maturação 1 e 2 foram randomizadas em CDR1 e CDR2 da cadeia pesada ou em CDR1 e CDR2 da cadeia leve. A terceira biblioteca de maturação foi randomizada nas regiões CDR3 de ambas as cadeias pesada e leve. As posições aleatórias nas respectivas regiões CDR são mostradas nas Figuras 20A e 20B. Para a geração da biblioteca de maturação 1, randomizada em CDR1 e 2 da cadeia pesada, dois fragmentos foram montados por “splicing por sobreposição de extensão” (SOE) PCR e clonados no vetor de fago (Figura 21A). As seguintes combinações de primer foram usadas para gerar os fragmentos da biblioteca: fragmento 1 (LMB3 (SEQ ID NO: 243, Tabela 16) e A5H1EL1D_H1_rev_TN (SEQ ID NO: 241, Tabela 16) e fragmento 2 (A5H1EL1D_H2_for_TN (SEQ ID NO: 242, Tabela 7) e HCDR3-rev-constant (SEQ ID NO: 244, Tabela 16).

TABELA 16: PRIMERS PARA BIBLIOTECA DE MATURAÇÃO DE AFINIDADE A5H1EL1D H1/H2 Nome Sequência SEQ ID NO: A5H1EL1D CAG CCA CTC GAG GCC TTT ACC CGG 241 _H1_rev_TN TGC TTG GCG TAC CCA X17 CAT X16 X15 X14 X13 GAA X12 GAA GCC AGA AGC

CGC GCA GCT GAG ACG X12: 60% T; 5% A/S/G/Y/N/D/E/Q X13: 50% T; 20% S; 4.3% A/G/Y/N/D/E/Q X14: 50% D; 20% S; 4.3% G/Y/T/N/A/E/Q X15: 60% Y; 4% G/V/H/S/E/Q/N/D/R/F X16: 50% Y; 20% A; 3.75% G/V/T/H/L/I/R/F X17: 50% N; 20% S; 3% D/E/Q/G/Y/V/T/H/A/L

Nome Sequência SEQ ID NO: A5H1EL1D CGC CAA GCA CCG GGT AAA GGC CTC 242 _H2_para_TN GAG TGG CTG GGT X18 ATC X19 X20 X21 X22 X23 GCG TAC ACC ACG GAA TAC

TCC GCC TCC X18: 60% F; 10% A; 6 % Y/V/L/I/G X19: 50% G; 20% S; 3% A/K/T/V/N/D/E/Q/L/I X20: 50% N; 20% G; 3.75 % D/E/Q/S/Y/T/H/A X21: 60% K; 5% A/T/Y/N/D/E/Q/R X22: 60% A; 4% V/G/D/P/H/N/E/Q/L/I X23: 60% N; 5% D/E/Q; 4.17% G/T/H/S/A/R LMB3 longo CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG ATT AC 243 HCDR3-rev- AAC GGT CAC CGT GGT ACC CTG GCC 244 constant CCA GTA GTC GAA ATA GAA GCG CAG

ACC AC

[001064] Para a geração da biblioteca de maturação 2, randomizada em CDR1 e 2 da cadeia leve, dois fragmentos foram montados por “splicing por sobreposição de extensão” (SOE) PCR e clonados no vetor de fago (Figura 21B). As seguintes combinações de primer foram usadas para gerar os fragmentos da biblioteca: fragmento 1 (LMB3 (SEQ ID NO: 243, Tabela 17) e A5H1EL1D_L1_rev_TN (SEQ ID NO: 245, Tabela 17) e fragmento 2 (A5H1EL1D_L2_for_TN (SEQ ID NO: 246, Tabela 17) e HCDR3-rev-constant (SEQ ID NO: 244, Tabela 17).

TABELA 17: PRIMERS PARA BIBLIOTECA DE MATURAÇÃO DE AFINIDADE A5H1EL1D L1/L2 Nome Sequência SEQ ID NO: A5H1EL1D GGA ACG CGG GGC CTG GCC TGG TTT 245 _L1_rev_TN TTG CTG ATA CCA X06 X05 X04 X03 X02 X01 GCT GGA TGC GCG GCA AGA CAG

GGT AGC ACG X01: 50% S; 20% V; 3,33% T/A/G/N/D/E/Q/Y/H X02: 50% V; 20% S; 3,33% T/A/G/N/Q/F/Y/P/H X03: 50% T; 20% S; 2,72% A/G/Y/V/P/H/N/D/E/Q/R X04: 60% Y; 4% F/G/A/V/T/H/S/N/Q/R X05: 70% I; 30% L X06: 50% H; 20% A; 3,33% R/K/G/S/T/Q/Y/N/V

Nome Sequência SEQ ID NO: A5H1EL1D CAG CAA AAA CCA GGC CAG GCC CCG 246 _L2_for_TN CGT TCC TGG ATC X07 X08 X09 X10 X11 CTC GCT TCT GGT ATC CCG GCA

CGT TTC TCC GGC X07: 60% Y; 10% F; 7,5% H/K/N/S X08: 50% A; 20% D; 3,33% V/G/S/T/Y/H/N/E/Q X09: 50% T; 20% A; 3,33% S/G/V/P/H/N/D/E/Q X10: 60% S; 4% T/A/G/N/D/E/Q/Y/V/H X11: 60% N; 4% D/E/Q/Y/K/T/H/S/A/R LMB3 longo CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG ATT 243

AC HCDR3-rev- AAC GGT CAC CGT GGT ACC CTG GCC 244 constant CCA GTA GTC GAA ATA GAA GCG CAG

ACC AC

[001065] Para a geração da biblioteca de maturação 3, randomizada em CDR3 das cadeias leve e pesada, dois fragmentos foram montados por PCR de “splicing por sobreposição de extensão” (SOE) e clonados no vetor de fago (Figura 21C). As seguintes combinações de primer foram usadas para gerar os fragmentos da biblioteca: fragmento 1 (LMB3 (SEQ ID NO: 243, Tabela 18) e LCDR3-rev-constant (SEQ ID NO: 249, Tabela 18) e fragmento 2 (A5H1EL1D_L3_for_TN (SEQ ID NO: 247, Tabela 18) e A5H1EL1D_H3_rev_TN (SEQ ID NO: 248, Tabela 18).

TABELA 18: PRIMERS PARA BIBLIOTECA DE MATURAÇÃO DE AFINIDADE A5H1EL1D L3/H3 Nome Sequência SEQ ID NO: A5H1EL1D GAG CCT GAA GAT TTT GCC GTA 247 _L3_para_TN TAC TAT TGT X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 ACT TTC GGT CAG GGC

ACC AAG CTG GAA ATC X24: 90% Q; 10% H X25: 60% H; 5% R/K/Q/E/Y/F/N/D X26: 65% W; 7% F/Y/V/L/I X27: 58% S; 4% T/A/G/N/D/E/Q; 2% Y/V/P/H/L/I/R X28: 58% S; 4% T/A/G/N/D/E/Q; 2% Y/V/P/H/L/I/R X29: 60% K; 5% R/H; 2,72% A/V/T/P/Y/N/D/E/Q/L/I X30: 70% P; 5% A/S/T/R/S/L X31: 60% P; 5% L/G/R/M; 2,86% A/V/L/I/F/S/R

Nome Sequência SEQ ID NO: A5H1EL1D AAC GGT CAC CGT GGT ACC CTG 248 _H3_rev_TN GCC CCA GTA GTC X40 X39 X38 X37 X36 X35 X34 X33 X32 AGT ACA GTA

GTA GGT GGC GGT GTC TTC TGC X32: 60% R; 10% K; 2,72% A/V/T/P/Y/N/D/E/Q/L/H X33: 60% D; 5% N/E/Q; 2,5% G/Y/V/T/H/S/A/L/I/R X34: 60% R; 5% K/H; 2,72% A/V/T/P/Y/N/D/E/Q/L/I X35: 60% G; 5% A/S/T; 2,5% Y/V/P/H/N/D/E/Q/L/I X36: 60% L; 4% I/V/A/F; 2,4% G/Y/T/P/H/S/N/D/E/Q X37: 60% R; 5% K/H; 2,72% A/V/T/P/Y/N/D/E/Q/L/I X38: 65% F; 5% Y/W/A/V/L/I/G X39: 60% Y; 5% F/W; 2.14% G/A/V/T/P/H/S/N/D/E/Q/L/I/R X40: 80% F; 10% I/L LCDR3-rev- ACA ATA GTA TAC GGC AAA ATC TTC 249 constante AGG CTC LMB3 longo CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG 243

ATT AC

Nome Sequência SEQ ID NO: amplificação de AGA AAC GGT CAC CGT GGT ACC 250 HCDR3 CTG GCC CCA GTA GTC

[001066] Para a montagem dos fragmentos de cada biblioteca, quantidades equimolares de cada fragmento foram utilizadas e amplificadas com os respectivos primers externos. Para a montagem dos fragmentos da terceira biblioteca, randomizados em HCDR3 e LCDR3, o primer LMB3 (SEQ ID NO: 243, Tabela 18) foi usado em combinação com o primer “amplificação de HCDR3” (SEQ ID NO: 250, Tabela 18). Esse primer foi usado a fim de estender a extremidade C-terminal de VH com a sequência contendo um sítio KpnI. Após a montagem de quantidades suficientes de fragmentos aleatórios de comprimento total para todas as bibliotecas, os mesmos foram digeridos com NcoI/KpnI juntamente com o vetor fagomídeo aceitador tratado de forma idêntica. Um excesso molar de 3 vezes de inserção da biblioteca foi ligado com 20 µg de vetor fagomídeo. Ligações purificadas foram usadas para 20 transformações resultando em cerca de 0,7 x 109 a 2 x 109 transformantes. Partículas de fagomídeo exibindo as bibliotecas de maturação de afinidade A5H1EL1D foram resgatadas e purificadas por purificação de PEG/NaCl para serem usadas para seleções.

10.2.2.2 SELEÇÃO DE CLONES DERIVADOS DE A5H1EL1D AMADURECIDOS POR

AFINIDADE

[001067] Para a seleção de clones maturados por afinidade, a seleção de exibição de fago com todas as 3 bibliotecas foi realizada com o uso de antígenos solúveis recombinantes. Rodadas de panning foram realizadas em solução de acordo com o seguinte padrão: 1. Pré-limpeza de partículas de fagomídeo não específicas por incubação com NA(B2)A-avi-His biotinilado 200 nM e NABA-avi-his por 0,5 h, 2. captura de NA(B2)A-avi-His biotinilado, NABA-

avi-his, e partículas de fagomídeo ligadas por adição de 5,4 x 107 microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina por 10 min, 3. Isolamento de partículas de fagomídeo não ligadas do sobrenadante para seleção posterior,

4. ligação de partículas de fagomídeo a N(A2B2)A-avi-His biotinilado 20 nM por 0,5 h em um volume total de 1 ml, 5. captura de proteína N(A2B2)A-avis-His biotinilada e partículas de fago especificamente ligadas por adição de 5,4 x 107 microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina por 10 min, 6. lavagem de grânulos usando 5 x 1 ml de PBS/Tween20 e 5 x 1 ml de PBS, 7. eluição de partículas de fago pela adição de 1 ml de TEA 100 mM por 10 min e neutralização pela adição de 500 l de Tris/HCl 1 M pH 7,4, 8. infecção de bactérias E. coli TG1 em crescimento exponencial, 9. infecção com helperfago VCSM13, e 10. precipitação subsequente de PEG/NaCl de partículas de fagomídeo a serem usadas em rodadas de seleção subsequentes. As seleções foram realizadas ao longo de 3 rodadas com o uso de concentrações decrescentes de antígeno (20 x 10-9 M, 10 x 10-9 M, e 2 x 10-9 M). Na rodada 3, as microesferas de estreptavidina foram lavadas com 20 x 1 ml de PBS/Tween 20 e 5 x 1 ml de PBS.

[001068] Ligantes específicos foram identificados por ELISA da seguinte forma: 100 l de proteína N(A2B2)A-avi-His biotinilada 10 nM ou proteína NA(B2)A-avi-His biotinilada 40 nM por poço foram revestidos em placas de neutravidina. Os sobrenadantes bacterianos contendo Fab foram adicionados e os Fabs de ligação foram detectados por meio de seus marcadores Flag com o uso de um anticorpo secundário anti-Flag/HRP. Os clones que eram ELISA positivos na proteína N(A2B2)A-avi-His recombinante, mas não na proteína NA(B2)A-avi-His foram testados adicionalmente por SPR.

10.2.2.3 IDENTIFICAÇÃO DE VARIANTES DERIVADAS DE A5H1EL1D MATURADAS

POR AFINIDADE POR SPR

[001069] A fim de caracterizar ainda mais os clones positivos para ELISA, a taxa de eliminação foi medida por ressonância plasmônica de superfície com o uso de uma máquina Proteon XPR36 e os resultados foram comparados com o clone humanizado parental A5H1EL1D.

[001070] Para esse experimento, cerca de 2000, 1000 e 500 RU de N(A2B2)A-avi-His biotinilada foram imobilizadas em 3 canais com o uso de um chip NLC revestido com estreptavidina na orientação vertical. Como um controle para a ligação não específica, 2000 RU de proteína NA(B2)A-avi-His biotinilada foi imobilizada no canal 4. Para a análise da taxa de dissociação dos clones ELISA positivos identificados, a direção da injeção foi alterada para a orientação horizontal. Antes da injeção, cada sobrenadante bacteriano contendo Fab foi filtrado e diluído 3 vezes com PBS. O tempo de associação foi de 100 s a 100 l/minuto e os tempos de dissociação foram de 600 ou 1200 s.

O sobrenadante bacteriano sem fragmento Fab foi usado para referência. A regeneração foi realizada com glicina 10 mM pH 1,5 por 35s a 50 l/min (orientação vertical).

[001071] As constantes de taxa de dissociação (koff) foram calculadas com o uso de um modelo de ligação Langmuir simples um-para-um no software ProteOn Manager v3.1 por meio do ajuste simultâneo dos sensorgramas. Os clones que expressam Fabs com as constantes de taxa de dissociação mais lentas foram identificados e selecionados. Os clones selecionados foram reavaliados em experimentos SPR adicionais nas mesmas condições. Dessa vez, durante cada injeção, 4 clones maturados por afinidade foram comparados diretamente em paralelo com o clone parental A5H1EL1D.

O sobrenadante bacteriano sem fragmento Fab foi usado para referência. Os clones que mostraram uma taxa de dissociação mais lenta do que A5H1EL1D em N(A2B2)A-avi-His e nenhuma ligação a NA(B2)A-avi-His foram selecionados e os domínios variáveis dos fagomídeos correspondentes foram sequenciados. As taxas de dissociação medidas dos melhores clones são mostradas na Tabela 19 e as sequências dos respectivos domínios variáveis são listadas na Tabela 20.

TABELA 19: CONSTANTES DE DISSOCIAÇÃO CINÉTICA (KOFF) DE CLONES

SELECIONADOS OBTIDOS NA ANÁLISE DE TRIAGEM COM SOBRENADANTE

BACTERIANO clone Constante de dissociação kd (1/s) A5H1EL1D 3,10E-04 P006.038 7,41E-05 P005.097 8,87E-05 P005.103 5,37E-05 P002.139 6,47E-05 P001.177 9,81E-05 P005.102 4,24E-05 TABELA 20: SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DO CLONE PARENTAL A5H1EL1D E

CLONES AMADURECIDOS POR AFINIDADE SELECIONADOS Clone Cadei SEQ ID Sequência a NO A5H1EL1D VL 187 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSV

TYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC

QHWSSKPPTFGQGTKLEIK VH 186 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT

FTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKA NAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQ MNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYW GQGTTVTVSS

Clone Cadei SEQ ID Sequência a NO P006.038 VL 195 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSV

TYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC

QHWSSVPPTFGQGTKLEIK VH 194 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT

FTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKA NAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQ MNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWG

QGTTVTVSS P005.097 VL 197 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSV

TYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC

QHWSSQPPTFGQGTKLEIK VH 196 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT

FTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKA NAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQ MNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFSFDYW

GQGTTVTVSS P005.103 VL 199 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSV

TYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC QHWSSISPTFGQGTKLEIK

Clone Cadei SEQ ID Sequência a NO VH 198 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT

FTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKA NAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQ MNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFYFDYWG

QGTTVTVSS P002.139 VL 201 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASSSV

TYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC

QHWSSKPPTFGQGTKLEIK VH 200 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFY

FTDYAMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKA NAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQ MNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYW

GQGTTVTVSS P001.177 VL 203 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSV

TYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC

QHWSSKPPTFGQGTKLEIK VH 202 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFY

FTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFISNKA NAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQ MNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYW GQGTTVTVSS

Clone Cadei SEQ ID Sequência a NO P005.102 VL 205 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSV

TYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC

QHWSSKSPTFGQGTKLEIK VH 204 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT

FTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKA NAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQ MNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWG

QGTTVTVSS P005.102- VL 207 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSV combo1 TYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIP

ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC

QHWSSKSPTFGQGTKLEIK VH 206 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFY

FTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKA NAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQ MNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWG

QGTTVTVSS P005.102- VL 209 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSV combo2 TYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIP

ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC QHWSSKSPTFGQGTKLEIK

Clone Cadei SEQ ID Sequência a NO VH 208 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFY

FSDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKA NAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQ MNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWG

QGTTVTVSS P005.103- VL 211 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSV combo1 TYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIP

ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC

QHWSSISPTFGQGTKLEIK VH 210 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT

FTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKA NAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQ MNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFSFDYWG

QGTTVTVSS P005.103- VL 213 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSV combo2 TYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIP

ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC

QHWSSISPTFGQGTKLEIK VH 212 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFY

FTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKA NAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQ MNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFSFDYWG QGTTVTVSS

Clone Cadei SEQ ID Sequência a NO P006.038- VL 215 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSV combo1 TYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIP

ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC

QHWSSVPPTFGQGTKLEIK VH 214 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFY

FTDYAMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKA NAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQ MNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWG

QGTTVTVSS P006.038- VL 217 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSV combo2 TYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIP

ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC

QHWSSVPPTFGQGTKLEIK VH 216 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT

FSDYEMNWVRQAPGKGLEWLGFISNKA NAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQ MNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWG QGTTVTVSS

10.2.2.4 PURIFICAÇÃO DE FAB DE CLONES A5H1EL1D MATURADOS POR AFINIDADE

[001072] A fim de caracterizar ainda mais os clones maturados por afinidade, os respectivos fragmentos Fab foram purificados para a análise exata dos parâmetros cinéticos. Para cada clone, uma cultura de 500 ml foi inoculada com bactérias portadoras do fagomídeo correspondente e induzida com IPTG 1 mM a uma densidade óptica medida a 600 nm (OD600)

de 0,9. Posteriormente, as culturas foram incubadas a 25 °C de um dia para o outro e colhidas por centrifugação. Após incubação do sedimento ressuspenso por 20 min em 25 ml de tampão PPB (Tris-HCl 30 mM pH 8, EDTA 1 mM, sacarose a 20%), as bactérias foram centrifugadas novamente e o sobrenadante foi colhido. Essa etapa de incubação foi repetida uma vez com 25 ml de uma solução de MgSO4 5 mM. Os sobrenadantes de ambas as etapas de incubação foram reunidos, filtrados e carregados em uma coluna IMAC (His gravitrap, GE Healthcare). Subsequentemente, a coluna foi lavada com 40 ml de tampão de lavagem (NaCl 500 mM, Imidazol 20 mM, NaH2PO4 20 mM pH 7,4). Após a eluição (NaCl 500 mM, Imidazol 500 mM, NaH2PO4 20 mM pH 7,4) o eluato foi tamponado novamente com o uso de colunas PD10 (GE Healthcare). O rendimento da proteína purificada estava na faixa de 300 a 500 g/l.

10.2.2.5 ANÁLISE SPR DE FRAGMENTOS FAB A5H1EL1D MATURADOS POR

AFINIDADE PURIFICADOS

[001073] A afinidade (KD) de fragmentos Fab purificados foi medida por ressonância plasmônica de superfície com o uso de uma máquina Proteon XPR36 com o uso da mesma configuração descrita antes.

[001074] Cerca de 2000, 1000, 500 e 250 RU de N(A2B2)A- avi-His biotinilada foram imobilizados em 4 canais de um chip NLC revestido com estreptavidina na orientação vertical. Como um controle para a ligação não específica, 2000 RU de proteína NA(B2)A-avi-His biotinilada foi imobilizada no canal 5. Para a determinação da afinidade (KD) dos clones purificados, a direção da injeção foi alterada para horizontal. Uma série de diluição dupla de fragmentos Fab purificados (variando os intervalos de concentração entre 100 e 3 nM) foram injetados simultaneamente a 100 l/min ao longo de canais separados 1-5, com tempos de associação de 100 s e tempos de dissociação de 1200 s. O tampão (PBST) foi injetado ao longo do sexto canal para fornecer um espaço em branco “em linha” para referência. A regeneração foi realizada com glicina 10 mM pH 1,5 por 35s a 50 l/min (orientação vertical).

[001075] As constantes de taxa de associação (kon) e as constantes de taxa de dissociação (koff) foram calculadas com o uso de um modelo de ligação Langmuir simples um-para-um no software ProteOn Manager v3.1, ajustando simultaneamente os sensorgramas de associação e dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação (KD) é calculada como a razão koff/kon. Os dados cinéticos e termodinâmicos estão listados na Tabela

21.

TABELA 21: DETERMINAÇÃO DE PARÂMETROS CINÉTICOS E TERMODINÂMICOS DE

FRAGMENTOS FAB PURIFICADOS POR SPR ID do clone k on (1/Ms) k off (1/s) KD (nM) A5H1EL1D 1,08E+5 2,48E-4 2,3 P006.038 2,25E+5 5,78E-5 0,25 P005.097 0,94E+5 8,54E-5 0,91 P005.103 1,00E+5 4,99E-5 0,5 P002.139 1,05E+5 6,53E-5 0,63 P001.177 2,67E+5 7,85E-4 0,29 P005.102 1,34E+5 3,92E-4 0,29

10.2.2.6 COMBINAÇÃO DE POSIÇÕES DE CDR DE CLONES MATURADOS POR

AFINIDADE

[001076] Em uma tentativa de aumentar ainda mais a afinidade para o CEA, as posições de CDR de vários ligantes maturados por afinidade previamente identificados foram combinadas entre si. Isso inclui não apenas posições específicas dentro de uma CDR, mas também combinações de CDRs de diferentes ligantes. Um alinhamento de todos os clones, derivados de exibição de fago e clones combinatórios, é mostrado nas Figuras 22A e 22B. As CDRs de todas as cadeias pesadas e cadeias leves estão listadas na Tabela 22 e 23, respectivamente. Os domínios VH e VL são resumidos na

Tabela 20.

TABELA 22: SEQUÊNCIAS DE CDR DE CADEIAS PESADAS MATURADAS POR

AFINIDADE Clone SEQ CDR-H1 SEQ CDR-H2 SEQ CDR-H3

ID NO ID NO ID NO A5H1EL1D 180 GFTFTDYYMN 181 FIGNKANAYTTEYSASVKG 182 DRGLRFYFDY P006.038 251 GFTFTDYYMN 252 FIGNKANAYTTEYSASVKG 253 DRGIRFGFDY P005.097 257 GFTFTDYYMN 258 FIGNKANAYTTEYSASVKG 259 DRGLRFSFDY P005.103 263 GFTFTDYYMN 264 FIGNKANAYTTEYSASVKG 265 DRGIRFYFDY P002.139 269 GFYFTDYAMN 270 VISNKANAYTTEYSASVKG 271 DRGLRFYFDY P001.177 275 GFYFTDYYMN 276 FISNKANAYTTEYSASVKG 277 DRGLRFYFDY P005.102 281 GFTFTDYYMN 282 FIGNKANAYTTEYSASVKG 283 DRGIRFQFDY P005.102- 287 GFYFTDYYMN 288 VISNKANAYTTEYSASVKG 289 DRGIRFQFDY combo1 P005.102- 293 GFYFSDYYMN 294 VISNKANAYTTEYSASVKG 295 DRGIRFQFDY combo2 P005.103- 299 GFTFTDYYMN 300 FIGNKANAYTTEYSASVKG 301 DRGIRFSFDY combo1 P005.103- 305 GFYFTDYYMN 306 VISNKANAYTTEYSASVKG 307 DRGIRFSFDY combo2 P006.038- 311 GFYFTDYAMN 312 VISNKANAYTTEYSASVKG 313 DRGIRFGFDY combo1 P006.038- 317 GFTFSDYEMN 318 FISNKANAYTTEYSASVKG 319 DRGIRFGFDY combo2 TABELA 23: SEQUÊNCIAS DE CDR DE CADEIAS LEVES MATURADAS POR AFINIDADE Clone SEQ ID CDR-L1 SEQ ID CDR-L2 SEQ ID CDR-L3

NO NO NO A5H1EL1D 183 RASSSVTYIH 184 ATSNLAS 185 QHWSSKPPT P006.038 254 RASSSVTYIH 255 ATSNLAS 256 QHWSSVPPT P005.097 260 RASSSVTYIH 261 ATSNLAS 262 QHWSSQPPT P005.103 266 RASSSVTYIH 267 ATSNLAS 268 QHWSSISPT P002.139 272 HASSSVTYIH 273 ATSNLAS 274 QHWSSKPPT P001.177 278 RASSSVTYIH 279 ATSNLAS 280 QHWSSKPPT P005.102 284 RASSSVTYIH 285 ATSNLAS 286 QHWSSKSPT P005.102- 290 RASSSVTYIH 291 ATSNLAS 292 QHWSSKSPT combo1 P005.102- 296 RASSSVTYIH 297 ATSNLAS 298 QHWSSKSPT combo2 P005.103- 302 RASSSVTYIH 303 ATSNLAS 304 QHWSSISPT combo1 P005.103- 308 RASSSVTYIH 309 ATSNLAS 310 QHWSSISPT combo2 P006.038- 314 RASSSVTYIH 315 ATSNLAS 316 QHWSSVPPT combo1 P006.038- 320 RASSSVTYIH 321 ATSNLAS 322 QHWSSVPPT combo2

10.3 GERAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DERIVADOS DE A5H1EL1D MATURADOS POR AFINIDADE

10.3.1 CLONAGEM, PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS BIOESPECÍFICOS

[001077] Os domínios variáveis de todos os clones foram sintetizados e clonados em plasmídeos que codificam para uma molécula biespecífica IgG 1+1 com base nas mutações knob-into-hole e a tecnologia crossmab em combinação com mutações PG-LALA. A segunda porção de ligação era específica para CD28. Uma descrição esquemática das moléculas finais é desenhada na Figura 1J. As moléculas resultantes são compostas pelas sequências listadas na Tabela 24: Todas as combinações de cadeia que expressam as sequências VL e VH dos ligantes maturados por afinidade (SEQ ID NO: 323-348) foram combinadas com as duas cadeias específicas para CD28 (SEQ ID NO: 349 e 350).

[001078] Os construtos resultantes foram preparados pela Evitria com o uso de seu sistema de vetor proprietário com técnicas de clonagem convencionais (não baseadas em PCR) e com o uso de células CHO K1 adaptadas a suspensão (originalmente recebidas de ATCC e adaptadas para crescimento livre de soro em cultura em suspensão em Evitria). Para a produção, a Evitria usou seus meios proprietários sem componentes de animais e sem soro (eviGrow e eviMake2) e seu reagente de transfecção exclusivo (eviFect). As proteínas foram purificadas a partir de sobrenadantes da cultura de células filtradas, referindo-se a protocolos padrão. Em resumo, proteínas contendo Fc foram purificadas a partir de sobrenadantes de cultura de células por cromatografia de afinidade usando Proteína A. A eluição foi alcançada em pH 3,0 seguida por neutralização imediata da amostra. A proteína foi concentrada e a proteína agregada foi separada da proteína monomérica por cromatografia de exclusão de tamanho em histidina 20 mM, cloreto de sódio 140 mM, pH 6,0.

TABELA 24: SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DOS CLONES ANTI-CEA MATURADOS POR AFINIDADE SELECIONADOS EM FORMATO DE IGG1 HUMANO P326G LALA

BIESPECÍFICO Clone cadeia SEQ Sequência de polipeptídeos

ID NO 323 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYY

MNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASV KGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTR DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLA VL-

PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA CH1-

LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ IgG1

TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP Fc-

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV (hole,

DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN PG-

STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA A5H1EL LALA)

PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSL 1D

SCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL

HNHYTQKSLSLSP 324 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWY

QQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGT

DFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTK VH-Ck LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN

FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV

TKSFNRGEC VL- 325 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWY

Clone cadeia SEQ Sequência de polipeptídeos

ID NO P006.03 CH1- QQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGT 8 IgG1 DFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTK Fc- LEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV (hole, KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY PG- SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK LALA) VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK

DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSR

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 326 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYY

MNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASV

KGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTR VH-Ck DRGIRFGFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPP

SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE

KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC VL- 327 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWY CH1- QQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGT P005.09 IgG1 DFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSQPPTFGQGTK 7 Fc- LEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV (hole, KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY PG- SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK

Clone cadeia SEQ Sequência de polipeptídeos

ID NO LALA) VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSR

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 328 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYY

MNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASV

KGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTR VH-Ck DRGLRFSFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPP

SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE

KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 329 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWY

QQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGT VL- DFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKL CH1- EIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK IgG1 DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS P005.10 Fc- LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 3 (hole, EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD PG- TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE LALA) VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG

KEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTL PPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG

Clone cadeia SEQ Sequência de polipeptídeos

ID NO QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQ

QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 330 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYY

MNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASV

KGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTR VH-Ck DRGIRFYFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPP

SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE

KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 331 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASSSVTYIHWY

QQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGT

DFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTK VL- LEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV CH1- KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY IgG1 SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK Fc- VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK P002.13 (hole, DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV 9 PG- EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN LALA) GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVC

TLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSR

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 332 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYA VH-Ck

MNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASV

Clone cadeia SEQ Sequência de polipeptídeos

ID NO KGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTR DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE

KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 333 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWY

QQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGT

DFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTK VL- LEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV CH1- KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY IgG1 SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK Fc- VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK (hole, DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV PG- EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN P001.17 LALA) GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVC 7 TLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWES

NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSR

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 334 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYY

MNWVRQAPGKGLEWLGFISNKANAYTTEYSASV

KGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTR VH-Ck DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPP

SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Clone cadeia SEQ Sequência de polipeptídeos

ID NO 335 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWY

QQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGT

DFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTK VL- LEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV CH1- KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY IgG1 SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK Fc- VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK (hole, DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV PG- EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN P005.10 LALA) GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVC 2 TLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWES

NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSR

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 336 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYY

MNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASV

KGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTR VH-Ck DRGIRFQFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPP

SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE

KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC VL- 337 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWY P005.10 CH1- QQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGT 2- IgG1 DFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTK combo1 Fc- LEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV (hole, KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY

Clone cadeia SEQ Sequência de polipeptídeos

ID NO PG- SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK LALA) VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSR

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 338 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYY

MNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASV

KGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTR VH-Ck DRGIRFQFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPP

SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE

KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 339 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWY

QQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGT VL-

DFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTK CH1-

LEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV P005.10 IgG1

KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY 2- Fc-

SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK combo2 (hole,

VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK PG- DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV LALA) EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVC

Clone cadeia SEQ Sequência de polipeptídeos

ID NO TLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSR

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 340 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFSDYY

MNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASV

KGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTR VH-Ck DRGIRFQFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPP

SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE

KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 341 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWY

QQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGT

DFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKL VL- EIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK CH1- DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS IgG1 LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV P005.10 Fc- EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD 3- (hole, TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE combo1 PG- VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG LALA) KEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTL

PPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQ

QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP VH-Ck 342 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYY

Clone cadeia SEQ Sequência de polipeptídeos

ID NO MNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASV KGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTR DRGIRFSFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE

KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 343 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWY

QQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGT

DFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKL VL- EIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK CH1- DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS IgG1 LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV Fc- EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD (hole, TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE P005.10 PG- VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG 3- LALA) KEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTL combo2 PPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG

QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQ

QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 344 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYY

MNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASV

KGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTR VH-Ck

DRGIRFSFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE

Clone cadeia SEQ Sequência de polipeptídeos

ID NO

KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 345 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWY

QQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGT

DFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTK VL- LEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV CH1- KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY IgG1 SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK Fc- VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK (hole, DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV PG- EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN P006.03 LALA) GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVC 8-

TLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWES combo1

NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSR

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 346 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYA

MNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASV

KGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTR VH-Ck DRGIRFGFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPP

SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE

KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC P006.03 VL- 347 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWY 8- CH1- QQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGT combo2 IgG1 DFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTK

Clone cadeia SEQ Sequência de polipeptídeos

ID NO Fc- LEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV (hole, KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY PG- SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK LALA) VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 348 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYE

MNWVRQAPGKGLEWLGFISNKANAYTTEYSASV

KGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTR VH-Ck DRGIRFGFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPP

SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE

KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 349 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYI VH-

HWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDR CH1- CD28 ATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYG IgG1 (SA_ LDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSS Fc Variante KSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTS (knob, 15) GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC PG-

NVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LALA) AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS

Clone cadeia SEQ Sequência de polipeptídeos

ID NO HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN

HYTQKSLSLSP 350 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVFLN

WYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGS

GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGG VL-Ck TKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLL

NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC

10.3.2 DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE DE ANTICORPOS SELECIONADOS POR SPR

[001079] A afinidade (KD) do anticorpo parental A5H1EL1D, bem como seus derivados maturados por afinidade, foi medida por SPR com o uso de um instrumento ProteOn XPR36 (Biorad) a 25 °C.

[001080] Cerca de 2000, 1000, 500 e 250 RU de N(A2B2)A- avi-His biotinilada foram imobilizados em 4 canais de um chip NLC revestido com estreptavidina na orientação vertical. Como um controle para a ligação não específica, 2000 RU de proteína NA(B2)A-avi-His biotinilada foi imobilizada no canal 5. Para a determinação da afinidade (KD) dos construtos biespecíficos purificados, a direção da injeção foi alterada para a orientação horizontal. Série de diluição dupla de IgGs bi-específicos purificados (variando os intervalos de concentração entre 25 e 1,56 nM) foram injetados simultaneamente a 100 μl/min ao longo de canais separados 1-5, com tempos de associação de 180 s e tempos de dissociação de 1200 s. O tampão (PBST) foi injetado ao longo do sexto canal para fornecer um espaço em branco “em linha” para referência. A regeneração foi realizada com glicina 10 mM pH 1,5 por 20s a 50 ul/min (orientação vertical).

[001081] As constantes de taxa de associação (kon) e as constantes de taxa de dissociação (koff) foram calculadas com o uso de um modelo de ligação Langmuir simples um-para-um no software ProteOn Manager v3.1, ajustando simultaneamente os sensorgramas de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (KD) pode ser calculada como a razão koff/kon. Todos os dados cinéticos e termodinâmicos estão listados na Tabela 25. Afinidade mais alta (valores KD mais baixos) foram observados para os clones maturados por afinidade que foram identificados pela seleção de exibição de fago. Além disso, foram testadas combinações com CDRs trocados e posições de CDR. Enquanto algumas combinações (por exemplo, clones “P005.103-combo2” e “P005.102-combo1”) resultaram em taxas de desativação muito lentas e, consequentemente, afinidades muito altas, a afinidade foi significativamente reduzida em 2 clones combinatórios (clones “P006.038-combo1” e “P006.038-combo2”).

TABELA 25: DETERMINAÇÃO DE PARÂMETROS CINÉTICOS E TERMODINÂMICOS DE CONSTRUTOS CEA-CD28 BIESPECÍFICOS PURIFICADOS POR SPR ID do clone k on (1/Ms) k off (1/s) KD (nM) A5H1EL1D 1,58E+5 3,33E-4 2,11 P006.038 2,67E+5 5,87E-5 0,22 P005.097 2,69E+5 8,87E-5 0,33 P005.103 2,57E+5 1,12E-4 0,44 P002.139 2,49E+5 9,70E-5 0,39 P001.177 2,05E+5 8,83E-5 0,43 P005.102 1,60E+5 3,31E-5 0,20 P005.102-combo1 2,07E+5 1,23E-5 0,06 P005.102-combo2 2,25E+5 1,85E-5 0,08 P005.103-combo1 1,26E+5 3,42E-5 0,27

ID do clone k on (1/Ms) k off (1/s) KD (nM) P005.103-combo2 1,23E+5 1,05E-5 0,09 P006.038-combo1 1,78E+5 7,99E-5 4,48 P006.038-combo2 1,91E+5 6,98E-4 3,66 EXEMPLO 11

GERAÇÃO E PRODUÇÃO DE OUTRAS MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD28 E ANTÍGENO CARCINOEMBRIONÁRIO (CEA)

11.1 CLONAGEM DAS MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO

[001082] Para a geração dos plasmídeos de expressão, as sequências dos respectivos domínios variáveis foram usadas e subclonadas em estrutura com as respectivas regiões constantes que estão pré-inseridas no respectivo vetor de expressão de mamífero receptor. Uma descrição esquemática das moléculas resultantes é mostrada na Figura 23. No domínio Fc, as mutações Pro329Gly, Leu234Ala e Leu235Ala (PG-LALA) foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas de IgG1 humana para anular a ligação aos receptores Fc gama de acordo com o método descrito na Publicação de Pedido de Patente Internacional n° WO 2012/130831. Para a geração de anticorpos biespecíficos, os fragmentos Fc continham o “knob” (mutações S354C/T366W, numeração de acordo com o índice EU de Kabat) ou mutações “hole” (mutações Y349C/T366S/L368A/Y407V de acordo com o índice EU de Kabat) para evitar emparelhamento incorreto das cadeias pesadas. A fim de evitar o pareamento incorreto de cadeias leves nas moléculas de ligação ao antígeno biespecífico, a troca de domínios VH/VL ou CH1/Ckappa foi introduzida em uma fração de ligação (tecnologia CrossFab).

Em outra fração de ligação, as cargas foram introduzidas nos domínios CH1 e Ckappa conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente Internacional n° WO 2015/150447. A geração e preparação do clone anti-CEA T84.66 são descritas no documento WO 2016/075278 A2.

[001083] As seguintes moléculas foram clonadas, uma ilustração esquemática das mesmas é mostrada nas Figuras 23A a 23D:

[001084] Molécula 11A: CEA (A5H1EL1D)-CD28(SA) formato 1+1, molécula biespecífica de huIgG1 PG-LALA CrossFab com modificações carregadas no fragmento Fab de CD28(SA) (knob) e troca VH/VL no fragmento Fab de CEA(A5H1EL1D) (hole) (Figura 23A) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 351, 352, 353 e 354 (P1AE4773).

[001085] Molécula 11B: CEA (A5H1EL1D)- CD28(SA_Variante 8) formato 1+1, molécula biespecífica de huIgG1 PG-LALA CrossFab com modificações carregadas no fragmento Fab de CD28(SA_Variante 8) (knob) e troca VH/VL no fragmento Fab de CEA(A5H1EL1D) (hole) (Figura 23A) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 351, 352, 355 e 356 (P1AE4774).

[001086] Molécula 11C: CEA (A5H1EL1D)- CD28(SA_Variante 15) formato 1+1, molécula biespecífica de huIgG1 PG- LALA CrossFab com modificações carregadas no fragmento Fab de CD28(SA_Variante 15) (knob) e troca VH/VL no fragmento Fab de CEA(A5H1EL1D) (hole) (Figura 23A) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 351, 352, 357 e 358 (P1AE4775).

[001087] Molécula 11D: CEA (A5H1EL1D)- CD28(SA_Variante 29) formato 1+1, molécula biespecífica de huIgG1 PG- LALA CrossFab com modificações carregadas no fragmento Fab de CD28(SA_Variante 29) (knob) e troca VH/VL no fragmento Fab de CEA(A5H1EL1D) (hole) (Figura 23A) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 351, 352, 359 e 354 (P1AE4776).

[001088] Molécula 11E: CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA) formato 1+1, moléculas crossFab huIgG1 PG-LALA biespecífica com troca VH/VL no fragmento Fab CD28(SA) (knob) e modificações carregadas no fragmento Fab CEA(A5H1EL1D) (hole) (Figura 23B) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 360, 361, 362 e 363 (P1AE4777).

[001089] Molécula 11F: CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA_Variante 8) formato 1+1, moléculas crossFab huIgG1 PG-LALA biespecífica com troca VH/VL no fragmento Fab CD28(SA_Variante 8) (knob) e modificações carregadas no fragmento Fab CEA(A5H1EL1D) (hole) (Figura 23B) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 360, 361, 364 e 365 (P1AE4780).

[001090] Molécula 11G: CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA_Variante 15) formato 1+1, moléculas crossFab huIgG1 PG-LALA biespecífica com troca VH/VL no fragmento Fab CD28(SA_Variante 15) (knob) e modificações carregadas no fragmento Fab CEA(A5H1EL1D) (hole) (Figura 23B) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 360, 361, 366 e 367 (P1AE4791).

[001091] Molécula 11H: CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA_Variante 29) formato 1+1, moléculas crossFab huIgG1 PG-LALA biespecífica com troca VH/VL no fragmento Fab CD28(SA_Variante 29) (knob) e modificações carregadas no fragmento Fab CEA(A5H1EL1D) (hole) (Figura 23B) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 360, 361, 368 e 363 (P1AE4793).

[001092] Molécula 11I: CEA (T84.66)-CD28(SA) formato 1+1, molécula biespecífica de huIgG1 PG-LALA CrossFab com modificações carregadas no fragmento Fab de CD28(SA) (knob) e troca VH/VL no fragmento Fab de CEA(T84.66) (hole) (Figura 23A) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 369, 370, 353 e 354 (P1AE6488).

[001093] Molécula 11J: CEA (T84.66)-CD28(SA_Variante 29) formato 1+1, molécula biespecífica de huIgG1 PG-LALA CrossFab com modificações carregadas no fragmento Fab de CD28(SA_Variante 29) (knob) e troca VH/VL no fragmento Fab de CEA(T84.66) (hole) (Figura 23A) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 369, 370, 359 e 354 (P1AE6495).

[001094] Molécula 11K: CEA (T84.66)-CD28(SA_Variante 15) formato 1+1, molécula biespecífica de huIgG1 PG-LALA CrossFab com modificações carregadas no fragmento Fab de CD28(SA_Variante 15) (knob) e troca VH/VL no fragmento Fab de CEA(T84.66) (hole) (Figura 23A) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 369, 370, 357 e 358 (P1AE6557).

[001095] Molécula 11L: CEA (T84.66)-CD28(SA_Variante 8) formato 1+1, molécula biespecífica de huIgG1 PG-LALA CrossFab com modificações carregadas no fragmento Fab de CD28(SA_Variante 8) (knob) e troca VH/VL no fragmento Fab de CEA(T84.66) (hole) (Figura 23A) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 369, 370, 355 e 356 (P1AE6556).

[001096] Molécula 11M: CEA (T84.66)-CD28 (SA_Variante 29) formato 1+1, moléculas crossFab huIgG1 PG-LALA biespecífica com troca VH/VL no fragmento Fab CD28(SA_Variante 29) (knob) e modificações carregadas no fragmento Fab CEA(T84.66) (hole) (Figura 23B) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 371, 372, 368 e 363 (P1AE9605).

[001097] Molécula 11N: CEA (T84.66)-CD28 (SA_Variante 8) formato 1+1, moléculas crossFab huIgG1 PG-LALA biespecífica com troca VH/VL no fragmento Fab CD28(SA_Variante 8) (knob) e modificações carregadas no fragmento Fab CEA(T84.66) (hole) (Figura 23B) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 371, 372, 366 e 367 (P1AE9606).

[001098] Molécula 11O: CEA (T84.66)-CD28 (SA_Variante 15) formato 1+1, moléculas crossFab huIgG1 PG-LALA biespecífica com troca

VH/VL no fragmento Fab CD28(SA_Variante 15) (knob) e modificações carregadas no fragmento Fab CEA(T84.66) (hole) (Figura 23B) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 371, 372, 364 e 365 (P1AE9607).

[001099] Molécula 11P: CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA- Variante 29) 2+1, construto crossFab anti-CD28 (SA_Variante 29) monovalente biespecífico e anti-CEA huIgG1 PG-LALA bivalente, modificações carregadas tanto em fragmentos Fab anti-CEA fundidos cabeça com cauda entre si (hole), troca VH/VL no fragmento CrossFab anti-CD28 (knob) (Figura 23C). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 368, 362, 361 e 373 (P1AE6924).

[001100] Molécula 11Q: CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA_Variante 29) 2+1, construto anti-CD28 (SA) monovalente biespecífico e anti-CEA huIgG1 PG-LALA CrossFab bivalente, “orientação clássica”, troca VH/VL no fragmento CrossFab anti-CD28, modificação carregada em fragmentos Fab anti-CEA (Figura 23D). A molécula compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 368, 374, 361 e 360 (P1AE6925).

[001101] Molécula 11R: CEA (P002.139)-CD28(SA_Variante 15) formato 1+1, molécula biespecífica de huIgG1 PG-LALA CrossFab com modificações carregadas no fragmento Fab de CD28(SA_Variante 15) (knob) e troca VH/VL no fragmento Fab de CEA(P002.139) (hole) (Figura 23A) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 375, 376, 357 e 358 (P1AE8371).

[001102] Molécula 11S: CEA (P002.139)-CD28(SA_Variante 8) formato 1+1, molécula biespecífica de huIgG1 PG-LALA CrossFab com modificações carregadas no fragmento Fab de CD28(SA_Variante 8) (knob) e troca VH/VL no fragmento Fab de CEA(P002.139) (hole) (Figura 23A) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 375, 376, 355 e

356 (P1AF1115).

[001103] Molécula 11T: CEA (P002.139)-CD28(SA_Variante 11) formato 1+1, molécula biespecífica de huIgG1 PG-LALA CrossFab com modificações carregadas no fragmento Fab de CD28(SA_Variante 11) (knob) e troca VH/VL no fragmento Fab de CEA(P002.139) (hole) (Figura 23A) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 375, 376, 355 e 354 (P1AF1116).

[001104] Para comparação, as seguintes variantes de anticorpo anti-CD28 foram feitas:

[001105] Molécula 11U: anticorpo CD28(SA_Variante 8) (PG- LALA), CD28(SA_Variante 8) em um isotipo de huIgG1 PG-LALA (Figura 1B) compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:377 e SEQ ID NO:378 (P1AE7035).

[001106] Molécula 11V: anticorpo CD28(SA_Variante 11) (PG-LALA), CD28(SA_Variante 11) em um isotipo de huIgG1 PG-LALA (Figura 1B) compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:379 e SEQ ID NO:380 (P1AE7036).

[001107] Molécula 11W: anticorpo CD28(SA_Variante 15) (PG-LALA), CD28(SA_Variante 15) em um isotipo de huIgG1 PG-LALA (Figura 1B) compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:381 e SEQ ID NO:382 (P1AE7037).

[001108] Molécula 11X: anticorpo CD28(SA_Variante 27) (PG-LALA), CD28(SA_Variante 27) em um isotipo de huIgG1 PG-LALA (Figura 1B) compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:383 e SEQ ID NO:384 (P1AE7038).

[001109] Molécula 11Y: anticorpo CD28(SA_Variante 29) (PG-LALA), CD28(SA_Variante 29) em um isotipo de huIgG1 PG-LALA (Figura 1B) compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:385 e SEQ ID

NO:386 (P1AE7039).

11.2 PRODUÇÃO DAS MOLÉCULAS

[001110] A expressão das moléculas acima mencionadas é conduzida por um promotor MPSV quimérico ou um promotor CMV. A poliadenilação é conduzida por uma sequência de sinal poliA sintética localizada na extremidade 3’ do CDS. Além disso, cada vetor contém uma sequência EBV OriP para replicação autossômica.

[001111] Para a produção das Moléculas 11A a 11D e 11I a 11T, células HEK293-EBNA que crescem em suspensão foram co- transfectadas com os respectivos vetores de expressão com o uso de polietilenimina como reagente de transfecção. Os anticorpos e anticorpos biespecíficos foram gerados por transfecção transitória de células HEK293 EBNA. As células foram centrifugadas e o meio substituído por meio CD CHO pré-aquecido. Os vetores de expressão foram misturados em meio CD CHO, PEI foi adicionado, a solução agitada em vórtice e incubada por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, as células foram misturadas com a solução de DNA/PEI, transferidas para frasco agitador e incubadas por 3 horas a 37 ° C em incubadora com atmosfera de 5% de CO2. Após a incubação, meio Excell com suplementos foi adicionado (Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, Editores: Weichang Zhou, Anne Kantardjieff). Um dia após os suplementos de transfecção (Ração) foram adicionados (Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, Editores: Weichang Zhou, Anne Kantardjieff). Os sobrenadantes celulares foram colhidos após 7 dias por centrifugação e filtração subsequente (filtro de 0,2 μm) e purificados por métodos padrão.

[001112] As moléculas 11U, 11V, 11W, 11X e 11Y foram produzidas e purificadas pela Evitria com o uso de seu sistema de vetor exclusivo com técnicas de clonagem convencionais (não baseadas em PCR) e com o uso de células CHO K1 adaptadas a suspensão (originalmente recebidas da ATCC e adaptadas ao soro crescimento livre em cultura em suspensão em Evitria). Para a produção, a Evitria usou seus meios proprietários sem componentes de animais e sem soro (eviGrow e eviMake2) e seu reagente de transfecção exclusivo (eviFect). O sobrenadante foi colhido por centrifugação e filtração subsequente (filtro de 0,2 μm) e purificado por métodos padrão. As moléculas 11E, 11F, 11G e 11H foram produzidas e purificadas por Proteros de acordo com seus métodos e protocolos padrão.

11.3 PURIFICAÇÃO DAS MOLÉCULAS

[001113] As proteínas foram purificadas a partir de sobrenadantes da cultura de células filtradas, referindo-se a protocolos padrão.

Em resumo, as proteínas contendo Fc foram purificadas a partir de sobrenadantes de cultura de células por cromatografia de afinidade com Proteína A (tampão de equilíbrio: citrato de sódio 20 mM, fosfato de sódio 20 mM, pH 7,5; tampão de eluição: citrato de sódio 20 mM, pH 3,0). A eluição foi alcançada a pH 3,0, seguida de neutralização de pH imediata da amostra. A proteína foi concentrada por centrifugação (Millipore Amicon® ULTRA-15 (Art.Nr.: UFC903096), e a proteína agregada foi separada da proteína monomérica por cromatografia de exclusão de tamanho em histidina 20 mM, cloreto de sódio 140 mM, pH 6,0.

11.4 DADOS ANALÍTICOS DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADAS A CD28 E ANTÍGENO CARCINOEMBRIONÁRIO (CEA)

[001114] A concentração de proteínas purificadas foi determinada por meio da medição da absorção a 280 nm com o uso do coeficiente de extinção em massa calculado com base na sequência de aminoácidos de acordo com Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423. Pureza e peso molecular das proteínas foram analisados por CE-SDS na presença e ausência de um agente redutor com o uso de um LabChipGXII

(Perkin Elmer). A determinação do teor de agregado foi realizada por cromatografia de HPLC a 25 °C com o uso de coluna analítica de exclusão de tamanho (TSKgel G3000 SW XL ou UP-SW3000) equilibrada em tampão de corrida (K2HPO4 25 mM, NaCl 125 mM, mono-hidrocloreto de L-arginina 200 mM, pH 6,7 ou KH2PO4, 200 mM, KCl 250 mM, pH 6,2 respectivamente). Um resumo dos parâmetros de purificação de todas as moléculas é fornecido na Tabela 26.

TABELA 26: RESUMO DA PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DAS MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CD28 11A A 11Y SEC Analítico Rendimento Pureza medida por Molécula Descrição (HMW/Monômero/LMW) [mg/l] CE-SDS [%] [%] CEA (A5H1EL1D)- 11A 11,4 0/100/0 97,8 CD28 (SA) 1+1 CEA (A5H1EL1D)- 11B CD28 (SA_Variante 8) 11,3 0/100/0 98,2 1+1 CEA (A5H1EL1D)- 11C CD28 (SA_Variante 15) 45,1 0/100/0 97,1 1+1 CEA (A5H1EL1D)- 11D CD28 (SA_Variante 29) 58,1 0/100/0 96,6 1+1 CEA (A5H1EL1D)- 11E CD28 (SA, cruzado) N/A 0,97/95,2/3,93 98,8 1+1 CEA (A5H1EL1D)- N/A 11F CD28 (SA_Variante 8, 0,3/96,83/2,86 96,43 cruzado) 1+1 CEA (A5H1EL1D)- N/A 11G CD28 (SA_Variante 15, 0,1/98,34/1,56 97,9 cruzado) 1+1 CEA (A5H1EL1D)- N/A 11H CD28 (SA_Variante 29, 1,07/96,03/2,9 95,79 cruzado) 1+1 CEA (T84.66) - CD28 11I N/A (SA) 1+1 CEA (T84.66) - CD28 11J 25,2 3,33/96,14/0,53 97,8 (SA_variante 29) 1+1 CEA (T84.66) - CD28 11K 3 5,19/93,06/1,75 96,32 (SA_Variante 15) 1+1 CEA (T84.66) - CD28 11L 7,8 5,12/95,5/1,84 95,5 (SA_Variante 8) 1+1

SEC Analítico Rendimento Pureza medida por Molécula Descrição (HMW/Monômero/LMW) [mg/l] CE-SDS [%] [%] CEA (T84.66)-CD28 11M (SA_variante 29, N/A cruzado) 1+1 CEA (T84.66)-CD28 N/A 11N (SA_Variante 15, cruzado) 1+1 CEA (T84.66)-CD28 N/A 11O (SA_Variante 8, cruzado) 1+1 CEA (A5H1EL1D, head N/A 11P to tail) - CD28 (SA_variante 29) 2+1 CEA (A5H1EL1D) - N/A 11Q CD28 (SA_variante 29) 2+1, clássico CEA(P002.139)-CD28 044/99,56/0 11R 7,27 100 (SA_Variante 15) 1+1 CEA(P002.139)-CD28 11S 12 0,57/97,68/1,75 99,44 (SA_Variante 8) 1+1 CEA(P002.139)-CD28 11T 7,25 0,7/96,61/2,69 95,1 (SA_Variante 11) 1+1 CD28 (SA_Variante 8) N/A 0/98,43/1,57 11U 80,2 IgG1 PG LALA CD28 (SA_Variante 11) N/A 0/98,52/1,48 11V 72,5 IgG1 PG LALA CD28 (SA_Variante 15) N/A 1,49/97,44/1,07 11W 82 IgG1 PG LALA CD28 (SA_Variante 27) N/A 1,46/97,15/1,39 11X 84,6 IgG1 PG LALA CD28 (SA_Variante 29) N/A 1.02/97.3 1.68 11Y 84,4 IgG1 PG LALA

11.5 ANÁLISE DE LIGAÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD28 E ANTÍGENO CARCINOEMBRIONÁRIO (CEA) POR SPR

[001115] Afinidade (KD) para CD28 das moléculas 10A-10D, que carregam o anticorpo anti-CEA A5H1EL1D e as variantes 8, 11 e 29 do ligante anti-CD28, bem como o ligante original CD28(SA), foram medidas por SPR por superfície ressonância de plasmon usando uma máquina Proteon XPR36. Para a imobilização do antígeno recombinante (ligante), huCD28-Fc foi diluído com PBST (fosfato 10 mM, cloreto de sódio 150 mM pH 7,4, Tween 20 a 0,005%) para concentrações que variam de 100 a 500 nM, e, então, injetado a 25 μl/minuto em tempos de contato variáveis. Isso resultou em níveis de imobilização entre 500 a 3000 unidades de resposta (RU) na orientação vertical.

[001116] Para a determinação da afinidade (KD) das moléculas purificadas, a direção da injeção foi alterada para a orientação horizontal. Série de diluição dupla de construtos purificados (variando os intervalos de concentração entre 100 e 6,25 nM) foram injetados simultaneamente a 100 μl/min ao longo de canais separados 1-5, com tempos de associação de 150 s e tempos de dissociação de 400 s. O tampão (PBST) foi injetado ao longo do sexto canal para fornecer um espaço em branco “em linha” para referência. A regeneração foi realizada com glicina 10 mM pH 1,5 por 35s a 50 l/min (orientação vertical). As constantes de taxa de associação (kon) e as constantes de taxa de dissociação (koff) foram calculadas com o uso de um modelo de ligação Langmuir simples um-para-um no software ProteOn Manager v3.1, ajustando simultaneamente os sensorgramas de associação e dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação (KD) é calculada como a razão koff/kon. Os dados cinéticos e termodinâmicos estão listados na Tabela

27.

TABELA 27: ANÁLISE CINÉTICA E TERMODINÂMICA DE VARIANTES ANTI-CD28 EM MOLÉCULAS BIESPECÍFICAS 11A A 11D Molécula biespecífica kon (1/(s*M) koff (1/s) KD (nM) CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA) 1+1 3,77E+5 2,94E-4 0,8 1,69E+5 9,80E-3 58 CEA (A5H1EL1D)-CD28 (CD28(SA_Variante 8) 1+1 CEA (A5H1EL1D)-CD28 2,59E+5 2,64E-3 10 (CD28(SA_Variante 15) 1+1 CEA (A5H1EL1D)- CD28 2,71E+5 3,24E-4 1,2 (CD28(SA_Variante 29) 1+1

11.6 CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DAS VARIANTES DE IGG ANTI-CD28 E MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO ANTI-CD28 DIRECIONADAS A CEA BIESPECÍFICAS 1+1 SELECIONADAS

[001117] A fim de caracterizar e comparar suas propriedades bioquímicas e biofísicas, as seguintes moléculas foram analisadas em detalhes: Moléculas variantes biespecíficas anti-CD28 direcionadas a CEA 10A-10D e Moléculas variantes IgG anti-CD28 10U-10Y. Os resultados são resumidos na Tabela 27 e 28.

CROMATOGRAFIA DE INTERAÇÃO HIDROFÓBICA (HIC)

[001118] A hidrofobicidade aparente foi determinada pela injeção de 20 µg de amostra em uma coluna HIC-Éter-5PW (Tosoh) equilibrada com Na-fosfato 25 mM, sulfato de amônio 1,5 M, pH 7,0. A eluição foi realizada com um gradiente linear de 0 a 100% de tampão B (fosfato de Na 25 mM, pH 7,0) em 60 minutos. Os tempos de retenção foram comparados aos padrões de proteína com hidrofobicidade conhecida. A maioria dos anticorpos exibe um tempo de retenção relativo entre 0 e 0,35.

ESTABILIDADE TÉRMICA

[001119] As amostras foram preparadas a uma concentração de 1 mg/ml em histidina/cloreto de histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, transferidas para uma placa óptica de 384 poços por centrifugação através de uma placa de filtro de 0,4 µm e cobertas com óleo de parafina. O raio hidrodinâmico foi medido repetidamente por dispersão dinâmica de luz em um DynaPro Plate Reader (Wyatt) enquanto as amostras eram aquecidas a uma taxa de 0,05 °C/min de 25 °C a 80 °C.

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE DE FCRN

[001120] FcRn foi expresso, purificado e biotinilado conforme descrito por Cymer, Schlothauer et al., Bioanalysis 2017, 9(17), doi.org/10.4155/bio-2017-0109. Para o acoplamento, o receptor preparado foi adicionado a estreptavidina-sepharose (GE Healthcare). A matriz FcRn- sepharose resultante foi empacotada em um alojamento de coluna. A coluna foi equilibrada com ácido 2-(N-morfolina)-etanossulfônico (MES) 20 mM, NaCl 140 mM, pH 5,5 (eluente A) a uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min. 30 µg de amostras de anticorpos foram diluídos em uma razão de volume de 1:1 com o eluente A e aplicados à coluna FcRn. A coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de eluente A seguido por eluição com um gradiente linear de 20 a 100% Tris/HCl 20 mM, NaCl 140 mM, pH 8,8 (eluente B) em 35 volumes de coluna. A análise foi realizada em forno de coluna a 25 °C. O perfil de eluição foi monitorado por medição contínua da absorvância a 280 nm. Os tempos de retenção foram comparados aos padrões de proteína com afinidades conhecidas. A maioria dos anticorpos exibe um tempo de retenção relativo entre 0 e 1.

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE DE HEPARINA

[001121] A afinidade para a heparina foi determinada pela injeção de 30-50 µg de amostra em uma coluna TSKgel Heparin-5PW (Tosoh) equilibrada com Tris 50 mM, pH 7,4. A eluição foi realizada com um gradiente linear de tampão B a 0 a 100% (Tris 50 mM, NaCl 1M, pH 7,4 mM) em 37 minutos. Os tempos de retenção foram comparados aos padrões de proteína com afinidades conhecidas.

[001122] Todas as variantes de sequência testadas passaram em todos os critérios e não diferem significativamente umas das outras em relação a todas as propriedades biofísicas e bioquímicas testadas (Tabelas 28 e 29).

TABELA 28: PROPRIEDADES BIOFÍSICAS E BIOQUÍMICAS DAS VARIANTES TESTADAS DE IGG ANTI-CD28 10U-10Y Amostra Estabilidade Hidrofobicidade Afinidade Afinidade de térmica (°C) aparente de FcRn heparina CD28 (SA_variante 8) IgG1 79 0,218 0,17 0,58

PG LALA CD28 (SA_variante 11) IgG1 78 0,313 0,21 0,58

Amostra Estabilidade Hidrofobicidade Afinidade Afinidade de térmica (°C) aparente de FcRn heparina

PG LALA CD28 (SA_variante 15) IgG1 79 0,265 0,25 0,59

PG LALA CD28 (SA_variante 27) IgG1 78 0,194 0,28 0,59

PG LALA CD28 (SA_variante 29) IgG1 78 0,308 0,37 0,59

PG LALA TABELA 29: PROPRIEDADES BIOFÍSICAS E BIOQUÍMICAS DE MOLÉCULAS DE VARIANTE ANTI-CD28 DIRECIONADAS A CEA BIESPECÍFICAS TESTADAS 11A-11D Amostra Estabilidade Hidrofobicidade Afinidade de Afinidade de térmica (°C) aparente FcRn heparina CEA (A5H1EL1D) - CD28 70 0,22 0,21 0,66 (SA) 1+1 CEA (A5H1EL1D) - CD28 67 0,17 0,08 0,66 (SA_Variante 8) 1+1 CEA (A5H1EL1D) - CD28 70 0,19 0,1 0,66 (SA_Variante 15) 1+1 CEA (A5H1EL1D) - CD28 70 0,22 0,17 0,67 (SA_Variante 29) 1+1 EXEMPLO 12

CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL IN VITRO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADAS A CD28 E ANTÍGENO CARCINOEMBRIONÁRIO (CEA)

12.1 LIGAÇÃO A CEACAM5 EM CÉLULAS MV3 QUE EXPRESSAM CEA

[001123] Para avaliar se a maturação por afinidade de A5H1EL1D resultou em ligação melhorada a CEACAM5, foi realizado um ensaio de ligação FACS em células MV3, geneticamente modificadas para expressar CEA. Como mostrado na Figura 24, um anticorpo biespecífico CEA- CD28 (Molécula 11R, P1AE8371) carregando o clone anti-CEA maturado por afinidade P002.139 mostrou ligação superior (EC50 = 4,1 nM) a CEACAM5 do que o clone A5H1EL1D (Molécula 11C, P1AE4775) (EC50 = 20,4 nM).

12.2 ENSAIO REPÓRTER IL-2 PARA ANALISAR A FUNCIONALIDADE IN VITRO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS CEA-CD28 EM COMBINAÇÃO COM TCBS

DIRECIONADOS A CEA

[001124] As células repórter IL-2 (J1631, Promega) são células T Jurkat geneticamente modificadas que expressam um repórter de luciferase conduzido por um promotor IL-2. Para avaliar a capacidade dos agonistas de CD28 direcionados a CEA para aumentar a função efetora de células T mediada por TCB, 10000 células MKN45/poço foram incubadas com 105 células repórter IL-2 (razão E:T 10:1) com concentração fixa de CEA-TCB (5 nM) e uma faixa de concentração de anticorpos biespecíficos CEA-CD28 (14 pM-10 nM). Após 6h de incubação a 37 ° C, CO2 a 5%, a luminescência foi avaliada usando OneGlo (E6120, Promega) de acordo com as instruções do fabricante. As placas foram lidas através do leitor de placas Tecan Spark 10M.

[001125] A funcionalidade do anticorpo biespecífico CEA- CD28 transportando o clone P002.139 anti-CEA maturado por afinidade (Molécula 11R, P1AE8371) ou o clone A5H1EL1D (Molécula 11C, P1AE4775) foi avaliada com o uso de um ensaio de célula repórter IL-2 em combinação com CEA-TCB (5 nM) e na presença de células MKN45 que expressam CEA.

Como mostrado nas Figuras 25A e 25B, a afinidade melhorada do clone P002.139 maturado por afinidade se traduziu em maior potência na capacidade coestimuladora em comparação com o clone A5H1EL1D.

EXEMPLO 13

CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL IN VIVO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADAS A CD28 E ANTÍGENO CARCINOEMBRIONÁRIO (CEA) EM

COMBINAÇÃO COM CEA TCB

13.1 ESTUDO DE EFICÁCIA COM MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO CEA-CD28 COM DIFERENTES DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CEA EM COMBINAÇÃO COM CEA-TCB EM XENOENXERTO MKN45 EM

CAMUNDONGOS HUMANIZADOS

[001126] O estudo de eficácia descrito no presente documento teve como objetivo compreender a potência dependente do clone CEA da molécula de ligação ao antígeno biespecífico CEA-CD28 em combinação com CEA-TCB em termos de regressão tumoral em camundongos NSG totalmente humanizados.

[001127] As células MKN45 humanas (carcinoma gástrico humano) foram originalmente obtidas da ATCC e após expansão depositadas no banco de células interno Glycart. As células foram cultivadas em DMEM contendo FCS a 10% a 37 °C em uma atmosfera saturada de água em CO2 a 5%. A passagem 12 in vitro foi usada para injeção subcutânea com uma viabilidade de 97%. Suspensão de células de 50 microlitros (1x106 células MKN45) misturada com 50 microlitros de Matrigel foram injetados por via subcutânea no flanco de camundongos anestesiados com uma agulha de 22G a 30G.

[001128] Camundongos NSG fêmeas, com a idade de 4-5 semanas no início do experimento (Jackson Laboratory), foram mantidos em condições isentas de patógenos específicos com ciclos diários de 12 h de luz/12 h de escuridão de acordo com as diretrizes autorizadas (GV-Solas; Felasa; TierschG). O protocolo do estudo experimental foi revisado e aprovado pelo governo local (ZH225-17). Após a chegada, os animais foram mantidos por uma semana para se acostumarem ao novo ambiente e para observação.

A monitorização contínua da saúde foi realizada regularmente.

[001129] Os camundongos fêmeas NSG foram injetados i.p.

com 15 mg/kg de Bussulfan, seguido um dia depois por uma injeção i.v. de 1x105 células-tronco hematopoiéticas humanas isoladas do sangue do cordão.

Na semana 14-16, após a injeção de células-tronco, os camundongos foram sangrados por via sublingual e o sangue foi analisado por citometria de fluxo para uma humanização bem-sucedida. Camundongos eficientemente enxertados foram randomizados de acordo com suas frequências de células T humanas nos diferentes grupos de tratamento. Na ocasião, camundongos foram injetados com células tumorais s.c. conforme descrito (Figura 26, d0) e tratado com os compostos ou tampão de histidina (Veículo) quando o tamanho do tumor atingiu aprox. 150 mm3 (dia 13). Todos os camundongos foram injetados i.v. com 200 µl da solução apropriada. Para obter a quantidade adequada de compostos por 200 µl, as soluções estoque (Tabela 30) foram diluídas com tampão de histidina quando necessário.

TABELA 30: COMPOSIÇÕES USADAS NO EXPERIMENTO IN VIVO Concentração Composto Tampão de formulação (mg/ml) Histidina 20 mM, 4,82 CEA-TCB NaCl 140 mM, (= solução estoque) pH 6,0 Histidina 20 mM, CEA(T84.66)-CD28 1,71 NaCl 140 mM, (SA_Variante 15) (= solução estoque) pH 6,0 Histidina 20 mM, CEA(A5H1EL1D)-CD28 3,89 NaCl 140 mM, (SA_Variante 15) (= solução estoque) pH 6,0

[001130] Para as terapias de combinação (Grupo C e D, Figura 26) com CEA-CD28 e CEA-TCB, as moléculas biespecíficas foram injetadas concomitantemente. O crescimento do tumor foi medido duas vezes por semana com o uso de um calibrador e o volume do tumor foi calculado da seguinte forma: Tv: (W2/2) x L (W: Largura, L: Comprimento)

[001131] Os valores de inibição do crescimento do tumor como uma medição da potência in vivo foram calculados com um programa estatístico interno da Roche como segue: 100 - Av (T_tratamento(dia x)- T_tratamento(linha de base)) Av (T_veículo(dia x)- T_Veículo(linha de base))

[001132] Esse estudo terminou no dia 39. A Figura 27A mostra a cinética de crescimento do tumor (média, +SEM), bem como a cinética de crescimento do tumor individual por grupo e camundongo (Figuras 27B a 27E). Conforme descrito aqui, o CEA-TCB, como um único agente, induziu pouca inibição do crescimento do tumor. No entanto, as combinações com ambas as moléculas CEA-CD28 mostraram inibição do crescimento tumoral melhorada. Especialmente a combinação de CEA-TCB com CEA-CD28 que contém o ligante de menor afinidade para CEA (A5H1EL1D) resultou em regressão de crescimento tumoral superior. Conforme exibido na Tabela 31, o valor TGI mais alto (TGI: 116%) foi calculado para o grupo de combinação de CEA-TCB com CEA-CD28 (huA5B7) indicando os efeitos antitumorais mais fortes. TGI significa inibição do crescimento do tumor, TGI >100 significa regressão do tumor e TGI = 100 é definido como estase do tumor.

TABELA 31: TGI NO DIA DE ESTUDO 39 (VEÍCULO COMO GRUPO DE CONTROLE) Grupo TGI CEA TCB 69 CEA TCB + CEA(T84.66)-CD28 (SA_Variante 15) 89 CEA TCB + CEA(A5H1EL1D)-CD28 (SA_Variante 15) 116

13.2 ESTUDO DE EFICÁCIA COM MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO CEA-CD28 COM TRÊS DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CD28 DIFERENTES EM COMBINAÇÃO COM CEACAM5-TCB E ANTICORPO ANTI-PDL1 EM XENOENXERTO BXPC3 EM CAMUNDONGOS HUMANIZADOS

[001133] Esse estudo de eficácia teve como objetivo compreender o impacto da afinidade do domínio de ligação ao antígeno CD28 das moléculas CEA-CD28 em combinação com CEACAM5-TCB e anti-PD-L1 em termos de regressão tumoral e padrões de ImmunoPD em camundongos NSG totalmente humanizados. Três variantes de afinidade diferentes foram testadas no estudo atual (Variante 8 < Variante 15 < Variante 29).

[001134] As células BXPC3 humanas (linha de células de câncer pancreático humano) foram originalmente obtidas na ECACC (Coleção Europeia de Cultura de Células) e após expansão depositadas no banco de células interno Roche Glycart. As células BXPC3 foram cultivadas em RPMI contendo FCS a 10% (PAA Laboratories, Áustria), com Glutamax a 1%. As células foram cultivadas a 37 °C em uma atmosfera saturada com água a CO 2 a 5%. A passagem 20 in vitro foi usada para injeção s.c. com uma viabilidade de >95%. Suspensão de células de 50 microlitros (1x106 células BXPC3) misturada com 50 microlitros de Matrigel foram injetados por via subcutânea no flanco de camundongos anestesiados com uma agulha de 22G a 30G.

[001135] Camundongos NSG fêmeas, com a idade de 4-5 semanas no início do experimento (Jackson Laboratory), foram mantidos em condições isentas de patógenos específicos com ciclos diários de 12 h de luz/12 h de escuridão de acordo com as diretrizes autorizadas (GV- Solas; Felasa; TierschG). O protocolo do estudo experimental foi revisado e aprovado pelo governo local (ZH225-17). Após a chegada, os animais foram mantidos por uma semana para se acostumarem ao novo ambiente e para observação. A monitorização contínua da saúde foi realizada regularmente.

[001136] Os camundongos fêmeas NSG foram injetados i.p. com 15 mg/kg de Bussulfan, seguido um dia depois por uma injeção i.v.

de 1x10 5 células-tronco hematopoiéticas humanas isoladas do sangue do cordão. Na semana 14-16, após a injeção de células-tronco, os camundongos foram sangrados por via sublingual e o sangue foi analisado por citometria de fluxo para uma humanização bem-sucedida.

Camundongos enxertados com eficiência foram randomizados de acordo com suas frequências de células T humanas nos diferentes grupos de tratamento A a F. Nesse momento, os camundongos foram injetados com células tumorais s.c. como descrito na Figura 28 e tratados com os compostos ou tampão de histidina (veículo) quando o tamanho do tumor atingiu aprox. 150 mm3 (dia 20). Todos os camundongos foram injetados i.v. com 200 µl da solução apropriada. Para obter a quantidade adequada de compostos por 200 µl, as soluções estoque (Tabela 32) foram diluídas com tampão de Histidina quando necessário.

TABELA 32: COMPOSIÇÕES USADAS NO EXPERIMENTO IN VIVO Concentração Composto Tampão de formulação (mg/ml) Histidina 20 mM, 20,5 CEACAM5-TCB NaCl 140 mM, (= solução estoque) pH 6,0 Histidina 20 mM, 60 anti-PD-L1 (Atezolizumab) NaCl 140 mM, (= solução estoque) pH 6,0 Histidina 20 mM, CEA(A5H1EL1D)-CD28 3,78 NaCl 140 mM, (SA_Variante 8) (= solução estoque) pH 6,0 Histidina 20 mM, CEA(A5H1EL1D)-CD28 3,89 NaCl 140 mM, (SA_Variante 15) (= solução estoque) pH 6,0 Histidina 20 mM, CEA(A5H1EL1D)-CD28 5,01 NaCl 140 mM, (SA_Variante 29) (= solução estoque) pH 6,0

[001137] No término (dia 52), os camundongos foram sacrificados, os tumores foram removidos, pesados e suspensões de células individuais foram preparadas através de uma digestão enzimática com Colagenase V e DNAse para análise FACS subsequente. Células únicas foram coradas para CD45, CD3, CD8 e CD4 humano e analisadas em FACS BDFortessa.

[001138] A Figura 29 mostra a cinética de crescimento do tumor (média, +SEM) para todos os grupos de tratamento, os valores de TGI correspondentes de cada braço de tratamento são mostrados na Tabela 33 abaixo. Conforme descrito aqui, a monoterapia CEACAM5 TCB, bem como a combinação com a-PD-L1 induziu pouca inibição do crescimento do tumor.

Apenas a adição de CEA-CD28 (SA_Variante 8) à combinação de CEACAM5- TCB e a-PD-L1 levou a um aumento da inibição do crescimento tumoral (TGI: 75%). Nem a variante 15 nem a variante 29 aumentaram os efeitos antitumorais. Curiosamente, os dados de Immuno-PD (Figuras 30A-D) de tumores de animais sacrificados no término do estudo, revelaram que a inibição do crescimento tumoral adicional induzida por CEA-CD28 variante 8 também é refletida por um aumento da frequência de células T intratumorais. A Figura 30A mostra gráficos de pontos representativos das suspensões de células únicas de tumor coradas de cada braço de tratamento. O resumo da infiltração de células T CD3, CD8 e CD4 está representado nas Figuras 30B, 30C e 30D, respectivamente. Nenhuma diferença estatística foi observada nos grupos tratados com CEA-CD28 (SA_Variante 15) ou CEA-CD28 (SA_Variante 29) em comparação com o único CEACAM5-TCB ou combinação com a-PD-L1 em termos de infiltração de células T no tumor. Os efeitos mais fortes do ImmunoPD foram detectados com CEA-CD28 (SA_Variante 8).

TABELA 33: TGI NO DIA DE ESTUDO 52 (VEÍCULO COMO GRUPO DE CONTROLE) Grupo TGI CEACAM5 TCB 35 CEACAM5 TCB + a-PD-L1 17 CEACAM5 TCB + a-PD-L1 + CEA(A5H1EL1D)-CD28 75 (SA_Variante 8) CEACAM5 TCB + a-PD-L1 + CEA(A5H1EL1D)-CD28 37 (SA_Variante 15) CEACAM5 TCB + a-PD-L1 + CEA(A5H1EL1D)-CD28 35 (SA_Variante 29)

13.3 ESTUDO DE EFICÁCIA COM MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO CEA-CD28 EM COMBINAÇÃO COM CEA TCB EM XENOENXERTO MKN45 EM

CAMUNDONGOS NSG HUMANIZADOS

[001139] O estudo de eficácia descrito no presente documento teve como objetivo estudar a combinação de CEA-TCB e CEA- CD28 (SA_Variante 8) em um segundo modelo de xenoenxerto humano em termos de regressão tumoral e padrões de ImmunoPD em camundongos NSG totalmente humanizados.

[001140] As células MKN45 humanas (carcinoma gástrico humano) foram originalmente obtidas da ATCC e após expansão depositadas no banco de células interno Glycart. As células foram cultivadas em DMEM contendo FCS a 10% a 37 °C em uma atmosfera saturada de água em CO2 a 5%. A passagem 12 in vitro foi usada para injeção subcutânea com uma viabilidade de >95%. Suspensão de células de 50 microlitros (1x106 células MKN45) misturada com 50 microlitros de Matrigel foram injetados por via subcutânea no flanco de camundongos anestesiados com uma agulha de 22G a 30G. Camundongos NSG fêmeas, com a idade de 4-5 semanas no início do experimento (Jackson Laboratory), foram mantidos em condições isentas de patógenos específicos com ciclos diários de 12 h de luz/12 h de escuridão de acordo com as diretrizes autorizadas (GV-Solas; Felasa; TierschG). O protocolo do estudo experimental foi revisado e aprovado pelo governo local (ZH225-17). Após a chegada, os animais foram mantidos por uma semana para se acostumarem ao novo ambiente e para observação. A monitorização contínua da saúde foi realizada regularmente.

[001141] Os camundongos fêmeas NSG foram injetados i.p.

Na semana 14-16, após a injeção de células-tronco, os camundongos foram sangrados por via sublingual e o sangue foi analisado por citometria de fluxo para uma humanização bem-sucedida. Camundongos eficientemente enxertados foram randomizados de acordo com suas frequências de células T humanas nos diferentes grupos de tratamento. Nesse momento, os camundongos foram injetados com células tumorais s.c. conforme descrito na Figura 31 e tratado com as moléculas ou tampão de histidina (veículo) quando o tamanho do tumor atingiu aprox. 150 mm3 (dia 13). Todos os camundongos foram injetados i.v. com 200 µl da solução apropriada. Para obter a quantidade adequada de compostos por 200 µl, as soluções estoque (Tabela 34) foram diluídas com tampão de Histidina quando necessário.

TABELA 34: COMPOSIÇÕES USADAS NO EXPERIMENTO IN VIVO Concentração Composto Tampão de formulação (mg/ml) Histidina 20 mM, 4,82 CEA-TCB NaCl 140 mM, (= solução estoque) pH 6,0 Histidina 20 mM, CEA(A5H1EL1D)-CD28 3,78 NaCl 140 mM, (SA_Variante 8) (= solução estoque) pH 6,0

[001142] Para a terapia de combinação (Grupo C, Figura 31), os construtos foram injetados concomitantemente. O crescimento do tumor foi medido duas vezes por semana com o uso de um calibrador e o volume do tumor foi calculado da seguinte forma: Tv: (W2/2) x L (W: Largura, L: Comprimento)

[001143] Os valores de inibição do crescimento do tumor (TGI) como uma medição da potência in vivo foram calculados com um programa estatístico interno da Roche como descrito no Exemplo 12.1 anterior.

[001144] No término (dia 48), os camundongos foram sacrificados, os tumores foram removidos, pesados e suspensões de células individuais foram preparadas através de uma digestão enzimática com Colagenase V e DNAse para análise FACS subsequente. Células únicas foram coradas para CD45 e CD3 humano e analisadas em FACS BDFortessa.

[001145] A Figura 32 mostra a cinética de crescimento do tumor (média, +SEM) para todos os grupos de tratamento, os valores de TGI correspondentes de cada braço de tratamento são mostrados na Tabela 35 abaixo. Conforme descrito no presente documento, a monoterapia com CEA- TCB induziu a inibição do crescimento do tumor com um valor de TGI de 84%.

No entanto, o tratamento de combinação com CEA-CD28 (SA_Variante 8) levou a uma inibição superior do crescimento do tumor (TGI: 101%). Além disso, os dados de Immuno-PD (Figura 3) de tumores de animais sacrificados no término do estudo revelaram que a forte inibição do crescimento tumoral induzida por CEA-CD28 (SA_Variante 8) em combinação com CEA-TCB também é refletida por um aumento de T intratumoral frequência celular. A Figura 33A mostra gráficos de pontos representativos das suspensões de células únicas de tumor coradas de cada braço de tratamento. O resumo da infiltração de células T CD3+ é descrito na Figura 33B.

TABELA 35: TGI NO DIA DE ESTUDO 48 (VEÍCULO COMO GRUPO DE CONTROLE) Grupo TGI CEA TCB 84 CEA TCB + CEA(A5H1EL1D)-CD28 (SA_Variante 8) 10 EXEMPLO 14

GERAÇÃO E PRODUÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADAS A CD28 E MOLÉCULA DE ADESÃO DE CÉLULAS EPITELIAIS (EPCAM), HER3, CD30 OU GLICOPROTEÍNA DE TROFOBLASTO (TPBG)

14.1 CLONAGEM DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADAS A CD28 E EPCAM, HER3, CD30 OU TPBG

[001146] Para a geração dos plasmídeos de expressão, as sequências dos respectivos domínios variáveis foram usadas e subclonadas em estrutura com as respectivas regiões constantes que estão pré-inseridas no respectivo vetor de expressão de mamífero receptor. No domínio Fc, as mutações Pro329Gly, Leu234Ala e Leu235Ala (PG-LALA) foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas de IgG1 humana para anular a ligação aos receptores Fc gama de acordo com o método descrito na Publicação de Pedido de Patente Internacional n° WO 2012/130831. Para a geração de anticorpos biespecíficos, os fragmentos Fc continham o “knob” (mutações S354C/T366W, numeração de acordo com o índice EU de Kabat) ou mutações “hole” (mutações Y349C/T366S/L368A/Y407V de acordo com o índice EU de Kabat) para evitar emparelhamento incorreto das cadeias pesadas. A fim de evitar o pareamento incorreto de cadeias leves nas moléculas de ligação ao antígeno biespecífico, a troca de domínios VH/VL ou CH1/Ckappa foi introduzida em uma fração de ligação (tecnologia CrossFab).

Em outra fração de ligação, as cargas foram introduzidas nos domínios CH1 e Ckappa conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente Internacional n° WO 2015/150447.

[001147] A geração e preparação do anticorpo anti-EpCAM MT201 (adecatumumabe) são descritas na Patente n° US 7.632.925 B2. A produção do anticorpo anti-HER3 (lumretuzumabe) é descrita no documento WO 2011/076683 A1. O anticorpo anti-CD30 brentuximabe é revelado no documento WO 02/34661 A2. A geração e preparação de anticorpos anti- TPBG, por exemplo, FAB091, são descritas no documento WO 2017/072207 A1.

[001148] As seguintes moléculas foram clonadas, uma ilustração esquemática das mesmas é mostrada nas Figuras 34A a 34D:

[001149] Molécula 14A: EpCAM (MT201)-CD28 (SA_Variante 15) formato 1+1, moléculas crossFab huIgG1 PG-LALA biespecífica com troca VH/VL no fragmento Fab CD28(SA_Variante 15) (knob) e modificações carregadas no fragmento Fab EpCAM(MT201) (hole) (Figura 34A) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 366, 367, 390 e 391 (P1AE9051).

[001150] Molécula 14B: HER3 (lumretuzumabe)- CD28(SA_Variante 15) formato 1+1, molécula biespecífica de huIgG1 PG- LALA CrossFab com modificações carregadas no fragmento Fab de CD28(SA_Variante 15) (knob) e troca VH/VL no fragmento Fab anti-HER3 (hole) (Figura 34B) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 357, 358, 392 e 393 (P1AF0151).

[001151] Molécula 14C: CD30 (brentuximabe)- CD28(SA_Variante 15) formato 1+1, molécula biespecífica de huIgG1 PG- LALA CrossFab com modificações carregadas no fragmento Fab de CD28(SA_Variante 15) (knob) e troca VH/VL no fragmento Fab anti-CD30

(hole) (Figura 34C) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 357, 358, 394 e 395 (P1AF1751).

[001152] Molécula 14D: TPBG(FAB091)-CD28 (SA_Variante 15) formato 1+1, molécula biespecífica de huIgG1 PG-LALA CrossFab com modificações carregadas no fragmento Fab de CD28(SA_Variante 15) (knob) e troca VH/VL no fragmento Fab anti-TPBG (hole) (Figura 34D) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 357, 358, 396 e 397 (P1AF1752).

14.2 PRODUÇÃO DAS MOLÉCULAS

[001153] A expressão das moléculas acima mencionadas é conduzida por um promotor MPSV quimérico ou um promotor CMV. A poliadenilação é conduzida por uma sequência de sinal poliA sintética localizada na extremidade 3’ do CDS. Além disso, cada vetor contém uma sequência EBV OriP para replicação autossômica.

[001154] Os anticorpos e anticorpos biespecíficos foram gerados por transfecção transitória de células HEK293 EBNA ou células CHO EBNA. As células foram centrifugadas e o meio foi substituído por meio CD CHO pré-aquecido (Thermo Fisher, Cat n° 10743029). Os vetores de expressão foram misturados em meio CD CHO, PEI (Polietilenimina, Polysciences, Inc, Cat n° 23966-1) foi adicionado, a solução agitada com vórtice e incubada durante 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, as células (2 Mio/ml) foram misturadas com a solução de vetor/PEI, transferidas para um frasco e incubadas por 3 horas a 37 °C em uma incubadora com agitação com uma atmosfera de CO2 a 5%. Após a incubação, meio Excell com suplementos (80% do volume total) foi adicionado (W. Zhou e A. Kantardjieff, Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, DOI: 10.1007/978-3-642- 54050-9; 2014). Um dia após a transfecção, foram adicionados suplementos (alimentação, 12% do volume total). Os sobrenadantes celulares foram colhidos após 7 dias por centrifugação e filtração subsequente (filtro de 0,2 μm), e as proteínas foram purificadas do sobrenadante colhido por métodos padrão conforme indicado abaixo.

14.3 PURIFICAÇÃO DAS MOLÉCULAS

[001155] As proteínas foram purificadas a partir de sobrenadantes da cultura de células filtradas, referindo-se a protocolos padrão.

14.4 DADOS ANALÍTICOS DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CD28

BIESPECÍFICO

[001156] As concentrações de proteínas purificadas foram determinadas por meio da medição da absorção a 280 nm com o uso do coeficiente de extinção em massa calculado com base na sequência de aminoácidos de acordo com Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423.

Pureza e peso molecular das proteínas foram analisados por CE-SDS na presença e ausência de um agente redutor com o uso de um LabChipGXII (Perkin Elmer). A determinação do teor de agregado foi realizada por cromatografia de HPLC a 25 °C com o uso de coluna analítica de exclusão de tamanho (TSKgel G3000 SW XL ou UP-SW3000) equilibrada em tampão de corrida (K2HPO4 25 mM, NaCl 125 mM, mono-hidrocloreto de L-arginina 200 mM, pH 6,7 ou KH2PO4, 200 mM, KCl 250 mM, pH 6,2 respectivamente). Um resumo dos parâmetros de purificação de todas as moléculas é fornecido na Tabela 36.

TABELA 36: RESUMO DA PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DAS MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CD28 13A A 13D SEC Analítico Rendimento Pureza medida por Molécula Descrição (HMW/Monômero/LMW) [mg/l] CE-SDS [%] [%] EPCAM (MT201) - 14A CD28 (SA_Variante 15) 34,6 8,28/91,72/0 94,24 1+1 HER3 (Lumretuzumab) - 14B CD28 (SA_Variante 15) 60,3 0,14/99,65/0,21 98,53 1+1 CD30 (Brentuximab)- 14C CD28 (SA_Variante 15) 24,4 0/99,45/0,5 94,06 1+1 TPBG (5T4) - CD28 14D 17,5 0/92,6/7,4 98,12 (SA_Variante 15) 1+1 EXEMPLO 15

CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL IN VITRO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO BIESPECÍFICAS DIRECIONADAS A CD28 E EPCAM, HER3, CD30 OU TPBG

15.1 LIGAÇÃO DE EPCAM-CD28 A CÉLULAS QUE EXPRESSAM EPCAM E CD28

[001157] A ligação de EpCAM-CD28 (Molécula 14A) com afinidade intermediária do clone CD28 Variante 15 (P1AE9051) a EpCAM foi testada usando células HT-29 (ATCC n° HTB-38) e a ligação a CD28 humano foi testada com células CHO que expressam humanos CD28 (linha celular parental CHO-k1 ATCC n° CCL-61, modificada para superexpressar estavelmente CD28 humano).

[001158] Para avaliar a ligação, as células foram colhidas, contadas, verificadas quanto à viabilidade e ressuspensas a 0.5 Mio/ml em tampão FACS (eBioscience, Cat n° 00-4222-26). As células 5E4 foram incubadas em placas de 96 poços de fundo redondo durante 1 h a 4 °C com concentrações crescentes do construto EpCAM-CD28 (10 pM - 500 nM). Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS frio,

incubadas por mais 30 min a 4 °C com PE de cabra anti-humano conjugado com PE (Jackson ImmunoReserach, Cat n° 109-116-098), lavadas duas vezes com tampão FACS frio, centrifugadas e ressuspensas em 85 ul de tampão FACS com DAPI (Roche, Cat n° 10236276001) diluído 1:10000. Para monitorar as interações de ligação inespecíficas entre construtos e células, um IgG anti- DP47 foi incluído como controle negativo. A ligação foi avaliada por citometria de fluxo com um FACS Fortessa (BD, Software FACS Diva). As curvas de ligação foram obtidas com o uso de GraphPadPrism7.

[001159] Os ensaios de ligação celular in vitro verificam que o anticorpo agonístico biespecífico EpCAM-CD28 (P1AE9051) se liga a CD28 humano (Figura 35A), bem como a EpCAM humano em células HT-29 (Figura 35B) de uma maneira dependente da concentração. Como esperado, nenhuma ligação foi detectada com o IgG anti-DP47, indicando que a detecção da ligação é devida à ligação específica de CD28 e EpCAM pelas respectivas frações de direcionamento.

15.2 CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL IN VITRO DA MOLÉCULA EPCAM-CD28 COM BASE NO ENSAIO REPÓRTER IL-2

[001160] Para avaliar a capacidade de EpCAM-CD28 (Molécula 14A) para suportar a ativação de células T mediada por anti-CD3, células repórter IL-2 (Promega, Cat n° J1651) serviram como células efetoras (linha de células T Jurkat que expressa um repórter de luciferase pelo promotor IL-2) e HT-29 serviram como alvos tumorais. As células alvo tumorais 1E4 foram incubadas em placas de 96 poços de fundo plano branco por 6 h a 37 °C com células repórter 5E4 IL-2 (E:T 5:1) na presença de anti-CD3 10 nM (eBioscience n° 16-0037-85) sozinho ou em combinação com concentrações crescentes do construto EpCAM-CD28 (24 pM - 100 nM). Antes da medição, as placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 15 min e, então, 100 µl de substrato (solução ONE-Glo, Promega, Cat n° E6120) foram adicionados às células. Após 10 min de incubação à temperatura ambiente no escuro, a luminescência (contagens/s) foi medida com um Tecan Spark 10M.

[001161] A ativação de células T em combinação com um estímulo anti-CD3 constante e subótimo foi avaliada. Para esse fim, células repórter de IL-2 Jurkat foram co-cultivadas com células HT29 que expressam EpCAM por 6h na presença de concentrações crescentes de EpCAM-CD28 (P1AE9051) e concentração limitante fixa de clone de IgG anti-CD3 OKT3 (10 nM). Conforme representado na Figura 35C, EpCAM-CD28 foi capaz de aumentar a ativação de células T, conforme avaliado pelo aumento da produção de IL-2 em células T expostas a estimulação de CD3 subótima de uma maneira dependente da concentração.

15.3 LIGAÇÃO DE HER3-CD28 A CÉLULAS QUE EXPRESSAM HER3 E CD28

[001162] A ligação de HER3-CD28 (Molécula 14B) com o clone CD28 de afinidade intermediária Variante 15 (P1AF0151) a HER3 foi testada com o uso de células T-47D (ATCC n° HTB-133) e a ligação a CD28 humano foi testada com células CHO que expressam humanos CD28 (linha celular parental CHO-k1 ATCC n° CCL-61, modificada para superexpressar estavelmente CD28 humano).

[001163] Para avaliar a ligação, as células foram colhidas, contadas, verificadas quanto à viabilidade e ressuspensas a 0.5 Mio/ml em tampão FACS (eBioscience, Cat n° 00-4222-26). As células 5E4 foram incubadas em placas de 96 poços de fundo redondo durante 1 h a 4 °C com concentrações crescentes do construto HER3-CD28 (10 pM - 500 nM). Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS frio, incubadas por mais 30 min a 4 °C com PE de cabra anti-humano conjugado com PE (Jackson ImmunoReserach, Cat n° 109-116-098), lavadas duas vezes com tampão FACS frio, centrifugadas e ressuspensas em 85 ul de tampão FACS com DAPI (Roche, Cat n° 10236276001) diluído 1:10000. Para monitorar as interações de ligação inespecíficas entre construtos e células, um IgG anti- DP47 foi incluído como controle negativo. A ligação foi avaliada por citometria de fluxo com um FACS Fortessa (BD, Software FACS Diva). As curvas de ligação foram obtidas com o uso de GraphPadPrism7.

ANÁLISE FACS

[001164] Para avaliar o nível relativo de HER3 na superfície de T-47D, as células 2E5 foram centrifugadas a 480xg por 5 min e lavadas com PBS. A coloração de superfície para HER3 (APC anti-humano, BioLegend n° 324708) foi realizada de acordo com as indicações do fornecedor. As células foram lavadas uma vez com 150 µl/poço de PBS e ressuspensas em 150 l/poço de PBS e analisadas com o uso de BD FACS Fortessa.

[001165] Ensaios de ligação de células in vitro verificam que o anticorpo agonístico biespecífico HER3-CD28 (Molécula 14B) se liga a CD28 humano (Figura 36A), bem como HER3 humano (Figura 36B) em células de uma maneira dependente da concentração. Como esperado, nenhuma ligação foi detectada com o IgG anti-DP47, indicando que a detecção da ligação é devida à ligação específica de CD28 e HER3 pelas respectivas frações de direcionamento.

15.4 CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL IN VITRO DA MOLÉCULA HER3-CD28 COM BASE NO ENSAIO REPÓRTER IL-2

[001166] Para avaliar a capacidade de HER3-CD28 (Molécula 14B) para suportar a ativação de células T mediada por anti-CD3, células repórter IL-2 (Promega, Cat n° J1651) serviram como células efetoras (linha de células T Jurkat que expressa um repórter de luciferase pelo promotor IL-2) e T-47D serviram como alvos tumorais. As células alvo tumorais 1E4 foram incubadas em placas de 96 poços de fundo plano branco por 6h a 37 °C com células repórter 5E4 IL-2 (E:T 5:1) na presença de anti-CD3 10 nM (eBioscience n° 16-0037-85) sozinho ou em combinação com concentrações crescentes do construto HER3-CD28 (24 pM - 100 nM). Antes da medição, as placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 15 min e, então, 100 ul de substrato (solução ONE-Glo, Promega, Cat n° E6120) foram adicionados às células. Após 10 min de incubação à temperatura ambiente no escuro, a luminescência (contagens/s) foi medida com um Tecan Spark 10M.

[001167] A ativação de células T em combinação com um estímulo anti-CD3 constante e subótimo foi avaliada. Para esse fim, células repórter de IL-2 Jurkat foram co-cultivadas com células HT29 que expressam EpCAM por 6h na presença de concentrações crescentes de HER3-CD28 (P1AF0151) e concentração limitante fixa de clone de IgG anti-CD3 OKT3 (10 nM). Conforme representado na Figura 36C, EpCAM-CD28 foi capaz de aumentar a ativação de células T, isto é, a produção de IL-2 em células T expostas a estimulação de CD3 subótima de uma maneira dependente da concentração.

15.5 CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL IN VITRO DE ANTICORPOS AGONÍSTICOS TPBG- CD28 E CD30-CD28 EM UM ENSAIO DE PBMC

[001168] A capacidade de TPBG(5T4)-CD28 (Molécula 14D) e CD30-CD28 (Molécula 14C) de aumentar a ativação de células T mediada por estimulação anti-CD3 será avaliada com células T de PBMC primárias de doadores saudáveis como células efetoras e que expressam 5T4 células alvo, como JIMT-1, NCI-H1975, NCI-N87 e células Calu-1, ou células alvo que expressam CD30, como KARPAS-299, respectivamente. Em tal ensaio, as células alvo do tumor 1E4 serão incubadas em placas de 96 poços de fundo redondo por 5 dias a 37 °C com 1E5 (E:T 10:1) na presença de concentração subótima de anti-CD3 (eBioscience n° 16- 0037-85, clone OKT3) sozinho ou em combinação com concentrações crescentes dos construtos agonísticos de CD28 (24 pM - 100 nM). A funcionalidade das moléculas alvo de CD28 será avaliada por citometria de fluxo, medindo marcadores de ativação de células T

(CD25, CD69) e proliferação de células T (diluição CFSE).

EXEMPLO 16

GERAÇÃO E PRODUÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD28 E UM ANTÍGENO DE SUPERFÍCIE CELULAR DE MIELOMA MÚLTIPLO (MM)

16.1 CLONAGEM DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD28 E UM ANTÍGENO DE SUPERFÍCIE CELULAR DE MIELOMA MÚLTIPLO (MM)

[001169] Para a geração dos plasmídeos de expressão, as sequências dos respectivos domínios variáveis foram usadas e subclonadas em estrutura com as respectivas regiões constantes que estão pré-inseridas no respectivo vetor de expressão de mamífero receptor. No domínio Fc, as mutações Pro329Gly, Leu234Ala e Leu235Ala (PG-LALA) foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas de IgG1 humana para anular a ligação aos receptores Fc gama de acordo com o método descrito na Publicação de Pedido de Patente Internacional n° WO 2012/130831. Para a geração de anticorpos biespecíficos, os fragmentos Fc continham o “knob” (mutações S354C/T366W, numeração de acordo com o índice EU de Kabat) ou mutações “hole” (mutações Y349C/T366S/L368A/Y407V de acordo com o índice EU de Kabat) para evitar emparelhamento incorreto das cadeias pesadas. A fim de evitar o pareamento incorreto de cadeias leves nas moléculas de ligação ao antígeno biespecífico, a troca de domínios VH/VL ou CH1/Ckappa foi introduzida em uma fração de ligação (tecnologia CrossFab).

[001170] O anticorpo anti-GPRC5D 5E11 é uma versão humanizada do clone 5E11 conforme descrito no documento WO 2019/154890

A1. Anticorpos anti-CD38, por exemplo, daratumumabe, são divulgados no documento WO 2006/99875 A1. A geração e preparação de anticorpos anti- BCMA são descritas no documento WO 2016/166629 A1.

[001171] As seguintes moléculas foram clonadas, uma ilustração esquemática das mesmas é mostrada nas Figuras 37A a 37C:

[001172] Molécula 16A: GPRC5D (5E11)-CD28 (SA_Variante 15) formato 1+1, moléculas crossFab huIgG1 PG-LALA biespecífica com troca VH/VL no fragmento Fab CD28(SA_Variante 15) (knob) e modificações carregadas no fragmento Fab GPRC5D(5E11) (hole) (Figura 37A) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 366, 367, 398 e 399 (P1AF1272).

[001173] Molécula 16B: GPRC5D (5E11)-CD28(SA_Variante 8) formato 1+1, molécula biespecífica de huIgG1 PG-LALA CrossFab com modificações carregadas no fragmento Fab de CD28(SA_Variante 15) (knob) e troca VH/VL no fragmento Fab de GPRC5D(5E11) (hole) (Figura 37A) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 364, 365, 398 e 399 (P1AF2954).

[001174] Molécula 16C: CD38 (Daratumumabe)- CD28(SA_Variante 15) formato 1+1, molécula biespecífica de huIgG1 PG- LALA CrossFab com modificações carregadas no fragmento Fab de CD28(SA_Variante 15) (knob) e troca VH/VL no fragmento Fab anti-CD38 (hole) (Figura 37B) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 357, 358, 400 e 401 (P1AE9038).

[001175] Molécula 16D: anti-BCMA-CD28 (SA_Variante 15) formato 1+1, molécula crossFab huIgG1 PG-LALA biespecífica com troca VH/VL no fragmento Fab CD28(SA_Variante 15) (knob) e modificações carregadas no fragmento Fab de anti-BCMA (hole) (Figura 34A) que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 366, 367, 402 e

403 (P1AE9053).

16.2 PRODUÇÃO DAS MOLÉCULAS

[001176] A expressão das moléculas acima mencionadas é conduzida por um promotor MPSV quimérico ou um promotor CMV. A poliadenilação é conduzida por uma sequência de sinal poliA sintética localizada na extremidade 3’ do CDS. Além disso, cada vetor contém uma sequência EBV OriP para replicação autossômica.

[001177] Os anticorpos e anticorpos biespecíficos foram gerados por transfecção transitória de células HEK293 EBNA ou células CHO EBNA. As células foram centrifugadas e o meio foi substituído por meio CD CHO pré-aquecido (Thermo Fisher, Cat n° 10743029). Os vetores de expressão foram misturados em meio CD CHO, PEI (Polietilenimina, Polysciences, Inc, Cat n° 23966-1) foi adicionado, a solução agitada com vórtice e incubada durante 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, as células (2 Mio/ml) foram misturadas com a solução de vetor/PEI, transferidas para um frasco e incubadas por 3 horas a 37 °C em uma incubadora com agitação com uma atmosfera de CO2 a 5%. Após a incubação, meio Excell com suplementos (80% do volume total) foi adicionado (W. Zhou e A. Kantardjieff, Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, DOI: 10.1007/978-3-642- 54050-9; 2014). Um dia após a transfecção, foram adicionados suplementos (alimentação, 12% do volume total). Os sobrenadantes celulares foram colhidos após 7 dias por centrifugação e filtração subsequente (filtro de 0,2 μm), e as proteínas foram purificadas do sobrenadante colhido por métodos padrão conforme indicado abaixo.

[001178] Alternativamente, os anticorpos e anticorpos biespecíficos descritos no presente documento foram preparados por Evitria com o uso de seu sistema de vetor proprietário com técnicas de clonagem convencionais (não baseadas em PCR) e com o uso de células CHO K1 adaptadas a suspensão (originalmente recebidas de ATCC e adaptadas para crescimento livre de soro em suspensão cultura em Evitria). Para a produção, a Evitria usou seus meios proprietários sem componentes de animais e sem soro (eviGrow e eviMake2) e seu reagente de transfecção exclusivo (eviFect). O sobrenadante foi colhido por centrifugação e filtração subsequente (filtro de 0,2 μm) e as proteínas foram purificadas do sobrenadante colhido por métodos padrão

16.3 PURIFICAÇÃO DAS MOLÉCULAS

[001179] As proteínas foram purificadas a partir de sobrenadantes da cultura de células filtradas, referindo-se a protocolos padrão.

16.4 DADOS ANALÍTICOS DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CD28

BIESPECÍFICO

[001180] As concentrações de proteínas purificadas foram determinadas por meio da medição da absorção a 280 nm com o uso do coeficiente de extinção em massa calculado com base na sequência de aminoácidos de acordo com Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423.

Pureza e peso molecular das proteínas foram analisados por CE-SDS na presença e ausência de um agente redutor com o uso de um LabChipGXII ou LabChip GX Touch (Perkin Elmer). A determinação do teor de agregado foi realizada por cromatografia de HPLC a 25 °C com o uso de coluna analítica de exclusão de tamanho (TSKgel G3000 SW XL ou UP-SW3000) equilibrada em tampão de corrida (K2HPO4 25 mM, NaCl 125 mM, mono-hidrocloreto de L- arginina 200 mM, pH 6,7 ou KH2PO4, 200 mM, KCl 250 mM, pH 6,2 respectivamente). Um resumo dos parâmetros de purificação das moléculas é fornecido na Tabela 37.

TABELA 37: RESUMO DA PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DAS MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CD28 16A A 16D SEC Analítico Pureza Rendimento Molécula Descrição (HMW/Monômero/LMW) medida por [mg/l] [%] CE-SDS [%] GPRC5D (5E11) - CD28 16A 46,89 0,73/97,68/1,59 93,44 (SA_Variante 15) 1+1 GPRC5D (5E11) - CD28 16B 89,84 2,99/95,26/1,75 88,76 (SA_Variante 8) 1+1 CD38 (Daratumumabe)- 16C 56,55 0,29/99,71/0 93,96 CD28 (SA_Variante 15) 1+1 BCMA - CD28 16D 87,6 1,75/98,25/0 94,33 (SA_Variante 15) 1+1 EXEMPLO 17

CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL IN VITRO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD28 E UM ANTÍGENO DE SUPERFÍCIE CELULAR DE MIELOMA MÚLTIPLO (MM)

17.1 LIGAÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD28 E UM ANTÍGENO DE SUPERFÍCIE CELULAR DE MIELOMA MÚLTIPLO (MM) ÀS CÉLULAS, SUPEREXPRESSANDO O ALVO INDICADO

[001181] Para medir a ligação a GPRC5D, BCMA, CD38 ou CD28, realizou-se um ensaio de ligação baseado em FACS em linhas de células de mieloma múltiplo relatadas (Lombardi et al., Molecular characterization of human multiple myeloma cell lines by integrative genomics: insights into the biology of the disease; Genes Chromosomes Cancer. 2007, 46 (3), 226-38) ou transfectantes CHO, que foram transduzidos para superexpressar de forma estável GPRC5D humano ou CD28 humano: a ligação a BCMA foi avaliada, com o uso de células IM-9 (ATCC® CCL-159), a ligação a CD38 foi avaliada, com o uso de células OCI-Ly18 (DSMZ ACC 699), a ligação a GPRC5D foi avaliada, com o uso de células CHO-hGPRC5D e a ligação a O CD28 foi avaliado com o uso de células CHO-hCD28.

[001182] IM-9 e OCI-Ly18 foram cultivados de acordo com as instruções do fabricante, os transfectantes CHO estáveis (linha celular parental CHO-k1 ATCC n° CCL-61) foram cultivados em F-12K, suplementado com FCS 10%. Resumidamente, as células em suspensão foram colhidas, contadas e verificadas quanto à viabilidade. As células CHO aderentes foram separadas com o uso do tampão de dissociação celular (Gibco), contadas e verificadas quanto à viabilidade. Todas as etapas subsequentes foram realizadas a 4 °C.

[001183] As células foram lavadas em tampão FACS uma vez (PBS, soro fetal bovino a 2%; EDTA 0,5m a 1% pH 8; NaN3 azida de sódio a 0,25%) e ressuspensas em tampão FACS a 1 Mio células por ml. Células 0,1 Mio foram semeadas por poço de uma placa de 96 poços de fundo redondo, lavadas com tampão FACS mais uma vez e os sobrenadantes foram descartados. As células foram coradas em um volume total de 50 ul por poço e concentrações crescentes das moléculas biespecíficas CD28 indicadas (0,07 - 300 nM) por 30 minutos a 4 °C. As células foram lavadas duas vezes com tampão FACS e incubadas por 30 min a 4 °C em um total de 25 ul por poço, contendo o anticorpo secundário pré-diluído (Alexa Fluor 488-AffiniPure F(ab’)2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (Jackson Immunoresearch, 109-546-008, diluído 1:100 em tampão FACS, respectivo 109-606-008 PE, Jackson Immunoresearch, diluído 1:100 em tampão FACS, como indicado). As células foram lavadas duas vezes e analisadas em um citômetro de fluxo BD Fortessa, equipado com o software FACS Diva. Curvas de ligação e valores de EC50 foram obtidos com o uso de GraphPadPrism6.

[001184] As Figuras 38A a 38F mostram que todas as moléculas de CD28 biespecíficas são capazes de se ligar a CD28 (A) humano, bem como ao respectivo segundo alvo, ou seja, CD38 humano, BCMA humano ou GPRC5D humano de uma maneira dependente da concentração.

Resumidamente, a molécula GPRC5D-CD28 tem o EC50 mais baixo para a ligação a CD28 humano (Tabela 37), mas atinge a ligação máxima mais baixa em comparação com as outras duas moléculas biespecíficas de CD28.

[001185] Ambas as moléculas de CD28 direcionadas a CD38 e BCMA mostram ligação dependente da concentração a CD38 e BCMA, respectivamente, e atingem a saturação na faixa de concentração avaliada (os valores de ligação de EC50 estão resumidos na Tabela 38). Em contraste, a molécula GPRC5D-CD28 está se ligando de maneira dependente da concentração, mas não atinge a saturação na mesma faixa de concentração, indicando uma afinidade mais baixa do GPRC5D versus o ligante CD38 ou BCMA, incluído nessas moléculas.

TABELA 38: VALORES DE EC50 (NM) PARA A LIGAÇÃO DAS MOLÉCULAS DE CD28 BIESPECÍFICAS INDICADAS A CD28 HUMANO OU AOS RESPECTIVOS ANTÍGENOS ALVO MM, EXPRESSOS NAS CÉLULAS Molécula EC50 Ligação a CD28 (nM) EC50 Ligação a CD38/BCMA/GPRC5D (nM) CD38-CD28 26,8 4,3 BCMA-CD28 9,9 3,96 GPRC5D-CD28 4,7 - 5,2 não calculado (SA_variante 15) GPRC5D-CD28 (SA_ 74,2 não calculado variante 8)

17.2 CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL IN VITRO COM BASE NO ENSAIO REPÓRTER IL-2 (CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DA ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T)

[001186] Para avaliar a capacidade das moléculas de ligação ao antígeno biespecífico CD38-CD28, BCMA-CD28 e GPRC5D-CD28 para apoiar a ativação de células T mediada por TCB, células repórter IL-2 (Promega, Ca n° J1651) foram usadas como células efetoras (células T Jurkat linha que expressa um repórter de luciferase conduzido pelo promotor IL-2) e células NCI-H929, sendo positivas para CD38, BCMA, bem como GPRC5D como alvos tumorais.

[001187] Resumidamente, 5 x103 células-alvo tumorais foram incubadas em placas de 384 poços de fundo plano branco (Microplaca tratada com cultura de tecido de fundo plano com 384 poços 353988 Falcon™) por 5 h, respectivas 22 h a 37 °C com 2,5 x104 células repórter IL-2 (E:T 5:1) na presença de GPRC5D-TCB 1 nM sozinho ou em combinação com concentrações crescentes das moléculas biespecíficas de CD28 (12,2 - 50 nM).

Antes da medição, as placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 15 min e, então, 20 ul de substrato (solução ONE-Glo, Promega, Cat n° E6120) foram adicionados às células. Após 10 min de incubação à temperatura ambiente no escuro, a Luminescência (contagens/s) foi medida com um Tecan Spark 10M.

[001188] Conforme representado nas Figuras 39A a 39F, nenhuma das moléculas CD28 direcionadas a MM induz a ativação da célula repórter IL2 Jurkat na ausência de um sinal TCB (linha cinza brilhante, Figuras 39A- 9F). Como esperado, com essas células repórter IL-2, também não há indução significativa de ativação da célula repórter na presença de 1 nM GPRC5D TCB, nem no ponto de tempo inicial (5h), nem no ponto de tempo posterior (após 22h).

[001189] No entanto, todas as moléculas direcionadas ao MM são capazes de induzir ativação significativa dependente da concentração e do tempo de células repórter de IL-2 na presença de GPRC5D-TCB 1 nM.

Enquanto as moléculas CD38-CD28 e BCMA-CD28 são capazes de induzir a ativação da célula repórter IL2 já após 5 h (Figuras 39A e 39C), GPRC5D- CD28 atinge níveis máximos de ativação semelhantes apenas no ponto de tempo posterior avaliado (22 h, Figura 39F), indicando diferentes cinéticas de atividade.

[001190] O anticorpo biespecífico anti-GPRC5D/anti-CD3 (GPRC5D TCB, Figura 37D) usado nos experimentos foi preparado em analogia com CEACAM5 TCB como descrito no Exemplo 8 e no documento WO 2016/079076 A1. GPRC5D TCB compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:404 e SEQ ID NO:405.

17.3 LISE MEDIADA POR CÉLULAS T DA LINHA CELULAR DE MIELOMA MÚLTIPLO

[001191] Para avaliar a capacidade de CD38-CD28, BCMA- CD28 e GPRC5D-CD28 para reforçar a lise mediada por TCB de GPRC5D de uma linha celular de mieloma múltiplo, 1,5x105 células efetoras pan T humanas foram incubadas com 3x104 células alvo NCI-H929 em uma razão final E:T de 1:1 por aproximadamente 22 h. As células Pan T foram isoladas de PBMCs por MACS, com o uso do kit de isolamento de células Pan T (Miltenyi Biotec, Cat n° 130-096-535) de acordo com as instruções do fabricante. GPRC5D TCB foi adicionado em concentrações crescentes (0,064 pM - 1 nM), as diferentes moléculas de ligação ao antígeno biespecífico CD28 direcionadas a MM foram adicionadas a uma concentração fixa de 0,2 nM. A lise de células tumorais foi avaliada como segue: As placas de ensaio foram centrifugadas durante 5 minutos e 50 ul de sobrenadante por poço foram transferidos para uma nova placa de 96 poços de fundo plano. Para normalização, a lise máxima das células alvo (= 100%) foi induzida pela incubação das células alvo com uma concentração final de 1% Triton X-100. Lise mínima (= 0%) refere-se a células alvo co-incubadas com células efetoras, mas sem qualquer construto biespecífico ou TCB. Após uma incubação de um dia para o outro de cerca de 22 h a 37 °C, CO2 a 5%, a liberação de LDH de células alvo apoptóticas/necróticas no sobrenadante foi medida com o uso do kit de detecção de LDH (Roche Applied Science, n°11 644 793 001), de acordo com as instruções do fabricante.

[001192] Conforme ilustrado nas Figuras 40a a 40C, o GPRC5D TCB induz a lise dependente da concentração de células NCI-H929.

Todas as três moléculas de ligação do antígeno biespecífico CD28 direcionadas a MM avaliadas são capazes de aumentar significativamente a eficácia em comparação com a monoterapia TCB, quando administrada a uma concentração fixa de 0,2 nM. Além disso, nenhuma das moléculas de ligação ao antígeno biespecífico CD28 direcionadas a MM está induzindo a lise de células tumorais na ausência de TCB, o que suporta a dependência das moléculas direcionadas a MM no sinal de TCB.

[001193] A Tabela 39 resume os valores de EC50, bem como a área sob a curva derivada dos dados mostrados nas Figuras 40A-40C.

Valores EC50 foram calculados com o uso de GraphPadPrism6.

TABELA 39: VALORES EC50 (NM) DE MORTE MEDIADA POR TCB ANTI-GPRC5D GPRC5D TCB + CD38-CD28 + BCMA-CD28 + GPRC5D-CD28 EC50 lise após 22 h 1,86 3,1 3,7 3,3 (pM) Área sob a curva 21,3 44,8 46,3 46,8 EXEMPLO 18

GERAÇÃO E PRODUÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO BIESPECÍFICAS DIRECIONADAS A CD28 E CD19 OU CD79B

18.1 CLONAGEM DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD28 E CD19 OU CD79B

[001194] A geração e preparação de anticorpos CD19 são reveladas no documento WO 2017/55541 A1 ou WO 2017/55328 A1. Em particular, o clone CD19 2B11 é descrito no documento WO 2017/55328 A1, que é incorporado no presente documento a título de referência. O clone CD79b huMA79b.v28 (correspondendo a polatuzumab), como usado no presente documento, é descrito no documento WO 2009/012268 A. Para a geração dos respectivos plasmídeos de expressão, as sequências dos respectivos domínios variáveis foram usadas e subclonadas no quadro com os respectivos regiões constantes que são pré-inseridas no respectivo vetor de expressão de mamífero receptor. Uma descrição esquemática das moléculas resultantes é mostrada nas Figuras 41A e 41B, respectivamente. As mutações Pro329Gly, Leu234Ala e Leu235Ala (PG-LALA) foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas de IgG1 humana para anular a ligação aos receptores Fc gama. Para a geração de anticorpos biespecíficos assimétricos, os fragmentos Fc continham as mutações “knob” ou “hole” para evitar o pareamento incorreto das cadeias pesadas. A fim de evitar o pareamento incorreto de cadeias leves em construtos de anticorpos bi e multiespecíficos, a troca de domínios VH/VL ou CH1/Ckappa foi introduzida em uma fração de ligação (tecnologia CrossFab). Em outra fração de ligação, cargas foram introduzidas nos domínios CH1 e Ckappa.

[001195] As seguintes moléculas foram clonadas, uma ilustração esquemática das mesmas é mostrada nas Figuras 41A e 41B:

[001196] Molécula 18A: CD19 (8B8-2B11) - CD28 (SA_v29) 1+1, moléculas crossFab huIgG1 PG-LALA biespecífica com modificações de carga no CD28 v29 Fab (knob) e troca VH/VL no CD19 (2B11) Fab (hole) (Figura 41A). A molécula compreende as sequências de aminoácidos da cadeia pesada das SEQ ID NO: 118 e 430 e as sequências de aminoácidos da cadeia leve das SEQ ID NO: 65 e 431 (P1AE8002).

[001197] Molécula 18B: CD19 (8B8-2B11) - CD28 (SA_v15) 1+1, moléculas crossFab huIgG1 PG-LALA biespecífica com modificações de carga no CD28 v15 Fab (knob) e troca VH/VL no CD19 (2B11) Fab (hole) (Figura 41A). A molécula compreende as sequências de aminoácidos da cadeia pesada das SEQ ID NO: 116 e 430 e as sequências de aminoácidos da cadeia leve das SEQ ID NO: 121 e 431 (P1AE9040).

[001198] Molécula 18C: CD19 (8B8-2B11) - CD28 (SA_v8) 1+1, moléculas crossFab huIgG1 PG-LALA biespecífica com modificações de carga no CD28 v8 Fab (knob) e troca VH/VL no CD19 (2B11) Fab (hole) (Figura 41A). A molécula compreende as sequências de aminoácidos da cadeia pesada das SEQ ID NO: 114 e 430 e as sequências de aminoácidos da cadeia leve das SEQ ID NO: 122 e 431 (P1AF0175).

[001199] Molécula D: CD19 (8B8-2B11) - CD28 (SA_v11) 1+1, moléculas crossFab huIgG1 PG-LALA biespecífica com modificações de carga no CD28 v11 Fab (knob) e troca VH/VL no CD19 (2B11) Fab (hole) (Figura 2B). A molécula compreende as sequências de aminoácidos da cadeia pesada das SEQ ID NO: 114 e 430 e as sequências de aminoácidos da cadeia leve das SEQ ID NO: 65 e 431 (P1AF0377).

[001200] Molécula E: CD19 (8B8-2B11) - CD28 (SA_v27) 1+1, moléculas crossFab huIgG1 PG-LALA biespecífica com modificações de carga no CD28 v27 Fab (knob) e troca VH/VL no CD19 (2B11) Fab (hole) (Figura 2B). A molécula compreende as sequências de aminoácidos da cadeia pesada das SEQ ID NO: 118 e 430 e as sequências de aminoácidos da cadeia leve das SEQ ID NO: 123 e 431 (P1AF0378).

[001201] Molécula F: CD79b (huMA79b.v28) - CD28 (SA_v15) 1+1, moléculas crossFab huIgG1 PG-LALA biespecífica com modificações de carga no CD28 v15 Fab (knob) e troca VH/VL no CD79b (huMA79b.v28) Fab (hole) (Figura 2C). A molécula compreende as sequências de aminoácidos da cadeia pesada das SEQ ID NO: 116 e 432 e as sequências de aminoácidos da cadeia leve das SEQ ID NO: 121 e 433 (P1AE9039).

18.2 PRODUÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD28 E CD19 OU CD79B

[001202] A expressão das moléculas acima mencionadas é conduzida por um promotor CMV. A poliadenilação é conduzida por uma sequência de sinal poliA sintética localizada na extremidade 3’ do CDS. Além disso, cada vetor contém uma sequência EBV OriP para replicação autossômica.

[001203] Para a produção de todos os construtos, células HEK293-EBNA que crescem em suspensão foram transientemente co- transfectadas com os respectivos vetores de expressão com o uso de polietilenimina como reagente de transfecção. As células foram centrifugadas e o meio substituído por meio CD CHO pré-aquecido. Os vetores de expressão foram misturados em meio CD CHO, PEI foi adicionado, a solução agitada em vórtice e incubada por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, as células foram misturadas com a solução de DNA/PEI, transferidas para frasco agitador e incubadas por 3 horas a 37 ° C em incubadora com atmosfera de 5% de CO2. Após a incubação, meio Excell com suplementos foi adicionado (Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, Editores: Weichang Zhou, Anne Kantardjieff). Um dia após os suplementos de transfecção (Ração) foram adicionados (Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, Editores: Weichang Zhou, Anne Kantardjieff). Os sobrenadantes celulares foram colhidos após 7 dias por centrifugação e filtração subsequente (filtro de 0,2 μm) e purificados por métodos padrão.

18.3 PURIFICAÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD28 E CD19 OU CD79B

[001204] As proteínas foram purificadas a partir de sobrenadantes da cultura de células filtradas, referindo-se a protocolos padrão.

18.4 DADOS ANALÍTICOS DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS OU TRIESPECÍFICOS DIRECIONADOS A CD28 E CD19 OU CD79B

[001205] A concentração de proteína de construtos purificados foi determinada medindo a densidade óptica (OD) a 280 nm, com uso do coeficiente de extinção de massa calculado com base na sequência de aminoácidos de acordo com Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423.

Pureza e peso molecular das proteínas foram analisados por CE-SDS na presença e ausência de um agente redutor com o uso de um LabChipGXII (Perkin Elmer). A determinação do teor de agregado foi realizada por cromatografia de HPLC a 25 °C com o uso de coluna analítica de exclusão de tamanho (TSKgel G3000 SW XL ou UP-SW3000) equilibrada em tampão de corrida (K2HPO4 25 mM, NaCl 125 mM, mono-hidrocloreto de L-arginina 200 mM, pH 6,7 ou KH2PO4, 200 mM, KCl 250 mM, pH 6,2 respectivamente). Um resumo dos parâmetros de purificação de todas as moléculas é fornecido na Tabela 40.

TABELA 40: RESUMO DA PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE MOLÉCULAS BIESPECÍFICAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CD28 SEC Analítico Rendimento Pureza medida por Molécula Descrição (HMW/Monômero/LMW) [mg/l] CE-SDS [%] [%] CD19 (2B11) - CD28 18A 24,9 1,45/98,55/0 96,25 (v29) 1+1 CD19 (2B11) - CD28 18B 45,05 0/99,1/0,9 98,78 (v15) 1+1 CD19 (2B11) - CD28 18C 22,06 2,08/96,67/1,25 93,11 (v8) 1+1 CD19 (2B11) - CD28 18D 40,9 0/98,9/1,1 97,1 (v11) 1+1 CD19 (2B11) - CD28 18E 41,7 0,49/98,9/0,61 90,9 (v27) 1+1

SEC Analítico Rendimento Pureza medida por Molécula Descrição (HMW/Monômero/LMW) [mg/l] CE-SDS [%] [%] CD79b 18F (huMA79b.v28) - 20,6 1,31/98,34/0,35 94,43 CD28 (v15) 1+1 EXEMPLO 19

ANÁLISE DE LIGAÇÃO E CINÉTICA DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD28 E CD19 OU CD79B

19.1 ANÁLISE CINÉTICA DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD79B

[001206] Afinidade (KD) de huMA79b.v28 para CD79b-His recombinante (Sinobiological n° 29750-H08H) foi medida por SPR por ressonância plasmônica de superfície com o uso de uma máquina Biacore T200. Para a captura de CD79b-His, um anticorpo anti-penta HIS foi acoplado a uma célula de fluxo de um chip CM5 por acoplamento de amina. Níveis de imobilização de aprox. 5000 unidades foram usados. CD79b-His foi, então, diluído para uma concentração de 1 nM e foi capturado pelo anticorpo anti- penta HIS durante 10 s a uma taxa de fluxo de 10 l/min.

[001207] Para a determinação da afinidade (KD) da Molécula F purificada (CD79b (huMA79b.v28) - CD28 (SA_variante 15) 1+1) uma série de diluição de duas vezes da molécula de ligação ao antígeno purificado (variando a concentração varia entre 125 e 0,49 nM) foram injetados a 30 μl/min com um tempo de associação de 180 s e um tempo de dissociação de 400 s. Tampão HBS-EP+buffer (tampão padrão GE-Healthcare BR-1006-69 1:10 diluído) foi injetado para referência. A regeneração foi realizada com glicina 10 mM pH 2,1 por 2x60 s. As constantes da taxa de associação (kon) e as constantes da taxa de dissociação (koff) foram calculadas com o uso de um modelo de ligação Langmuir simples um-para-um, ajustando simultaneamente os sensorgramas de associação e dissociação (Figura 42). A constante de dissociação de equilíbrio (KD) foi calculada como a razão koff/kon. Os resultados são mostrados na Tabela 41, abaixo. A afinidade da Molécula F (CD79b (huMA79b.v28) - CD28 (SA_variante 15) 1+1) com CD79b-His é 76 nM.

TABELA 41: CARACTERIZAÇÃO DA LIGAÇÃO DE HUMA79B.V28 A CD79B-HIS

SOLÚVEL RECOMBINANTE clone k on (1/Ms) k off (1/s) KD (nM) huMA79b.v28 2,57E+5 1,95E-2 76

19.2 ANÁLISE CINÉTICA DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD28

[001208] A afinidade (KD) das moléculas de ligação ao antígeno biespecífico produzidas a CD28 foi medida por SPR com o uso de um instrumento ProteOn XPR36 (Biorad) a 25 °C com antígeno huCD28-Fc biotinilado imobilizado em chips NLC por captura de neutravidina. Imobilização de antígenos recombinantes (ligante): O antígeno foi diluído com PBST (fosfato 10 mM, cloreto de sódio 150 mM pH 7,4, Tween 20 a 0,005%) para 10 μg/ml, então, injetado a 30 μl/minuto em tempos de contato variáveis, para atingir níveis de imobilização de cerca de 200, 400 ou 800 unidades de resposta (RU) na orientação vertical. Injeção de analitos: Para medições de cinética única, a direção da injeção foi alterada para orientação horizontal, séries de diluição dupla de variantes de afinidade anti-CD28 direcionadas a CD19 biespecífico purificado (variando os intervalos de concentração entre 50 e 3,125 nM) foram injetadas simultaneamente a 50 μl/min ao longo de canais separados 1-5, com tempos de associação de 150s e tempos de dissociação de 450s. O tampão (PBST) foi injetado ao longo do sexto canal para fornecer um espaço em branco “em linha” para referência. As constantes de taxa de associação (kon) e as constantes de taxa de dissociação (koff) foram calculadas com o uso de um modelo de ligação Langmuir simples um-para-um no software ProteOn Manager v3.1, ajustando simultaneamente os sensorgramas de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (KD) foi calculada como a razão koff/kon. Os clones analisados revelaram valores KD em uma faixa ampla (entre 1 e 50 nM).

EXEMPLO 20 LIGAÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO DE CD28 BIESPECÍFICO A CÉLULAS QUE EXPRESSAM CD28 E CD19- OU CD79B-

[001209] A ligação a CD28 humano foi testada com células CHO que expressam CD28 humano (linha celular parental CHO-k1 ATCC n° CCL-61, modificada para superexpressar CD28 humano de forma estável).

[001210] Os construtos variantes monovalentes de CD28 tipo IgG de um braço mostraram diferenças na ligação, como pode ser visto nas Figuras 4A a 4C.

[001211] A ligação a CD19 e CD79b foi testada usando linhas de células B expressando diferentes níveis de CD19 e CD79b: Nalm6 (DSMZ n° ACC 128), RCK8 (DSMZ n° ACC 561), WSU DLCL2 (DSMZ n° ACC 575) e

Z138 (presente de M. Dyer, Univ. of Leicester).

[001212] Para avaliar a ligação, as células foram colhidas, contadas, verificadas quanto à viabilidade e ressuspensas a 0.5 Mio/ml em tampão FACS (eBioscience, Cat n° 00-4222-26). As células 5E4 foram incubadas em placas de 96 poços de fundo redondo durante 1 h a 4 °C com concentrações crescentes dos construtos CD19-CD28 (ou CD79b-CD28) (10 pM - 500 nM). Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS frio, incubadas por mais 30 min a 4 °C com PE de cabra anti-humano conjugado com PE (Jackson ImmunoReserach, Cat n° 109-116-098), lavadas duas vezes com tampão FACS frio, centrifugadas e ressuspensas em 85 ul de tampão FACS com DAPI (Roche, Cat n° 10236276001) diluído 1:10000. Para monitorar as interações de ligação inespecíficas entre construtos e células, um IgG anti-DP47 foi incluído como controle negativo. A ligação foi avaliada por citometria de fluxo com um FACS Fortessa (BD, Software FACS Diva). As curvas de ligação foram obtidas com o uso de GraphPadPrism7. Uma comparação da ligação de CD19-CD28 v15 às diferentes linhas de células B é mostrada nas Figuras 43A e 43B.

ANÁLISE FACS

[001213] Para avaliar o nível relativo de CD19 na superfície das linhas de células B (Nalm6, RCK8, WSU DLCL2 e Z138), as células foram bloqueadas com Fc antes da coloração com o uso de Human Fc Block (BD, Cat n° 564220), então 2x 105 células foram centrifugadas a 480xg por 5 min e lavadas com PBS. A coloração de superfície para CD19 (BV650 anti-humano, BioLegend n° 302238) foi realizada de acordo com as indicações do fornecedor. As células foram lavadas uma vez com 150 l/poço de PBS e ressuspensas em 150 l/poço de PBS e analisadas com o uso de BD FACS Fortessa.

[001214] Os ensaios de ligação celular in vitro verificaram que todos os anticorpos agonísticos CD19-CD28 se ligam ao CD19 humano, bem como a CD28 humano nas células de uma maneira dependente da concentração (Figuras 44A e 44B). Como esperado, nenhuma ligação foi detectada com o IgG anti-DP47, indicando que a detecção da ligação é devida à ligação específica de CD28 e CD19 pelas respectivas frações de direcionamento. Os valores de EC50 para a ligação a CD28 são mostrados na Tabela 42 e os valores de EC50 para a ligação ao CD19 são mostrados na Tabela 43.

TABELA 42: VALORES EC50 DE ANTICORPOS AGONÍSTICOS CD19-CD28 PARA LIGAÇÃO A CD28 ID Moléculas EC50 (nM) P1AF0175 CD19-CD28 v8 232 P1AF0377 CD19-CD28 v11 150,4 P1AE9040 CD19-CD28 v15 15,55 P1AF0378 CD19-CD28 v27 10,75 P1AE8002 CD19-CD28 v29 6,646 TABELA 43: VALORES EC50 DE ANTICORPOS AGONÍSTICOS CD19-CD28 PARA LIGAÇÃO A CD19 ID Moléculas EC50 (nM) P1AF0175 CD19-CD28 v8 0,2324 P1AF0377 CD19-CD28 v11 0,3631 P1AE9040 CD19-CD28 v15 0,416 P1AF0378 CD19-CD28 v27 0,368 P1AE8002 CD19-CD28 v29 0,2742 EXEMPLO 21

CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL IN VITRO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO DE CD28 BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD19 OU CD79B

[001215] Vários ensaios in vitro baseados em células foram realizados com PBMCs humanos primários para avaliar a atividade de CD28(SA) e moléculas de ligação ao antígeno CD28 direcionado a CD19 ou CD79b biespecífico na presença e ausência de sinais de TCR fornecidos por anticorpos biespecíficos de células T (TCB). Proliferação de células T,

secreção de citocinas e morte de células tumorais conforme determinado por citometria de fluxo, citocina ELISA e imagem de células vivas foram obtidas como leituras.

ISOLAMENTO DE PBMC

[001216] As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram preparadas por centrifugação em gradiente de densidade a partir de preparações de linfócitos enriquecidos de sangue heparinizado obtido de Buffy Coat (Blutspende Zürich). 25 ml de sangue (diluído 1: 2 em PBS) foram colocados em camadas sobre 15 ml de lymphoprep (tecnologias STEMCELL, Cat n° 07851) e centrifugados à temperatura ambiente por 25 min a 845xg sem freio. A interfase contendo PBMC foi coletada em tubos de 50 ml com uma pipeta de 10 ml. As células foram lavadas com PBS e centrifugadas 5 min a 611xg. O sobrenadante foi descartado, o pélete ressuspenso em 50 ml de PBS e centrifugado por 5 min a 304xg. A etapa de lavagem foi repetida, centrifugando a 171xg. As células foram ressuspensas em RPMI 1640 Glutamax (contendo soro humano a 5%, piruvato de sódio, NEAA, 2- mercaptoetanol 50 µM, penicilina/estreptomicina) e processadas para posterior análise funcional de acordo com o respectivo protocolo de ensaio.

CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL IN VITRO DE MOLÉCULAS CD19-CD28 E CD79B- CD28 COM BASE NO ENSAIO REPÓRTER IL-2

[001217] Para avaliar a capacidade de CD19-CD28 e CD79b- CD28 de suportar a ativação de células T mediada por TCB, as células repórter IL-2 (Promega, Cat n° J1651) serviram como células efetoras (linha de células T Jurkat que expressa um repórter de luciferase conduzido pelo Promotor IL-2) e Nalm6, RCK8, WSU DLCL2 e Z138 serviram como alvos tumorais. 2x104 células alvo tumorais foram incubadas em placas de 96 poços de fundo plano branco por 6 h a 37 °C com 105 células repórter IL-2 (E:T 5:1) na presença de concentrações subótimas de CD20-TCB (P1AD4071) (10 nM para Nalm6 ou

0,05 nM para RCK8, WSU DLCL2 e Z138) sozinho ou em combinação com concentrações crescentes dos construtos CD19-CD28 (ou CD79b-CD28) (0,2 pM - 10 nM). Antes da medição, as placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 15 min e, então, 100 ul de substrato (solução ONE-Glo, Promega, Cat n° E6120) foram adicionados às células. Após 10 min de incubação à temperatura ambiente no escuro, a Luminescência (contagens/s) foi medida com um Tecan Spark 10M.

CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL IN VITRO DE CD19-CD28 COM BASE NA ATIVAÇÃO DE

CÉLULAS T ISOLADAS DE PBMC

[001218] Para avaliar a capacidade de CD19-CD28 de suportar a ativação de células T mediada por TCB, as células pan T foram usadas como células efetoras e isoladas de PBMCs por MACS, com o uso do Kit de Isolamento de Células Pan T (Miltenyi Biotec, Cat n° 130-096-535) de acordo com as instruções do fabricante e Nalm6, RCK8, WSU DLCL2 e Z138 serviram como alvos de tumor. 2x104 células alvo tumorais foram incubadas em placas de 96 poços de fundo plano por 48 h a 37°C com 105 células pan T (E:T 5:1) na presença de concentrações subótimas de CD20-TCB (P1AD4071) (10 nM para Nalm6 ou 0,05 nM para RCK8, WSU DLCL2 e Z138) sozinho ou em combinação com concentrações crescentes dos construtos CD19-CD28 (0,2 pM - 10 nM). A ativação de células T foi avaliada por meio de citometria de fluxo. Resumidamente, as células foram centrifugadas a 480xg por 5 min e lavadas com PBS. A coloração de superfície para CD8 (BV421 anti-humano, BioLegend n° 301036), CD4 (PE-Cy7 anti-humano, BioLegend n° 344611), CD25 (BV605 anti-humano, BioLegend n° 302632), CD69 (PE anti-humano, BioLegend n° 310906) foi realizada de acordo com as indicações do fornecedor. As células foram lavadas uma vez com 150 µl/poço de PBS e ressuspensas em 150 ul/poço de PBS e analisadas com o uso de BD FACS Fortessa.

AVALIAÇÃO DE LIBERAÇÃO DE CITOCINA

[001219] Para avaliar a capacidade do CD19-CD28 de desencadear a liberação de citocinas na presença de sinalização de TCR, 5x105 PBMCs foram incubadas em placas de 96 poços de fundo em U por 48 h a 37 ° C na presença de CD19-CD28 concentração subótima (1 nM) de CD20- TCB (P1AD4071) (0,4 pM). Para avaliar a capacidade do CD19-CD28 de desencadear a liberação de citocinas na ausência de sinalização de TCR, 5x105 PBMCs foram incubadas em placas de 96 poços de fundo em U por 48 h a 37 ° C na presença de concentrações crescentes dos construtos CD19-CD28 (0,08 nM - 100 nM). A liberação de citocinas foi avaliada por meio de ensaio Multiplex. 50 l/poço de sobrenadante foi varrido para secreção de G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, MCP-1 (MCAF), MIP-1β e TNF-α com o uso do Ensaio Bio-Plex Pro Human Cytokine 17-plex (Bio-rad, Cat n° m5000031yv) de acordo com as indicações do fornecedor.

CD19-CD28 AUMENTA A ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T MEDIADA POR CD20-TCB EM

VÁRIAS LINHAS DE CÉLULAS B

[001220] Para avaliar a capacidade dos anticorpos CD19- CD28 de aumentar a função efetora mediada por CD20-TCB, foi avaliada a ativação de células T na combinação de TCB. Para esse fim, células Jurkat repórter IL-2 foram co-cultivadas com quatro linhas celulares diferentes que expressam CD19 (Nalm6, WSU DLCL2, Z138, RCK8) por 6h na presença de concentrações crescentes de CD19-CD28 v15 (P1AE9040) e concentração limitante fixada de CD20-TCB (P1AD4071). CD20 TCB é um anticorpo biespecífico anti-CD20/anti-CD3 em um formato 2+1, conforme descrito no Exemplo 1 do documento WO 2016/020309 A1. Conforme representado nas Figuras 45A a 45D, CD19-CD28 aumenta a função efetora mediada por CD20- TCB na presença de todas as quatro linhas de células B de uma maneira dependente da concentração.

VARIANTES DE LIGANTE DE CD28 COM AFINIDADE REDUZIDA SÃO FUNCIONAIS IN VITRO EM UM FORMATO BIESPECÍFICO CD19-CD28

[001221] O clone CD28(SA) original tem uma afinidade de KD =1 nM. Clones de anticorpo de alta afinidade abrigam o risco de estarem sujeitos a efeitos de sumidouro periférico, especialmente se o alvo for altamente expresso no sangue periférico, como é o caso do CD28. A fim de (i) reduzir os efeitos de sumidouro periférico, e (ii) reduzir o risco de ativação de células T periféricas por meio da ligação fora do tumor de targ. Agonistas de CD28 para células T, geramos uma série de 31 clones de CD28 com afinidades reduzidas pela introdução de mutações pontuais nas CDRs (consulte o Exemplo 1.1). Os clones candidatos foram selecionados conforme descrito anteriormente. 5 moléculas com diferentes afinidades de CD28 foram geradas no formato biespecífico direcionado a CD19: CD19-CD28 v8 (P1AF0175), CD19-CD28 v11 (P1AF0377), CD19-CD28 v15 (P1AE9040), CD19-CD28 v27 (P1AF0378) e CD19-CD28 v29 (P1AE8002). As Figuras 44A e 44B mostram que todas as moléculas de CD19-CD28 geradas se ligam ao CD19 humano, bem como a CD28, e as intensidades de ligação se correlacionam com as afinidades de ligante.

[001222] Para avaliar se as variantes do clone de CD28 com afinidade reduzida eram funcionais e capazes de suportar funções efetoras mediadas por TCB, avaliou-se a ativação de células T na combinação de TCB.

Para esse fim, células Jurkat repórter de IL-2 foram co-cultivadas com células Nalm6 que expressam CD19 por 6 h na presença de concentrações crescentes de CD19-CD28 e concentração limitante fixa de CD20-TCB. Conforme representado na Figura 46, todas as variantes dos ligantes de CD28 eram funcionais e capazes de aumentar a ativação de células T mediada por TCB de uma maneira dependente da concentração. As células Pan T foram utilizadas como células efetoras e isoladas de PBMCs por MACS, com o uso do Kit de Isolamento de Células Pan T (Miltenyi Biotec) de acordo com as instruções do fabricante.

CD19-CD28 NÃO ATIVA CÉLULAS T PBMC NA AUSÊNCIA DE SINAIS DE TCR

[001223] Para confirmar que os construtos CD19-CD28 são inativos sem um sinal de TCR, como o fornecido por CD20-TCB, avaliou-se o status de ativação de células T derivadas de PBMC após co-cultura com células alvo que expressam CD20 (Nalm6) e CD19- CD28 na ausência ou presença de CD20-TCB. Conforme representado na Figura 47, CD19- CD28 aumenta a expressão de CD69 mediada por CD20-TCB em células T PBMC de uma maneira dependente da dose, enquanto na ausência de TCB, CD19-CD28 não leva à ativação de células T, mesmo em altas concentrações (100 nM). Essa constatação é confirmada pela presente observação de que CD19-CD28 não levou à liberação de citocinas em células T derivadas de PBMC após co-incubação com CD19-CD28 v8 ou CD19-CD28 v15 na presença ou ausência de CD20-TCB (Figuras 48A a 48D). Em conclusão, esses dados confirmam que CD19-CD28 não é um anticorpo superagonístico, mas requer um sinal de TCR, isto é, fornecido por um TCB, para aumentar a ativação de células T.

CD79B-CD28 AUMENTA A ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T MEDIADA POR CD20-TCB

[001224] Além de anticorpos agonísticos de CD28 direcionados a CD19, também geramos anticorpos CD28 direcionados a CD79b para avaliar sua capacidade de aumentar a ativação de células T mediada por CD20-TCB. Para isso, foi usada a linha de células B positiva para CD79b Z138. Conforme mostrado na Figura 49A, CD79b-CD28 liga-se a Z138.

Além disso, CD79b-CD28 foi capaz de aumentar a produção de IL-2 mediada por CD20-TCB de células IL-2 Jurkat quando incubadas com Z138 na presença de CD20-TCB 0,05 nM (Figura 49B).

EXEMPLO 22

CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL IN VIVO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO DIRECIONADO A CD28 E CD19

ESTUDO DE EFICÁCIA COM MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICO CD19-CD28 COM DIFERENTES VARIANTES DE CD28 EM XENOENXERTO NALM6 EM

CAMUNDONGOS HUMANIZADOS

[001225] O estudo de eficácia descrito aqui teve como objetivo avaliar qual variante de CD28 na molécula de oferta de antígeno biespecífico CD19-CD28 levará a uma inibição do crescimento tumoral mais forte em monoterapia em um modelo de linfoma humano positivo para CD19 em camundongos NSG totalmente humanizados.

[001226] As células NALM6 humanas (leucemia precursora de células B) foram obtidas originalmente da ATCC e após expansão depositadas no banco de células interno Glycart. As células foram cultivadas em RPMI contendo FCS a 10% e 1x Glutamax. As células foram cultivadas a 37 °C em uma atmosfera saturada com água a CO2 a 5%. Suspensão de células de 50 microlitros (1x106 células NALM6) misturada com 50 microlitros de Matrigel foram injetados por via subcutânea no flanco de camundongos anestesiados com uma agulha de 22G a 30G.

[001227] Camundongos NSG fêmeas, com a idade de 4-5 semanas no início do experimento (Jackson Laboratory), foram mantidos em condições isentas de patógenos específicos com ciclos diários de 12 h de luz/12 h de escuridão de acordo com as diretrizes autorizadas (GV-Solas; Felasa; TierschG). O protocolo do estudo experimental foi revisado e aprovado pelo governo local (ZH225-17). Após a chegada, os animais foram mantidos por uma semana para se acostumarem ao novo ambiente e para observação. A monitorização contínua da saúde foi realizada regularmente.

[001228] Os camundongos fêmeas NSG foram injetados i.p.

Na semana 14-16, após a injeção de células-tronco, os camundongos foram sangrados por via sublingual e o sangue foi analisado por citometria de fluxo para uma humanização bem-sucedida. Camundongos eficientemente enxertados foram randomizados de acordo com suas frequências de células T humanas nos diferentes grupos de tratamento. Na ocasião, camundongos foram injetados com células tumorais s.c. conforme descrito (Figura 50) e tratado com os compostos ou tampão de Histidina (Veículo) quando o tamanho do tumor atingiu aprox. 150 mm3 (dia 18). Todos os camundongos foram injetados i.v. com 200 µl da solução apropriada. Para obter a quantidade adequada de compostos por 200 µl, as soluções estoque (Tabela 44) foram diluídas com tampão de Histidina quando necessário.

TABELA 4: COMPOSIÇÕES USADAS NO EXPERIMENTO IN VIVO Concentração Composto Tampão de formulação (mg/ml) Histidina 20 mM, 5,63 CD19-CD28 (variante 15) NaCl 140 mM, (= solução estoque) pH6,0 Histidina 20 mM, 3,53 CD19-CD28 (variante 8) NaCl 140 mM, (= solução estoque) pH6,0

[001229] O crescimento do tumor foi medido duas vezes por semana com o uso de um calibrador e o volume do tumor foi calculado da seguinte forma: Tv: (W2/2) x L (W: Largura, L: Comprimento)

[001230] Esse estudo terminou no dia 53. A Figura 51A mostra a cinética de crescimento do tumor (média, +SEM) e as Figuras 51B a 51D mostram a cinética de crescimento do tumor individual por grupo e camundongo. Como descrito no presente documento CD19-CD28 variante 8 como um único agente induziu inibição do crescimento tumoral mais forte em comparação com CD19-CD28 variante 15. O animal veículo teve que ser sacrificado mais cedo devido à formação de metástases após s.c. injeção de células tumorais. O efeito monoterapêutico em camundongos humanizados pode ser explicado pelo reforço de células T humanas alo-reativas, que podem ser vistas como um substituto para o reconhecimento de neo-antígeno, no sistema de camundongo.

REFERÊNCIAS: Acuto, O., e Michel, F. (2003). CD28-mediated co-stimulation: a quantitative support for TCR signalling. Nat Rev Immunol 3, 939-951.

Atamaniuk, J., Gleiss A., Porpazcy E., Kainz B., Grunt T.W., Raderer M., Hilgarth B., Drach J., Ludwig H., Gisslinger H., Jaeger U., Gaiger A. (2012). Overexpression of G protein-coupled receptor 5D in the bone marrow is associated with poor prognosis in patients with multiple myeloma. Eur J Clin Invest. 42(9), 953-60.

Bahlis N.J., King A.M., Kolonias D. Carlson L.M., Liu H.Y., Hussein M.A., Terebelo H.R., Byrne G.E. Jr, Levine B.L., Boise L.H., Lee K.P.

(2007). CD28-mediated regulation of multiple myeloma cell proliferation and survival. Blood 109 (11), 5002–5010.

Boomer, J.S., e Green, J.M. (2010). An enigmatic tail of CD28 signaling. Cold Spring Harb Perspect Biol 2, a002436.

Bräuner-Osborne H., Jensen A.A., Sheppard P.O., Brodin B., Krogsgaard-Larsen P., O’Hara P. (2001). Cloning and characterization of a human orphan family C G-protein coupled receptor GPRC5D. Biochim.

Biophys. Acta 1518(3), 237-48.

Carreno, B.M., e Collins, M. (2002). The B7 family of ligands and its receptors: new pathways for costimulation and inhibition of immune responses. Annu Rev Immunol 20, 29-53. Chen, L., e Flies, D.B. (2013). Molecular mechanisms of T cell co- stimulation and co-inhibition. Nat Rev Immunol 13, 227-242.

Cho S.F., Anderson K.C., Tai Y.T. (2018). Targeting B Cell Maturation Antigen (BCMA) in Multiple Myeloma: Potential Uses of BCMA- Based Immunotherapy. Front Immunol. 9, 1821.

Cohen Y., Gutwein O., Garach-Jehoshua O., Bar-Haim A., Kornberg A. (2013). GPRC5D is a promising marker for monitoring the tumor load and to target multiple myeloma cells. Hematology 18(6), 348-51.

Engelhardt, J.J., Sullivan, T.J., e Allison, J.P. (2006). CTLA-4 overexpression inhibits T cell responses through a CD28-B7-dependent mechanism. J Immunol 177, 1052-1061.

Esensten, J.H., Helou, Y.A., Chopra, G., Weiss, A., e Bluestone, J.A. (2016). CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity 44, 973-988.

Fraser, J.D., Irving, B.A., Crabtree, G.R., e Weiss, A. (1991).

Regulation of interleukin-2 gene enhancer activity by the T cell accessory molecule CD28. Science 251, 313-316.

Gao Y., Wang X., Yan H., Zeng J., Ma S., Niu Y., Zhou G., Jiang Y., Chen Y. (2016). Comparative Transcriptome Analysis of Fetal Skin Reveals Key Genes Related to Hair Follicle Morphogenesis in Cashmere Goats. PLoS One 11(3), e0151118.

Hui, E., Cheung, J., Zhu, J., Su, X., Taylor, M.J., Wallweber, H.A., Sasmal, D.K., Huang, J., Kim, J.M., Mellman, I., e Vale, R.D. (2017). T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.

Science 355, 1428-1433.

Hunig, T. (2012). The storm has cleared: lessons from the CD28 superagonist TGN1412 trial. Nat Rev Immunol 12, 317-318.

Inoue, S., Nambu T. e Shimomura T. (2004). The RAIG family member, GPRC5D, is associated with hard-keratinized structures. J Invest Dermatol. 122(3), 565-73.

June, C.H., Ledbetter, J.A., Gillespie, M.M., Lindsten, T., e Thompson, C.B. (1987). T-cell proliferation involving the CD28 pathway is associated with cyclosporine-resistant interleukin 2 gene expression. Mol Cell Biol 7, 4472-4481.

Kamphorst, A.O., Wieland, A., Nasti, T., Yang, S., Zhang, R., Barber, D.L., Konieczny, B.T., Daugherty, C.Z., Koenig, L., Yu, K., et al. (2017).

Rescue of exhausted CD8 T cells by PD-1-targeted therapies is CD28- dependent. Science 355, 1423-1427.

Lavin, Y., Kobayashi, S., Leader, A., Amir, E.D., Elefant, N., Bigenwald, C., Remark, R., Sweeney, R., Becker, C.D., Levine, J.H., et al.

(2017). Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell 169, 750-765 e717.

Linsley, P.S., Clark, E.A., e Ledbetter, J.A. (1990). T-cell antigen CD28 mediates adhesion with B cells by interacting with activation antigen B7/BB-1. Proc Natl Acad Sci U S A 87, 5031-5035.

Moreau, P. e S.V. Rajkumar (2016). Multiple myeloma-translation of trial results into reality. Lancet, 388(10040): p. 111-113.

Murray M.E., Gavile C.M., Nair J.R., Koorella C., Carlson L.M., Buac D., Utley A., Chesi M., Bergsagel P.L., Boise L.H., Lee K.P. (2014). CD28- mediated pro-survival signaling induces chemotherapeutic resistance in multiple myeloma. Blood 123 (24), 3770 – 3779.

Römer, P.S., Berr, S., Avota, E., Na, S.Y., Battaglia, M., ten Berge, I., Einsele, H., e Hunig, T. (2011). Preculture of PBMCs at high cell density increases sensitivity of T-cell responses, revealing cytokine release by CD28 superagonist TGN1412. Blood 118, 6772-6782.

Tai, X., Van Laethem, F., Sharpe, A.H., e Singer, A. (2007). Induction of autoimmune disease in CTLA-4-/- mice depends on a specific CD28 motif that is required for in vivo costimulation. Proc Natl Acad Sci U S A

104, 13756-13761.

Thompson, C.B., Lindsten, T., Ledbetter, J.A., Kunkel, S.L., Young, H.A., Emerson, S.G., Leiden, J.M., e June, C.H. (1989). CD28 activation pathway regulates the production of multiple T-cell-derived lymphokines/cytokines. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 1333-1337.

Tirosh, I., Izar, B., Prakadan, S.M., Wadsworth, M.H., 2nd, Treacy, D., Trombetta, J.J., Rotem, A., Rodman, C., Lian, C., Murphy, G., et al. (2016).

Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq. Science 352, 189-196.

Zheng, C., Zheng, L., Yoo, J.K., Guo, H., Zhang, Y., Guo, X., Kang, B., Hu, R., Huang, J.Y., Zhang, Q., et al. (2017). Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell 169, 1342- 1356 e1316.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO caracterizada pela ligação monovalente a CD28, que compreende (a) um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28, (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduz a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

2. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo domínio Fc ser de subclasse de IgG1 humana e compreender as mutações de aminoácido L234A, L235A e P329G (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

3. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreender (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada CDR-H1 de SEQ ID NO: 36, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 37, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 38, e uma região variável de cadeia leve (V LCD28) que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve CDR-L1 de SEQ ID NO: 39, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 40 e uma CDR- L3 de SEQ ID NO: 41; ou

(ii) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma CDR-H1 de SEQ ID NO: 20, uma CDR-H2 de SEQ ID NO: 21, e uma CDR-H3 de SEQ ID NO: 22, e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende uma CDR-L1 de SEQ ID NO: 23, uma CDR-L2 de SEQ ID NO: 24 e uma CDR-L3 de SEQ ID NO: 25.

4. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreender uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:26, e uma região variável de cadeia leve (V LCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:27.

5. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreender uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50 e SEQ ID NO:51, e uma região variável de cadeia leve (V LCD28) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60 e SEQ ID NO:61.

6. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 5, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD28 compreender

(a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:54, ou

(b) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:27, ou

(c) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:51 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, ou

(d) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:53, ou

(e) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:54, ou

(f) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:59, ou (g) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:46 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:27, ou (h) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:43 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:27, ou (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:53, ou (j) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:59, ou (k) uma região variável de cadeia pesada (VHCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VLCD28) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:27.

7. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor ser selecionado do grupo que consiste em Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP), Antígeno Carcinoembrionário (CEA), receptor alfa de Folato (FolR1), Proteoglicano de Sulfato de Condroitina Associado ao Melanoma (MCSP), Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR), receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), p95HER2, molécula de adesão de células epiteliais (EpCAM), HER3, CD30, TPBG (5T4), CD19, CD79b, CD20, CD22, CD37, CD38, BCMA e

GPRC5D.

8. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor ser um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a Antígeno Carcinoembrionário (CEA).

9. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica ao CEA compreender (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:188, uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:189, e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:190, e uma região variável de cadeia leve (V LCEA) que compreende uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:191, uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:192 e uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:193; ou (ii) uma região variável de cadeia pesada (V HCEA) que compreende uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:180, uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:181, e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:182, e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:183, uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:184 e uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:185; ou

(iii) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:127, uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:128, e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:129, e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:130, uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:131 e uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:132, (iv) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:507, uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:508, e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:509, e uma região variável de cadeia leve (V LCEA) que compreende uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:510, uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:511 e uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:512.

10. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA compreender uma região variável de cadeia pesada (V HCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:186, e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:187.

11. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA compreender

(a) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:194 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:195, ou

(b) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:196 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:197, ou

(c) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:198 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:199, ou

(d) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:200 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:201, ou

(e) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:202 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:203, ou

(f) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:204 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:205, ou

(g) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:206 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:207, ou (h) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:208 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:209, ou (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:210 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:211, ou (j) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:212 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:213.

12. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou 11, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CEA compreender uma região variável de cadeia pesada (V HCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:200, e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:201.

13. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor ser um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica à Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP).

14. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 13, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica ao FAP compreender (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:12, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:13, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14, e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:15, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:16 e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:17, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR- L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:7, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8 e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9.

15. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 13 ou 14, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a FAP compreender uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18, e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:19.

16. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor ser um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica à molécula de adesão a células epiteliais (EpCAM).

17. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 16, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a EpCAM compreender uma região variável de cadeia pesada (VHEpCAM) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:515, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:516, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:517, e uma região variável de cadeia leve (VLEpCAM) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:518, (v) CDR -L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:519, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:520.

18. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 16 ou 17, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a EpCAM compreender uma região variável de cadeia pesada (VHEpCAM) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:521, e uma região variável de cadeia leve (VLEpCAM) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:522.

19. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor ser um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a HER3.

20. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 19, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a HER3 compreender uma região variável de cadeia pesada (VHHER3) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:523, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:524, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:525, e uma região variável de cadeia leve (VLHER3) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:526, (v) CDR -L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:527, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:528.

21. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 19 ou 20, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a HER3 compreender uma região variável de cadeia pesada (VHHER3) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:529, e uma região variável de cadeia leve (VLHER3) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:530.

22. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor ser um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD30.

23. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 22, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD30 compreender uma região variável de cadeia pesada (VHCD30) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:531, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:532, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:533, e uma região variável de cadeia leve (VLCD30) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:534, (v) CDR -L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:535, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:536.

24. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 22 ou 23, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD30 compreender uma região variável de cadeia pesada (VHCD30) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:537, e uma região variável de cadeia leve (VLCD30) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:538.

25. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor ser um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a TBPG.

26. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 25, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a TBPG compreender uma região variável de cadeia pesada (VHTBPG) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:539, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:540, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:541, e uma região variável de cadeia leve (VLTBPG) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:542, (v) CDR -L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:543, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:544.

27. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 25 ou 26, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a TBPG compreender uma região variável de cadeia pesada (VHTBPG) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:545, e uma região variável de cadeia leve (VLTBPG) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:546.

28. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor ser um antígeno de superfície celular de Mieloma Múltiplo (MM) selecionado do grupo que consiste em CD38, BCMA e GPRC5D.

29. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 28, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor ser um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a GPRC5D.

30. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 28 ou 29, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a GPRC5D compreender (a) uma região variável de cadeia pesada (VHGPRC5D) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:563, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:564, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO:565, e uma região variável de cadeia leve (V LGPRC5D) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:566, (v) CDR -L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:567, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:568, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHGPRC5D) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:579, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:580, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:581, e uma região variável de cadeia leve (VLGPRC5D) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:582, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:583 e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:584.

31. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 28 a 30, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a GPRC5D compreender uma região variável de cadeia pesada (VHGPRC5D) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:569, e uma região variável de cadeia leve (VLGPRC5D) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:570.

32. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 28, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor ser um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD38.

33. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 28 ou 32, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD38 compreender uma região variável de cadeia pesada (VHCD38) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:547, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:548, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:549, e uma região variável de cadeia leve (VLCD38) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:550, (v) CDR -L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:551, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:552.

34. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 28 ou 32 ou 33, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD38 compreender uma região variável de cadeia pesada (VHCD38) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:553, e uma região variável de cadeia leve (VLCD38) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:554.

35. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 28, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor ser um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a BCMA.

36. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 28 ou 35, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a BCMA compreender uma região variável de cadeia pesada (VHBCMA) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:555, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:556, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:557, e uma região variável de cadeia leve (VLBCMA) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:558, (v) CDR -L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:559, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:560.

37. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 28 ou 35 ou 36, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a BCMA compreender uma região variável de cadeia pesada (VHBCMA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:561, e uma região variável de cadeia leve (VLBCMA) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:562.

38. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor ser um antígeno de superfície de célula B selecionado do grupo que consiste em CD19, CD79b, CD20, CD22 e CD37.

39. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 38, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor ser um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD19.

40. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 38 ou 39, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD19 compreender (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:406, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:407, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:408, e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:409, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:410 e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:411, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:414, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:415, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:416, e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:417, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:418 e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:419.

41. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 38 ou 39 ou 40, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD19 compreender (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 98% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:412, e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 98% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:413, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 98% ou 100%

idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:420, e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 98% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:421.

42. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 38 a 41, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD19 compreender uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:412, e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:413.

43. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 38, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor ser um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD79b.

44. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 38 ou 43, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica a CD79b compreender uma região variável de cadeia pesada (VHCD79b) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:422, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:423, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:424, e uma região variável de cadeia leve (VLCD79b) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:425, (v) CDR -L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:426, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:427.

45. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 38 ou 43 ou 44, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação a CD79b compreender uma região variável de cadeia pesada (VHCD79b) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:428, e uma região variável de cadeia leve (VLCD79b) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:429.

46. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 45, caracterizada por compreender (a) um fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28, (b) um fragmento crossFab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduz a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.

47. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 45, caracterizada por compreender (a) um primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28, (b) um segundo fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduz a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora,

em que o primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N-terminal da cadeia pesada de Fab do segundo fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, que, por sua vez, é fundido em seu C- terminal ao N-terminal de uma das subunidades de domínio Fc.

48. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 45, caracterizada por compreender (a) um primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28, (b) um segundo e um terceiro fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que reduz a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora, em que o primeiro fragmento Fab capaz de ligação específica a CD28 é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N-terminal da cadeia pesada de Fab do segundo fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor, que, por sua vez, é fundido em seu C- terminal ao N-terminal da primeira subunidade de domínio Fc, e o terceiro fragmento Fab capaz de ligação específica a um antígeno associado a tumor é fundido no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao N-terminal da segunda subunidade de domínio Fc.

49. UM OU MAIS POLINUCLEOTÍDEOS ISOLADOS caracterizados por codificar a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 48.

50. UM OU MAIS VETORES, particularmente vetor de expressão, caracterizados por compreender o polinucleotídeo (ou polinucleotídeos), conforme definido na reivindicação 49.

51. CÉLULA HOSPEDEIRA caracterizada por compreender o polinucleotídeo (ou polinucleotídeos), conforme definido na reivindicação 49 ou o vetor (ou vetores), conforme definido na reivindicação 50.

52. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA MOLÉCULA de ligação ao antígeno cd28 agonístico biespecífico caracterizado por compreender as etapas de a) cultivar a célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 51, sob condições adequadas para a expressão da molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico e b) opcionalmente recuperar a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico biespecífico.

53. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO caracterizada por ser produzida por meio do método, conforme definido na reivindicação 52.

54. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por compreender a molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 48, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

55. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 54, caracterizada por ser para uso no tratamento de câncer.

56. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 48, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 54, caracterizadas por serem para uso como um medicamento.

57. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 48, caracterizada por ser para uso no aumento de (a) ativação de células T ou (b) funções efetoras de células T.

58. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 48, caracterizada por ser para uso no tratamento de câncer.

59. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 48, caracterizada por ser para uso no tratamento de câncer, em que a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico é para administração em combinação com um agente quimioterápico, radioterapia e/ou outros agentes para uso em imunoterapia contra o câncer.

60. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 48, caracterizada por ser para uso no tratamento de câncer, em que a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico é para administração em combinação com um anticorpo biespecífico anti-CD3 de ativação de células T.

61. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO AGONÍSTICO CD28 BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 48, caracterizada por ser para uso no tratamento de câncer, em que a molécula de ligação ao antígeno CD28 agonístico é para administração em combinação com um anticorpo anti-PD-L1 ou um anticorpo anti-PD-1.

62. USO DA MOLÉCULA de ligação ao antígeno agonístico cd28 biespecífico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 48, ou da composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 54, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento do câncer.

63. MÉTODO DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE CÉLULAS TUMORAIS em um indivíduo, caracterizado por compreender administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da molécula de ligação ao antígeno agonístico CD28 biespecífico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 48, ou a composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 24, para inibir o crescimento das células tumorais.