ES2848732T3 - Inmunoterapia mejorada - Google Patents

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Christian Klein
Valeria G Nicolini
Pablo Umana
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Roche Glycart AG
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Abstract

Una combinación, para su uso en el tratamiento del cáncer en un individuo que lo necesite, de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, en la que el primer anticuerpo se dirige a un antígeno presentado en una célula tumoral o en un entorno de células tumorales, y en la que el resto efector es un resto efector IL-2 mutante que comprende al menos una mutación aminoacídica que reduce o suprime la afinidad del resto efector IL-2 mutante por la subunidad α del receptor de IL-2, pero conserva la afinidad del resto efector IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, en comparación con el resto efector IL-2 no mutado; y (b) un segundo anticuerpo seleccionado del grupo de (i) un anticuerpo de clase IgG dirigido al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que comprende el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 102 y el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 103, en el que el anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado, y (ii) un anticuerpo de clase IgG dirigido a HER3, que comprende el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 142 y el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 146, en la que el anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado.

Description

DESCRIPCIÓN
Inmunoterapia mejorada
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a la inmunoterapia. Más en particular, la invención se refiere a inmunoconjugados dirigidos a antígeno y anticuerpos genomanipulados con Fc para su uso combinado como agentes inmunoterápicos. Además, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden combinaciones de dichos inmunoconjugados y anticuerpos y procedimientos de uso de los mismos en el tratamiento de enfermedades.
Antecedentes
La destrucción selectiva de una célula individual o de un tipo de célula específico a menudo es deseable en una variedad de entornos clínicos. Por ejemplo, el objetivo principal del tratamiento del cáncer es destruir específicamente las células tumorales, dejando las células y los tejidos sanos intactos y sin daños.
Una forma atractiva de lograr esto es induciendo una respuesta inmunitaria contra el tumor, para hacer que las células efectoras inmunitarias, tales como los linfocitos citolíticos naturales (NK) o los linfocitos T citotóxicos (CTL), ataquen y destruyan las células tumorales. Las células efectoras se pueden activar mediante diversos estímulos, que incluyen una serie de citocinas que inducen eventos de señalización a través de la unión a sus receptores en la superficie de las células inmunitarias. Por ejemplo, la interleucina-2 (IL-2), que, entre otras cosas, estimula la proliferación y la activación de los linfocitos T citotóxicos y los linfocitos NK, se ha aprobado para el tratamiento del carcinoma metastásico de células renales y el melanoma maligno. Sin embargo, el aclaramiento rápido de la sangre y la falta de especificidad tumoral requieren la administración sistémica de altas dosis de una citocina a fin de lograr una concentración suficientemente alta de la citocina en el sitio del tumor para activar una respuesta inmunitaria o tener un efecto antitumoral. Estos altos niveles sistémicos de citocina pueden dar lugar a una toxicidad intensa y reacciones adversas, como es el caso también de IL-2. Para su uso en el tratamiento del cáncer, por lo tanto, es deseable administrar específicamente citocinas al tumor o al microentorno tumoral. Esto se puede lograr conjugando la citocina con un resto dirigido, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, específico para un antígeno tumoral. Otra ventaja de dichos inmunoconjugados es su semivida en suero incrementada en comparación con la citocina no conjugada. Su capacidad para maximizar las actividades inmunoestimuladoras en el sitio de un tumor mientras se mantienen los efectos secundarios sistémicos a un mínimo a una dosis más baja hace que los inmunoconjugados de citocinas sean agentes inmunoterápicos óptimos.
Otra forma de activar las células efectoras es a través del acoplamiento de los receptores de Fc activadores en su superficie por la porción Fc de inmunoglobulinas o proteínas de fusión recombinantes que comprenden una región Fc. Las llamadas funciones efectoras de un anticuerpo que están mediadas por su región Fc son un importante mecanismo de acción en la inmunoterapia del cáncer basada en anticuerpos. La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, la destrucción de células diana recubiertas de anticuerpos (por ejemplo, células tumorales) por linfocitos NK, se desencadena cuando el anticuerpo unido a la superficie de una célula interactúa con receptores de Fc en el linfocito NK. Los linfocitos NK expresan FcYRIIIa (CD16a) que reconoce las inmunoglobulinas de la subclase IgG1 o IgG3. Otras funciones efectoras incluyen la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), y varían con la clase y subclase del anticuerpo, dado que diferentes tipos de células inmunitarias portan diferentes conjuntos de receptores de Fc que reconocen diferentes tipos y subtipos de dominios constantes de la cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, los dominios constantes de la cadena pesada a, ó, y, £ o p, correspondientes a los anticuerpos de clase IgA, IgD, IgE, IgG o IgM, respectivamente). Se han empleado diversas estrategias para incrementar las funciones efectoras de los anticuerpos. Por ejemplo, Shields et al. (J Biol Chem 9(2), 6591-6604 (2001)) muestran que las sustituciones aminoacídicas en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de residuos) mejoran la unión de anticuerpos al receptor de FcYlIIa y ADCC. Se describen otras variantes de anticuerpo que tienen modificaciones de aminoácido en la región Fc y que presentan una función efectora y unión al receptor de Fc mejoradas, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 6.737.056, el documento WO 2004/063351 y el documento WO 2004/099249. De forma alternativa, se puede obtener una unión al receptor de Fc y función efectora incrementadas alterando la glucosilación de un anticuerpo. Los anticuerpos de tipo IgG1, los anticuerpos que se usan más comúnmente en la inmunoterapia del cáncer, tienen un sitio de glucosilación unido a N conservado en Asn 297 en cada dominio CH2 de la región Fc. Los dos oligosacáridos biantenarios complejos unidos a Asn 297 están ocultos entre los dominios CH2, formando contactos extensivos con el esqueleto polipeptídico, y su presencia es esencial para que el anticuerpo pueda mediar en funciones efectoras, incluyendo la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Lifely et al., Glycobiology 5, 813-822 (1995); Jefferis et al., Immunol Rev 163, 59-76 (1998); Wright y Morrison, Trends Biotechnol 15, 26-32 (1997)). Los estudios de genomanipulación de proteínas han mostrado que los FcyR interactúan con la región bisagra inferior del dominio CH2 de IgG (Lund et al., J Immunol 157, 4963-69 (1996)). Sin embargo, la unión de FcyR también requiere la presencia de los oligosacáridos en la región CH2 (Lund et al., J Immunol 157, 4963-69 (1996); Wright y Morrison, Trends Biotech 15, 26-31 (1997)), lo que sugiere que tanto el oligosacárido como el polipéptido contribuyen directamente al sitio de interacción o bien que se requiere que el oligosacárido mantenga una conformación de polipéptido CH2 activa. Por lo tanto, se puede explorar la modificación de la estructura del oligosacárido como un medio para incrementar la afinidad de la interacción entre IgG1 y FcyR, y para incrementar la actividad ADCC de los anticuerpos IgG1. Umaña et al. (Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999) y la patente de EE. UU. n.° 6.602.684 (documento WO 99/54342)) mostraron que la sobreexpresión de p-(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una glucosiltransferasa que cataliza la formación de oligosacáridos bisecados, en células de ovario de hámster chino (CHO) incrementa significativamente la actividad ADCC in vitro de los anticuerpos producidos en esas células. La sobreexpresión de GnTIII en líneas de células de producción da lugar a anticuerpos enriquecidos en oligosacáridos bisecados, que en general también son no fucosilados y de tipo híbrido. Si además de GnTIII, se sobreexpresa la manosidasa II (ManII) en líneas de células de producción, se obtienen anticuerpos enriquecidos en oligosacáridos bisecados, no fucosilados del tipo complejo (Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)). Ambos tipos de anticuerpos muestran una ADCC fuertemente incrementada, en comparación con anticuerpos con glucanos no modificados, pero solo los anticuerpos en los que la mayoría de los N-glucanos son del tipo complejo pueden inducir una citotoxicidad dependiente del complemento significativa (Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)). El factor crucial para el incremento de la actividad de ADCC parece ser la eliminación de fucosa del residuo de N-acetilglucosamina más interno del núcleo de oligosacárido, que mejora la unión del dominio Fc de IgG a FcYRIIIa (Shinkawa et al., J Biol Chem 278, 3466-3473 (2003)). Otros procedimientos para producir anticuerpos con fucosilación reducida incluyen, por ejemplo, expresión en células huésped deficientes en a-(1,6)-fucosiltransferasa (Yamane-Ohnuki et al., Biotech Bioeng 87, 614-622 (2004); Niwa et al., J Immunol Methods 306, 151-160 (2006)). El documento WO 2011/001276 A1 se refiere al tratamiento del cáncer usando anticuerpos anti-ErbB, tales como cetuximab o trastuzumab, en combinación con conjugados de anticuerpo-interleucina 2 (IL-2) que se dirigen a tenascina C.
A pesar de los éxitos logrados en la inmunoterapia contra el cáncer mediante el uso de citocinas libres, inmunoconjugados o anticuerpos genomanipulados, existe una necesidad continua de nuevas opciones de tratamiento eficaces y seguras en el tratamiento del cáncer.
Sumario de la invención
Los autores de la presente invención han descubierto que la combinación de estas dos estrategias para la activación de células inmunitarias locales, es decir, la estimulación simultánea de células efectoras por inmunoconjugados de citocina y por anticuerpos genomanipulados para que tengan funciones efectoras incrementadas, mejora enormemente la eficacia de la inmunoterapia contra el cáncer.
En consecuencia, la presente invención proporciona una combinación, para su uso en el tratamiento del cáncer en un individuo que lo necesite, de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, en la que el primer anticuerpo está dirigido a un antígeno presentado en una célula tumoral o en un entorno de células tumorales, y en la que el resto efector es un resto efector IL-2 mutante que comprende al menos una mutación aminoacídica que reduce o suprime la afinidad del resto efector IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2, pero conserva la afinidad del resto efector IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, en comparación con el resto efector IL-2 no mutado, y (b) un segundo anticuerpo seleccionado del grupo de (i) un anticuerpo de clase IgG dirigido al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que comprende el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 102 y el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 103, en la que el anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado, y (ii) un anticuerpo de clase IgG dirigido a HER3, que comprende el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 142 y el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 146, en la que el anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado. El resto efector IL-2 mutante puede comprender tres sustituciones aminoacídicas en las posiciones correspondientes a los residuos 42, 45 y 72 de IL-2 humana (SEQ ID NO: 1). El resto efector IL-2 mutante puede ser IL-2 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G. El resto efector IL-2 mutante puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 2. El primer anticuerpo puede ser un anticuerpo de longitud completa, en particular un anticuerpo de clase IgG, más en particular un anticuerpo de subclase IgG1. El resto efector puede compartir un enlace peptídico amino o carboxiterminal con el primer anticuerpo. El primer anticuerpo se puede genomanipular para que tenga una unión reducida a un receptor de Fc activador, en particular una unión reducida a FcYRIIIa humano. El primer anticuerpo puede comprender una sustitución aminoacídica en la posición P329 de las cadenas pesadas de inmunoglobulina (numeración EU como se describe en Kabat). El primer anticuerpo puede comprender las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G (numeración EU como se describe en Kabat) en las cadenas pesadas de inmunoglobulina. El inmunoconjugado puede consistir esencialmente en un resto efector y un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida, en el que el resto efector se fusiona en su aminoácido aminoterminal con el extremo carboxílico de una de las cadenas pesadas del primer anticuerpo, opcionalmente a través de un conector peptídico. El primer anticuerpo se puede dirigir a un antígeno seleccionado del grupo de proteína de activación de fibroblastos (FAP), el dominio A1 de tenascina C (TNC A1), el dominio A2 de tenascina C (TNC A2), el dominio adicional B de fibronectina (EDB), antígeno carcinoembrionario (CEA) y proteoglucano de sulfato de condroitina asociado al melanoma (MCSP). El primer anticuerpo se puede dirigir a FAP y comprende (i) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 12 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 11; (ii) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 17 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 16; (iii) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 47 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 46; (iv) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 63 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 62; o (v) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 67 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 66. El primer anticuerpo se puede dirigir a CEA y, si es así, comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 114 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 115. El segundo anticuerpo puede ser un anticuerpo de clase IgG de longitud completa, en particular un anticuerpo de subclase IgG1. La función efectora se puede seleccionar del grupo de unión a un receptor de Fc activador, ADCC, ADCP, CDC y secreción de citocinas. El segundo anticuerpo se puede genomanipular mediante la introducción de una o más mutaciones aminoacídicas en la región Fc o mediante modificación de la glucosilación en la región Fc. El individuo puede ser un mamífero, en particular un ser humano.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que la composición farmacéutica comprende (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, en la que el primer anticuerpo está dirigido a un antígeno presentado en una célula tumoral o en un entorno de células tumorales, y en la que el resto efector es un resto efector IL-2 mutante que comprende al menos una mutación aminoacídica que reduce o suprime la afinidad del resto efector IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2, pero conserva la afinidad del resto efector IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, en comparación con el resto efector IL-2 no mutado, y (b) un segundo anticuerpo seleccionado del grupo de (i) un anticuerpo de clase IgG dirigido al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que comprende el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 102 y el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 103, en la que el anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado, y (ii) un anticuerpo de clase IgG dirigido a HER3, que comprende el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 142 y el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 146, en la que el anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para su uso en el tratamiento del cáncer, que comprende en el mismo recipiente o en recipientes separados (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, en el que el primer anticuerpo está dirigido a un antígeno presentado en una célula tumoral o en un entorno de células tumorales, y en el que el resto efector es un resto efector IL-2 mutante que comprende al menos una mutación aminoacídica que reduce o suprime la afinidad del resto efector IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2, pero conserva la afinidad del resto efector IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, en comparación con el resto efector IL-2 no mutado; (b) un segundo anticuerpo seleccionado del grupo de (i) un anticuerpo de clase IgG dirigido al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que comprende el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 102 y el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 103, en el que el anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado, y (ii) un anticuerpo de clase IgG dirigido a HER3, que comprende el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 142 y el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 146, en el que el anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado y (c) opcionalmente un prospecto del envase que comprende instrucciones impresas que indican el uso del tratamiento combinado como procedimiento para tratar el cáncer.
Un aspecto de la presente invención se refiere a una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesite. En un modo de realización, el resto efector es una citocina. En un aspecto de la divulgación, la citocina se selecciona del grupo que consiste en IL-2, GM-CSF, IFN-a e IL-12. En un modo de realización particular, el resto efector es IL-2. En otro aspecto, el resto efector es IL-12. En otro modo de realización particular, el resto efector IL-2 es un resto efector IL-2 mutante que comprende al menos una mutación aminoacídica, en particular una sustitución aminoacídica que reduce o suprime la afinidad del resto efector IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2, pero conserva la afinidad del resto efector IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, en comparación con el resto efector IL-2 no mutado. En un modo de realización específico, el resto efector IL-2 mutante comprende una, dos o tres sustituciones aminoacídicas en una, dos o tres posiciones seleccionadas de las posiciones correspondientes al residuo 42, 45 y 72 de IL-2 humana (SEQ ID NO: 1). En un modo de realización más específico, el resto efector IL-2 mutante comprende tres sustituciones aminoacídicas en las posiciones correspondientes al residuo 42, 45 y 72 de IL-2 humana. En un modo de realización incluso más específico, el resto efector IL-2 mutante es IL-2 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G. En determinados modos de realización, el resto efector IL-2 mutante comprende adicionalmente una mutación aminoacídica en una posición correspondiente a la posición 3 de IL-2 humana, que elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2. En un modo de realización específico, el resto efector IL-2 mutante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En un modo de realización, el resto efector es un resto efector monocatenario.
En un modo de realización, el primer anticuerpo es un anticuerpo de clase IgG de longitud completa, en particular un anticuerpo de subclase IgG1 de longitud completa. En un modo de realización, el resto efector comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con el primer anticuerpo. En un modo de realización, el resto efector comparte un enlace peptídico aminoterminal con el primer anticuerpo. En un modo de realización, el resto efector se fusiona en su extremo N con el extremo C de una de las cadenas pesadas del primer anticuerpo. En un modo de realización particular, el inmunoconjugado comprende no más de un resto efector. En un modo de realización, el inmunoconjugado consiste esencialmente en un resto efector y un primer anticuerpo unido por uno o más conectores peptídicos. En un modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende un resto efector, en particular un resto efector monocatenario, y un primer anticuerpo, en particular un anticuerpo de clase IgG de longitud completa, en el que el resto efector se fusiona en su aminoácido aminoterminal con el extremo carboxílico de una de las cadenas pesadas del primer anticuerpo, opcionalmente a través de un conector peptídico. En determinados modos de realización, el primer anticuerpo comprende en la región Fc una modificación que promueve la heterodimerización de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina no idénticas. En un modo de realización específico, dicha modificación es una modificación de botón en ojal, que comprende una modificación de botón en una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina y una modificación de ojal en la otra de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina. En un modo de realización, el primer anticuerpo comprende una modificación dentro de la interfase entre las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina en el dominio CH3, en el que i) en el dominio CH3 de una cadena pesada, un residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de ese modo una protuberancia ("botón") dentro de la interfase en el dominio CH3 de una cadena pesada que se puede posicionar en una cavidad ("ojal") dentro de la interfase en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, y ii) en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, un residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de ese modo una cavidad ("ojal") dentro de la interfase en el segundo dominio CH3 dentro del que se puede posicionar una protuberancia ("ojal") dentro de la interfase en el primer dominio CH3. En un modo de realización, el primer anticuerpo comprende la sustitución aminoacídica T366W y opcionalmente la sustitución aminoacídica S354C en una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, y las sustituciones aminoacídicas T366S, L368A, Y407V y, opcionalmente, Y349C en la otra de las cadenas pesadas de inmunoglobulina. En un modo de realización particular, el resto efector se fusiona con el aminoácido amino o carboxiterminal de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la modificación de botón.
En un modo de realización, la función efectora reducida del primer anticuerpo se selecciona del grupo de unión reducida a un receptor de Fc activador, ADCC reducida, ADCp reducida, c Dc reducida y secreción de citocinas reducida. En un modo de realización, la función efectora reducida es unión reducida a un receptor de Fc activador. En un modo de realización, el receptor de Fc activador es un receptor humano. En un modo de realización, el receptor de Fc activador es un receptor de Fcy. En un modo de realización específico, el receptor de Fc activador se selecciona del grupo de FcYRIIIa, FcyRI y FcRYIIa. En un modo de realización, el receptor de Fc activador es FcYRIIIa, en particular FcYRIIIa humano. En un modo de realización, la función efectora reducida es una ADCC reducida. En un modo de realización, la función efectora reducida es unión reducida a un receptor de Fc activador y ADCC reducida.
En un modo de realización, el primer anticuerpo se genomanipula mediante la introducción de una o más mutaciones aminoacídicas en la región Fc. En un modo de realización específico, las mutaciones aminoacídicas son sustituciones aminoacídicas. En un modo de realización específico, el primer anticuerpo, en particular un anticuerpo de subclase IgG1 humana de longitud completa, comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329 de las cadenas pesadas de inmunoglobulina (numeración de Kabat). En un modo de realización más específico, la sustitución aminoacídica es P329A o P329G, en particular, P329G. En un modo de realización, el anticuerpo comprende otra sustitución aminoacídica en una posición seleccionada de S228, E233, L234, L235, N297 y P331 de las cadenas pesadas de inmunoglobulina. En un modo de realización más específico, la otra sustitución aminoacídica es S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S. En un modo de realización particular, el anticuerpo comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones P329, L234 y L235 de las cadenas pesadas de inmunoglobulina (numeración de Kabat). En un modo de realización más particular, el anticuerpo comprende las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G (LALA P329G) en las cadenas pesadas de inmunoglobulina.
En determinados modos de realización, el primer anticuerpo se dirige a un antígeno presentado en una célula tumoral o en un entorno de células tumorales. En un modo de realización específica, el primer anticuerpo se dirige a un antígeno seleccionado del grupo de proteína de activación de fibroblastos (FAP), el dominio A1 de tenascina C (TNC A1), el dominio A2 de tenascina C (TNC A2), el dominio adicional B de fibronectina (EDB), antígeno carcinoembrionario (CEA) y proteoglucano de sulfato de condroitina asociado al melanoma (MCSP). En un modo de realización particular, el primer anticuerpo se dirige a CEA. En otro modo de realización particular, el primer anticuerpo se dirige a FAP.
En un modo de realización, la función efectora incrementada del segundo anticuerpo se selecciona del grupo de unión incrementada a un receptor de Fc activador, ADCC incrementada, ADCP incrementada, CDC incrementada y secreción de citocinas incrementada. En un modo de realización, la función efectora incrementada es unión incrementada a un receptor de Fc activador. En un modo de realización específico, el receptor de Fc activador se selecciona del grupo de FcYRIIIa, FcyRI y FcRYlIa. En un modo de realización, el receptor de Fc activador es FcYRIIIa. En un modo de realización, la función efectora incrementada es una ADCC incrementada. En un modo de realización, la función efectora incrementada es unión incrementada a un receptor de Fc activador y ADCC incrementada.
En un modo de realización, el segundo anticuerpo se genomanipula mediante la introducción de una o más mutaciones aminoacídicas en la región Fc. En un modo de realización específico, las mutaciones aminoacídicas son sustituciones aminoacídicas. En un modo de realización, el segundo anticuerpo se genomanipula mediante modificación de la glucosilación en la región Fc. En un modo de realización específico, la modificación de la glucosilación en la región Fc es una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc, en comparación con un anticuerpo no genomanipulado. En un modo de realización incluso más específico, la proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc es al menos un 20 %, preferentemente al menos un 50 %, lo más preferentemente al menos un 70 % de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc. En otro modo de realización específico, la modificación de la glucosilación en la región Fc es una proporción incrementada de oligosacáridos bisecados en la región Fc, en comparación con un anticuerpo no genomanipulado. En un modo de realización incluso más específico, la proporción incrementada de oligosacáridos bisecados en la región Fc es al menos aproximadamente un 20 %, preferentemente al menos un 50 %, y lo más preferentemente al menos un 70 % de oligosacáridos bisecados en la región Fc. En aún otro modo de realización específico, la modificación de la glucosilación en la región Fc es una proporción incrementada de oligosacáridos bisecados, no fucosilados en la región Fc, en comparación con un anticuerpo no manipulado. Preferentemente, el segundo anticuerpo tiene al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 35 %, o al menos aproximadamente un 50 % de oligosacáridos bisecados, no fucosilados en la región Fc. En un modo de realización particular, el segundo anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado. Una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc de un anticuerpo da como resultado que el anticuerpo tenga una función efectora incrementada, en particular una ADCC incrementada. En un modo de realización particular, los oligosacáridos no fucosilados son oligosacáridos bisecados, no fucosilados.
En un modo de realización, el segundo anticuerpo es un anticuerpo de clase IgG de longitud completa, en particular un anticuerpo de la subclase IgG1 de longitud completa. En determinados modos de realización, el segundo anticuerpo se dirige a un antígeno presentado en una célula tumoral. En un aspecto, el segundo anticuerpo se dirige a un antígeno seleccionado del grupo de CD20, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), h ER2, HER3, receptor del factor de crecimiento insulínico 1 (IGF-1R), c-Met, proteína 1 que contiene el dominio CUB (CDCP1), antígeno carcinoembrionario (CEA) y proteoglucano de sulfato de condroitina asociado al melanoma (MCSP).
En un modo de realización particular, el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-CD20 genomanipulado para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado. Los anticuerpos anti-CD20 adecuados se describen en el documento WO 2005/044859. En otro modo de realización particular, el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-EGFR genomanipulado para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado. Los anticuerpos anti-EGFR adecuados se describen en los documentos WO 2006/082515 y WO 2008/017963. En otro modo de realización particular, el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-IGF-1R genomanipulado para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado. Los anticuerpos anti-IGF-1R adecuados se describen en el documento WO 2008/077546. En aún otro modo de realización particular, el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-CEA genomanipulado para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado. Los anticuerpos anti-CEA adecuados se describen en la publicación de PCT número WO 2011/023787. En aún otro modo de realización particular, el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-HER3 genomanipulado para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado. Los anticuerpos anti-HER3 adecuados se describen en la publicación de PCT número WO 2011/076683. En aún otro modo de realización particular, el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-CDCP1 genomanipulado para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado. Los anticuerpos anti-CDCP1 adecuados se describen en la publicación de PCT número WO 2011/023389. En un modo de realización, el segundo anticuerpo se genomanipula para que tenga glucosilación modificada en la región Fc, en comparación con un anticuerpo no genomanipulado, produciendo el anticuerpo en una célula huésped que tiene actividad alterada de una o más glucosiltransferasas.
En un modo de realización, el segundo anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc, en comparación con un anticuerpo no genomanipulado, produciendo el anticuerpo en una célula huésped que tiene actividad p-(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII) incrementada. En un modo de realización particular, la célula huésped tiene adicionalmente actividad a-manosidasa II (ManII) incrementada. En otro modo de realización, el segundo anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc, en comparación con un anticuerpo no genomanipulado, produciendo el anticuerpo en una célula huésped que tiene actividad a-(1,6)-fucosiltransferasa disminuida.
En un modo de realización, la enfermedad es un trastorno tratable mediante estimulación de la función de células efectoras. En un modo de realización, la enfermedad es un trastorno de proliferación celular. En un modo de realización particular, la enfermedad es cáncer. En un aspecto específico, el cáncer se selecciona del grupo de cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de cerebro, linfoma, leucemia y cáncer de piel. En un modo de realización, el individuo es un mamífero. En un modo de realización particular, el individuo es un ser humano.
En un modo de realización particular, la divulgación proporciona una combinación de
(a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo de clase IgG de longitud completa genomanipulado para que tenga una función efectora reducida mediante la introducción de una o más mutaciones aminoacídicas en la región Fc y una citocina, en el que el resto efector se fusiona en su aminoácido aminoterminal con el extremo carboxílico de una de las cadenas pesadas del primer anticuerpo, opcionalmente a través de un conector peptídico, y
(b) un segundo anticuerpo de clase IgG de longitud completa genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada mediante modificación de la glucosilación en la región Fc, para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesite.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La divulgación también engloba el uso de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en un individuo.
La divulgación proporciona además un procedimiento de tratamiento de una enfermedad en un individuo, que comprende administrar al individuo una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, en una cantidad terapéuticamente eficaz.
También se proporciona por la divulgación un procedimiento de estimulación de la función de células efectoras en un individuo, que comprende administrar al individuo una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, en una cantidad eficaz para estimular la función de las células efectoras.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un kit destinado al tratamiento de una enfermedad, que comprende en el mismo recipiente o en recipientes separados (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, y (c) opcionalmente un prospecto del envase que comprende instrucciones impresas que indican el uso del tratamiento combinado como un procedimiento para tratar la enfermedad.
Se entiende que el inmunoconjugado y el segundo anticuerpo usados en la composición farmacéutica, uso, procedimientos y kit de acuerdo con la invención pueden incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, descritos en los párrafos precedentes en relación con los segundos anticuerpos e inmunoconjugados útiles para la invención.
Breve descripción de los dibujos
FIGURA 1. El inmunoconjugado IgG-IL-2 28H1 dirigido a FAP (A) o el inmunoconjugado IgG-IL-2 DP47GS no dirigido (B), que comprende la IL-2 mutante cuádruple (qm) que carece de unión a CD25, y el GlycoMab anti-EGFR se sometieron a prueba en la línea celular de carcinoma de cabeza y cuello humana FaDu, inyectada por vía intralingual en ratones SCID. Los datos muestran que la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm 28H1, pero no el inmunoconjugado IgG-IL2 qm DP47GS, y el GlycoMab anti-EGFR media una eficacia superior en términos de la mediana de supervivencia potenciada en comparación con el inmunoconjugado respectivo o el GlycoMab anti-EGFR solo (véase el ejemplo 1).
FIGURA 2. Destrucción global de células tumorales A549 por los PBMC (E:T = 10:1, 4 horas), pretratados o no con inmunoconjugado IgG-IL2 qm 28H1 dirigido a FAP o IL-2 (Proleukin) 0,57 nM (A) o 5,7 nM (B), en presencia de diferentes concentraciones de GlycoMab anti-EGFR (véase el ejemplo 2).
FIGURA 3. El inmunoconjugado IgG-IL-2 CH1A1A dirigido a CEA que comprende la IL-2 mutante cuádruple (qm) que carece de unión a CD25, y el GlycoMab anti-EGFR (A) o cetuximab (B) se sometieron a prueba en la línea celular de carcinoma colorrectal humana LS174T, inyectada por vía intraesplénica en ratones SCID transgénicos para FcyRIII. Los datos muestran que la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y el GlycoMab anti-EGFR media una eficacia superior en términos de la mediana de supervivencia y supervivencia global potenciada en comparación con el inmunoconjugado respectivo, el GlycoMab anti-EGFR o cetuximab solo, así como la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y cetuximab (véase el ejemplo 3).
FIGURA 4. El inmunoconjugado IgG-IL-2 CH1A1A dirigido a CEA que comprende la IL-2 mutante cuádruple (qm) que carece de unión a CD25, y el GlycoMab anti-EGFR (A) o cetuximab (B) se sometieron a prueba en la línea celular de carcinoma de pulmón humana A549, inyectada por vía intravenosa en ratones SCID transgénicos para FcyRIII. Los datos muestran que la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y el GlycoMab anti-EGFR media una eficacia superior en términos de la mediana de supervivencia y supervivencia global potenciada en comparación con el inmunoconjugado respectivo o el GlycoMab anti-EGFR solo, así como la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y cetuximab (véase el ejemplo 4).
FIGURA 5. El inmunoconjugado IgG-IL-2 CH1A1A dirigido a CEA que comprende la IL-2 mutante cuádruple (qm) que carece de unión a CD25, y el GlycoMab anti-Her3 se sometieron a prueba en la línea celular de carcinoma colorrectal humana LS174T, inyectados por vía intraesplénica en ratones SCID transgénicos para FcyRIII. Los datos muestran que la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y el GlycoMab anti-Her3 media una eficacia superior en términos de la mediana de supervivencia potenciada en comparación con el inmunoconjugado respectivo o el GlycoMab anti-Her3 solo (véase el ejemplo 5).
FIGURA 6. El inmunoconjugado IgG-IL-2 28H1 dirigido a FAP que comprende la IL-2 mutante cuádruple (qm) que carece de unión a CD25, y el GlycoMab anti-EGFR se sometieron a prueba en la línea celular de carcinoma renal humana ACHN, inyectada por vía intrarrenal en ratones SCID transgénicos para FcyRIII. Los datos muestran que la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y el GlycoMab anti-EGFR media una eficacia superior en términos de la mediana de supervivencia y supervivencia global potenciada en comparación con el GlycoMab anti-EGFR solo, o el GlycoMab anti-EGFR en combinación con Proleukin® (véase el ejemplo 6).
FIGURA 7. Destrucción global de células LS174T por los PBMC tras el tratamiento con GlycoMab anti-Her3 solo (panel izquierdo), el inmunoconjugado IgG-IL-2 qm CH1A1A solo (panel derecho) o la combinación del inmunoconjugado IgG-IL-2 qm CH1A1A con el GlycoMab anti-Her3 (panel derecho).
FIGURA 8. Expresión de CD25 (A) o CD69 (B) en linfocitos NK tras el tratamiento con GlycoMab anti-Her3 solo (panel izquierdo), el inmunoconjugado IgG-IL-2 qm CH1A1A solo (panel derecho) o la combinación del inmunoconjugado IgG-IL-2 qm CH1A1A con el GlycoMab anti-Her3 (panel derecho).
Descripción detallada de la invención
En un primer aspecto, la divulgación proporciona una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesite.
La divulgación proporciona además un procedimiento de tratamiento de una enfermedad en un individuo, que comprende administrar al individuo una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, en una cantidad terapéuticamente eficaz.
También se proporciona por la divulgación un procedimiento de estimulación de la función de células efectoras en un individuo, que comprende administrar al individuo una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, en una cantidad eficaz para estimular la función de las células efectoras.
Definiciones
Los términos se usan en el presente documento como se usan en general en la técnica, a menos que se defina de otro modo a continuación.
Como se usa en el presente documento, el término "inmunoconjugado" se refiere a una molécula polipeptídica que incluye al menos un resto efector y un anticuerpo. En determinados modos de realización, el inmunoconjugado comprende no más de un resto efector. Los inmunoconjugados particulares de acuerdo con la invención consisten esencialmente en un resto efector y un anticuerpo unido por uno o más conectores peptídicos. Los inmunoconjugados particulares de acuerdo con la invención son proteínas de fusión, es decir, los componentes del inmunoconjugado están unidos por enlaces peptídicos.
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo de control" se refiere a un anticuerpo como existiría libre de restos efectores. Por ejemplo, cuando se compara un inmunoconjugado IgG-IL2 como se describe en el presente documento con un anticuerpo de control, el anticuerpo de control es IgG libre, en el que el inmunoconjugado IgG-IL2 y la molécula de IgG libre se pueden unir específicamente al mismo determinante antigénico.
Como se usa en el presente documento, el término "determinante antigénico" es sinónimo de "antígeno" y "epítopo" y se refiere a un sitio (por ejemplo, un tramo contiguo de aminoácidos o una configuración conformacional compuesta por diferentes regiones de aminoácidos no contiguos) en una macromolécula polipeptídica a la que se une un anticuerpo, formando un complejo de anticuerpo-antígeno. Se pueden encontrar determinantes antigénicos útiles, por ejemplo, en las superficies de células tumorales, en las superficies de células infectadas por virus, en las superficies de otras células enfermas, libres en el suero sanguíneo y/o en la matriz extracelular (MEC).
Por "se une específicamente" se quiere decir que la unión es selectiva para el antígeno y se puede discriminar de interacciones no deseadas o no específicas. La capacidad de un anticuerpo para unirse a un determinante antigénico específico se puede medir a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien otras técnicas familiares para un experto en la técnica, por ejemplo, la técnica de resonancia de plasmón superficial (analizada en un instrumento BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J17, 323-329 (2000)) y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)).
Los términos "anticuerpo anti-[antígeno]" y "un anticuerpo que se une a [antígeno]" se refieren a un anticuerpo que se puede unir al antígeno respectivo con una afinidad suficiente de manera que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico al dirigirse contra el antígeno. En un modo de realización, el grado de unión de un anticuerpo anti-[antígeno] a una proteína no relacionada es inferior a aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo al antígeno medida, por ejemplo, mediante un radioinmunoanálisis (RIA). En determinados modos de realización, un anticuerpo que se une a [antígeno] tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 pM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, o < 0,001 nM (por ejemplo, 10'8 M o menos, por ejemplo, de 10'8 M a 10'13 M, por ejemplo, de 10'9 M a 10'13 M).
"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su ligando de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañera Y se puede representar en general por la constante de disociación (KD), que es la proporción de las constantes de velocidad de disociación y asociación (kdis y kas, respectivamente). Por tanto, las afinidades equivalentes pueden comprender diferentes constantes de velocidad, siempre que la proporción de las constantes de velocidad permanezca igual. La afinidad se puede medir por procedimientos bien establecidos conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Un procedimiento particular para medir la afinidad es la resonancia de plasmón superficial (SPR).
De acuerdo con un modo de realización, KD se mide por resonancia de plasmón superficial usando un aparato BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25 °C con el ligando (por ejemplo, receptor del resto efector, receptor de Fc o antígeno diana) inmovilizado en chips CM5. En resumen, se activan chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, GE Healthcare) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye el ligando recombinante con acetato de sodio 10 mM, pH 5,5, a 0,5-30 pg/ml antes de la inyección a una caudal de 10 pl/minuto para lograr aproximadamente 100­ 5000 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del ligando, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, diluciones en serie de tres a cinco veces del inmunoconjugado (intervalo entre ~0,01 nM a 300 nM) se inyectan en HBS-EP+ (GE Healthcare, HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %, pH 7,4) a 25 °C a un caudal de aproximadamente 30-50 pl/min. Se calculan las velocidades de asociación (kas) y velocidades de disociación (kdis) usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno sencillo (programa informático de evaluación de BIACORE® T100 versión 1.1.1) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. Se calcula la constante de disociación en equilibrio (Kd) como la proporción kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999).
"Unión reducida", por ejemplo unión reducida a un receptor de Fc o a CD25, se refiere a una disminución en la afinidad para la interacción respectiva, como se mide por ejemplo por SPR. Por claridad, el término incluye también la reducción de la afinidad hasta cero (o por debajo del límite de detección del procedimiento analítico), es decir, la supresión completa de la interacción. A la inversa, "unión incrementada" se refiere a un incremento en la afinidad de unión para la interacción respectiva.
Como se usa en el presente documento, los términos "primero" y "segundo" con respecto a los anticuerpos, restos efectores, etc., se usan por conveniencia para distinguir cuando hay más de uno de cada tipo de resto. El uso de estos términos no pretende conferir un orden u orientación específica del inmunoconjugado a menos que así se establezca explícitamente.
Como se usa en el presente documento, el término "resto efector" se refiere a un polipéptido, por ejemplo, una proteína o glucoproteína, que influye en la actividad celular, por ejemplo, a través de la transducción de señales u otras vías celulares. En consecuencia, el resto efector de la invención se puede asociar a la señalización mediada por receptor que transmite una señal desde el exterior de la membrana celular para modular una respuesta en una célula que porta uno o más receptores para el resto efector. En un modo de realización, un resto efector puede provocar una respuesta citotóxica en células que portan uno o más receptores para el resto efector. En otro modo de realización, un resto efector puede provocar una respuesta proliferativa en células que portan uno o más receptores para el resto efector. En otro modo de realización, un resto efector puede provocar la diferenciación en células que portan receptores para el resto efector. En otro modo de realización, un resto efector puede alterar la expresión (es decir, regular por incremento o regular por disminución) de una proteína celular endógena en células que portan receptores para el resto efector. Los ejemplos no limitantes de restos efectores incluyen citocinas, factores de crecimiento, hormonas, enzimas, sustratos y cofactores. El resto efector se puede asociar con un anticuerpo en una variedad de configuraciones para formar un inmunoconjugado.
Como se usa en el presente documento, el término "citocina" se refiere a una molécula que media y/o regula una función o proceso biológico o celular (por ejemplo, inmunidad, inflamación y hematopoyesis). El término "citocina" como se usa en el presente documento incluye "linfocinas", "quimiocinas", "monocinas" e "interleucinas". Los ejemplos de citocinas útiles incluyen, pero no se limitan a, GM-CSF, IL-1a, IL-1p, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-a, IFN-p, IFN-y, MIP-1a, MIP-1 p, TGF-p, TNF-a y TNF-p. Las citocinas particulares son IL-2 e IL-12. El término "citocina", como se usa en el presente documento, también incluye variantes de citocinas que comprenden una o más mutaciones aminoacídicas en las secuencias de aminoácidos de la correspondiente citocina natural, tal como, por ejemplo, las variantes de IL-2 descritas en Sauvé et al., Proc Natl Acad Sci USA 88, 4636-40 (1991); Hu et al., Blood 101, 4853-4861 (2003) y la publicación de patente de EE. UU. n.° 2003/0124678; Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000); Heaton et al., Cancer Res 53, 2597-602 (1993) y la patente de EE. UU. n.° 5.229.109; la publicación de patente de EE. UU. n.° 2007/0036752; el documento WO 2008/0034473; el documento WO 2009/061853; o en el presente documento anteriormente y a continuación.
Como se usa en el presente documento, el término "monocatenaria" se refiere a una molécula que comprende monómeros de aminoácidos unidos linealmente por enlaces peptídicos. En un modo de realización, el resto efector es un resto efector monocatenario. Los ejemplos no limitantes de restos efectores monocatenarios incluyen citocinas, factores de crecimiento, hormonas, enzimas, sustratos y cofactores. Cuando el resto efector es una citocina y la citocina de interés se encuentra normalmente como un multímero en la naturaleza, cada subunidad de la citocina multimérica se codifica secuencialmente por la cadena sencilla del resto efector. En consecuencia, los ejemplos no limitantes de restos efectores monocatenarios útiles incluyen GM-CSF, IL-1 a, IL-1 p, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-a, IFN-p, IFN-y, MIP-1a, MIP-1 p, TGF-p, TNF-a y TNF-p.
Como se usa en el presente documento, el término "resto efector de control" se refiere a un resto efector no conjugado. Por ejemplo, cuando se compara un inmunoconjugado de IL-2 como se describe en el presente documento con un resto efector de control, el resto efector de control es IL-2 libre no conjugada. Asimismo, por ejemplo, cuando se compara un inmunoconjugado de IL-12 con un resto efector de control, el resto efector de control es IL-12 libre, no conjugada (por ejemplo, existente como una proteína heterodimérica en la que las subunidades p40 y p35 comparten solo enlace(s) disulfuro).
Como se usa en el presente documento, el término "receptor de resto efector" se refiere a una molécula de polipéptido que se puede unir específicamente a un resto efector. Por ejemplo, cuando IL-2 es el resto efector, el receptor del resto efector que se une a una molécula de IL-2 (por ejemplo, un inmunoconjugado que comprende IL-2) es el receptor de IL-2. De forma similar, por ejemplo, cuando IL-12 es el resto efector de un inmunoconjugado, el receptor del resto efector es el receptor de IL-12. Cuando un resto efector se une específicamente a más de un receptor, todos los receptores que se unen específicamente al resto efector son "receptores del resto efector" para ese resto efector.
El término "anticuerpo" se usa en el presente documento en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, que incluyen pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada y comprendan una región Fc o una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina.
Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de inmunoglobulina natural.
El término "inmunoglobulina" se refiere a una proteína que tiene la estructura de un anticuerpo natural. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la clase IgG son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que se unen con enlaces disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), también llamados región constante de la cadena pesada. De forma similar, desde el extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio constante ligero (CL), también llamado región constante de la cadena ligera. La cadena pesada de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de cinco tipos, llamados a (IgA), 6 (IgD), £ (IgE), y (IgG) o p (IgM), algunos de los cuales se pueden dividir además en subtipos, por ejemplo, Y1 (IgG1), Y2 (IgG2), Y3 (IgG3), Y4 (IgG4), a1 (IgA1) y a2 (IgA2). La cadena ligera de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), basados en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante. Una inmunoglobulina consiste esencialmente en dos moléculas Fab y una región Fc, unidas por medio de la región bisagra de inmunoglobulina.
Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv), anticuerpos de dominio único y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plückthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994); véase también el documento WO 93/16185; y las patentes de EE. UU. n.° 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopos de unión al receptor de rescate y que tienen una semivida in vivo incrementada, véase la patente de EE. UU. n.° 5.869.046. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129­ 134 (2003); y Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados modos de realización, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1). Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.
El término "dominio de unión a antígeno" se refiere a la parte de un anticuerpo que comprende el área que se une específicamente a y es complementaria a parte o la totalidad de un antígeno. Se puede proporcionar un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, por uno o más dominios variables de anticuerpo (también llamados regiones variables de anticuerpo). En particular, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo.
El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural tienen, en general, estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). Véase, por ejemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un dominio VH o VL único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno.
El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son de secuencia hipervariable y/o forman bucles definidos estructuralmente ("bucles hipervariables"). En general, los anticuerpos tetracatenarios naturales comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR comprenden en general residuos aminoacídicos de los bucles hipervariables y/o de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), siendo las últimas las de variabilidad de secuencia más alta y/o estando implicadas en el reconocimiento antigénico. Con la excepción de la CDR1 en VH, las CDR comprenden en general los residuos aminoacídicos que forman los bucles hipervariables. Las regiones hipervariables (HVR) también se denominan "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), y estos términos se usan en el presente documento de manera intercambiable en referencia a porciones de la región variable que forman las regiones de unión a antígeno. Esta región particular se ha descrito por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) y Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987), donde las definiciones incluyen residuos aminoacídicos superpuestos o subconjuntos de los mismos cuando se comparan entre sí. No obstante, se pretende que la aplicación de cualquier definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo esté dentro del alcance del término como se define y se usa en el presente documento. Los residuos aminoacídicos apropiados que engloban las CDR, como se define por cada una de las referencias citadas anteriormente, se exponen a continuación en la tabla 1 a modo de comparación. Los números de residuos exactos que engloba una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar de forma rutinaria los residuos que comprende una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.
TABLA 1. Definiciones de CDR1
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1 La numeración de todas las definiciones de CDR en la tabla 1 es de acuerdo con las convenciones de numeración expuestas por Kabat et al. (véase a continuación).
2 "AbM" con una "b" minúscula, como se usa en la tabla 1, se refiere a las CDR como se define por el programa informático de modelado de anticuerpos "AbM" de Oxford Molecular.
Kabat et al. también definieron un sistema de numeración para secuencias de región variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de la región variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la propia secuencia. Como se usa en el presente documento, la "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que se especifique de otro modo, las referencias a la numeración de posiciones de residuos aminoacídicos específicas en una región variable de anticuerpo están de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.
Las secuencias polipeptídicas del listado de secuencias (es decir, SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) no están numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, está dentro de la habilidad del experto en la técnica convertir la numeración de las secuencias del listado de secuencias a la numeración de Kabat.
"Región estructural" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste en general en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen, en general, en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 6, £, y y M, respectivamente.
El término "región Fc" o "dominio Fc" se usa en el presente documento para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de IgG pueden variar ligeramente, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define normalmente por extenderse de Cys226, o de Pro230, al extremo carboxiterminal de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede estar o no estar presente. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante está de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Una "región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina" pretende incluir variantes alélicas naturales de la región Fc de una inmunoglobulina así como variantes que tienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones o deleciones pero que no disminuyen sustancialmente la capacidad de la inmunoglobulina para mediar funciones efectoras (tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos). Por ejemplo, se pueden eliminar uno o más aminoácidos del extremo N o del extremo C de la región Fc de una inmunoglobulina sin pérdida sustancial de la función biológica. Dichas variantes se pueden seleccionar de acuerdo con las reglas generales conocidas en la técnica para que tenga un efecto mínimo sobre la actividad (véase, por ejemplo, Bowie et al., Science 247, 1306-10 (1990)).
Una "modificación que promueve la heterodimerización" es una manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de un polipéptido, por ejemplo, una cadena pesada de inmunoglobulina, que reduce o impide la asociación del polipéptido con un polipéptido idéntico para formar un homodímero. Una modificación que promueve la heterodimerización como se usa en el presente documento incluye en particular las modificaciones separadas hechas a cada uno de dos polipéptidos deseados para formar un dímero, en el que las modificaciones son complementarias entre sí para promover la asociación de los dos polipéptidos. Por ejemplo, una modificación que promueve la heterodimerización puede alterar la estructura o carga de uno o ambos de los polipéptidos deseados para formar un dímero para hacer su asociación estérica o electrostáticamente favorable, respectivamente. La heterodimerización se produce entre dos polipéptidos no idénticos, tales como dos cadenas pesadas de inmunoglobulina en las que los componentes de inmunoconjugados adicionales fusionados a cada una de las cadenas pesadas (por ejemplo, el resto efector) no son iguales. En los inmunoconjugados de la presente invención, la modificación que promueve la heterodimerización está en la(s) cadena(s) pesada(s), específicamente en la región Fc, de una molécula de inmunoglobulina. En algunos modos de realización, la modificación que promueve la heterodimerización comprende una mutación aminoacídica, específicamente una sustitución aminoacídica. En un modo de realización particular, la modificación que promueve la heterodimerización comprende una mutación aminoacídica separada, específicamente una sustitución aminoacídica, en cada una de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina.
El término "funciones efectoras" cuando se usa en referencia a los anticuerpos se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión a receptor de Fc, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de citocinas, captación de antígenos mediada por complejo inmunitario por células presentadoras de antígenos, regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.
Como se usa en el presente documento, el término "células efectoras" se refiere a una población de linfocitos que muestran receptores de restos efectores, por ejemplo, receptores de citocinas, y/o receptores de Fc en su superficie a través de los que se unen a un resto efector, por ejemplo, una citocina, y/o una región Fc de un anticuerpo y contribuyen a la destrucción de células diana, por ejemplo, células tumorales. Las células efectoras pueden, por ejemplo, mediar efectos citotóxicos o fagocíticos. Las células efectoras incluyen, pero no se limitan a, linfocitos T efectores tales como linfocitos T citotóxicos CD8+, linfocitos T auxiliares CD4+, linfocitos T y§, linfocitos NK, linfocitos citolíticos activados por linfocina (LAK) y macrófagos/monocitos. Dependiendo del patrón de expresión de su receptor puede haber subconjuntos diferentes de células efectoras, es decir (a) células que expresan receptores para un resto efector particular pero no receptores de Fc y se estimulan por los inmunoconjugados pero no por los anticuerpos de la invención (por ejemplo, linfocitos T, que expresan los receptores de IL-2); (b) células que expresan receptores de Fc pero no receptores para un resto efector particular y se estimulan por los anticuerpos pero no por los inmunoconjugados de la invención; y (c) células que expresan tanto receptores de Fc como receptores para un resto efector particular y se estimulan simultáneamente por los anticuerpos y los inmunoconjugados de la invención (por ejemplo, linfocitos Nk , que expresan receptores de FcyIII y receptores de IL-2).
Como se usa en el presente documento, se considera que los términos "genomanipulación, genomanipulado, genomanipula" incluyen cualquier manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de un polipéptido natural o recombinante o fragmento del mismo. La genomanipulación incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos, del patrón de glucosilación o del grupo de cadena lateral de aminoácidos individuales, así como combinaciones de estos enfoques. La "genomanipulación", en particular con el prefijo "gluco", así como el término "genomanipulación de la glucosilación" incluye la genomanipulación metabólica de la maquinaria de glucosilación de una célula, incluyendo las manipulaciones genéticas de las vías de síntesis de los oligosacáridos para lograr una alteración de la glucosilación de las glucoproteínas expresadas en las células. Además, la genomanipulación de la glucosilación incluye los efectos de las mutaciones y del medio celular sobre la glucosilación. En un modo de realización, la genomanipulación de la glucosilación es una alteración en la actividad de glucosiltransferasa. En un modo de realización particular, la genomanipulación da como resultado una actividad glucosaminiltransferasa y/o actividad fucosiltransferasa alteradas. La genomanipulación de la glucosilación se puede usar para obtener una "célula huésped que tenga una actividad GnTIII incrementada" (por ejemplo, una célula huésped que se ha manipulado para expresar niveles incrementados de uno o más polipéptidos que tienen actividad p-(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)), una "célula huésped que tiene actividad ManII incrementada" (por ejemplo, una célula huésped que se ha manipulado para expresar niveles incrementados de uno o más polipéptidos que tienen actividad a-manosidasa II (ManII)) o una "célula huésped que tiene actividad a-(1,6)-fucosiltransferasa disminuida" (por ejemplo, una célula huésped que se ha manipulado para expresar niveles disminuidos de a-(1,6)-fucosiltransferasa).
El término "mutación aminoacídica", como se usa en el presente documento, pretende englobar sustituciones, deleciones, inserciones y modificaciones aminoacídicas. Se puede realizar cualquier combinación de sustitución, deleción, inserción y modificación para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión reducida a un receptor de Fc. Las deleciones e inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen deleciones e inserciones de aminoácidos amino y/o carboxiterminales. Las mutaciones aminoacídicas particulares son sustituciones aminoacídicas. Con el propósito de alterar, por ejemplo, las características de unión de una región Fc, son en particular preferentes las sustituciones aminoacídicas no conservadoras, es decir, el reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas diferentes. Las sustituciones aminoacídicas incluyen el reemplazo por aminoácidos no naturales o por derivados de aminoácidos naturales de los veinte aminoácidos estándar (por ejemplo, 4-hidroxiprolina, 3-metilhistidina, ornitina, homoserina, 5-hidroxilisina). Se pueden generar mutaciones aminoacídicas usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis dirigida a sitio, PCR, síntesis génica y similares. Se contempla que también pueden ser útiles procedimientos de alteración del grupo de cadena lateral de un aminoácido por procedimientos distintos de genomanipulación, tales como modificación química. Se pueden usar diversas designaciones en el presente documento para indicar la misma mutación aminoacídica. Por ejemplo, una sustitución de prolina en la posición 329 de la región Fc por glicina se puede indicar como 329G, G329, G329, P329G o Pro329Gly.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin tener en consideración ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la máxima alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde se ha registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían. En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada (que, de forma alternativa, se puede parafrasear como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como sigue:
100 veces la fracción X/Y
donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos de B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.
Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pasos. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento. Una célula huésped es cualquier tipo de sistema celular que se puede usar para generar los anticuerpos e inmunoconjugados usados para la presente invención. En un modo de realización, la célula huésped se genomanipula para permitir la producción de un anticuerpo con oligosacáridos modificados. En determinados modos de realización, las células huésped se han manipulado para expresar niveles incrementados de uno o más polipéptidos que tienen actividad p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII). En determinados modos de realización, las células huésped se han manipulado adicionalmente para expresar niveles incrementados de uno o más polipéptidos que tienen actividad a-manosidasa II (ManII). Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, tales como células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insecto y células vegetales, por nombrar solo algunas, pero también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o tejido animal o vegetal cultivado.
Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido que tiene actividad GnTIII" se refiere a polipéptidos que pueden catalizar la adición de un residuo de N-acetilglucosamina (GIcNAc) en un enlace p-1,4 al manósido unido a p del núcleo de trimanosilo de oligosacáridos unidos a N. Esto incluye polipéptidos de fusión que presentan actividad enzimática similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad de la p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III, también conocida como p-1,4-manosil-glucoproteína 4-beta-N-acetilglucosaminiltransferasa (EC 2.1/4/144), de acuerdo con el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB), como se mide en un ensayo biológico particular, con o sin dependencia de la dosis. En el caso de que exista dependencia de la dosis, no necesita ser idéntica a la de GnTIII, sino en su lugar, sustancialmente similar a la dependencia de la dosis en una actividad dada en comparación con la GnTIII (es decir, el polipéptido candidato presentará mayor actividad o no más de aproximadamente 25 veces menos y, preferentemente, no más de unas diez veces menos actividad, y lo más preferentemente, no más de unas tres veces menos actividad en relación con la GnTIII). En determinados modos de realización, el polipéptido que tiene actividad GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnTIII y el dominio de localización de Golgi de un polipéptido heterólogo residente en Golgi. En particular, el dominio de localización de Golgi es el dominio de localización de manosidasa II o GnTI, lo más en particular el dominio de localización de manosidasa II. De forma alternativa, el dominio de localización de Golgi se selecciona del grupo que consiste en: el dominio de localización de manosidasa I, el dominio de localización de GnTII y el dominio de localización de la a-1,6-fucosiltransferasa del núcleo. Los procedimientos para generar dichos polipéptidos de fusión y usarlos para producir anticuerpos con funciones efectoras incrementadas se divulgan en el documento WO 2004/065540, la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 60/495.142 y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0241817.
Como se usa en el presente documento, el término "dominio de localización de Golgi" se refiere a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido residente en Golgi que es responsable de anclar el polipéptido a una localización dentro del aparato de Golgi. En general, los dominios de localización comprenden "colas" aminoterminales de una enzima.
Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido que tiene actividad ManII" se refiere a polipéptidos que pueden catalizar la hidrólisis de los residuos terminales de a-D-manosa unidos a 1,3 y 1,6 en el producto intermedio ramificado de manosa GlcNAcMansGlcNAc2 de oligosacáridos unidos a N. Esto incluye polipéptidos que presentan una actividad enzimática similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad de la a-manosidasa II de Golgi, también conocida como oligosacárido de manosilo 1,3-1,6-a-manosidasa II (EC 3.1/2/114), de acuerdo con el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB).
Un "receptor de Fc activador' es un receptor de Fc que, después del acoplamiento por una región Fc de un anticuerpo, provoca eventos de señalización que estimulan a la célula portadora del receptor para realizar funciones efectoras. Los receptores de Fc activadores incluyen FcYRIIIa (CD16a), FcyRI (CD64), FcYRIIa (CD32) y FcaRI (CD89).
La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) es un mecanismo inmunitario que da lugar a la lisis de células diana recubiertas de anticuerpo por células efectoras inmunitarias. Las células diana son células a las que se unen específicamente anticuerpos o fragmentos de los mismos que comprenden una región Fc, en general por medio de la parte de proteína que está en el extremo N de la región Fc. Como se usa en el presente documento, el término "ADCc incrementada/reducida" se define como un incremento/reducción del número de células diana que se lisan en un tiempo dado, a una concentración dada de anticuerpo en el medio que rodea las células diana, por el mecanismo de ADCC definido anteriormente, y/o bien una reducción/incremento de la concentración de anticuerpo, en el medio que rodea las células diana, requerida para lograr la lisis de un número dado de células diana en un tiempo dado, por el mecanismo de ADCC. El incremento/reducción de la ADCC es en relación con la ADCC mediada por el mismo anticuerpo, producida por el mismo tipo de células huésped, usando los mismos procedimientos estándar de producción, purificación, formulación y almacenamiento (que se conocen por los expertos en la técnica), pero que no se ha genomanipulado. Por ejemplo, el incremento en ADCC mediada por un anticuerpo producido por células huésped genomanipuladas para que tengan un patrón alterado de glucosilación (por ejemplo, para expresar la glucosiltransferasa, GnTIII, u otras glucosiltransferasas) mediante los procedimientos descritos en el presente documento, es en relación con la ADCC mediada por el mismo anticuerpo producido por el mismo tipo de células huésped no genomanipuladas.
Por "anticuerpo que tiene citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) incrementada/reducida" se entiende un anticuerpo que tiene una ADCC incrementada/reducida determinada por cualquier procedimiento adecuado conocido por los expertos en la técnica. Un ensayo de ADCC in vitro aceptado es como sigue:
1) el ensayo usa células diana que son conocidas por expresar el antígeno diana reconocido por la región de unión a antígeno del anticuerpo;
2) el ensayo usa leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) humanos, aislados de sangre de un donante sano elegido al azar, como células efectoras;
3) se lleva a cabo el ensayo de acuerdo con el siguiente protocolo:
i) se aíslan los PBMC usando procedimientos de centrifugación por densidad estándar y se suspenden a 5 x 106 células/ml en medio de cultivo celular RPMI;
ii) se cultivan las células diana por procedimientos de histocultivo estándar, se recogen de la fase de crecimiento exponencial con una viabilidad mayor de un 90 %, se lavan en medio de cultivo celular RPMI, se marcan con 100 microcurios de 51Cr, se lavan dos veces con medio de cultivo celular y se resuspenden en medio de cultivo celular a una densidad de 105 células/ml;
iii) se transfieren 100 microlitros de la suspensión de células diana final anterior a cada pocillo de una placa de microvaloración de 96 pocillos;
iv) se diluye el anticuerpo en serie de 4000 ng/ml a 0,04 ng/ml en medio de cultivo celular y se añaden 50 microlitros de las soluciones de anticuerpo resultantes a las células diana en la placa de microvaloración de 96 pocillos, sometiendo a prueba por triplicado diversas concentraciones de anticuerpo que abarcan todo el intervalo de concentraciones anterior;
v) para los controles de liberación máxima (MR), 3 pocillos adicionales de la placa que contienen las células diana marcadas reciben 50 microlitros de una solución acuosa al 2 % (v/v) de un detergente no iónico (Nonidet, Sigma, St. Louis), en lugar de la solución de anticuerpo (punto iv anterior);
vi) para los controles de liberación espontánea (SR), 3 pocillos adicionales en la placa que contiene las células diana marcadas reciben 50 microlitros de medio de cultivo celular RPMI en lugar de la solución de anticuerpo (punto iv anterior);
vii) a continuación, se centrifuga la placa de microvaloración de 96 pocillos a 50 x g durante 1 minuto y se incuba durante 1 hora a 4 °C;
viii) Se añaden 50 microlitros de la suspensión de PBMC (punto i anterior) a cada pocillo para proporcionar una proporción de células efectoras:diana de 25:1 y se disponen las placas en una estufa de incubación en una atmósfera con un CO2 al 5 % a 37 °C durante 4 horas;
ix) se recoge el sobrenadante sin células de cada pocillo y se cuantifica la radioactividad liberada experimentalmente (ER) usando un contador gamma;
x) se calcula el porcentaje de lisis específica para cada concentración de anticuerpo de acuerdo con la fórmula (ER-MR)/(MR-SR) x 100, donde ER es la radioactividad promedio cuantificada (véase el punto ix anterior) para esa concentración de anticuerpo, MR es la radioactividad promedio cuantificada (véase el punto ix anterior) para los controles de MR (véase el punto v anterior) y SR es la radioactividad promedio cuantificada (véase el punto ix anterior) para los controles de SR (véase el punto vi anterior);
4) "ADCC incrementada/reducida" se define como un incremento/reducción en el porcentaje máximo de lisis específica observada dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo sometido a prueba anterior, y/o bien como una reducción/incremento en la concentración de anticuerpo requerida para lograr la mitad del porcentaje máximo de lisis específica observada dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo sometido a prueba anterior. El incremento/reducción de la ADCC es en relación con la ADCC, medida con el ensayo anterior, mediada por el mismo anticuerpo, producida por el mismo tipo de células huésped, usando los mismos procedimientos estándar de producción, purificación, formulación y almacenamiento, que se conocen por los expertos en la técnica, pero que no se ha genomanipulado.
Como se usa en el presente documento, "combinación" (y las variaciones gramaticales de la misma tales como "combinar" o "que combina") engloba las combinaciones de un inmunoconjugado y un anticuerpo de acuerdo con la invención en las que el inmunoconjugado y el anticuerpo están en el mismo recipiente o en diferentes recipientes, en la misma formulación o en diferentes formulaciones farmacéuticas, se administran conjuntamente o por separado, se administran simultánea o secuencialmente, en cualquier orden, y se administran por la misma vía o por diferentes vías, siempre que el inmunoconjugado y el anticuerpo puedan ejercer simultáneamente sus efectos biológicos en el organismo, es decir estimular simultáneamente las células efectoras. Por ejemplo, "combinar" un inmunoconjugado y un anticuerpo de acuerdo con la invención puede significar administrar en primer lugar el inmunoconjugado en una formulación farmacéutica particular, seguido de la administración del anticuerpo en otra formulación farmacéutica, o viceversa.
Una "cantidad eficaz" de un agente se refiere a la cantidad que es necesaria para dar como resultado un cambio fisiológico en la célula o tejido al que se administra.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, por ejemplo, una composición farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente, por ejemplo, elimina, disminuye, retrasa, minimiza o previene efectos adversos de una enfermedad. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una combinación de varios ingredientes activos puede ser una cantidad terapéuticamente eficaz de cada uno de los ingredientes activos. De forma alternativa, para reducir los efectos secundarios provocadospor el tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de una combinación de varios ingredientes activos puede ser cantidades de los ingredientes activos individuales que son eficaces para producir un efecto aditivo, o superaditivo o sinérgico, y que en combinación son terapéuticamente eficaces, pero que pueden ser cantidades subterapéuticas de uno o varios de los ingredientes activos si se usaran solos.
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En particular, el individuo o sujeto es un humano. El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la formulación.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural de una enfermedad en el individuo que se está tratando, y se puede realizar para profilaxis o bien durante la evolución de la enfermedad clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En algunos modos de realización, se usan combinaciones de la invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.
El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos.
Inmunoconjugados
Los inmunoconjugados útiles en la presente invención son moléculas polipeptídicas que comprenden un resto efector y un anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida, en comparación con un anticuerpo correspondiente no genomanipulado.
Los inmunoconjugados se pueden preparar conjugando químicamente el resto efector con el anticuerpo, o expresando el resto efector y el anticuerpo como una proteína de fusión (véase, por ejemplo, Nakamura y Kubo, Cancer 80, 2650-2655 (1997); y Becker et al., Proc Natl Acad Sci USA 93, 7826-7831 (1996)). Para su uso en la presente invención, en general, son preferentes los inmunoconjugados expresados como proteínas de fusión. En consecuencia, en determinados modos de realización, el resto efector comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con el anticuerpo (es decir, el inmunoconjugado es una proteína de fusión). En dichos inmunoconjugados, un resto efector se puede fusionar, por ejemplo, a una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina. En particular son útiles en la presente invención los inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo de clase IgG de longitud completa, en particular un anticuerpo de subclase IgG1 de longitud completa. En un modo de realización, el resto efector es un resto efector monocatenario. En un modo de realización, el resto efector es una citocina. Los anticuerpos y restos efectores del inmunoconjugado incluyen los que se describen en detalle en el presente documento anteriormente y a continuación. El anticuerpo del inmunoconjugado se puede dirigir contra una variedad de moléculas diana (por ejemplo, un determinante antigénico en una molécula de proteína expresada en una célula tumoral o estroma tumoral). Los ejemplos no limitantes de anticuerpos se describen en el presente documento. Los inmunoconjugados en particular útiles como se describe en el presente documento presentan típicamente una o más de las siguientes propiedades: alta especificidad de acción, toxicidad reducida, buena capacidad de producción y/o estabilidad mejorada, en particular en comparación con inmunoconjugados de diferentes configuraciones dirigidos a los mismos determinantes antigénicos y que portan los mismos restos efectores. Los inmunoconjugados particulares para su uso en la presente invención se describen adicionalmente en la publicación de PCT número WO 2012/146628.
Formatos de inmunoconjugados
Los inmunoconjugados descritos en la publicación de PCT número WO 2012/146628 comprenden no más de un resto efector. En consecuencia, en un modo de realización particular, el inmunoconjugado para su uso en la presente invención comprende no más de un resto efector. En un modo de realización particular, el resto efector es un resto efector monocatenario. El anticuerpo comprendido en los inmunoconjugados de acuerdo con la invención es en particular un anticuerpo de clase IgG de longitud completa, más en particular un anticuerpo de subclase IgG1 de longitud completa. En un modo de realización, el anticuerpo es humano. En otros modos de realización, el anticuerpo es humanizado o quimérico. En un modo de realización, el anticuerpo comprende una región Fc humana, más en particular una región Fc de IgG humana, lo más en particular una región Fc de IgG1 humana. Los anticuerpos útiles en la invención pueden comprender una región constante de la cadena pesada gamma 1 de Ig humana, como se expone en SEQ ID NO: 124 (es decir, los anticuerpos son de la subclase IgG1 humana).
En un modo de realización, el resto efector comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con el anticuerpo. En un modo de realización, el inmunoconjugado consiste esencialmente en un resto efector y un anticuerpo, en particular un anticuerpo de clase IgG, más en particular un anticuerpo de subclase IgG1, unido por uno o más conectores peptídicos. En un modo de realización específico, el resto efector se fusiona en su aminoácido aminoterminal con el aminoácido carboxiterminal de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, opcionalmente a través de un conector peptídico.
En determinados modos de realización, en particular cuando el inmunoconjugado comprende solo un único resto efector, el anticuerpo comprende en la región Fc una modificación que promueve la heterodimerización de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina no idénticas. El sitio de la interacción proteína-proteína más extensa entre las dos cadenas polipeptídicas de una región Fc de IgG humana está en el dominio CH3 de la región Fc. Por tanto, en un modo de realización, dicha modificación está en el dominio CH3 de la región Fc. En un modo de realización específico, dicha modificación es una modificación de botón en ojal, que comprende una modificación de botón en una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina y una modificación de ojal en la otra de las cadenas pesadas de inmunoglobulina. La tecnología de botón en ojal se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.731.168; US 7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) y Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfase de un primer polipéptido y una correspondiente cavidad ("ojal") en la interfase de un segundo polipéptido, de modo que la protuberancia se puede situar en la cavidad para promover la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase del primer polipéptido por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano).
Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfase del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácido grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). La protuberancia y la cavidad se pueden realizar alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, por ejemplo, por mutagénesis específica de sitio o por síntesis peptídica. En un modo de realización específico, una modificación de botón comprende la sustitución aminoacídica T366W en una de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina, y la modificación de ojal comprende las sustituciones aminoacídicas T366S, L368A e Y407V en la otra de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina (numeración de Kabat). En otro modo de realización específico, la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la modificación de botón comprende adicionalmente la sustitución aminoacídica S354C, y la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la modificación de ojal comprende adicionalmente la sustitución aminoacídica Y349C. La introducción de estos dos residuos de cisteína da como resultado la formación de un puente de disulfuro entre las dos cadenas pesadas, estabilizando adicionalmente el dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
En un modo de realización particular, el resto efector se une al aminoácido carboxiterminal de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la modificación de botón.
En un modo de realización alternativo, una modificación que promueve la heterodimerización de dos cadenas polipeptídicas no idénticas comprende una modificación que media los efectos de conducción electrostática, por ejemplo, como se describe en la publicación de PCT WO 2009/089004. En general, este procedimiento implica el reemplazo de uno o más residuos aminoacídicos en la interfaz de las dos cadenas polipeptídicas por residuos aminoacídicos cargados de modo que la formación de homodímeros se vuelve electrostáticamente desfavorable pero la heterodimerización se vuelve electrostáticamente favorable.
Una región Fc confiere al inmunoconjugado propiedades farmacocinéticas favorables, que incluyen una semivida en suero prolongada que contribuye a una buena acumulación en el tejido diana y a una proporción de distribución tejido-sangre favorable. Al mismo tiempo, sin embargo, puede dar lugar a dirigir de forma indeseable el inmunoconjugado a células que expresan receptores de Fc en lugar de a las células que portan antígenos preferentes. Además, la coactivación de las vías de señalización del receptor de Fc puede dar lugar a la liberación de citocinas que, en combinación con el resto efector y la larga semivida del inmunoconjugado, da como resultado una activación excesiva de los receptores de citocinas y efectos secundarios graves tras la administración sistémica. De acuerdo con esto, se ha descrito que los inmunoconjugados de IgG-IL-2 convencionales se asocian con reacciones a la infusión (véase, por ejemplo, King et al., J Clin Oncol 22, 4463-4473 (2004)).
En consecuencia, el anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado se genomanipula para que tenga una función efectora reducida, en comparación con un anticuerpo correspondiente no genomanipulado. En modos de realización particulares, la función efectora reducida es la unión reducida a un receptor de Fc activador. En un modo de realización de este tipo, el anticuerpo comprende en su región Fc una o más mutaciones aminoacídicas que reducen la afinidad de unión del inmunoconjugado a un receptor de Fc activador. Típicamente, la misma o más mutaciones aminoacídicas están presentes en cada una de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina. En un modo de realización, dicha mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del inmunoconjugado al receptor de Fc activador en al menos 2 veces, al menos 5 veces o al menos 10 veces. En modos de realización donde hay más de una mutación aminoacídica que reduce la afinidad de unión del inmunoconjugado al receptor de Fc activador, la combinación de estas mutaciones aminoacídicas puede reducir la afinidad de unión del inmunoconjugado al receptor de Fc activador en al menos 10 veces, al menos 20 veces o incluso al menos 50 veces. En un modo de realización, el inmunoconjugado que comprende un anticuerpo genomanipulado presenta menos de un 20 %, en particular menos de un 10 %, más en particular menos de un 5 % de la afinidad de unión a un receptor de Fc activador en comparación con un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo no genomanipulado. En un modo de realización específico, el receptor de Fc activador es un receptor de Fcy, más específicamente FcYRIIIa, FcyRI o FcYRIIa. Preferentemente, se reduce la unión a cada uno de estos receptores. En algunos modos de realización también se reduce la afinidad de unión por un componente del complemento, específicamente la afinidad de unión por C1q. En un modo de realización, no se reduce la afinidad de unión por el receptor de Fc neonatal (FcRn). Se logra una unión sustancialmente similar a FcRn, es decir, la conservación de la afinidad de unión del anticuerpo a dicho receptor, cuando el anticuerpo (o el inmunoconjugado que comprende dicho anticuerpo) presenta más de aproximadamente un 70 % de la afinidad de unión de una forma no genomanipulada del anticuerpo (o el inmunoconjugado que comprende dicha forma no genomanipulada del anticuerpo) a FcRn. Los anticuerpos, o inmunoconjugados que comprenden dichos anticuerpos, pueden presentar más de aproximadamente un 80 % e incluso más de aproximadamente un 90 % de dicha afinidad. En un modo de realización, la mutación aminoacídica es una sustitución aminoacídica. En un modo de realización, el anticuerpo, en particular un anticuerpo de subclase IgG1 humana, comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329 de la cadena pesada de inmunoglobulina (numeración de Kabat). En un modo de realización más específico, la sustitución aminoacídica es P329A o P329G, en particular, P329G. En un modo de realización, el anticuerpo comprende otra sustitución aminoacídica en una posición seleccionada de S228, E233, L234, L235, N297 y P331 de la cadena pesada de inmunoglobulina. En un modo de realización más específico, la otra sustitución aminoacídica es S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S. En un modo de realización particular, el anticuerpo comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones P329, L234 y L235 de la cadena pesada de inmunoglobulina (numeración de Kabat). En un modo de realización más particular, el anticuerpo comprende las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G (LALA P329G) en la cadena pesada de inmunoglobulina. Esta combinación de sustituciones aminoacídicas casi suprime, en particular, de forma eficaz la unión del recep tor de Fcy de una molécula de IgG humana y, por consiguiente, reduce la función efectora incluyendo la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (Ad CC), como se describe en la publicación de PCT n.° WO 2012/130831. El documento WO 2012/130831 también describe procedimientos de preparación de dichos anticuerpos mutantes y procedimientos para determinar sus propiedades tales como la unión al receptor de Fc o funciones efectoras.
Los anticuerpos mutantes se pueden preparar por deleción, sustitución, inserción o modificación de aminoácidos usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, PCR, síntesis génica y similares. Los cambios nucleotídicos correctos se pueden verificar, por ejemplo, por secuenciación.
La unión a receptores de Fc se puede determinar fácilmente, por ejemplo, por ELISA, o por resonancia de plasmón superficial (SPR) usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores de Fc tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. Un ensayo de unión de este tipo adecuado se describe en el presente documento. De forma alternativa, la afinidad de unión de los anticuerpos o los inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo para los receptores de Fc se puede evaluar usando líneas celulares conocidas por expresar receptores de Fc particulares, tales como linfocitos NK que expresan el receptor de FcyIIIa.
En algunos modos de realización, el anticuerpo del inmunoconjugado se genomanipula para que tenga una función efectora reducida, en particular una ADCC reducida, en comparación con un anticuerpo no genomanipulado.
La función efectora de un anticuerpo, o un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo, se puede medir por procedimientos conocidos en la técnica. Un ensayo adecuado para medir la ADCC se describe en el presente documento. Otros ejemplos de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) y Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA82, 1499-1502 (1985); patente de EE. UU. n.° 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radioactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).
En algunos modos de realización se altera la unión del anticuerpo a un componente del complemento, específicamente a C1q. En consecuencia, en algunos modos de realización en los que el anticuerpo se genomanipula para que tenga una función efectora reducida, dicha función efectora reducida incluye CDC reducida. Se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para determinar si el inmunoconjugado se puede unir a C1q y, por consiguiente, tiene actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos Wo 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento se puede realizar un ensayo de CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045­ 1052 (2003); y Cragg y Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).
En algunos modos de realización, el inmunoconjugado comprende uno o más sitios de escisión proteolítica localizados entre el resto efector y el anticuerpo. Los componentes del inmunoconjugado se pueden unir directamente o a través de diversos conectores, en particular conectores peptídicos que comprenden uno o más aminoácidos, típicamente aproximadamente de 2-20 aminoácidos, que se describen en el presente documento o se conocen en la técnica. Los conectores peptídicos no inmunogénicos adecuados incluyen, por ejemplo, los conectores peptídicos (G4S)n, (SG4)n o G4(SG4)n, en los que n es, en general, un número entre 1 y 10, típicamente entre 2 y 4.
Anticuerpos de inmunoconjugados
El anticuerpo del inmunoconjugado de la invención es, en general, una molécula de inmunoglobulina que se une a un determinante antigénico específico y puede dirigir la entidad a la que está unido (por ejemplo, un resto efector) a un sitio diana, por ejemplo, a un tipo específico de célula tumoral o estroma tumoral que porta el determinante antigénico. El inmunoconjugado se puede unir a determinantes antigénicos encontrados, por ejemplo, en las superficies de células tumorales, en las superficies de células infectadas por virus, en las superficies de otras células enfermas, libres en el suero sanguíneo y/o en la matriz extracelular (MEC). Los ejemplos no limitantes de antígenos tumorales incluyen MAGE, MART-1/melan A, gp100, dipeptidilpeptidasa IV (DPPIV), proteína de unión a adenosinadesaminasa (ADAbp), ciclofilina b, antígeno colorrectal asociado (CRC)-C017-1A/GA733, antígeno carcinoembrionario (CEA) y sus epítopos inmunogénicos CAP-1 y CAP-2, etv6, aml1, antígeno prostático específico (PSA) y sus epítopos inmunogénicos PSA-1, PSA-2 y PSA-3, antígeno prostático específico de membrana (PSMA), receptor de linfocitos T/cadena zeta-CD3, familia MAGe de antígenos tumorales (por ejemplo, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), familia GAGE de antígenos tumorales (por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinasa, p53, familia MUC, HER2/neu, p21ras, RCAS1, a-fetoproteína, E-cadherina, a-catenina, p-catenina y Y-catenina, p120ctn, gp100 Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, proteína de poliposis adenomatosa coli (APC), fodrina, conexina 37, idiotipo de Ig, p15, gp75, gangliósidos GM2 y GD2, productos víricos tales como proteínas del papilomavirus humano, familia Smad de antígenos tumorales, lmp-1, P1A, antígeno nuclear codificado por EBV (EBNA)-1, glucógeno fosforilasa cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 y CT-7, y c-erbB-2. Los ejemplos no limitantes de antígenos víricos incluyen hemaglutinina del virus de la gripe, PLM-1 del virus de Epstein-Barr, glucoproteína E2 del virus de la hepatitis C, gp160 del VIH y gp120 del VIH. Los ejemplos no limitantes de antígenos de la MEC incluyen sindecano, heparanasa, integrinas, osteopontina, enlace, cadherinas, laminina, EGF de tipo laminina, lectina, fibronectina, Notch, tenascina y matrixina. Los inmunoconjugados de la invención se pueden unir a los siguientes ejemplos específicos no limitantes de antígenos de superficie celular: FAP, Her2, EGFR, IGF-1R, CD2 (antígeno de superficie de linfocitos T), CD3 (heteromultímero asociado al TCR), CD22 (receptor de linfocitos B), CD23 (receptor de IgE de baja afinidad), CD25 (cadena a del receptor de IL-2), CD30 (receptor de citocina), CD33 (antígeno de superficie celular mieloide), CD40 (receptor del factor de necrosis tumoral), IL-6R (receptor de IL6), CD20, MCSP, c-Met, proteína 1 que contiene el dominio CUB (CDCP1) y PDGFpR (receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas p).
En determinados modos de realización, el anticuerpo se dirige a un antígeno presentado en una célula tumoral o en un entorno de células tumorales. En un modo de realización específico, el anticuerpo se dirige a un antígeno seleccionado del grupo de proteína de activación de fibroblastos (FAP), el dominio A1 de tenascina C (TNC A1), el dominio A2 de tenascina C (TNC A2), el dominio adicional B de fibronectina (EDB), antígeno carcinoembrionario (CEA) y proteoglucano de sulfato de condroitina asociado al melanoma (MCSP).
El anticuerpo puede ser cualquier tipo de anticuerpo o fragmento del mismo que conserva la unión específica a un determinante antigénico y comprende una región Fc. En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa. Los anticuerpos preferentes en particular son inmunoglobulinas de la clase IgG, específicamente de la subclase IgGi.
En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo que es específico para el dominio A i y/o A4 de tenascina (TNC-A1 o TNC-A4 o TNC-A1/A4). En un modo de realización específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 8 o bien a SEQ ID NO: 9, o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 6 o bien a SEQ ID NO: 7, o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En un modo de realización más específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 8 o bien a s Eq ID NO: 9 o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 6 o bien a SEQ ID NO: 7 o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad.
En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo que es específico para el dominio A2 de tenascina (TNC-A2). En un modo de realización específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 85, o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82 y SEQ ID NO: 84, o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En un modo de realización más específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 85, o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82 y SEQ ID NO: 84, o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad.
En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo que es específico para la proteína activada por fibroblastos (FAP). En un modo de realización específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 69, o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realización más específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 69, o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 12 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 11. En otro modo de realización específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 17 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 16. En otro modo de realización específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 47 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 46. En otro modo de realización específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 63 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 62. En otro modo de realización específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 67 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 66. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado de la presente invención comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 125 o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 126 o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 129 o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado de la presente invención comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SeQ ID NO: 127 o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 128 o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 129 o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado de la presente invención comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 130 o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 131 o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 132 o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad.
En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo que es específico para el proteoglucano de sulfato de condroitina de melanoma (MCSP). En un modo de realización específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 86 o bien a SEQ ID NO: 122 o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 87 o bien a SEQ ID NO: 123 o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En un modo de realización más específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 86 o bien a SEQ ID NO: 122, o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 87 o bien a SEQ ID NO: 123, o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En un modo de realización más específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 86, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 87. En otro modo de realización específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 122, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 123.
En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo que es específico para el antígeno carcinoembrionario (CEA). En un modo de realización específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 114 o a una variante de la misma que conserva la funcionalidad. En otro modo de realización específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 115 o a una variante de la misma que conserva la funcionalidad. En un modo de realización más específico, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 114, o a una variante de la misma que conserva la funcionalidad, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 115, o a una variante de la misma que conserva la funcionalidad. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado de la presente invención comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 136 o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 137 o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 138 o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad.
Los inmunoconjugados de acuerdo con la invención incluyen los que comprenden secuencias que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 3-87, 108-132 y 136-138, incluyendo los fragmentos funcionales o variantes de las mismas. Los inmunoconjugados de acuerdo con la invención también engloban anticuerpos que comprenden secuencias de SEQ ID NO: 3-127 con sustituciones aminoacídicas conservadoras. Se entiende que en las secuencias de SEQ ID NO: 126, 128, 131, 134 y 137, se puede reemplazar la secuencia de la secuencia de la IL-2 mutante descrita en el presente documento (véase SEQ ID NO: 2) por la secuencia de IL-2 humana (véase SEQ ID NO: 1).
Restos efectores de los inmunoconjugados
Los restos efectores para su uso en la invención son, en general, polipéptidos que influyen en la actividad celular, por ejemplo, a través de vías de transducción de señales. En consecuencia, el resto efector del inmunoconjugado útil en la invención se puede asociar con la señalización mediada por receptor que transmite una señal desde el exterior de la membrana celular para modular una respuesta dentro de la célula. Por ejemplo, un resto efector del inmunoconjugado puede ser una citocina. En un modo de realización particular, el resto efector es un resto efector monocatenario como se define en el presente documento. En un modo de realización, el resto efector, típicamente un resto efector monocatenario, del inmunoconjugado de acuerdo con la invención es una citocina seleccionada del grupo que consiste en: IL-2, GM-CSF, IFN-a e IL-12. En un modo de realización, el resto efector es IL-2. En otro modo de realización, el resto efector monocatenario del inmunoconjugado es una citocina seleccionada del grupo que consiste en: IL-8, MIP-1a, MIP-1p y TGF-p.
En un modo de realización, el resto efector, en particular un resto efector monocatenario, del inmunoconjugado es IL-2. En un modo de realización específico, el resto efector IL-2 puede provocar una o más de las respuestas celulares seleccionadas del grupo que consiste en: proliferación en un linfocito T activado, diferenciación en un linfocito T activado, actividad de linfocitos T citotóxicos (CTL), proliferación en un linfocito B activado, diferenciación en un linfocito B activado, proliferación en un linfocito citolítico natural (NK), diferenciación en un linfocito NK, secreción de citocinas por un linfocito T activado o un linfocito NK, y citotoxicidad antitumoral de linfocitos NK activados por linfocinas (LAK). En determinados modos de realización, el resto efector IL-2 es un resto efector IL-2 mutante que comprende al menos una mutación aminoacídica que reduce o suprime la afinidad del resto efector IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2 (también conocido como CD25) pero conserva la afinidad del resto efector iL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia (que consiste en las subunidades p y y del receptor de IL-2), en comparación con el resto efector IL-2 no mutado. En un modo de realización, las mutaciones aminoacídicas son sustituciones aminoacídicas. En un modo de realización específico, el resto efector IL-2 mutante comprende una, dos o tres sustituciones aminoacídicas en una, dos o tres posiciones seleccionadas de las posiciones correspondientes al residuo 42, 45 y 72 de IL-2 humana (SEQ ID NO: 1). En un modo de realización más específico, el resto efector IL-2 mutante comprende tres sustituciones aminoacídicas en las posiciones correspondientes al residuo 42, 45 y 72 de IL-2 humana. En un modo de realización incluso más específico, el resto efector IL-2 mutante es IL-2 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G. En un modo de realización, el resto efector IL-2 mutante comprende adicionalmente una mutación aminoacídica en una posición correspondiente a la posición 3 de IL-2 humana, que elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2. En particular, dicha mutación aminoacídica adicional es una sustitución aminoacídica que reemplaza un residuo de treonina por un residuo de alanina. La secuencia de una IL-2 mutante cuádruple (QM) que comprende las sustituciones aminoacídicas T3A, F42A, Y45A y L72G se muestra en SEQ ID NO: 2. Las moléculas de IL-2 mutantes adecuadas se describen en más detalle en la publicación de PCT número WO 2012/107417.
Las moléculas de IL-2 mutantes útiles como restos efectores en los inmunoconjugados se pueden preparar por deleción, sustitución, inserción o modificación usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, PCR, síntesis génica y similares. Los cambios nucleotídicos correctos se pueden verificar, por ejemplo, por secuenciación. A este respecto, se ha descrito la secuencia de nucleótidos de IL-2 natural por Taniguchi et al. (Nature 302, 305-10 (1983)) y el ácido nucleico que codifica IL-2 humana está disponible en depósitos públicos tales como American Type Culture Collection (Rockville MD). Una secuencia ejemplar de IL-2 humana se muestra en SEQ ID NO: 1. La sustitución o inserción puede implicar residuos aminoacídicos naturales así como no naturales. La modificación de aminoácidos incluye procedimientos bien conocidos de modificación química tales como la adición o eliminación de sitios de glucosilación o uniones de glúcidos, y similares.
En un modo de realización, el resto efector, en particular un resto efector monocatenario, del inmunoconjugado es GM-CSF. En un modo de realización específico, el resto efector GM-CSF puede provocar la proliferación y/o diferenciación en un granulocito, un monocito o una célula dendrítica. En un modo de realización, el resto efector, en particular un resto efector monocatenario, del inmunoconjugado es IFN-a. En un modo de realización específico, el resto efector IFN-a puede provocar una o más de las respuestas celulares seleccionadas del grupo que consiste en: inhibir la replicación vírica en una célula infectada por virus y regular por incremento la expresión del complejo principal de histocompatibilidad I (MHC I). En otro modo de realización específico, el resto efector IFN-a puede inhibir la proliferación en una célula tumoral. En un modo de realización, el resto efector, en particular un resto efector monocatenario, del inmunoconjugado es IL-12. En un modo de realización específico, el resto efector IL-12 puede provocar una o más de las respuestas celulares seleccionadas del grupo que consiste en: proliferación en un linfocito NK, diferenciación en un linfocito T NK, proliferación en un linfocito T y diferenciación en un linfocito T. En un modo de realización, el resto efector, en particular un resto efector monocatenario, del inmunoconjugado es IL-8. En un modo de realización específico, el resto efector IL-8 puede provocar quimiotaxia en neutrófilos. En un modo de realización, el resto efector, en particular un resto efector monocatenario, del inmunoconjugado, es MIP-1a. En un modo de realización específico, el resto efector PIM-1a puede provocar quimiotaxia en monocitos y linfocitos T. En un modo de realización, el resto efector, en particular un resto efector monocatenario, del inmunoconjugado es PIM-1p. En un modo de realización específico, el resto efector PIM-1p puede provocar quimiotaxia en monocitos y linfocitos T. En un modo de realización, el resto efector, en particular un resto efector monocatenario, del inmunoconjugado es TGF-p. En un modo de realización específico, el resto efector TGF-p puede provocar una o más de las respuestas celulares seleccionadas del grupo que consiste en: quimiotaxia en monocitos, quimiotaxia en macrófagos, regulación por incremento de la expresión de IL-1 en macrófagos activados y regulación por incremento de la expresión de IgA en linfocitos B activados.
Anticuerpos para su combinación con los inmunoconjugados
De acuerdo con la invención, los anticuerpos para su combinación con los inmunoconjugados se genomanipulan para que tengan una función efectora incrementada. Los anticuerpos útiles en la presente invención para su combinación con los inmunoconjugados incluyen anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se unen a un determinante antigénico específico, por ejemplo un antígeno de células tumorales específico, y comprenden una región Fc. En determinados modos de realización, el anticuerpo se dirige a un antígeno presentado en una célula tumoral. Los antígenos diana particulares de los anticuerpos útiles en la presente invención incluyen los antígenos expresadosen la superficie de células tumorales, que incluyen, pero no se limitan a, receptores de superficie celular tales como receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), receptores del factor de crecimiento insulínico (IGFR) y receptores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), antígeno prostático específico de membrana (PSMA), antígeno carcinoembrionario (CEA), dipeptidilpeptidasa iV (CD26, dPpIV), FAP, HER2/neu, HER-3, E-cadherina, CD20, proteoglucano de sulfato de condroitina asociado al melanoma (MCSP), c-Met, proteína 1 que contiene el dominio cUb (CDCP1) y antígeno del carcinoma de células escamosas (SCCA).
En un modo de realización específico, el anticuerpo se dirige a un antígeno seleccionado del grupo de CD20, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), HER2, HER3, receptor del factor de crecimiento insulínico 1 (IGF-1R), antígeno carcinoembrionario (CEA), c-Met, proteína 1 que contiene el dominio CUB (CDCP1) y proteoglucano de sulfato de condroitina asociado al melanoma (MCSP). En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico dirigido a dos o más antígenos seleccionados del grupo de CD20, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), HER2, HER3, receptor del factor de crecimiento insulínico 1 (IGF-1R), antígeno carcinoembrionario (CEA), c-Met, proteína 1 que contiene el dominio CUB (CDCP1) y proteoglucano de sulfato de condroitina asociado al melanoma (MCSP).
Los anticuerpos anti-CD20 específicos útiles en la presente invención son anticuerpos anti-CD20 de tipo II de clase IgG humanizados, que tienen la especificidad de unión del anticuerpo B-Ly1 murino (Poppema y Visser, Biotest Bulletin 3, 131-139 (1987)). En particular, es útil un anticuerpo anti-CD20 de tipo II de clase IgG humanizado, que comprende
a) en el dominio variable de la cadena pesada una CDR1 de SEQ ID NO: 88, una CDR2 de SEQ ID NO: 89 y una CDR3 de SEQ ID NO: 90, y
b) en el dominio variable de la cadena ligera una CDR1 de SEQ ID NO: 91, una CDR2 de SEQ ID NO: 92 y una CDR3 de SEQ ID NO: 93.
En particular, las regiones estructurales (FR) de la región variable de la cadena pesada FR1, FR2 y FR3 de dicho anticuerpo son secuencias de FR humanas codificadas por la secuencia de la línea germinal humana VH1_10, la región variable de la cadena pesada FR4 de dicho anticuerpo es una secuencia de FR humana codificada por la secuencia de la línea germinal humana JH4, las FR de la región variable de la cadena ligera FR1, FR2 y FR3 de dicho anticuerpo son secuencias de FR humanas codificadas por la secuencia de la línea germinal humana VK_2_40, y la región variable de la cadena ligera FR4 de dicho anticuerpo es una secuencia FR humana codificada por la secuencia de la línea germinal humana JK4.
Un anticuerpo anti-CD20 más particular que es útil en la presente invención comprende el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 94 y el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 95.
Dichos anticuerpos anti-CD20 se describen en el documento WO 2005/044859.
Los anticuerpos anti-EGFR específicos útiles en la presente invención son anticuerpos de clase IgG humanizados, que tienen la especificidad de unión del anticuerpo ICR62 de rata (Modjtahedi et al., Br J Cancer 67, 247-253 (1993)). En particular, es útil un anticuerpo anti-EGFR de clase IgG humanizado, que comprende
a) en el dominio variable de la cadena pesada una CDR1 de SEQ ID NO: 96, una CDR2 de SEQ ID NO: 97 y una CDR3 de SEQ ID NO: 98, y
b) en el dominio variable de la cadena ligera una CDR1 de SEQ ID NO: 99, una CDR2 de SEQ ID NO: 100 y una CDR3 de SEQ ID NO: 101.
Un anticuerpo anti-EGFR más particular que es útil en la invención comprende el dominio variable de la cadena pesada de SeQ ID NO: 102 y el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 103.
Dichos anticuerpos anti-EGFR se describen en los documentos WO 2006/082515 y WO 2008/017963.
Otros anticuerpos anti-EGFR de clase IgG humanizados adecuados útiles para la invención incluyen cetuximab/IMC-C225 (Erbitux®, descrito en Goldstein et al., Clin Cancer Res 1, 1311-1318 (1995)), panitumumab/ABX-EGF (Vectibix®, descrito en Yang et al., Cancer Res 59, 1236-1243 (1999), Yang et al., Critical Reviews in Oncology/Hematology 38, 17-23 (2001)), nimotuzumab/h-R3 (TheraCim®, descrito en Mateo et al., Immunotechnology 3, 71-81 (1997); Crombet-Ramos et al., Int J Cancer 101, 567-575 (2002), Boland & Bebb, Expert Opin Biol Ther 9, 1199-1206 (2009)), matuzumab/EMD 72000 (descrito en Bier et al., Cancer Immunol Immunother 46, 167-173 (1998), Kim, Curr Opin Mol Ther 6, 96-103 (2004)), y zalutumumab/2F8 (descrito en Bleeker et al., J Immunol 173, 4699-4707 (2004), Lammerts van Bueren, PNAS 105, 6109-6114 (2008)).
Los anticuerpos anti-IGF-1R específicos útiles en la presente invención se describen en los documentos WO 2005/005635 y WO 2008/077546, e inhiben la unión del factor de crecimiento insulínico 1 (IGF-1) y el factor de crecimiento insulínico 2 (IGF-2) al receptor del factor de crecimiento insulínico 1 (IGF-1R).
Los anticuerpos anti-IGF-1R útiles para la invención son preferentemente anticuerpos monoclonales y, además, anticuerpos quiméricos (dominio constante humano), anticuerpos humanizados y, de manera especial, preferentemente anticuerpos completamente humanos. Los anticuerpos anti-IGF-1R particulares útiles para la invención se unen a IGF-1R humano en competencia con el anticuerpo 18, es decir, se unen al mismo epítopo de IGF-1R que el anticuerpo 18, que se describe en el documento WO 2005/005635. Los anticuerpos anti-IGF-1 R particulares se caracterizan además por una afinidad hacia IGF-1R de 10'8 M (Kd) o menos, en particular de aproximadamente 10'9 a 10'13 M, y preferentemente no muestran inhibición detectable dependiente de la concentración de la insulina que se une al receptor de insulina.
Los anticuerpos anti-IGF-1R particulares útiles para la invención comprenden regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que tienen las siguientes secuencias:
a) una cadena pesada de anticuerpo que comprende como CDR CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 104 o 106;
b) una cadena ligera de anticuerpo que comprende como CDR CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 105 o 107.
En particular, los anticuerpos anti-IGF-1R útiles para la invención comprenden una secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo de SEQ ID NO: 104 y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo de SEQ ID NO: 105, o una secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo de SEQ ID NO: 106 y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo de SEQ ID NO: 107.
Los anticuerpos anti-IGF-1R particulares útiles para la invención se pueden obtener a partir de las líneas celulares de hibridoma <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 e <IGF-1R> HUMAB-Clone 22, que están depositadas en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Alemania, con los números de depósito DSM ACC 2587 y DSM ACC 2594, respectivamente.
Otros anticuerpos anti-IGF-1R adecuados útiles para la invención son, por ejemplo el mAb IgG1 completamente humano cixutumumab/IMC-A12 (descrito en Burtrum et al., Cancer Res 63, 8912-21 (2003);. Rowinsky et al., Clin.
Cáncer Res 13, 5549s-5555s (2007), el mAb IgG1 completamente humano AMG-479 (descrito en Beltran et al., Mol Cáncer Ther 8, 1095-1105 (2009); Tolcher et al., J Clin Oncol 27, 5800-7 (2009)), el mAb IgG1 humanizado MK-0646/h7C10 (descrito en Goetsch et al., Int J Cancer 113, 316-28 (2005); Broussas et al., Int J Cancer 124, 2281-93 (2009); Hidalgo et al., J Clin Oncol 26, resumen 3520 (2008); Atzori et al., J Clin Oncol 26, resumen 3519 (2008)), el mAb IgG1 humanizado AVE1642 (descrito en Descamps et al., Br J Cancer 100, 366-9 (2009); Tolcher et al., J Clin Oncol 26, resumen 3582 (2008); Moreau et al., Blood 110, resumen 1166 (2007); Maloney et al., Cancer Res 63, 5073-83 (2003)), el mAb IgG2 completamente humano figitumumab/CP-751.871 (Cohen et al., Clin Cancer Res 11, 2063-73 (2005); Haluska et al., Clin Cancer Res 13, 5834-40 (2007); Lacy et al., J Clin Oncol 26, 3196-203 (2008); Gualberto y Karp, Clin Lung Cancer 10, 273-80 (2009), el mAb IgG1 completamente humano SCH-717454 (descrito en el documento WO 2008/076257 o Kolb et al., Pediatr Blood Cancer 50, 1190-7 (2008)), el mAb 2.13.2. (descrito en el documento US 7.037.498 (documento WO 2002/053596)) o el mAb IgG4 completamente humano BIIB022. Los anticuerpos anti-CEA específicos útiles en la presente invención son anticuerpos de clase IgG humanizados, que tienen la especificidad de unión del anticuerpo PR1A3 murino (Richman y Bodmer, Int J Cancer 39, 317-328 (1987)). En particular, es útil un anticuerpo anti-CEA de clase IgG humanizado, que comprende
a) en el dominio variable de la cadena pesada una CDR1 de SEQ ID NO: 108, una CDR2 de SEQ ID NO: 109 y una CDR3 de SEQ ID NO: 110, y
b) en el dominio variable de la cadena ligera una CDR1 de SEQ ID NO: 111, una CDR2 de SEQ ID NO: 112 y una CDR3 de SEQ ID NO: 113.
Un anticuerpo anti-CEA más particular que es útil en la invención comprende el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 114 y el dominio variable de la cadena ligera de sEq ID NO: 115.
Dichos anticuerpos anti-CEA se describen en la publicación de PCT número WO 2011/023787.
Los anticuerpos anti-HER3 específicos que son útiles en la presente invención son anticuerpos de clase IgG humanizados, tales como Mab 205.10.1, Mab 205.10.2 y Mab 205.10.3, en particular Mab 205.10.2, descritos en la publicación de PCT número de WO 2011/076683. En particular, es útil un anticuerpo anti-HER3 de clase IgG humanizado, que comprende
a) en el dominio variable de la cadena pesada una CDR1 de SEQ ID NO: 139, una CDR2 de SEQ ID NO: 140 y una CDR3 de SEQ ID NO: 141, y
b) en el dominio variable de la cadena ligera una CDR1 de SEQ ID NO: 143, una CDR2 de SEQ ID NO: 144 y una CDR3 de SEQ ID NO: 145.
Un anticuerpo anti-HER3 más particular que es útil en la invención comprende el dominio variable de la cadena pesada de SeQ ID NO: 142 y el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 146.
Los anticuerpos anti-CDCP1 específicos que son útiles en la presente invención son anticuerpos de clase IgG humanizados derivados del anticuerpo CUB4 (número de depósito DSM ACC 2551 (DSMZ), como se describe en la publicación de PCT número WO 2011/023389).
Los anticuerpos anti-MCSP ejemplares que se pueden usar en la presente invención se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente europea número Ep 11178393.2. En particular, es útil un anticuerpo anti-MCSP de clase IgG humanizado, que comprende
a) en el dominio variable de la cadena pesada una CDR1 de SEQ ID NO: 116, una CDR2 de SEQ ID NO: 117 y una CDR3 de SEQ ID NO: 118, y
b) en el dominio variable de la cadena ligera una CDR1 de SEQ ID NO: 119, una CDR2 de SEQ ID NO: 120 y una CDR3 de SEQ ID NO: 121.
Un anticuerpo anti-MCSP más particular que es útil en la invención comprende el dominio variable de la cadena pesada de SeQ ID NO: 122 y el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 123.
En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa de la clase IgG. En un modo de realización particular, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1. En un modo de realización, el anticuerpo comprende una región Fc humana, más en particular una región Fc de IgG humana, lo más en particular una región Fc de IgG1 humana. Los anticuerpos útiles en la invención, tales como los anticuerpos anti-IGF-1R, anti-EGFR y anti-CD20 descritos anteriormente, pueden comprender una región constante de la cadena pesada gamma 1 de Ig humana, como se expone en SEQ ID NO: 124 (es decir, los anticuerpos son de la subclase IgG1 humana).
Los anticuerpos útiles en la presente invención se genomanipulan para que tengan una función efectora incrementada, en comparación con un anticuerpo correspondiente no genomanipulado. En un modo de realización, el anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada tiene al menos 2 veces, al menos 10 veces o incluso al menos 100 veces la función efectora incrementada, en comparación con un anticuerpo no genomanipulado correspondiente. La función efectora incrementada puede incluir, pero no se limita a, una o más de las siguientes: unión al receptor de Fc incrementada, unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) incrementadas, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) incrementada, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) incrementada, secreción de citocinas incrementada, captación de antígenos mediada por inmunocomplejos por células presentadoras de antígenos incrementada, unión a linfocitos NK incrementada, unión a macrófagos incrementada, unión a monocitos incrementada, unión a células polimorfonucleares incrementada, señalización directa que induce apoptosis incrementada, reticulación de anticuerpos unidos a la diana incrementada, maduración de células dendríticas incrementada o activación de linfocitos T incrementada.
En un modo de realización, la función efectora incrementada es una o más seleccionadas del grupo de unión al receptor de Fc incrementada, CDC incrementada, ADCC incrementada, ADCP incrementada y secreción de citocinas incrementada. En un modo de realización, la función efectora incrementada es unión incrementada a un receptor de Fc activador. En un modo de realización de este tipo, la afinidad de unión al receptor de Fc activador se incrementa al menos 2 veces, en particular al menos 10 veces, en comparación con la afinidad de unión de un anticuerpo no genomanipulado correspondiente. En un modo de realización específico, el receptor de Fc activador se selecciona del grupo de FcYRIIIa, FcyRI y FcYRIIa. En un modo de realización, el receptor de Fc activador es FcYRIIIa, en particular FcYRIIIa humano. En otro modo de realización, la función efectora incrementada es una ADCC incrementada. En un modo de realización de este tipo, la ADCC se incrementa al menos 10 veces, en particular al menos 100 veces, en comparación con la ADCC mediada por un anticuerpo correspondiente no genomanipulado. En aún otro modo de realización, la función efectora incrementada es unión incrementada a un receptor de Fc activador y ADCC incrementada.
Se puede medir la función efectora incrementada por procedimientos conocidos en la técnica. Un ensayo adecuado para medir la ADCC se describe en el presente documento. Otros ejemplos de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) y Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); patente de EE. UU. n.° 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radioactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998). La unión a receptores de Fc se puede determinar fácilmente, por ejemplo, por ELISA, o por resonancia de plasmón superficial (SPR) usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores de Fc tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. De acuerdo con un modo de realización particular, la afinidad de unión a un receptor de Fc activador se mide por resonancia de plasmón superficial usando un aparato BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25 °C. De forma alternativa, la afinidad de unión de los anticuerpos por los receptores de Fc se puede evaluar usando las líneas celulares conocidas por expresar receptores de Fc particulares, tales como linfocitos NK que expresan el receptor de FcYIIIa. También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para determinar si el anticuerpo se puede unir a C1q y, de ahí que tenga actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento se puede realizar un ensayo de CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); y Cragg y Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).
La función efectora incrementada puede resultar, por ejemplo, de la glucomanipulación de la región Fc o de la introducción de mutaciones aminoacídicas en la región Fc del anticuerpo. En un modo de realización, el anticuerpo se genomanipula mediante la introducción de una o más mutaciones aminoacídicas en la región Fc. En un modo de realización específico, las mutaciones aminoacídicas son sustituciones aminoacídicas. En un modo de realización incluso más específico, las sustituciones aminoacídicas están en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de residuos). Se describen otras mutaciones aminoacídicas adecuadas, por ejemplo, en Shields et al., J Biol Chem 9(2), 6591-6604 (2001); la patente de EE. UU. n.° 6.737.056; el documento WO 2004/063351 y el documento WO 2004/099249. Las regiones Fc mutantes se pueden preparar por deleción, sustitución, inserción o modificación de aminoácidos usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, PCR, síntesis génica y similares. Los cambios nucleotídicos correctos se pueden verificar, por ejemplo, por secuenciación.
En otro modo de realización, el anticuerpo se genomanipula mediante modificación de la glucosilación en la región Fc. En un modo de realización específico, el anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado. Una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc de un anticuerpo da como resultado que el anticuerpo tenga una función efectora incrementada, en particular una ADCC incrementada.
En un modo de realización más específico, al menos aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 55 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o aproximadamente un 100 %, preferentemente al menos aproximadamente un 50 %, más preferentemente al menos aproximadamente un 70 %, de los oligosacáridos unidos a N en la región Fc del anticuerpo son no fucosilados. Los oligosacáridos no fucosilados pueden ser del tipo híbrido 0 complejo.
En otro modo de realización específico, el anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos bisecados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado. En un modo de realización más específico, al menos aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 15 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 55 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o aproximadamente un 100 %, preferentemente al menos aproximadamente un 50 %, más preferentemente al menos aproximadamente un 70 %, de los oligosacáridos unidos a N en la región Fc del anticuerpo son bisecados. Los oligosacáridos bisecados pueden ser del tipo híbrido o complejo.
En aún otro modo de realización específico, el anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos bisecados no fucosilados en la región Fc, en comparación con un anticuerpo no genomanipulado. En un modo de realización más específico, al menos aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 15 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 55 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o aproximadamente un 100 %, preferentemente al menos aproximadamente un 15 %, más preferentemente al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 35 % o al menos aproximadamente un 50 % de los oligosacáridos unidos a N en la región Fc del anticuerpo son bisecados, no fucosilados. Los oligosacáridos bisecados no fucosilados pueden ser del tipo híbrido o complejo.
Las estructuras de oligosacáridos en la región Fc del anticuerpo se pueden analizar por procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante espectrometría de masas MALDI TOF como se describe en Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999) o Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006). El porcentaje de oligosacáridos no fucosilados es la cantidad de oligosacáridos que carecen de residuos de fucosa, en relación con todos los oligosacáridos unidos a Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y con alto contenido en manosa) e identificados en una muestra tratada con N-glucosidasa F por EM MALDI TOF. Asn 297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración EU de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn 297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos en dirección 5' o en dirección 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia insignificantes en los anticuerpos. El porcentaje de oligosacáridos bisecados o bisecados no fucosilados se determina de forma análoga.
En un modo de realización, el anticuerpo se genomanipula para que tenga glucosilación modificada en la región Fc, en comparación con un anticuerpo no genomanipulado, produciendo el anticuerpo en una célula huésped que tiene actividad alterada de una o más glucosiltransferasas. Las glucosiltransferasas incluyen p-(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), p-(1,4)-galactosiltransferasa (GalT), p-(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa 1 (GnTI), p-(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa II (GnTII) y a-(1,6)-fucosiltransferasa. En un modo de realización específico, el anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc, en comparación con un anticuerpo no genomanipulado, produciendo el anticuerpo en una célula huésped que tiene una actividad p-(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII) incrementada. En un modo de realización incluso más específico, la célula huésped tiene adicionalmente actividad a-manosidasa II (ManII) incrementada. La metodología de la glucomanipulación que se puede usar para genomanipular anticuerpos útiles para la presente invención se ha descrito con mayor detalle en Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); el documento WO 99/54342 (patente de EE. UU. n.° 6.602.684; documento EP 1071700); el documento w O 2004/065540 (publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0241817; documento EP 1587921), el documento WO 03/011878 (publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2003/0175884). Los anticuerpos glucomanipulados que usan esta metodología se denominan GlycoMab en el presente documento.
En general, se puede usar cualquier tipo de línea celular cultivada, incluyendo las líneas celulares analizadas en el presente documento, para generar líneas celulares para la producción de anticuerpos anti-TNC A2 con un patrón de glucosilación alterado. Las líneas celulares particulares incluyen células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, y otras células de mamífero. En determinados modos de realización, las células huésped se han manipulado para expresar niveles incrementados de uno o más polipéptidos que tienen actividad (3(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII). En determinados modos de realización, las células huésped se han manipulado adicionalmente para expresar niveles incrementados de uno o más polipéptidos que tienen actividad amanosidasa II (ManII). En un modo de realización específico, el polipéptido que tiene actividad GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnTIII y el dominio de localización de Golgi de un polipéptido heterólogo residente en Golgi. En particular, dicho dominio de localización de Golgi es el dominio de localización de Golgi de manosidasa II. Los procedimientos para generar dichos polipéptidos de fusión y usarlos para producir anticuerpos con funciones efectoras incrementadas se divulgan en Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006) y el documento WO 2004/065540.
Las células huésped que contienen la secuencia codificante de un anticuerpo útil para la invención y/o la secuencia codificante de polipéptidos que tienen actividad glucosiltransferasa, y que expresan los productos génicos biológicamente activos, se pueden identificar, por ejemplo, por hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN; la presencia o ausencia de funciones génicas "marcadoras"; evaluando el nivel de transcripción medido por la expresión de los respectivos transcritos de ARNm en la célula huésped; o la detección del producto génico medido por inmunoensayo o por su actividad biológica; procedimientos que son bien conocidos en la técnica. La actividad GnTIII o ManII se puede detectar, por ejemplo, empleando una lectina que se une a productos de biosíntesis de GnTIII o ManII, respectivamente. Un ejemplo para dicha lectina es la lectina E4-PHA que se une preferentemente a oligosacáridos que contienen GlcNAc bisecante. Los productos de biosíntesis (es decir, estructuras de oligosacáridos específicas) de polipéptidos que tienen actividad GnTIII o ManII también se pueden detectar mediante análisis de espectrometría de masas de los oligosacáridos liberados a partir de glucoproteínas producidas por células que expresan dichos polipéptidos. De forma alternativa, se puede usar un ensayo funcional que mide la función efectora incrementada, por ejemplo, la unión al receptor de Fc incrementada, mediada por anticuerpos producidos por las células genomanipuladas con el polipéptido que tiene actividad GnTIII o ManII.
En otro modo de realización, el anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc, en comparación con un anticuerpo no genomanipulado, produciendo el anticuerpo en una célula huésped que tiene actividad a-(1,6)-fucosiltransferasa disminuida. Una célula huésped que tiene actividad a-(1,6)-fucosiltransferasa disminuida puede ser una célula en la que el gen de la a(1,6)-fucosiltransferasa se ha inactivado o desactivado de otro modo, por ejemplo, se ha suprimido (véase Yamane-Ohnuki et al., Biotech Bioeng 87, 614 (2004); Kanda et al., Biotechnol Bioeng 94(4), 680-688 (2006); Niwa et al., J Immunol Methods 306, 151-160 (2006)).
Otros ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos desfucosilados incluyen células CHO Lec13 deficientes en fucosilación de proteínas (Ripka et al., Arch Biochem Biophys 249, 533-545 (1986); solicitud de patente de EE. UU. n.° 2003/0157108 y el documento WO 2004/056312, especialmente en el ejemplo 11). Los anticuerpos útiles en la presente invención, de forma alternativa, se pueden genomanipular para que tengan residuos de fucosa reducida en la región Fc de acuerdo con las técnicas divulgadas en los documentos EP 1176 195 A1, WO 03/084570, WO 03/085119 y las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2003/0115614, 2004/093621, 2004/110282, 2004/110704, 2004/132140, la patente de EE. UU. n.° 6.946.292 (Kyowa), por ejemplo, reduciendo o suprimiendo la actividad de una proteína transportadora de GDP-fucosa en las células huésped usadas para la producción de anticuerpos.
Los anticuerpos glucomanipulados útiles en la invención también se pueden producir en sistemas de expresión que producen glucoproteínas modificadas, tales como las enseñadas en el documento WO 03/056914 (GlycoFi, Inc.) o en los documentos WO 2004/057002 y WO 2004/024927 (Greenovation).
Procedimientos recombinantes
Los procedimientos para producir anticuerpos e inmunoconjugados útiles en la invención se conocen bien en la técnica, y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 2012/146628, WO 2005/044859, WO 2006/082515, WO 2008/017963, WO 2005/005635, WO 2008/077546, WO 2011/023787, WO 2011/076683, WO 2011/023389 y WO 2006/100582. También se describen los procedimientos establecidos para producir anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales, por ejemplo, en Harlow y Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
Los anticuerpos no naturales o fragmentos de los mismos se pueden construir usando síntesis de péptidos en fase sólida, se pueden producir de manera recombinante (por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567) o se pueden obtener, por ejemplo, seleccionando colecciones combinatorias que comprenden cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.969.108 para McCafferty). Para la producción recombinante de inmunoconjugados y anticuerpos útiles en la invención, se aíslan uno o más polinucleótidos que codifican dicho inmunoconjugado o anticuerpo y se insertan en uno o más vectores para su posterior clonación y/o expresión en una célula huésped. Dichos polinucleótidos se pueden aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales. Los procedimientos, que se conocen bien por los expertos en la técnica, se pueden usar para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificante de un anticuerpo o inmunoconjugado junto con señales de control de la transcripción/traducción apropiadas. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación in vivo/recombinación genética. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) y Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989).
Los inmunoconjugados útiles en la invención se pueden expresar a partir de un único polinucleótido que codifica el inmunoconjugado completo o a partir de múltiples (por ejemplo, dos o más) polinucleótidos que se coexpresan. Los polipéptidos codificados por polinucleótidos que se coexpresan se pueden asociar, por ejemplo, a través de enlaces disulfuro u otros medios para formar un inmunoconjugado funcional. Por ejemplo, la porción de la cadena ligera de un anticuerpo se puede codificar por un polinucleótido separado de la porción del inmunoconjugado que comprende la porción de la cadena pesada del anticuerpo y el resto efector. Cuando se coexpresen, los polipéptidos de la cadena pesada se asociarán con los polipéptidos de la cadena ligera para formar el anticuerpo.
Las células huésped adecuadas para replicar y para soportar la expresión de proteínas recombinantes se conocen bien en la técnica. Dichas células se pueden transfectar o transducir según sea apropiado con el vector de expresión particular y se pueden cultivar grandes cantidades de células que contienen vectores para sembrar fermentadores a gran escala para obtener cantidades suficientes de las proteínas, por ejemplo, para aplicaciones clínicas. Las células huésped adecuadas incluyen microorganismos procariotas, tales como E. coli, o diversas células eucariotas, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto o similares. Por ejemplo, las proteínas recombinantes se pueden producir en bacterias, en particular cuando no se necesita la glucosilación. Después de la expresión, la proteína se puede aislar de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente. Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como los hongos filamentosos o levaduras, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican proteínas, incluyendo cepas de hongos y levaduras en las que sus vías de glucosilación se han "humanizado", dando como resultado la producción de una proteína con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véase Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), y Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). Las células huésped adecuadas para la expresión de proteínas (glucosiladas) también derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar conjuntamente con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.959.177; 6.040.498; 6.420.548; 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en vegetales transgénicos). También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que se adaptan para cultivar en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (HEK) (células 293 o 293T como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), células de riñón de crías de hámster (BHK), células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), células de riñón de mono (CV1), células de riñón de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA), células de riñón canino (MDCK), células de hígado de rata búfalo (BRL 3A), células de pulmón humano (W138), células de hígado humano (Hep G2), células de tumor de mama de ratón (MMT 060562), células TRI (como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), células MRC-5 y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO-DHFR-(Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como YO, NS0, P3X63 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de proteínas, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003). Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, células de levadura, células de insecto, células bacterianas y células vegetales, por nombrar solo algunas, pero también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o tejido animal o vegetal cultivado. En un modo de realización, la célula huésped es una célula eucariota, en particular una célula de mamífero, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula 293 de riñón embrionario humano (HEK) o una célula linfática (por ejemplo, una célula Y0, NS0, Sp20).
Si el anticuerpo y el inmunoconjugado están destinados para uso humano, se pueden usar formas quiméricas de anticuerpos en las que las regiones constantes del anticuerpo proceden de un ser humano. También se puede preparar una forma humanizada o totalmente humana del anticuerpo de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.565.332 para Winter). La humanización se puede lograr mediante diversos procedimientos incluyendo, pero sin limitarse a, (a) injertar las CDR no humanas (por ejemplo, anticuerpo donante) en regiones estructurales y constantes humanas (por ejemplo, anticuerpo receptor) con o sin retención de residuos estructurales cruciales (por ejemplo, los que son importantes para conservar buenas funciones de afinidad de unión a antígeno o de anticuerpo), (b) injertar solo las regiones determinantes de la especificidad (SDR o a-CDR; los residuos cruciales para la interacción anticuerpo-antígeno) no humanas en regiones estructurales y constantes humanas, o (c) trasplantar todos los dominios variables no humanos, pero "enmascararlos" con una sección similar a humana mediante el reemplazo de residuos superficiales. Los anticuerpos humanizados y procedimientos para prepararlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); las patentes de EE. UU. n.° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (que describen un injerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (que describe el "rebamizado"); Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (que describe el "reordenamiento de Fr"); y Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) y Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (que describe el enfoque de "selección guiada" al reordenamiento de FR). Se pueden producir anticuerpos humanos y regiones variables humanas usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen en general en van Dijk y van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) y Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Las regiones variables humanas pueden formar parte de y derivarse de anticuerpos monoclonales humanos preparados por el procedimiento de hibridoma (véase, por ejemplo, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)). También se pueden preparar anticuerpos humanos y regiones variables humanas administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para que produzca anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica (véase, por ejemplo, Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)). También se pueden generar anticuerpos humanos y regiones variables humanas aislando secuencias de regiones variables de clones de Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de humano (véase, por ejemplo, Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); y McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624­ 628 (1991)). Típicamente, los fagos presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab.
En determinados modos de realización, los anticuerpos útiles en la presente invención se genomanipulan para que tengan una afinidad de unión potenciada de acuerdo con, por ejemplo, los procedimientos divulgados en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2004/0132066. La capacidad de los anticuerpos útiles en la invención para unirse a un determinante antigénico específico se puede medir a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien otras técnicas familiares para un experto en la técnica, por ejemplo, la técnica de resonancia de plasmón superficial (analizada en un sistema BIACORE T100) (Liljeblad et al., Glyco J17, 323-329 (2000)) y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)).
Los anticuerpos e inmunoconjugados preparados como se describe en el presente documento se pueden purificar mediante técnicas conocidas en la técnica tales como cromatografía de líquidos de alto rendimiento, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño y similares. Las condiciones reales usadas para purificar una proteína particular dependerán, en parte, de factores tales como carga neta, hidrofobia, hidrofilia, etc., y serán evidentes para los expertos en la técnica.
Composiciones farmacéuticas
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas se pueden usar, por ejemplo, en cualquiera de los procedimientos terapéuticos descritos a continuación.
Las composiciones farmacéuticas de un inmunoconjugado y un anticuerpo que tienen una función efectora incrementada como se describe en el presente documento se preparan mezclando dicho inmunoconjugado y anticuerpo que tienen el grado de pureza deseado con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 18.a edición, Mack Printing Company (1990)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, en general, no son tóxicos para los destinatarios a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión de fármacos intersticiales tales como glucoproteínas hialuronidasas activas a pH neutro solubles (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas hialuronidasas a pH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente de EE. UU. n.° 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales tales como condroitinasas.
Las formulaciones liofilizadas ejemplares se describen en la patente de EE. UU. n.° 6.267.958. Las formulaciones acuosas incluyen las descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.171.586 y el documento WO 2006/044908, incluyendo las últimas formulaciones un tampón histidina-acetato.
La composición farmacéutica del presente documento también puede contener ingredientes activos adicionales según sea necesario para la indicación particular que se esté tratando, en particular aquellos con actividades complementarias que no se ven afectadas de manera adversa entre sí. Por ejemplo, si la enfermedad que se va a tratar es cáncer, puede ser deseable proporcionar además uno o más agentes antineoplásicos, por ejemplo, un agente quimioterápico, un inhibidor de la proliferación de células tumorales o un activador de la apoptosis de células tumorales. Dichos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.
Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences 18.a edición, Mack Printing Company (1990). Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, estando dichas matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las composiciones que se van a usar para su administración in vivo son, en general, estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.
Procedimientos de tratamiento
Se puede usar la combinación proporcionada en el presente documento de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, en procedimientos terapéuticos.
En un aspecto, se proporciona una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, para su uso como medicamento. En otros aspectos, se proporciona una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En determinados modos de realización, se proporciona una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, para su uso en un procedimiento de tratamiento. En determinados, la invención proporciona una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad, que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de la combinación. En un modo de realización de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. En otros modos de realización, la invención proporciona una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, para su uso en la estimulación de la función de las células efectoras. En determinados modos de realización, la invención proporciona una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, para su uso en un procedimiento de estimulación de la función de las células efectoras en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la combinación para estimular la función de las células efectoras. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es un mamífero, en particular un ser humano. Una "enfermedad" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es una enfermedad tratable mediante la estimulación de la función de las células efectoras. En determinados modos de realización, la enfermedad es un trastorno de proliferación celular, en particular cáncer. En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, en la fabricación o preparación de un medicamento. En un modo de realización, el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad. En otro modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad que comprende administrar a un individuo que tiene la enfermedad una cantidad terapéuticamente eficaz del medicamento. En un modo de realización de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. En otro modo de realización, el medicamento es para estimular la función de las células efectoras. En otro modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de estimulación de la función de las células efectoras en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad del medicamento eficaz para estimular la función de las células efectoras. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es un mamífero, en particular un ser humano. Una "enfermedad" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es una enfermedad tratable mediante la estimulación de la función de las células efectoras. En determinados modos de realización, la enfermedad es un trastorno de proliferación celular, en particular cáncer.
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad. En un modo de realización, el procedimiento comprende administrar a un individuo que tiene dicha enfermedad una cantidad terapéuticamente eficaz de una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada. En un modo de realización de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, como se describe a continuación. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es un mamífero, en particular un ser humano. Una "enfermedad" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es una enfermedad tratable mediante la estimulación de la función de las células efectoras. En determinados modos de realización, la enfermedad es un trastorno de proliferación celular, en particular cáncer.
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para estimular la función de las células efectoras en un individuo. En un modo de realización, el procedimiento comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, para estimular la función de las células efectoras. En un modo de realización, un "individuo" es un mamífero, en particular un ser humano.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las combinaciones de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada proporcionada en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos anteriores. En un modo de realización, una composición farmacéutica comprende una combinación proporcionada en el presente documento, de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de las combinaciones proporcionadas en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.
De acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores, la enfermedad es un trastorno tratable mediante la estimulación de la función de las células efectoras. Las combinaciones de la invención son útiles en el tratamiento de estados de enfermedad donde la estimulación del sistema inmunitario del huésped es beneficiosa, en condiciones particulares donde es deseable una respuesta inmunitaria celular potenciada. Estas pueden incluir estados de enfermedad donde la respuesta inmunitaria del huésped es insuficiente o deficiente. Los estados de enfermedad para los que se pueden administrar las combinaciones de la invención comprenden, por ejemplo, un tumor o infección donde una respuesta inmunitaria celular sería un mecanismo crucial para la inmunidad específica. Los estados de enfermedad específicos para los que se pueden emplear las combinaciones de la presente invención incluyen cáncer, específicamente carcinoma de células renales o melanoma; inmunodeficiencia, específicamente en pacientes infectados por VIH, pacientes inmunodeprimidos, infección crónica y similares. En determinados modos de realización, la enfermedad es un trastorno de proliferación celular. En un particular, la enfermedad es cáncer, específicamente un cáncer seleccionado del grupo de cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de cerebro, linfoma, leucemia, cáncer de piel.
Las combinaciones de la invención se pueden usar solas o bien conjuntamente con otros agentes en un tratamiento. Por ejemplo, una combinación de la invención se puede coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional. En determinados modos de realización, un agente terapéutico adicional es un agente antineoplásico, por ejemplo, un agente quimioterápico, un inhibidor de la proliferación de células tumorales o un activador de la apoptosis de células tumorales.
Las politerapias como se proporciona en el presente documento engloban la administración del anticuerpo y el inmunoconjugado conjuntamente (donde se incluyen los dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones separadas) y por separado, en cuyo caso, la administración del anticuerpo se puede producir antes, simultáneamente y/o después de la administración del inmunoconjugado, agente terapéutico y/o adyuvante adicionales. Las combinaciones de la invención también se pueden combinar con radioterapia.
Una combinación de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) se puede administrar mediante cualquier vía adecuada, incluyendo la administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. El anticuerpo y el inmunoconjugado se pueden administrar por la misma vía o por vías diferentes. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. En el presente documento se contemplan diversas pautas de dosificación que incluyen, pero sin limitarse a, administraciones únicas o múltiples durante diversos momentos, administración en bolo e infusión intermitente.
Las combinaciones de la invención se formularán, dosificarán y administrarán de una forma consistente con las prácticas médicas correctas. Los factores que se deben tener en consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración de los agentes, el procedimiento de administración, la pauta de administración y otros factores conocidos por los médicos. Aunque no se necesita, la combinación se formula opcionalmente con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo e inmunoconjugado presentes en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan, en general, en las mismas dosificaciones y con las vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que sea apropiada.
Para la prevención o tratamiento de enfermedades, la dosificación apropiada de un anticuerpo e inmunoconjugado (cuando se usan en las combinaciones de la invención, opcionalmente conjuntamente con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, del tipo de anticuerpo e inmunoconjugado, de la gravedad y la evolución de la enfermedad, ya sea que la combinación se administre para propósitos preventivos o terapéuticos, del tratamiento previo, de la anamnesis del paciente y de la respuesta al anticuerpo y/o inmunoconjugado, y del criterio del médico adjunto. El anticuerpo y el inmunoconjugado se administran adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos.
Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosificación candidata inicial para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, en general, se prolongaría el tratamiento hasta que se produjera una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosificación ejemplar del anticuerpo estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Se puede administrar una dosis inicial mayor de carga, seguida de una o más dosis menores. Una pauta posológica ejemplar comprende administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo. Las mismas consideraciones con respecto a la dosificación se aplican al inmunoconjugado que se va a usar en las combinaciones de acuerdo con la invención. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas de dosificación. La progresión de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.
Artículos de fabricación
En otro aspecto de la invención se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende uno o más recipientes y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo que se va a usar en las combinaciones de la invención. Otro agente activo es el inmunoconjugado que se va a usar en las combinaciones de la invención, que puede estar en la misma composición y recipiente, como el anticuerpo, o que se puede proporcionar en una composición y recipiente diferentes. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección.
En un aspecto, la invención proporciona un kit destinado al tratamiento de una enfermedad, que comprende en el mismo recipiente o en recipientes separados (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, y (b) un segundo anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada, y que comprende además opcionalmente (c) un prospecto del envase que comprende instrucciones impresas que indican el uso del tratamiento combinado como un procedimiento para tratar la enfermedad. Además, el kit puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora incrementada; (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector; y opcionalmente (c) un tercer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende otro agente citotóxico o de otro modo terapéutico. El kit en este modo de realización de la invención puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el kit puede comprender además un tercer (o cuarto) recipiente que comprenda un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.
Ejemplos
Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden poner en práctica otros modos de realización diversos, dada la descripción general proporcionada anteriormente.
Procedimientos generales
La glucomanipulación de la región Fc de un anticuerpo da lugar a una afinidad de unión incrementada a los receptores FcyRIII humanos, lo que a su vez se traduce en una inducción de ADCC potenciada y una eficacia antitumoral. Los receptores FcyRIII humanos se expresan en macrófagos, neutrófilos y linfocitos citolíticos naturales (NK), células dendríticas y linfocitos T Y§. En el ratón, la especie más ampliamente utilizada para pruebas de eficacia preclínica, FcyRIV murino, el homólogo murino de FcYRIIIa humano, está presente en los macrófagos y neutrófilos pero no en los linfocitos NK. Por lo tanto, no se refleja la magnitud total de cualquier eficacia mejorada esperada con anticuerpos glucomodificados en esos modelos. Se generó un ratón transgénico para FcYRIIIa humano (CD16a), que presenta la expresión de CD16a humano estable en linfocitos NK murinos en sangre, tejidos linfáticos y tumores. Además, el nivel de expresión de CD16a humano en linfocitos NK no estimulados en la sangre de estos ratones transgénicos refleja el encontrado en seres humanos. También se demostró que una regulación por disminución de FcYRIIIa humano en los linfocitos NK asociados a tumores después del tratamiento con anticuerpos se correlaciona con la actividad antitumoral. Por último, se demostró una eficacia significativamente mejorada del tratamiento con anticuerpos glucomodificados en modelos tumorales usando esta nueva cepa de ratón en comparación con sus compañeros de camada negativos para CD16 humano.
Ejemplo 1
Modelo de xenoinjerto de carcinoma de cabeza y cuello FaDu
Se sometieron a prueba los inmunoconjugados IgG-IL2 28H1 dirigido a FAP e IgG-IL2 DP47GS no dirigido que comprendían la IL-2 mutante cuádruple (qm) (SEQ ID NO: 125, 126, 129 y SEQ ID NO: 133-135, respectivamente) y el GlycoMab anti-EGFR (SEQ ID NO: 102 y 103) en la línea celular de carcinoma de cabeza y cuello humana FaDu, inyectada por vía intralingual en ratones SCID. La IHQ demostró que este modelo tumoral en tejido congelado en fresco era positivo para FAP. Las células FaDu se obtuvieron originalmente de la ATCC (American Type Culture Collection) y después de la expansión se depositaron en el banco de células interno de Glycart. La línea de células tumorales se cultivó de forma rutinaria en DMEM que contenía FCS al 10 % (Gibco) a 37 °C en una atmósfera saturada de agua con CO2 al 5 %. Se usó el paso 9 in vitro para inyección intralingual, con una viabilidad de un 95,8 %. Se inyectaron por vía intralingual veinte pl de suspensión celular (2 x 105 células FaDu en medio AimV (Gibco)). Ratones hembra SCID (Taconics, Dinamarca), de 8-9 semanas de edad al inicio del experimento se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz/12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas, Felasa, TierschG). Se revisó el protocolo de estudio experimental y se aprobó por el gobierno local (P 2008016). Después de su llegada, se mantuvo a los animales durante una semana para que se acostumbraran al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo de forma periódica. A los ratones se les inyectaron por vía intralingual el día 0 del estudio 2 x 105 células FaDu, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana después de la inyección de células tumorales, a los ratones se les inyectó i.v. el inmunoconjugado IgG-IL2 qm 28H1, el inmunoconjugado IgG-IL2 qm DP47GS, el GlycoMab anti-EGFR, la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm 28H1 y el GlycoMab anti-EGFR o la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm DP47GS y el GlycoMab anti-EGFR una vez a la semana durante cuatro semanas. A todos los ratones se les inyectaron i.v. 200 pl de la solución apropiada. Las dosis se especifican en la tabla 2. A los ratones en el grupo de vehículo se les inyectó PBS y en los grupos de tratamiento el inmunoconjugado IgG-IL2 qm 28H1, el inmunoconjugado IgG-IL2 qm DP47GS, el GlycoMab anti-EGFR, la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm 28H1 y el GlycoMab anti-EGFR o la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm DP47GS y el GlycoMab anti-EGFR. Para obtener la cantidad apropiada de inmunoconjugado por 200 jl, las soluciones madre se diluyeron con PBS cuando fue necesario. La figura 1A muestra que solo la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm 28H1 dirigido a FAP y el GlycoMab anti-EGFR mediaron una eficacia superior en términos de la mediana de supervivencia potenciada en comparación con el inmunoconjugado IgG-IL2 qm 28H1 o el GlycoMab anti-EGFR solos. Por el contrario, la combinación de IgG-IL2 qm DP47GS no dirigido y el GlycoMab anti-EGFR no mostró superioridad con respecto a la administración del agente único (figura 1B).
TABLA 2.
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Ejemplo 2
Refuerzo in vitro de la capacidad de destrucción de linfocitos NK por inmunoconjugados de IL-2
Para determinar el efecto de los inmunoconjugados sobre los linfocitos NK, se evaluó la destrucción de células tumorales tras el tratamiento con los inmunoconjugados, en particular inmunoconjugados que comprenden IL-2 como resto efector. Para este propósito, se aislaron linfocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) de acuerdo con procedimientos estándar, usando Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO, EE. UU.). En resumen, se extrajo sangre venosa con jeringuillas heparinizadas a voluntarios sanos. La sangre se diluyó 2:1 con PBS que no contenía calcio ni magnesio y se extendió sobre Histopaque-1077. El gradiente se centrifugó a 450 x g durante 30 min a temperatura ambiente (TA) sin frenado. La interfase que contiene los PBMC se recogió y se lavó con PBS tres veces en total (350 x g seguido de 300 x g durante 10 min a TA).
Los PBMC aislados se incubaron con inmunoconjugados de IL-2 (Proleukin) o IL-2, añadidos al sobrenadante celular, durante 45 h. Posteriormente, los PBMC se recuperaron y se usaron para ADCC mediada por GlycoMab anti-EGFR de células A549 a una E:T de 10:1, durante 4 h. La destrucción de las células diana se detectó midiendo la liberación de LDH en los sobrenadantes celulares (kit de detección de citotoxicidad con LDH de Roche). La figura 2 muestra la destrucción global de células tumorales A549 por los PBMC, pretratados o no con inmunoconjugado IgG-IL2 qm 28H1 dirigido a FAP o IL-2 (Proleukin) 0,57 nM (A) o 5,7 nM (B), en presencia de diferentes concentraciones de GlycoMab anti-EGFR. Los gráficos muestran que el pretratamiento con inmunoconjugado de las células efectoras da como resultado un incremento mayor en la destrucción de las células diana con concentraciones en incremento de GlycoMab, en comparación con las células efectoras no tratadas.
Ejemplo 3
Modelo de xenoinjerto colorrectal LS174T
El inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A dirigido a CEA (SEQ ID NO: 136-138), el GlycoMab anti-EGFR (SEQ ID NO: 102 y 103) y cetuximab se sometieron a prueba en la línea celular LS174T colorrectal humana, inyectada por vía intraesplénica en ratones SCID transgénicos para FcyRIII humano. La IHQ demostró que este modelo tumoral en tejido congelado en fresco era positivo para CEA. Las células LS174T (células de carcinoma de colon humano) se obtuvieron originalmente de la ECACC (European Collection of Cell Culture) y después de la expansión se depositaron en el banco de células interno de Glycart. LS174T se cultivaron en medio de Eagle MEM que contenía FCS al 10 % (PAA Laboratories, Austria), Glutamax al 1 % y aminoácidos no esenciales MEM al 1 % (Sigma). Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera saturada de agua con CO2 al 5 %. Se usó el paso 19 o 23 in vitro para inyección intraesplénica, con una viabilidad de un 99 %. Se realizó una pequeña incisión en el sitio abdominal izquierdo de los ratones SCID transgénicos para FcyRIII anestesiados. Se inyectaron treinta microlitros de suspensión celular (2 x 106 células LS174T en medio AIM V) a través de la pared abdominal justo debajo de la cápsula del bazo. Las heridas superficiales se cerraron usando pinzas de forcipresión o suturas resolubles. Ratones SCID hembra transgénicos para FcyRIII; de 8-9 semanas de edad al inicio del experimento (adquiridos a Taconi, Dinamarca) se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz/12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas, Felasa, TierschG). Se revisó y aprobó el protocolo del estudio experimental por las autoridades gubernamentales locales (P 2008016, P2011/128). Después de su llegada, se mantuvo a los animales durante una semana para que se acostumbraran al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo de forma periódica. A los ratones se les inyectaron por vía intraesplénica el día 0 del estudio 2 x 106 células LS174T, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana después de la inyección de células tumorales, a los ratones se les inyectó i.v. el inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A, el GlycoMab anti-EGFR, cetuximab, la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y el GlycoMab anti-EGFR o la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y cetuximab una vez a la semana durante tres semanas. A todos los ratones se les inyectaron i.v. 200 pl de la solución apropiada. Las dosis se especifican en la tabla 3. A los ratones en el grupo de vehículo se les inyectó PBS y en los grupos de tratamiento el inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A o el GlycoMab anti-EGFR, cetuximab, la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y el GlycoMab anti-EGFR o la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y cetuximab. Para obtener la cantidad apropiada de inmunoconjugado por 200 pl, las soluciones madre se diluyeron con PBS cuando fue necesario. La figura 3 y las tablas 3A y 3B muestran que la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y el GlycoMab anti-EGFR mediaron una eficacia superior en términos de la mediana de supervivencia y supervivencia global potenciadas en comparación con el inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A solo, el GlycoMab anti-EGFR solo, cetuximab solo, o la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y cetuximab.
TABLA 3.
Figure imgf000037_0001
TABLA 3A. Resumen de los datos de supervivencia correspondientes a la figura 3A.
Figure imgf000037_0002
TABLA 3B. Resumen de los datos de supervivencia correspondientes a la figura 3B.
Figure imgf000037_0003
Ejemplo 4
Modelo de xenoinjerto pulmonar A549
El inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A dirigido a CEA (SEQ ID NO: 136-138), el GlycoMab anti-EGFR (SEQ ID NO: 102 y 103) y cetuximab se sometieron a prueba en la línea celular A549 de NSCLC humano, inyectada i.v. en ratones SCID transgénicos para FcyRIII humano.
Las células del carcinoma broncopulmonar no microcítico A549 se obtuvieron originalmente de la ATCC (CCL-185) y después de la expansión se depositaron en el banco de células interno de Roche-Glycart. La línea de células tumorales se cultivó de forma rutinaria en DMEM que contenía FCS al 10 % (Gibco) a 37 °C en una atmósfera saturada de agua con CO2 al 5 %. Se usó el paso 8 para trasplante, con una viabilidad de un 97-98 %. Se inyectaron i.v. 5 x 106 células por animal en la vena de la cola en 200 pl de medio de cultivo celular AIM V (Gibco).
Ratones hembra SCID con FcyRIII (Roche-Glycart; Suiza), de 8-9 semanas de edad al inicio del experimento (criados en Charles River, Lyon, Francia) se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz/12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas, Felasa, TierschG). Se revisó y aprobó el protocolo del estudio experimental por las autoridades gubernamentales locales (P 2011/128). Después de su llegada, se mantuvo a los animales durante una semana para que se acostumbraran al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo de forma periódica.
A los ratones se les inyectaron i.v. el día 0 del estudio 5 x 106 células A549, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana (figura 4A) o dos semanas (figura 4B) después de la inyección de las células tumorales, a los ratones se les inyectó i.v. el inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A, el GlycoMab anti-EGFR, cetuximab, la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y el GlycoMab anti-EGFR o la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y cetuximab una vez a la semana durante tres semanas. A todos los ratones se les inyectaron i.v. 200 pl de la solución apropiada. Las dosis se especifican en la tabla 4. A los ratones en el grupo de vehículo se les inyectó PBS y en el grupo de tratamiento el inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A, el GlycoMab anti-EGFR, la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y el GlycoMab anti-EGFR o la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y cetuximab. Para obtener la cantidad apropiada de inmunoconjugado por 200 pl, las soluciones madre se diluyeron con PBS cuando fue necesario.
La figura 4 y las tablas 4A y 4B muestran que la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y el GlycoMab anti-EGFR media una eficacia superior en términos de mediana de supervivencia y supervivencia global potenciadas en comparación con el inmunoconjugado respectivo, el GlycoMab anti-EGFR o el cetuximab solo, así como la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y cetuximab.
TABLA 4.
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TABLA 4A. Resumen de los datos de supervivencia correspondientes a la figura 4A.
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TABLA 4B. Resumen de los datos de supervivencia correspondientes a la figura 4B.
Figure imgf000038_0003
Ejemplo 5
Modelo de xenoinjerto colorrectal LS174T
El inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A dirigido a CEA (SEQ ID NO: 136-138) y el GlycoMab anti-Her3 (SEQ ID NO: 142 y 146) se sometieron a prueba en la línea celular LS174T colorrectal humana, inyectada por vía intraesplénica en ratones SCID transgénicos para FcyRIII humano.
Las células LS174T (células de carcinoma de colon humano) se obtuvieron originalmente de la ECACC (European Collection of Cell Culture) y después de la expansión se depositaron en el banco de células interno de Roche-Glycart. LS174T se cultivaron en medio de Eagle MEM que contenía FCS al 10 % (PAA Laboratories, Austria), Glutamax al 1 % y aminoácidos no esenciales MEM al 1 % (Sigma). Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera saturada de agua con CO2 al 5%. Se usó el paso 21 in vitro para inyección intraesplénica, con una viabilidad de un 97,9 %. Se realizó una pequeña incisión en el sitio abdominal izquierdo de los ratones SCID transgénicos para FcyRIII humano anestesiados. Se inyectaron treinta microlitros (2 x 106 células LS174T en medio AIM V) de suspensión celular a través de la pared abdominal justo debajo de la cápsula del bazo. Las heridas superficiales se cerraron usando suturas resolubles.
Ratones SCID hembra transgénicos para FcyRIII humano; de 8-9 semanas de edad al inicio del experimento (Roche-Glycart, Suiza) se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz/12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas, Felasa, TierschG). Se revisó y aprobó el protocolo del estudio experimental por las autoridades gubernamentales locales (P 2011/128). Después de su llegada, se mantuvo a los animales durante una semana para que se acostumbraran al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo de forma periódica.
A los ratones se les inyectaron por vía intraesplénica el día 0 del estudio 2 x 106 células LS174T, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana después de la inyección de células tumorales, a los ratones se les inyectó i.v. el inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A, el GlycoMab anti-Her3 o la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y el GlycoMab anti-Her3 una vez a la semana durante tres semanas.
A todos los ratones se les inyectaron i.v. 200 pl de la solución apropiada. Las dosis se especifican en la tabla 5. A los ratones del grupo de vehículo se les inyectó PBS y en los grupos de tratamiento el inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A, el GlycoMab anti-Her3 o la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y el GlycoMab anti-Her3. Para obtener la cantidad apropiada de inmunoconjugado por 200 pl, las soluciones madre se diluyeron con PBS cuando fue necesario. La figura 5 y la tabla 5A muestran que la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A y el GlycoMab anti-Her3 mediaba una eficacia superior en términos de la mediana de supervivencia potenciada en comparación con el inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A o el GlycoMab anti-Her3 solo.
TABLA 5.
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TABLA 5A. Resumen de los datos de supervivencia correspondientes a la figura 5.
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Ejemplo 6
Modelo de xenoinjerto de carcinoma renal ACHN
El inmunoconjugado IgG-IL228H1 dirigido a FAP que comprende la IL-2 muíante cuádruple (qm) (SEQ ID NO: 125, 126 y 129) y el GlycoMab anti-EGFR (SEQ ID NO: 102 y 103) se sometieron a prueba en la línea de células renales humana ACHN, inyectada por vía intrarrenal en ratones SCID transgénicos para FcyRIII humano.
Las células ACHN (células de adenocarcinoma renal humano) se obtuvieron originalmente de la ATCC (American Type Culture Collection) y después de la expansión se depositaron en el banco de células interno de Roche-Glycart. Las ACHN se cultivaron en DMEM que contenía FCS al 10 %. Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera saturada de agua con CO2 al 5 %. Se usó el paso 22 in vitro para inyección intrarrenal, con una viabilidad de un 96,4 %. Se realizó una pequeña incisión (2 cm) en el flanco derecho y la pared peritoneal de ratones SCID transgénicos para FcyRIII humano anestesiados. Se inyectaron cincuenta pl (1 x 106 células de ACHN en medio AIM V) de suspensión celular 2 mm de forma subcapsular en el riñón. Las heridas superficiales y la pared peritoneal se cerraron usando suturas resolubles.
Ratones SCID hembra transgénicos para FcyRIII humano; de 8-9 semanas de edad al inicio del experimento (Roche-Glycart, Suiza) se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz/12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas, Felasa, TierschG). Se revisó y aprobó el protocolo del estudio experimental por las autoridades gubernamentales locales (P 2011/128). Después de su llegada, se mantuvo a los animales durante una semana para que se acostumbraran al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo de forma periódica.
A los ratones se les inyectaron por vía intrarrenal el día 0 del estudio 1 x 106 células ACHN, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana después de la inyección de células tumorales, a los ratones se les inyectó i.v. vehículo, GlycoMab anti-EGFR, la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 28H1 y el GlycoMab anti-EGFR o la combinación de Proleukin® y el GlycoMab anti-EGFR. El GlycoMab EGFR y el inmunoconjugado IgG-IL2 28H1 se dosificaron una vez a la semana durante 3 semanas. Proleukin® se inyectó diariamente de lunes a viernes durante 3 semanas.
A todos los ratones se les inyectaron i.v. 200 pl de la solución apropiada. Las dosis se especifican en la tabla 6. A los ratones en el grupo de vehículo se les inyectó PBS y en los grupos de tratamiento GlycoMab anti-EGFR, la combinación del inmunoconjugado IgG-IL2 28H1 y el GlycoMab anti-EGFR o la combinación de Proleukin® y el GlycoMab anti-EGFR. Para obtener la cantidad apropiada de inmunoconjugado por 200 pl, las soluciones madre se diluyeron con PBS cuando fue necesario.
La figura 6 y la tabla 6A muestran que la combinación del inmunoconjugado IgG-IL228H1 y el GlycoMab anti-EGFR medió una eficacia superior en términos de la mediana de supervivencia y supervivencia global potenciadas en comparación con GlycoMab anti-EGFR solo y la combinación de Proleukin® y el GlycoMab anti-EGFR.
TABLA 6.
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TABLA 6A. Resumen de los datos de supervivencia correspondientes a la figura 6.
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Ejemplo 7
Refuerzo in vitro de la capacidad de destrucción de linfocitos NK y expresión de linfocitos NK CD25 y CD69 por inmunoconjugados de IL-2
Como en el ejemplo 2, se evaluó la destrucción de células tumorales (LS174T) por linfocitos NK tras el tratamiento con un inmunoconjugado, en particular un inmunoconjugado que comprende IL-2 como resto efector, y un GlycoMab, en este caso un GlycoMab anti-Her3. Se detectó la destrucción de células diana midiendo la liberación de LDH en el sobrenadante celular.
Los PBMC se aislaron a partir de sangre fresca. En resumen, se diluyó la sangre 3:1 con PBS. Se apilaron aproximadamente 30 ml de la mezcla de sangre/PBS en 15 ml de Histopaque (Sigma) y se centrifugó durante 30 min a 450 g durante 30 min sin frenado. Se recogieron los linfocitos con una pipeta de 5 ml en tubos de 50 ml que contenían PBS. Se llenaron los tubos hasta 50 ml con PBS y se centrifugaron durante 10 min a 350 g. Se descartó el sobrenadante, se resuspendió el sedimento en 50 ml de PBS y se centrifugó durante 10 min a 300 g. La etapa de lavado se repitió una vez. Se contaron las células y se resuspendieron en RPMI precalentado que contenía glutamina al 1 % y FCS al 10 % con 1 x 106 células por ml. Se incubaron las células durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, se extrajeron las células y se contaron.
LS174T (ECACC n.° 87060401) es una línea celular de adenocarcinoma de colon de raza blanca humana. Se cultivaron las células en EMEM que contenía glutamina al 1 %, aminoácidos no esenciales al 1 % y FCS al 10 % y se dividieron de cada dos a tres días antes de alcanzar la confluencia. Se separaron las células LS174T usando tripsina. Se contaron las células y se verificó la viabilidad. La viabilidad de las células antes del ensayo fue del 99,4 %. Se resuspendieron las células en su medio respectivo a 0,3 x 106 por ml. Se sembraron 100 pl de la suspensión celular en una placa de fondo plano tratada con cultivo celular de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, se eliminó el sobrenadante de las células. A continuación, se añadieron 50 pl del GlycoMab anti-Her3 diluido (SEQ ID NO: 142 y 146) a 1000 ng/ml, 100 ng/ml y 10 ng/ml o medio a los pocillos respectivos. A continuación, se añadieron 50 pl del inmunoconjugado IgG-IL2 qm CH1A1A dirigido a CEA (SEQ ID NO: 136-138) a las concentraciones indicadas (véase la figura 7) o medio por pocillo. Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, se añadieron 100 pl de PBMC a 3 x 106 células por ml o medio para alcanzar un volumen final de 200 pl por pocillo. Se incubaron las células durante 24 horas en la incubadora. Después de la incubación, se centrifugó la placa durante 4 minutos a 400 g y se recogió el sobrenadante. Se usaron 50 pl por pocillo del sobrenadante para medir la liberación de LDH (kit de detección de citotoxicidad con LDH de Roche). El sobrenadante restante se almacenó a -20 °C hasta su uso posterior. Se resuspendieron las células en tampón FACS y se almacenaron a 4 °C antes de comenzar con la tinción FACS (véase a continuación).
La figura 7 muestra la destrucción global de células LS174T por los PBMC tras el tratamiento con GlycoMab anti -Her3 solo (panel izquierdo), el inmunoconjugado IgG-IL-2 qm CH1A1A solo (panel derecho) o la combinación del inmunoconjugado IgG-IL-2 qm CH1A1A con el GlycoMab anti-Her3 (panel derecho).
Los PBMC se recogieron después de 24 horas y se usaron para el análisis FACS de la expresión de CD25 y CD69 de linfocitos NK. Se centrifugaron las células durante 4 min a 400 g y se lavaron una vez con PBS que contenía BSA al 0,1 % (tampón FACS). A continuación se añadieron a las células 20 pl por pocillo de la mezcla de anticuerpos. Se incubaron las células durante 30 min en el frigorífico. Posteriormente, se lavaron dos veces las células con tampón FACS y se resuspendieron en 200 pl de tampón FACS que contenía PFA al 2 % por pocillo. Se realizó el análisis usando BD FACS Fortessa y la siguiente mezcla de anticuerpos: CD3 PE/Cy7 (BioLegend, n.° 300420; diluido 1:40), CD56 APC (BioLegend n.° 318310; diluido 1:20), CD69 Brilliant Violet 421 (BioLegend n.° 310929; diluido 1:40), CD25 PE (BD Bioscience n.° 557138; diluido 1:20).
La figura 8 muestra la expresión de CD25 (A) o CD69 (B) en linfocitos NK tras el tratamiento con GlycoMab anti-Her3 solo (panel izquierdo), el inmunoconjugado IgG-IL-2 qm CH1A1A solo (panel derecho) o la combinación del inmunoconjugado IgG-IL-2 qm CH1A1A con el GlycoMab anti-Her3 (panel derecho).

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Una combinación, para su uso en el tratamiento del cáncer en un individuo que lo necesite, de
(a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, en la que el primer anticuerpo se dirige a un antígeno presentado en una célula tumoral o en un entorno de células tumorales, y en la que el resto efector es un resto efector IL-2 mutante que comprende al menos una mutación aminoacídica que reduce o suprime la afinidad del resto efector IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2, pero conserva la afinidad del resto efector IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, en comparación con el resto efector IL-2 no mutado; y
(b) un segundo anticuerpo seleccionado del grupo de
(i) un anticuerpo de clase IgG dirigido al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que comprende el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 102 y el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 103, en el que el anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado, y
(ii) un anticuerpo de clase IgG dirigido a HER3, que comprende el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 142 y el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 146, en la que el anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado.
2. La combinación de acuerdo con el uso de la reivindicación 1, en la que el resto efector IL-2 mutante comprende tres sustituciones aminoacídicas en las posiciones correspondientes a los residuos 42, 45 y 72 de IL-2 humana (SEQ ID NO: 1).
3. La combinación de acuerdo con el uso de la reivindicación 1 o 2, en la que el resto efector IL-2 mutante es IL-2 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G.
4. La combinación de acuerdo con el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el resto efector IL-2 mutante comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2.
5. La combinación de acuerdo con el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el primer anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, en particular un anticuerpo de clase IgG, más en particular un anticuerpo de subclase IgG1.
6. La combinación de acuerdo con el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el resto efector comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con el primer anticuerpo.
7. La combinación de acuerdo con el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el primer anticuerpo se genomanipula para que tenga una unión reducida a un receptor de Fc activador, en particular una unión reducida a FcYRIIIa humano.
8. La combinación de acuerdo con el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el primer anticuerpo comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329 de las cadenas pesadas de inmunoglobulina (numeración EU como se describe en Kabat).
9. La combinación de acuerdo con el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el primer anticuerpo comprende las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G (numeración EU como se describe en Kabat) en las cadenas pesadas de inmunoglobulina.
10. La combinación de acuerdo con el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el inmunoconjugado consiste esencialmente en un resto efector y un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida, en la que el resto efector se fusiona en su aminoácido aminoterminal al extremo carboxílico de una de las cadenas pesadas del primer anticuerpo, opcionalmente a través de un conector peptídico.
11. La combinación de acuerdo con el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el primer anticuerpo se dirige a un antígeno seleccionado del grupo de proteína de activación de fibroblastos (FAP), el dominio A1 de tenascina C (TNC A1), el dominio A2 de tenascina C (TNC A2), el dominio adicional B de fibronectina (EDB), antígeno carcinoembrionario (CEA) y proteoglucano de sulfato de condroitina asociado al melanoma (MCSP).
12. La combinación de acuerdo con el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el primer anticuerpo se dirige a FAP y comprende
(i) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 12 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 11;
(ii) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 17 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 16;
(iii) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 47 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 46;
(iv) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 63 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 62; o
(v) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 67 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 66.
13. La combinación de acuerdo con el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el primer anticuerpo se dirige a CEA y comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 114 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 115.
14. La combinación de acuerdo con el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que el segundo anticuerpo es un anticuerpo de clase IgG de longitud completa, en particular un anticuerpo de la subclase IgG1.
15. La combinación de acuerdo con el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que la función efectora se selecciona del grupo de unión a un receptor de Fc activador, ADCC, ADCP, CDC y secreción de citocinas.
16. La combinación de acuerdo con el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que el segundo anticuerpo se genomanipula mediante la introducción de una o más mutaciones aminoacídicas en la región Fc o mediante modificación de la glucosilación en la región Fc.
17. La combinación de acuerdo con el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la que el individuo es un mamífero, en particular un ser humano.
18. Una composición farmacéutica en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que la composición farmacéutica comprende
(a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, en la que el primer anticuerpo se dirige a un antígeno presentado en una célula tumoral o en un entorno de células tumorales, y en la que el resto efector es un resto efector IL-2 mutante que comprende al menos una mutación aminoacídica que reduce o suprime la afinidad del resto efector IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2, pero conserva la afinidad del resto efector IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, en comparación con el resto efector IL-2 no mutado; y
(b) un segundo anticuerpo seleccionado del grupo de
(i) un anticuerpo de clase IgG dirigido al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que comprende el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 102 y el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 103, en el que el anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado, y
(ii) un anticuerpo de clase IgG dirigido a HER3, que comprende el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 142 y el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 146, en la que el anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado.
19. Un kit para su uso en el tratamiento del cáncer, que comprende en el mismo recipiente o en recipientes separados
(a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo genomanipulado para que tenga una función efectora reducida y un resto efector, en el que el primer anticuerpo se dirige a un antígeno presentado en una célula tumoral o en un entorno de células tumorales, y en el que el resto efector es un resto efector IL-2 mutante que comprende al menos una mutación aminoacídica que reduce o suprime la afinidad del resto efector IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2, pero conserva la afinidad del resto efector IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, en comparación con el resto efector IL-2 no mutado;
(b) un segundo anticuerpo seleccionado del grupo de
(i) un anticuerpo de clase IgG dirigido al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que comprende el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 102 y el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 103, en el que el anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado, y
(ii) un anticuerpo de clase IgG dirigido a HER3, que comprende el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 142 y el dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 146, en el que el anticuerpo se genomanipula para que tenga una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado; y
(c) opcionalmente, un prospecto del envase que comprende instrucciones impresas que indican el uso del tratamiento combinado como un procedimiento para tratar el cáncer.
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