KR100973564B1

KR100973564B1 - 최적화된 Ｆｃ 변이체 및 그의 제조 방법

Info

Publication number: KR100973564B1
Application number: KR1020097009022A
Authority: KR
Inventors: 그레고리 알란 라자르; 아더 제이. 치리노; 웨이 당; 존 루돌프 데스자르라이스; 스테펜 콜 도베르스타인; 로버트 제이. 하이스; 셰어 바하두르 카르키; 오미드 바파
Original assignee: 젠코어 인코포레이티드
Priority date: 2003-05-02
Filing date: 2004-03-26
Publication date: 2010-08-03
Also published as: RU2337107C2; CA2766627A1; IL213648A; JP2009209150A; CA2766627C; JP5226613B2; KR20090059170A; IL213648A0; RU2005137578A

Abstract

본 발명은 최적화된 Fc 변이체, 그것의 제조 방법 및 최적화된 Fc 변이체를 포함하는 항체 및 Fc 융합체에 관한 것이다.

Fc 변이체

Description

최적화된 Ｆｃ 변이체 및 그의 제조 방법{OPTIMIZED Fc VARIANTS AND METHODS FOR THEIR GENERATION}

이 출원은 미합중국 특허법(35 U.S.C) 119조(e)에 의거하여 2003년 6월 12일자 미국 출원번호 60/477,839호, 2003년 3월 2일자 미국 출원번호 60/467,606호, 2002년 9월 27일자 미국 출원번호 60/414,433호 및 2003년 1월 23일자 미국 출원번호 60/442,301호를 우선권으로 주장하는, 2003년 9월 26일자 미국 출원번호 10/672,280호의 일부 계속 출원이며, 2003년 3월 3일자 미국 출원번호 10/379,392호에 대한 일부 계속 출원이고, 상기 모든 출원은 원용에 의해 본 명세서에서 포함된다.

본 발명은 신규의 최적화된 Fc 변이체(variant), 그것의 제조를 위한 조작 방법 및 그것의 적용, 특히 치료 용도에 관한 것이다.

항체는 특정 항원에 결합하는 면역 단백질이다. 인간과 랫를 포함하는 대부분의 포유동물에서 항체는 경쇄와 중쇄가 짝을 이루어 만들어진다. 각 쇄는 개별 면역 글로불린 도메인이 모여 이루어지기 때문에, 그러한 단백질을 통틀어 면역 글로불린이라고 일컫는다. 각 쇄는 가변부위와 불변부위라고 하는 뚜렷이 구분되는 두 부위로 이루어진다. 경쇄와 중쇄의 가변 부위는 항체마다 그 서열이 상당히 다르며, 가변 부위로 인해 표적 항원과 결합할 수 있다. 불변부위는 그 서열 변화가 덜하지만, 불변부위 때문에 항체가 중요한 생화학적 현상을 일으키는 몇 가지 천연 단백질과 결합할 수 있다. 인간에 있어서 항체에는 중요한 5가지 클래스가 있는데 IgA(서브클래스(亞種)인 IgA1과 IgA2 포함), IgD, IgE, IgG(서브클래스인 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 포함), IgM이다. 이 5가지 종류의 항체를 서로 구별하는 것은 그 불변부위에 있는데, 가변부위들 사이에도 미세한 차이가 존재할 수 있다. 도 1은 본 명세서에서 면역 글로불린의 일반적인 구조적 특징을 기술하기 위한 예로 들고 있는 IgG 항체를 도시한다. IgG 항체는 두 개의 경쇄와 두 개의 중쇄로 이루어진 이종사량체(heterotetramer) 단백질이다. IgG 중쇄는 N-말단에서 C-말단까지 VH-C γ1-C γ2-C γ3 순서로 연결된 네 개의 면역 글로불린 도메인으로 이루어지는데, 이들은 각각 중쇄 가변부위, 불변 감마 1도메인, 불변 감마 2도메인, 불변 감마 3도메인을 나타낸다. IgG 경쇄는 N-말단에서 C-말단까지 V_L-C_L로 연결된 두 개의 면역 글로불린 도메인으로 이루어지는데, 이들은 각각 경쇄 가변 도메인과 경쇄 불변 도메인을 나타낸다.

항체의 가변부위는 그 분자의 항원 결합 결정부(antigen binding determinant)를 포함하므로 항체가 그 표적 항원에 대하여 가지는 특이성을 결정한다. 가변부위는 같은 종류에 속하는 항체들 사이에서 그 서열이 가장 뚜렷이 구분되는 부위이므로 가변부위로 일컫는다. 서열의 변화는 대부분이 상보성 결정 부 위(complementarity determining region, CDR)에 몰려 있다. 경쇄와 중쇄에 각 3개씩 총 6개의 상보성 결정 부위가 있는데, V_H CDR1, V_H CDR2, V_H CDR3, V_L CDR1, V_L CDR1, V_LCDR2, V_L CDR3로 지칭한다. CDR 부위 밖의 가변부위는 골격부위(framework region, FR)라고 일컫는다. CDR만큼 다양하지 않으나 서로 다른 항체의 FR 사이에도 다양성이 존재한다. 전체적으로 항체의 이러한 구조적 특성 덕택에 면역계가 광범위한 종류의 항원에 대한 특이성을 획득하기 위한 항원 결합의 다양성(CDR)을 구축하는데 필요한 안정적인 뼈대(FR)가 생긴다. 다양한 생물학적 종에서 비롯한 항체가 항원과 결합하여 이룬 복합체(complex) 또는 항원과 결합하지 않은 항체에 대한 수많은 고해상도 구조가 존재한다. 항체 가변부위의 서열과 구조적 면모는 그 특성이 잘 연구되어 있고(Morea 외, 1997, Biophys Chem 68:9~16; Morea 외, 2000, Methods 20:267~279), 항체에서 보존된 특징들 덕택에 항체 공학적 기법이 풍부하게 발전할 수 있었다(Maynard 외, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339~376). 예를 들어 한 항체, 가령 랫 항체에서 CDR을 따와서 다른 항체, 가령 인간 항체의 골격부에 이식하는 것이 가능하다. 당업계에서 “인간화(humanization)"라고 하는 이러한 과정은 인간 유래가 아닌 항체로부터 항원성이 적은 치료제 항체를 생성할 수 있게 한다. 항체의 다른 부위가 없이 가변부위로 구성된 조각이 존재할 수 있는데, 이에는 V_H-C γ1과 V_H-C_L로 구성된 항원 결합 조각(Fab), V_H와 V_L로 이루어진 가변 조각(Fv), V_H와 V_L이 한 쇄로 연결된 구성의단일 쇄 가변 조각(scFv)와 그 밖의 다양한 가변 부위 조각들이 속한다(Little 외, 2000, Immunol Today 21:364~370).

항체의 Fc 부위는 다양한 Fc 리셉터와 리간드에 결합하므로 작용체 기능(effector function)으로 일컫는 중요한 기능을 행하는 능력을 가진다. IgG에서 도 1에서 나타낸 Fc 부위는 면역 글로불린 도메인 C γ2와 C γ3 및 C γ2로 이어지는 N-말단 경첩부로 구성된다. IgG 종류에서 중요한 Fc 리셉터의 단백질 계열(family)은 Fc 감마 리셉터(Fc γR, Fc gamma receptor)이다. 이 리셉터들은 항체와 면역계의 세포와의 교류를 매개한다(Raghavan 외, 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181~220; Ravetch 외, 2001, Annu Rev Immunol 19:275~290). 인간의 경우, 상기 단백질 계열에 속하는 것으로는 Fc γRI(CD64), Fc γII(CD32) 그리고 FcγRII(CD16)가 있는데, FcγRI에는 FcγRIa, FcγRIb. FcγRIc 아이소형(isoform)이, FcγRII에는 FcγRIIa(H131과 R131 동종이형(allotype)이 포함됨), FcγRIIb(FcγRIIb-1과 FcγRIb-2의 동종이형 포함), FcγRIIc 아이소형이, 그리고 FcγRIII에는 FcγRIIIa(V158과 F158 동종이형 포함)과 FcγRIIIb 아이소형이 속하게 된다. 이 리셉터들은 전형적으로 Fc와 결합하는 것을 매개하는 세포외 도메인, 막 통과 부위, 그리고 세포내에서 신호전달 과정을 매개할 가능성도 있는 세포내 도메인을 가지고 있다. 이 리셉터들은 단핵세포, 대식세포, 중성구, 가지 세포, 호산구(eosinophil), 비만 세포(mast cell), 혈소판, B 세포, 대형 과립상 림프구(large granular lymphocyte), 랑게르한스 세포, 자연 살상 세포 그리고 γγ T 세포를 포함하는 다양한 면역 세포에서 발현된다. Fc/FcγR 복합체가 형성되면, 작용체 세포(effector cell)들을 항원이 결합한 곳으로 끌어들여 세포 내에서 일어나는 신호 전달 과정과 그에 따른 중요한 면역 반응을 일으키는 것이 전형적인데, 이러한 면역 반응에는 염증 매개 물질의 방출, B 세포 활성화, 세포내이입(endocytosis), 식세포 작용, 세포 독성 공격(cytotoxic attack) 등이 있다. 세포 독성 작용과 식세포 작용을 매개하는 능력은 항체가 표적 세포를 파괴하는데 쓰일 수 있는 메커니즘이다. FcγR를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포에 결합한 항원을 인식하고 이어서 그 표적 세포를 용해(lysis)하는 세포 매개 반응을 항체의존 세포매개 세포독성(ADCC, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)라고 한다(Raghavan 외, 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181~220; Ghetie 외, 2000, Annu Rev Immunol 18:739~766; Ravetch 외, 2001, Annu Rev Immunol 19: 275~290). FcγR를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포에 결합한 항원을 인식하고 이어서 그 표적 세포에 대한 식세포 작용을 일으키는 세포 매개 반응을 항체의존 세포매개 식세포 작용(ADCP, antibody-dependent cell-mediated phagocytosis)이라고 한다. 인간 FcγR의 세포외 도메인에 대해서는 구조를 결정한 단백질 구조가 여러 개 있는데, 이에는 FcγRIIa(pdb 기탁 코드(accession code) 1H9V)(Sondermann 외, 2001, J Mol Biol 309: 737~749)(pdb 기탁 코드 1FCG)(Maxwell 외, 1999, Nat Struct Biol 6: 437~442)와 FcγRIIb(pdb 기탁 코드 2FCB)(Sondermann 외, 1999, Embo J 18:1095~1103) 그리고 FcγRIIIb(pdb 기탁 코드 1E4J)(Sondermann 외, 2000, Nature 406:267~273)이 포함된다. 모든 FcγR은 Fc의 동일 부위에 결합하는데, 도 2에 나타낸 Cγ2 도메인 N-말단과 그에 선행하는 경첩부가 그 부위이다. 이 상호작용은 그 구조적 특성이 잘 연구되어 있고(Sondermann 외, 2001, J Mol Biol 309:737~749), 인간 FcγRIIIb의 세포외 도메인에 인간 Fc가 결합한 복합체 몇 가지는 그 구조가 결정되어 있고(pdb 기탁 코드 1E4K)(Sondermann 외, 2000, Nature 406:267~273)(pdb 기탁 코드 1IIS와 1IIX)(Radaev 외, 2001, J Biol Chem 276:16469~16477), 인간 IgE Fc/Fc_εRIα 복합체(pdb 기탁 코드 1F6A)(Garman 외, 2000, Nature 406:259~266) 역시 구조가 결정되어 있다.

IgG의 다른 서브클래스들은 FcγR에 대하여 서로 다른 친화성을 가지고 있는데, IgG1과 IgG3는 IgG2와 IgG4보다 그 리셉터에 훨씬 더 강하게 결합하는 것이 전형적이다(Jefferis 외, 2002, Immunol Lett 82:57~65). 모든 FcγR는 IgG Fc의 동일한 부위에 결합하지만 서로 다른 친화성으로 결합한다. 높은 친화성으로 결합하는 FcγRI은 IgG1에 대하여 K_d가 10^-8 M^-1 인데 반하여 친화성이 낮은 FcγRII와 FcγRIII은 일반적으로 그 K_d값이 각각 10^-6과 10^-7에서 결합한다. FcγRIIIa와 FcγRIIIb의 세포외 도메인은 96% 동일하지만, FcγRIIIb는 세포 내 신호전달 도메인을 가지고 있지 않다. 더욱이 FcγRI, FcγRIIa/c와 FcγRIIIa는 면역 복합체 유발 활성화에 대한 양성 조절인자이고 티로신에 근거한 면역 리셉터 활성화 모티프(ITAM, immunorecetor tyrosine-based activation motif)를 가지는 세포내 도메인이 있는 특징이 있는데 반하여, FcγRIIb는 티로신에 근거한 면역 리셉터 억제 모티프(ITIM, immunoreceptor tyrosine-based inhibtion motif)를 가지고 있기 때 문에 억제 조절인자이다. 따라서 전자는 활성 리셉터로, FcγRIIb는 억제 리셉터로 부른다. 이 리셉터들은 또한 서로 다른 면역 세포에서 그 발현 형태와 발현량을 달리 한다. 여기에 복잡성을 더하는 또 하나는 인간 단백질체에서 나타나는 FcγR의 다형성(polymorphism)이다. 특히 임상적으로 중요하게 관련된 다형성은 V158/F158 FcγRIIIa이다. 인간 IgG1은 V158 동종이형에 F158 이형보다 더 큰 친화성으로 결합한다. 이 친화성 차이 그리고 아마도 ADCC 및/또는 ADCP에 미치는 그 영향은 항CD20 항체 rituximab(Rituxan^®, IDEC Pharmaceutical Corporation의 등록 상표)의 효력을 결정하는 중요한 요소이다. V158 동종이형 보유 환자는 rituximab 요법에 대한 반응이 양호하지만, 친화성이 낮은 F158 동종이형 보유자는 반응이 저조하다(Cartron 외, 2002, Blood 99:754~758). 약 10~20%의 인간이 V158/V158의 동형접합체(homozygote)이고, 45%의 인간이 V158/F158 이형접합체이며, 35~45%의 인간이 F158/F158 이형접합체이다(Lehmbecher 외, 1999, Blood 94:4220~4232; Cartron 외, 2002, Blood 99:754~758). 따라서 80~90%의 인간은 치료에 저조하게 반응하는데, 이는 곧 F158 FcγRIIIa 대립유전자를 적어도 하나 가지고 있다는 뜻이다.

도 1에 나타낸 것처럼 Fc상에서 서로 겹치지만 별개인 하나의 결합 부위가, 보체 단백질 C1q와의 계면 역할을 한다. Fc/FcγR 결합이 ADCC를 매개하는 것과 똑같이 Fc/C1q 결합은 보체 의존성 세포독성(CDC, complement-dependent cytotoxicity)를 매개한다. C1q는 세린 단백질 가수분해 효소 C1r과 C1s와 복합체 를 이뤄 C1 복합체를 형성한다. C1q는 항체 6개와 결합할 수 있지만, 두 개의 IgG하고만 결합하여도 보체 연쇄증폭반응(complement cascade)을 일으키는 데는 충분하다. Fc와 FcγR 사이의 상호작용과 유사하게 서로 다른 서브클래스의 IgG들은 C1q에 대하여 그 친화성이 다른데, IgG1과 IgG3가 IgG2와 IgG4보다 FcγR에 대하여 더 세게 결합하는 것이 전형적이다(Jefferis 외, 2002, Immunol Lett 82:57~85). Fc/C1q 복합체에 대해서 현재로는 어떠한 구조도 얻은 것이 없지만 인간 IgG상의 C1q 결합부위에 대한 돌연변이 연구 결과 D270, K322, K326, P329, P331과 E333 잔기를 포함하는 구역(Idusogie 외, 2000, J Immunol 164:4178~4184; Idusogie 외, 2001, J Immunol 166:2571~2575)으로 지도를 작성(mapping)하였다.

도 1에 나타낸 것처럼, Cγ2와 Cγ3 도메인 사이에 위치하는 Fc상의 한 자리는 신생아 리셉터 FcRn과의 상호작용을 매개하는데, 이 결합에 의하여 세포내 이입된 항체가 엔도솜에서 혈액으로 다시 재활용된다(Raghavan 외, 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12: 181~220; Ghetie 외, 2000, Annu Rev Immunol 18:739~766). 이러한 과정은 전장(全長) 분자의 거대한 크기에 의하여 콩팥에서 여과되는 것이 차단되는 점과 결부되었을 때 항체의 혈청 내 반감기가 1주에서 3주에 이르도록 하는 유리한 효과를 낳는다. Fc가 FcRn에 결합하는 것도 항체 수송에서 중요한 역할을 맡는다. Fc에서 FcRn과 결합하는 자리는 세균 단백질 A와 단백질 G가 결합하는 자리이기도 하다. 이들 단백질의 강력한 결합을 이용하여 단백질 정제 과정에서 단백질 A나 단백질 G 친화성 크로마토그래피를 사용하는 항체의 정제 수단으로 삼는 것이 전형적인 예이다. 따라서 Fc상에 있는 이 부위의 결합 정확도는 항체의 임상 적 특성과 항체의 정제 모두에 있어서 중요하다. 랫(rat) Fc/FcRn 복합체(Martin 외, 2001, Mol Cell 7:867~877)와 Fc의 단백질 A와 G에 대한 복합체들(Deisenhofer, 1981, Biochemistry 20, 2361~2370; Sauer-Eriksson 외, 1995, Structure 3:265~278; Tashiro 외, 1995, Curr Opin Struct Biol 5:471~481)의 구조로부터 Fc가 이들 단백질과 일으키는 상호작용에 대한 고찰할 수 있다.

Fc 부위의 주된 특징은 도 1에 나타낸 것처럼 N297에 일어나는 보존된 N-연결 당화 반응이다. 종종 올리고당이라고도 하는 이 탄수화물은 항체에서 그 구조와 기능면에서 핵심적인 역할을 맡으며, 항체를 반드시 포유류 발현 시스템에서 제조하여야 하는 주된 이유 중의 하나다. 비록 어느 특정 이론에 구애받고자 하는 것은 아니나, 이 탄수화물의 구조적 용도는 아마도 Fc를 안정화하거나 가용화(solubilize)하고, Cγ3와 Cγ2 도메인 사이 특정 각(specific angle)이나 유연도 수준을 정하며, 두 Cγ2 도메인끼리 중심축을 따라 응집하는 것을 막거나 이 모든 요인을 조합한 것이라고 학계에서 생각하고 있다. FcγR과 C1q에 대하여 Fc가 효율적으로 결합하려면 이 수식(modification)이 필요하고 N297 연결 탄수화물의 조성이 바뀌거나 없어지게 되면 이들 단백질에 대한 결합도 영향을 수용체 된다(Umana 외, 1999, Nat Biotechnol 17:176~180; Davies 외, 2001, Biotechnol Bioeng 74:288~294; Mimura 외, 2001, J Biol Chem 276:45539~45547; Radaev 외, 2001, J Biol Chem 276:16478~16483; Shield 외, 2001, J Biol Chem 276:6591~6604; Shields 외, 2002, J Biol Chem 277:26733~26740; Simmons 외, 2002, J Immunol Methods 263:133~147). 그러나 이 탄수화물은 FcγR와 전혀 특이 적으로 접촉하지 않거나 거의 접촉하지 않는데(Radaev 외, 2001, J Biol Chem 276: 16469~16477), 이는 Fc/FcγR 결합을 매개하는 데 있어서 N297 탄수화물의 기능적 역할이 Fc의 형태(conformation)를 결정하는 데 맡는 구조적 역할을 통하여 이루어짐을 가리킬 수 있다. 이러한 점은 Fc 당결합형(glycoform) 4개에 대하여 수집한 결정 구조로 뒷받침되는데, 여기서 이 올리고당의 조성이 Cγ2의 형태에 영향을 주고 그에 따라 Fc/FcγR 계면에도 영향이 미침(Krapp 외, 2003, J Mol Biol 325:979~989)이 나타난다.

앞서 설명한 항체들의 특징-표적에 대한 특이성, 면역계의 작용체 메카니즘(effector mechanism)을 매개하는 능력, 혈청 내 긴 반감기-은 항체를 강력한 치료제로 만든다. 단일 클론 항체는 암, 염증, 심장혈관계 질환을 포함하는 다양한 증상을 처치하기 위하여 치료제로 쓰인다. 시판되는 항체 제품은 현재 열 가지가 있고, 개발 중인 것은 수백 가지에 이른다. 항체에 더하여, 항체 유사 단백질로서 연구와 치료법에서 점점 그 역할이 커지는 단백질이 Fc 융합 단백질이다(Chamow 외, 1996, Trends Biotechnol 14:52~60; Ashkenazi 외, 1997, Curr Opin Immunol 9:195~200). Fc 융합 단백질이란 하나 이상의 폴리펩티드가 Fc에 연결되어 작동하는 단백질이다. Fc 융합 단백질은 항체의 Fc 부위를 가지고 있기 때문에 이 부위의 유리한 작용체 기능과 약동학적 특성을, 리셉터, 리간드 또는 기타 단백질 또는 단백질 도메인의 표적 결합 부위와 함께 지니고 있다. 여기서 후자의 역할은 표적 인식을 매개하기 위함이고 따라서 기능적으로 항체 가변부위와 유사하다. Fc 융합 단백질과 항체는 구조적, 기능적으로 겹치기 때문에 본 발명에 서 항체에 대하여 논한 부분은 곧바로 Fc 융합 단백질에도 적용된다.

이렇게 광범위한 사용에도 불구하고 항체는 임상적으로 쓰이기에는 최적화되어 있지 않다. 항체의 두 가지 중요한 결점은 최적 수준에 미달하는 항암 효과와 생산에 필요한 조건이 과하다는 점이다. 본 발명은 이러한 결점에 대하여 다루고 있다.

항체가 종양 세포를 파괴할 수 있는 메카니즘은 여러 가지가 있는데, 이에는 성장에 필수 성장 경로 차단을 통한 항증식 효과, 세포자살(apoptosis)에 이르는 세포 내 신호 과정, 리셉터의 하향 조절(down regulation) 및/또는 리셉터 전환(turnover)의 향상, CDC, ADCC, ADCP와 적응성 면역 반응의 촉진이 포함된다(Cragg 외, 1999, Curr Opin Immunol 11:541~547; Glennie 외, 2000, Immunol Today 21:403~410). 항종양 작용의 효력은 이러한 메카니즘의 조합에 의한 것일 수 있고, 임상 요법에서 각 요소의 상대적 중요성은 암의 종류에 달려 있다. 이러한 항종양 치료제를 다양하게 구비하고 있음에도 불구하고, 항암제로서의 항체의 효능은, 특히 그 높은 단가를 감안할 때 만족스럽지 못하다. 환자의 종양 반응 데이터를 보면 단일 클론 항체는 한 가지 치료제의 정상적인 세포 독성 화학요법과 비교했을 때 다만 약간의 향상 효과가 있을 뿐임을 알 수 있다. 예를 들어 저수준(low grade) 비호지킨성 림프종이 재발한 환자 중 절반만이 항CD20 항체 리툭시맵에 반응하였다(McLaughlin 외, 1998, J Clin Oncol 16:2825~2833). 임상 환자 166명 중, 6%가 완전하게 반응하였고, 42%는 부분적으로 반응하였으며, 반응 지속 기간의 중앙값(median)은 12개월이었다. 전이성 유방암을 치료하는 항HER2/neu 항체 트라스투주맵(Herceptin®, Genentech의 등록 상표)은 효력이 약하다. 트라스투주맵을 사용하는 환자 222명에 대하여 조사한 전체적인 반응율은 15%에 불과했고, 완전한 반응은 8명, 부분적 반응은 26명이었으며 반응 지속기간과 생존 기간의 중앙값은 9에서 13개월이었다(Cobleigh 외, 1999, J Clin Oncol 17:2639~2648). 현재 항암요법에서는 사망률을 조금 떨어뜨리면 성공이라고 규정한다. 따라서 항체가 표적 암세포를 살상하는 능력을 키워야할 중대한 필요성이 있다.

항체의 항암 효능을 증진시키는 확실한 방법은 ADCC, ADCP, DCC 등의 세포독성 작용체 기능(effector function)을 매개하는 능력을 높이는 일이다. 항체의 항암 활성을 위한 FcγR 매개 작용체 기능의 중요성은 랫에서 입증된 바 있고(Clynes 외, 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:652~656; Clynes 외, 2000, Nat Med 6:443~446), Fc와 특정 FcγR 사이의 상호작용 친화성는 세포기반 검정 실험에서 상관 관계가 있는 것으로 나타난다(Shields 외, 2001, J Biol Chem 276:6591~6604; Presta 외, 2002, Biochem Soc Trans 30:487~490; Shields 외, 2002, J Biol Chem 277:26733~26740). 더욱이 인간 FcγRIIIa의 고친화성(V158) 혹은 저친화성(F158) 동종이형의 다형성 종류와 임상적 효능 사이에 상관 관계가 관측되었다(Cartron 외, 2002, Blood 99:754~758). 이들 데이터는 Fc 부위가 있어서 어떤 Fcγ결합하는 것이 최적화된 항체는 작용체 기능을 더 잘 매개할 수 있고, 그에 따라 환자의 암세포를 더 잘 살상할 수 있을 것이라는 점을 시사한다. 활성과 억제 리셉터 사이의 균형은 중요하게 고려할 점이며, 활성화 리셉터, 예를 들어 FcγRI, FcγRIIa/c, FcγRIIIa에 대하여 향상된 친화성을 가지되, 억제 리셉터 FcγRIIIb에 대하여는 줄어든 친화성을 가지는 Fc가 작용체 기능을 최적으로 일으킬 수 있다. 나아가 FcγR은 항원 전달 세포(antigen presenting cell)가 항원을 취하고 처리하는 일을 매개할 수 있으므로 Fc/FcγR 친화성이 향상되면 항체 치료제가 적응성 면역 반응을 유발하는 능력도 향상될 수 있다.

Fc에 대한 돌연변이 연구는 다양한 목표하에 이루어 졌으나, 일반적으로는 알라닌으로 치환하거나(alanine scanning으로 지칭) 서열 상동성에 기반한 치환법으로 연구하였다(Duncan 외, 1988, Nature 332: 563~564; Lund 외, 1991, J Immunol 147 : 2657~2662; Lund 외, 1992, Mol Immunol 29:53~59; Jefferiset 외, 1995, Immunol Lett 44:111~117; Lund 외, 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis 외, 1996, Immunol Lett 54: 101~104; Lund 외, 1996, J Immunol 157:4963~4969; Armour 외, 1999, Eur J Immunol 29:2613~2624; Shields 외, 2001, J Biol Chem 276:6591~6604; Jefferis 외, 2002, Immunol Lett 82:57~65) (미국 특허 5,624,821호, 5,885,573호, PCT출원 WO00/42072호, WO 9/58572호). 아미노산 치환 중 대부분은 FcγR과의 결합을 약화시키거나 없애버린다. 그러나 더 높은 FcγR 친화성을 가지는 FcγR를 만드는 시도에서 몇 가지 성공 사례가 있었다(예를 들어 미국 특허 5,624,821호와 PCT 출원 WO 00/42072호를 참조). 예를 들어 Winter와 그 동료들은 마우스 IgG2 항체의 235번 위치에 인간 아미노산을 치환해 넣어(글루탐산에서 류신으로 치환) 그 마우스 항체가 인간 Fcγ결합하는 능력을 100배 향상시켰다(Duncan 외, 1988, Nature 332:563~564)(미국 특허 5,624,821호). Shields 외에서는 알라닌 스캐닝(alanine scanning) 돌연변이법을 사용하여 Fc 잔기중 Fcγ결합에 중요한 것들에 대하여 지도를 작성하고, 이어서 몇몇 선택한 잔기에 대하여 非알라닌 치환을 수행하였다(Shields 외, 2001, J Biol Chem 276:6591~6604; Presta 외, 2002, Biochem Soc Trans 30:487~490) (PCT WO 00/42072). S298A, E333A와 K334A를 포함하여 이 명세서에서 공개하는 몇 가지 돌연변이체는 활성 리셉터 FcγRIIIa에 대해서는 결합력이 향상되었고, 억제 리셉터 FcγRIIb에 대해서는 완화된 결합력을 보여준다. 이 돌연변이체를 모아서 이중, 삼중 돌연변이체를 얻었는데, 이들은 결합력이 부가적으로(additively) 향상되었다. 본 명세서에서 공개하는 가장 우수한 돌연변이체는 S298A/E333A/K334A 삼중 돌연변이체로 F158 Fcγ대하여 약 1.7배 늘어난 결합력을, FcγRIIb에 대하여 5배 줄어든 결합력을, 그리고 2.1배 늘어난 ADCC 효능을 보여준다.

FcγR에 대한 Fc의 친화성는 공학 기술로 변형한 세포주에서 생산한 항체의 가공된 당결합형을 이용하여서도 향상시킨 바 있다(Umama 외, 1999, Nat Biotechnol 17:26733~26740; Shinkawa 외, 2003, J Biol Chem 278:3466~3473). 이러한 방식으로 FcγRIIIa에 결합하는 능력과 ADCC를 매개하는 능력이 크게 향상된 항체를 생성할 수 있었다. 비록 대규모 생산 조건에서 발현 세포주들의 성장 효율과 같은 실제적인 한계점이 있지만, Fc/FcγR의 결합력과 작용체 기능을 향상시키는 이러한 방법은 유망하다. 실제로 본 발명의 Fc 변이체와 다른 종류의 당결합형 단백질 제조 기술을 결합하면 최적의 작용체 기능을 이룩하는데 있어서 부가적이거나 상승적인 효과를 얻을 수도 있다.

비록 더 나은 작용체 기능에 대한 필요성이 있지만, 몇몇 항체 치료법에서는 작용 체 기능의 감축이나 제거가 바람직하다. 이는 치료용 항체의 메카니즘이 표적 항체를 지니는 세포를 차단하거나 길항(antagonism)하지만 살상하지는 않는 경우일 때 종종 그러하다. 이러한 경우에 표적 세포를 사멸시키는 것은 바람직하지 않으며 부작용으로 볼 수 있다. 예를 들어 항CD4 항체는 T세포 CD4 리셉터를 차단하는 능력 덕택에 효과적인 소염제가 되지만, 항CD4 항체가 FcγR 리셉터를 끌어들이므로 표적 세포에 대한 면역 공격을 지시하게 되어 T 세포가 고갈되는 결과를 낳는다(Reddy 외, 2000, J Immunol 164:1925~1933). 작용체 기능은 방사표지된 항체와 독소 단백질에 접합한 항체에 있어서도 문제가 될 수 있는데, 각각 전자는 방사성 접합물, 후자는 면역독소로 지칭하겠다. 이들 약물로 암세포를 살상할 수 있지만, Fc와 FcγR의 상호작용을 통하여 면역세포를 끌어들이게 되면 건강한 면역 세포를 위험한 약제(방사능이나 독소) 옆에 놓게 되므로 정상 림프 조직도 표적 암세포와 함께 살상되는 결과를 낳을 수 있다(Hutchinset 외, 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92:11980~11984; White 외, 2001, Annu Rev Med 52:125~142). 이 문제는 보체 또는 작용체를 끌어들이는 능력이 부진한 IgG 아이소면역형, 예를 들어 IgG2와 IgG4를 사용하면 잠재적으로 해결할 수 있다. 다른 해결책은 결합력이 감소되었거나 없어진 Fc 변이체를 개발하는 것이다(Alegre 외, 1994, Transplantation 57:1537~1543; Hutchins 외, 1995, Proc Natl Acad Sci USA· 92: 11980~11984; Armouret 외, 1999, Eur J Immunol 29: 2613~2624; Reddyet 외, 2000, J Immunol 164 :1925~1933; Xuet 외, 2000, Cell Immunol 200:16~26; Shields 외, 2001, J Biol Chem 276:6591~6604) (미국특허 6,194,551호, 5,885,573호 PCT출원99/58572 호). 작용체 기능을 없애거나 줄이는 데에 있어서 핵심적으로 고려할 사항은 항체의 다른 중요한 특성이 변질되지 않도록 하는 것이다. Fc 변이체에 단백질 공학적 가공을 함에 있어서는 FcγR 및/또는 C1q에 대한 결합력을 상실할 뿐 아니라 항체의 안정성, 용해도, 구조적 일체성과 FcRn, 단백질 A, 단백질 G 등의 다른 중요 Fc 리간드와 상호작용하는 능력을 유지하도록 하여야 한다.

본 발명은 항체의 중대 결점 중 또 다른 하나, 즉 생산 과정의 과도한 요구 조건(Garber, 2001, Nat Biotechnol 19:184~185; Dove, 2002, Nat Biotechnol 20:777~779)에 대해서도 다루고 있다. 항체는 포유세포에서 발현되어야만 하고, 현재 시판중인 항체와 대규모의 수요를 가지는 다른 생물학적 치료제를 제조하는 데 실질적으로 가용 설비 능력을 모두 쓰고 있다. 생명공학 제제 수백종이 개발 중이고 그 대부분이 항체인 상황에서, 더욱 효율적이고 저렴한 제조 방법에 대한 필요성은 절실하다. 항체 제조설비가 부족하여 생길 수 있는 파급 효과는 세 가지가 있다. 첫째 생산자들로 하여금 제품의 단가를 높이도록 하여 그 비용을 소비자에 전가하도록 할 것이다. 둘째, 승인을 얻은 항체 제품의 공업적 생산에 지장을 줌으로써 고수요 치료 제제를 환자들에게 공급하는 것을 제한할 것이다. 마지막으로 임상 실험은 현재로는 수익성이 없는 단백질을 대량으로 사용하여야 하므로, 부족한 공급량이 개발 도상인 항체를 시장에 진입시키는 데 방해가 될 것이다.

이러한 문제점을 줄이기 위한 시도로서 다른 제조 방법들도 사용되었다. 유전자 이전(transgenic) 식물과 동물을 잠재적인 저렴하고 대용량의 생산 시스템으로 만들기 위한 노력이 경주되고 있다(Chadd 외, 2001, Curr Opin Biotechnol 12:188~194). 하지만 그러한 발현 시스템은 인간의 당단백질과 상당히 다른 방식으로 당화를 일으킬 수 있다. 이렇게 되면 작용체 기능이 줄어들거나 심지어 없어질 수도 있는데, 이는 앞서 설명하였듯이 그 탄수화물 구조가 FcγR와 보체 결합에 중대한 영향력을 미칠 수 있기 때문이다. 잠재적으로 인간 유래가 아닌 당결합형 단백질에서 더 큰 문제로 작용할 수 있는 것은 항원성이다. 탄수화물은 면역계에서 항원성의 주요한 근원이 되며, 비인간형 당결합형 단백질의 존재는 치료 효과를 없애버리는 항체 반응을 일으킬 수 가능성이 클 뿐만 아니라, 더 심각한 경우 악성 면역 반응을 불러올 수 있다. 따라서 유전자 이식 식물과 동물에서 제조된 항체의 효력과 안전성은 아직 불확실한 채로 있다. 세균내 발현은 항체 제조 문제점에 대한 다른 매력적인 해결책이다. 세균내, 예를 들어 대장균내 발현은 비용에 비하여 효과가 크고 용량이 큰 단백질 제조방법이 된다. 항체와 같이 복잡한 단백질에 대해서는 세균내 발현이 넘어야 할 장애물이 여러 가지가 있는데, 이에는 이 복잡한 분자의 접힘(folding)과 조립(assembly), 적절한 이황화 결합 형성, 용해도, 안정성, 세균에서 발현된 단백질은 당화되지 않으므로 당화가 부재시의 기능성 등의 문제점이 포함된다. 항원과 결합하는 전장(全長) 비당화 항체를 대장균에서 성공적으로 발현하였고(Simmons 외, 2002, J Immunol Methods 263:133~147), 따라서 세균에서 발현된 항체의 접힘, 조립과 적절한 이황화결합의 형성은 진핵세포의 샤프론(chaperone) 장치가 없는 상황에서도 가능하다. 그러나 세균에서 발현된 항체의 치료제로서의 궁극적인 효용은 당화의 부재 때문에 여전히 지장을 받는데, 당화의 부재는 작용체 기능의 부족을 가져 오고, 안정성과 가용성을 낮출 수도 있다. 이 점은 장기간 동안 고농도로 제제로 조성하여야 하는 임상 응용 분야에서는 더욱 문제가 된다.

비당화 Fc로서 수용액상의 특성이 뛰어나고 작용체 기능을 잘 매개할 수 있는 것은 상기의 다른 항체 생산 방법의 성공 가능성을 크게 높일 수 있다. 비당화 Fc의 구조적, 기능적 결점을 극복함으로써 항체를 세균과 유전자 이식 식물 및 동물에서 항원성의 위험은 줄이고 암과 같이 세포독성이 바람직한 임상 응용 분야에서는 작용체 기능을 유지한 채 생산할 수 있다. 본 발명은 단백질 공학 방법을 이용하여 작용체 기능을 가지고 안정적이며 가용성인 Fc 변이체를 개발하는 것을 기술한다. 현재 그러한 Fc 변이체는 해당 기술 분야에서 존재하지 않는다.

정리하자면, 치료 특성이 향상된 항체에 대한 필요성이 존재한다. Fc 변이체를 최적화하거나 기능을 향상되도록 단백질 공학을 이용하는 것은 이러한 필요성을 충족하는 데 있어서 유망한 접근 방법이다. 하지만 단백질 공학으로 원하는 특성을 가지는 Fc 변이체를 만드는 데 큰 장애가 되는 점은 수많은 가능성 속에서 어떠한 아미노산 변형이 원하는 특성을 달성할 수 있는지 예측하기 난망하다는 것과 항체의 생산과 선별 방법이 비효율적이라는 점이다. 실로 선행기술이 완전하게 성공하지 못한 중요한 까닭은 알라닌 스캐닝이나 다양한 발현 세포주를 이용한 당결합형 단백질의 생산과 같이 정선되지 않은 방식을 여태까지 사용해 왔다는 점이다. 이와 같은 연구에서 실제로 Fc를 변형한 방법은 바람직한 특성을 가지는 변이체를 얻을 것이라는 기대하에 전적으로 또는 부분적으로 무작위적인 방법을 택하였다. 본 발명은 다양한 단백질 공학적 방법을 제공하는데, 그 중 다수는 좀 더 다듬어지 고 효율이 높은 기법에 바탕을 두고 있으며, 이 방법을 사용하여 원하는 특성에 맞춘 Fc 변이체의 개발에 있어서 그 장애물을 극복할 수 있을 것이다. 여기서 기술하는 공학적 방법에서는 Fc 변형을 인도할 설계 전략, 바람직한 Fc 변이체를 설계하기 위한 컴퓨터 계산 선별 방법, 유망한 변이체를 실험으로 결정하기 위한 라이브러리 생성 방법, 바람직한 특성을 가진 Fc 변이체를 결정하기 위한 다양한 실험적 생산방법과 선별 방법을 제공한다.

발명의 개요

본 발명은 치료 요법에 관련된 몇 가지 특성을 최적화한 Fc 변이체를 제공한다. Fc 변이체는 대개 변이체 단백질의 일부분인데, 상기 변이체 단백질은 바람직하게는 항체 또는 Fc 융합 단백질를 포함한다.

본 발명의 목적은 아미노산 변형을 통하여 최적화된 Fc 변이체를 생성하는 데 쓰일 수 있는 Fc의 새로운 위치를 제공하는 것이다. 상기 Fc 위치에는 230, 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 273, 275, 299, 302, 313, 323,325, 328과 332가 포함되는데, 여기서 Fc 부위에 대한 잔기의 위치 숫자는 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 본 발명은 최적화된 Fc 변이체를 생성하기 위한 상기 새로운 Fc 위치 모든 곳에 대한 모든 아미노산 변형 방식을 기술한다.

본 발명의 또다른 목적은 컴퓨터 계산 방식으로 선별한 Fc 변이체를 제공하는 것이다. 컴퓨터 계산 방식으로 선별한 Fc 변이체란 본 명세서에서 기술하는 컴퓨터 선별 계산에서 무작위 경우보다 원하는 특성을 갖추도록 최적화될 가능성이 훨씬 더 높다고 예측한 변이체를 말한다. 이리 하여 컴퓨터 조작을 통한 선별은 실험에 의한 선별의 전단계나 혹은 대체물이 될 수 있고, 따라서 상기 컴퓨터 계산 방식으로 선별한 Fc 변이체는 신규하다고 볼 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 명세서에서 기술하는 실험 방법 중 적어도 하나 이상을 사용하여 그 특성을 연구한 Fc 변이체를 제공하는 것이다. 일 예에서 상기 Fc 변이체는 이하의 군에서 선택되는 위치에 적어도 하나 이상의 아미노산 치환을 구비하고 있는데, 여기서 잔기 위치를 나타내는 숫자는 Kabat과 같이 EU 인덱스에 따르며 다음과 같다: 230, 233, 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 270, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 283, 296, 297, 298, 299, 302, 313, 318, 320, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335. 일 예에서 상기 Fc 변이체는 이하의 군에서 선택되는 위치에 적어도 하나 이상의 아미노산 치환을 구비하고 있는데, 여기서 잔기 위치를 나타내는 숫자는 Kabat과 같이 EU 인덱스에 따르며 다음과 같다: 221, 222, 224, 227, 228, 230, 231, 223, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 258, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 283, 285, 286, 288, 290, 291, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 302, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335 336, 428. 바람직한 한 pdb있는데, 여기서 잔기 위치를 나타내는 숫자는 Kabat과 같이 EU 인덱스에 따르며 다음과 같다: P230A, E233D, L234D, L234E, L234N, L234Q, L234T, L234H, L234Y, L234I, L234V, L234F, L235D, L235S, L235N, L235Q, L235T, L235H, L235Y, L235I, L235V, L235F, S239D, S239E, S239N, S239Q, S239F, S239T, S239H, S239Y, V240I, V240A, V240T, V240M, F241W, F241L, F241Y, F241E, F241R, F243W, F243L F243Y, F243R, F243Q, P244H, P245A, P247V, P247G, V262I, V262A, V262T, V262E, V263I, V263A, V263T, V263M, V264L, V264I, V264W, V264T, V264R, V264F, V264M, V264Y, V264E, D265G, D265N, D265Q, D265Y, D265F, D265V, D265I, D265L, D265H, D265T, V266I, V266A, V266T, V266M, S267Q, S267L, S267T, S267H, S267D, S267N, E269H, E269Y, E269F, E269R, E269T, E269L, E269N, D270Q, D270T, D270H, E272S, E272K, E272I, E272Y, V273I, K274T, K274E, K274R, K274L, K274Y, F275W, N276S, N276E, N276R, N276L, N276Y, Y278T, Y278E, Y278K, Y278W, E283R, Y296E, Y296Q, Y296D, Y296N, Y296S, Y296T, Y296L, Y296I, Y296H, N297S, N297D, N297E, A298H, T299I, T299L, T299A, T299S, T299V, T299H, T299F, T299E, V302I, W313F, E318R, K320T, K320D, K320I, K322T, K322H, V323I, S324T, S324D, S324R, S324I, S324V, S324L, S324Y, N325Q, N325L, N325I, N325D, N325E, N325A, N325T, N325V, N325H, K326L, K326I, K326T, A327N, A327L, A327D, A327T, L328M, L328D, L328E, L328N, L328Q, L328F, L328I, L328V, L328T, L328H, L328A, P329F, A330L, A330Y, A330V, A330I, A330F, A330R, A330H, A330S, A330W, A330M, P331V, P331H, I332D, I332E, I332N, I332Q, I332T, I332H, I332Y, I332A, E333T, E333H, E333I, E333Y, K334I, K334T, K334F, T335D, T335R, T335Y. 가장 바람직한 일예에서, 상기 Fc 변이체들은 아래 군에서 선택되는데, 여기서 잔기 위치를 나타내는 숫자는 Kabat과 같이 EU 인덱스에 따르며 다음과 같다: V264L, V264I, F241W, F241L, F243W, F243L, F241L/F243L/V262I/V264I, F241W/F243W, F241W/F243W/V262A/V264A, F241L/V262I, F243L/V264I, F243L/V262I/V264W, F241Y/F243Y/V262T/V264T, F241E/F243R/V262E/V264R, F241E/F243Q/V262T/V264E, F241R/F243Q/V262T/V264R, F241E/F243Y/V262T/V264R, L328M, L328E, L328F, I332E, L328M/I332E, P244H, P245A, P247V, W313F, P244H/P245A/P247V, P247G, V264I/I332E, F241E/F243R/V262E/V264R/I332E, F241E/F243Q/V262T/V264E/I332E, F241R/F243Q/V262T/V264R/I332E, F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E, S298A/I332E, S239E/I332E, S239Q/I332E, S239E, D265G, D265N, S239E/D265G, S239E/D265N, S239E/D265Q, Y296E, Y296Q, T299I, A327N, S267Q/A327S, S267L/A327S, A327L, P329F, A330L, A330Y, I332D, N297S, N297D, N297S/I3323, N297D/I332E, N297E/I332E, D265Y/N297D/I332E, D265Y/N297D/T299L/I332E, D265F/N297E/I332E, L328I/I332E, L328Q/I332E, I332N, I332Q, V264T, V264F, V240I, V263I, V266I, T299A, T299S, T299V, N325Q, N325L, N325I, S239D, S239N, S239F, S239D/I332D, S239D/I332E, S239D/I332N, S239D/I332Q, S239E/I332D, S239E/I332N, S239Q/I332Q, S239N/I332D, S239N/I332E, S239N/I332N, S239N/I332Q, S239Q/I332D, S239Q/I332N, S239Q/I332Q, Y296D, 296N, F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E, A330Y/I332E, V264I/A330Y/I332E, A330L/I332E, V264I/A330L/I332E, L234D, L234E, L234N, L234Q, L234T, L234H, L234Y, L234I, L234V, L234F, L235D, L235S, L235N, L235Q, L235T, L235H, L235Y, L235I, L235V, L235F, S239T, S239H, S239Y, V240A, V240T, V240M, V263A, V263T, V263M, V264M, V264Y, V266A, V266T, V266M, E269H, E269Y, E269F, E269R, Y296S, Y296T, Y296L, Y296I, A298H, T299H, A330V, A330I, A330F, A330R, A330H, N325D, N325E, N325A, N325T, N325V, N325H, L328D/I332E, L328I/I332E, L328N/I332E, L328Q/I332E, L328V/I332E, L328T/I332E, L328H/I332E, L328I/I332E, L328N/I332E, L328Q/I332E, L328V/I332E, L328T/I332E, L328H/I332E, L328I/I332E, L328A, I332T, I332H, I332Y, I332A, S239E/V264I/I332E, S239Q/V264I/I332E, S239E/V264I/A330Y/I332E, S239E/V264I/S298A/A330Y/I332E, S239D/N297D/I332E, S239E/N297D/I332E, S239D/D265V/N297D/I332E, S239D/D265I/N297D/I332E, S239D/D265L/N297D/I332E, S239D/D265F/N297D/I332E, S239D/D265Y/N297D/I332E, S239D/D265H/N297D/I332E, S239D/D265T/N297D/I332E, V264E/N297D/I332E, Y296D/N297D/I332E, Y296E/N297D/I332E, Y296N/N297D/I332E, Y296Q/N297D/I332E, Y296H/N297D/I332E, Y296T/N297D/I332E, N297D/T299V/I332E, N297D/T299I/I332E, N297D/T299L/I332E, N297D/T299F/I332E, N297D/T299H/I332E, N297D/T299E/I332E, N297D/A330Y/I332E, N297D/S298A/A330Y/I332E, S239D/A330Y/I332E, S239N/A3306/I332E, S239D/A330L/I332E, S239N/A330L/I332E, V264I/S298A/I332E, S239D/S298A/I332E, S239N/S298A/I332E, S239D/V264I/I332E, S239D/V264I/S298A/I332E, S239D/V264I/A330L/I332E, L328N, L328H, S239D/I332E/A330I, N297D/I332E/S239D/A330L, P230A, E233D, P230A/E233D, P230A/E233D/I332E, S267T, S267H, S267D, S267N, E269T, E269L, E269N, D270Q, D270T, D270H, E272S, E272K, E272I, E272Y, V273I, K274T, K274E, K274R, K274L, K274Y, F275W, N276S, N276E, N276R, N276L, N276Y, Y278T, Y278E, Y278K, Y278W, E283R, V302I, E318R, K320T, K320D, K320I, K322T, K322H, V323I, S324T, S324D, S324R, S324I, S324V, S324L, S324Y, K326L, K326I, K326T, A327D, A327T, A330S, A330W, A330M, P331V, P331H, E333T, E333H, E333I, E333Y, K334I, K334T, K334F, T335D, T335R, T335Y, L234I/L235D, V240I/V2668, S239D/A330Y/I332E/L234I, S239D/A330Y/I332E/L235D, S239D/A330Y/I332E/V240I, S239D/A330Y/I332E/V264T, S239D/A330Y/I332E/V266I, S239D/A330Y/I332E/K326E, S239D/A330Y/I332E/K326T, S239D/N297D/I332E/A330Y, S239D/N297D/I332E/A330Y/F241S/F243H/V262T/V264T, S239D/N297D/I332E/L235D, S239D/N297D/I332E/K326E.

본 발명의 또 다른 목적은 다음 아미노산 치환으로 이루어지는 군에서 선택되는 Fc 변이체를 제공하는 것인데, Fc 부위의 잔기 위치 숫자는 Kabat과 같이 EU 인덱스에 따른다: D221K, D221Y, K222E, K222Y, T223E, T223K, H224E, H224Y, T225E, T225, T225K, T225W, P227E, P227K, P227Y, P227G, P228E, P228K, P228Y, P228G, P230E, P230Y, P230G, A231E, A231K, A231Y, A231P, A231G, P232E, P232K, P232Y, P232G, E233N, E233Q, E233K, E233R, E233S, E233T, E233H, E233A, E233V, E233L, E2331, E233F, E233M, E233Y, E233W, E233G, L234K, L234R, L234S, L234A, L234M, L234W, L234P, L234G, L235E, L235K, L235R, L235A, L235M, L235W, L235P, L235G, G236D, G236E, G236N, G236Q, G236K, G236R, G236S, G236T, G236H, G236A, G236V, G236L, G2361, G236F, G236M, G236Y, G236W, G236P, G237D, G237E, G237N, G237Q, G237K, G237R, G237S, G237T, G237H, G237V, G237L, G237I, G237F, G237M, G237Y, G237W, G237P, P238D, P238E, P238N, P238Q, P238K, P238R, P238S, P238T, P238H, P238V, P238L, P238I, P238F, P238M, P238Y, P238W, P238G, S239Q, S239K, S239R, S239V, S239L, S239I, S239M, S239W, S239P, S239G, F241D, F241E, F241Y, F243E, K246D, K246E, K246H, K246Y, D249Q, D249H, D249Y, R255E, R255Y, E258S, E258H, E258Y, T260D, T260E, T260H, T260Y, V262E, V262F, V264D, V264E, V264N, V264Q, V264K, V264R, V264S, V264H, V264W, V264P, V264G, D265Q, D265K, D265R, D265S, D265T, D265H, D265V, D265L, D265I, D265F, D265M, D265Y, D265W, D265P, S267E, S267Q, S267K, S267R, S267V, S267L, S267I, S267F, S267M, S267Y, S267W, S267P, H268D, H268E, H268Q, H268K, H268R, H268T, H268V, H268L, H268I, H268F, H268M, H268W, H268P, H268G, E269K, E269S, E269V, E269I, E269M, E269W, E269P, E269G, D270R, D270S, D270L, D270I, D270F, D270M, D270Y, D270W, D270P, D270G, P271D, P271E, P271N, P271Q, P271K, P271R, P271S, P271T, P271H, P271A, P271V, P271L, P271I, P271F, P271M, P271Y, P271W, P271G, E272D, E272R, E272T, E272H, E272V, E272L, E272F, E272M, E272W, E272P, E272G, K274D, K274N, K274S, K274H, K274V, K274I, K274F, K274M, K274W, K274P, K274G, F275L, N276D, N276T, N276H, N276V, N276I, N276F, N276M, N276W, N276P, N276G, Y278D, Y278N, Y278Q, Y278R, Y278S, Y278H, Y278V, Y278L, Y278I, Y278M, Y278P, Y278G, D280K, D280L, D280W, D280P, D280G, G281D, G281K, G281Y, G281P, V282E, V282K, V282Y, V282P, V282G, E283K, E283H, E283L, E283Y, E283P, E283G, V284E, V284N, V284T, V284L, V284Y, H285D, H285E, H285Q, H285K, H285Y, H285W, N286E, N286Y, N286P, N286G, K288D, K288E, K288Y, K290D, K290N, K290H, K290L, K290W, P291D, P291E, P291Q, P291T, P291H, P291I, P291G, R292D, R292E, R292T, R292Y, E293N, E293R, E293S, E293T, E293H, E293V, E293L, E293I, E293F, E293M, E293Y, E293W, E293P, E293G, E294K, E294R, E294S, E294T, E294H, E294V, E294L, E294I, E294F, E294M, E294Y, E294W, E294P, E294G, Q295D, Q295E, Q295N, Q295R, Q295S, Q295T, Q295H, Q295V, Q295I, Q295F, Q295M, Q295Y, Q295W, Q295P, Q295G, Y296K, Y296R, Y296A, Y296V, Y296M, Y296G, N297Q, N297K, N297R, N297T, N297H, N297V, N297L, N297I, N297F, N297M, N297Y, N297W, N297P, N297G, S298D, S298E, S298Q, S298K, S298R, S298I, S298F, S298M, S298Y, S298W, T299D, T299E, T299N, T299Q, T299K, T299R, T299L, T299F, T299M, T299Y, T299W, T299P, T299G, Y300D, Y300E, Y300N, Y300Q, Y300K, Y300R, Y300S, Y300T, Y300H, Y300A, Y300V, Y300M, Y300W, Y300P, Y300G, R301D, R301E, R301H, R301Y, V303D, V303E, V303Y, S304D, S304N, S304T, S304H, S304L, V305E, V305T, V305Y, K317E, K317Q, E318Q, E318H, E318L, E318Y, K320N, K320S, K320H, K320V, K320L, K320F, K320Y, K320W, K320P, K320G, K322D, K322S, K322V, K322I, K322F, K322Y, K322W, K322P, K322G, S324H, S324F, S324M, S324W, S324P, S324G, N325K, N325R, N325S, N325F, N325M, N325Y, N325W, N325P, N325G, K326P, A327E, A327K, A327R, A327H, A327V, A3271, A327F, A327M, A327Y, A327W, A327P, L328D, L328Q, L328K, L328R, L328S, L328T, L328V, L3281, L328Y, L328W, L328P, L328G, P329D, P329E, P329N, P329Q, P329K, P329R, P329S, P329T, P329H, P329V, P329L, P3291, P329M, P329Y, P329W, P329G, A330E, A330N, A330T, A330P, A330G, P331D, P331Q, P331R, P331T, P331L, P331I, P331F, P331M, P331Y, P331W, I332K, I332R, I332S, I332V, I332L, I332F, I332M, I332W, I332P, I332G, E333L, E333F, E333M, E333P, K334P, T335N, T335S, T335H, T335V, T335L, T335I, T335F, T335M, T335W, T335P, T335G, I336E, I336K, I336Y, S337E, S337N, S337H.

본 발명의 또다른 목적은 적어도 한 개 이상의 FcγR에 더 큰 친화성로 결합 하는 Fc 변이체를 제공하는 것이다. 일 예에서 상기 Fc 변이체는 FcγR에 대하여 모체 Fc 폴리펩티드보다 1배 이상의 친화성을 가지고 있다. 다른 실시예에서 상기 Fc 변이체는 Fc 폴리펩티드 모체보다 FcγR에 대하여 5배 이상의 친화성을 가진다. 바람직한 예에서 상기 Fc 변이체는 FcγR에 대하여 Fc 폴리펩티드 모체보다 그 친화성이 5배와 300배 사이 정도로 더 크다. 일 예에서 상기 Fc 변이체는 아래 군에서 선택되는 잔기 위치에 아미노산 치환을 적어도 하나 가지고 있는데, 잔기 위치의 숫자는 Kabat과 같이 EU 인덱스에 따른다: 230, 233, 234, 235, 239, 240, 243, 264, 266, 272, 274, 275, 276, 278,302, 318,324, 325,326, 328, 330, 332, 335. 바람직한 일 예에서 상기 Fc 변이체는 다음의 군에서 선택되는 아미노산 치환을 적어도 하나 갖추고 있는데, 잔기 위치의 숫자는 Kabat과 같이 EU 인덱스에 따른다: P230A, E233D, L234E, L234Y, L234I, L235D, L235S, L235Y, L235I S239D, S239E, S239N, S239Q, S239T, V2401, V240M, F243L, V264I, V264T, V264Y, V2661, E272Y, K274T, K274E, K274R, K274L, K274Y, F275W, N276L, Y278T, V3021, E318R, S324D, S324I, S324V, N325T, K326I, K326T, L328M, L3281, L328Q, L328D, L328V, L328T, A330Y, A330L, A330I, I332D, I332E, I332N, I332Q, T335D, T335R, T335Y. 대부분의 경우에 바람직한 일 예에서 상기 Fc 변이체는 아래 아미노산 치환체로 이루어지는 군에서 선택되는데, 잔기 위치의 숫자는 Kabat과 같이 EU 인덱스에 따른다: V264I, F243L/V264I, L328M, I332E, L328M/I332E, V264I/I332E, S298A/I332E, S239E/I332E, S239Q/I332E, S239E, A330Y, I332D, L328I/I332E, L328Q/I332E, V264T, V240I, V266I, S239D, S239D/I332D, S239D/I332E, S239D/I332N, S239D/I332Q, S239E/I332D, S239E/I332N, S239E/I332Q, S239N/I332D, S239N/I332E, S239Q/I332D, A330Y/I332E, V264I/A330Y/I332E, A330L/I332E, V264I/A330L/I332E, L234E, L234Y, L234I, L235D, L235S, L235Y, L235I, S239T, V240M, V264Y, A330I, N325T, L328D/I332E, L328V/I332E, L328T/I332E, L328I/I332E, S239E/V264I/I332E, S239Q/V264I/I332E, S239E/V264I/A330Y/I332E, S239D/A330Y/I332E, S239N/A330Y/I332E, S239D/A330L/I332E, S239N/A330L/I332E, V264I/S298A/I332E, S239D/S298A/I332E, S239N/S298A/I332E, S239D/V264I/I332E, S239D/V2648/S298A/I332E, S239D/V264I/A330L/I332E, S239D/I332E/A330I, P230A, P230A/E233D/I332E, E272Y, K274T, K247E, K274R, K274L, K274Y, F275W, N276L, Y278T, V302I, E318R, S324D, S324I, S324V, K326I, K326T, T335D, T335R, T335Y, V240I/V266I, S239D/A330Y/I332E/L234I, S239D/A330Y/I332E/L235D, S239D/A330Y/I332E/V240I, S239D/A330Y/I332E/V264T, S239D/A330Y/I332E/K326E, S239D/A330Y/I332E/K326T.

본 발명의 다른 목적은 FcγRIIIa:FcγRIIb 비율이 1:1 이상인 Fc 변이체를 제공하는 것이다. 일 예에서 상기 Fc 변이체는 FcγRIIIa:FcγRIIb 비율이 11:1 이상이다. 바람직한 예에서 상기 Fc 변이체는 FcγRIIIa:FcγRIIb 비율이 11:1과 86:1 사이에 있다. 일 예에서 상기 Fc 변이체는 234, 235, 239, 240, 264, 296, 300과 I332로 이루어지는 잔기 위치에 적어도 하나의 아미노산 치환을 가지고 있는데, 여기서 Fc 부위 잔기 위치의 숫자는 Kabat과 같이 EU 인덱스에 따른다. 바람직한 일 예에서 상기 Fc 변이체는 L234Y, L234I, L235I, S239D, S239E, S239N, S239Q, V240A, V240M, V264I, V264Y, V296Q, A330L, A330Y, A330I, I332D, I332E로 이루어지는 군에서 선택한 아미노산 치환을 적어도 하나 가지는데, 여기서 잔기 위치의 숫자는 Kabat과 같이 EU 인덱스에 따른다. 가장 바람직한 일 예에서 상기 Fc 변이체는 다음 치환체군에서 선택되는데, 여기서 잔기 위치의 숫자는 Kabat과 같이 EU 인덱스에 따른다: I332E, V264I/I332E, S239E/I332E, S239Q/I332E, Y296Q, A330L, A330Y, I332D, S239D, S239D/I332E, A330Y/I332E, V264I/A330Y/I332E, A330L/I332E, V264I/A330L/I332E, L234Y, L234I, L235I, V240A, V240M, V264Y, A330I, S239D/A330L/I332E, S239D/S298A/I332E, S239N/S298A/I332E, S239D/V264I/I332E, S239D/V264I/S298A/I332E, S239D/V264I/A330L/I332E.

본 발명의 또다른 목적은 작용체의 존재하에 작용체 기능을 더 잘 매개하는 Fc 변이체를 제공하는 것이다. 일 예에서 상기 Fc 변이체는 Fc 폴리펩티드 모체가 매개하는 것보다 더욱 큰 ADCC 반응을 매개한다. 바람직한 일 예에서 상기 Fc 변이체는 Fc 폴리펩티드가 매개하는 것보다 5배 이상 강한 ADCC 반응을 매개한다. 가장 바람직한 일 예에서 상기 Fc 변이체가 매개하는 ADCC 반응은 Fc 폴리펩티드 모체가 매개하는 것보다 5배에서 1000배 사이 정도로 더 크다. 일 예에서 상기 Fc 변이체는 230, 233, 234, 235, 239, 240, 243, 264, 266, 272, 274, 275, 276, 278, 302, 318, 324, 325, 326, 328, 330, 332, 335의 잔기 위치로 이루어지는 군에서 선택한 위치에 아미노산 치환을 적어도 하나 가지는데, 여기서 Fc 부위의 위치의 번호 지정은 Kabat와 같이 EU 인덱스를 따른다. 바람직한 일 예에서 상기 Fc 변이체는 다음 군에서 선택한 아미노산 치환을 적어도 하나 가지는데, 여기서 위치 의 번호 지정은 Kabat와 같이 EU 인덱스를 따른다: P230A, E233D, L234E, L234Y, L234I, L235D, L235S, L235Y, L235I, S239D, S239E, S239N, S293Q, S239T, V240I, V240M, F243L, V264I, V264T, V264Y, V2661, E272Y, K274T, K274E, K274R, K274L, K274Y, F275W, N276L, Y278T, V302I, E318R, S324D, S324I, S324V, N325T, K3261, K326T, L328M, L328I, L328Q, L328D, L328V, L328T, A330Y, A330L, A330I, I332D, I332E, I332N, I332Q, T335D, T335R, T335Y. 가장 바람직한 일 예에서 상기 Fc 변이체는 다음 군으로부터 선택되는데, 여기서 위치의 번호 지정은 Kabat와 같이 EU 인덱스를 따른다: V264I, F243L/V264I, L328M, I332E, L328M/I332E, V264I/I332E, S298A/I332E, S239E/I332E, S239Q/I332E, S239E, A330Y, I332D, L328I/I332E, L328Q/I332E, V264T, V240I, V266I, S239D, S239D/I332D, S239D/I332E, S239D/I332N, S239D/I332Q, S239E/I332D, S239E/I332N, S239E/I332Q, S239N/I332D, S239N/I332E, S239Q/I332D, A330Y/I332E, V264I/A330Y/I332E, A330L/I332E, V264I/A330L/I332E, L234E, L234Y, L234I, L235D, L235S, L235Y, L235I, S239T, V240M, V264Y, A330I, N325T, L328D/I332E, L328V/I332E, L328T/I332E, L328I/I332E, S239E/V264I/I332E, S239Q/V264I/I332E, S239E/V264I/A330Y/I332E, S239D/A330Y/I332E, S239N/A330Y/I332E, S239D/A330L/I332E, S239N/A330L/I332E, V264I/S298A/I332E, S239D/S298A/I332E, S239N/S298A/I332E, S239D/V264I/I332E, S239D/V264I/S298A/I332E, S239D/V264I/A33OL/I332E, S239D/I332E/A330I, P230A, P230A/E233D/I332E, E272Y, K274T, K274E, K274R, K274L, K274Y, F275W, N276L, Y278T, V3021, E318R, S324D, S324I, S324V, K326I, K326T, T335D, T335R, T335Y, V240I/V266I, S239D/A330Y/I332E/L234I, S239D/A330Y/I332E/L235D, S239D/A330Y/I332E/V240I, S239D/A330Y/I332E/V264T, S239D/A330Y/I332E/K326E 및 S239D/A330Y/I332E/K326T.

본 발명의 또다른 목적은 하나 이상의 FcγR에 보다 약한 친화성으로 결합하는 Fc 변이체를 제공하는 것이다. 일예에서, 상기 Fc 변이체는 아래로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 위치의 번호 지정은 Kabat와 같이 EU 인덱스를 따른다: 230, 233, 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 270, 273, 276, 278, 283, 296, 297, 298, 299, 313, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 330, 332 및 333. 바람직한 예에서, 상기 Fc 변이체는 아래로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 번호 지정은 Kabat와 같이 EU 인덱스를 따른다: P230A, E233D, L234D, L234N, L234Q, L234T, L234H, L234V, L234F, L234I, L235N, L235Q, L235T, L235H, L235V, L235F, L235D, S239E, S239N, S239Q, S239F, S239H, S239Y, V240A, V240T, F241W, F241L, F241Y, F241E, F241R, F243W, F243L F243Y, F243R, F243Q, P244H, P245A, P247V, P247G, V262I, V262A, V262T, V262E, V263I, V263A, V263T, V263M, V264L, V264I, V264W, V264T, V264R, V264F, V264M, V264E, D265G, D265N, D265Q, D265Y, D265F, D265V, D265I, D265L, D265H, D265T, V266A, V266T, V266M, S267Q, S267L, E269H, E269Y, E269F, E269R, E269T, E269L, E269N, D270Q, D270T, D270H, V273I, N276S, N276E, N276R, N276Y, Y278E, Y278W, E283R, Y296E, Y296Q, Y296D, Y296N, Y296S, Y296T, Y296L, Y296I, Y296H, N297S, N297D, N297E, A298H, T299I, T299L, T299A, T299S, T299V, T299H, T299F, T299E, W313F, V323I, S324R, S324L, S324Y, N325Q, N325L, N325I, N325D, N325E, N325A, N325V, N325H, A327N, A327L, L328M, 328E, L328N, L328Q, A327D, A327T, L328F, L328H, L328A, L328N, L328H, P329F, A330L, A330V, A330F, A330R, A330H, I332N, I332Q, I332T, I332H, I332Y, I332A, E333T 및 E333H. 가장 바람직한 예에서, 상기 Fc 변이체는 아래로 이루어진 군으로부터 선택되며, 위치의 번호 지정은 Kabat와 같이 EU 인덱스를 따른다: V264L, F241W, F241L, F243W, F243L, F241L/F243L/V262I/V264I, F241W/F243W, F241W/F243W/V262A/V264A, F241L/V262I, F243L/V262I/V264W, F241Y/F243Y/V262T/V264T, F241E/F243R/V262E/V264R, F241E/F243Q/V262T/V264E, F241R/F243Q/V262T/V264R, F241E/F243Y/V262T/V264R, L328M, L328E, L328F, P244H, P245A, P247V, W313F, P244H/P245A/P247V, P247G, F241 E/F243R/V262E/V264R/I332E, F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E, D265G, D265N, S239E/D265G, S239E/D265N, S239E/D265Q, Y296E, Y296Q, T2991, A327N, S267Q/A327S, S267L/A327S, A327L, P329F, A330L, N297S, N297D, N297S/I332E, I332N, I332Q, V264F, V2631, T299A, T299S, T299V, N325Q, N325L, N3251, S239N, S239F, S239N/I332N, S239N/I332Q, S239Q/I332N, S239Q/I332Q, Y296D, Y296N, L234D, L234N, L234Q, L234T, L234H, L234V, L234F, L235N, L235Q, L235T, L235H, L235V, L235F, S239H, S239Y, V240A, V263T, V263M, V264M, V266A, V266T, V266M, E269H, E269Y, E269F, E269R, Y296S, Y296T, Y296L, Y2961, A298H, T299H, A330V, A330F, A330R, A330H, N325D, N325E, N325A, N325V, N325H, L328E/I332E, L328N/I332E, L328Q/I332E, L328H/I332E, L328A, I332T, I332H, I332Y, I332A, L328N, L328H, E233D, P230A/E233D, E269T, E269L, E269N, D270Q, D270T, D270H, V2731, N276S, N276E, N276R, N276Y, Y278E, Y278W, E283R, V3231, S324R, S324L, S324Y, A327D, A327T, E333T, E333H, L234I/L235D.

본 발명의 또다른 목적은 작용체의 존재하에 ADCC를 덜 효율적으로 매개하는 Fc 변이체를 제공하는 것이다. 일 예에서 상기 Fc 변이체는 다음 잔기 위치의 군에서 선택되는 곳에 아미노산 치환을 적어도 하나 가지는데, 여기서 Fc 부위 위치의 번호 지정은 Kabat와 같이 EU 인덱스를 따른다: 230, 233, 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 270, 273, 276, 278, 283, 296, 297, 298, 299, 313,323, 324,325, 327,328, 329,330, 332, 333. 바람직한 일 예에서 상기 Fc 변이체는 다음 치환체군에서 선택되는 아미노산 치환을 적어도 하나 가지는데, 여기서 위치의 번호 지정은 Kabat와 같이 EU 인덱스를 따른다: P230A, E233D, L234D, L234N, L234Q, L234T, L234H, L234V, L234F, L234I, L235N, L235Q, L235T, L235H, L235V, L235F, L235D, S239E, S239N, S239Q, S239F, S239H, S239Y, V240A, V240T, F241W, F241L, F241Y, F241E, F241R, F243W, F243L F243Y, F243R, F243Q, P244H, P245A, P247V, P247G, V262I, V262A, V262T, V262E, V263I, V263A, V263T, V263M, V264L, V264I, V264W, V264T, V264R, V264F, V264M, V264E, D265G, D265N, D265Q, D265Y, D265F, D265V, D265I, D265L, D265H, D265T, V266A, V266T, V266M, S267Q, S267L, E269H, E269Y, E269F, E269R, E269T, E269L, E269N, D270Q, D270T, D270H, V273I, N276S, N276E, N276R, N276Y, Y278E, Y278W, E283R, Y296E, Y296Q, Y296D, Y296N, Y296S, Y296T, Y296L, Y296I, Y296H, N297S, N297D, N297E, A298H, T299I, T299L, T299A, T299S, T299V, T299H, T299F, T299E, W313F, V323I, S324R, S324L, S324Y, N325Q, N325L, N325I, N325D, N325E, N325A, N325V, N325H, A327N, A327L, L328M, 328E, L328N, L328Q, A327D, A327T, L328F, L328H, L328A, L328N, L328H, P329F, A330L, A330V, A330F, A330R, A330H, I332N, I332Q, I332T, I332H, I332Y, I332A, E333T, E333H. 가장 바람직한 일 예에서 상기 Fc 변이체는 다음 군에서 선택되는데, 여기서 Fc 부위의 위치의 번호 지정은 Kabat와 같이 EU 인덱스를 따른다: V264L, F241W, F241L, F243W, F243L, F241L/F243L/V262I/V264I, F241W/F243W, F241W/F243W/V262A/V264A, F241L/V262I, F243L/V262I/V264W, F241Y/F243Y/V262T/V264T, F241E/F243R/V262E/V264R, F241E/F243Q/V262T/V264E, F241R/F243Q/V262T/V264R, F241E/F243Y/V262T/V264R, L328M, L328E, L328F, P244H, P245A, P247V, W313F, P244H/P245A/P247V, P247G, F241E/F243R/V262E/V264R/I332E, F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E, D265G, D265N, S239E/D265G, S239E/D265N, S239E/D265Q, Y296E, Y296Q, T299I, A327N, S267Q/A327S, S267L/A327S, A327L, P329F, A330L, N297S, N297D, N297S/I332E, I332N, I332Q, V264F, V263I, T299A, T299S, T299V, N325Q, N325L, N325I, S239N, S239F, S239N/I332N, S239N/I332Q, S239Q/I332N, S239Q/I332Q, Y296D, Y296N, L234D, L234N, L234Q, L234T, L234H, L234V, L234F, L235N, L235Q, L235T, L235H, L235V, L235F, S239H, S239Y, V240A, V263T, V263M, V264M, V266A, V266T, V266M, E269H, E269Y, E269F, E269R, Y296S, Y296T, Y296L, Y296I, A298H, T299H, A330V, A330F, A330R, A330H, N325D, N325E, N325A, N325V, N325H, L328E/I332E, L328N/I332E, L328Q/I332E, L328H/I332E, L328A, I332T, I332H, I332Y, I332A, L328N, L328H, E233D, P230A/E233D, E269T, E269L, E269N, D270Q, D270T, D270H, V273I, N276S, N276E, N276R, N276Y, Y278E, Y278W, E283R, V323I, S324R, S324L, S324Y, A327D, A327T, E333T, E333H, L234I/L235D.

본 발명의 또다른 목적은 당화되지 않은 Fc 폴리펩티드 모체와 비교하였을 때, 그 기능 및/또는 용액 성질이 향상된 Fc 변이체를 제공하는 것이다. 향상된 기능이란 여기서 Fc 리간드에 대한 결합력이 강화되는 것을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 향상된 용액 성질이란 여기서 안정성과 가용성을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 일 예에서 상기 당화되지 않은 Fc 변이체는 당화된 Fc 폴리펩티드 모체와 비교하였을 때, FcγR에 대해서 비슷하거나 향상된 결합력을 가진다. 한 다른 실시예에서 상기 Fc 변이체는 FcγR에 대해서 당화된 Fc 폴리펩티드 모체가 가지는 친화성의 0.4배 한도 내에서 결합한다. 일 예에서 상기 Fc 변이체는 239, 241, 243, 262, 264, 265, 296, 297, 330, 332의 잔기 위치로 이루어지는 군에서 선택된 위치에 아미노산 치환을 적어도 하나 가지는데, 여기서 Fc 부위 위치의 번호 지정은 Kabat와 같이 EU 인덱스를 따른다. 바람직한 일 예에서 상기 Fc 변이체는 S239D, S239E, F241Y, F243Y, V262T, V264T, V264E, D265Y, D265H, D265V, D265I, Y296N, N297D, A330Y와 I332E로 이루어지는 군에서 선택한 아미노산 치환을 적어도 하나 가지는데, 여기서 Fc 부위의 위치의 번호 지정은 Kabat와 같이 EU 인덱스를 따른다. 가장 바람직한 예에서, 상기 Fc 변이체는 다음 군에서 선택 되는데, 여기서 위치의 번호 지정은 Kabat와 같이 EU 인덱스를 따른다: N297D/I332E, F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E, S239D/N297D/I332E, S239E/N297D/I332E, S239D/D265Y/N297D/I332E, S239D/D265H/N297D/I332E, V264E/N297D/I332E, Y296N/N297D/I332E, N297D/A330Y/I332E, S239D/D265V/N297D/I332E, S239D/D265I/N297D/I332E, N297D/S298A/A330Y/I332E.

본 발명은 또한 Fc 변이체를 최적화하는 단백질 공학적 가공 방법을 제공한다. Fc 최적화를 인도하는데 사용할 수 있는 설계 전략을 제공하는 것은 본 발명의 목적이다. 본 발명의 또다른 목적은 Fc 변이체를 설계하는데 사용할 수 있는 컴퓨터 조작을 통한 선별 방법을 제공하는 것이다. 나아가 본 발명의 다른 목적은 검사용 실험에 사용할 수 있는 라이브러리를 생성하는 방법을 마련하는 것이다. 본 발명의 추가적인 목적은 최적화된 Fc 변이체를 얻기 위한 생산과 선별의 실험적인 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 본 명세서에서 기술하는 Fc 변이체를 코딩하는 분리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 상기 핵산을 갖춘 벡터를 제공하며, 이 경우 선택적으로는 제어 서열에 연결되어 작동하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 이 벡터를 포함하는 숙주세포와 이 Fc 변이체를 제조하는 방법을 제공하고, 선택적으로는 이 변이체를 회수하는 방법을 제공한다.

본 발명은 본 명세서에서 기술하는 Fc 변이체를 갖춘 신규한 항체와 Fc 융합 단백질을 제공한다. 상기 신규한 항체와 Fc 융합 단백질은 치료제로서 사용될 수도 있다.

본 발명은 본 명세서에서 기술하는 Fc 변이체를 포함한 항체와 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공하며, 생리적 또는 약학적으로 적절한 담체나 희석제를 제공한다.

본 발명은 본 명세서에서 기술하는 Fc 변이체를 포함한 항체와 Fc 융합 단백질의 치료와 진단 응용 분야에 대하여 고찰한다.

발명의 상세한 설명

발명을 좀 더 상세하게 기술하게 위하여 몇 가지 용어를 이항 정의한다. 이같은 정의에는 그와 문법상 동등한 내용도 포함되는 것으로 한다.

“ADCC” 또는 “항체 의존적 세포매개 세포독성”은 본 명세서에서 FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적세포에 결합한 항체를 인식하고, 이후 표적 세포에 세포 용해를 초래하는 세포 매개 반응을 뜻한다.

“ADCP” 또는 “항체 의존적 세포 매개 식세포작용”은 본 명세서에서 FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적세포에 결합한 항체를 인식하고 그에 따라 그 표적 세포에 대한 식세포작용을 야기하는 세포 매개 반응을 뜻한다.

"아미노산 변형”은 본 명세서에서 폴리펩티드 서열상의 아미노산 치환, 삽입, 삭제를 뜻한다. 본 명세서에서 바람직한 아미노산 변형은 치환이다. “아미노산 치환” 또는 “치환”이라고 함은 본 명세서에서 모체 폴리펩티드 서열의 어떤 위치에 있는 아미노산을 다른 아미노산으로 바꾸는 것이다. 예를 들어 I332E 치환은 변형 폴리펩티드를 가리키는데, 이 경우는 Fc의 한 변이체이며, 332 위치의 아이소류신이 글루탐산으로 바뀐 것이다.

“항체”는 본 명세서에서 실질적으로 알려진 면역 글로불린 유전자 전체 또는 일부에 의하여 코딩되는 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 의미한다. 알려진 면역 글로불린 유전자에는, 예를 들어 인간의 경우, κ, λ와 중쇄 유전자좌(locus)가 포함되는데, 이들이 모여 수많은 가변부위 유전자를 구성하며, 또한 불변부위 유전자 μ, δ, γ, σ, α가 포함되는데, 이들은 각각 IgM, IgD, IgG, IgE와 IgA 아이소형을 코딩한다. 본 명세서에서 항체란 전장 길이의 항체와 항체 조각을 모두 포함하는 것을 의미하며, 어떤 생명체에서 비롯한 자연 항체, 가공된 항체 또는 실험이나 치료 용도 혹은 아래에서 정의할 다른 용도로 재조합 생성한 항체를 가리킬 수 있다. “항체”라는 용어는 선행기술에 알려진 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv 등의 항체 조각이나 다른 항원에 결합하는 항체의 부분 서열을 포함하는데, 이 부분 서열은 완전한 항체를 변형하거나 재조합 DNA 기술을 이용하여 새로 합성하여 만들어진다. 특히 바람직한 것은 여기서 기술하는 Fc 변이체를 갖춘 전장 항체이다. “항체”라는 용어에는 단일 클론과 다클론 항체가 포함된다. 항체는 길항제(antagonist)로도 작동제(agonist)로도 작용할 수 있으며, 억제성, 중화성이거나 촉진성일 수도 있다.

본 발명의 항체는 인간 항체가 아니거나, 키메라이거나 인간화된 것이거나 또는 완전한 인간 항체일 수도 있다. 인간화 항체와 키메라 항체의 개념에 대해서는 Clark 외 2000년 논문(Clark 외, 2000, Immunol Today 21:397~402)와 그 인용문헌을 참조한다. 키메라 항체는 비인간 항체의 가변부위를 갖추고 있는데, 일례로 마우스나 랫에서 유래한 V_H나 V_L도메인이 인간 항체의 불변부위에 연결되어 작동하는 항체를 들 수 있다(미국 특허 4,816,567호가 그 예이다). 바람직한 예에서 본 발명의 항체들은 인간화된다. “인간화” 항체란 본 명세서에서 인간의 골격(FR) 부위와 인간 유래가 아닌(대개 마우스나 랫) 하나 혹은 여러 개의 상보성 결정 부위(CDR)를 갖추고 있는 것을 뜻한다. CDR이 유래한 비인간 항체는 “공여체(donor)"로, 골격 부위가 유래한 인간 항체는 “수용체(acceptor)”로 지칭한다. 인간화는 주로 공여체 CDR을 수용체(인간) V_L과 V_H 골격 부위(Winter 미국 5, 225,539호)에 이식하는 것에 달려 있다. 이러한 전략은 “CDR 이식”이라고 한다. 선택된 수용체 골격부위에 대하여 “역돌연변이”를 일으켜 그 해당 공여체 아미노산 잔기로 바꿔주지 않으면 처음 이식시 잃어버린 친화성을 회복할 수 없는 경우가 잦다(미국 출원 5,530,101호, 5,585,089호, 5,693,761호, 5,693,762호, 6,180,370호, 5,859, 205호, 5,821,337호, 6,054,297호, 6,407,213호). 최적화된 인간화 항체는 면역 글로불린 불변부위를 적어도 한 부분 이상 갖추고 있는데, 전형적으로 인간 면역 글로불린 불변부위를 갖추며, 따라서 전형적으로 인간 Fc 부위를 갖추게 된다. 비인간 항체를 인간화하는 방법은 선행기술로 잘 알려져 있으며, Winter와 공동 연구자들의 방법(Jones 외, 1986, Nature 321:522~525; Riechmann 외, 1988, Nature 332:323~329; Verhoeyen 외, 1988, Science 239:1534~1536)을 사용하면 근본적으로 항체의 인간화가 가능하다. 인간화된 쥐 단일클론 항체에 대한 더 많은 사례는 선행기술로 알려져 있는데, 그 예로 인간 단백질 C에 결합하는 항 체(O'Connor 외, 1988, Protein Eng 11:321~328), 인터류킨 2 리셉터(Queen 외, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 86:10029~10033)와 인간 표피성장인자 리셉터 2(Carter 외, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285~4289)를 들 수 있다. 다른 실시예에서 본 발명의 항체는 완전한 인간 항체여도 무방한데, 이는 항체의 서열이 완전하게 또는 실질적으로 인간 서열인 것을 말한다. 완전한 인간 항체를 생성하는 많은 방법이 선행기술로 알려져 있는데, 이에는 유전자이전 마우스(Bruggemann 외, 1997, Curr Opin Biotechnol 8:455~458) 또는 인간 항체 라이브러리와 그에 결부된 선택 방법(Griffiths 외, 1988, Curr Opin Biotechnol 9:102~108)이 포함된다.

“항체”의 정의에 분명하게 포함되는 것이 비당화 항체이다. “비당화 항체”란 본 명세서에서 그 Fc 부위의 297 위치에 부착된 탄수화물이 없는 항체를 뜻하는데, 위치의 번호는 Kabat와 같이 EU 인덱스에 따른다. 이 비당화 항체는 탈당화 항체, 즉 Fc 탄수화물이 제거, 예를 들어 화학저리나 효소학절으로 제거된 항체일 수 있다. 한편 이 비당화 항체는 Fc 탄수화물 없이 발현된 당화가 일어나지 않은 항체, 예를 들어 당화 방식을 코딩하는 잔기 하나 혹은 여러 개가 돌연변이되거나, 단백질에 탄수화물을 접합시키지 않는 생물, 예를 들어 세균에서 발현된 항체일 수 있다.

“항체”의 정의에 분명하게 포함되는 것이 Fc 변이체 부분을 가지고 있는 전장 항체이다. “전장 항체”란 본 명세서에서 가변부위와 불변부위를 포함하는 항체의 그 자연스런 생물학적 형태를 이루는 구조를 의미한다. 예를 들어 인간과 쥐를 포함하는 대부분의 포유동물에서 IgG 종류의 전장 항체는 4량체로서 두 개의 면역 글로불린 쇄이 이루는 쌍이 동일하게 두 개 있는 분자인데, 여기서 각 쌍에는 하나의 경쇄와 하나의 중쇄이 존재하고, 각 경쇄은 면역 글로불린 VL과 CL 도메인을, 각 중쇄은 면역 글로불린 V_H, Cγ1, Cγ2, Cγ3 도메인을 갖추고 있다. 몇몇 포유동물, 예를 들어 낙타와 라마(llama)에서는 IgG 항체가 오로지 두 중쇄만으로 이루어지는데, 각 중쇄은 Fc 부위에 연결된 가변부위를 갖추고 있다. 본 명세서에서 “IgG”라고 함은 IgG 항체 종류에 속하는 폴리펩티드로서 알려진 면역 글로불린 감마 유전자에 의하여 실질적으로 코딩되는 것을 말한다. 이 항체 종류는 인간에서 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4를 포함하며, 마우스에서는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3를 포함한다.

“아미노산” 및 "아미노산 성동성"은 본 명세서에서 자연적으로 존재하는 20개의 아미노산과 어느 특정, 정의된 위치에 존재할 수 있는 모든 비자연적 유사 물질을 의미한다. “단백질”이란 본 명세서에서 적어도 두 개의 아미노산이 공유결합으로 연결된 것을 말하며, 여기에는 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드와 펩티드가 포함된다. 이 단백질들은 자연적으로 존재하는 아미노산과 펩티드 결합으로 이루어질 수도 있고, 합성한 펩티드유사 구조(peptidomimetic structure), 즉 펩토이드(peptoid; Simon 외, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89(20):9367)등의 유사체로 이루어질 수도 있는데, 특히 LC 펩티드를 환자에게 투여하는 경우 그러하다. 따라서 본 명세서에서 사용하는 “아미노산” 또는 “펩티드 잔기”란 자연적으로 존재하는 아미노산과 합성된 것 모두를 말한다. 예를 들어 호모페닐알라닌, 시트룰린, 노르류신은 본 발명에 관해서는 아미노산으로 간주한다. “아미노산”은 또한 프롤린과 수산화프롤린과 같은 이미노산 잔기도 포함한다. 아미노산 측쇄는 (R) 또는 (S) 배열 중의 어느 하나일 수 있다. 바람직한 예에서 아미노산은 (S) 또는 L-배열을 이룬다. 만약 비자연적으로 존재하는 측쇄를 사용한 경우, 비아미노산 치환체를 사용할 수도 있는데, 이는 예를 들어 생체 내 파괴를 막거나 지연시키기 위함이다.

"컴퓨터 조작을 통한 선별 방법(computational screening method)”은 본 명세서에서 단백질에 한 개 또는 여러 개의 돌연변이를 설계하는 모든 방법을 의미하는데, 여기서 후보 아미노산을 치환하면 후보 아미노산 치환체 사이에서 혹은 치환 안 된단백질의 나머지 부분과 그 측쇄가 일으키는 상호작용 에너지를 컴퓨터를 이용하여 계산하게 된다. 당업자라면 잘 알고 있을 내용으로서, 에너지 계산이라고 지칭할 에너지 평가는 한 개나 여러 개의 아미노산 치환을 점수화하는 어떤 방법을 말한다. 상기 방법은 물리적 또는 화학적 에너지 항(term)을 가지고 있거나, 지식(knowledge), 통계, 서열 기반(based) 에너지 항 또는 그와 유사한 요소를 가지고 있다. 컴퓨터 조작을 통한 선별 방법을 이루는 계산은 본 명세서에서 “컴퓨터 조작을 통한 선별 계산(computational screening calculation)”이라고 지칭한다.

“작용체 기능(effector function)”은 본 명세서에서 항체 Fc 부위가 Fc 리셉터나 리간드와 상호작용하여 일어나는 생화학적 사건(event)을 의미한다. 작용체 기능은 ADCC, ADCP와 CDC를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. “작용체 세 포(effector cell)”란 본 명세서에서 면역계의 세포로서 Fc 리셉터를 한 개 또는 여러 개 가지며, 하나 혹은 여러 가지의 작용체 기능을 매개하는 것을 말한다. 작용 세포는 단핵세포, 대식세포, 중성구, 가지 세포, 호산구(eosinophil), 비만 세포(mast cell), 혈소판, B 세포, 대형 과립상 림프구(large granular lymphocyte), 랑게르한스 세포, 자연 세포독성 세포와 γγ T 세포를 포함하지만 이에 국한되지는 않으며, 인간, 마우스, 랫, 토끼와 원숭이 등의 생물에서 유래할 수 있지만 이에 국한되지는 않는다. “라이브러리”란 본 명세서에서 모든 형태의 Fc 변이체의 집합을 의미하며, 이에는 핵산 또는 아미노산 서열의 목록, 다양한 위치에 일어난 핵산 또는 아미노산 치환의 목록, 라이브러리 서열을 코딩하는 핵산을 구비한 물리적 라이브러리, 정제 또는 비정제 Fc 변이체 단백질을 갖춘 물리적 라이브러리가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.

“Fc”, “Fc 부위”, “Fc 폴리펩티드” 등은 본 명세서에서 정의한 항체로서 항체의 불변부위 중 첫째 면역 글로불린 도메인을 제외한 불변부위를 갖춘 폴리펩티드를 포함하는 것을 의미한다. 따라서 Fc는 IgA, IgD, IgG의 불변부위 마지막 두 면역 글로불린 도메인과 IgE, IgM의 마지막 세 면역 글로불린 도메인, 그리고 이들 도메인에 대하여 N-말단 방향인 유연한 경첩부를 지칭한다. IgA와 IgM에서는 Fc가 J 쇄를 포함할 수도 있다. IgG에서는 도 1에서 나타낸 대로, Fc가 면역 글로불린 도메인 Cγ2와 Cγ3, 그리고 Cγ1과 Cγ2를 이어주는 경첩부를 갖추고 있다. 비록 Fc 부위의 경계가 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 부위는 대체로 C226 또는 P230 잔기부터 그 C-말단 잔기까지로 구성된다고 정의하며, 여기서 잔기 번호 는 Kabat와 같이 EU 인덱스에 따른다. Fc라고 하면 이 부위가 분리된 상태이거나 한 항체의 일부분으로 있거나 항체 조각이거나 Fc 융합 단백질인 경우를 가리킨다. Fc는 한 항체이거나 Fc 융합 단백질이거나 Fc를 갖춘 단백질이거나 단백질 도메인일 수 있다. 특히 바람직한 것은 Fc 변이체로서 자연적으로 존재하지 않는 Fc 변이체들이다.

“Fc 융합체”란 본 명세서에서 하나나 여러 폴리펩티드가 한 Fc 부위 또는 그 유도체에 작동할 수 있게 연결된 것을 의미한다. Fc 융합체는 본 명세서에서 선행기술상의 용어“면역 부착소(immunoadhesin)”, “Ig 융합체”, “Ig 키메라”, “리셉터 글로불린”(Chamow 외, 1996, Trends Biotechnol 14:52~60; Ashkenazi 외, 1997, Curr Opin Immunol 9:195~200)과 같은 의미이다. Fc 융합체는 면역 글로불린 Fc 부위와 융합 파트너를 결합한 것인데, 융합 파트너는 일반적으로 모든 단백질과 소형 분자가 될 수 있다. Fc 융합체의 비Fc 부분, 즉 융합 파트너의 역할은 표적에 대한 결합을 매개하는 것이며, 따라서 항체 가변부위의 역할과 유사하다. 실질적으로 어떠한 단백질이나 소형 분자라도 Fc와 연결되어 Fc 융합 단백질을 이룰 수 있다. 단백질 융합 파트너에는 리셉터의 표적 결합 부위, 부착소 분자, 리간드, 효소, 사이토킨, 케모킨 또는 다른 어떤 단백질이나 단백질 도메인이 포함되지만 이에 국한되는 것은 아니다. 소형 분자 융합 파트너에는 Fc 융합체를 치료 표적으로 인도하는 모든 치료제가 포함된다. 그러한 표적에는 모든 분자가 될 수 있으며, 바람직하게는 질병에 연루된 세포외 리셉터가 된다. 승인받은 소형 분자 약물의 표적이 되는 표면 리셉터 중 두 단백질군(protein family)은 G-단백질 연결 리셉터(G-protein coupled receptor, GPCR)와 K⁺, Na⁺, Ca²⁺ 통로단백질을 포함하는 이온 통로 단백질이다. 세계적으로 시판되는 약물의 70%에 가까운 양이 GPCR을 표적으로 한다. 따라서 본 발명의 Fc 변이체는 예를 들어 다음을 표적으로 하는 소형 분자에 융합될 수 있다: 한 개나 여러 개의 GABA 리셉터, 퓨린성(purinergic) 리셉터, 아드레날린 작동(adrenergic) 리셉터, 히스타민성 리셉터, 아편계 약물리셉터(opioid receptor), 케모킨 리셉터, 글루탐산 리셉터, 니코틴 리셉터, 5HT(세로토닌) 리셉터, 에스트로겐 리셉터. 융합 파트너는 치료상 유용한 표적에 접근하는 단백질에 대한 소형 분자유사체일 수도 있다. Fc 융합 파트너로 작용할 수 있는 구체적인 약물에 대한 예는 L. S. Goodman 외 편집, Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics(9판, 1996 뉴욕 McGraw-Hill 출판사)에서 찾을 수 있다. 융합 파트너에는 존재하는 약물의 표적에 결합하는 소형 분자와 단백질만 포함되는 것이 아니라, 현재 약물 표적으로 되어 있지 않은 고아 리셉터(orphan receptor)도 포함된다. 유전체와 단백질체 프로젝트가 완료되면서 이것이 약물 발견에 있어서 추동력이 된다는 것이 확인되고 있는데, 이 프로젝트들은 수많은 고아 리셉터를 낳았다. 이들 새 분자를 약물 표적으로 확증하고, 이들을 표적으로 하는 단백질과 소형 분자 치료제를 개발하는 데에는 엄청난 가능성이 잠재되어 있다. 그러한 단백질과 소형 분자 치료제는 본 발명의 Fc 변이체를 이용한 Fc 융합 파트너로서 고려할 수 있다. 아래에서 정의하고 기술할 다양한 연결부(linker)를 사용하여 Fc를 융합 파트너에 공유결합으로 연결하여 Fc 융합 단백 질을 생성할 수 있다.

“Fc 감마 리셉터” 또는 “FcγR"는 본 명세서에서 IgG 항체 Fc 부위에 결합하고 실질적으로 FcγR 유전자에 의하여 코딩되는 단백질군의 모든 구성원을 의미한다. 인간에 있어서 이 단백질군에는 아이소형 FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc를 가지는 아이소형 FcγRIIa(동종이형 H131과 R131 포함), FcγRIIb(FcγRIIb-1과 FcγRIIb-2 포함), FcγRIIc를 가지는 FcγRII(CD32), 그리고 아이소형 FcγRIIIa(동종이형 V158과 F158 포함), FcγRIIIb(동종이형 FcγRIIIb-NA1과 FcγRIIIb-NA2 포함, Jefferis 외, 2002, Immunol Lett 82:57~65)를 가지는 FcγRIII(CD16) 뿐만 아니라 모든 미발견 인간 Fcγ또는 FcγR 아이소형이나 동종이형도 포함된다. Fcγ어떤 생물로부터도 유래할 수 있으며, 이에는 인간, 마우스, 랫, 토끼, 원숭이가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 마우스 FcγR는 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16), FcγRIII-2(CD16-2)뿐만 아니라 모든 미발견 마우스 FcγR과 FcγR 아이소형 또는 동종이형을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.

“Fc 리간드”란 본 명세서에서 항체 Fc 부위에 결합하여 Fc-리간드 복합체를 이룰 수 있으며 어떠한 생물로부터도 유래할 수 있는 분자를 가리키는데, 바람직하게는 폴리펩티드이다. Fc 리간드는 FcγR, FcγR, FcγR, FcRn, C1q, C3, 만난(mannan) 결합 렉틴, 만노스 리셉터, 포도상구균(staphylococcal) 단백질 A, 포도상구균 단백질 G, 바이러스성 FcγR을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. Fc 리간드는 또한 Fc 리셉터 동족물(homolog, FcRH)를 포함하는데, 이들은 FcγR에 상 동성이 있는 FcγR 리셉터 단백질군이다(Davis 외, 2002, Immunological Reviews 190:123~136). Fc 리셉터는 Fc에 결합하는 미발견 분자를 포함할 수 있다.

“IgG” 본 명세서에서 알려진 면역 글로불린 감마 유전자에 의하여 실질적으로 코딩되는 항체 종류(class)에 속하는 폴리펩티드를 뜻한다. 인간에 있어서 이 항체 종류에는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4가 속한다. 마우스에서 이 항체 종류에는 IgG1, IgG2, IgG3가 속한다. “면역 글로불린(Ig)"은 본 명세서에서 면역 글로불린 유전자에 의하여 실질적으로 코딩되는 폴리펩티드 하나 또는 여러 개로 구성된 단백질을 뜻한다. 면역 글로불린은 항체를 포함하는데 항체에 국한되지는 않는다. 면역 글로불린은 여러 구조적 형태를 가질 수 있는데, 전장 항체, 항체 조각, 개별 면역 글로불린 도메인이 이에 속하지만, 이것들에 국한되지는 않는다. “면역 글로불린(Ig) 도메인”이란 본 명세서에서 면역 글로불린 부위로서 단백질 구조 분야의 당업자가 독립한 구조적 단위로서 존재한다고 확인한 것을 말한다. Ig 도메인은 전형적으로 β-샌드위치 접힘 모양(folding topology)을 띠고 있다. 알려진 항체 IgG 종류에 속하는 Ig 도메인들은 V_H, Cγ1, Cγ2, Cγ3, V_L과 C_L이다.

"모체 폴리펩티드” 또는 “전구체 폴리펩티드”(Fc 모체 또는 전구체를 포함한다)란 본 명세서에서 변이체를 생성하도록 변형될 폴리펩티드를 말한다. 상기 모체 폴리펩티드는 자연적으로 존재하는 폴리펩티드거나 자연적으로 존재하는 폴리펩티드의 변이체거나 가공한 형태일 수 있다. 모체 폴리펩티드는 폴리펩티드 그 자체, 그를 갖춘 조성물 또는 그를 코딩하는 아미노산 서열을 가리킬 수 있다. 그 에 따라 본 명세서에서 “모체 Fc 폴리펩티드”는 변형되지 않은 Fc 폴리펩티드로서 변이체를 생성하도록 변형될 것을 뜻하며, “모체 항체”란 변형되지 않은 항체로서 변이 항체를 생성하도록 변형될 것을 뜻한다.

앞에서 설명한 것과 같이 Fc 분자의 어떤 위치는 변형될 수 있다. “위치”란 본 명세서에서 단백질 서열에서 한 장소를 뜻한다. 위치는 순서대로 번호를 매길 수도 있고, 또는 확립된 틀에 따라서, 예를 들어 Kabat과 같이 EU 인덱스에 따라서 번호를 매길 수도 있다. 예를 들어 위치 297은 인간 항체 IgG1의 한 위치이다. 앞에서 설명한 대로 서로 대응하는 위치는 일반적으로 다른 모체 서열과 정렬하여 결정한다.

“잔기”란 본 명세서에서 단백질의 한 위치로서 아미노산과 결부된 것을 말한다. 예를 들어 아스파라긴 297(또는 Asn297, N297이라고도 지칭한다)은 인간 항체 IgG1의 한 잔기이다.

“표적 항원”이란 본 명세서에서 어느 지정한 항체 가변부위에 특이적으로 결합하는 분자를 뜻한다. 표적 항원은 단백질, 탄수화물, 지질 또는 다른 화합물일 수 있다.

“표적 세포”란 본 명세서에서 표적 항원을 발현하는 세포를 뜻한다.

“가변부위”란 본 명세서에서 면역 글로불린의 한 부위로서 각각 κ, λ, 중쇄 면역 글로불린 유전자좌(genetic locus)를 이루는 유전자 V_κ, V_λ, 및/또는 V_H에 의하여 실질적으로 코딩되는 Ig 도메인을 하나나 여럿을 갖추고 있는 것을 뜻한 다.

“폴리펩티드 변이체”란 본 명세서에서 적어도 하나의 아미노산 변형 때문에 모체 폴리펩티드와 달라진 폴리펩티드 서열을 뜻한다. 폴리펩티드 변이체는 그 폴리펩티드 자체, 그 폴리펩티드를 갖춘 조성물 또는 그를 코딩하는 아미노산 서열을 가리킬 수 있다. 바람직하게는 폴리펩티든 변이체에는 모체 폴리펩티드와 비교하였을 때 적어도 한 아미노산 변형, 예를 들어 1개에서 10개 정도의 아미노산 변형을 가지고 있으며, 바람직하게는 모체와 비교하여 1개에서 5개 정도의 아미노산 변형을 가진다. 본 명세서의 폴리펩티드 변이체 서열은 그 모체 폴리펩티드 서열과 적어도 약 80% 상동성을 지니는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 적어도 약 90% 상동성을, 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 상동성을 지닌다. 그에 따라 본 명세서에서 “Fc 변이체”라고 하면 모체 Fc 서열에서 적어도 한 아미노산 변형 때문에 달라진 Fc 서열을 뜻한다. Fc 변이체는 Fc 부위만으로 이루어지거나 항체, Fc 융합 단백질 또는 Fc가 대부분을 이루는 다른 단백질의 일부로 존재할 수도 있다. Fc 변이체는 Fc 폴리펩티드 그 자체, Fc 변이체를 갖춘 조성물, 그를 코딩하는 아미노산 서열을 가리킬 수도 있다. 바람직한 일 예에서 본 발명의 단백질 변이체는 여기서 기술하는 Fc 변이체를 구비하고 있고 그에 따라 그 Fc 변이체를 지닌 항체(그리고 그에 따른 유도체)나 Fc 융합 단백질을 갖추게 된다. 나아가 몇몇 경우에는 상기 Fc는 천연형 Fc의 변이체이거나 “모체” 변이체에 대한 변이체이다.

본 발명에서 논의된 모든 위치에 대하여, 면역글로불린 중쇄의 번호는 EU 인 덱스에 따라 지정된다 (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda). "Kabat에서와 같은 EU 인덱스"란, 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 번호 지정을 일컫는다.

본 발명의 Fc 변이체는 다양한 특성들에 대하여 최적화될 수 있다. 최적화될 수 있는 특성들은, 이들로 제한되지는 않으나, FcγR에 대한 증진된 또는 감소된 친화성을 포함한다. 바람직한 일면에 있어서, 본 발명의 Fc 변이체는 인간의 활성화성(activating) FcγR, 바람직하게는 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa, 및 FcγRIIIb, 가장 바람직하게는 FcγRIIIa에 대하여 증진된 친화성을 갖도록 최적화된다. 대안적으로 바람직한 일면에 있어서, 상기 Fc 변이체는 인간의 저해성 리셉터 FcγRIIb에 대하여 감소된 친화성을 갖도록 최적화된다. 이들 바람직한 일면들은, 인간에 있어서 증진된 치료학적 특성들, 예를 들어 증진된 작동체 기능 및 보다 큰 항암 효능을 가지는 항체 및 Fc 융합체를 제공하기 위하여 고려된다. 대안적인 일면에 있어서, 본 발명의 Fc 변이체는, 이들로 제한되지는 않으나 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa, 및 FcγRIIIb를 포함하는 인간 FcγR에 대하여 감소된 또는 변경된 친화성을 가지도록 최적화된다. 이들 일면은, 인간에 있어서 증진된 치료학적 특성들, 예를 들어 감소된 작동체 기능 및 감소된 독성을 가지는 항체 및 Fc 융합체를 제공하기 위하여 고려된다. 바람직한 일면에 있어서는 인간 FcγR에 대한 Fc 결합의 최적화가 포함되나, 대안적인 일면에 있어서, 본 발명의 Fc 변이체는, 이들로 제한되지는 않으나, 마우스, 랫, 토끼, 및 원 숭이를 포함하는 비인간 유기체로부터 유래되는 FcγR에 대하여 증진된 또는 감소된 친화성을 갖는다. 비인간 FcγR에 대한 결합에 대하여 최적화된 Fc 변이체는 실험 용도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 마우스 모델은 다양한 질환에 대하여 이용 가능하며, 주어진 약물 후보 물질(candidate)에 대한 효능, 독성, 및 약물 동력학과 같은 특성들의 테스트를 가능하게 한다. 당 기술 분야에 공지된 바와 같이, 암 세포는 인간 암을 모방하는 마우스 내로 이식(graft) 또는 주입(inject)될 수 있으며, 이러한 과정을 이종 이식(xenografting)이라 한다. 하나 이상의 마우스 FcγR에 대하여 최적화된 Fc 변이체를 포함하는 항체 또는 Fc 융합체의 테스트는, 항체 또는 Fc 융합체의 효능, 그의 작용 메커니즘 등에 대하여 유용한 정보를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 Fc 변이체는 비당화된 형태에서의 증진된 기능성 및/또는 용해 특성에 대하여 최적화될 수 있다. 바람직한 일면에 있어서, 본 발명의 비당화된 Fc 변이체는 모체 Fc 폴리펩티드의 비당화된 형태보다 큰 친화성으로 Fc 리간드에 결합한다. 상기 Fc 리간드는, 이들로 제한되지는 않으나, FcγR, C1q, FcRn, 및 단백질 A 및 G를 포함하며, 이들로 제한되지는 않으나, 인간, 마우스, 랫, 토끼, 또는 원숭이, 바람직하게는 인간을 포함하는 임의의 기원으로부터 유래될 수 있다. 대안적으로 바람직한 일면에 있어서, 상기 Fc 변이체는 비당화된 형태의 모체 Fc 폴리펩티드보다 안정된 및/또는 큰 가용성을 가지도록 최적화된다. 이상에서 제시된 최적화된 특성들 중 임의의 특성을 나타내도록 조작되거나 예측된 Fc 변이체는 본원에서 "최적화된 Fc 변이체"라 일컬어진다.

본 발명의 Fc 변이체는, 광범위한 기원으로부터 유래되는 모체 Fc 폴리펩티 드로부터 유래될 수 있다. 상기 모체 Fc 폴리펩티드는, 이들로 제한되지는 않으나, 인간, 마우스, 랫, 토끼, 낙타, 라마, 드로머데리(dromedary), 및 원숭이를 포함하는 임의의 유기체, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간 및 마우스 유래의 하나 이상의 Fc 유전자에 의하여 실질적으로 코딩될 수 있다. 바람직한 일면에 있어서, 상기 모체 Fc 폴리펩티드는 모체 항체라고 불리는 항체를 구성한다. 상기 모체 항체는, 예를 들어, 형질전환 마우스(Bruggemann et al., 1997, Curr Opin Biotechnol 8: 455-458) 또는 선별 방법과 결합된 인간 항체 라이브러리 (Griffiths et al., 1998, Curr Opin Biotechnol 9: 102-108)를 이용하여 얻어진 완전히 인간 유래의 것일 수 있다. 상기 모체 항체가 천연 발생의 것일 필요는 없다. 예를 들어, 상기 모체 항체는, 이들로 제한되지는 않으나, 키메라 항체 및 인간화된 항체를 포함하는 조작된 항체일 수 있다 (Clark, 2000, Immunol Today 21: 397-402). 상기 모체 항체는 하나 이상의 천연 항체 유전자에 의하여 실질적으로 코딩되는 항체의 조작된 변이체일 수 있다. 일면에 있어서, 상기 모체 항체는, 당 기술 분야에 공지된 바와 같이, 친화성에 대하여 완성된다. 대안적으로, 상기 항체는 예를 들어 2003년 3월 3일자로 출원된 USSN 10/339788에 개시된 바와 같은 몇몇 다른 방식으로 변형된다.

본 발명의 Fc 변이체는, 임의의 항체 클래스의 면역글로불린 유전자에 의하여 실질적으로 코딩될 수 있다. 바람직한 일면에 있어서, 본 발명의 Fc 변이체는, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4를 포함하는 IgG 클래스의 항체에 속하는 서열을 포함하는 항체 또는 Fc 융합체에 이용될 수 있다. 대안적인 일면에 있어서, 본 발명의 Fc 변이체는, IgA (서브클래스 IgA1 및 IgA2 포함), IgD, IgE, IgG, 또는 IgM 클래스의 항체에 속하는 서열을 포함하는 항체 또는 Fc 융합체에 이용될 수 있다. 본 발명의 Fc 변이체는 하나 이상의 단백질 쇄를 포함할 수 있다. 즉, 본 발명은, 항체 또는 Fc 융합체, 즉 모노머(monomer), 또는 호모올리고머 또는 헤테로올리고머를 포함하는 올리고머에 이용될 수 있다.

바람직한 예에서, 본 발명의 항체는 인간 서열을 근간으로 한 것이므로, 따라서 인간의 서열은 그외 서열, 예컨대 랫, 마우스 및 원숭이의 서열과 비교되는 "베이스" 서열로 사용된다. 일차 서열 또는 구조에 대한 상동성을 구축하기 위해, 전구체 또는 모체 Fc 폴리펩티드의 아미노산 서열을 본원의 인간 Fc 서열과 직접 비교할 수 있다. 서열 정렬하여, 하나 이상의 공지의 상동성 정렬 프로그램을 사용하고(예컨대 종 사이에 보존된 잔기를 이용함), 정렬을 유지하기 위한 필수 삽입 및 삭제를 허용(즉, 임의적인 삭제 및 삽입을 통한 보존성 잔기 제거를 피하기 위함)한 후, 인간 Fc의 일차 서열에서 특정 서열에 등가의 잔기를 확인한다. 보존적 잔기의 정렬시 이러한 잔기들이 100% 보존되어야 한다. 그러나, 보존적 잔기의 75% 이상 또는 적게는 50%는, 또한 등가의 잔기를 확인하는데 적합하다(때때로 "해당 잔기"로 언급됨). 또한 등가의 잔기는 3차 구조가 결정된 Fc 폴리펩티드에 대한 3차 구조로 상동성을 결정함으로써 규정될 수 있다. 등가의 잔기는 모체 또는 전구체(N상의 N, CA상의 CA, C 상의 C 및 O 상의 O)의 특정 아미노산 잔기의 주쇄 원자 2이상의 원자 대등물은 정렬후 0.13nm 이내인 것으로 정의되며, 바람직하기로는 0.1nm 이내인 것으로 정의된다. 정렬은 최상 모델이 파악되어 Fc 폴리펩티드의 비-수소성 단백질 원자의 원자적 대등물의 최대 중첩을 제공하도록 배치된다.

본 발명의 Fc 변이체는, 이들로 제한되지는 않으나, 작동체 기능 또는 하나 이상의 Fc 리간드와의 상호작용을 변경시키는 변형을 포함하는 기타 Fc 변형과 조합될 수 있다. 그러한 조합은 항체 또는 Fc 융합체에 있어서 부가적인, 상승적인, 또는 신규한 특성을 제공한다. 일면에 있어서, 본 발명의 Fc 변이체는 기타 공지의 Fc 변이체와 함께 조합될 수 있다 (Duncan et al., 1988, Nature 332: 563-564; Lund et al., 1991, J Immunol 147: 2657-2662; Lund et al., 1992, Mol Immunol 29: 53-59; Alegre et al., 1994, Transplantation 57: 1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A 92: 11980-11984; Jefferis et al., 1995, Immunol Lett 44: 111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9: 115-119; Jefferis et al., 1996, Immunol Lett 54: 101-104; Lund et al., 1996, J Immunol 157 : 4963-4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29: 2613-2624; Idusogie et al., 2000, J Immunol 164: 4178-4184; Reddy et al., 2000, J Immunol 164 : 1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200: 16-26; Idusogie et al., 2001, J Immunol 166: 2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276: 6591-6604; Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82: 57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30: 487-490; Hinton et al., 2004, J Biol Chem 279:6213-6216)(US 5,624,821; US 5,885,573; US 6,194,551; PCT WO 00/42072; PCT WO 99/58572; US 2004-0002587A1). 대안적인 일면에 있어서, 본 발명의 Fc 변이체는 하나 이상의 조작된 당형태를 포함하는 항체 또는 Fc 융합체 내로 도입된다. 본원에 사용된 바 와 같이, "조작된 당형태(engineered glycoform)"란, Fc 폴리펩티드에 공유 결합된 탄수화물 조성물을 의미하며, 여기서 상기 탄수화물 조성물은 모체 Fc 폴리펩티드와 화학적으로 상이하다. 조작된 당형태는, 이들로 제한되지는 않으나, 작동체 기능의 증진 또는 감소를 포함하는 다양한 목적에 유용할 수 있다. 조작된 당형태는, 여러가지 공지 방법으로 제조될 수 있다(Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17: 176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74: 288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277: 26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278: 3466-3473); (US 6,602,684; USSN 10/277,370; USSN 10/113,929; PCT WO 00/61739 A1; PCT WO 01/29246 A1; PCT WO 02/31140 A1; PCT WO 02/30954 A1); (포텔리젠트™ 기술(Potelligent technology) (Biowa, Inc., Princeton, N.J.); (GlycoMAbT™ 당화 조작 기술(glycosylation engineering technology)(GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland)). 이러한 많은 기술들은 Fc 부위에 공유결합으로 부착된 푸코실화(fucosylate) 및 또는 양분성(bisecting) 올리고당의 수준 조절을 토대로 하며, 예컨대 다양한 유기체, 또는 세포주 내에서 Fc 폴리펩티드를 발현시킴으로써(예, Lce-13 CHO 세포 또는 랫 하이브리도만 YB2/0 세포), 당화 기작에 참여하는 효소를 조절함으로써(예, FUT8[α1,6-푸코실트랜스퍼라제] 및/또는 β1-4-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III[GnTIII]), 또는 Fc 폴리펩티드 발현 후 탄수화물(들)을 변형시킴으로써, 제작될 수 있다. 조작된 당형태는 통상적으로, 상이한 탄수화물 또는 올리고당을 일컫는다. 그러므로, Fc 폴리펩티드, 예를 들어 항체 또는 Fc 융합체는, 조작된 당형태를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조작된 당형태는, 상이한 탄수화물 또는 올리고당을 포함하는 Fc 폴리펩티드를 일컬을 수 있다. 그러므로, 본 발명의 Fc 변이체와 기타 Fc 변형의 조합, 그리고 발견되지 않은 Fc 변형의 조합은, 최적화된 특성을 가지는 신규한 항체 또는 Fc 융합체에 대하여 고려된다.

*본 발명의 Fc 변이체는 항체에 있어서의 용도를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, "본 발명의 항체"란, 본 발명의 Fc 변이체를 포함하는 항체를 의미한다. 본 발명은, 실제로 Fc를 포함하는 임의의 단백질에 있어서의 용도를 가지며, 그러므로, 본 발명의 Fc 변이체의 적용은 항체로 제한되지 않는다. 본 발명의 Fc 변이체는 Fc 융합체에 있어서의 용도를 가질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "본 발명의 Fc 융합체"란, 본 발명의 Fc 변이체를 포함하는 Fc 융합체를 일컫는다. Fc 융합체는, 사이토카인(cytokine), 가용성 리셉터 도메인, 부착 분자, 리간드, 효소, 펩티드, 또는 기타 단백질 또는 단백질 도메인에 작동가능하도록 연결된 본 발명의 Fc 변이체를 포함할 수 있으며, 이들로 제한되지는 않으나, US 5,843,725; US 6,018,026; US 6, 291, 212; US 6, 291,646; US 6,300,099; US 6,323,323; PCT WO 00/24782; 및 (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14: 52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9: 195-200)에 개시된 Fc 융합체를 포함한다.

실질적으로 임의의 항원이 본 발명의 항체 및 융합체에 의하여 표적화될 수 있으며, 이들로 제한되지는 않으나, 다음과 같은 리스트의 단백질, 서브유닛(subunit), 도메인, 모티브, 및 에피토프를 포함한다: CD2, CD3, CD3E, CD4, CD11, CD11a, CD14, CD16, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33 (p67 단백질), CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD80, CD147, GD3, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, 인터페론 알파(interferon alpha), 인터페론 베타, 인터페론 감마; TNF-알파, TNF 베타2, TNFc, TNF 알파베타, TNF-RI, TNF-RII, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEGI, OX40L, TRAIL 리셉터-1, A1 아데노신 리셉터, 림포톡신 베타 리셉터(Lymphotoxin Beta Receptor), TACI, BAFF-R, EPO; LFA-3, ICAM-1, ICAM-3, EpCAM, 인테그린(integrin) 베타1, 인테그린 베타2, 인테그린 알파4/베타7, 인테그린 알파2, 인테그린 알파3, 인테그린 알파4, 인테그린 알파5, 인테그린 알파6, 인테그린 알파v, 알파V베타3 인테그린, FGFR-3, 각질형성세포 성장 인자(Keratinocyte Growth Factor), VLA-1, VLA-4, L-셀렉틴(selectin), 항-Id, E-셀렉틴, HLA, HLA-DR, CTLA-4, T 세포 리셉터, B7-1, B7-2, VNR 인테그린, TGF 베타1, TGF 베타2, 에오탁신(eotaxin) 1, BLyS (B-lymphocyte Stimulator), 보체 C5, IgE, 인자 VII, CD64, CBL, NCA 90, EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), 조직 인자(Tissue factor), VEGF, VEGFR, 엔도텔린(endothelin) 리셉터, VLA-4, 햅텐(Hapten) NP-cap 또는 NIP-cap, T 세포 리셉터 알파/베타, E-셀렉틴, 디곡신(digoxin), 태반의 알칼리성 포스파타아제(placental alkaline phosphatase; PLAP) 및 고환의(testicular) PLAP형 알칼리성 포스파타아제, 트랜스페린(transferrin) 리셉터, 발암성 배아 항원(Carcinoembryonic antigen; CEA), CEACAM5, HMFG PEM, 무친(mucin) MUC1, MUC18, 헤파라나제(Heparanase) I, 인간 심장의 미오신(cardiac myosin), 종양-관련 당단백질-72 (TAG-72), 종양-관련 항원 CA 125, 전립선 특이성 막 항원 (Prostate specific membrane antigen; PSMA), 고분자량 흑색종-관련 항원(High molecular weight melanoma-associated antigen; HMW-MAA), 암종-관련 항원, Gco단백질 Ilb/Illa(GPIIb/IIIa), 루이스 Y 관련 탄수화물(Lewis Y related carbohydrate)을 발현하는 종양-관련 항원, 인간 사이토메갈로 바이러스 (human cytomegalovirus; HCMV) gH 외피(envelope) 당단백질, HIV gp120, HCMV, 호흡기 신시털 바이러스(respiratory syncital virus) RSV F, RSV Fgp, VNR 인테그린, IL-8, 사이토케라틴 종양-관련 항원, Hep B gp120, CMV, gpIIbIIIa, HIV IIIB gp120 V3 루프, 호흡기 신사이셜 바이러스 (respiratory syncytial virus; RSV) Fgp, 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV), gD 당단백질, HSV gB 당단백질, HCMV gB 외피 당단백질, 및 클로스트리듐 페르그린젠스(Clostridium perfringens) 독소.

당업자라면, 이상에 개시한 표적 리스트가, 특이적인 단백질 및 생분자(biomolecule)뿐 아니라, 그들을 포함하는 생화학적 경로 또는 경로들을 일컬음을 이해할 것이다. 예를 들어, 표적 항원으로서 CTLA-4의 언급은, CTLA-4, B7-1, B7-2, CD28, 및 기타 발견되지 않은 리간드 또는 리셉터를 포함하는 T 세포 공-자극성 경로를 구성하는 리간드 및 리셉터도 표적임을 의미한다. 그러므로, 본원에 사용된 바와 같이, 표적은 특이적인 생분자, 그리고 상기 표적이 속하는 생화학적 경로의 일원 및 상기 표적과 상호 작용하는 단백질 세트를 일컫는다. 당업자라면, Fc 융합체를 제조하기 위하여, 이상에 개시한 표적 항원, 그들에 결합하는 리간드 또는 리셉터, 또는 그들의 해당 생화학적 경로의 기타 일원들 중 하나가, 본 발명의 Fc 변이체에 작동가능하도록 연결될 수 있음을 이해할 것이다. 그러므로, 예를 들어, EGFR를 표적화하는 Fc 변이체는 EGF, TGFα, 또는 EGFR을 결합시킬 수 있는 발견된 또는 발견되지 않은 기타 리간드를 작동가능하도록 연결시킴으로써 제작될 수 있다. 따라서, 본 발명의 Fc 변이체는, EGF, TGFα, 또는 EGFR을 결합시킬 수 있는 발견된 또는 발견되지 않은 기타 리간드를 제작하기 위하여 EGFR에 작동가능하도록 연결될 수 있다. 그러므로, 이들로 제한되는 것은 아니나, 이상에 개시한 표적 및 그들의 해당 생화학적 경로를 구성하는 단백질을 포함하는, 리간드, 리셉터, 또는 기타 단백질 또는 단백질 도메인은 Fc 융합체를 개발하기 위하여 본 발명의 Fc 변이체에 작동가능하도록 연결될 수 있다.

임상 실험 또는 개발 용도로서 허가된 다수의 항체 및 Fc 융합체가 본 발명의 Fc 변이체로부터 유용성을 찾을 수 있다. 본원에 있어서, 이러한 항체 및 Fc 융합체를 "임상적 제품(cliniocal product) 및 후보 물질(candidate)"이라 일컫는다. 그러므로, 바람직한 일면에 있어서, 본 발명의 Fc 변이체는 임상적 제품 및 후보 물질의 측면으로 사용될 수 있다. 예를 들어, CD20을 표적화하는 다수의 항체들이 본 발명의 Fc 변이체로부터 유용성을 찾을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 Fc 변이체는 리툭시맵(Rituxan^®, IDEC/Genethech/Roche) (예를 들어, US 5,736,137 참조), 비-호드그킨의 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)을 치료하는 것으로 허가된 키메라 항-CD20 항체; HuMax-CD20, 현재 Genmab에 의하여 개발되고 있는 중인 항- CD20, US 5,500,362에 개시된 항-CD20 항체, AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics,Inc.), 및 HumaLYM (Intracel)과 실질적으로 유사한 항체에 사용될 수 있다. EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4)를 포함하는 표피 성장 인자 리셉터(epidermal growth factor receptor) 부류의 일원들을 표적화하는 다수의 항체가 본 발명의 Fc 변이체로부터 이익을 취할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 Fc 변이체는 다음과 실질적으로 유사한 항체에 사용될 수 있다: 트라스투주맵(Herceptin^®; Genentech) (예를 들어, US 5,677,171 참조), 유방암의 치료에 대하여 허가된 인간화된 항-Her2/neu 항체; 현재 Genentech에 의하여 개발 중에 있는 페르투주맵(pertuzumab) (rhuMab-2C4, Omnitarg™); US 4,753,894에 개시되어 있는 항-Her2 항체; 세투시맵(cetuximab)(Erbitux^®, Imclone) (US 4,943,533; PCT WO 96/40210); 다양한 암에 대한 임상 실험에 사용되는 키메라 항-EGFR 항체; 현재 Abgenix/Immunex/Amgen에 의하여 개발 중에 있는 ABX-EGF (US 6, 235,883); 현재 Genmab에 의하여 개발 중에 있는 HuMax-EGFr (USSN 10/172,317); 425, EMD55900, EMD62000, 및 EMD72000 (MerckKGaA) (US 5,558,864; Murthy et al., 1987, Arch Biochem Biophys. 252 (2): 549-60; Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35 (4): 315-20; Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4 (7): 773-83); ICR62 (Institute of Cancer Research) (PCT WO 95/20045; Modjtahedi et al., 1993, Br J Cancer. 1993, 67 (2): 247-53; Modjtahedi et al., 1996, Br J Cancer, 73 (2): 228-35; Modjtahedi et al., 2003, Int J Cancer, 105 (2): 273-80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba (US 5,891,996; US 6,506,883; Mateo et al., 1997, Immunotechnology, 3 (1): 71-81); mAb-806 (Ludwig Institue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al., 2003, Proc Natl Acad Sci U. S. A. 100 (2): 639-44); KSB-102 (KS Biomedix); MR1-1(IVAX, National Cancer Institute)(PCT WO 0162931A2); 및 SC100(Scancell) (PCT WO 01/88138). 또 다른 하나의 바람직한 일면에 있어서, 본 발명의 Fc 변이체는, 현재 B-세포 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia)의 치료용으로 허가되어 있는 인간화된 단일 클론성 항체인 알렘투주맵(Campath^®, Millenium)에 사용될 수 있다. 본 발명의 Fc 변이체는 이들로 제한되지는 않으나, 다음을 포함하는 기타 임상적 제품 및 후보 물질과 실질적으로 유사한 항체에 사용될 수 있다: 뮤로몬냅(muromonab)-CD3 (Orthoclone OKT32^®), Ortho Biotech/Johnson & Johnson에 의하여 개발된, 항-CD3 항체, 이브리투모맵 타이욱세탄(ibritumomab tiuxetan)(Zevalin^®), IDEC/Schering AG에 의하여 개발된, 항-CD20 항체, 젬투주맵 오조자마이신(gemtuzumab ozogamicin)(Mylotarg^®), Celltech/Wyeth에 의하여 개발된, 항-CD33 (p67 단백질) 항체, 알레파셉트(alefacept)(Amevive^®), Biogen에 의하여 개발된, 항-LFA-3 Fc 융합체, Centocor/Lilly에 의하여 개발된, 아브식사이맵(abciximab)(ReoPro^®), Novartis에 의하여 개발된, 바실릭사이맵(basiliximab)(Simulect^®), Medlmmune에 의하여 개발된, 팔리바이주맵^®), 인플릭사이맵(Remicade^®), Centocor에 의하여 개발된, 항-TNF 알파 항체, 아달리뮤맵(Humira^®), Abbott에 의하여 개발된, 항-TNF 알파 항체, Humicade^TM, Celltech에 의하여 개발된, 항-TNF 알파 항체, 에타네르셉트(Enbrel^®), Immunex/Amgen에 의하여 개발된 항-TNF 알파 Fc 융합체, ABX-CBL, Abgenix에 의하여 개발된, 항-CD147 항체, ABX-IL8, Abgenix에 의하여 개발 중에 있는 항-IL8 항체, ABX-MA1, Abgenix에 의하여 개발 중에 있는 항-MUC18 항체, 펩투모맵(Pemtumomab)(R1549, ⁹⁰Y-mu-HMFG1), Antisoma에 의하여 개발 중에 있는 항-MUC1, Therex(R1550), Antisoma에 의하여 개발 중에 있는 항-MUC1 항체, Antisoma에 의하여 개발 중에 있는 안지오맵(AngioMAb), Antisoma에 의하여 개발 중에 있는 HuBC-1, Antisoma에 의하여 개발 중에 있는 티오플라틴(Thioplatin)(AS1407), Antegren^®(나탈리주맵), Biogen에 의하여 개발 중에 있는 항-알파-4-베타-1 (VLA-4) 및 알파-4-베타-7 항체, VLA-1 mAb, Biogen에 의하여 개발 중에 있는 항-VLA-1 인테그린 항체, LTBR mAb, Biogen에 의하여 개발 중에 있는 항-림포톡신 베타 리셉터 (anti-lymphotoxin beta receptor; LTBR) 항체, CAT-152, Cambridge Antibody Technology에 의하여 개발 중에 있는 항-TGFβ2 항체, J695, Cambridge Antibody Technology 및 Abbott에 의하여 개발 중에 있는 항-IL-12 항체, CAT-192, Cambridge Antibody Technology 및 Genzyme에 의하여 개발 중에 있는 항-TGFβ1 항체, CAT-213, Cambridge Antibody Technology에 의하여 개발 중에 있는 항-에오탁신 1 항체, Lymphostat-B^TM, Cambridge Antibody Technology 및 Human Genome Sciences Inc.에 의하여 개발 중에 있는 항-Blys 항체, TRAIL-R1mAb, Cambridge Antibody Technology 및 Human Genome Sciences Inc.에 의하여 개발 중에 있는 항-TRAIL-R1 항체, Avastin™ (bevacizumab, rhuMAb-VEGF), Genentech에 의하여 개발 중에 있는 항-VEGF 항체, Genentech에 의하여 개발 중에 있는 항-HER 리셉터 부류의 항체, 항-조직 인자 (Anti-Tissue Factor; ATF), Genentech에 의하여 개발 중에 있는 항-조직 인자 항체, Xolair™ (Omalizumab), Genentech에 의하여 개발 중에 있는 항-lgE 항체, Raptiva™ (Efalizumab), Genentech 및 Xoma에 의하여 개발 중에 있는 항-CD11a 항체, Genentech 및 Millenium Pharmaceuticals에 의하여 개발 중에 있는 MLN-02 항체 (이전에는 LDP-02이란 불림), HuMax CD4, Genmab에 의하여 개발 중에 있는 항-CD4 항체, HuMax-IL15, Genmab 및 Amgen에 의하여 개발 중에 있는 항-IL15 항체, Genmab 및 Medarex에 의하여 개발 중에 있는 HuMax-Inflam, HuMax-Cancer, Genmab 및 Medarex 및 Oxford GcoSciences에 의하여 개발 중에 있는 항-헤파라나제 I 항체, Genmab 및 Amgen에 의하여 개발 중에 있는 HuMax-Lymphoma, Genmab에 의하여 개발 중에 있는 HuMax-TAC, IDEC Pharmaceuticals에 의하여 개발 중에 있는 IDEC-131 및 항-CD40L 항체, IDEC-151(Clenoliximab), IDEC Pharmaceuticals에 의 하여 개발 중에 있는 항-CD4 항체, IDEC-114, IDEC Pharmaceuticals에 의하여 개발 중에 있는 항-CD80 항체, IDEC-152, IDEC Pharmaceuticals에 의하여 개발 중에 있는 항-CD23, IDEC Pharmaceuticals에 의하여 개발 중에 있는 항-대식세포 이동 인자(macrophage migration factor; MIF) 항체, Imclone에 의하여 개발 중에 있는 항-이디오타입(idiotypic) 항체, BEC2, Imclone에 의하여 개발 중에 있는 항-KDR 항체, IMC-1C11, Imclone에 의하여 개발 중에 있는 항-flk-1 항체, DC101, Imclone에 의하여 개발 중에 있는 항-VE 카드헤린(cadherin) 항체, Immunomedics에 의하여 개발 중에 있는 항-암배아 항체(anti-carcinoembryonic antibody; CEA), CEA-Cide™ (Iabeteuzumab), Immunomedics에 의하여 개발 중에 있는 항-CD22 항체, LymphoCide™ (Epratuzumab), Immunomedics에 의하여 개발 중에 있는 AFP-Cide, Immunomedics에 의하여 개발 중에 있는 MyelomaCide, Immunomedics에 의하여 개발 중에 있는 LkoCide, Immunomedics에 의하여 개발 중에 있는 ProstaCide, Medarex에 의하여 개발 중에 있는 항-CTLA4 항체, MDX-010, Medarex에 의하여 개발 중에 있는 항-CD30 항체, MDX-060, Medarex에 의하여 개발 중에 있는 MDX-070, Medarex에 의하여 개발 중에 있는 MDX-018, Medarex 및 Immuno-Designed Molecules에 의하여 개발 중에 있는 항-Her2 항체, Osidem™ (IDM-1), Medarex 및 Genmab에 의하여 개발 중에 있는 항-CD4 항체, HuMax™-CD4, Medarex 및 Genmab에 의하여 개발 중에 있는 항-IL15 항체, HuMax-IL15, Medarex 및 Centocor/J&J에 의하여 개발 중에 있는 항-TNFα 항체, CNTO 148, Centocor/J&J에 의하여 개발 중에 있는 항-사이토카인 항체, CNTO1275, MorphoSys에 의하여 개발 중에 있는 항-세포내 부착 분자(intercellular adhesion molecule)-1(ICAM-1)(CD54) 항체, MOR101 및 MOR102, MorphoSys에 의하여 개발 중에 있는 항-섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor)-3(FGFR-3), MOR201, Protein Design Labs에 의하여 개발 중에 있는 항-CD3 항체, Nuvion^® (visilizumab), Protein Design Labs에 의하여 개발 중에 있는 항-감마 인터페론 항체, HuZAF™, Protein Design Labs에 의하여 개발 중에 있는 항-□5□1-인테그린, Protein Design Labs에 의하여 개발 중에 있는 항-IL-12, ING-1, Xoma에 의하여 개발 중에 있는 항-Ep-CAM 항체, 및 MLN01, Xoma에 의하여 개발 중에 있는 항-Beta 2 인테그린 항체.

이상에 개시한 항체 및 Fc 융합체 임상적 제품 및 후보 물질에 대한 상기 변이체의 적용이, 그들의 정밀한 조성에 제약되는 것을 의미하지는 않는다. 본 발명의 Fc 변이체는 이상에 개시한 임상적 제품 및 후보 물질, 또는 그들과 실질적으로 유사한 항체 및 Fc 융합체 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 Fc 변이체는, 기타 다양한 방식으로 인간화된, 친화성 발달된, 조작된, 또는 변형된, 이상에 개시한 임상적 후보 물질 및 산물의 개조된 형태로도 도입될 수 있다. 나아가, 이상에 개시한 임상적 제품 및 후보 물질의 전체 폴리펩티드가, 본 발명의 Fc 변이체를 혼입한 새로운 항체 또는 Fc 융합체를 제작하는 데 사용될 필요는 없다. 예를 들어, 임상적 제품 또는 후보 물질 항체의 단지 가변 부위, 실질적으로 유사한 가변 부위, 또는 상기 가변 부위의 인간화된, 친화성 발달된, 조작된, 또는 변형된 개조형이 사용될 수 있다. 또 다른 일면에 있어서, 본 발명의 Fc 변이체는, 이상에 개시한 임 상적 제품 및 후보 물질과 동일한 에피토프, 항원, 리간드, 또는 리셉터에 결합하는 항체 또는 Fc 융합체에 있어서의 용도를 가질 수 있다.

본 발명의 Fc 변이체는 광범위한 항체 및 Fc 융합체 산물에 있어서의 용도를 가질 수 있다. 일면에 있어서, 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체는 치료용, 진단용, 또는 연구용 시약(reagent), 바람직하게는 치료용 시약이다. 대안적으로, 본 발명의 항체 및 Fc 융합체는 농업적 용도 및 산업적 용도로 사용될 수 있다. 대안적인 일면에 있어서, 본 발명의 Fc 변이체는 실험적으로 스크리닝될 수 있는 라이브러리를 구성한다. 이 라이브러리는 핵산 또는 아미노산 서열의 리스트일 수도 있고, 상기 라이브러리를 코딩하는 핵산 또는 폴리펩티드의 물리적 조성물일 수도 있다. 상기 Fc 변이체는 단일 클론성 또는 다중 클론성인 항체 조성물에 있어서의 용도를 가질 수 있다. 본 발명의 항체 및 Fc 융합체는 작용서, 길항성, ㅈ중화성, 저해성 또는 자극성일 수 있다. 바람직한 일면에 있어서, 본 발명의 항체 및 Fc 융합체는 표적 항원, 예를 들어, 암 세포를 함유하는 표적 세포를 죽이는 데에 사용된다. 대안적인 일면에 있어서, 본 발명의 항체 및 Fc 융합체는, 예를 들어 사이토카인 또는 사이토카인 리셉터에 대하여 길항 작용하기 위하여, 표적 항원을 블로킹하거나, 길항 작용하거나, 또는 방해하는 데 사용된다. 대안적으로 바람직한 일면에 있어서, 본 발명의 항체 및 Fc 융합체는, 표적 항원을 블로킹하거나, 길항 작용하거나, 또는 방해하는 데 및 상기 표적 항원을 함유하는 표적 세포를 죽이는 데 사용된다.

본 발명의 Fc 변이체는 다양한 치료 목적으로 사용될 수 있다. 바람직한 일면에 있어서, Fc 변이체 단백질은, 항체-관련 질환을 치료하기 위하여 환자에게 투여된다. 본 발명의 목적에 있어서, "환자(patient)"는 인간 및 기타 동물을 포함하며, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간을 포함한다. 그러므로, 본 발명의 항체 및 Fc 융합체는 인간 요법 및 수의학적(veterinary) 용도를 갖는다. 바람직한 일면에 있어서, 상기 환자는 포유류이다. 가장 바람직한 일면에 있어서, 상기 환자는 인간이다. 본원에 있어서, "치료(treatment)"란 용어는, 질병 또는 질환의 치료학적 처치(therapeutic treatment)뿐 아니라, 예방학적 처치(prophylactic treatment), 또는 억제 조치(suppressive measure)를 의미한다. 그러므로, 예를 들어, 질병이 발생하기 전에 항체 또는 Fc 융합체를 성공적으로 투여하면, 그러한 질환을 치료할 수 있다. 또 다른 하나의 일례로서, 질병의 임상적 징후(clinical manifestation) 이후, 상기 질병의 증후(symptom)를 퇴치하기 위하여, 최적화된 항체 또는 Fc 융합체를 성공적으로 투여하는 것은, 상기 질병을 치료하는 과정에 포함된다. "치료(treatment)"는 또한, 질병이 발현된 후, 상기 질병을 박멸하기 위하여, 최적화된 항체 또는 Fc 융합체를 투여하는 것을 포괄한다. 임상적 증후가 발병한 후 및 임상적 증후가 발달한 이후, 제제를 성공적으로 투여하는 것은, 임상적 증후의 가능한 경감 및 질병의 향상과 함께, 상기 질병을 치료하는 과정을 포함한다. "치료를 필요로 하는(in need of treatment)" 개체란, 이미 질병 또는 질환을 가지는 포유류뿐 아니라, 질병 또는 질환이 예방된 바 있는 포유류를 포함하여, 질병 또는 질환을 갖기 쉬운 포유류를 포함한다. 본원에 있어서, "항체 관련 질환(antibody related disorder)" 또는 "항체 반응성 질환(antibody responsive disorder)" 또는 "증상(condition)" 또는 "질환(disease)"은, 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체를 포함하는 약학적 조성물을 투여함으로써 향상될 수 있는 질환을 의미한다. 항체 관련 질환은, 이들로 제한되지는 않으나, 자가면역 질환(autoimmune disease), 면역학적 질환(immunological disease), 감염성 질환(infectious disease), 염증성 질환(inflammatory disease), 신경학적 질환(neurological disease), 및 암을 포함하는 종양학적(oncological) 및 신생(neoplastic) 질환을 포함한다. 본원에 있어서, "암(cancer)" 및 "암성(cancerous)"이란, 통상적으로 세포의 비조절성 성장을 특징으로 하는 포유류의 생리학적 증상(physiological condition)을 일컫거나 설명한다. 암의 예로는, 이들로 제한되지는 않으나, 암종, 림프종, 모세포종(blastoma), 사르코마(sarcoma) (림포사르코마 포함), 신경 내분비 종양(neuroendocrine tumor), 메소텔라이오마(mesothelioma), 쉬와노마(schwanoma), 수막종(meningioma), 아데노암종(adenocarcinoma), 흑색종, 및 백혈병 또는 림프 악성 종양(malignancy)이 포함된다. 그러한 암의 보다 구체적인 예로는, 편평 세포 암(squamous cell cancer) (예를 들어, 상피 편평 세포 암), 소세포 폐암, 비-소세포 폐암을 포함하는 폐암, 폐의 아데노암종 및 폐의 편평 암종, 복막(peritoneum)의 암, 간세포 암(hepatocellular cancer), 위암(gastric cancer 또는 stomach cancer), 예를 들어 위장암(gastrointestinal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 아교모세포종(glioblastoma), 자궁 경부 암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 헤파토마(hepatoma), 유방암, 결장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 대장결장암(colorectal cancer), 자궁 내막(endometrial) 또는 자궁(uterine) 암종, 침선(salivary gland) 암종, 신장암(kidney cancer) 또는 신암(renal cancer), 전립선 암, 음문암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간장 암종(hepatic carcinoma), 항문(anal) 암종, 음경(penile) 암종, 고환 암(testicular cancer), 식도암(esophagael cancer), 담관(biliary tract) 종양, 그리고 두부 및 목부(neck) 암을 포함한다. 나아가, 본 발명의 Fc 변이체는, 이들로 제한되지는 않으나, 다음과 같은 증상의 치료에 사용될 수 있다: 충혈성 심장 부전(congestive heart failure; CHF), 맥관염(vasculitis), 로세시아(rosecea), 좌창(acne), 습진(eczema), 심근염(myocarditis) 및 기타 심근(myocardium) 증상, 전신 낭창성 홍반증(systemic lupus erythematosus), 당뇨병(diabetes), 척추병증(spondylopathy), 활액성 섬유아세포증(synovial fibroblast), 및 골수 기질(bone marrow stroma); 골 손실(bone loss); 파제트병(Paget's disease), 파골세포증(osteoclastoma); 다발성 골수종(multiple myeloma); 유방암; 불사용 골 감소증(disuse osteopenia); 영양 실조(malnutrition), 치주 질환(periodontal disease), 가우셔병(Gaucher's disease), 랑게르한스 세포 조직구증(Langerhans'cell histiocytosis), 척수 손상(spinal cord injury), 급성 패혈성 관절염(acute septic arthritis), 골연화증(osteomalacia), 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 단일골 섬유질 이형성증(monoostotic fibrous dysplasia), 다골 섬유질 이형성증(polyostotic fibrous dysplasia), 치주 재건(periodontal reconstruction), 및 골절(bone fracture); 유육종증(sarcoidosis); 다발성 골수종(multiple myeloma); 골수염성 골 암(osteolytic bone cancer), 유방암, 폐암, 신장암 및 직장암; 골 전이(bone metastasis), 골 통증 관리(bone pain management), 및 체액성 악성 고칼슘증(humoral malignant hypercalcemia), 교착성 척수염증(ankylosing spondylitisa) 및 기타 척수 관절 병증(spondyloarthropathy); 이식 거부반응(transplantation rejection), 바이러스 감염, 혈액 신생종(hematologicneoplasisa) 및 신생종형 증상(neoplastic-like condition), 예를 들어, 호드그킨 림프종; 비-호드그킨 림프종(부르키트 림프종(Burkitt's lymphom), 작은 림프구성 림프종/만성 림프구성 백혈병, 사상균병 균상종(mycosis fungoid), 맨틀 세포 림프종(mantlecell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 발산성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 연변 림프종(marginal zone lymphoma), 모발 세포 백혈병(hairycell leukemia) 및 림프 형질 세포성 백혈병(lymphoplasmacytic leukemia)), 림프구 전구체 세포 종양, 예를 들어 B-세포 급성 림프 모세포성(lymphoblastic) 백혈병/림프종, 및 T-세포 급성 림프 모세포성 백혈병/림프종, 흉선종(thymoma), 성숙된 T 및 NK 세포 종양, 예를 들어 말초 T-세포 백혈병, 성체(adult) T-세포 백혈병/T-세포림프종 및 거대 과립구 림프구성 백혈병(large granular lymphocytic leukemia), 랑게르한스 세포 혈구증(histocytosis), 골수 신생종(myeloid neoplasia), 예를 들어, 급성 골수 백혈병(acute myelogenous leukemia), 예를 들어, 화농증(maturation)을 동반하는 AML, 분화(differentiation)를 동반하지 않는 AML, 급성 전구 골수구성 백혈병(acute promyelocytic leukemia), 급성 골수 단구성 백혈병(acute myelomonocytic leukemia), 및 급성 단구성 백혈병(acute monocytic leukemia), 골수 이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 및 만성 골수 증식성 질환(clonic myeloproliferative disorder), 예를 들어, 만성 골수 백혈병, 중추 신경계(central nervous system)에 있어서의 종양, 예를 들어, 뇌종양 (신경아교종, 신경모세포종, 성형 세포종(astrocytoma), 속질 모세포종(medulloblastoma), 뇌실막 세포종(ependymoma), 및 망막 모세포종(retinoblastoma)), 고형 종양(비강 인두 암(nasopharyngeal cancer), 기저 세포 암종(basal cell carcinoma), 췌장암, 담관(bile duct) 암, 카포스 사르코마(Kapos's sarcoma), 고환 암, 자궁, 자궁 경부 또는 자궁 경관(cervical) 암, 난소암, 1차 간암 또는 자궁 내막 암, 및 혈관계의 암(안지오사르코마(angiosarcoma) 및 혈관 주위 세포종(hemagiopericytoma)), 골다공증(osteoporosis), 간염(hepatitis), HIV, AIDS, 척수 속질염(spondyloarthritis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 염증성 창자 질환(inflammatory bowel diseases; IBD), 패혈증(sepsis) 및 패혈성 졸중(septic shock), 크론병(Crohn's disease), 건선(psoriasis), 쉴러아데르마 (schleraderma), 이식에 거부에 대한 숙주 질환 (graft versus host disease; GVHD), 동종 이형 섬 이식 거부반응(allogenic islet graft rejection), 혈액 악성 종양(hematologic malignancy), 예를 들어 다발성 골수종(MM), 골수 이형성 증후군(MDS) 및 급성 골수 백혈병(AML), 종양 관련 염증, 주변 신경 손상(peripheral nerve injury) 또는 탈수초성 질환(demyelinating disease).

일면에 있어서, 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체는 부적합한 단백질 발현을 수반하는 질병을 가지는 환자에게 투여된다. 본 발명의 범위 내에서, 이는, 존재하는 단백질의 양에 있어서의 변화, 돌연변이체 단백질의 존재, 또는 이들 둘 모두에 기인하는 이상(aberrant) 단백질을 특징으로 하는 질병 및 질환을 포함하는 것을 의미한다. 이러한 과다는, 이들로 제한되지는 않으나, 분자적 수준에 있어서의 과다 발현, 작용 부위에 있어서의 연장된 또는 축적된 출현, 또는 정상 수준에 비하여 증가된 단백질 활성을 포함하는 임의의 원인에 기인할 수 있다. 이러한 정의 하에, 단백질 감소를 특징으로 하는 질병 및 질환이 포함된다. 그러한 단백질 감소는, 이들로 제한되지는 않으나, 분자적 수준에 있어서의 감소된 발현, 작용 부위에 있어서의 단축된 또는 감소된 출현, 단백질의 돌연변이 형태, 또는 정상 수준에 비하여 감소된 단백질 활성을 포함하는 임의의 원인에 기인할 수 있다. 그러한 단백질 과다 또는 감소는 정상 발현, 출현, 또는 단백질 활성을 기준으로 하여 측정될 수 있으며, 그러한 측정은 본 발명의 항체 및 Fc 융합체의 개발 및/또는 임상적 테스트에 있어 중요한 역할을 담당할 수 있다.

일면에 있어서, 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체는 환자에게 투여되는 단독의 치료학적 활성 제제이다. 대안적으로, 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체는 하나 이상의 기타 치료제와 함께 투여되며, 그러한 제제로는, 이들로 제한되지는 않으나, 세포독성 제제, 화학치료제, 사이토카인, 성장 저해성 제제, 항-체액성 제제, 키나제 저해제, 항-혈관신생 제제, 심장 보호제(cardioprotectant), 또는 기타 치료제들이 포함된다. 이러한 분자들은 의도하는 목적에 유효한 양으로 조합물 내에 안 정되게 존재한다. 숙련된 의사(skilled medical practitioner)라면, 본원에 유용한 기타 치료제의 적합한 용량을 경험에 입각하여 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 항체 및 Fc 융합체는 1종 이상의 기타 치료학적 요법(regimen)과 동시에 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체는 화학 요법, 방사선 요법(radiation therapy), 또는 화학 요법 및 방사선 요법과 병행하여, 환자에게 투여될 수 있다. 일면에 있어서, 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체는, 본 발명의 Fc 변이체를 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있는, 1종 이상의 항체 또는 Fc 융합체와 함께 투여될 수 있다.

일면에 있어서, 본 발명의 항체 및 Fc 융합체는 화학치료제와 함께 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "화학치료제(chemotherapeutic agent)"란, 암의 치료에 유용한 화학적 화합물을 의미한다. 화학치료제의 예는, 이들로 제한되지는 않으나, 다음을 포함한다: 알킬화 제제(alkylating agent), 예를 들어 티오테파(thiotepa) 및 사이클로스포스파미드(cyclosphosphamide; CYTOXAN^TM); 알킬 술포네이트(alkyl sulfonates), 예를 들어 부술판(busulfan), 임프로술판(improsulfan) 및 파이포술판(piposulfan); 아자이라이딘(aziridine), 예를 들어 벤조도파(benzodopa), 카르보큐온(carboquone), 메투레도파(meturedopa), 및 우레도파(uredopa); 에틸렌이민 및 메틸아멜라민(methylamelamine), 예를 들어 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드(trietylenephosphoramide), 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라 민(trimethylolomelamine); 나이트로겐 머스타드(nitrogen mustard), 예를 들어, 클로르암부실(chlorambucil), 클로르나파진(chlornaphazine), 콜로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴(estramustine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로르에타민(mechlorethamine), 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드(mechlorethamine oxide hydrochloride), 멜팔란(melphalan), 노브엠비친(novembichin), 펜에스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 머스타드(uracil mustard); 나이트로수레아스(nitrosureas), 예를 들어 카르무스틴(carmustine), 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 니무스틴(nimustine), 라니무스틴(ranimustine); 항생제(antibiotics), 예를 들어 아클라사이노마이신(aclacinomysin), 아크타이노마이신(actinomycin), 오트라마이신(authramycin), 아자세린, 블레오마이신(bleomycin), 카크타이노마이신(cactinomycin), 칼리케아마이신(calicheamicin), 카라바이신(carabicin), 카마이노마이신(caminomycin), 카르자이노필린(carzinophilin), 크로모마이신(chromomycin), 타크타이노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 테토루바이신(detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루바이신(doxorubicin), 에피루바이신(epirubicin), 에소루바이신(esorubicin), 아이다루바이신(idarubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신(mitomycin), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올라이보마이신(olivomycin), 페플로마이신(peplomycin), 포트파이로마이신(potfiromycin), 퓨 로마이신(puromycin), 큐엘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토나이그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 투베르사이딘(tubercidin), 우베나이멕스(ubenimex), 자이노스타틴(zinostatin), 조루바이신(zorubicin); 항-대사산물(anti-metabolite), 예를 들어 메토트렉세이트(methotrexate) 및 5-플루오로우라신(5-fluorouracil; 5-FU); 폴산(folic acid) 유사체, 예를 들어 데노프테린(denopterin), 메토트렉세이트(methotrexate), 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate); 퓨린(purine) 유사체, 예를 들어 플루다라빈(fludarabine), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 티아미프린(thiamiprine), 티오구아닌(thioguanine); 피리미딘(pyrimidine) 유사체, 예를 들어 안사이타빈(ancitabine), 아자사이타이딘(azacitidine), 6-아자우라이딘(6-azauridine), 카르모푸르(carmofur), 사이타라빈(cytarabine), 디데옥시우리딘(dideoxyuridine), 독시플루우리딘(doxifluridine), 에노사이타빈(enocitabine), 플록스우리딘(floxuridine), 5-FU; 및 로젠즈(rogens), 예를 들어 칼루스테론(calusterone), 드로모스타놀론 프로피오네이트(dromostanolone propionate), 에피티오스타놀(epitiostanol), 메피티오스탄(mepitiostane), 테스토락톤(testolactone); 항-아드레날(anti-adrenals), 예를 들어 아미노글루테트이미드(aminoglutethimide), 마이토탄(mitotane), 트리로스탄(trilostane); 폴산 보충제(folic acid replenisher), 예를 들어 프롤린산(frolinic acid); 아세그락톤(aceglatone); 알도포스파미드 글라코사이드(aldophosphamide glycoside); 아미노레불린산(aminolevulinic acid); 암사크린(amsacrine); 베스트라부 실(bestrabucil); 비스안트렌(bisantrene); 에타트락세이트(edatraxate); 데포파민(defofamine); 데메콜신(demecolcine); 디아자이큐온(diaziquone); 엘포르마이틴(elformithine); 엘리프타이늄 아세테이트(elliptinium acetate); 에토글루사이드(etoglucid); 갈륨 나이트레이트(gallium nitrate); 하이드록시우레아; 렌타이난(lentinan); 로나이다민(lonidamine); 마이토구아존(mitoguazone); 마이톡산트론(mitoxantrone); 모파이다몰(mopidamol); 나이트라크린(nitracrine); 펜토스타틴(pentostatin); 페나메트(phenamet); 파이라루바이신(pirarubicin); 포도파일린산(podophyllinic acid); 2-에틸하이드라자이드; 프로카르바진(procarbazine); PSK^®; 라족산(razoxane); 사이조퓨란(sizofuran); 스파이로게르마늄(spirogermanium); 테누아존산(tenuazonic acid); 트리아자이큐온(triaziquone); 2, 2', 2"-트라클로로트리에틸아민; 우레탄(urethan); 바인데신(vindesine); 다카르바진(dacarbazine); 만노무스틴(mannomustine); 마이토브로나이톨(mitobronitol); 마이토락톨(mitolactol); 파이포브로만(pipobroman); 가사이토신(gacytosine); 아라비노사이드(arabinoside) ("Ara-C"); 사이클로포스파이드(cyclophosphamide); 티오테파; 탁산(taxane), 예를 들어 파클라이탁셀(paclitaxel)(TAXOL^®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세칵셀(docetaxel)(TAXOTERE^®, Rhne-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로르암부실(chlorambucil); 겜시타빈(gemcitabine); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린(mercaptopurine); 메토트렉세이트; 플라티늄 유사체, 예를 들어 시스플라틴(cisplatin) 및 카르보플라 틴(carboplatin); 빈블라스틴(vinblastine); 플라티늄; 에토포사이드(etoposide)(VP-16); 이포스파미드(ifosfamide); 마이토마이신 C; 마이톡산트론(mitoxantrone); 빈트라이스틴(vincristine); 비노렐빈(vinorelbine); 나벨빈(navelbine); 노반트론(novantrone); 테나이포사이드(teniposide); 다우노마이신(daunomycin); 아미노프테린(aminopterin); 젤로다(xeloda); 이반드로네이트(ibandronate); CPT-11; 토포아이소머라아제(topoisomerase) 저해제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(difluoromethylornithine ;DMFO); 레틴산(retinoic acid); 에스페라마이신(esperamicin); 카페시타빈(capecitabine); 타이미딜레이트 신테아제 저해제(thymidylate synthase inhibitor)(예를 들어, Tomudex); 콕스-2 저해제(cox-2 inhibitor), 예를 들어 셀라이콕사이브(celicoxib)(CELEBREX^®) 또는 MK-0966(VIOXX^®); 및 약학적으로 허용 가능한 이들의 염, 산, 또는 유도체. 또한 이러한 정의 하에, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 저해하는 작용을 하는 항-호르몬성 제제, 예를 들어 항-에스트로겐(anti-estrogen), 예를 들어 탐옥시펜(tamoxifen), 랄록시펜(raloxifene), 아로마타아제 저해 4(5)-이미다졸(aromatase inhibiting 4(5)-imidazole), 4-하이드록시탐옥시펜, 트리옥시펜(trioxifene), 케옥시펜(keoxifene), LY 117018, 오나프리스톤(onapristone), 및 토레미펜(toremifene)(Fareston); 및 항-안드로겐(anti-androgen), 예를 들어 플루타마이드(flutamide), 나일루타마이드(nilutamide), 바이칼루타마이드(bicalutamide), 류프롤라이드(leuprolide), 및 고세렐린(goserelin); 및 약학적 으로 허용 가능한 이들의 염, 산, 또는 유도체가 포함된다.

화학치료학적 또는 기타 세포독성 제제가 프로드럭로서 투여될 수 있다. "프로드럭(prodrug)"란, 본원에 사용된 바와 같이, 모체 약물에 비하여 종양 세포에 대한 세포독성이 작은 약학적 활성 물질 및 보다 활성이 큰 모체 형태로 효소적으로 활성화되거나 전환될 수 있는, 전구체 또는 유도체 형태를 의미한다. 이에 대해서는 예를 들어 다음 문헌을 참조한다: Wilman, 1986, Biochemical Society Transactions, 615th Meeting Belfast, 14: 375-382; and Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.): 247-267, Humana Press, 1985. 본 발명에 사용될 수 있는 프로드럭는, 이들로 제한되지는 않으나, 보다 큰 활성의 세포독성이 없는 약물로 전환될 수 있는, 포스페이트-함유 프로드럭, 티오포스페이트-함유 프로드럭, 설페이트-함유 프로드럭, 펩티드-함유 프로드럭, D-아미노산-변형된 프로드럭, 당화된 프로드럭, 베타-락탐-함유 프로드럭, 선택적으로 치환된 펜옥시아세트아미드-함유 프로드럭 또는 선택적으로 치환된 페닐아세트아미드-함유 프로드럭, 5-플루오로사이토신(5-fluorocytosine) 및 기타 5-플루오로우리딘(5-fluorouridine) 프로드럭를 포함한다. 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체와 함께 사용될 수 있는 프로드럭 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예로는, 이들로 제한되지는 않으나, 이상에 개시한 임의의 화학치료제들이 포함된다.

본 발명의 항체 및 Fc 융합체는 기타 치료학적 요법과 함께 조합될 수 있다. 예를 들어, 일면에 있어서, 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체를 이용해 치료될 환자 에게는 또한 방사선 요법을 제공할 수 있다. 방사선 요법은 당업자에게 알려져 있고, 당 기술 분야에서 통상적으로 활용되는 프로토콜에 따라 투여될 수 있다. 그러한 방사선 요법은, 이들로 제한되지는 않으나, 세슘(cesium), 이리듐(iridium), 요오드(iodine), 또는 코발트 방사선 요법을 포함한다. 상기 방사선 요법은 전신 조사(irradiation)에 의하여 실시될 수도 있고, 폐, 방광, 또는 전립선과 같은 신체 내부의 또는 상의 특정 부위 또는 조직에 국부적으로 적용될 수도 있다. 통상적으로, 방사선 요법은 약 1주 내지 2주의 기간에 걸쳐 간헐적으로 투여될 수 있다. 그러나, 상기 방사선 요법은, 이보다 장기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 예를 들어, 방사선 요법은 약 6주 약 7주 동안 두부 또는 목부 암을 가지는 환자에게 투여될 수 있다. 선택적으로, 상기 방사선 요법은, 단일 용량(single dose) 또는 다수회 용량(multiple doses), 또는 순차적인 용량(sequential doses)으로서 투여될 수 있다. 숙련된 의사는 본원에 유용한 방사선 요법의 적합한 용량을 경험에 입각하여 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 또 다른 일면에 따르면, 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체 및 1종 이상의 기타 항암 요법이 체외(ex vivo) 암 세포를 치료하는 데 이용된다. 그러한 체외 치료는 골수 이식(bone marrow transplantation) 및 특히 자가조직(autologous) 골수 이식에 유용할 수 있을 것으로 여겨진다. 예를 들어, 이상에서 설명한 바와 같은, 항체 또는 Fc 융합체 및 1종 이상의 기타 항암 요법을 이용해 암 세포를 가지는 세포 또는 조직(들)의 치료는, 수령 환자 내에 이식하기 이전에 암 세포를 고갈시키거나 또는 실질적으로 고갈시키는 데에 사용될 수 있다. 물론, 본 발명의 항체 및 Fc 융합체는 외과적 수술과 같은 또 다른 치료 학적 기법과 조합하여 이용될 수 있을 것으로 여겨진다.

대안적인 일면에 있어서, 본 발명의 항체 및 Fc 융합체는 사이토카인과 함께 투여된다. "사이토카인(cytokine)"이란, 본원에 사용된 바와 같이, 세포내 매개인자로서 또 다른 하나의 세포에 대하여 작용하는 하나의 세포군에 의하여 방출되는 단백질에 대한 일반적인 용어이다. 그러한 사이토카인의 예로는, 림포카인(lymphokine), 모노카인(monokine), 및 통상적인 폴리펩티드 호르몬이 있다. 그러한 사이토카인으로는 다음과 같은 것들이 있다: 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소의 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone); 타이록신(thyroxine); 인슐린(insulin); 프로인슐린(proinsulin); 렐락신(relaxin); 프로렐락신(prorelaxin); 당단백질 호르몬, 예를 들어 여포 자극 호르몬(follicle stimulating hormone; FSH), 갑상선 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone; TSH), 및 황체 형성 호르몬(luteinizing hormone; LH); 간장 성장 인자(hepatic growth factor); 섬유아세포(fibroblast) 성장 인자; 프로락틴(prolactin); 플라센타 락토젠(placenta lactogen); 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor)-알파 및-베타; 뮤렐라이안-저해 물질(mullerian-inhibiting substance); 마우스 생식선 자극 호르몬(gonadotropin)-관련 펩티드; 인히빈(inhibin); 엑티빈(activin); 혈관 내피 성장인자(vascular endothelial growth factor); 인테그린; 트롬보포이에틴(thrombopoietin; TPO); 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-베타; 혈소판-성장 인자; 형질전환(transforming growth factor; TGF), 예를 들어 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린형 성장인자 I 및 II; 에리 트로포이에틴(erythropoietin; EPO); 골 유도 인자(osteoinductive factor); 인터페론, 예를 들어 인터페론-알파, 인터페론-베타, 및 인터페론-감마; 콜로니 자극 인자(colony stimulating factor; CSF), 예를 들어 대식 세포-CSF (M-CSF); 과립구(granulocyte)-대식 세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터류킨(IL), 예를 들어 IL-1, IL-1알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, 종양 괴사 인자, 예를 들어 TNF-알파 또는 TNF-베타; 및 LIF 및 키트 리간드(kit ligand; KL)를 포함하는 기타 폴리펩티드 인자. 본원에 사용된 바와 같이, 사이토카인이란 용어는, 상기 천연 서열 사이토카인의 생물학적 활성 등가체 및 천연 기원 또는 재조합 세포 배양물 유래의 단백질을 포함한다.

다양한 기타 치료제가 본 발명의 항체 및 Fc 융합체와 함께 사용될 수 있다. 일면에 있어서, 상기 항체 또는 Fc 융합체는 항-혈관신생 제제와 함께 투여된다. "항-혈관신생 제제(anti-angiogenic agent)"란, 본원에 사용된 바와 같이, 혈관(blood vessel)의 발생을 어느 정도 블로킹 또는 방해하는 화합물을 의미한다. 상기 항-혈관신생 인자는, 예를 들어, 혈관형성(angiogenesis)을 촉진하는 데 관여하는 성장 인자 또는 성장 인자 리셉터에 결합하는 작은 분자 또는 단백질, 예를 들어 항체, Fc 융합체, 또는 사이토카인일 수 있다. 본원에 있어서, 바람직한 항-혈관신생 인자는 혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor; VEGF)에 결합하는 항체이다. 대안적인 일면에 있어서, 상기 항체 또는 Fc 융합체는 적응성 면역 반응을 유도하거나 증진시키는 치료제, 예를 들어 CTLA-4를 표적화하는 항체와 함께 투여된다. 대안적인 일면에 있어서, 상기 항체 또는 Fc 융합체는 타 이로신 키나제 저해제와 함께 투여된다. "타이로신 키나제 저해제(tyrosine kinase inhibitor)"란, 본원에 사용된 바와 같이, 타이로신 키나제의 타이로신 키나제 활성을 어느 수준으로 저해하는 분자를 의미한다. 그러한 타이로신 키나제 저해제의 예로는, 이들로 제한되지는 않으나, 다음과 같은 것들이 포함된다: 퀴나졸린(quinazoline), 예를 들어 PD 153035, 4-(3-클로로아닐리노)퀴나졸린; 피리도피리미딘(pyridopyrimidine); 피리미도피리미딘(pyrimidopyrimidine); 피롤로피리미딘(pyrrolopyrimidine), 예를 들어 CGP 59326, CGP 60261 및 CGP 62706; 피라졸로피리미딘(pyrazolopyrimidine), 4-(페닐아미노)-7H-피롤로(2,3-d)피리미딘; 쿠르쿠민(curcumin) (디페룰로일 메탄(diferuloyl methane), 4,5-비스(4-플루오로아닐리노)프탈이미드); 나이트로티오펜 모이어티(nitrothiophene moiety)를 함유하는 티르포스틴(tyrphostine); PD-0183805 (Warner-Lambert); 안티센스(antisense) 분자 (예를 들어, ErbB-코딩 핵산에 결합하는 것들); 퀴녹살린(quinoxaline) (US 5,804,396); 트립호스틴(tryphostin) (US 5,804,396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering A G); pan-ErbB 저해제, 예를 들어 C1-1033 (Pfizer); 아피니탁(Affinitac) (ISIS 3521; Isis/Lilly); 임마티닙 메실레이트(Imatinib mesylate) (STI571, Gleevec^®; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016(Glaxo Smith Kline); C1-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); 세막시닙(Semaxinib) (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering A G); INC-1C11 (Imclone); 또는 하기의 공보 중 하나에 개시된 것들: US 5,804,396; PCT WO 99/09016 (American Cyanimid); PCT WO 98/43960 (American Cyanamid); PCT WO 97/38983 (Warner-Lambert); PCT WO 99/06378 (Warner-Lambert); PCT WO 99/06396 (Warner-Lambert); PCT WO 96/30347 (Pfizer, Inc); PCT WO 96/33978 (AstraZeneca); PCT W096/3397 (AstraZeneca);PCT WO 96/33980 (AstraZeneca), 제피티닙(gefitinib) (TRESSA™, ZD1839, AstraZeneca), 및 OSI-774(Tarceva™, OSI Pharmaceuticals/Genentech).

Fc 융합(전술한 바 참조) 또는 항체- 또는 FC 융합-접합체(이하 참조)를 제조하기 위해 본 발명의 용도에서 여러가지 링커들을 볼 수 있다. "링커", "링커 서열", "공간", "테트링(tethering) 서열" 또는 문법상 등가물은, 본원에서 두개의 분자를 연결하여 바람직한 배위로 두 분자들이 위치되도록 제공하는 분자 또는 분자군(예, 모노머 도는 폴리머)이다. 링커 분자들을 공유결합으로 통합하기 위해 사용될 수 있는 수많은 방법들이 있다. 이로는, 단백질 또는 단백질 도메인의 N- 및 C-말단간의 폴리펩티드 연결, 이황화 결합을 통한 연결, 화학적 가교 반응제를 통한 연결을 포함하나 이에 한정되진 않는다. 이러한 예의 일측면에서, 링커는 재조합 기술 도는 펩티드 합성에 의해 생성된 펩티드 결합이다. 두개의 폴리펩티드 체인이 연결되어 지는 특정 조건에 있어 적합한 링커의 선택은 다양한 파라미터에 의존적이며, 상기 파라미터로는 두개의 폴리펩티드 체인의 특성(예, 이들이 자연적으로 올리고머화되었는지), 공지된 경우 N- 과 C-말단 사이의 거리, 및/또는 단백질 분해 및 산화에 대한 링커 안정성을 포함하지만, 이에 한정되진 않는다. 또한, 상기 링커는 유연성을 제공하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 따라서, 링커 펩티드는 하기 아미노산 잔기를 우세적으로 포함할 수 있다: Gly, Ser, Ala, 또는 Thr. 링커 펩티드는 서로 상대적으로 정확한 구조를 취하여 적합한 활성을 유지하는 방식으로 두가지 물질을 연결하기에 적합한 길이를 가져야 한다. 상기 목적에 적합한 길이는, 적어도 30개 또는 30개 이하의 아미노산 잔기를 포함한다. 바람직하기로는, 링커는 약 1 내지 30개의 아미노산 길이이며, 바람직하기로는 1, 2, 3, 4,5, 6,7, 8,9, 10,11, 12,13, 14,15, 16,17, 18 19 및 20개의 아미노산 길이이다. 또한, 링커 펩티드에 함유되는 것으로 선별된 아미노산 잔기는, 폴리펩티드의 활성을 현저하게 방해하지 않는 특성을 가져야 한다. 따라서, 전체 링커 펩티드는 폴리펩티드 활성과 무관하거나 또는 내부 폴딩 또는 리셉터 모노머 도메인의 결합을 심각하게 방해하는 하나 이상의 모노머에서 아미노산 잔기와의 그외 결합 형성 또는 상호작용을 방해하는 전하를 띄지 않아야 한다. 유용한 링커로는, 당업자라면 이해가능한 바와 같이, 글리신-세린 폴리머(예로 (GS)n, (GSGGS)n((서열번호 6), (GGGS)n(서열번호 7) 및 (GGGS)n(서열번호 8)을 포함함, 상기에서 n은 1이상의 정수이다), 글리신-알라닌 폴리머, 알라닌-세린 폴리머, 및 셰이커 칼륨 채널에 대한 테터(tether) 및 그외 다수의 유연성 링커와 같은 다른 유연성 링커를 포함한다. 이들 두개의 아미노산은 비교적 비조직적이며, 따라서 성분 사이에 중성의 테터로 제공할 수 있어, 글리신-세린 폴리머가 바람직하다. 두번째로, 세린은 친수성이므로, 구형의 글리신 체인일 수 있는 것을 가용화할 수 있다. 세번째로, 유사 체인은 단일 체인 항체와 같은 재조합 단백질의 서브유닛을 연결하기에 효과적인 것으로 입증되었다. 적합한 링커는 또한 두개의 폴리펩티드 체인 사이의 갭을 연결할 수 있는 천연 모티프에 대해 공지된 3차 구조 데이타베이스를 스크리닝함으 로써 확인할 수 있다. 바람직한 예에서, 링커는 인간 환자에게 투여되었을때 면역반응을 발생시키지 않는다. 따라서 링커는 면역원성이 낮거나 또는 면역원성이 낮은 것으로 추정되는 것을 선택할 수 있다. 예컨대, 인간에게서 본래 존재하는 링커를 선별할 수 있다. 바람직한 예에서, 링커는 항체 Fab와 Fc 부위를 연결하는 서열인, 항체의 힌지(hinge) 서열을 가진다. 또한 링커는 힌지 부위의 일부 또는 항체의 힌지 부위와 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 서열을 가진다. 적합한 링커를 수득하는 다른 방법은, 간단한 링커 예컨대 (Gly4Ser)n를 무작위적 돌연변이 유발을 통해 최적화하는 것이다. 또한 적합한 폴리펩티드 링커가 확정되면, 연결되는 도메인과 보다 더 최적으로 상호작용하는 아미노산을 선택하기 위해, 부가적인 링커 폴리펩티드가 창출될 수 있다. 그외 본 발명에 사용될 수 있는 링커 타입으로는, 인위적인 폴리펩티드 링커 및 인테인(intein)이 있다. 다른 예에서, 이황화 결합은 두개의 분자를 연결하기 위해 설계된다. 다른 예에서, 링커는 화학적 가교제이다. 예를 들면, 여러가지 이중 작용성을 가지는 단백질 커플링제를 사용할 수 있으며, 비제한적으로 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란(iminothiolane; IT), 이미도에스테르의 이중 작용성 유도체(예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르(예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트(disuccinimidyl suberate)), 알데하이드(예를 들어, 글루타르알데하이드(glutareldehyde)), 비스-아자이도 화합물(예를 들어, 비스(p-아자이도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들어, 비스(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아 민), 디이소시아네이트(예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디나이트로벤젠)을 포함한다. 예를 들어, 리신 면역독소(ricin immunotoxin)는, Vitetta et al., 1971, Science 238: 1098에 설명된 바와 같이 제조될 수 있다. 화학적 링커는 동위원소에 킬레이션을 할 수도 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 대한 방사능 뉴클레오타이드(radionucleotide)의 접합을 위한 예시적인 킬레이팅화 제제(chelating agent)이다(PCT WO 94/11026). 링커(linker)는 세포 내에서 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 절단 가능한 링커일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성(acid-labile) 링커, 펩티다아제(peptidase)-감수성(sensitive) 링커, 디메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커(Chari et al., 1992, Cancer Research 52: 127-131)가 사용될 수 있다. 대안적으로, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함한, 여러가지 비단백질성 폴리머를 링커로 사용할 수 있으며, 본 발명의 Fc 변이체를 융합 파트너에 연결하여 Fc 융합체를 제조하거나 또는 항체 또는 본 발명의 Fc 융합체를 연결하여 접합체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.

일예에서, 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체는 본원에서 접합체라고 나타낸 다른 치료학적 화합물에 접합되거나 또는 작동가능하도록 연결된다. 상기 접합체는, 세포독성 제제, 화학치료학적 제제, 사이토카인, 항-혈관신생 제제, 티로신 키나제 저해제, 독소, 방사선동위원소 또는 기타 치료학적으로 활성형의 제제일 수 있다. 화학치료학적 제제, 사이토카인, 항-혈관신생 제제, 티로신 키나제 저해제 및 기타 치료학적으로 활성형의 제제는 상기에 기술되어 있으며, 전술한 모든 치료제는 항체 또는 Fc 융합 접합체로서의 용도를 가질 수 있다. 다른 예로, 항체 또는 Fc 융합체는, 이들로 제한되지는 않으나, 그의 단편 및/또는 변이체를 포함하는, 박테리아, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 작은 분자 독소 및 효소적으로 활성인 독소를 포함하는 독소에 접합되거나 작동가능하도록 연결된다. 작은 분자 독소는, 이들로 제한되지는 않으나, 칼리케마이신(calicheamicin), 메이탄신(maytansine) (US 5, 208,020), 트리코텐(trichothene), 및 CC1065를 포함한다. 본 발명의 일면에 있어서, 상기 항체 또는 Fc 융합체는 하나 이상의 메이탄신 분자 (예를 들어, 약 1개 약 10개 메이탄신 분자/항체 분자)에 접합된다. 메이탄신은, 예를 들어 May-SH3으로 환원되며 변형된 항체 또는 Fc 융합체와 반응할 수 있는 May-SS-Me로 전환되어 (Chari et al., 1992, Cancer Research 52: 127-131), 메이탄시노이드-항체 또는 메이탄시노이드-Fc 융합체 접합체를 생성할 수 있다. 또 다른 하나의 관심 접합체는, 하나 이상의 칼리케마이신 분자에 접합된 항체 또는 Fc 융합체를 포함한다. 상기 칼리케마이신 부류의 항생제는 피코몰(picomolar) 이하의 농도에서 2중 가닥 DNA의 파괴를 야기할 수 있다. 사용 가능한 칼리케마이신의 구조적 유사체는, 이들로 제한되지는 않으나, γ₁ ¹, α₂ ¹, α₃, N-아세틸-γ₁ ¹, PSAG, 및 θ₁ ¹을 포함한다 (Hinman et al., 1993, Cancer Research 53: 3336-3342; Lode et al., 1998, Cancer Research 58: 2925-2928) (US 5,714,586; US 5,712,374; US 5, 264,586; US 5,773,001). 돌라스타틴(dolastatin) 10 유사체, 예를 들어 아우리스타틴(auristatin) E(AE) 및 모노메틸아우리스타틴(monomethylauristatin E; MMAE)이 본 발명의 Fc 변이체에 대한 접합체로서 사용될 수 있다 (Doronina et al., 2003, Nat Biotechnol 21 (7): 778-84; Francisco et al., 2003 Blood 102 (4): 1458-65). 유용한 효소적 활성 독소는, 이들로 제한되지는 않으나, 디프테리아(diphtheria) A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 엑소톡시(exotoxin) A 쇄 (Pseudomonas aeruginosa 유래), 리신 A 쇄, 아브린(abrin) A 쇄, 모덱신(modeccin) A 쇄, 알파-사르신(sarcin), 알류라이트 포르디 단백질(Aleurites fordii protein), 디안틴(dianthin) 단백질, 파이톨라카 아메리카나 단백질(Phytolaca americana protein) (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모로디카 차란티아(momordica charantia) 저해제, 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 저해제, 젤로닌(gelonin), 마이토젤린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin), 및 트리코테센(tricothecene)을 포함한다. 이에 대해서는, 예를 들어, PCT WO 93/21232를 참조한다. 본 발명은, 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체, 및 뉴클레오타이드 분해 활성(nucleolytic activity)을 가지는 화합물, 예를 들어 리보뉴클레아제(ribonuclease) 또는 DNA 엔도뉴클레아제(endonuclease), 예를 들어 데옥시리보뉴클레아제(deoxyribonuclease; DNase) 사이에 형성된 접합체 또는 융합체를 추가로 포함한다.

대안적인 일면에 있어서, 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체는, 방사성 접합체 를 형성하는 방사성 동위원소에 접합되거나 작동가능하도록 연결될 수 있다. 다양한 방사능 활성(radioactive) 동위원소가, 방사성 접합체 항체 및 Fc 융합체의 제조에 이용 가능하다. 그러한 방사능 활성 동위원소의 예로는, 이들로 제한되지는 않으나, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², 및 Lu의 방사능 활성 동위원소가 포함된다.

또 다른 일면에 있어서, 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체는, 종양의 사전-표적화에 이용하기 위하여, "리셉터(receptor)" (예를 들어, 스트렙트아비딘(streptavidin))에 접합될 수 있으며, 이때, 항체-리셉터 또는 Fc 융합체-리셉터 접합체를 환자에게 투여한 후, 제거용 제제(clearing agent)를 이용하여 결합되지 않은 접합체를 순환계로부터 제거한 뒤, 세포독성 제제(예를 들어, 방사성 뉴클레오타이드)에 접합된 "리간드"(예를 들어, 아비딘)를 투여한다. 대안적인 일면에 있어서, 상기 항체 또는 Fc 융합체는, 항체 의존성 효소-매개의 프로드럭 요법(Antibody Dependent Enzyme Mediated Prodrug Therapy; ADEPT)을 이용하기 위하여 효소에 접합되거나 작동가능하도록 연결된다. ADEPT는 상기 항체 또는 Fc 융합체는, 프로드럭를 전환시키는 프로드럭-활성화 효소(예를 들어, 펩티딜 화학치료제, 참조: PCT WO 81/01145)에 접합시키거나 작동가능하도록 연결시킴으로서 사용될 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, PCT WO88/07378 및 US 4,975, 278을 참조한다. ADEPT에 유용한 면역접합체의 효소 성분은, 활성, 세포독성이 보다 큰 형태로 전환시키는 방식으로 프로드럭에 대하여 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한 다. 본 발명의 방법에 유용한 효소는, 이들로 제한되지는 않으나, 다음과 같은 것들을 포함한다: 알칼리성 포스파타아제: 포스페이트-함유 프로드럭를 유리된 약물로 전환시키는 데 유용함; 아릴술페이타아제(arylsulfatase): 설페이트-함유 프로드럭를 유리된 약물로 전환시키는 데 유용함; 사이토신 데아미나제(cytosine deaminase): 비독성 5-플루오로사이토신(fluorocytosine)을 항암 약물인 5-플루오로우라실(fluorouracil)로 전환시키는 데 유용함; 프로테아제, 예를 들어 세라티아 프로테아제(serratia protease), 테르몰라이신(thermolysin), 서브틸리신(subtilisin), 카르복시펩티다아제, 및 카텝신(cathepsin) (예를 들어, 카텝신 B 및 L): 펩티드-함유 프로드럭를 유리된 약물로 전환시키는 데 유용함; D-알라닐카르복시펩티다아제: D-아미노산 치환체를 함유하는 프로드럭를 전환시키는 데 유용함; 탄수화물-절단 효소, 예를 들어 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase) 및 뉴라미미다아제(neuramimidase): 당화 프로드럭를 유리된 약물로 전환시키는 데 유용함; 베타-락라마아제: 알파-락탐으로써 유도체화된 약물을 유리된 약물로 전환시키는 데 유용함; 및 페니실린 아미다아제(penicillin amidase), 예를 들어 페니실린 V 아미다아제 또는 페니실린 G 아미다아제: 각각 펜옥시아세틸기 또는 페닐아세틸기로써 그들의 아민 나이트로겐에 대하여 유도체화된 약물을 유리된 약물로 전환시키는 데 유용함. 대안적으로, 당 기술 분야에 "압자임(abzyme)"이라고도 알려진 효소적 활성을 가지는 항체 또한, 본 발명의 프로드럭를 유리된 활성 약물로 전환시키는 데에 사용될 수 있다 (참조: Massey, 1987, Nature 328: 457-458). 항체-압자임 및 Fc 융합체-압자임 접합체는 종양 세포군으로 상기 압자임을 전달하기 위 하여 제조될 수 있다.

본 발명의 항체 및 Fc 융합체의 기타 변형된 형태도 본원에 포함된다. 예를 들어, 상기 항체 또는 Fc 융합체는, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 코폴리머와 같은, 다양한 비단백질성 폴리머 중 하나에 결합될 수 있다.

본 발명의 항체 또는 Fc 융합체 및 1종 이상의 치료학적 활성 제제가 제형화된 약학적 조성물도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체 및 Fc 융합체의 포뮬레이션(Formulation)은, 동결 건조된 포뮬레이션 또는 수용액의 형태로, 원하는 순도를 가지는 항체 또는 Fc 융합체를 선택적인 약학적으로 허용 가능한 캐리어, 부형제(excipient) 또는 안정화제(stabilizer)와 혼합함으로써 보관용으로 제조된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980). 허용 가능한 캐리어, 부형제, 또는 안정화제는, 사용되는 용량 및 농도에서 수령체에 대하여 비독성인 것으로서, 다음과 같은 것들을 포함한다: 버퍼, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트, 및 기타 유기산; 항산화제(antioxidant), 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제(preservative) (예를 들어, 아스코타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드(asoctadecyldimethylbenzyl ammonium chloride); 헥사메티오늄 클로라이드(hexamethonium chloride); 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 벤제티오늄 클로라이드(benzethonium chloride); 페놀,, 부틸 오르벤질 알코올 (butyl orbenzyl alcohol); 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜(catechol); 레조르시놀(resorcinol); 사이클로헥산올(cyclohexanol); 3-펜탄올(pentanol); 및 m-크로솔(cresol); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머(hydrophilic polymer), 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글라이신(glycine), 글루타민(glutamin), 아스파라긴(asparagine), 히스티딘(histidine), 아르기닌(arginine), 또는 라이신(lysine); 당당류(monosaccharide), 이당류(disaccharide), 및 만노오스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이팅화 제제, 예를 들어 EDTA; 당(sugar), 예를 들어 수크로오스(sucrose), 만니톨(mannitol), 트레할로오스(trehalose) 또는 소르비톨(sorbitol); 감미제(sweetener) 및 기타 향미제(flavoring agent); 충전제(filler), 예를 들어 미세결정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 락토오스, 옥수수 전분 및 기타 전분; 결합 제제; 첨가제; 착색제(coloring agent); 염-형성 반대이온(salt-forming counterion), 예를 들어 소듐; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제(non-ionic surfactant), 예를 들어 TWEEN, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 바람직한 일면에 있어서, 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체를 포함하는 약학적 조성물은 수용성 형태로서, 약학적으로 허용 가능한 염으로서 존재하며, 이는 산 및 염기 부가 염 모두를 포함하는 것을 의미한다. "약학적으로 허용 가능한 산 부가 염(pharmaceutically acceptable acid addition salt)"이란, 유리된 염기의 생물학적 유효성을 유지하며, 생물학적으로나 기타 측면에서 바람직한 염을 일컬으며, 이들은 염산, 붕산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산, 및 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브 산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등과 같은 유기산과 함께 형성된다. "약학적으로 허용 가능한 염기 부가 염(pharmaceutically acceptable base addition salt)"은, 소듐, 포타슘, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 염 등과 같은 무기 염기로부터 유도되는 것들을 포함한다. 특히 바람직한 것은 암모늄, 포타슘, 소듐, 칼슘, 및 마그네슘 염이다. 약학적으로 허용 가능한 비-독성 유기 염기로부터 유래되는 염은, 1차, 2차, 및 3차 아민, 천연 발생의 치환된 아민을 포함하는 치환된 아민, 환형 아민, 및 염기성 이온 교환 수지, 예를 들어 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 및 에탄올아민의 염을 포함한다. 생체내 투여에 사용되는 포뮬레이션(formulation)은 살균되는 것이 바람직하다. 이는 살균 여과 막 또는 기타 방법을 통한 여과에 의하여 용이하게 수행될 수 있다.

본원에 개시된 항체 및 Fc 융합체는 면역리포솜(immunoliposome)으로서 제형화될 수 있다. 리포솜은 포유류에 대한 치료제의 전달에 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질, 및/또는 계면활성제를 포함하는 작은 소포(vesicle)이다. 상기 항체 또는 Fc 융합체를 함유하는 리포솜은, Epstein et al., 1985, Proc Natl Acad Sci USA, 82:3688; Hwang et al., 1980, Proc Natl Acad Sci USA, 77:4030; US 4,485,045; US 4,544,545; 및 PCT WO 97/38731에 개시된 것들과 같은 당 기술 분야에 공지된 방법에 의해 제조된다. 증진된 순환 시간(circulation time)을 가지는 리포솜은 US 5,013,556에 개시되어 있다. 리포솜의 성분은 일반적으로 생물학적 막의 지질 배열에 유사한 이중층 형태로 배열된다. 특히 유용한 리포솜은, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용해 역상 증발(reverse phase evaporation) 방법을 통해 제조할 수 있다. 리포솜은, 원하는 직경을 가지는 리포솜을 수득하기 위하여, 소정의 구경의 필터를 통해 압출된다. 화학치료제 또는 기타 치료학적 활성 제제가 선택적으로 리포솜 내에 함유된다 (Gabizon et al., 1989, J National Cancer Inst 81:1484).

항체, Fc 융합체, 및 기타 치료학적 활성 제제는 또한, 이들로 제한되지는 않으나, 코아세르베이션 기법(coacervation technique), 계면 중합(interfacial polymerization) (예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐(gelatin-microcapsule), 또는 폴리-(메틸메타크릴레이트)마이크로캡슐 이용), 콜로이드 약물 전달 시스템(colloidal drug delivery system) (예를 들어, 리포솜(liposome), 알부민 마이크로스피어(albumin microsphere), 마이크로에멀젼(microemulsion), 나노 입자(nano-particle) 및 나노 갭슐(nanocapsules), 및 매크로에멀젼(macroemulsion)을 포함하는 방법에 의하여, 마이크로캡슐 내에 포획(entrap)될 수 있다. 그러한 기법들은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980에 개시되어 있다. 지속-방출형 제제(sustained-release preparation)가 제조될 수 있다. 지속-방출형 제제의 적합한 예는, 성형된 입자(shaped article), 예를 들어 필름(film), 또는 마이크로캡슐 형태의 고형 소수성(hydrophobic) 폴리머의 반투과성 매트릭스(semipermeable matrix)를 포함한다. 지속-방출형 매트릭스의 예로는, 다음과 같은 것들이 포함된다: 폴리에스테르, 하이드로겔(hydrogel) (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드(polylactide) (US 3,773,919), L-글루타르산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머, 비분해성(non-degradable) 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성(degradable) 락트산-글리콜산 코폴리머, 예를 들어 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜 코폴리머 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성되는 주사 가능한 마이크로스피어), 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산, 및 폴리-DL-락타이드-코-글리콜라이드(PLG)의 매트릭스 내로 혼입된 원하는 생활성 분자로 구성되는 마이크로스피어계 전달 시스템인 ProLease^® (Alkermes로부터 상업적으로 입수 가능함).

상기 포뮬레이션 내에서, 치료학적으로 활성인 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체의 농도는 약 0.1 중량% 내지 100 중량%의 범위에서 가변적일 수 있다. 바람직한 일면에 있어서, 상기 항체 또는 Fc 융합체의 농도는 0.003몰 내지 1.0몰 범위 내이다. 환자를 치료하기 위하여, 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체의 치료학적 유효 용량이 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "치료학적 유효 용량(therapeutically effective dose)"이란, 투여되어 효과를 일으키는 용량을 의미한다. 정확한 용량은 치료 목적에 따라 결정될 것이며, 당업자는 공지된 방법을 이용하여 그 용량을 결정할 수 있을 것이다. 투여량(dosage)은 단위 체중(kg)에 대하여 0.01 내지 100 mg/kg 이상, 예를 들어 0.1, 1, 10, 또는 50 mg/kg 범위일 수 있으며, 1 내지 10mg/kg 범위가 바람직하다. 당 기술 분야에 공지된 바와 같이, 항체 또는 Fc 융합체 분해, 전신 전달 대 국소 전달, 및 새로운 프로테아제 합성 속도, 그리고 연령, 체중, 전반적인 건강 상태, 성별, 식이, 투여 시간, 약물 상호 작용, 및 증상의 경중에 따른 조정(adjustment)이 필요할 수 있으며, 당업자라면 일상적인 실험을 통해 이를 결정 할 수 있을 것이다.

바람직하게는 살균된 수용액(sterile aqueous solution) 형태의, 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체를 포함하는 약학적 조성물의 투여는, 이들로 제한되지는 않으나, 다음과 같은 다양한 경로를 통해 이루어질 수 있다: 경구(orally), 피하(subcutaneously), 정맥내(intravenously), 비내(intranasally), 이내(intraotically), 경피(transdermally), 국소(topically) (예를 들어, 젤, 고약(salve), 로션(lotion), 크림(cream) 등), 복막내(intraperitoneally), 근육내(intramuscularly), 폐내(intrapulmonary) (예를 들어, AERx^® 흡입 가능한 기술(inhalable technology): Aradigm으로부터 상업적으로 입수 가능함, 또는 Inhance^TM폐 전달 시스템(enhance pulmonary delivery system): Inhale Therapeutics로부터 상업적으로 입수 가능함), 경(vaginally), 비경구(parenterally), 직장(rectally), 또는 안내(intraocularly) 경로. 일부의 경우, 예를 들어 상처 또는 염증 등을 치료하는 경우, 상기 항체 또는 Fc 융합체는 용액 또는 스프레이(spray)로서 직접 적용될 수 있다. 따라서, 당 기술 분야에 공지된 바와 같이, 상기 약학적 조성물은 투여 방식에 따라 제형화될 수 있다.

조작 방법(Engineering Method)

본 발명은 Fc 변이체을 제조하는 데 사용될 수 있는 조작 방법을 제공한다. 종래 기술에 있어 Fc 조작을 어렵게 해왔던 주된 장애는, 부분적으로는 조작 전략 및 방법의 비능률에 기인하며, 항체 생산 및 스크리닝의 낮은 처리 수준에 기인하여, 변형에 있어 단지 무작위적 시도만이 가능하였다는 점이다. 본 발명은 이러한 단점들을 극복하는 조작 방법을 제시한다. 다양한 설계 전략, 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 방법, 라이브러리 제작 방법, 및 실험적 생산 및 스크리닝 방법이 고려된다. 이들 전략, 접근법, 기법, 및 방법은, 최적화된 Fc 변이체를 조작하기 위하여, 개별적으로 또는 조합적으로 적용될 수 있다.

* 설계 전략

원하는 특성에 대하여 최적화된 Fc 변이체를 조작하는 가장 효과적인 접근법은, 그 목적에 따라 조작 과정을 지정하는 것이다. 따라서, 본 발명은 최적화된 Fc 변이체를 조작하는 데 사용될 수 있는 설계 전락을 교시한다. 설계 전략의 사용은 Fc 조작을 가이드하는 것을 의미하며, 그것을 조작하는 데 사용된 설계 전략을 기준으로 하는 몇몇 최적화된 특성에 대하여 Fc 변이체를 제한하는 것을 의미하지는 않는다. 먼저, 이는 상충적인(counterintuitive) 것으로 보일 수 있으나, 그의 유효성은 단백질 및 단백질-단백질 복합체의 구조, 안정성, 용해성, 및 기능을 측정하는 미소한 상호 작용의 막대한 복잡성으로부터 유래한다. 어떠한 단백질 위치, 잔기, 상호 작용 등이 설계 목적에 있어 중요한 것인 지를 예측하기 위하여 노 력할 수는 있으나, 종종 결정적인 것은 예측이 불가능하다. 단백질 구조, 안정성, 용해성, 및 기능에 대한 효과는, 유망하거나 유망하지 않거나에 관계없이, 흔히 예측하기가 어렵다. 또한, 단백질에 대하여 불리한 또는 유해한 무수한 아미노산 변형이 존재한다. 그러므로, 종종 최상의 접근법은, 일반적으로 설계에 집중되나, 유해한 효과를 야기하지 않는 단백질 변이체의 제작으로부터 유래한다. 이러한 방식으로, 설계 전략의 주요 목표는 질적 다양성의 야기일 수 있다. 극히 단순한 수준에서, 이는 사용자의 기호에 있어 승산의 누적을 생각하는 것일 수 있다. 일례로서, 탄수화물 및 도메인-도메인 각도가 어떠한 방식으로 Fc의 특성들을 좌우하는 지는 잘 이해되지 않았음에도 불구하고, 이하에서 설명하는 바와 같이, Fc 탄수화물 또는 특정 도메인-도메인 각도의 동요는 최적화된 Fc 변이체를 제작하는 유효한 설계 전략이다. 즉, 질적 다양성에 의하여 스크리닝되는 불리한 아미노산 변형의 수를 감소시킴으로써, 이들 설계 전략이 실용 단계에 접어들게 되었다. 그러므로, 본 발명에 있어서의 설계 전략의 참된 가치는 유용한 Fc 변이체를 제작하고자 하는 조작을 가이드하는 능력에 있다. 얻어진 변이체 중 임의의 하나의 특이적인 가치는 실험 후 측정된다.

Fc 변이체를 조작하는 설계 전략은, Fc와 일부 Fc 리간드의 상호 작용이 Fc 및 Fc 리간드 사이의 경계면에서 아미노산 변형을 조작함으로써 변경되는 방식으로 제공된다. 본원에 있어서, Fc 리간드는, 이들로 제한되지는 않으나, FcγR, C1q, FcRn, 단백질 A 또는 G 등을 포함할 수 있다. 결합 경계면에 영향을 주는 Fc 위치에서의 활발한 알맞은 치환을 통하여, 변이체들은 새로운 경계면 배위를 샘플링하 게 조작될 수 있으며, 그러한 새로운 경계면 형태에 있어, 일부는 상기 Fc 리간드에 대한 결합을 향상시킬 수 있고, 일부는 Fc 리간드 결합을 감소시킬 수 있으며, 일부는 기타 유리한 특성을 가질 수 있다. 그러한 새로운 경계면 형태는, 상기 경계면을 형성하는 Fc 리간드 잔기와의 직접적인 상호 작용을 야기할 수도 있고, 측쇄 또는 골격 형태의 동요와 같은, 상기 아미노산 변형에 의하여 유발되는 간접적인 효과를 야기할 수도 있다. 가변 위치는 경계면의 형태를 결정함에 있어 중요한 역할을 담당하는 것으로 여겨지는 임의의 위치로서 선택될 수 있다. 예를 들어, 가변 위치는, 예를 들어 Fc 리간드와 직접 접촉하는 임의의 잔기의 5 옹스트롬(Å), 바람직하게는 1 내지 10 Å 길이 이내의 잔기의 세트로서 선택될 수 있다.

Fc 변이체를 제작하는 부가적인 설계 전략은, N297의 Fc 탄수화물의 형태가 최적화되는 방식으로 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, 최적화는 원하는 특성, 예를 들어 FcγR에 대하여 증가된 또는 감소된 친화성을 야기하는 N297 탄수화물에 있어서의 형태적 및 조성적 변화를 포함하는 것을 의미한다. 이러한 전략은 탄수화물 구조 및 형태가 Fc/FcγR 및 Fc/C1q 결합에 유의하게 영향을 준다는 연구 결과에 의하여 지지된다 (Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17: 176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74: 288-294; Mimura et al., 2001, J Biol Chem 276: 45539-45547; Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276: 16478-16483; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277: 26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278: 3466-3473). 그러나, 상기 탄수화물은 FcγR과 특이적으로 접촉하지 않는다. 탄수화물과 상호 작용하는 위치에서의 활발한 알맞은 치환을 통하여, 변이 체의 질적 다양성은 새로운 탄수화물 배위를 샘플링하도록 조작될 수 있다. 이들 중 일부는 하나 이상의 Fc 리간드에 대한 결합을 향상시킬 수 있으며, 일부는 그러한 결합을 감소시킬 수 있다. Fc/탄수화물 경계면에 근접한 대부분의 돌연변이는 탄수화물 배위를 변경시키는 것으로 여겨지는 반면, 일부 돌연변이는 당화 조성을 변경시키는 것으로 확인된 바 있다 (Lund et al., 1996, J Immunol 157: 4963-4969; Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82: 57-65).

Fc 변이체를 제작하는 또 다른 하나의 설계 전략은 Cγ2 및 Cγ3 도메인 사이의 각도가 최적화되는 방식으로 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, 최적화는 원하는 특성, 예를 들어 FcγR에 대하여 증가된 또는 감소된 친화성을 야기하는 Cγ2-Cγ3 도메인 각도에 있어서의 형태적 변화를 설명하는 것을 의미한다. 이 각도는 Fc/FcγR 친화성에 대한 중요한 결정인자이며 (Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276: 16478-16483), Fc/FcγR 경계면으로부터 원거리에 위치하는 다수의 돌연변이는 이를 조절함으로써 잠재적으로 결합에 영향을 준다 (Shields et al., 2001, J Biol Chem 276: 6591-6604). Cγ2-Cγ3 각도 및 서로에 대한 도메인의 가요성(flexibility)을 결정하는 데 있어 중요한 역할을 담당하는 것으로 여겨지는 위치에서의 활발한 알맞은 치환을 통하여, 변이체의 질적 다양성이 새로운 각도 및 가요성 수준을 샘플링하도록 설계될 수 있으며, 일부는 원하는 Fc 특성에 대하여 최적화될 수 있다.

Fc 변이체를 제작하는 또 다른 하나의 설계 전략은, Fc를 당화에 대한 구조적 및 기능적 의존성을 제거하도록 조작하는 방식으로 제공된다. 이러한 설계 전 략은, N297 탄수화물의 부재 하에, Fc 구조, 안정성, 용해성, 및/또는 Fc 기능(예를 들어, Fc for 하나 이상의 Fc 리간드에 대한 Fc의 친화성)의 최적화를 포함한다. 하나의 접근법에 있어서, 당화의 부재 하에 용매(solvent)에 노출되는 위치는, 그들이 안정되고, Fc 구조와 구조적으로 일치하며, 응집하는 경향을 갖지 않도록 조작된다. Cγ2는 단지 항체 내의 짝지어지 않은 Ig 도메인이다 (도 1 참조). 그러므로, 상기 N297 탄수화물은, Fc의 안정성 및 구조적 무결성을 유지시키는 동시에, Cγ2 도메인을 중심축에 걸쳐 응집되지 않도록 하면서, 정상적으로 또 다른 Ig 도메인과의 단백질-단백질 상호 작용에 대한 경계면이 되는 노출된 소수성 패치를 은폐시킨다. 비당화된 Fc를 최적화하는 접근법은, 이들로 제한되지는 않으나, Cγ2-Cγ2 다이머(dimer) 축을 향해 안쪽으로 향하는 극성 및/또는 전하는 띠는 잔기의 혼입에 의한, 비당화된 Fc 안정성 및/또는 용해성을 증진시키는 아미노산 변형의 설계, 및 기타 Fc 리간드로써 비당화된 Fc/FcγR 경계면 또는 비당화된 Fc의 경계면을 직접적으로 증진시키는 아미노산 변형의 설계를 포함한다.

Fc 변이체를 제작하는 부가적인 설계 전략은 Cγ2 도메인의 배위가 최적화되는 방식으로 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, 최적화는, 원하는 특성, 예를 들어 FcγR에 대하여 증가된 또는 감소된 친화성을 야기하는 Cγ2 도메인 내에서의 형태적 변화를 의미한다. Cγ2 형태에 영향을 주는 위치에서의 활발한 알맞은 치환을 통하여, 변이체의 질적 다양성은 새로운 Cγ2 배위를 샘플링하도록 조작될 수 있으며, 일부는 설계 목표를 달성할 수 있다. 그러한 새로운 Cγ2 형태는 예를 들어, 상기 변이체에 의하여 샘플링되는 대안적인 골격 형태의 결과일 수 있다. 가 변 위치는 CD2 구조, 안정성, 용해성, 가요성, 기능 등을 결정하는 데 있어 중요한 역할을 담당하는 것으로 여겨지는 임의의 위치로서 선택될 수 있다. 예를 들어, Cγ2 소수성 코어 잔기, 즉 용매로부터 부분적으로 또는 완전히 격리된 Cγ2 잔기가 조작될 수 있다. 대안적으로, 비코어(noncore) 잔기가 고려될 수 있으며, 그러한 잔기는 골격 구조, 안정성, 또는 가요성을 결정하는 데 중요한 것으로 여겨진다.

Fc 변이체를 제작하는 부가적인 제작 설계 전략은, Fc 및 Fc 리간드 사이의 전정기적(electrostatic) 상호 작용을 조절하는 FcγR, 상보체, 또는 몇몇 기타 Fc 리간드에 대한 결합이 변형에 의하여 변경되는 방식으로 제공된다. 그러한 변형은 Fc의 전체적인 정전기적 특성을 최적화하는 것으로 간주될 수 있으며, 중성 아미노산을 전하를 띠는 아미노산으로 대체하는 단계, 전하를 띠는 아미노산을 중성 아미노산으로 대체하는 단계, 또는 전하를 띠는 아미노산을 반대 전하를 띠는 아미노산으로 대체(즉, 전하 반전)하는 단계를 포함한다. 그러한 변형은 Fc 및 하나 이상의 Fc 리간드, 예를 들어 FcγR 사이의 결합 친화성을 변화시키는 데 사용될 수 있다. 바람직한 일면에 있어서, 정전기적 치환이 결합에 영향을 줄 수 있는 위치는, 정전기 전위(potential)를 계산하는 다양한 공지된 방법 중 하나를 이용하여 선택한다. 가장 간단한 일면에 있어서, 쿨롱의 법칙(Coulomb's law)을 이용해, 단백질 내의 위치에 대한 함수로서 정전기 전위를 산출한다. 다른 일면에 있어서는, 이온 강도 효과를 설명하는 Debye-Huckel 스케일링이 포함된다. 보다 구체적인 일면에 있어서는, 예를 들어 Poisson-Boltzmann 산출이 포함된다. 그러한 정전기적 산출은 위치에 초점을 두며, 특이적인 아미노산 변형에 대하여 설계 목표의 달성을 시 사한다. 몇몇 경우, 이들 치환은 상이한 Fc 리간드에 대한 결합에 가변적으로 영향을 줄 것으로 여겨지며, 예를 들어 활성화하는 FcγR에 대한 결합은 증진시키는 한편, 저해성 FcγR에 대한 결합 친화성은 감소시킬 것으로 여겨진다.

* 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝

유용한 Fc 변이체를 얻는 데 있어서의 주된 장애 요인은, 어떠한 아미노산 변형이, 막대한 가능성 중에서, 원하는 목표를 달성할 지를 예측하기가 어렵다는 점이다. 실제로, 임상적으로 중요한 가치를 가지는 Fc 변이체를 제조하는 데 있어서 Fc를 조작하고자 한 시도가 실패해온 주된 원인 중 하나는, Fc 조작에 대한 접근법들이 히트-또는-미스 접근법(hit-or-miss approach)을 수반한다는 것이다. 본 발명은, Fc 변이체의 정량적 및 시스템적 조작을 가능하게 하는 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 방법은 통상적으로, 자동 수준의 스코어링(scoring) 기능, 측쇄 로타머(rotamer) 샘플링, 단백질 서열, 구조, 및 기능 사이의 관계를 정확하게 포착하는 진보된 최적화 방법을 이용한다. 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝은, 결과로서 얻어지는 막대한 다양성을 필터링함으로써, 표적 위치에서의 전체 서열 스페이스의 가능성 탐구를 가능하게 한다. 컴퓨터 조작을 통해 스크리닝된 변이체 라이브러리는 안정되고, 적당하게 폴딩된, 기능적 서열에 대하여 중요한 가치가 있으며, 이는 원하는 목표에 대하여 Fc의 최적화를 활성화한다. 단백질 구조, 안정성, 용해성, 및 기능에 대한 중첩된 서열 제한으로 인하여, 라이브러리 내의 다수의 후보 물질들이 "낭비되는(wasted)" 서열 스페이스를 점유한다. 예를 들어, 대부분의 서열 스페이스는 폴딩되지 않은(unfolded), 잘못 폴딩된(misfolded), 불완전하게 폴딩된, 부분적으로 폴딩된, 또는 응집된(aggregated) 단백질을 코딩한다. Ig 도메인은 작은 베타 시트 구조(beta sheet structure)이기 때문에, 이는 특히 Fc 조작과 관련이 있으며, 그러한 조작은 요구가 극히 지나친 것으로 입증된 바 있다 (Quinn et al., 1994, Proc Natl Acad Sci U S A 91: 8747-8751; Richardson et al., 2002, Proc Natl Acad Sci U S A 99: 2754-2759). 심지어, 베타 시트의 표면에 대한 표면적으로 유해한 치환은 심각한 패킹(packing) 충돌을 초래할 수 있으며, 이는 폴딩 평형을 현저히 붕괴시킬 수 있다 (Smith et al., 1995, Science 270: 980-982). 부수적으로, 알라닌은 최악의 베타 시트 형성체(former) 중 하나이다 (Minor et al., 1994, Nature 371: 264-267). 베타 시트의 안정성 및 특이성에 대한 결정인자는 극히 다수의 미소한 상호 작용들 사이에 있어서의 정밀한 균형이다. 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝는, 주로 생산적인 서열 스페이스로 구성되는 라이브러리의 제작을 가능하게 하며, 그리하여 설계 목표에 대하여 최적화된 단백질을 동정하는 기회를 증대시킨다. 실제로, 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝은 증가된 히트-속도(hit-rate)를 산출함으로써, 실험적으로 스크리닝되는 변이체의 개수를 감소시킨다. Fc 조작에 있어서의 부가적인 장애는, 상관된 또는 관련된 돌연변이의 활성 설계에 대한 요구이다. 예를 들어, 이렇게 하여 관찰된 최대 Fc/FcγR 친화성 증진은, 알라닌 스캔에서 개별적으로 얻어진 3개의 보다 양호한 바인더를 조합함으로써 수득된 S298A/E333A/K334A이다 (Shields et al., 2001, J Biol Chem 276: 6591-6604). 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝은 3회의 개별적인 실험 대신에 1회의 실험에서 3배의 변이체를 제조할 수 있으며, 나아가 단지 알라닌 대신 그들 위치에서 20개의 모든 아미노산의 기능성을 테스트할 수 있다. 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝은 실험적으로 취급이 용이한 크기와 관련된 문제를 감소시킴으로써 그러한 복잡성을 처리한다.

광범위하여 검토된, 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝은, 다음과 같은 4개의 단계를 수반한다: 1) 단백질 주형(template) 구조 또는 구조들의 선택 및 준비 단계; 2) 가변 위치의 선택, 그 위치에서 고려되는 아미노산의 선택, 및/또는 고려되는 아미노산을 모델링하는 로타머의 선택 단계; 3) 에너지 계산 단계; 및 4) 조합 최적화. 보다 상세히 설명하면, 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 과정은 다음과 같이 설명될 수 있다. 단백질의 3차원 구조가 출발점으로서 사용된다. 최적화될 위치가 동정되며, 이는 전체 단백질 서열 또는 그의 서브세트(들)일 수 있다. 바람직한 일면에 있어서, 각각의 고려되는 아미노산은, 로타머라 불리는 불연속적인 허가된 형태에 의하여 제시될 수 있다. 상호 작용 에너지가 각각의 고려되는 아미노산 및 각각의 기타 고려되는 아미노산 및 단백질 골격 및 가변 잔기를 포함하는 나머지 단백질 사이에서 산출된다. 바람직한 일면에 있어서, 상호 작용 에너지는 각각의 고려되는 아미노산 측쇄 로타머 및 각각의 기타 고려되는 아미노산 측쇄 로타머 및 단백질 골격 및 가변 잔기를 포함하는 나머지 단백질 사이에서 산출된다. 이어서, 하나 또는 그 이상의 조합적 검색 알고리즘(combinatorial search algorithm)을 이용해 최저 에너지 서열 및/또는 낮은 에너지 서열이 동정된다.

*바람직한 일면에 있어서, 사용되는 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 방법은 US 6,188,965; US 6, 269,312; US 6,403,312; USSN 09/782,004; USSN 09/927,790; USSN 10/218,102; PCT WO 98/07254; PCT WO 01/40091; 및 PCT WO 02/25588에 개시된 바와 같은, Protein Design Automation^® (PDA^®) 기술과 실질적으로 유사하다. 또 다른 하나의 바람직한 일면에 있어서, 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 방법은 (Raha et al., 2000, Protein Sci 9: 1106-1119), USSN 09/877,695, 및 USSN 10/071,859에 개시된 바와 같은, Sequence Prediction Algorithm™ (SPA™) 기술과 실질적으로 유사하다. 또 다른 하나의 바람직한 일면에 있어서, "ANTIBODY OPTIMIZATION"라는 표제 하에 2003년 3월 3일자로 출원 USSN 10/339788에 개시된 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 방법이 사용된다. 다른 일면에 있어서는, PDA^® 기술 및 SPA™ 기술을 조합한 방법, 그리고 기타 설계 기구와 조합된 이들 컴퓨터 조작 방법의 조합 방법을 포함하는, 상이한 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 방법들의 조합된 방법이 사용된다. 유사하게, 이들 컴퓨터 조작 방법은 동시에 또는 순차적으로, 임의의 순서로 사용될 수 있다.

주형 구조는 상기 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 산출에 대한 입력정보(input)로서 사용된다. 본원에 있어서, "주형 구조(template structure)"란, 최적화될 단백질의 일부 또는 전체의 구조적 배위체를 의미한다. 상기 주형 구조는 3차원 구조(즉, 단백질 원자 세트에 대한 3차원 배위체)가 알려져 있는 임의의 단백질일 수 있으며, 계산, 평가, 모델링, 제조, 또는 측정될 수 있다. 단백질의 3 차원 구조는, 이들로 제한되지는 않으나, X-선 결정학적 기법, 핵 자기 공명(nuclear magnetic resonance; NMR) 기법, 새로운 모델링, 및 상동성 모델링을 포함하는 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 최적화가, 실험적으로 해석되지 않은 구조의 단백질에 대하여 요구되는 경우, 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 산출에 대한 주형으로서 제공될 수 있는 적합한 구조적 모델이 제작될 수 있다. 단백질의 상동성 모델을 제작하는 방법은 당 기술 분야에 알려져 있으며, 이들 방법이 본 발명에 사용된다. 이에 대해서는 예를 들어, 하기의 문헌들을 참조한다: Luo, et al., 2002, Protein Sci 11: 1218-1226, Lehmann & Wyss, 2001, Curr Opin Biotechnol 12 (4): 371-5; Lehmann et al., 2000, Biochim Biophys Acta 1543 (2): 408-415; Rath & Davidson, 2000, Protein Sci, 9 (12): 2457-69; Lehmann et al., 2000, Protein Eng 13(1): 49-57; Desjarlais & Berg, 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90 (6): 2256-60; Desjarlais & Berg, 1992, Proteins 12 (2): 101-4; Henikoff & Henikoff, 2000, Adv Protein Chem 54: 73-97; Henikoff & Henikoff, 1994, J Mol Biol 243 (4): 574-8; Morea et al., 2000, Methods 20: 267-269. 단백질/단백질 복합체는 또한, 도킹(docking) 방법을 이용하여 수득할 수 있다. 주형 구조로서 제공될 수 있는 적합한 단백질 구조는, 이들로 제한되지는 않으나, Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB, formerly the Brookhaven National Lab)에 의하여 편집 및 제공되는 Protein Data Base에 개시된 모든 것들을 포함한다.

상기 주형 구조는 천연 발생되거나 조작된 단백질일 수 있다. 상기 주형 구 조는 임의의 유기체, 바람직하게는 인간, 마우스, 랫, 토끼, 및 원숭이 유래의 단백질에 의하여 실질적으로 코딩되는 단백질의 것일 수 있다. 상기 주형 구조는 임의의 다수의 단백질 구조적 형태를 포함할 수 있다. 바람직한 일면에 있어서, 상기 주형 구조는 Fc 부위 또는 Fc의 도메인 또는 단편을 포함한다. 대안적으로 바람직한 일면에 있어서, 상기 주형 구조는 Fc 또는 하나 이상의 Fc 리간드에 결합된 Fc의 도메인 또는 단편을 포함하며, Fc/FcγR 복합체가 바람직하다. 상기 주형 구조 내의 Fc는, 당화될 수도 있고 당화되지 않을 수도 있다. 상기 주형 구조는 하나 이상의 단백질 쇄를 포함할 수 있다. 상기 주형 구조는, 이들로 제한되지는 않으나, 작은 분자, 기질(substrate), 보조-인자(cofactor), 금속, 분 분자, 보조기(prosthetic group), 폴리머, 및 탄수화물을 포함하는, 비단백질 성분을 추가적으로 함유할 수 있다. 바람직한 일면에 있어서, 상기 주형 구조는 복수의 또는 세트의 주형 단백질, 예를 들어 NMR로부터 얻어지는 구조체의 앙상블(ensemble)이다. 대안적으로, 세트의 주형 구조는 관련 단백질 또는 구조의 세트로부터 제작되거나, 인위적으로 창안된 앙상블로부터 제작된다. 상기 주형 구조의 조성 및 원료는 조작 목표에 따라 결정된다. 예를 들어, 인간 Fc/FcγR 친화성을 증진하는 경우에는, 인간 Fc/FcγR 복합체 구조 또는 그의 유도체가 주형 구조로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 복합체를 형성하지 않은 Fc 구조가 주형 구조로서 사용될 수도 있다. 목표가 마우스 FcγR에 대한 인간 Fc의 친화성을 증진시키는 것인 경우, 상기 주형 구조는 마우스 FcγR에 결합된 인간 Fc의 구조 또는 모델일 수 있다.

상기 주형 구조는 설계 산출 이전에 변형되거나 변경될 수 있다. 주형 구조 를 제조하는 다양한 방법은, US 6,188,965; US 6, 269,312; US 6,403,312; USSN 09/782,004; USSN 09/927,790; USSN 09/877,695; USSN 10/071,859, USSN 10/218,102; PCT WO 98/07254; PCT WO 01/40091; 및 PCT WO 02/25588에 개시되어 있다. 예를 들어, 바람직한 일면에 있어서, 상기 구조 내에 포함되어 있지 않은 경우, 명료한 수소가 첨가될 수 있다. 대안적인 일면에 있어서, 반데르 발스 충돌(van der Waals clash), 불리한 결합 각도, 및 불리한 결합 길이에 기인하는 응력을 포함하는, 응력을 완화시키기 위하여, 상기 구조의 에너지 최소화(minimization)가 가동된다. 대안적으로, 상기 주형 구조는 유도된 또는 무작위적 동요를 포함하는 수동식 방법과 같은 기타 방법을 이용하여 변경된다. 또한, 에너지 산출 및 조합적 최적화 단계를 포함하는 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝의 이후 단계 동안에 상기 주형 구조를 변형시킬 수도 있다. 대안적인 일면에 있어서, 상기 주형 구조는 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 산출 과정 이전 또는 동안에 변형되지 않는다.

일단 주형 구조가 얻어지면, 가변 위치가 선택된다. 본원에 있어서, "가변 위치(variable position)"란, 아미노산 신원이 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 산출에서 변경되도록 허가되는 위치를 의미한다. 당 기술 분야에 공지된 바와 같이, 아미노산 변형을 특정 가변 위치에서만 고려되도록 하면, 산출의 복잡성이 감소되며, 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝이 설계 목표에 직접 맞춤 제작되도록 한다. 하나 또는 그 이상의 잔기가 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 산출에 있어 가변 위치일 수 있다. 가변 위치로서 선택되는 위치는, 최적화된 단백질 특성, 예를 들어 Fcγ R에 대한 Fc 친화성, Fc 안정성, Fc 용해성 등에 기여하거나, 기여하는 것으로 가정된 것일 수 있다. 가변 위치의 잔기는 특이적인 단백질 특성에 대하여 유리하게 또는 불리하게 기여할 수 있다. 예를 들어, Fc/FcγR 경계면의 잔기는 결합을 매개하는 데에 관여할 수 있으며, 그러므로, 이 위치는 Fc/FcγR 친화성 향상을 목적으로 하는 설계 산출에 있어 가변적일 수 있다. 또 다른 하나의 일례로서, 노출된 소수성 측쇄를 가지는 잔기는 불리한 응집을 유발하는 데 관여할 수 있으며, 그러므로, 이 위치는 용해성 향상을 목적으로 하는 설계 산출에 있어 가변적일 수 있다. 가변 위치는 특정한 단백질 특성에 대한 결정인자인 상호 작용에 직접적으로 관여하는 위치일 수 있다. 예를 들어, Fc의 FcγR 결합 부위는 그러한 특정 FycR에 접촉하는 모든 잔기를 포함하는 것으로 규정될 수 있다. 본원에 있어서, "접촉(contact)"이란, Fc 잔기의 적어도 하나의 원자와, 결합된 FcγR의 적어도 하나의 원자 사이의 몇몇 화학적 상호 작용을 의미하며, 이러한 화학적 상호 작용은, 이들로 제한되지는 않으나, 반 데르 발스 상호 작용, 수소 결합 상호 작용, 정전기적 상호 작용, 및 소수성 상호 작용을 포함한다. 대안적인 일면에 있어서, 가변 위치는 단백질 특성에 간접적으로 관여하는 그러한 위치를 포함할 수 있으며, 즉 그러한 위치는 Fc 특성에 기여하는 것으로 알려져 있거나, Fc 특성에 기여하는 것으로 가정된 잔기에 가장 근접할 수 있다. 예를 들어, Fc의 FcγR 결합 부위는, 예를 들어 반 데르 발스 하에 FcγR과 접촉하는 4-10 Å의 임의의 Fc 잔기와 같이, 특정 거리 이내의 모든 Fc 잔기를 포함하는 것으로 정의될 수 있다. 그러므로, 이 경우 가변 위치는 FcγR과 직접 접촉하는 잔기뿐 아니라, FcγR과 접하는 잔기에 접하며, 그리하여 간접적으로 결합에 영향을 주는 것들도 선택될 수 있다. 선택되는 특정 위치는 이용될 설계 전략에 따라 좌우된다.

가변적이지 않은 주형 구조 내의 하나 또는 그 이상의 위치가 플로트될 수 있다. 본원에 있어서, "플로트되는 위치(floated position)"란, 아미노산 신원이 아닌 아미노산 형태가 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 산출에 있어서 가변하도록 허가된 위치를 의미한다. 일면에 있어서, 상기 플로트되는 위치는 모체 아미노산 신원을 가질 수 있다. 예를 들어, 플로트되는 위치는 작은 거리 이내의, 예를 들어 5 Å의 가변 위치 잔기일 수 있는 위치일 수 있다. 대안적인 일면에 있어서, 플로트되는 위치는 모체와 다른 아미노산 신원을 가질 수 있다. 목표가 특이적인 돌연변이의 활력적인 또는 구조적 출력을 평가하는 것인 경우, 그러한 예도 본 발명에 이용될 수 있다.

가변적이지 않거나 또는 플로트되지 않는 위치는 고정될 수 있다. 본원에 있어서, "고정된 위치(fixed position)"란, 아미노산 신원 및 형태가 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 산출에 있어 일정하게 유지되는 위치를 의미한다. 고정될 수 있는 위치는, 최적화될 특성에 관여하는 것으로 알려져 있지 않거나, 그러할 것으로 가정되지 않은 잔기를 포함한다. 이 경우에는, 이들 위치를 변화시킴으로써 획득되는 것이 거의 또는 전혀 없을 것으로 가정된다. 고정되는 위치는 또한, 해당 잔기가 적당한 폴딩, 구조, 안정성, 용해성, 및/또는 생물학적 기능을 유지하는 데에 있어 중요한 것으로 알려져 있거나, 그러할 것으로 가정된 위치를 포함한다. 예를 들어, 위치는, 각각 Fc 리간드에 대한 결합 및 적당한 당화가 교란되지 않도록 하 기 위하여, 특정 Fc 리간드와 상호 작용하는 잔기 또는 당화된 부위를 코딩하는 잔기에 대하여 고정될 수 있다. 유사하게, 안정성이 최적화되는 경우에는, Fc 리간드, 예를 들어 FcγR과 직접적으로 또는 간접적으로 상호 작용하는 위치를 고정함으로써, 결합이 교란되지 않도록 하는 것이 유익할 수 있다. 고정된 위치는 또한, 구조적으로 중요한 잔기, 예를 들어 다이설파이드 결합(disulfide bridge)에 관여하는 시스테인, 골격 형태를 결정하는 데 있어 결정적으로 중요한 잔기, 예를 들어 프롤린 또는 글라이신, 결정적인 수소 결합 잔기, 및 유리한 패킹 상호 작용을 형성하는 잔기를 포함할 수 있다.

컴퓨터 조작을 통한 스크리닝에 있어 다음 단계는, 각각의 특정 가변 위치에서 고려될 가능한 아미노산 신원의 세트를 선택하는 것이다. 이러한 세트의 가능한 아미노산은, 본원에 있어서, 가변 위치에서 "고려되는 아미노산(considered amino acid)"을 일컫는다. "아미노산(amino acid)"이란, 본원에 사용된 바와 같이, 20개의 천연 아미노산 및 임의의 비천연 또는 합성 유사체의 세트를 일컫는다. 일면에 있어서, 모든 20개의 천연 아미노산이 고려된다. 대안적으로, 서브세트의 아미노산, 또는 심지어는 단지 하나의 아미노산이 주어진 가변 위치에 고려된다. 당업자라면, 가변 위치에 대하여 단지 몇몇 아미노산 신원만을 고려하는 것이, 검색에 있어서의 조합적 복잡성을 감소시킨다는 점에서, 컴퓨터 조작에 유리함을 이해할 것이다. 나아가, 가변 위치에 대하여 단지 몇몇 아미노산만을 고려하는 것이, 특이적인 설계 전략에 대하여 산출을 맞춤 설계하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 비당화된 Fc의 용해성을 최적화하기 위해서는, 탄수화물의 부재 하에 용매에 노출되는 비극성 Fc 잔기에 대하여 단지 극성 아미노산만을 고려하는 것이 유리할 수 있다. 천연 아미노산의 합성 아미노산 및 유사체를 포함하는 비천연 아미노산 또한 아미노산으로서 고려된다. 이에 대해서는, 예를 들어 하기 문헌을 참조한다: Chiri et al., 2003, Science, 301 (5635): 964-7; 및 Chin et al., 2003, Chem Bio1. 10 (6): 511-9.

각각의 위치에 대하여 고려된 아미노산을 선택하는 데에는, 매우 다양한 방법들이, 단독으로 또는 조합적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 주어진 가변 위치에 대하여 고려되는 아미노산 세트는 용매에 대한 노출 정도를 기준으로 선정될 수 있다. 소수성 또는 비극성 아미노산은 통상적으로 상기 단백질의 내부 또는 코어에 위치하며, 이러한 위치는 용매에 대한 접근이 불가능하거나 거의 불가능하다. 그러므로, 가변 코어 위치에 대해서는, 단지 또는 주로 비극성 아미노산, 예를 들어 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 및 메티오닌만을 고려하는 것이 유리할 수 있다. 친수성 또는 극성 아미노산은 통상적으로, 단백질의 외부 또는 표면 상에 위치하며, 이러한 위치는 용매의 접근 가능성이 상당히 크다. 그러므로, 가변적인 표면 위치에 대해서는, 단지 또는 주로 극성 아미노산, 예를 들어 알라닌, 세린, 트레오닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루타민, 글루타르산, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘만을 고려하는 것이 유리할 수 있다. 일부의 위치는 부분적으로는 노출되고 부분적으로는 묻혀 있는 상태로서, 코어 및 표면 잔기 사이의 경계 잔기로서 제공되는 측면에서 단백질 코어 위치인지 표면 위치인지가 명확하지 않은 경우가 있다. 그러므로, 그러한 가변적인 경계 위치에 대 해서는, 비극성 아미노산 및 극성 아미노산 모두, 예를 들어 알라닌, 세린, 트레오닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루타민, 글루타르산, 아르기닌, 라이신 히스티딘, 발린, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 및 메티오닌을 고려하는 것이 유리할 수 있다. 가변 위치에 있어서의 용매에 대한 노출 정도는, 단백질 구조 생물학 전문가에 의하여, 또는 당 기술 분야에 공지되어 있는 다양한 알고리즘을 이용하여, 주형 구조에 대한 주관적인 평가(subjective evaluation) 또는 육안 검사(visual inspection)에 의하여 측정될 수 있다. 가변 위치에 대하여 고려되는 아미노산 타입의 선택은, 컴퓨터 조작 방법, 예를 들어 용매이 접근이 가능한 표면적을 산출함으로써, 또는 용매 접근 가능한 표면에 대한 Cα-Cβ 벡터의 배향(orientation)을 평가하는 알고리즘을 이용함으로써 전적으로 측정되거나 또는 용이해질 수 있다. 이에 대해서는 하기 문헌을 참조한다: US 6,188,965; US 6, 269,312; US 6,403,312; USSN 09/782,004; USSN 09/927,790; USSN 10/218,102; PCT WO 98/07254; PCT WO 01/40091; 및 PCT WO 02/25588. 일면에 있어서, 각각의 가변 위치는 코어, 표면, 또는 경계 위치로서 명확하게 분류되거나, 또는 코어, 표면, 또는 경계와 실질적으로 유사한 부류일 수 있다.

대안적인 일면에 있어서, 가변 위치에 대하여 허가된 아미노산 세트의 선택은 가정에 따라 추론(hypothesis-driven)될 수 있다. 어떠한 아미노산 타입이 가변 위치에 대하여 고려되는 지에 대한 가정은 단백질 구조적 생물학자에의 의한 주형 구조의 주관적인 평가 또는 육안 검사에 의하여 추론될 수 있다. 예를 들어, 가변 위치에 대하여 수소 결합 상호 작용이 유리할 수 있는 것으로 추측되는 경우 에는, 심지어 상기 위치가 코어 상에 존재하는 경우에도, 수소 결합을 형성할 역량이 있는 극성 잔기가 고려될 수 있다. 유사하게, 가변 위치에 대하여 소수성 패킹 상호 작용이 유리할 수 있을 것으로 추측되는 경우에는, 심지어 상기 위치가 표면 상에 존재하는 경우에도, 유리한 패킹 상호 작용을 일으킬 역량이 있는 비극성 잔기가 고려될 수 있다. 가정에 따른 추론 방식의 접근법의 다른 예는, 골격 가요성 또는 단백질 폴드의 허여를 수반할 수 있다. 당 기술 분야에 공지된 바와 같이, 몇몇 잔기, 예를 들어 프롤린, 글라이신, 및 시스테인은 단백질의 구조 및 안정성에 있어 중요한 역할을 담당한다. 글라이신은 다른 모든 아미노산들보다 골격 가요성을 크게 할 수 있으며, 프롤린은 다른 모든 아미노산들보다 골격을 강하게 속박하며, 시스테인은 다이설파이드 결합을 형성할 수 있다. 그러므로, 원하는 설계 목표를 달성하기 위해서는, 하나 이상의 이들 아미노산 타입을 포함하는 것이 유리할 수 있다. 대안적으로, 이들 아미노산 타입 중 하나 이상을 고려되는 아미노산 리스트로부터 배제하는 것이 유리할 수 있다.

대안적인 일면에 있어서, 서브세트의 아미노산은 보상 범위(coverage)를 최대화하기 위하여 선택될 수 있다. 이러한 경우, 주형 구조 내의 것들과 유사한 특성을 가지는 부가적인 아미노산이 가변 위치에 대하여 고려될 수 있다. 예를 들어, 주형 구조 내의 가변 위치의 잔기가 거대 소수성 잔기인 경우, 부가적인 거대 소수성 아미노산이 그 위치에 대하여 고려될 수 있다. 대안적으로, 서브세트의 아미노산은 다양성을 최대화하기 위하여 선택될 수 있다. 이러한 경우, 이러한 경우, 주형 구조 내의 것들과 유사한 특성을 가지는 아미노산이 가변 위치에 대하여 고려될 수 있다. 예를 들어, 주형 구조 내의 가변 위치의 잔기가 거대 소수성 잔기인 경우에는, 극성이 작은 아미노산이 고려될 수 있다.

당 기술 분야에 공지된 바와 같이, 일부 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 방법에는, 설계 산출 과정 동안 측정된 고려되는 아미노산의 신원만이 요구된다. 즉, 아미노산 측쇄의 형태 또는 가능한 형태에 관한 정보가 전혀 요구되지 않는다. 기타 바람직한 방법에서는, 각각의 아미노산에 대하여 고려되는, 소위 로타머라 불리는 불연속적인 측쇄 형태의 세트가 이용된다. 그러므로, 한 세트의 로타머가 각각의 가변 위치 및 플로트되는 위치에 대하여 고려될 수 있다. 로타머는 공개되어 있는 로타머 라이브러리로부터 입수할 수 있다 (이에 대해서는 예를 들어 하기의 문헌을 참조한다: Lovel et al., 2000, Proteins: Structure Function and Genetics 40: 389-408; Dunbrack & Cohen, 1997, Protein Science 6: 1661-1681; DeMaeyer et al., 1997, Folding and Design 2: 53-66; Tuffery et al., 1991, J Biomol Struct Dyn 8: 1267-1289, Ponder & Richards, 1987, J Mol Biol 193: 775-791). 당 기술 분야에 공지된 바와 같이, 로타머 라이브러리는 골격-비의존성 또는 골격-의존성일 수 있다. 로타머는 또한, 분자 역학(molecular mechanics) 또는 최초 산출, 및 기타 방법을 이용하여 획득할 수 있다. 바람직한 일면에 있어서는, 가요성 로타머 모델이 사용된다 (이에 대해서는 하기 문헌을 참조한다: Mendes et al., 1999, Proteins: Structure, Function, and Genetics 37: 530-543). 유사하게, 인위적으로 제작된 로타머가 사용될 수 있으며, 각각의 아미노산 및/또는 가변 위치에 대하여 선택된 세트를 증대시킬 수도 있다. 일면에 있어서, 에너지가 낮지 않은 적어도 하나의 형태가 로타머 리스트에 포함된다. 대안적인 일면에 있어서, 주형 구조 내의 가변 위치 잔기의 로타머가 그 가변 위치에 대하여 허가된 로타머 리스트에 포함된다. 대안적인 일면에 있어서는, 단지 가변 위치에 대하여 고려되는 각각의 아미노산의 신원만이 제공되며, 각각의 아미노산에 대한 특이적인 배위에 대한 언급은 설계 산출 과정 동안 사용되지 않는다. 즉, 로타머의 사용은 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝에 있어 필수적인 것이 아니다.

실험적 정보는 가변 위치의 선정 및/또는 가변 위치에 대하여 고려되는 아미노산의 선정을 가이드하는 데 사용될 수 있다. 당 기술 분야에 공지된 바와 같이, 돌연변이 유발 실험은 흔히, 단백질의 구조 및 기능에 있어서의 특정 잔기의 역할, 예를 들어, 어떠한 단백질 잔기가 안정성을 결정하는 데 역할을 담당하는 지, 또는 어떠한 잔기가 단백질-단백질 상호 작용의 경계면을 구성하는 지를 측정하기 위하여 실시된다. 그러한 실험으로부터 얻어지는 데이터는 본 발명에 유용하다. 예를 들어, Fc/FcγR 친화성 증진에 대한 가변 위치는, 돌연변이가 결합에 영향을 주는 것으로 확인된 모든 가변 위치를 포함할 수 있다. 유사하게, 그러한 실험으로부터 얻어지는 결과는 가변 위치에 대한 허가된 아미노산 타입의 선정을 가이드하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 타입의 아미노산 치환이 유리할 것으로 확인된 경우, 그러한 아미노산의 유사한 타입의이 고려될 수 있다. 일면에 있어서, 실험적으로 유리할 것으로 확인된 것들과 유사한 특성을 가지는 부가적인 아미노산이 가변 위치에 대하여 고려될 수 있다. 예를 들어, 거대 소수성 잔기에 대한 Fc/FcγR 경계면에 있어서의 가변 위치에 대한 실험적 돌연변이가 유리한 것으로 확인된 경우, 사용자는 컴퓨터 조작 스크린 내에서 그 위치에 대하여 부가적인 거대 소수성 아미노산을 포함하는 것을 선택할 수 있다. 당 기술 분야에 공지된 바와 같이, 디스플레이(display) 및 기타 선택 기술이 상기 선택된 특성에 대하여 유리한 아미노산 치환 리스트를 제작하기 위하여 유작위 돌연변이 유발과 결합될 수 있다. 그러한 실험적 작업으로부터 얻어지는 리스트는 본 발명에 이용될 수 있다. 예를 들어, 그러한 실험에서 불변하는 것으로 확인된 위치는 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 산출 과정에서 가변 위치로서 배제될 수 있는 반면, 돌연변이가 보다 용이한 것으로 확인되었거나, 또는 돌연변이에 대하여 호의적으로 반응하는 것으로 확인된 위치는 가변 위치로서 선정될 수 있다. 유사하게, 그러한 실험으로부터 얻어진 결과는 가변 위치에 대한 허가된 아미노산 타입의 선정을 가이드하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 특정 타입의 아미노산이 실험적 선택 과정에서 보다 높은 빈도로 발생하는 경우에는, 그러한 아미노산과 유사한 타입이 고려될 수 있다. 일면에 있어서, 실험적으로 유리할 것으로 확인된 것들과 유사한 특성을 가지는 부가적인 아미노산이 가변 위치에 대하여 고려될 수 있다. Fc/FcγR 경계면에 존재하는 가변 위치에 대한 선택된 돌연변이가 전하를 띠지 않는 극성 아미노산인 것으로 확인되는 경우, 사용자는 그 위치에 대하여 부가적인 전하를 띠지 않는 극성 아미노산, 또는 전하를 띠는 극성 아미노산을 포함하는 것을 선택할 수 있다.

서열 정보는 또한, 가변 위치의 선정 및/또는 가변 위치에 대하여 고려되는 아미노산의 선정을 가이드하는 데 사용될 수 있다. 당 기술 분야에 공지된 바와 같이, 몇몇 단백질은 공통적인 구조적 스캐폴드를 공유하며, 서열에 있어 상동하 다. 이러한 정보는 단백질 부류에 있어서의 특정 위치에 대한 식견을 획득하는 데 사용될 수 있다. 당 기술 분야에 공지된 바와 같이, 서열 정렬은 흔히, 단백질 잔기가 보존되어 있는 지 또는 보존되어 있지 않은 지의 여부를 측정하기 위하여 실시된다. 즉, 단백질 서열의 정렬을 비교 및 대조함으로써, 한 위치에 대한 가변 정도를 확인할 수 있으며, 해당 위치에서 천연적으로 발생한 아미노산 타입을 확인할 수 있다. 그러한 분석으로부터 얻어지는 정보는 본 발명에 유용하다. 가변 위치 및 해당 가변 위치에 대한 고려되는 아미노산의 선정하는 데 있어 서열 정도를 사용하면 상당한 이점이 얻어진다. 가변 위치를 선정함에 있어 서열 정보를 이용하는 경우 얻어지는 일차적인 장점은 돌연변이 경향이 보다 큰 위치 및 보다 작은 위치에 대한 정보를 얻을 수 있다는 것이다. 그러므로, 서열 정보는 질적 다양성, 즉 단백질의 구조, 안정성 등에 대하여 유해하지 않은 돌연변이가 컴퓨터 조작을 통해 샘플링되도록 하는 데에 도움이 될 수 있다. 동일한 장점이 가변 위치에 대하여 고려되는 아미노산을 선택하기 위하여 서열 정보를 이용하는 데에 적용된다. 즉, 단백질 서열 정렬에 있어 발생할 수 있는 아미노산 세트는, 단백질의 구조, 안정성, 용해성, 기능 등과의 양립 가능성에 면에서, 무작위 정렬보다 높은 기회를 가지기 위하여 전개에 의하여 사전-스크리닝될 수 있을 것으로 여겨진다. 그러므로, 보다 높은 질적 다양성이 컴퓨터 조작을 통해 샘플링된다. 가변 위치에 대하여 고려되는 아미노산 타입을 선정함에 있어 서열 정보를 이용하는 경우 얻어지는 두 번째 장점은 특정 정렬이 무작위 서열보다 면역원성이 작을 수 있는 서열을 제시할 수 있다는 점이다. 예를 들어, 주어진 가변 위치에 대하여 고려되는 아미노 산이 인간 단백질 서열의 정렬 시 그 위치에서 발생한 아미노산 세트인 경우, 그러한 아미노산은 최적화된 단백질이 인간 치료제로서 사용되는 경우, 면역 반응을 전혀 또는 낮게 야기하는 성질에 대하여 사전-스크리닝될 수 있을 것으로 여겨진다.

상기 서열의 기원은 매우 가변적일 수 있으며, 이들로 제한되지는 않으나, 다음을 포함하는, 공지된 데이터베이스 중 하나를 포함한다: Kabat database (Johnson & Wu, 2001, Nucleic Acids Res 29: 205-206; Johnson & Wu, 2000, Nucleic Acids Res 28: 214-218), IMGT database (IMGT, the international ImMunoGeneTics informationsystem^®; Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res 27: 209-212; Ruiz et al., 2000 Nucleic Acids Re. 28: 219-221; Lefranc et al., 2001, Nucleic Acids Res 29: 207-209; Lefranc et al., 2003, Nucleic Acids Res 31: 307-310), 및 VBASE, SwissProt, GenBank and Entrez, 및 EMBL Nucleotide Sequence Database. 단백질 서열 정보는, 이들로 제한되지는 않으나, 포유류를 포함하는 임의의 유기체 유래의 천연 발생 단백질의 서열 정렬로부터 입수, 수집, 및/또는 제작될 수 있다. 단백질 서열 정보는, 개인적으로 수집된 데이터베이스로부터 입수될 수 있다. 수많은 서열-기준 정렬 프로그램 및 당 기술 분야에 공지된 방법이 존재하며, 이들 모두, 본 발명에 있어 Fc 및 Fc 리간드를 포함하는 단백질의 서열 정렬을 제작하는 데에 이용될 수 있다.

일단 정렬이 완성되면, 서열 정보는 가변 위치의 선정을 가이드하는 데 사용 될 수 있다. 그러한 서열 정보는 주어진 위치에 대한 상기 가변성과 관련이 있을 수 있다. 본원에 있어서, 가변성은 가변 위치와 구별되어야 한다. 가변성은, 서열 정렬 내의 주어진 위치가 거기에서 발생하는 아미노산 타입에 대하여 변화(variation)를 나타내는 정도를 일컫는다. 다시 말해, 가변 위치는 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 산출 과정 동안 아미노산 신원을 변화시키기 위하여 사용자에 의하여 선정된 위치를 일컫는다. 가변성은 바이오인포매틱스(bioinformatics) 분야의 전문가에 의하여 정량적으로 측정될 수 있다. 또한, 확인될 수 있는 가변성을 정략적으로 측정하는 당 기술 분야에 공지된 방법도 본 발명에 이용 가능하다. 가장 바람직한 일면에 있어서, 엔트로피(Entropy) 또는 쉐논 엔트로피(Shannon Entropy) 정보가 측정된다. 가변 위치는 밀접하게 관련된 단백질 서열, 또는 보다 덜 밀접하게 관련된 단백질 서열로부터 입수된 서열 정보를 기준으로 선정될 수 있다.

가변 위치를 선정하기 위하여 서열 정보를 사용하는 것 또한 본 발명에 광범위하여 이용된다. 예를 들어, 주형 구조 내의 Fc/FcγR 경계면 위치가 트립토판인 경우, 및 트립토판이 한 정렬 내에서 서열의 90% 이상으로 그 위치에서 관찰되는 경우, 그 위치는 고정된 상태로 유지시키는 것이 유리할 수 있다. 반면, 또 다른 하나의 경계면 위치가 보다 큰 가변성 수준을 가지는 것으로 확인되는 경우, 예를 들어 5개의 상이한 아미노산이 각각 대략 20%의 빈도로 그 위치에서 관찰되는 경우, 그 위치가 가변 위치로서 선정될 수 있다. 또 다른 일면에 있어서, 정렬된 단백질 서열에 대한 육안 검사가 단백질 구조에 대한 육안 검사를 대체하거나, 이에 도움을 줄 수 있다. 서열 정보는 또한 가변 위치에 대하여 고려되는 아미노산의 선정을 가이드하는 데에도 사용될 수 있다. 그러한 서열 정보는 아미노산, 아미노산, 또는 아미노산 타입 (예를 들어 극성 또는 비극성, 전하를 띠는 또는 전하를 띠지 않는)이 주어진 위치에서 자연적으로 또는 그 외의 방식으로 발생하는 빈도와 관련될 수 있다. 일면에 있어서, 가변 위치에 대하여 고려되는 아미노산 세트는 정렬 시 그 위치에서 관찰되는 아미노산의 세트를 포함한다. 그러므로, 상기 위치-특이성 정렬 정보는 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 산출 시 가변 위치에 대하여 고려되는 아미노산의 리스트를 제작하는 데에 직접 사용된다. 그러한 전략은 당 기술 분야에 공지되어 있으며, 이에 대해서는 예를 들어 다음과 같은 문헌을 참조한다: Lehmann & Wyss, 2001, Curr Opin Biotechnol 12 (4): 371-5; Lehmann et al., 2000, Biochim Biophys Acta 1543 (2): 408-415; Rath & Davidson, 2000, Protein Sci, 9 (12): 2457-69; Lehmann et al., 2000, Protein Eng 13(1): 49-57; Desjarlais & Berg, 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90 (6): 2256-60; Desjarlais & Berg, 1992, Proteins 12 (2): 101-4; Henikoff & Henikoff, 2000, Adv Protein Chem 54: 73-97; Henikoff & Henikoff, 1994, J Mol Biol 243 (4): 574-8. 대안적인 일면에 있어서, 가변 위치 또는 가변 위치들에 대하여 고려되는 아미노산 아미노산 세트는 정렬에 있어 가장 높은 빈도로 관찰되는 아미노산 세트를 포함할 수 있다. 그러므로, 특정 표준이 아미노산 또는 아미노산 타입의 빈도가 가변 위치에 대하여 고려되는 아미노산 세트에 있어서의 그의 포함을 보장하는 지의 여부를 측정하는 데에 적용된다. 당 기술 분야에 공지된 바와 같이, 서열 정렬은 정렬 내의 임의의 위치에 대한 서열 다양성, 및 한 위치에 대한 각각의 아미노산의 발생 빈도 및 가능성을 산출하는 통계 방법을 이용하여 분석될 수 있다. 이어서, 그러한 데이터는 어느 아미노산 타입이 고려되어야 하는 지를 결정하는 데 사용될 수 있다. 가장 간단한 일면에 있어서, 이러한 발생 빈도는 한 아미노산이 하나의 정렬 위치에서 관찰되는 회수를 카운트한 뒤, 이를 상기 정렬 내의 서열의 총수로 나눔으로써 산출된다. 다른 일면에 있어서, 카운트 절차에 대한 각각의 서열, 위치 또는 아미노산의 기여 정도는 다양한 가능한 메커니즘에 의하여 측정된다. 바람직한 일면에 있어서, 빈도 전략에 대한 각각의 정렬된 서열의 기여 정도는, 그 정렬 내의 기타 서열과 비교한 그의 다양성에 따라 결정된다. 이를 달성하는 통상적인 전략으로는, Henikoff 및 Henikoff에 의하여 제안된 서열 웨이팅 시스템(sequece weighting system)이 있다 (Henikoff & Henikoff, 2000, Adv Protein Chem 54: 73-97; Henikoff & Henikoff, 1994, J Mol Biol 243: 574-8). 바람직한 일면에 있어서, 통계에 대한 각각의 서열의 기여도는 표적 서열, 즉, 사용되는 주형 구조에 대한 유사성의 크기에 따라 좌우되며, 표적 서열에 대한 유사성이 큰 서열일수록 보다 크게 기여한다. 유사성 측정의 예로는, 이들로 제한되지는 않으나, 서열 신원, BLOSUM 유사성 스코어(similarity score), PAM 매트릭스 유사성 스코어, 및 BLAST 스코어가 포함된다. 대안적인 일면에 있어서, 통계에 대한 각각의 서열의 기여도는 그의 알려져 있는 물리적 또는 기능적 특성들에 따라 좌우된다. 그러한 특성으로는, 이들로 제한되지는 않으나, 열 안정성 및 화학적 안정성, 활성에 대한 기여도, 및 용해성이 포함된다. 예를 들어, 비당화된 Fc를 용해성에 대하여 최적화하 는 경우, 가용성이 가장 큰 것으로 알려져 있는 정렬의 서열(이에 대해서는 예를 들어 다음 문헌 참조: Ewert et al., 2003, J Mol Biol 325: 531-553)이 산출된 빈도에 대하여 가장 크게 기여할 것이다.

가변 위치에 대하여 고려될 서열 정렬 내의 아미노산 세트를 선정하기 위하여 적용되는 표준의 종류에 관계없이, 서열 정보를 이용해 고려되는 아미노산을 선정하는 방식이 본 발명에 이용된다. 예를 들어, 노출된 비극성 표면 잔기의 대체에 의하여 Fc의 용해성을 최적화하기 위하여, 고려되는 아미노산이, 일부 표준을 충족시키며, 단백질 서열의 정렬 내의 그 위치에서 관찰되는 아미노산 세트, 또는 그러한 아미노산의 서브세트로서 선정될 수 있다. 또 다른 하나의 일례로서, 하나 이상의 아미노산이, 보상 범위를 최대화하기 위하여 서열 정렬로부터 유래되는 아미노산 리스트로부터 주관적으로 공제되거나 첨가될 수 있다. 예를 들어, 서열 정렬 내에서 발견되는 것들과 유사한 특성을 가지는 부가적인 아미노산이 가변 위치에 대하여 고려될 수 있다. 예를 들어, FcγR을 결합시키는 것으로 알려져 있는 또는 그러할 것으로 가정되는 Fc 위치가 서열 정렬 내에 전하를 띠지 않는 극성 아미노산를 가지는 것으로 관찰되는 경우, 사용자는 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 산출 시 부가적인 전하를 띠지 않는 극성 아미노산 또는 , 또는 그 위치에 대하여 전하를 띠는 극성 아미노산을 포함하는 것으로 선택할 수 있다.

일면에 있어서, 서열 정렬 정보는, 이하에 설명한 바와 같이, 에너지 산출과 조합된다. 예를 들어, 허위 에너지가, 스코어링 함수(scoring function)를 생성시키기 위하여 서열 정보로부터 유도될 수 있다. 서열-기준 스코어링 함수를 사용하 면, 산출의 복잡성을 감소시키는 데 도움이 될 수 있다. 그러나, 당업자라면, 서열 정보는 흔히 실제로 구조적으로 상충될 수 있는 돌연변이들 사이의 그릇된 상관 관계를 나타낼 수 있기 때문에, 서열-기준 스코어링 함수의 단독 사용은 부적합할 수 있음을 이해할 것이다. 그러므로, 바람직한 일면에 있어서, 구조-기준 에너지 산출 방법이 단독으로 또는 서열-기준 스코어링 함수와 함께 사용된다. 즉, 바람직한 일면에 있어서, 서열 정렬 정보는 분석 단계에 단독으로 사용되지 않는다.

에너지 산출이란, 아미노산 변형이 스코어링되는 과정을 일컫는다. 상호 작용 에너지는 하나 이상의 스코어링 함수에 의하여 측정된다. 다양한 스코어링 함수가 본 발명에 있어 에너지를 산출하는 데에 이용된다. 스코어링 함수는 임의의 전위의 수를 포함할 수 있으며, 본원에 있어서, 전위란 스코어링 함수의 에너지 텀(term)을 일컬으며, 이들로 제한되지는 않으나, 반 데르 발스 전위, 수소 결합 전위, 원 용매화 전위(atomic solvation potential) 또는 기타 용매화 모델, 2차 구조 성향 전위(secondary structure propensity potential), 정전기적 전위(electrostatic potential), 비틀림 전위(torsional potential), 및 엔트로피 전위가 포함된다. 에너지 텀은 위치, 고려되는 아미노산, 및 기타 고려 사항에 따라 달라지나, 각각의 가변 또는 플로트되는 위치를 스코어링하는 데에는 적어도 하나의 에너지 텀이 사용된다. 일면에 있어서, 하나의 에너지 텀을 이용하는 스코어링 함수가 사용된다. 가장 바람직한 일면에 있어서, 에너지는, 반 데르 발스, 용매화, 정전기적, 및 수소 결합 상호 작용, 및 이들의 조합된 작용을 나타내는 하나 이상의 에너지 텀을 함유하는 스코어링 함수를 이용하여 산출된다. 부가적인 일면 에 있어서, 부가적인 에너지 텀은, 이들로 제한되지는 않으나, 엔트로피 텀, 비틀림 에너지, 및 정보-기준 에너지를 포함한다.

US 6,188,965; US 6, 269,312; US 6,403,312; USSN 09/782,004; USSN 09/927,790; USSN 09/877,695; USSN 10/071,859, USSN 10/218,102; PCT WO 98/07254; PCT WO 01/40091; 및 PCT WO 02/25588에는, 다양한 스코어링 함수가 개시되어 있다. 당업자라면, 스코어링 함수가 물리-화학적 에너지 텀으로 제한될 필요가 없음을 인지할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 방법에는 지식-기준 전위가 사용될 수 있다. 그러한 지식-기준 전위는 단백질 서열 및/또는 구조 통계로부터 유도되며, 이들로 제한되지는 않으나, 서열 정렬로부터 유도되는 트레딩 전위(threading potential), 참조 에너지(reference energy), 허위 에너지, 상동성-기준 에너지, 및 서열 성향을 포함한다. 바람직한 일면에 있어서, 스코어링 함수는, MHC에 대한 펩티드의 결합에 대하여 테이터로부터 유도되는 함수와 같이, 면역원성에 대한 모델을 포함하도록 변형되며 (Major Htocompatability Complex), 이는 잠재인 면역원성 서열을 동정하는 데 사용될 수 있다 (이에 대해서는 예를 들어 하기 문헌을 참조한다: USSN 09/903,378; USSN 10/039,170; USSN 60/222,697; USSN 10/339788; PCT WO 01/21823; 및 PCT WO02/00165). 일면에 있어서, 서열 정렬 정보는 아미노산 치환을 스코어링하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단백질 서열의 비교가, 단백질의 기원이 인간, 원숭이, 마우스 또는 그 외의 것 중 어는 것인지의 여부에 관계없이, 본 발명의 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 방법에 있어서 아미노산 돌연변이를 추측 또는 스코어링하는 데 사용될 수 있다. 일면에 있어서, 당 기술 분야에 공지된 바와 같이, 하나 이상의 스코어링 함수가, 컴퓨터 조작 분석 과정 동안 최적화 또는 "트레이닝(trained)"될 수 있으며, 이후 상기 최적화된 시스템을 이용하여 분석이 재실시될 수 있다. 그러한 변경된 스코어링 함수는, 예를 들어, 실험 데이터를 이용하여 스코어링 함수를 트레이닝함으로써 얻을 수 있다. 당업자라면, 하나 이상의 에너지 텀으로 구성되는 다수의 역장(force field)이 스코어링 함수로서 제공될 수 있음을 이해할 것이다. 역장은, 이들로 제한되지는 않으나, 최초 또는 양자 역학적 역장(quantum mechanical force field), 반-경험적 역장(semi-empirical force field), 및 분자 역학적 역장(molecular mechanics force field)을 포함한다. 지식을 기준으로 하거나, 통계 방법을 이용하는 스코어링 함수가 본 발명에 사용될 수 있다. 이들 방법은 서열 및 3차원 단백질 구조 사이의 매치(match)를 평가하는 데 사용될 수 있으며, 따라서 단백질 구조에 대한 충실도(fidelity)에 대하여 아미노산 치환을 스코어링하는 데에 사용될 수 있다. 일면에 있어서, 분자 역학 산출(molecular dynamics calculation)이 돌연변이 서열 스코어를 개별적으로 산출함으로써 서열을 컴퓨터 조작을 통해 스크리닝하는 데 사용될 수 있다.

*유효한 에너지 산출을 가능하게 하기 위하여 아미노산을 제시하는 다양한 방법이 존재한다. 바람직한 일면에 있어서, 고려되는 아미노산은 상술한 바와 같이 로타머로서 제시되며, 기타 가변 및 플로트되는 로타머, 고정된 위치의 잔기, 및 골격 구조 및 임의의 비단백질성 원자와 함께, 각각의 가변 위치 및 플로트되는 위치에 대한 각각의 가능한 로타머의 상호 작용 에너지(또는 스코어)가 산출된다. 바람직한 일면에 있어서, 다음과 같은 두 세트의 상호 작용 에너지가, 모든 가변 및 플로트되는 위치 각각에 대한 각각의 측쇄 로타머에 대하여 산출된다: 로타머 및 고정된 원자 사이의 상호 작용 에너지 ("단일(single)" 에너지); 그리고 가변 및 플로트되는 위치의 로타머 및 기타 가변 및 플로트되는 위치 각각에 대한 기타 가능한 로타머 사이의 상호 작용 에너지 ("이중(double)"에너지). 대안적인 일면에 있어서, 단일 및 이중 에너지는 고정된 위치뿐 아니라, 가변 및 플로트되는 위치에 대하여 산출된다. 대안적인 일면에 있어서, 고려되는 아미노산은 로타머로서 제시되지 않는다.

컴퓨터 조작을 통한 스크리닝의 중요한 성분은 유리한 스코어, 즉 에너지가 낮은 하나 이상의 서열을 동정하는 것이다. 막대한 가능성들 중에서 낮은 에너지 서열 세트를 결정하는 것을 사소한 것이나, 이러한 문제를 해결하기 위하여, 조합적 최적화 알고리즘이 활용된다. 조합적 최적화 알고리즘에 대한 요구는 통상적인 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 산출에서 고려되는 가능성 개수의 조사에 의하여 예시된다. 불연속적인 로타머 세트의 성질은, 주어진 설계 문제에 대하여 가능한 로타머 서열의 개수의 간단한 산출을 가능하게 한다. 위치당 n과 m의 가능한 로타머 길이의 골격이 가능한 로타머 서열을 가질 것이며, 그 수는 서열 길이에 대한 지수 함수로서 증가할 것이다. 매우 간단한 산출의 경우, 최적의 서열 및/또는 하나 이상의 유리한 서열을 동정하기 위하여 각각의 가능한 서열을 조사할 수 있다. 그러 나, 통상적인 설계 문제의 경우, 가능한 서열의 개수(10⁸⁰ 또는 그 이상)는, 각각의 가능한 서열이 처리될 수 없을 정도로 충분히 크다. 그러므로, 최적의 서열 및/또는 하나 이상의 유리한 서열을 동정하기 위하여, 다양한 조합적 최적화 알고리즘이 사용될 수 있다. 조합적 최적화 알고리즘은, 다음과 같은 2개의 클래스로 분류될 수 있다: (1) 그들이 수렴되는 경우, 전체적인 최소 에너지 배위의 복귀를 보장하는 알고리즘; 및 (2) 전체적인 최소 에너지 배위의 복귀를 보장하지는 않으나, 항상 용액을 복귀시키는 알고리즘. 상기 제1 클래스의 알고리즘의 예로는, 이들로 제한되지는 않으나, 다음과 같은 것들이 포함된다: Dead-End Elimination(DEE) 및 Branch & Bound(B & B) (Branch and Terminate 포함) (Gordon & Mayo, 1999, Structure Fold Des 7: 1089-98). 상기 제2 클래스의 알고리즘의 예로는, 이들로 제한되지는 않으나, 다음과 같은 것들이 포함된다: Monte Carlo(MC), 자가-일치 평균 필드(self-consistent mean field; SCMF), Boltzmann 샘플링(Metropolis et al., 1953, J Chem Phys 21: 1087), 촉진되는 어닐링(simulated annealing) (Kirkpatrick et al., 1983, Science, 220: 671-680), 유전학적 알고리즘(genetic algorithm; GA), 및 Fast and Accurate Side-Chain Topology and Energy Refinement (FASTER) (Desmet, et al., 2002, Proteins, 48: 31-43). 조합적 최적화 알고리즘은 단독으로도 사용될 수 있고, 또 다른 조합적 최적화 알고리즘과 조합하여 사용될 수도 있다.

본 발명의 일면에 있어서, 조합적 최적화 알고리즘을 적용하는 전략은 전체 적인 최소 에너지 배위를 발견하는 것이다. 대안적인 일면에 있어서, 상기 전략은 하나 이상의 낮은 에너지 또는 유리한 서열을 발견하는 것이다. 대안적인 일면에 있어서, 상기 전략은 전체적인 최소 에너지 배위를 발견한 뒤, 하나 이상의 낮은 에너지 또는 유리한 서열을 발견하는 것이다. 이에 대해서는 예를 들어, USSN 6, 269,312에 개략적으로 설명되어 있다. 바람직한 일면에 있어서, Dead End Elimination (DEE) 단계 및 Monte Carlo 단계가 이용된다. 다른 일면에 있어서, 타부(tabu) 검색 알고리즘이 이용되거나, 기타 검색 방법 중 DEE 및/또는 Monte Carlo와 조합하여 이용된다 (Modern Heuristic Search Methods, edited by V. J. Rayward-Smith et al., 1996, John Wiley & Sons Ltd.; USSN 10/218,102; and PCT WO 02/25588). 또 다른 바람직한 일면에 있어서, 유전학적 알고리즘이 이용되며, 이에 대해서는 예를 들어 USSN 09/877,695 및 USSN 10/071,859를 참조한다. 또 다른 일례로서는, US 6,188,965; US 6, 269,312; US 6,403,312; USSN 09/782,004; USSN 09/927,790; USSN 10/218,102; PCT WO 98/07254; PCT WO 01/40091; 및 PCT WO 02/25588에 보다 상세히 설명되어 있는 바와 같이, 전체적인 최적에 도달할 수 있으며, 이후 컴퓨터 조작 프로세싱(processing)이 발생해, 부가적인 최적화된 서열을 제작할 수 있다. 가장 간단한 일면에 있어서, 설계 산출은 조합적이지 않다. 즉, 에너지 산출값은 단일 가변 위치에 대한 개별적인 아미노산 치환을 평가하는 데 사용된다. 기타 산출값의 경우에는, 하나 이상의 가변 위치에 대하여 아미노산을 평가하는 것이 바람직하다. 바람직한 일면에 있어서, 모든 가능한 상호 작용 에너지는 조합적 최적화 이전에 산출된다. 대안적으로 바람직한 일면에 있어서, 에너지는, 필요한 경우, 조합적 최적화 과정 동안에 산출될 수 있다.

라이브러리 제작

본 발명은, 최적화된 Fc 변이체들 중 하나에 대하여 실험적으로 스크리닝될 수 있는 라이브러리를 제작하는 방법을 제공한다. "라이브러리(library)"란, 본원에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 Fc 변이체의 세트를 의미한다. 라이브러리는 임의의 형태의 변이체 세트를 일컬을 수 있다. 일면에 있어서, 상기 라이브러리는, 핵산 또는 아미노산 서열의 리스트, 또는 가변 위치에 대한 핵산 또는 아미노산 치환의 리스트이다. 예를 들어, 본 발명을 예시하기 위한 하기의 실시예들은, 가변 위치에 대한 아미노산 치환으로서 라이브러리를 제공한다. 일면에 있어서, 라이브러리는 원하는 특성에 대하여 최적화된 Fc 변이체인 적어도 하나의 서열의 리스트이다. 이에 대해서는 예를 들어 하기의 문헌을 참조한다: Filikov et al., 2002, Protein Sci 11: 1452-1461 and Luo et al., 2002, Protein Sci 11: 1218-1226. 대안적인 일면에 있어서, 라이브러리는 조합적 리스트로서 규정될 수 있으며, 이는 아미노산 치환의 리스트가 각각의 가변 위치에 대하여 제작되었음을 의미하며, 각각의 치환이 모든 기타 가변 위치에 대하여 모든 기타 설계된 치환과 조합되는 의미를 내포한다. 이러한 경우, 모든 가변 위치에 대하여 모든 가능성의 조합을 확장시키면, 거대한 명확하게 규정된 라이브러리가 얻어진다. 라이브러리는, Fc 부위 또는 Fc 부위의 일부 도메인 또는 단편을 포함하는 폴리펩티드의 물리적 조성물을 일컬을 수 있다. 그러므로, 라이브러리는, 정제된 형태 또는 정제되지 않은 형태의 항체 또는 Fc 융합체의 물리적 조성물을 일컬을 수 있다. 라이브러리 는, 상기 라이브러리 서열을 코딩하는 핵산의 물리적 조성물을 일컬을 수 있다. 상기 핵산은 상기 라이브러리 일원을 코딩하는 유전자, 임의의 작동가능하도록 연결된 핵산을 가지는 상기 라이브러리 일원을 코딩하는 유전자, 또는 임의의 기타 작동가능하도록 연결된 조절 서열, 선별 가능한 마커, 융합 구조체, 및/또는 기타 요소(element)와 함께 상기 라이브러리 일원을 코딩하는 발현 벡터일 수 있다. 예를 들어, 상기 라이브러리는, Fc 라이브러리 일원을 코딩하는 포유류의 발현 벡터 세트일 수 있으며, 상기 단백질 산물은 후속하여 발현, 정제, 및 실험적으로 스크리닝될 수 있다. 또 다른 일례로서, 상기 라이브러리는 디스플레이 라이브러리일 수 있다. 그러한 라이브러리는 예를 들어, 파지(phage) 디스플레이, 리보솜(ribosome) 디스플레이, 효모(yeast) 디스플레이, 박테리아 표면 디스플레이 등을 가능하게 하는, 몇몇 융합 파트너에 작동가능하도록 연결된 라이브러리 일원을 코딩하는 발현 벡터의 세트를 포함할 수 있다.

상기 라이브러리는 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝으로부터 얻어진 출력 서열 또는 서열들을 이용하여 제작될 수 있다. 이상에서 논의된 바와 같이, 컴퓨터 조작을 통해 제작된 라이브러리는, 무작위적으로 제작된 라이브러리에 비하여, 안정된, 적당하게 폴딩된, 기능적 서열에 대하여 유의하게 강화되어 있다. 결과적으로, 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝은, 설계 목표에 대하여 최적화된 단백질의 동정 기회를 증가시킨다. 몇몇 경우, 라이브러리는 모체 서열을 함유하는 것이 바람직할 수 있으나, 라이브러리 내의 서열 세트는 일반적으로, 항상 그러한 것은 아니지만, 모체 서열과 현저히 상이하다. 당 기술 분야에 공지된 바와 같이, 라이브러리 가 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 산출의 출력 결과로부터 유래되는 다양한 방식이 있다. 예를 들어, US 6,403,312; USSN 09/782,004; USSN 09/927,790; USSN 10/218,102; PCT WO 01/40091; 및 PCT WO 02/25588에 개시된 라이브러리 제작 방법이 본 발명에 이용될 수 있다. 일면에 있어서, 전체적인 최적의 서열의 특정 범위의 이내의 서열 스코어링이 라이브러리에 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 최저 에너지 서열의 10 kcal/mol 이내의 모든 서열이 라이브러리로서 사용될 수 있다. 대안적인 일면에 있어서, 하나 이상의 국부적 최소 서열의 특정 범위 이내에서 서열 스코어링이 사용될 수 있다. 바람직한 일면에 있어서, 상기 라이브러리 서열은 필터링된 세트로부터 얻어진다. 그러한 리스트 또는 세트는 당 기술 분야에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 Monte Carlo, B & B, 또는 SCMF과 같은 알고리즘을 이용하여 제작될 수 있다. 예를 들어, 필터링된 세트 내의 상위 10³ 또는 상위 10⁵개의 서열이 라이브러리를 포함할 수 있다. 대안적으로, 모든 돌연변이의 조합에 의하여 규정되는 서열의 총수가 라이브러리에 대한 컷오프(cutoff) 표준으로서 사용될 수 있다. 재조합된 서열의 총수에 대한 바람직한 값은 10 내지 10² 범위이며, 특히 바람직한 값은 100 내지 10⁹ 범위이다. 대안적으로, 컷오프는, 위치당 소정의 개수의 돌연변이가 도달되는 경우에 강요될 수 이 있다. 몇 가지 일면에 있어서, 컷오프를 만들지 않는 서열이 라이브러리 내에 포함된다. 이는 몇몇 경우, 예를 들어 라이브러리 제작에 대한 접근법을 평가하는 경우, 대조군 또는 비교군을 제공하는 경우, 또는 부가적인 서열 스페이스를 샘플링하는 경우에 바람직할 수 있다. 예를 들어, 심지어 모체 서열이 컷오프를 만들지 않는 경우일 지라도, 그러한 모체 서열이 라이브러리 내에 포함될 수 있다.

클러스터링 알고리즘(Clustering algorithm)은, 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 방법에 의하여 유도된 서열을 대표적인 그룹으로 분류하는 데에 유용할 수 있다. 예를 들어, USSN 10/218,102 및 PCT WO 02/25588에 개시된 클러스터링 방법 및 그의 적용 방법이 본 발명에 이용될 수 있다. 대표적인 그룹은 예를 들어 유사성에 의하여 규정될 수 있다. 유사성의 측정값은, 이들로 제한되지는 않으나, 서열 유사성 및 에너지 유사성을 포함한다. 그러므로, 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝으로부터 얻어지는 출력 서열은 국부적 최소 서열 주변에서 클러스터링될 수 있으며, 본원에 있어서 이는 클러스터링된 서열 세트라 일컬어진다. 예를 들어, 서열 스페이스 내에 근접한 서열의 세트가 기타 세트들로부터 구별될 수 있다. 일면에 있어서, 클러스터링된 세트들의 하나의 서브세트 이내의 보상 범위는, 클러스터링된 서열 세트의 하나 이상을 구성하는 서열의 일부, 대부분 또는 모두를 라이브러리 내에 포함시킴으로써 최대화될 수 있다. 예를 들어, 라이브러리 내에 이들 세트 내의 대다수의 서열을 포함시킴으로써, 1개, 2개, 또는 3개의 최저 에너지 클러스터링된 세트 이내의 보상 범위를 최대화하는 것이 유용할 수 있다. 대안적인 일면에 있어서, 클러스터링된 세트의 서열 전반에 걸친 다양성은 라이브러리 이내에 각각의 클러스터링된 세트 이내의 단지 한 서브세트의 서열만을 포함시킴으로써 샘플링될 수 있다. 예를 들어, 각각의 클러스터링된 세트 유래의 최저 에너지 서열을 라이브러리 내에 포함시킴으로써, 모든 또는 대부분의 클러스터링된 세트가 광 범위하게 샘플링될 수 있었다.

서열 정보는, 라이브러리 제작으로 위하여, 컴퓨터 조작을 통해 스크리닝 결과를 가이드 또는 필터링하는 데에 사용될 수 있다. 상술한 바와 같이, 단백질 서열의 정렬을 비교 및 대조함으로써, 한 위치에 대한 가변 정도 및 그 위치에서 천연적으로 발생하는 아미노산 타입이 확인될 수 있다. 그러한 분석으로부터 얻어지는 데이터는 본 발명에 유용하다. 서열 정보를 이용하는 경우 얻어지는 장점에 대해서는 이상에 제시되어 있으며, 그러한 장점들이 라이브러리 제작을 가이드하기 위하여 서열 정보를 사용하는 경우에 동등하게 적용된다. 서열 정렬 시 발생하는 아미노산 세트는, 단백질의 구조, 안정성, 용해성, 기능, 및 면역원성과의 양립성 면에서 무작위 정렬보다 높은 기회를 가지기 위하여 전개에 의하여 사전-스크리닝될 수 있을 것으로 여겨진다. 상술한 바와 같은, 서열 기원의 다양성 및 서열 정렬을 제작하는 방법이, 라이브러리 제작을 가이드하기 위한 서열 정보에도 적용된다. 유사하게, 이상에서 논의된 바와 같이, 한 정렬 내의 특정 잔기의 중요성 및 중량을 측정하는 데에는 다양한 표준이 적용될 수 있다. 이들 방법 또한, 라이브러리 제작을 가이드하기 위한 서열 정보에도 적용된다. 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝의 결과로부터 얻어지는 라이브러리 제작을 가이드하기 위한 서열 정보는 본 발명에 광범위하게 사용된다. 일면에 있어서, 서열 정보 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 출력 결과로부터 얻어지는 서열을 필터링하는 데 사용된다. 즉, 라이브러리를 제작하기 위하여, 일부의 치환이 컴퓨터 조작 출력 결과로부터 공제된다. 예를 들어, 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 산출 또는 산출들의 얻어진 출력 결과는, 라이 브러리가, 예를 들어 서열의 정렬 시 그 위치에서 관찰되는, 일부 표준만을 충족시키는 단지 그러한 아미노산, 또는 그러한 아미노산의 서브세트만을 포함하도록 필터링될 수 있다. 대안적인 일면에 있어서, 서열 정보는 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 출력에 서열을 첨가하는 데에 사용된다. 즉, 서열 정보는, 라이브러리를 제작하기 위하여 컴퓨터 조작 출력에 첨가되는 부가적인 아미노산의 선정을 가이드하는 데 사용된다. 예를 들어, 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 산출로부터의 주어지 위치에 대한 아미노산의 출력 세트는, 단백질 서열의 정렬 시 그 위치에서 관찰되는 하나 이상의 아미노산을 포함하도록 증대될 수 있다. 대안적인 일면에 있어서, 서열 정렬 정보를 기준으로 하여, 보상 범위 또는 다양성을 최대화하기 위하여, 하나 이상의 아미노산이 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 서열 출력에 대하여 첨가되거나 공제될 수 있다. 예를 들어, 서열 정렬에 있어서 발견되는 것들과 유사한 특성을 가지는 부가적인 아미노산이 상기 라이브러리에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 한 위치가 서열 정렬에 있어서 전하를 띠지 않는 극성 아미노산을 가지는 것으로 관찰되는 경우, 부가적인 전하를 띠지 않는 극성 아미노산이 상기 라이브러리의 그 위치에 첨가될 수 있다.

라이브러리는, 후속의 라이브러리를 제작하기 위하여, 추가 프로세싱될 수 있다. 이러한 방식으로, 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 산출로부터의 출력 결과는 1차 라이브러리로 간주될 수 있다. 이러한 1차 라이브러리는, 기타 산출로부터 얻어지는 기타 2차 라이브러리, 또는 후속의 산출, 서열 정보, 또는 기타 분석 방법을 이용하여 프로세싱되는, 또는 후속의 라이브러리를 제작하기 위하여 실험적으로 프로세싱되는 또 다른 라이브러리와 조합될 수 있으며, 이러한 또 다른 라이브러리를 본원에서는 2차 라이브러리라 일컫는다. 본원으로부터 이해되는 바와 같이, 상술한 바와 같이, 라이브러리를 가이드 또는 필터링하기 위한 서열 정보를 이용하는 것은, 그 자체가 1차 라이브러리로부터 2차 라이브러리를 제작하는 한가지 방법이다. 2차 라이브러리의 제작은, 사용자들로 하여금 한 라이브러리 내의 매개변수(parameter)들을 보다 크게 통제할 수 있도록 한다. 이는 보다 유효한 실험적 스크리닝을 가능하게 하며, 실험 결과로부터의 피드백(feedback)의 보다 용이하게 해석을 가능하게 할 수 있으며, 이는 보다 유효한 설계/실험 사이클을 제공한다.

1차 라이브러리로부터 2차 라이브러리를 제작하는 다양한 방법이 존재한다. 예를 들어, USSN 10/218,102 및 PCT WO 02/25588에는, 본 발명에 이용할 수 있는 2차 라이브러리 제작 방법이 개시되어 있다. 통상적으로, 1차 라이브러리가 몇 가지 방식으로 프로세싱되는 몇 가지 선택 단계가 발생한다. 예를 들어, 일면에 있어서, 일부 세트의 1차 서열이 2차 라이브러리를 형성하기 위하여 선정되는 선택 단계가 발생한다. 대안적인 일면에 있어서, 선택 단계는, 또한 일반적으로 선택 단계를 포함하는 컴퓨터 조작 단계이며, 여기서 몇몇 서브세트의 1차 라이브러리가 선정된 뒤, 추가의 컴퓨터 조작 분석 과정에 제시되며, 이는 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 및 다음과 같은 기법을 포함한다: 인 실리코(in silico)" 셔플링(shuffling) 또는 재조합(recombination) (US 5,830,721; US 5,811, 238; US 5,605,793; 및 US 5,837,458), 예를 들어 변형된 뉴클레오타이드를 이용하는 에러-경향의(error-prone) PCR; 다중 카세트(multi-cassettes)의 사용을 포함하는 공지 된 돌연변이 유발 기법; 및 DNA 셔플링 (Crameri et al., 1998, Nature 391: 288-291; Coco et al., 2001, Nat Biotechnol 19: 354-9; Coco et al., 2002, Nat Biotechnol, 20: 1246-50), 이종(heterogeneous) DNA 샘플 (US 5,939, 250); ITCHY (Ostermeier et al., 1999, Nat Biotechnol 17: 1205-1209); StEP (Zhao et al., 1998, Nat Biotechnol 16: 258-261), GSSM (US 6,171,820 및 US 5,965,408); 생체내 상동 재조합(in vivo homologous recombination), 라이게아제 관련 유전자 어셈블리 (ligase assisted gene assembly), 말단-상보적인 PCR, 사전-융합(profusion) (Roberts & Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94: 12297-12302); 효모/박테리아 표면 디스플레이(yeast/bacteria surface display) (Lu et al., 1995, Biotechnology 13: 366-372); Seed & Aruffo, 1987, Proc Natl Acad Sci USA 84 (10): 3365-3369; Boder & Wittrup, 1997, Nat Biotechnol15: 553-557). 대안적인 일면에 있어서, 선택 단계는 실험적 단계, 예를 들어 이하의 임의의 라이브러리 스크리닝 단계로서 발생하며, 여기서 1차 라이브러리의 일부 서브세트는 선정된 뒤, 이하에서 논의된 바와 같은, 유도 전개(evolution) 방법 중 하나를 이용하여, 실험적으로 재조합되어, 2차 라이브러리를 형성한다. 바람직한 일면에 있어서, 상기 1차 라이브러리는 US 6, 403,312에 개략적으로 설명된 바와 같이 제작 및 프로세싱된다.

2차 라이브러리 및 후속의 라이브러리의 제작은 본 발명에 광범위하게 이용될 수 있다. 일면에 있어서, 상이한 1차 라이브러리가, 2차 라이브러리 또는 후속의 라이브러리를 제작하기 위하여 제조합될 수 있다. 또 다른 일면에 있어서, 2차 라이브러리는, 돌연변이 가능성이 높은 위치 및 고도로 보존된 위치에 대하여 서열 다양성을 샘플링함으로써 제작될 수 있다. 상기 1차 라이브러리는, 주형 단백질 내의 어떠한 아미노산 위치가 고도의 돌연변이 빈도를 가지는 지, 및 어느 위치가 낮은 돌연변이 빈도를 가지는 지를 측정하기 위하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝에서 높은 돌연변이 다양성 정도를 나타내는 단백질 내의 위치가 후속의 설계 산출 단계에서 고정될 수 있다. 이렇게 하면, 제1 세트와 동일한 크기의 필터링된 세트가 제1 라이브러리 내에 고도로 보존된 위치에서 다양성을 나타낼 것이다. 대안적으로, 상기 2차 라이브러리는, 특정 빈도 이상의 돌연변이 빈도를 갖지 않는 위치를 불변 상태로 유지시키면서, 많은 개수의 돌연변이를 가지는 위치에 대하여 아미노산를 변화시킴으로써 제작될 수 있다.

이러한 기재가 1차 라이브러리 및 2차 라이브러리에 대한 후속의 라이브러리의 제작을 강제하는 것을 의미하지 않는다. 1차 라이브러리 및 2차 라이브러리는, 추가로 3차 라이브러리, 4차 라이브러리 등을 제작하기 위하여 프로세싱될 수 있다. 이러한 방식으로, 라이브러리 제작은 반복적인 과정이다. 예를 들어, 3차 라이브러리는 하나 이상의 2차 라이브러리에 적용되는 다양한 부가적인 단계를 이용함으로써 제작될 수 있다. 예를 들어, 추가의 컴퓨터 조작 프로세싱이 이루어질 수 있으며, 2차 라이브러리는 재조합될 수도 있고, 상이한 2차 라이브러리의 서브세트가 조합될 수도 있다. 바람직한 일면에 있어서, 3차 라이브러리는 2차 라이브러리의 조합에 의하여 제작될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 상이한 부분을 분석한 1차 및/또는 2차 라이브러리를 조합하여, 단백질의 조합된 부분들을 처리하는 3 차 라이브러리를 제작할 수 있다. 대안적인 일면에 있어서, 1차 라이브러리 유래의 변이체는 또 다른 1차 라이브러리 유래의 변이체와 조합되어, 매우 긴 필터링된 세트를 창출하는 경우보다 저렴한 컴퓨터 조작 비용으로, 조합된 3차 라이브러리를 제공할 수 있다. 이러한 조합은, 예를 들어 Fc의 거대 단백질, 특히 거대한 다중 도메인 단백질을 분석하는 데에 적용될 수 있다. 그러므로, 2차 라이브러리 제작에 관한 이상의 설명은 1차 라이브러리에 대한 후속의 임의의 라이브러리를 제작하는 데 적용되며, 여기서 최종 결과는, 설계 목표에 대하여 최적화된 단백질 변이체를 획득하기 위하여 실험적으로 스크리닝될 수 있는 최종 라이브러리이다. 이러한 예들은 본 발명에 대한 임의의 특정 용도 또는 이론으로 2차 라이브러리를 한정하는 의미하는 것은 아니다. 오히려, 이들 예는 2차 라이브러리, 및 후속의 라이브러리, 예를 들어 3차 라이브러리 등의 제작이 라이브러리 제작을 위한 컴퓨터 조작을 통한 스크리닝 방법에 광범위하게 유용함을 예시하는 것임을 의미한다.

실험적 생산 및 탐색

본 발명은 Fc 변이체의 라이브러리 생산 및 탐색하는 방법을 제공한다.

상기한 방법은 본 발명을 임의의 특정한 적용 또는 작용의 이론에 한정하고자 하는 의도는 아니다. 오히려, 상기 제공된 방법은 하나 이상의 Fc 변이체 또는 Fc 변이체의 하나 이상의 라이브러리가 실험적으로 생산되고 탐색되어 최적화된 Fc 변이체를 얻을 수 있다는 것을 일반적으로 설명하고자 하는 것이다. 본 명세서에 정확하게 정의된 바와 같은 Fc 도메인, 그의 도메인 또는 단편, 또는 항체 또는 Fc 융합체와 같은 Fc를 포함하는 더 큰 폴리펩티드이든, Fc 변이체는 임의의 문맥에서 생산되고 탐색될 수 있다. 항체 분자 생물학, 발현, 정제 및 탐색을 위한 일반적 방법은 Duebel & Kontermann에 의하여 편집된, Antibody Engineering, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; 및 Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5: 683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2: 339-76; Antibodies: A Laboratory Manual by Harlow & Lane, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988에 개시되어 있다.

본 발명의 일 예에서, 상기 라이브러리 서열은 상기 구성원(member) 서열을 코딩하는 핵산을 제작하는데 사용되고, 원하는 경우 숙주 세포에 클로닝되어 발현되고 분석될 수 있다. 따라서, 각 구성원 단백질 서열을 코딩하는 핵산, 특히 DNA가 제작될 수 있다. 이들 실시(practice)는 잘 알려진 과정을 사용하여 수행된다. 예를 들면, 본 발명에 사용될 수 있는 다양한 방법들이 Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 3^rd Ed.(Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001), 및 Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley & Sons)에 개시되어 있다. 당업자에 의하여 이해되고 있는 바와 같이, 많은 수의 서열을 포함하는 라이브러리를 위한 정확한 서열을 생성하는 것은 잠재적으로 비싸고 시간 소모적이다. 따라서, 본 발명의 라이브러리를 효율적으로 생성하기 위하여 사용될 수 있는 다양한 방법들이 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 그러한 방법들은 미국 특허 제6,403,312호; 미국 출원번호 제09/782,004호; 미국 출원번호 제09/927,790호; 미국 출원번호 제10/218,102호; PCT WO 01/40091; 및 PCT WO 02/25588에 기재 되어 있고 참조되어진다. 그러한 방법들에는 유전자 조립법, PCR-기초한 방법 및 PCR의 변이법들을 이용하는 방법, 라이게이즈 연쇄 반응에 기초한 방법, 합성 셔플링에 사용되는 방법들, 오류 유발성 증폭법 및 무작위 돌연변이를 갖는 올리고를 사용하는 방법들과 같은 풀링된 올리고 방법, 고전적 부위-지향된 돌연변이 유발법, 카세트 돌연변이유발법, 및 다른 증폭 및 유전자 합성법이 포함되나 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 당업계에 알려져 있는 바와 같이, 유전자 조립, 돌연변이 유발, 벡터 서브클로닝 등을 위한 다양한 상업적으로 이용가능한 키트 및 방법들이 있으며, 그러한 상업적 제품들은 라이브러리의 Fc 변이체 구성원을 코딩하는 핵산을 생성하기 위하여 본 발명에 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 Fc 변이체는 상기 Fc 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산, 바람직하게는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를, 상기 단백질의 발현을 유도 또는 야기시키기에 적절한 조건하에서 배양함으로써 생산될 수 있다. 발현에 적절한 상기 조건은 발현 벡터 및 숙주 세포의 선택에 따라 변할 것이고, 일상적 실험을 통하여 당업자에 의하여 용이하게 확인될 것이다. 포유동물 세포, 박테리아, 곤충 세포 및 효모를 포함하나 이들에 한정되는 것은 아닌, 아주 다양한 적절한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 사용될 수 있는 다양한 세포주가 미국세포주은행(American Type Culture Collection)으로부터 이용가능한, ATCC^® 세포주 카탈로그에 기재되어 있다.

바람직한 예에서, 상기 Fc 변이체는, 발현 구조체가 레트로바이러스 또는 아 데노바이러스와 같은 바이러스를 이용하여 포유동물 세포에 도입될 수 있는 시스템을 포함한, 포유동물 발현 시스템에서 발현된다. 임의의 포유동물 세포가 사용될 수 있으며, 특히 바람직하게는 인간, 마우스, 탯, 햄스터 및 영장류 세포이다. 또한 적합한 세포에는 Jurkat T 세포, NIH3T3, CHO, COS, 및 293 세포가 포함되나 이들 예에 한정되지 않는, 알려진 연구 세포가 포함된다. 또다른 바람직한 예에서, 라이브러리 단백질은 박테리아 세포에서 발현된다. 박테리아 발현 시스템은 당업계에 잘 알려져 있으며, 대장균, 바실러스 서브틸러스, 스트렙토코커스 크레모리스 및 스트렙토코커스 리비단스가 포함된다. 또다른 바람직한 예에서, Fc 변이체는 곤충 세포 또는 효모 세포에서 생산된다. 또다른 예에서, Fc 변이체는 무세포 번역 시스템을 사용하여 시험관내에서 발현된다. 원핵세포(예, 대장균) 및 진핵세포(예, 밀배야, 토끼 레티큘로사이트)로부터 유래된 시험관내 번역 시스템이 이용가능하고, 희망하는 단백질의 발현 수준 및 기능적 특성에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 당업자에 의하여 이해되고 있는 바와 같이, 시험관내 번역 시스템은 일부 디스플레이 기술 예를 들면, 리보좀 디스플레이를 위하여 필요하다. 더욱이, 상기 Fc 변이체는 화학 합성법에 의하여 생산될 수 있다.

본 발명의 상기 Fc 변이체를 코딩하는 상기 핵산은 발현 벡터에 삽입되어 상기 단백질을 발현할 수 있다. 다양한 발현 벡터가 단백질 발현을 위하여 이용될 수 있다. 발현 벡터는 자가 복제 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈 내에 삽입되는 벡터를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 상기 숙주 세포 형태와 양립가능하도록 제작된다. 따라서, 본 발명에 사용될 수 있는 발현 벡터에는 포유동물 세포, 박테리아, 곤충 세포, 효모 및 시험관내 시스템에서 단백질 발현을 할 수 있는 것들이 포함되나 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 당업계에 알려진 바와 같이, Fc 변이체 단백질을 발현하기 위하여 본 발명에 사용될 수 있는 다양한 발현 벡터가 상업적으로 또는 다른 방법으로 이용가능하다.

발현 벡터는 제어 또는 조절 서열, 선택 마커, 임의의 융합 파트너, 및/또는 추가적인 요소와 작동가능하게 연결된 단백질을 전형적으로 포함한다. 본 명세서에서 "작동가능하게 연결된(operably linked)"이란 상기 핵산이 또다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여 있는 것을 의미한다. 일반적으로, 이들 발현 벡터에는 상기 Fc 변이체를 코딩하는 상기 핵산에 작동가능하게 연결된 전사 및 번역 조절 핵산을 포함하고, 상기 단백질을 발현시키기 위하여 사용된 상기 숙주 세포에 일반적으로 적절하다. 일반적으로, 상기 전사 및 번역 조절 서열은 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위, 전자 시작 및 종결 서열, 번역 시작 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성자 서열을 포함할 수 있다. 또한 당업계에 알려진 바와 같이, 발현 벡터는 선별 유전자 또는 마커를 일반적으로 포함하고 있어, 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포의 선별이 가능하도록 한다. 선별 유전자는 당업계에 잘 알려져 있으며, 사용되는 상기 숙주 세포에 따라 달라질 것이다.

Fc 변이체는 융합 파트너에 작동가능하게 연결되어 있어 상기 발현된 단백질의 표적화(targeting), 정제, 탐색, 디스플레이 등이 될 수 있도록 할 수 있다. 융합 파트너는 링커 서열을 통하여 상기 Fc 변이체 서열에 연결될 수 있다. 상기 링커 서열은 비록 긴 링커 서열도 또한 사용될 수 있으나, 일반적으로 작은 수, 전 형적으로 10개 이하의 아미노산을 포함한다. 일반적으로, 링커 서열은 유연성이 있고 분해에 저항성이 있는 것으로 선택된다. 당업자에 의하여 이해되고 있는 바와 같이, 임의의 아주 다양한 서열이 링커로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 통상적인 링커 서열은 아미노산 서열 GGGGS(서열번호 7)를 포함한다. 융합 파트너는 Fc 변이체 단백질 및 임의의 연합된 융합 파터너를 희망하는 세포 위치 또는 세포외부 배지로 지시하는 표적화 또는 신호 서열일 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, 특정한 신호 서열은 단백질을 성장 배지로 분비하거나, 세포의 내막과 외막 사이에 위치하는 페리플라즘 공간으로 지시할 수 있다. 융합 파트너는 또한 정제 및/또는 탐색이 될 수 있도록 하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 서열일 수 있다. 그러한 융합 파트너에는 폴리히스티딘 태그(His-tag)(예를 들면, 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 시스템(예, Ni⁺²친화성 칼럼)과 함께 사용하기 위한 H₆ 및 H₁₀ 또는 다른 태그), GST 융합체, MBP 융합체, Strep-tag, 박테리아 효소 BirA의 BSP 비오티닐화 표적 서열, 및 항체에 의하여 표적화된 에피토프 태그(예를 들면, c-myc 태그, flag-tag 등)가 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 당업자에 의하여 이해되고 있는 바와 같이, 그러한 태그는 정제, 탐색 또는 둘 모두를 위하여 유용할 수 있다. 예를 들면, Fc 변이체는 His-tag을 Ni⁺² 친화성 칼럼에 고정화함으로써 His-tag를 사용하여 정제될 수 있고, 다음으로 정제된 후에 동일한 상기 His-tag이 Ni⁺² 코팅된 플레이트에 상기 항체를 고정화하여 ELISA 또는 다른 결합 분석(하기하는 바와 같음)을 수행하기 위하여 사용될 수 있다. 융합 파트너는 선별방법을 사용하여 Fc 변이체를 탐색할 수 있도록 할 수 있다(아래 참조). 다양한 선별 방법이 가능하도록 하는 융합 파트너는 당업계에 잘 알려져 있으며, 이들 모두는 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들면, Fc 변이체 라이브러리의 구성원을 유전자 III 단백질에 융합함으로써, 파지 디스플레이가 이용되어질 수 있다(Kay et al., Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, Academic Press, San Diego, CA, 1996; Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10838; Smith, 1985, Science 228: 1315-1317). 융합 파트너는 Fc 변이체가 표지되어지도록 할 수 있다. 또한, 융합 파트너는 상기 발현 벡터 상의 특이적 서열에 결합하여, 상기 융합 파트너 및 연관된 Fc 변이체가 그들을 코딩하는 상기 핵산과 공유적으로 또는 비공유적으로 연결되어지도록 할 수 있다. 예를 들면, 미국 출원번호 제09/642,574호; 미국 출원번호 제10/080,376호; 미국 출원번호 제09/792,630호; 미국 출원번호 제10/023, 208호; 미국 출원번호 제09/792,626호; 미국 출원번호 제10/082,671호; 미국 출원번호 제09/953,351호; 미국 출원번호 제10/097,100호; 미국 출원번호 제60/366,658호; PCT WO 00/22906; PCT WO 01/49058; PCT WO 02/04852; PCT WO 02/04853; PCT WO 02/08023; PCT WO01/28702; 및 PCT WO 02/07466에는 그러한 융합 파트너 및 본 발명에 사용될 수 있는 방법이 개시되어 있다.

외래 핵산을 숙주 세포에 도입하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 사용되는 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 방법들에는 덱스트란 매개된 형질감염, 칼 슘 포스페이트 침전, 칼슘 클로라이드 처리, 폴리브렌 매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 바이러스 또는 파지 감염, 리포좀 내에 상기 폴리뉴클레오티드의 포집화, 및 상기 DNA의 핵 내로의 직접적인 미세주입이 포함되나 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 포유동물 세포의 경우에 있어서, 형질감염은 임시적 또는 안정적일 수 있다.

바람직한 예에서, Fc 변이체 단백질은 발현 후 정제되거나 분리된다. 단백질은 당업계에 알려진 다양한 방법으로 분리되거나 정제될 수 있다. 표준 정제 방법에는 대기압하에서 또는 FPLC 및 HPLC와 같은 시스템을 사용하여 고압하에서 수행되는, 이온 교환, 소수성 상호작용, 친화성, 크기 또는 겔 여과, 및 역상을 포함한 크로마토그래피 방법이 포함된다. 정제 방법에는 또한 전기영동, 면역학적, 침전, 투석, 및 크로마토포커싱 방법이 포함된다. 단백질 농도와 연관되어, 한외여과 및 정용 여과(diafiltration) 방법이 또한 유용하다. 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이, 다양한 천연 단백질이 Fc 및 항체에 결합하고, 이들 단백질은 Fc 변이체의 정제를 위하여 본 발명에 사용되어질 수 있다. 예를 들면, 박테리아 단백질 A 및 G는 상기 Fc 도메인에 결합한다. 비슷하게, 물론 상기 항체의 표적 항원이 하는 바와 같이, 상기 박테리아 단백질 L은 일부 항체의 상기 Fab 도메인에 결합한다. 정제는 종종 특정한 융합 파트너에 의하여 가능하게 될 수 있다. 예를 들면, Fc 변이체 단백질은 GST 융합체가 이용되는 경우, 글루타치온 수지를, His-tag가 이용되는 경우, Ni⁺² 친화성 크로마토그래피를, 또는 flag-tag가 사용되는 경우, 고 정화된 항-flag 항체를 사용하여 정제될 수 있다. 적합한 정제 방법에서 일반적 지침에 대하여, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY,1994 참조. 필요한 정제의 정도는 상기 Fc 변이체의 탐색 또는 용도에 따라 달라질 것이다. 일부 예에서는 정제가 필요하지 않다. 예를 들면, 일 예에서, 상기 Fc 변이체가 분비되는 경우, 탐색은 상기 배지로부터 직접적으로 이루어질 수 있다. 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이, 일부 선별 방법은 단백질의 정제와는 관련이 없다. 따라서, 예를 들면, Fc 변이체의 라이브러리는 파지 디스플레이 라이브러리로 만들어져, 단백질 정제가 수행되지 않을 수 있다.

Fc 변이체는 시험관내 분석, 생체내 및 세포에 기초한 분석 및 선별 기술에 사용되는 방법들을 포함하나 이들 예에 한정되지는 않는, 다양한 방법들을 사용하여 탐색될 수 있다. 자동화 및 고용량 탐색 기술이 상기 탐색 과정에 사용되어질 수 있다. 탐색은 융합 파트너 또는 표지의 용도를 이용할 수 있다. 융합 단백질의 용도는 상기한 바와 같다. 본 명세서에 있어서 "표지된(labeled)"이란 본 발명의 상기 Fc 변이체가 탐색에서 검출될 수 있도록 하기 위하여 부착된 하나 이상의 원소, 동위원소, 또는 화학적 화합물을 갖는 것을 의미한다. 일반적으로, 표지는 3가지의 부류에 속한다: a) 항체에 의하여 인지되는 융합 파트너로서 삽입된 에피토프일 수 있는, 면역 표지, b) 방사능 또는 무거운 동위원소일 수 있는 동위원소 표지, 및 c) 형광 및 발색 염료 또는 다른 표지 방법이 가능하도록 하는 비오틴과 같은 분자를 포함할 수 있는, 소분자 표지. 표지는 임의의 위치에서 상기 화합물 에 삽입될 수 있으며, 단백질 발현 중에 시험관내 또는 생체내로 삽입될 수 있다.

바람직한 예에서, Fc 변이체의 기능적 및/또는 생물리학적 특성은 시험관내 분석으로 탐색될 수 있다. 시험관내 분석은 넓은 동적 범위가 희망하는 특성에 대하여 탐색될 수 있도록 한다. 탐색될 수 있는 Fc 변이체의 특성에는 안정성, 용해도, 및 Fc 리간드, 예를 들면 FcγR에 대한 친화성이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 복수의 특성이 동시 또는 개별적으로 탐색될 수 있다. 상기 분석의 요건에 따라, 단백질은 정제되거나 정제되지 않은 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 탐색은 상기 Fc 변이체에 결합하는 것으로 알려진 또는 결합할 것으로 여겨지는 단백질 또는 비단백질에 Fc 변이체가 결합하는지에 대한 정성 또는 정량적인 결합 분석이다. 바람직한 예에서, 상기 탐색은 상기 항체의 또는 Fc 융합체의 표적 항원에의 결합을 측정하기 위한 결합 분석이다. 또다른 바람직한 예에서, 상기 탐색은 변이체가 FcγR의 패밀리, 신생아 리셉터 FcRn, 보체 단백질 C1q, 및 박테리아 단백질 A 및 G를 포함하나 이들에 한정되지 않는 Fc 리간드에 결합하는지에 대한 분석이다. 상기 Fc 리간드는 임의의 개체로부터 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간, 마우스, 탯, 토끼, 및 원숭이로부터 유래한 것이다. 결합 분석은 FRET(형광 공명 에너지 전달) 및 BRET(생물발광 공명 에너지 전달)-기초한 분석, AlphaScreen^TM(증폭된 발광 근접성 균질성 분석), 섬광근접측정법, ELISA, SPR(표면 플라즈몬 공명, 또한 BIACORE^TM로도 알려짐), 등온적정 칼로리메트리(ITC), 분별 스캐닝 칼로리메트리(DSC), 겔 전기영동, 및 겔 여과를 포함한 크로마토그래피를 포 함하나, 이들 예에 한정되지는 않는, 당업계에 알려진 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 이들 및 다른 방법들은 상기 Fc 변이체의 일부 융합 파트너 미국특허 제 표지를 이용할 수 있다. 분석은 발색, 형광, 발광, 미국특허 제 동위원소 표지를 포함하나 이들 예에 한정되는 것은 아닌, 다양한 검출 방법을 이용할 수 있다.

Fc 변이체 단백질의 생물리학적 특성은 예를 들면, 안정성 및 용해도는 당업계에 알려진 다양한 방법을 이용하여 탐색될 수 있다. 단백질 안정성은 접혀진 상태(folded state)와 펼쳐진 않은 상태(unfolded state) 사이의 열역학적 평형을 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 Fc 변이체 단백질은 화학적 변성제, 열, 미국특허 제 pH를 이용하여 펼쳐질 수 있고, 이 전이는 원편광이색성 분광법(circular dichroism spectroscopy), 형광 분광법, 흡광 분광법, NMR 분광법, 칼로리메트리, 및 단백질 분해를 포함하나, 이들 예에 한정되지 않는, 방법들을 이용하여 모니터링될 수 있다. 당업자에 의하여 이해되고 있는 바와 같이, 접힘 및 펼침 전이의 속도론적 변수(kinetic parameter)가 또한 이들 방법 및 다른 기법을 사용하여 모니터링될 수 있다. Fc 변이체 단백질의 용해도 및 전체적 구조적 견고성은 당업계에 알려진 다양한 방법을 사용하여 정량적으로 또는 정성적으로 결정될 수 있다. Fc 변이체 단백질의 생물리학적 특성을 특징지우기 위하여 본 발명에 사용될 수 있는 방법에는 겔 전기영동, 크기 배제 크로마토그래피 및 역상 고속액상 크로마토그래피(RP-HPLC)와 같은 크로마토그래피, 질량 분석법, 자외선 흡광 분광법, 형광 분광법, 원편광이색성 분광법, 등온적정 칼로리메트리, 분별스캐닝 칼로 리메트리, 분석적 한외 원심분리, 동적 광 산란, 단백질 분해, 및 가교, 탁도 측정, 여과지 지연 분석(filter retardation assays), 면역학적 분석, 형광 염료 결합 분석, 단백질-염색 분석, 현미경, 및 ELISA 또는 다른 결합 분석을 통한 응집체의 검출이 포함된다. X-선 결정학적 기법 및 NMR 분광법을 이용한 구조 분석이 또한 사용될 수 있다. 일 예에서, 안정성 및/또는 용해도는 어떤 정의된 시간 경과 후에 단백질 용액의 양을 결정함으로써 측정될 수 있다. 이 분석에서, 상기 단백질은 일부 극한 조건, 예를 들면, 상승된 온도, 낮은 pH, 또는 변성제의 존재에 노출되거나 노출되지 않을 수 있다. 기능은 일반적으로 안정하고, 용해성이고, 및/또는 잘 접혀진/구조화된 단백질을 필요로 하기 때문에, 상기한 기능적 및 결합 분석은 또한 그러한 측정을 수행하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들면, Fc 변이체를 포함하는 용액은 표적 항원에 결합할 수 있는 능력에 대하여 분석되고, 다음으로 하나 이상의 정의된 시간 동안 상승된 온도에 노출되고, 다음으로 다시 항원 결합에 대하여 분석될 수 있다. 펼쳐지고 응집된 단백질은 항원에 결합할 것으로 예상되지 않기 때문에, 잔존 활성의 양은 상기 Fc 변이체의 안정성 및 용해도의 척도를 제공한다.

바람직한 예에서, 상기 라이브러리는, 하나 이상의 세포-기초한 또는 생체내 분석을 사용하여 탐색된다. 그러한 분석에 대하여, 정제된 또는 정제되지 않은, Fc 변이체 단백질은 일반적으로 외래적으로 첨가되어 세포가 라이브러리에 속하는 개별 변이체 또는 변이체들의 풀에 노출된다. 이들 분석은 항상은 아니지만, 일반적으로 상기 Fc 변이체를 포함하는 항체 또는 Fc 융합체의 기능 즉, 상기 항체 또 는 Fc 융합체가 표적 항원에 결합하고 일부 생화학적 과정, 예를 들면, 작용체 기능, 리간드/리셉터 결합 저해, 세포자가사 등을 매개하는 능력에 근거한다. 그러한 분석은 종종 항체 또는 Fc 융합체에 대하여 세포가 반응하는 것, 예를 들면, 세포 생존, 세포 사멸, 세포 형태의 변화 또는 천연 유전자 또는 리포터 유전자의 세포 발현과 같은 전사적 활성화를 모니터링하는 것과 관련된다. 예를 들면, 그러한 분석은 Fc 변이체가 ADCC, ADCP, 또는 CDC를 유도할 수 있는 능력을 측정할 수 있다. 일부 분석에 대하여, 상기 표적 세포에 대하여 부가적인, 추가의 세포 또는 성분 예를 들면, 혈청 보체, 또는 말초혈액 단핵세포(PBMC), NK 세포, 마크로파지 등과 같은 작용체 세포가 첨가되어질 필요가 있다. 그러한 부가적인 세포는 임의의 개체, 바람직하게는 인간, 마우스, 탯, 토끼 및 원숭이로부터 유래할 것일 수 있다. 항체 및 Fc 융합체는 상기 항체 표적 항원을 발현하는 특정한 세포의 세포자가사를 야기시킬 수 있거나, 또는 상기 분석에 첨가된 면역 세포에 의한 표적 세포에 대한 공격을 매개할 수 있다. 세포 사멸 또는 생존성을 모니터링하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 염료, 면역학적, 세포화학적, 및 방사능 시약을 사용하는 것이 포함된다. 예를 들면, 카스파제 염색 분석법은 세포자가사가 측정될 수 있도록 하고, 방사능 기질 또는 알라마르 블루(alamar blue)와 같은 형광 염료의 섭취 또는 방출은 세포 성장 또는 활성화가 모니터링될 수 있도록 할 수 있다. 바람직한 예에서, DELFIA^® EuTDA-기초한 세포독성 분석(Perkin Elmer, MA)이 사용된다. 또한, 죽은 또는 손상된 표적 세포는 하나 이상의 천연 세포내 단백질 예를 들면, 락테이트 디히드로게나제의 방출을 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 전사적 활성화는 또한 세포-기초한 분석법에서 기능을 분석하는 방법으로서 역할을 할 수 있다. 이 경우, 반응은 상승조절될 수 있는 천연 유전자 또는 단백질에 대하여 분석함으로써 모니터링될 수 있으며, 예를 들면, 특정한 인터루킨의 방출이 측정될 수 있거나, 대안적으로 판독(readout)은 리포터 구조체를 통하여 될 수 있다. 세포 기초한 분석은 Fc 변이체의 존재에 대한 반응으로서 세포의 형태학적 변화의 측정과 또한 연관될 수 있다. 그러한 분석을 위한 세포 형태는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있으며, 당업계에 알려진 다양한 세포주가 사용될 수 있다.

또한, 세포 기초한 탐색은 Fc 변이체를 코딩하는 핵산으로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 이용하여 수행된다. 즉, Fc 변이체 단백질은 상기 세포에 외래적으로 첨가되지 않는다. 예를 들면, 일 예에서, 상기 세포 기초한 탐색은 세포 표면 디스플레이를 이용한다. 세포 표면 상에 Fc 변이체를 디스플레이할 수 있는 용합 파트너가 이용될 수 있다(Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12: 395-399). 본 발명에 사용될 수 있는 세포 표면 디스플레이 방법에는 박테리아(Georgiou et al.,1997, Nat Biotechnol 15: 29-34; Georgiou et al., 1993, Trends Biotechnol 11: 6-10; Lee et al., 2000, Nat Biotechnol 18: 645-648; Jun et al., 1998, Nat Biotechnol 16: 576-80), 효모(Boder & Wittrup, 2000, Methods Enzymol 328: 430-44; Boder & Wittrup, 1997, Nat Biotechnol 15: 553-557), 및 포유 동물 세포(Whitehorn et al., 1995, Biol technology 13: 1215-1219) 상에의 디스플레이가 포함되나 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 또다른 예에서, Fc 변이체 단백질은 세포 표면에 디스플레이되지 않고, 오히려 세포 내부적으로 또는 일부 다른 세포 구획 내에서 탐색될 수 있다. 예를 들면, 페리플라즘 발현 및 세포분별 탐색(cytometric screening)(Chen et al., 2001, Nat Biotechnol 19: 537-542), 단백질 단편 상보성 분석(Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91: 10340-10344.; Pelletier et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95: 12141-12146), 및 효모 2 교잡 탐색(yeast two hybrid screen)(Fields & Song, 1989, Nature 340: 245- 246)이 본 발명에 사용될 수 있다. 또한, 상기 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들면, 항체 또는 Fc 융합체가 세포에 일부 선택가능한 성장 잇점을 제공하는 경우, 이 특성이 Fc 변이체에 대하여 탐색 또는 선별하기 위하여 사용될 수 있다.

당업계에 알려진 바와 같이, 탐색 방법의 서브세트는 라이브러리의 유리한 구성원을 선별하는 방법들이다. 그러한 방법은 본 명세서의 "선별 방법(selection methods)"으로 참조되어 있으며, 이들 방법은 Fc 변이체 라이브러리 탐색을 위한 본 발명에 사용될 수 있다. 라이브러리가 선별방법을 사용하여 탐색되는 경우, 유리한 즉 일부 선별 기준을 만족하는 라이브러리의 구성원들만이 증식되고, 분리되고, 및/또는 관찰된다. 이해되고 있는 바와 같이, 가장 적합한 변이체만이 관찰되기 때문에, 그러한 방법은 라이브러리 구성원의 상기 적합성(fitness)을 개별적으로 분석하는 방법에 의하여 탐색될 수 있는 것보다 더 큰 라이브러리를 탐색할 수 있도록 한다. 선별은 Fc 변이체의 표현형을 그의 유전형과 즉, Fc 변이체의 기능을 그를 코딩하는 핵산과 공유적으로 또는 비공유적으로 연결하는 임의의 방법, 기 법 또는 융합 파트너에 의하여 가능하게 된다. 예를 들면, 선별 방법으로서 파지 디스플레이의 사용은 라이브러리 구성원을 유전자 III 단백질에 융합함으로써 가능하게 된다. 이런 식으로, 일부 기준, 예를 들면, FcγR에 대한 결합 친화성을 만족하는 변이체 단백질의 선별 또는 분리는 또한 그를 코딩하는 핵산을 선별 또는 분리한다. 일단 분리되면, 상기 Fc 변이체를 코딩하는 상기 유전자 또는 유전자들은 증폭될 수 있다. 패닝(panning)이라고 알려진, 분리 및 증폭의 이 과정은 반복되어, 상기 라이브러리 중의 유리한 Fc 변이체가 부유화되도록 할 수 있다. 최종적으로 부착된 핵산의 핵산 서열분석에 의하여 유전자를 확인할 수 있게 된다.

Fc 변이체 라이브러리 탐색을 위한 본 발명에 사용될 수 있는 다양한 선별 방법이, 당업계에 알려져 있다. 이들 예에는, 파지 디스플레이(Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, Kay et al., 1996, Academic Press, San Diego, CA, 1996; Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10838; Smith, 1985, Science 228: 1315-1317) 및 선택적 파지 감염과 같은 그의 파생 방법(Malmborg et al., 1997, J Mol Biol 273: 544-551), 선택적으로 감염성인 파지(Krebber et al., 1997, J Mol Biol 268: 619-630), 및 지연된 감염성 패닝(Benhar et al., 2000, J Mol Biol 301: 893-904), 박테리아(Georgiou et al, 1997, Nat Biotechnol 15: 29-34; Georgiou et al., 1993, Trends Biotechnol 11: 6-10; Lee et al., 2000, Nat Biotechnol 18: 645-648; Jun et al., 1998, Nat Biotechnol 16: 576-80), 효모(Boder & Wittrup, 2000, Methods Enzymol 328: 430-44; Boder & Wittrup,1997, Nat Biotechnol 15: 553-557), 및 포유동물 세 포(Whitehorn et al., 1995, Biol technology 13: 1215-1219) 상에의 디스플레이와 같은 세포 표면 디스플레이(Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12: 395-399), 뿐만 아니라 폴리좀 디스플레이(Mattheakis et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91: 9022-9026), 리보좀 디스플레이(Hanes et al., 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94: 4937-4942), mRNA 디스플레이(Roberts & Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94: 12297-12302; Nemoto et al., 1997, FEBS Lett 414: 405-408), 및 리보좀-불활성화 디스플레이 시스템(Zhou et aL, 2002, J Am Chem Soc 124, 538-543)과 같은 시험관내 디스플레이 기술(Amstutz et al., 2001, Curr Opin Biotechnol 12: 400-405)이 포함되나 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 사용될 수 있는 다른 선별 방법에는, 페리플라즘 발현 및 세포분별 탐색(cytometric screening)(Chen et al., 2001, Nat Biotechnol 19: 537-542), 단백질 단편 상보성 분석(Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91: 10340-10344; Pelletier et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95: 12141-12146), 및 선별 방식(Visintin et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96: 11723-11728)으로 사용된 효모 2 잡종 탐색(Fields & Song, 1989, Nature 340: 245-246)을 포함되나 이들 예에 한정되지는 않는 생체내 방법과 같은, 디스플레이에 의존하지 않는 방법이 포함된다. 또다른 예에서, 선별은 상기 발현 벡터 상의 특이적 서열에 결합하는, 그에 따라 상기 융합 파트너를 공유적으로 또는 비공유적으로 연결하고 Fc 변이체 라이브러리 구성원을 그들을 코딩하는 핵산과 연관시키는, 융합 파트너에 의하여 가능하게 된다. 예를 들면, 미국 출원번호 제09/642,574; 미국 출 원번호 제10/080,376; 미국 출원번호 제09/792,630; 미국 출원번호 제10/023, 208; 미국 출원번호 제09/792,626; 미국 출원번호 제10/082,671; 미국 출원번호 제09/953,351; 미국 출원번호 제10/097,100; 미국 출원번호 제60/366,658; PCT WO 00/22906; PCT WO 01/49058; PCT WO 02/04852; PCT WO 02/04853; PCT WO 02/08023; PCT WO 01/28702; 및 PCT WO 02/07466에는 본 발명에 사용될 수 있는 그러한 융합 파트너 및 기술이 개시되어 있다. 또다른 예에서, 항체 또는 Fc 융합체와 같은 상기 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드의 발현이 세포에 일부 성장, 재생 또는 생존 잇점을 제공하는 경우에는, 생체내 선별이 일어날 수 있다.

*"지향된 진화(directed evolution)" 방법이라고 하는 선별 방법의 서브세트는, 종종 새로운 돌연변이의 삽입과 함께, 선별 중에 유리한 서열의 교잡(mating) 또는 교배(breading)를 포함한다. 당업자에 의하여 이해되고 있는 바와 같이, 지향된 진화법은 라이브러리 중의 가장 유리한 서열의 확인을 촉진할 수 있고, 탐색되는 서열의 다양성을 증가시킬 수 있다. Fc 변이체 라이브러리 탐색을 위한 본 발명에 사용될 수 있는 당업계에 알려진 다양한 지향된 진화에는, DNA 셔플링(PCT WO 00/42561 A3; PCT WO01/70947 A3), 엑손 셔플링(미국특허 제6,365,377호; Kolkman & Stemmer, 2001, Nat Biotechnol 19: 423-428), 패미리 셔플링(Crameri et al., 1998, Nature 391: 288-291; 미국특허 제6,376, 246호), RACHITT^TM(Coco et al., 2001, Nat Biotechnol 19: 354-359; PCT WO 02/06469), STEP 및 시험관내 재 조합의 무작위 개시(priming)(Zhao et al., 1998, Nat Biotechnol 16: 258-261; Shao et al., 1998, Nucleic Acids Res 26: 681-683), 엑소뉴클레아제 매개 유전자 조립(미국특허 제6,352,842호; 미국특허 제6,361,974호), 유전자 부위 포화 돌연변이 유발법(Gene Site Saturation Mutagenesis^TM)(미국특허 제6,358,709호), Gene Reassembly^TM(미국특허 제6,358,709), SCRATCHY(Lutz et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98: 11248-11253), DNA 단편화 방법(Kikuchi et al., Gene 236: 159-167), 단일가닥 DNA 셔플링(Kikuchi et al., 2000, Gene 243: 133-137), 및 AMEsystem^TM 지향된 진화 단백질 공학 기술(Applied Molecular Evolution)(미국특허 제5,824,514호; 미국특허 제5,817,483호; 미국특허 제5,814,476호; 미국특허 제5,763,192호; 미국특허 제5,723,323호)이 포함되나 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 Fc 변이체를 포함하는 상기 항체 및 Fc 융합체의 생물학적 특성은 세포, 조직 및 전체 개체 실험으로 특성화되어질 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, 약물은 질병 또는 질병 모델을 치료하기 위한 약물의 효능을 측정하기 위하여, 또는 약물의 약물 동력학, 독성 및 다른 특성을 측정하기 위하여, 마우스, 탯, 토끼, 개, 고양이, 돼지 및 원숭이를 포함되나 이들 예에 한정되지는 않는 동물 중에서 종종 시험된다. 상기 동물은 질병 모델이라고 할 수도 있다. 치료제는 종종 누드 마우스, SCID 마우스, 이종이식(xenograft) 마우스,(녹인 및 녹아웃 을 포함한) 유전자이식 마우스를 포함하나 이들 예에 한정되지 않는 마우스에서 종종 시험된다. 예를 들면, 항-종양 치료제로 의도하고 있는 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체 는 마우스 암 모델, 예를 들면, 이종이식 마우스에서 시험될 수 있다. 이 방법에서, 종양 또는 종양 세포주가 마우스 상에 이식 또는 마우스 내에 주입되고, 다음으로 상기 마우스는 상기 항체 또는 Fc 융합체가 암 성장을 감소 또는 저해하는 능력을 결정하기 위하여 상기 치료제로 처리된다. 그러한 실험은 상기 항체 또는 Fc 융합체가 치료제로서 사용되어질 가능성을 결정하기 의한 유의한 데이터를 제공할 수 있다. 임의의 개체, 바람직하게는 포유동물이 시험을 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 인간과의 유전적 유사성으로 인하여, 원숭이가 적합한 치료제 모델일 수 있으며, 따라서 본 발명의 상기 항체 또는 Fc 융합체의 효능, 독성, 약물 동력학, 또는 다른 특성을 시험하기 위하여 사용될 수 있다. 인간에서 본 발명의 상기 항체 또는 Fc 융합체의 시험은 약물로서 허가를 얻기 위하여 최종적으로 필요하고, 따라서 당연히 이들 시험은 고려된다. 따라서, 본 발명의 상기 항체 및 Fc 융합체는 그의 치료적 효능, 독성, 약물 동력학 및/또는 다른 임상적 특성을 결정하기 위하여 인간에서 시험될 수 있다.

본 발명을 설명하기 위하여 이하 실시예를 제공한다. 이들 실시예는 임의의 특정한 적용 또는 작용 이론에 본 발명을 한정하고자 하는 의도는 아니다.

본 발명에서 논의된 모든 위치에 대하여, 번호 지정은 Kabat(Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda)에서와 같은 EU 색인에 따랐다. 항체 분야의 당업자는, 이 약정이 면역글로불린 서열의 특이적 도메인에서 비순서적 숫자지정(nonsequential numbering)으로 구성되고 있어, 면역글로불린 패밀리 내의 보존된 위치에 대하여 표준화된 참조가 가능하도록 한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 상기 EU 색인에 의하여 정의된 바와 같은 임의의 주어진 면역글로불린의 상기 위치는 반드시 그의 순서적 서열에 대응되는 것은 아닐 것이다. 도 3은, 이 원리를 보다 명확하게 설명하기 위하여, 항체 알렘투주맵에 대하여 순서적 및 EU 색인 숫자메김을 나타내고 있다. Kabat 270, 272,312, 315,356, 및 358을 포함하나 이들 예에 한정되지 않는 많은 Fc 위치에서 다형이 관찰되고, 따라서 제공된 서열과 과학 문헌에 제공된 서열 사이에 사소한 차이가 존재할 수 있다는 것에 또한 주의하여야 한다.

실시예 1. Fc 라이브러리의 컴퓨터를 이용한 탐색 및 설계

최적화된 Fc 변이체를 설계하기 위하여 컴퓨터 탐색 계산을 수행하였다. Fc 변이체는 컴퓨터적으로 탐색되고, 제작되고 여러 계산/실험 순환에 걸쳐서 실험적으로 조사되었다. 각 연속 순환에 대하여, 실험적 데이터는 다음 세트의 컴퓨터 조작을 통한 탐색 계산 및 라이브러리 설계에 뒤먹임(feedback)으로 제공되었다. 모든 컴퓨터 조작을 통한 탐색 계산 및 라이브러리 설계는 실시예 1에 제공되었다. 각 계산 세트에 대하여, 결과를 제공하고 관련 정보 및 변수를 제공하는 표가 제공되어 있다.

FcγR의 세포외 도메인에 결합된 Fc의 여러 다른 구조가 상기 컴퓨터 조작을 통한 탐색 계산을 위한 주형 구조로서 역할을 하였다. 공중이 이용가능한 Fc/FcγR 복합체 구조에는 pdb 허가 코드 1E4K(Sondermann et al, 2000, Nature 406: 267-273. ), 및 pdb 허가 코드 1IIS 및 1IIX(Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276: 16469-16477)가 포함되었다. FcγRIIIb 및 FcγRIIIa의 상기 세포외 도메인은 96% 동일하고, 그러므로 상기 Fc/FcγRIIIb 구조를 사용하는 것은 FcγRIIIa를 사용하는 것과 필수적으로 동등하다. 그럼에도 불구하고, 일부 계산에 대하여, 더욱 더 정확한 Fc/FcγRIIIa 주형 구조가 상기 IIIS 및 1E4K 구조(D129G 1IIS 및 D129G 1E4K 주형 구조라고 함)에서의 D129G 돌연변이를 모델링함으로써 제작되었다. 더욱이, 인간 FcγRIIb, 인간 F158 FcγRIIIa, 및 마우스 FcγRIII의 상기 세포외 도메인에 결합된 인간 Fc에 대한 구조가 표준 방법, 이용가능한 FcγR 서열 정보, 상기한 Fc/FcγR 구조뿐만 아니라, 결합하지 않은 복합체(pdb 허가 코드 1H9V)(Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309: 737-749)(pdb 허가 코드 1FCG)(Maxwell et al., 1999, Nat Struct Biol 6:437-442), FcγRIIb(pdb 허가 코드 1E4J)(Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273)에 대한 구조적 정보를 이용하여 모델링되었다.

그러한 위치에서 고려되어야 할 변이가능한 위치 및 아미노산이 상기한 Fc/FcγR 및 FcγR 구조의 육안 검사, 및 용매 접근가능성 및 서열 정보를 이용하여 선택되었다. Fc 및 FcγR의 서열 정보는 치환이 활성화 및 저해성 리셉터 사이의 분별하는 친화성을 제공할 수 있는 변이가능한 위치를 결정하는데 특히 유용하였다. 실제적으로 모든 Cγ2 위치가 컴퓨터적으로 탐색되었다. 상기 Fc 구조는 각각(도 2에 나타낸) 힌지 및 Cγ2-Cγ3 도메인을 포함하는 두 개의 중쇄의 호모다이머이다(1IIS, 1IIX 및 1E4K 구조에서 표지된 쇄 A와 B). 상기 FcγR(상기 1IIS, 1IIX 및 1E4K 구조에서 표지된 쇄 C)가 상기 Fc 호모다이머에 비대칭적으로 결합하기 때문에, 각 쇄는 종종 설계 계산에서 분리되어 고려되었다. 일부 계산에 대하여, 변이가능한 위치 잔기에 근접한 Fc 및/또는 FcγR 잔기들은 유동적(floated), 즉, 상기 아미노산 동일성이 아닌 상기 아미노산 구조(conformation)가 단백질 설계 계산에서 변하도록 하여, 구조 조정이 가능하도록 하였다. 이들은 관련되는 경우 각 계산 세트에 대한 하기 표에 나타내었다. 일반적으로 고려된 아미노산은 달리 언급이 없으면, 코어, 코어 XM, 표면, 경계, 경계 XM, 또는 모든 20개 분류에 속하였다. 이들 분류는 아래와 같이 정의된다: 코어 = 알라닌, 발린, 이소루신, 루신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 및 메티오닌; 코어 XM = 알라닌, 발린, 이소루신, 루신, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; 표면 = 알라닌, 세린, 쓰레오닌, 아스파트산, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘; 경계 = 알라닌, 세린, 쓰레오닌, 아스파트산, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산, 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 발린, 이소루신, 루신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 및 메티오닌; 경계 XM = 경계 = 알라닌, 세린, 쓰레오닌, 아스파트산, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산, 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 발린, 이소루신, 루신, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; 모든 20 = 모든 20개 천연 아미노산.

대부분의 계산은 2개의 일반적 형태의 컴퓨터 조작을 통한 탐색 방법 중의 하나를 따랐다. 한가지 방법에서, 변이가능한 위치에서 아미노산의 구 조(conformation)는 Dunbrack & Cohen의 로타머(rotamer) 라이브러리(Dunbrack et al., 1997, Protein Sci 6: 1661-1681)로부터 유래된 골격-비의존적 측쇄 로타머의 세트로서 나타내었다. 선택된 변이가능한 위치에서 상기 고려된 아미노산의 모든 가능한 조합의 에너지를 반데르 발스, 용매화, 정전기적, 및 수소 결합 상호작용을 기술하는 용어를 포함하는 역장을 사용하여 계산하였고, 최적(기저 상태) 서열을 데드엔드 제거(Dead End Elimination)(DEE) 알로리듬을 사용하여 결정하였다. 당업자에 의하여 이해되고 있는 바와 같이, 상기 예측된 가장 낮은 에너지 서열이, 단백질의 미묘한 구조(conformation)적 차이가 안정성에 현격한 차이를 초래할 수 있다는 사실과 연계된, 주로 점수 매김(scoring) 기능에서의 오류로 인하여, 반드시 진짜 가장 낮은 에너지 서열인 것은 아니다. 그러나, 예측된 기저 상태 서열은 진짜 기저 상태에 가까울 것이며, 따라서 상기 예측된 기저 상태 중의 서열 공간과 에너지에 있어서 가까운 서열의 에너지를 평가함으로서 추가적인 유리한 다양성을 조사할 수 있다. 이를 달성하기 위하여 뿐만 아니라 라이브러리용 서열의 다양성을 생성하기 위하여, 상기 예측된 기저 상태 중의 1000 유사 서열의 에너지를 평가하기 위하여 몬테 카를로(Monte Carlo)(MC) 알고리듬을 사용하였다. 그 변이가능한 위치에서 그 아미노산를 포함하는 상기 1000 서열 세트로부터의 서열의 숫자는 그 치환에 대한 채움(occupancy)이라고 하였고, 이 값은 그 치환이 얼마나 유리한 것인가를 반영할 수 있다. 이 컴퓨터 조작을 통한 탐색 방법은 실질적으로, 미국특허 제6,188,965호; 미국특허 제6, 269,312호; 미국특허 제6,403,312호; 미국 출원번호 제09/782,004호; 미국 출원번호 제09/927,790호; 미국 출원번호 제 10/218,102호; PCT WO 98/07254; PCT WO 01/40091; 및 PCT WO 02/25588에 개시된 바와 같은, 단백질 설계 자동화(Protein Design Automation^®(PDA^®) 기술과 비슷하며, 기술의 편의를 위하여, 실시예에 걸쳐서 PDA^® 기술이라고 한다. 이들 계산의 결과를 나타내는 표들은 지정된 쇄 상의 각 변이가능한 위치(칼럼 1) 각 변이가능한 위치에서 고려된 아미노산(칼럼 2), 각 변이가능한 위치에서 천연형 Fc 아미노산 동일성(칼럼 3), 상기 DEE 기저 상태 서열 중에서 각 변이가능한 위치에서 아미노산 동일성(칼럼 4), 및 몬테 칼를로 출력에서 관찰된 아미노산의 세트 및 대응되는 채움(occupancy)(칼럼 5)을 제공한다. 예를 들면, 하기 표 1의 첫번째 열(row)에서, 328 위치는 그 위치에 대한 변이가능한 잔기의 세트로서 경계 아미노산을 사용하여 변하였고, L은 상기 상단 1000 서열 중에 330회 출현하였고, M은 302 회 출현하였다 등.

다른 계산 방법은, 시료로 채취된 서열들에 대하여 "진화(evolution)"의 각 회 동안 계산된 에너지와 함께, 낮은 에너지 서열을 탐색하기 위하여 유전적 알고리듬(GA)을 사용하였다. 변이가능한 및 유동화된(floated) 위치에서 아미노산의 구조(conformation)을 유연한 로타머 모델(Mendes et al., 1999, Proteins 37: 530-543)을 사용한 골격-비의존적 로타머 라이브러리로부터 파생된 측쇄 로타머의 세트로서 나타내었다. 에너지는 반데르 발스, 용매화, 정전기적 및 수소 결합 상호작용을 기술하는 용어를 포함한 역장을 사용하여 계산하였다. 이 계산에 의하여 낮은 에너지인 것으로 예측된 300 서열의 목록이 생성되었다. 상기 결과의 분석 및 라이브러리 생성을 촉진하기 위하여, 상기 300 출력 서열을 컴퓨터적으로 클러스터화하여 유사성 점수(Diamond, 1995, Acta Cryst D51: 127-135)에 근거한 관련된 그룹으로 서열을 할당하기 위하여 가장 가까운 이웃 단일 연관 계측적 클러스터링 알고리듬을 사용하여 비슷한 서열의 10개 그룹으로 나누었다. 즉, 그룹 내의 모든 서열은 상기 동일 그룹 내의 모든 다른 서열과 가장 유사하고, 다른 그룹 내의 서열에 덜 비슷하다. 이들 10개 클러스터의 각각으로부터의 가장 낮은 에너지 서열은 각 그룹의 대표로서 사용하였고, 결과로서 제공하였다. 이 컴퓨터 조작을 통한 탐색 방법은 실질적으로(Rahaet al., 2000, Protein Sci 9: 1106-1119); 미국 출원번호 제09/877,695; 및 미국 출원번호 제10/071,859에 개시된 바와 같은, 서열 예측 알고리듬(Sequence Prediction Algorithm^TM)(SPA^TM) 기술과 유사하며, 기술의 편의를 위하여, 실시예에 걸쳐서 SPA^TM 기술이라고 한다. 이들 계산의 결과를 나타내는 표들은 지정된 쇄 상의 각 변이가능한 위치(칼럼 1) 각 변이가능한 위치에서 고려된 아미노산(칼럼 2), 각 변이가능한 위치에서 천연형 Fc 아미노산 동일성(칼럼 3), 및 각 클러스터 그룹으로부터의 가장 낮은 에너지 서열에 대한 변이가능한 위치에서 아미노산 동일성(칼럼 4-13)을 제공한다.

FcγR와의 결합을 매개하고 또는 잠재적으로 결합을 매개하는 변이가능한 위치의 그룹에서 상기 Fc/FcγR 계면에서의 에너지적으로 유리한 상호작용을 설계하기 위하여, 컴퓨터 조작을 통한 탐색을 적용하였다. 상기 결합 계면은 두 개의 다른 쇄 상의 많은 수의 Fc 잔기와 관련되기 때문에, 그리고 FcγR는 Fc에 비대칭적 으로 결합하기 때문에, 잔기들을 다른 세트의 상호작용하는 변이가능한 위치로 분류하고, 별도의 계산 세트에서 설계하였다. 많은 경우 이들 세트는 연계되어 있는 것처럼 여겨진, 즉 하나 이상의 잔기들의 에너지가 하나 이상의 다른 잔기들의 동일성에 의존되는 잔기들의 그룹으로서 선택하였다. 다양한 주형 구조가 사용되었으며, 많은 경우 계산을 통하여 양 쇄 상에서의 치환을 탐색하였다. 상기 변이가능한 위치 세트의 많은 것에 대하여, 계산은 상기한 바와 같은 양 PDA^® 및 SPA^TM기술 컴퓨터 조작을 통한 탐색 방법을 사용하여 수행하였다. 이들 계산의 결과 및 관련 사항을 하기 표 1-30에 제공하였다. 사용된 컴퓨터 조작을 통한 탐색 방법, 사용된 주형 구조, 그 구조가 당 원소를 가졌는지 아니지 여부, 및 유동화(floated)되었을 수도 있는 임의의 잔기들을 포함한, 관련 변수 및 정보를 아래 각 표에 나타내었다. 예를 들면, 표 2는 쇄 C(상기 FcγRIIIb 리셉터) 상의 120, 132 및 134 잔기들이 유동화된(floated) PDA^® 계산으로부터의 결과를 제공한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 것은 단독 또는 임의의 조합으로(바람직한 조합이 청구범위, 요약 및 도면에 목록화되어 있는 것에 주의하라), 상기 목록화된 위치 내의 임의의 상기 목록화된 아미노산 잔기들을 갖는 항체이다. 바람직한 일 조합은 기저 상태의 상기 목록화된 위치 내의 상기 목록화된 아미노산 잔기들이다(본 명세서에서 상기 천연형으로부터 구분되는 바와 같이, 때때로 "글로벌 해(global solution)"라고도 한다). 더욱이, 표 내 및 표 사이 모두에서 SPA^TM 단백질 사이의 조합이 또한 포함되어 있다. 주어진 표에 목록화되지 않은 잔기들은 변하지 않은 것을 의미하고, 따라서 천연형으로 남아 있다는 것에 주의해야 한다. 예를 들면, 표 4에 제공된 상기 SPA^TM 계산 결과에서, 칼럼 4(클러스터 1을 나타낸다)는 6개의 목록화된 위치에서 6개의 목록화된 아미노산을 나타낸다(예, 칼럼 4는 239E, 265G, 267S, 269Y, 270T 및 299S를 제외하고 천연형 서열을 갖는 단일 단백질이다). 따라서, 이들 개별 단백질 각각은 본 발명 내에 포함되어 진다. 또한, 잔기 위치 및 그들 잔기 위치에서 특정한 아미노산은 표 내의 칼럼 사이에서, 또는 표 사이에서 조합되어질 수 있다. 더욱이, 각 표는 당의 존재 또는 부존재를 나타내고 있을지라도, 상기 컴퓨터 조작을 통한 탐색 계산에서 상기 원소들의 존재 또는 부존재는 그러한 계산에 의하여 설계된 Fc 변이체가 당화되지 않은 또는 당화된 Fc에만 적용되어져야 한다는 것을 의미하는 것은 아니다. 따라서, 비록 표 1의 계산이 주형 구조 내에 존재하는 당 원소들이 없이 수행되었으나, 그 결과 얻어진 예측된 치환은 당화된 또는 당화되지 않은 항체 또는 Fc 융합체에서 유리할 수 있다.

표 1

위치	고려되는 아미노산	천연형	바닥상태	바닥상태 주변 서열

PDA^® 기술, 1IIS 주형 구조; -탄수화물

표 2

PDA^® 기술, 1IIS 주형 구조; +탄수화물; 플로트된 120 C, 132 C, 134 C

표 3

PDA^® 기술; 1IIS 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 120 C, 122 C, 132 C, 133 C,134 C

표 4

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPA™ 기술; 1IIS 주형 구조; + 탄수화물; 플로트된 120 C, 122 C, 132 C, 133 C,134 C

표 5

*PDA^® 기술; 1IIS 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 119 C, 128 C, 157 C

표 6

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPA™ 기술; 1IIS 주형 구조; + 탄수화물; 플로트된 119 C, 128 C, 157 C

표 7

PDA^® 기술; 1IIS 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 88 C, 90 C, 113 C, 114 C, 116 C, 160 C, 161 C

표 8

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPA™ 기술; 1IIS 주형 구조; + 탄수화물; 플로트된 88 C, 90 C, 113 C, 114 C,116 C, 160 C, 161 C

표 9

SPA™ 기술; 1IIS 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 120 C, 132 C, 134 C

표 10

*

PDA^® 기술; D129G 1E4K 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 113 C, 116 C, 132 C, 155 C, 157 C

표 11

SPA™ 기술; D129G 1E4K 주형 구조; + 탄수화물; 플로트된 113 C, 116 C, 132 C, 155 C, 157 C

표 12

표 13

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPA™ 기술; D129G 1IIS 주형 구조; + 탄수화물; 플로트된 120 C

표 14

PDA^® 기술; D129G 1IIS 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 90 C, 160 C, 161 C

표 15

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPA™ 기술; D129G 1IIS 주형 구조; + 탄수화물; 플로트된 90 C, 160 C, 161 C

표 16

PDA^® 기술; D129G 1E4K 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 117 C

*표 17

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPA™ 기술; D129G 1E4K 주형 구조; + 탄수화물; 플로트된 117 C

표 18

PDA^® 기술; D129G 1E4K 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 87 C, 157 C, 158 C

표 19

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPA™ 기술; D129G 1E4K 주형 구조; + 탄수화물 원자; 플로트된 87 C, 157 C,158 C

표 20

PDA^® 기술; D129G 1IIS 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 273 A, 275 A, 302 A, 323 A, 134 C

표 21

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPAT™ 기술; D129G 1IIS 주형 구조; + 탄수화물; 플로트된 273 A, 275 A, 302 A, 323 A, 134 C

표 22

PDA^® 기술; D129G 1IIS 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 273 B, 275 B, 302 B, 323 B, 161 C

표 23

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPA™ 기술; D129G 1IIS 주형 구조; + 탄수화물; 플로트된 273 B, 275 B, 302 B, 323 B, 161 C

표 24

PDA^®기술; D129G 1E4K 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 273 B, 275 B, 302 B, 323 B, 131 C

표 25

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPA™ 기술; D129G 1E4K 주형 구조; + 탄수화물; 플로트된 273 B, 275 B, 302 B, 323 B, 131 C

*표 26

PDA^® 기술; D129G 1E4K 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 273 B, 275 B, 302 A, 323 A, 158 C

표 27

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPA™ 기술; D129G 1E4K 주형 구조; + 탄수화물; 플로트된 273 A, 275 A, 302 A, 323 A, 158 C

컴퓨터를 이용한 탐색 계산은 N297 당 및 Cγ2 도메인의 구조(conformation)을 최적화하기 위하여, Fc 변이체를 설계하는 것을 목적으로 하였다. 당과 상호작용하는 위치에서 에너지학적으로 유리한 치환을 탐색함으로써, 그 시료를 새롭고 잠재적으로 유리한 당 구조로 조작할 수 있다. Fc 잔기들 F241, F243, V262, 및 V264는 Fc/당 상호작용을 매개하고, 따라서 표적 위치이다. 이들 설계 계산의 결과는 표 28에 제공하였다.

표 28

PDA^® 기술, 1IIS 주형 구조; - 탄수화물

컴퓨터 조작을 통한 탐색 계산은 Cγ3 및 Cγ2 도메인 사이의 각을 최적화하기 위하여 Fc 변이체를 설계하는 것을 목적으로 하였다. Cγ2/Cγ3 계면에 위치하는 잔기들 P244, P245, P247, 및 W313은, 상기 Cγ2-Cγ3 각을 결정하고 서로에 대한 상기 도메인의 유연성을 결정하는데 있어서 중심적 역할을 하는 것으로 보인다. 이들 위치에서 에너직학적으로 유리한 치환을 탐색함으로써, 변이체를 새롭고, 잠재적으로 유리한 각 및 유연성의 수준을 갖도록 설계될 수 있다. 이들 설계 계산의 결과는 표 29에 제공하였다.

표 29

PDA^® 기술; 1IIS 주형 구조; - 탄수화물

PDA^® 및 SPA^TM 컴퓨터 조작을 통한 탐색 방법을 사용한 상기 계산에 더하여, 정전기적 잠재력만을 사용한 추가의 계산을 사용하여 Fc 변이체를 컴퓨터적으로 탐색하였다. 쿨롱의 법칙 및 드바이-훼켈(Debye-Huckel) 스케일링으로 계산한 것은, 중성 아미노산의 음전하를 띤 아미노산으로의 치환은 FcγRIIIa에의 결합을 촉진할 수 있고, 양전하를 띤 아미노산을 중성 또는 음전하를 띤 아미노산으로 치환하는 것은 FcγR 결합을 촉진할 수 있는, 및 양전하를 띤 아미노산을 중성 또는 음 전하를 띤 아미노산으로 치환은 FcγR에 대한 결합을 촉진할 수 있는 위치를 포함한, FcγR 치환이 하나 이상의 FcγR에 결합하는 것을 유리하게 영향을 미치는 Fc 내의 많은 위치가 주목받도록 하였다. 이들 결과는 표 30에 제공하였다.

표 30

- 잔기를 이용한 + 잔기 치환	- 잔기를 이용한 중성 잔기의 치환

쿨롱의 법칙 및 데비-헉켈 스케일링; 1IIS 주형 구조; + 탄수화물

비당화된 Fc를 최적화하기 위하여, 즉 Fc 구조, 안정성, 용해도 및 당의 부재하에서 Fc/FcγR 친화성을 최적화하기 위하여, 컴퓨터 조작을 통한 탐색 계산을 수행하였다. 설계 계산은 잔기 297, 그것에 근접한 잔기들, 상기 Fc/FcγR 계면에서의 잔기들 및 상기 Fc/당 계면 잔기들에서의 상기 비당화된 Fc 주형 구조의 문맥에서 유리한 치환을 설계하는 것을 목적으로 하였다. 변이가능한 위치를 다른 세트의 상호작용하는 변이가능한 위치로 그룹화하고, 별개 세트의 계산으로 설계하였고, 다양한 주형 구조를 사용하였다. 많은 상기 변이가능한 위치 세트에 대하여, 계산은 상기 PDA^TM 및 SPA^TM 컴퓨터 조작을 통한 탐색 방법 모두를 사용하여 수행되었다. 이들 계산의 결과 및 관련된 정보를 하기 표 31-53에 제공하였다.

표 31

PDA^® 기술; 1IIS 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 122 C, 129 C, 132 C, 155 C

표 32

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

*SPA™ 기술; 1IIS 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 122 C, 129 C, 132 C, 155 C

표 33

PDA^® 기술; D129G 1IIS 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 120 C, 122 C, 128 C, 132 C, 155 C

표 34

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPA™ 기술; D129G 1IIS 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 120 C, 122 C, 128 C, 132 C, 155 C

표 35

PDA^® 기술; D129G 1E4K 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 117 C, 119 C, 125 C, 129 C, 152 C

표 36

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPA™ 기술; D129G 1E4K 주형 구조; -탄수화물; 플로트된 117 C, 119 C, 125 C, 129 C, 152 C

표 37

표 38

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPA^TM 기술; D129G 1IIS 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 120 C, 122 C, 128 C, 132 C, 155 C

표 39

PDA^® 기술; D129G 1E4K 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 117 C, 119 C, 125 C,129 C, 152 C

표 40

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPA™ 기술; D129G 1E4K 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 117 C, 119 C, 125 C, 129 C, 152 C

표 41

PDA^® 기술; D129G 1IIS 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 120 C, 122 C, 132 C, 155 C

표 42

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPA™ 기술; D129G 1IIS 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 120 C, 122 C, 132 C, 155 C

표 43

PDA^® 기술; D129G 1E4K 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 117 C, 119 C, 129 C, 152 C

표 44

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPAT™ 기술; D129G 1E4K 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 117 C, 119 C, 129 C, 152 C

표 45

PDA^® 기술; D129G 1IIS 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 299 A, 120 C, 122 C, 132 C, 155 C

표 46

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPA™ 기술; D129G 1IIS 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 299 A, 120 C, 122 C, 132 C, 155 C

표 47

PDA^® 기술; D129G 1E4K 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 299 B, 117 C, 119 C, 129 C, 152 C

표 48

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPA™ 기술; D129G 1E4K 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 299 B, 117 C, 119 C,129 C, 152 C

표 49

PDA^® 기술; D129G 1IIS 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 239 A, 265 A, 120 C, 122 C, 132 C, 155 C

표 50

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPA™ 기술; D129G 1IIS 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 239 A, 265 A, 120 C, 122 C, 132 C, 155 C

표 51

PDA^® 기술; D129G 1E4K 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 239 B, 265 B, 117 C, 119 C, 129 C, 152 C

표 52

위치	고려되는 아미노산	천연형	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

SPA™ 기술; D129G 1E4K 주형 구조; - 탄수화물; 플로트된 239 B, 265 B, 117 C, 119C, 129C, 152C

안정하고, Fc 구조를 유지하고, 응집하는 경향을 가지지 않도록 당화 부재하에서 용매에 노출된 잔기들에서 유리한 치환을 설계함으로써 비당화된 Fc를 최적화하기 위하여 컴퓨터 조작을 통한 탐색 계산을 수행하였다. 상기 N297 당은 Fc의 안정성 및 구조적 견고성을 유지하고 상기 Cγ2 도메인이 중심축을 가로질러 응집되지 않도록 하는, 통상적으로 다른 Ig 도메인과의 단백질-단백질 상호작용을 위한 계면인 노출된 소수성 패치를 걸친다. 이전에 제공된 계산에서 고려되었던 상기 대향된 Cγ2 도메인을 향하여 안쪽으로 향하는 노출된 비극성 잔기들인 L328, I332, 및 I336과 같은 잔기들에 더하여, 설계를 위하여 핵심 잔기들은 Cγ2 상의 당 뒤에 위치하는 F241, F243, V262, 및 V264이다. 이들 Cγ2 잔기들의 중요성은 서열 정렬에 의한 상기 Cγ3 도메인 중의 대응되는 잔기들은 두 개의 Cγ3 도메인 사이의 비극성 상호작용을 매개하거나 상기 Cγ3 코어 중에 묻혀 있다는 것을 주의함으로써 지지 된다. 이들 설계 계산의 결과를 표 53에 제공하였다.

표 53

PDA^® 기술; 1IIS 주형 구조; - 탄수화물

최종 세트의 계산에서, SPA^TM 컴퓨터 조작을 통한 탐색 방법을 적용하여 모든 선택된 변이가능한 위치에서 모든 20 아미노산으로의 치환을 평가하였다. 모든 20 아미노산에 대한 가장 낮은 로타머 구조를 결정하고, 이 에너지를 그 변이가능한 위치에서 그 아미노산에 대한 치환의 에너지로서 정의하였다. 따라서, 이들 계산은 각 변이가능한 위치에서 상기 20 아미노산의 각각에 대한 치환의 에너지를 제공하였다. 상기 계산은 다른 Fc/FcγRIIIb 복합체(1IIS, 1IIX, 1E4K), 모델화된 Fc/FcγRIIb 복합체, 및 복합체화되지 않은 Fc(1DN2)를 포함한, 다양한 주형 구조를 사용하였으며, 따라서 Fc/FcγR 친화성, C1q 친화성, Fc 안정성, Fc 용해도, 당구조 및 힌지 구조의 최적화를 포함한, 당화된 및 비당화된 Fc 모두를 목적으로 한 다양한 설계 목적에 유용하였다. 더욱이, 이들 계산은 유리한 및 유리하지 않은 치환 모두에 대한 에너지를 제공하기 때문에, 활성화 대 저해성 FcγR에 분별 결합이 가능하도록 할 수 있는 치환을 안내한다. 다양한 주형 구조가 사용되었고, 계산에 의하여 두 개 쇄 모두 상에서 치환을 조사하였다. 이들 계산 및 관련된 변수 및 정보는 하기 표 54-60에 제공하였다. 칼럼 1은 상기 주형 구조의 쇄 A와 B 상 의 상기 변이가능한 위치를 목록화한다. 칼럼 2는 각 변이가능한 위치에서 천연형 아미노산 동일성을 목록화한다. 나머지 20 칼럼은 천연의 20개 아미노산(상단 열에 나타냄)의 각각에 대한 에너지를 제공한다. 모든 치환은 0 에너지로 설정된, 가장 낮은 에너지 치환에 대하여 표준화되었다. 예를 들면, 표 54에서, 쇄 A 상의 L235에 대하여, 세린이 상기 가장 낮은 에너지 치환이고, L235A는 L235S 보다 0.9 kcal/mol 덜 안정하다. 극히 높은 에너지는 20-50 kcal/mol 사이의 에너지에 대하여는 20 kcal/mol로, 50 kcal/mol 보다 높은 에너지에 대하여는 50 kcal/mol로 설정하였다. 유리한 치환은 각 위치에 대하여 상기 가장 낮은 에너지 치환, 및 상기 가장 낮은 에너지 치환으로부터 작은 에너지 차이를 가진 치환, 예를 들면 1-2, 1-3, 1-5, 또는 1-10 kcal/mol 내의 치환일 것으로 고려될 수 있다.

표 54

SPAT™ 기술; 1IIS 주형 구조; + 탄수화물 원자, 플로트되지 않은 위치

표 55

SPA™ 기술; 1IIS 주형 구조; - 탄수화물, 플로트되지 않은 위치

표 56

SPA™ 기술; D129G 1IIS 주형 구조; + 탄수화물

표 57

SPA™ 기술; D129G 1IIX 주형 구조; + 탄수화물

표 58

SPA™ 기술; D129G 1E4K 주형 구조; + 탄수화물

표 59

SPA™ 기술; Fc/FcγRIIb 모델 주형 구조; - 탄수화물

표 60

SPA™ 기술; 1DN2 주형 구조; + 탄수화물

상기 표 1-60에 제공된 상기 설계 계산의 결과를 실험적 생산 및 탐색을 위한 일련의 Fc 변이체 라이브러리를 제작하기 위하여 사용하였다. 실험적 라이브러리는 컴퓨터 조작을 통한 및 실험적 탐색의 연속 반복(round)으로 설계되었다. 추후의 Fc 라이브러리의 설계는 이전 라이브러리로부터의 피드백으로부터 혜택을 받았으며, 따라서 이전 탐색에서 유리한 특성을 보였던 Fc 변이체의 조합들을 일반적으로 포함하였다. 제작되고 실험적으로 시험된 Fc 변이체의 전체 세트는 표 61에 나타내었다. 이 표에서, 열 1은 변이가능한 위치를 목록화하고, 뒤따르는 열들은 천연형 및 상기 Fc 변이체에 대한 그들 변이가능한 위치에서 상기 아미노산을 나타낸다. 예를 들면, 변이체 18(서열번호 26)은 뒤따른 4개의 돌연변이를 갖는다: F241E, F243Y, V262T, 및 V264R. Fc 변이체의 이 세트를 구성하는 상기 변이가능한 위치 잔기들은 도 4에 구조적으로 설명하였으며, 도 5에 인간 IgF1 Fc 서열(서열번호 2)의 문맥 중에 제공하였다.

표 61

실시예 2: Fc 라이브러리의 실험적 생산 및 탐색

Fc 변이체에 대한 대부분의 실험은 항-암 항체 알렘투주맵(Campath^TM, Ilex Pharmaceuticals LP의 등록상표)의 문맥에서 수행되었다. 알렘투주맵은 그의 표적 항원 CD52 내의 짧은 선형 에피토프에 결합한다(Hale et al., 1990, Tissue Antigens 35: 118-127; Hale, 1995, Immunotechnology 1: 175-187). 알렘투주맵 은 작용체 세포를 새로 끌어오는 그의 능력에서 그의 효능이 부분적으로 적합하기 때문에(Dyer et al., 1989, Blood 73: 1431-1439; Friend et al., 1991, Transplant Proc 23: 2253-2254; Hale et aL, 1998, Blood 92: 4581-4590; Glennie et al., 2000, Immunol Today 21: 403-410), 그리고 결합 분석에서 그의 항원의 생산 및 사용이 상대적으로 간단하기 때문에, 일차 조작 주형으로서 선택되었다. 다른 항체들의 문맥에서 본 발명의 상기 최적화된 Fc 변이체를 평가하기 위하여, 선 택된 Fc 변이체를 항-CD20 항체 리툭시맵(Rituxan^®, IDEC Pharmaceuticals Corporation의 등록상표), 항-Her2 항체 트라스투주맵(Herceptin^®, Genentech의 등록상표), 및 항-EGFR 항체 세투시맵(Erbitux^®, Imclone의 등록상표)로 평가하였다. 탐색 목적을 위하여 알렘투주맵, 리툭시맵, 및 트라스투주맵을 사용하는 것은 본 발명의 임의의 특정한 항체에 한정하고자 하는 의도는 아니다.

알렘투주맵, 리툭시맵, 및 트라스투주맵에 대한 상기 IgG1 전장 경쇄(V-C) 및 중쇄 (VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3) 항체 유전자는 서브클로닝을 촉진하기 위하여 편리한 말단 제한 부위를 갖도록 제작되었다. 상기 유전자를 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1Zeo(Invitrogen)에 연결하여 넣었다. pcDNA3.1Zeo의 VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3 클론을 상기 Fc 도메인의 돌연변이유발을 위한 주형으로 사용하였다. 돌연변이는 PCR 기초한 돌연변이유발 기법을 사용하여 이 클론 내에 도입되었다. Fc 변이체는 서열의 신뢰도를 확인하기 위하여 서열분석되었다. 중쇄 유전자(VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3)(천연형 또는 변이체)를 포함하는 플라스미드를 293T 세포 내로 경쇄 유전자(VL CL)를 포함하는 플라스미드와 함께 공동 형질감염하였다. 형질감염 5일 후 배지를 회수하였다. 면역글로불린의 발현은 퍼옥시다제-접합된 염소-항 인간 IgG(JacksonImmunoResearch, catalog #; 109-035-088)를 사용한 웨스턴에 의하여 트란스펙토마의 배양 상등액을 탐색함으로써 모니터링하였다. 도 6은 293T 세포에서 천연형 알렘투주맵 및 변이체 1 내지 10의 발현을 나타내는 것이다. 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피(Pierce, Catalog #; 20334)를 이용하여 상등액으로 부터 정제하였다. 도 7은 천연형 알렘투주맵에 대한 단백질 정제의 결과를 나타내는 것이다. 항체 Fc 변이체 천연형과 비슷한 발현 및 정제를 보였다. 일부 Fc 변이체는 당의 부존재하에서의 그들의 용액 및 기능적 특성을 결정하기 위하여 당을 제거하였다. 당이 제거된 항체를 얻기 위하여, 정제된 알렘투주맵 항체를 37 ℃에서 24 시간 동안 펩티드-N-글리코시다제(PNGase F)와 함께 배양하였다. 도 8은 여러 Fc 변이체 및 천연형 알렘투주맵에 대한 당제거를 확인하는 SDS PAGE 겔을 제공하는 것이다.

이들 조건하에서 생산된 알렘투주맵의 기능적 신뢰도를 확인하기 위하여, GST에 융합된 항원성 CD52 펩티드를 IPTG 유도하에서 대장균 BL21(DE3)에서 발현하였다. 유도되지 않은 및 유도된 시료를 SDS PAGE 겔 상에서 전개하고, PVDF 막으로 옮겼다. 웨스턴 분석을 위하여, Sotec으로부터의 알렘투주맵(최종 농도, 2.5ng/ul) 또는 형질감염된 293T 세포의 배지(최종 알렘투주맵 농도 약 0.1-0.2ng/ul)를 일차 항체로 사용하였고, 퍼옥시다제-접합된 염소-항 인간 IgG를 이차 항체로서 사용하였다. 도 9는 이들 결과를 나타낸다. 표적 항원에 결합하는 능력은 발현된 알렘투주맵의 구조적 및 기능적 신뢰도를 확인한다. 알렘투주맵과 동일한 가변도메인을 가진 Fc 변이체는 항원에 대한 비교될만한 결합 친화성을 유지할 것으로 예측된다.

Fc/FcγR 결합에 대하여 탐색하기 위하여, 인간 V158 FcγRIIIa, 인간 F158 FcγRIIIa, 인간 FcγRIIb, 인간 FcγRIIa, 및 마우스 FcγRIII의 세포외부 도메인이 발현되고 정제되었다. 도 10은 인간 V158 FcγRIIIa의 발현 및 정제의 결과를 나타내는 SDS PAGE 겔이를 제공한다. 이 리셉터의 세포외부 도메인은 포유동물 유전자 은행(Mammalian Gene Collection)(MGC: 22630)으로부터 얻은 클론으로부터 PCR에 의하여 얻었다. 상기 리셉터는 글루타치온 S-트란스퍼라제(GST)와 융합되어 탐색될 수 있도록 하였다. 태그된 FcγRIIIa를 293T 세포에 형질감염하고, 분비된 FcγRIIIa를 포함하는 배지를 3일 후에 회수하고 정제하였다. 웨스턴 분석을 위하여, 막을 항-GST 항체로 탐침하였다.

FcγRIIIa 및 FcγRIIb에 대한 결합 친화성은 AlphaScreen^TM 분석(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay(ALPHA), PerkinElmer, Wellesley, MA), 비드-기초한 비방사능 발광 근접 분석을 사용하여 모든 설계된 Fc 변이체에 대하여 측정하였다. 도너 비드의 레이저 여기는, 상기 리셉터 비드에 충분하게 가까운 경우 화학발광 과정의 폭포(cascade)를 생성하고, 결국에는 520-620 nm에서 형광 발광을 일으키는 산소를 여기시킨다. 상기 AlphaScreen^TM 분석을 Fc 변이체 탐색을 위한 경쟁적 분석으로서 적용하였다. 천연형 알렘투주맵 항체를 스트렙타비딘 도너 비드에 부착하기 위하여 표준 방법으로 비오틴닐화하고, GST-태그된 FcγR를 글루타치온 킬레이트 리셉터 비드에 결합시켰다. 경쟁하는 Fc 변이체의 부존재하에서, 천연형 항체 및 FcγR는 상호작용하여 520-620 nm에서 신호를 생성한다. 태그되지 않은 Fc 변이체를 첨가하면 상기 천연형 Fc/FcγR 상호작용과 경쟁하여, 형광을 정량적으로 감소시켜 상대적 결합 친화성을 결정할 수 있도록 한다. 모든 Fc 변이체는 상기 AphaScreen^TM 분석을 사용하여 V158 FcγRIIIa 결합에 대하여 탐색하 였다. Fc 변이체는 알렘투주맵 또는 트라스투주맵의 문맥에서 탐색되었고, 선택된 Fc 변이체는 또한 리툭시맵 및 세투시맵의 문맥에서 탐색되었다. 선택된 Fc 변이체는 추후 다른 FcγR 및 Fc 리간드뿐만 아니라 FcγRIIb에 대한 결합에 대하여 탐색되었다.

도 11은 선택된 Fc 변이체에 의한 인간 V158 FcγRIIIa에 대한 결합에 대하여 AlphaScreen^TM 데이터를 나타낸다. 상기 결합 데이터는, 각각 낮은 및 높은 항체 농도에서 기저선에 의하여 제공된, 각 특정한 곡선에 대하여 최대 및 최소 발광 신호에 대하여 표준화되었다. 상기 데이터는 비선형 회귀를 사용하여 일 부위 경쟁 모델에 적합화하였고(fit), 이들 적합화(fit) 결과를 도면 중의 곡선으로 나타내었다. 이들 적합화 결과는 도 11에서 점선으로 설명된, 각 항체에 대한 저해성 농도 50%(IC50)(즉, 50% 저해에 필요한 농도)를 제공하여, Fc 변이체의 상대적 결합 친화가 정량적으로 결정되도록 한다. 여기서, 천연형 알렘투주맵은 IC50가(4.63x10^-9)x(2) = 9.2 nM인 반면, S239D는 IC50가(3.98x10^-10)x(2) = 0.8 nM이다. 따라서, S239D 알렘투주맵은 인간 V158 FcγRIIIa에 천연형 알렘투주맵에 비하여 9.2 nM/0.8nM = 11.64 배 더 강하게 결합한다. 비슷한 계산이 모든 Fc 변이체의 인간 V158 FcγRIIIa에 대한 결합에 대하여 수행되었다. 선택된 Fc 변이체는 또한 인간 FcγRIIb에 대한 결합에 대하여 탐색되었고, 이들 AlphaScreen^TM 결합 데이터의 예를 도 12에 나타내었다. 표 62는 AlphaScreen^TM 분석에 의하여 결정된 바와 같은, Fc 변이체의 인간 V158 FcγRIIIa(칼럼 3) 및 인간 FcγRIIb(칼럼 4)에 대한 결합에 대하여 모 항체에 대한 상대적 증가 배수 또는 감소 배수를 나타낸 것이다. 이들 데이터에 대하여, 천연형 Fc에 대하여 1보다 큰 배수는 결합 친화성의 증가를, 1보다 작은 배수는 결합 친화성의 감소를 나타낸다. 1-206 및 217-218에 대한 데이터는 트라스투주맵의 문맥에서 시험된 별표(*)로 나타낸 것을 제외하고는, 알렘투주맵의 문맥에서 얻어졌다. 207-216 및 219-303에 대한 모든 데이터는 트라스투주맵의 문맥에서 얻어졌다.

표 62

실시예 3: FcγR에 대한 선택적으로 증가된 결합

최적화된 특성을 갖는 많은 가능성 있는 Fc 변이체를 상기 FcγRIIIa 및 FcγRIIb 탐색으로부터 얻었다. 표 62는 FcγRIIIa에 더 강하게 결합하는 Fc 변이체를 제공하며, 따라서 항체 및 Fc 융합체의 작용체 기능을 향상하기 위한 후보들이다. 이들에는 239, 264, 272, 274, 330, 및 332에서 치환을 포함하는 많은 변이체가 포함된다. 도 13a 및 13b는 이들 Fc 변이체의 일부의 AlphaScreen^TM 결합 데이터를 나타내는 것이다. 대부분의 이들 Fc 변이체는 S298A/E333A/K334A(서열번호 45)에 비하여 실질적으로 더 큰 FcγRIIIa 결합 증진을 제공한다.

선택된 Fc 변이체는 그 적용성의 범위를 조사하기 위하여 복수의 항체의 문맥에서 탐색되었다. 트라스투주맵, 리툭시맵, 및 세투시맵의 문맥에서 인간 V158 FcγRIIIa에 대한 선택된 Fc 변이체의 결합에 대한 AlphaScreen^TM 데이터는 도 14a, 14b, 15a 및 15b에 나타내었다. 도 13의 알렘투주맵에 대한 데이터와 함께, 상기 결과는 항체 문맥과는 상관없이 일관된 결합 증진이 있다는 것을 나타내고, 따라서 본 발명의 상기 Fc 변이체가 항체 및 Fc 융합체에 넓게 적용될 수 있다는 것을 나타낸다.

FcγRIIb에 비하여 FcγRIIIa에 분별적으로 증진된 결합을 보이는 Fc 변이체가 얻어졌다. 논의된 바와 같이, 최적 작용체 기능은 활성화 FcγR에 대한 친화성이 저해성 FcγRIIb에 대한 친화성보다 더 큰 Fc 변이체로부터 유발될 수 있다. 이 특이성을 갖는 두 개의 Fc 변이체에 대한 FcγRIIIa 및 FcγRIIb에 대한 결합을 직접적으로 비교하는 AlphaScreen^TM 데이터는 도 16a 및 16b에 나타내었다. 이 개념은 정량적으로 활성화 FcγR의 배수-증진 또는 -감소(표 62, 칼럼 3)를 저해성 FcγR의 배수-증진 또는 -감소(표 62, 칼럼 4)로 나눔으로써 정의될 수 있으며, 본 명세서에서는 FcγRIIIa-배수:FcγRIIb-배수 비율로서 나타낸다. 이 값은 표 62의 칼럼 5에 제공되어 있다. 표 62는 Fc 변이체가 86:1 만큼 높은 FcγRIIIa-배수:FcγRIIb-배수 비율을 갖는, 이 특이성 프로필을 제공한다는 것을 나타낸다.

작용체 기능을 증진시키기 위한 본 발명의 가장 가능성 있는 Fc 변이체의 일부는 FcγRIIIa에 대한 친화성이 실질적으로 증가되었고 유리한 FcγRIIIa-배수 : FcγRIIb-배수 비율을 갖는다. 이들에는 예를 들면, S239D/I332E(서열번호 95)(FcγRIIIa-배수 = 56, FcγRIIIa-배수 : FcγRIIb-배수 = 3), S239D/A330Y/I332E(서열번호 212)(FcγRIIIa-배수 = 130), S239D/A330L/I332E(서열번호 214)(FcγRIIIa-배수 = 139, FcγRIIIa-배수 : FcγRIIb-배수 = 18), 및 S239D/S298A/I332E(서열번 호 217)(FcγRIIIa-배수 = 295, FcγRIIIa-배수 : FcγRIIb-배수 = 48)이 포함된다. 도 17은 이들 및 인간 V158 FcγRIIIa에 대한 다른 Fc 변이체에 대한 AlphaScreen^TM 결합 데이터를 나타낸다.

작용체 기능에 기여하는 많은 FcγR이 있기 때문에, 다른 리셉터에 대하여 추가적으로 Fc 변이체를 탐색할 가치가 있을 수 있다. 도 18은 인간 R131 FcγRIIa에 대한 선택된 Fc 변이체의 결합에 대한 AlphaScreen^TM 데이터를 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 유리한 결합 증진 및 특이성 프로필을 갖는 상기한 변이체들은 또한 이 활성화 리셉터에 대하여 증진된 결합을 나타낸다. 탐색을 위하여 FcγRIIIa, FcγRIIb, 및 FcγRIIc를 사용하는 것은 실험적 시험을 그들 특정한 FcγR에 한정하는 의도는 아니다; 종래 개시된 바와 같은, 인간, 마우스, 탯, 원숭이 등으로부터 유래된 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII의 무수한 이소폼 및 알로타입을 포함하나 이들 예에 한정되는 것은 아닌, 다른 FcγR이 탐색을 위하여 고려된다.

요약하면, 도 11-18 및 표 62에 제공된 상기 FcγR 결합 데이터는 234, 235, 239, 240, 243, 264, 266, 272, 274, 278, 325, 328, 330, 및 332 위치에서의 많은 치환이 항체 및 Fc 융합체의 작용체 기능을 향상하기 위한 가능성 있는 후보이다는 것을 나타낸다. 이들 치환의 일부의 조합은 상가적 또는 상승적 결합 향상을 일반적으로 초래하기 때문에, 표 62에 제공된 Fc 변이체의 아직 탐색되지 않은 조합들이 또한 유리한 결과를 제공할 것이라는 것이 예측된다. 따라서, 상기 Fc 변이체의 모든 조합들이 고려된다. 비슷하게, 다른 발견된 또는 발견되지 않은 Fc 변이 체와 표 62의 상기 Fc 변이체의 모든 조합들이 또한 유리한 특성을 제공할 수 있으며, 이들 조합들이 또한 고려된다. 더욱이, 234, 235, 239, 240, 243, 264, 266, 325, 328, 330, 및 332 위치에서의 다른 치환들이 또한 유리한 결합 증진 및 특이성을 제공할 수 있을 것이라는 것이 이들 결과로부터 예측되며, 따라서 표 62에 제공된 것들 외에 이들 위치에서의 치환들이 고려된다.

실시예 4: FcγR에 대한 감소된 결합

논의된 바와 같이, 더 큰 작용체 기능에 대한 요구가 있을지라도, 일부 항체 치료제에 대하여, 감소된 또는 제거된 작용체 기능이 원하는 것일 수 있다. 표 62의 여러 Fc 변이체는 FcγR 결합을 실질적으로 감소시키기거나 제거하며, 따라서 작용체 기능이 바람직하지 않은 항체 및 Fc 융합체에 사용될 수 있다. 그러한 변이체의 일부 예에 대한 AlphaScreen^TM 결합 데이터를 도 19a 및 19b에 나타내었다. 이들 Fc 변이체 뿐만 아니라 조합에의 그들이 용도는 원하는 경우 작용체 기능을 제거하기 위하여, 예를 들면, 작용 기작이 표적 항원을 가진 세포를 저해하거나 길항하지만 죽이지는 않는 항체 및 Fc 융합체에 사용될 수 있다.

실시예 5: 비당화된 Fc 변이체

논의된 바와 같이, 현재 실험의 한 가지 목적은 최적화된 비당화된 Fc 변이체를 얻는 것이다. 여러 Fc 변이체들이 이 목적을 향한 의미 있는 진전을 제공한다. 당화의 부위이기 때문에, N297에서의 치환은 비당화된 Fc를 생성시킨다. N297에서 치환을 포함하는 모든 다른 Fc 변이체는 FcγR 결합을 완전히 제거하는 반면, N297D/I332E(서열번호 71)는 표 62에 나타내고 도 20에 도시된 바와 같은, FcγRIIIa에 대하여 유의한 결합 친화성을 갖는다. 비록 컴퓨터 조작을 통한 탐색 예측은 잠재적으로 새로운 유리한 Fc/FcγR 상호작용 및 유리한 정전기적 특성의 조합 때문인 것이라는 것을 암시하고 있을지라도, 이 결과에 대한 정확한 이유는 이 변이체에 대한 고해상 구조가 없는 상태에서는 명확하지 않다. 실제로, 다른 정전기적 치환들이 비당화된 Fc의 추가의 최적화를 위하여 가시화되었다. 표 62는 S239D/N297D/I332E(서열번호 188) 및 N297D/A330Y/I332E(서열번호 210)와 같은 다른 비당화된 Fc 변이체는, 각각 당화된 천연형 알렘투주맵의 0.28- 및 0.43-배 내의 FcγRIIIa에 대한 친화성을 가져오는 결합 증진을 제공한다는 것을 나타낸다. 당화된 모 Fc에 비하여 거의 동일하거나 훨씬 좋은 친화성을 가진 하나 이상의 FcγR에 결합하는 비당화된 Fc 변이체를 얻는 목적과 함께, FcγR 결합을 증진하는 다른 Fc 변이체와의 이들 변이체의 조합들이 고려된다. 가능성 있는 Fc 변이체의 추가적인 세트는 당의 부존재에서 안정성 및 용해도 증진을 제공한다. FγR 결합을 매개하지 않으나 상기 당과 Fc 사이의 계면을 결정하는 위치인 241, 243, 262, 및 264 위치에서의 치환들을 포함하는 Fc 변이체는, 아마도 그들이 상기 당의 구조(conformation)을 교란하기 때문에, FγR 결합을 제거한다. 그러나, 당이 제거된 형태에 있어서, Fc 변이체 F241E/F243R/V262E/V264R(서열번호 23), F241 E/F243Q/V262T/V264E(서열번호 24), F241R/F243Q/V262T/V264R(서열번호 25), 및 F241E/F243Y/V262T/V264R(서열번호 26)은 도 21에 AlphaScreen^TM 데이터에 의하여 나타낸 바와 같이, 당화된 형태 보다 FcγRIIIa에 대한 더 강한 결합을 나타낸다. 이 결과는 이들이 비당화된 Fc의 상기 구조, 안정성, 용해도 및 기능의 최적화를 위한 핵심 위치들이라는 것을 나타낸다. 이들 결과는 함께 당의 부존재 하에서 항체 및 Fc 융합체의 유리한 기능적 및 용액 특성을 회복시키고, 이들 및 다른 Fc 위치들에서 치환들을 포함하는 유리한 용액 특성 및 완전한 기능성을 갖는 비당화된 항체 및 Fc 융합체에 이를 수 있도록 하기 위하여 단백질 공학이 사용될 수 있다는 것을 암시한다.

실시예 6: FcγRIIIa의 다형 형태에 대한 Fc 변이체의 친화성

상기에서 논의된 바와 같이, Fc-매기된 작용체 기능의 중요한 변수는 FcγRFcγRIIIa의 두 V158 및 F158 다형 형태에 대한 Fc의 친화성이다. 선택된 변이체의 두 리셉터 알로타입에 대한 결합을 비교하는 AlphaScreenTM 데이터를 도 22a(V158 FcγRIIIa) 및 도 22b(F158 FcγRIIIa)에 나타내었다. 나타낸 바와 같이, 모든 변이체는 두 FcγRIIIa 알로타입에 대한 결합을 향상시킨다. 이들 데이터는 증지된 작용체 기능을 가진 본 발명의 그러한 Fc 변이체가 전체 환자 집단에 넓게 적용가능할 것이고, 임상적 효능에 대한 증진은 그것을 가장 필요로 하는 가장 낮은 반응성 환자 집단에 대하여 잠재적으로 가장 클 것이라는 것을 나타낸다.

이들 Fc 변이체의 상기 FcγR 결합 친화성은 표면 플라즈몬 공명(SPR)(Biacore, Uppsala, Sweden)을 사용하여 더 조사되었다. SPR은 단백질-단백질 상호작용의 결합 친화성을 측정할 수 있도록 하는 민감하고 극히 정량적인 방 법이며, Fc/FcγR 결합을 효과적으로 측정하기 위하여 사용되어 왔다(Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16478-16483). 따라서, SPR은 AlphaScreen^TM 분석에 훌륭한 상보성 결합 분석을 제공한다. His-태그된 V158 FcγRIIIa를 SPR 칩 상에 고정화하였고, 천연형 및 Fc 변이체 알렘투주맵 항체를 농도의 범위에서 상기 칩 상에 흘렸다. 결합 상수는 표준 곡선-적합화 방법을 사용하여 상기 데이터를 적합화(fitting)하여 얻었다. 표 63은 SPR을 사용하여 얻어진 선택된 Fc 변이체의 V158 FcγRIIIa 및 F158 FcγRIIIa에 대한 결합에 대한 해리 상수(Kd)를 나타내고, 그들을 AlphaScreen^TM 분석으로부터 얻은 IC50과 비교한다. 각 변이체에 대한 Kd 및 IC50을 천연형 알렘투주맵의 그것으로 나눔으로써, 천연형에 대한 배수-증진(fold)이 얻어졌다.

표 63

상기 SPR 데이터는 AlphaScreen^TM 분석에 의하여 관찰된 FcγRIIIa 친화성에 대한 향상을 확증한다. 표 63은 S298A(서열번호 43) 및 S298A/E333A/K334A(서열번호 45)에 비하여 V264I/I332E(서열번호 38) 및 I332E(서열번호 30)의 우수성을 추가적으로 나타낸다. 반면, S298A/E333A/K334A(서열번호 45)는 V158 및 F158 FcγRIIIa에 대한 Fc 결합을 각각 1.7-배 및 4.7-배 향상시키고, I332E(서열번호 30)는 각각 2.2-배 및 10.1-배의 결합 증진을 나타내고, V264I/I332E(서열번호 38)는 각각 4.0-배 및 14-배의 결합 증진을 나타낸다. 또한 주의할 것은 F158 FcγRIIIa(52 nM)에 대한 V264I/I332E(서열번호 38)의 친화성은 V158 알로타입(68 nM)에 대한 천연형의 그것보다 좋다는 것이다. 이는 이 Fc 변이체 뿐만 아니라 훨씬 더 큰 결합 향상을 갖는 Fc 변이체들이, 낮은 반응성 환자 집단에 대한 항체의 임상적 효능이 현재 높은 반응자(responder)에 대하여 가능한 것을 이룰 수 있도록 할 수 있다는 것을 암시한다. 상기 SPR과 AlphaScreen^TM 결합 측정의 상관관계를 도 23a-23d에 나타내었다. 도 23a 및 23b는 각각 V158 FcγRIIIa 및 F158 FcγRIIIa에 대한 결합에 대한 Kd-IC50 상관관계를 나타내고, 도 23c 및 23d는 각각 V158 FcγRIIIa 및 F158 FcγRIIIa에 대한 결합에 대한 배수-향상 상관관계를 나타낸다. 이들 데이터가 곧은 직선에 잘 맞는 것(r² =0.9, r² = 0.84, r² = 0.98, 및 r²= 0.90)은 상기 AlphaScreen^TM 측정의 정확성을 지지하는 것이고, Fc 변이체의 상대적 FcγR 결합 친화성을 결정하기 위한 그의 용도를 입증하는 것이다.

SPR 데이터는 또한 인간 V158 FcγRIIIa, F158 FcγRIIIa, 및 FcγRIIb에 대한 선택된 트라스투주맵 Fc 변이체의 결합에 위하여 또한 얻어졌다. 이들 데이터는 표 64에 나타내었다. S239D/I332E/S298A(서열번호 217)와 F158 FcγRIIIa의 상호작용에 대하여 관찰된 100 배 이상 더 강한 결합을 갖는, 시험된 상기 Fc 변이체는 상기 활성화 리셉터 FcγRIIIa에 대한 실질적 결합 증진을 나타낸다. 더욱이, 가장 좋은 FcγRIIIa에 결합하는 것에 대하여, F158 FcγRIIIa/FcγRIIb 비율이 3-4로 관찰되었다.

표 64

실시예 7: Fc 변이체의 ADCC

작용체 기능에 미치는 영향을 결정하기 위하여, 세포-기초한 ADCC 분석을 선택된 Fc 변이체에 대하여 수행하였다. ADCC는 작용체 세포로서 정제된 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 사용한, ELFIA^TM EuTDA-기초한 세포독성 분석(Perkin Elmer, MA)을 사용하여 측정하였다. 표적 세포를 1x10⁶ 세포/ml에서 BATDA로 적재하고, 4회 세척하고 10,000 세포/웰로 96-웰 플레이트에 접종하였다. 다음으로, 상기 표적 세포가 지정된 최종 농도에서 Fc 변이체 또는 천연형 항체를 사용하여 식균되었다(opsonized). 버피 코트로부터 분리된 인간 PBMC를 표적 세포의 지정된 배수-과량에서 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 4 시간 동안 배양하였다. 상기 공동 배양된 세포를 500xg로 원심분리하고, 상등액을 별개의 플레이트로 옮기고 Eu 용액과 함께 배양하고, Packard Fusion^TM α-FP HT 리더(Packard Biosciences, IL)를 사용하여 상대적 형광 단위를 측정하였다. 시료를 오류 추정을 제공하기 위하여 3배수로 전개하였다(n=3, +/-S. D.). PBMC를 PCR을 사용하여 V158 또는 F158 FcγRIIIa 알로타입에 대하여 알로타입을 결정하였다.

DoHH-2 림프종 표적 세포를 사용하여, Fc 변이체 및 천연형 알렘투주맵에 대하여 ADCC 분석을 수행하였다. 도 24a는 10 ng/ml 항체에서 이들 단백질의 ADCC를 나타내는 막대 그래프이다. 결과는, AlphaScreen^TM 분석 및 SPR에 의하여 지정된 바와 같은 FcγRIIIa에 대한 그들의 결합 향상에 비례하는 상대적인 ADCC 증진과 함께, 알렘투주맵 Fc 변이체 I332E(서열번호 30), V264I(서열번호 11), 및 I332E/V264I(서열번호 38)가 천연형 알렘투주맵에 비하여 실질적으로 증진된 ADCC를 갖는다는 것을 나타낸다. 항체 농도에 미치는 ADCC의 용량 의존성은 도 24b에 나타내었다. 결합 데이터는 각각 낮은 및 높은 항체 농도에서 이 기저선에 의하여 제공된, 각 특정한 곡선에 대한 최소 및 최대 형광 신호에 대하여 표준화되었다. 상기 데이터를 상기 도면에서 곡선에 의하여 표시된, 비선형 회귀를 사용하여 사인파형 용량-반응 모델에 적합화하였다. 상기 적합화(fit)는 각 Fc 변이체에 대하여 ADCC에 대한 상대적 증진을 제공하는, 효과적인 농도 50%(즉, 50% 효능에 필요한 농도)를 결정할 수 있도록 한다. 이들 결합 데이터에 대한 상기 EC50은 AlphaScreen^TM 경쟁 데이터로부터 얻은 IC50과 유사하며, 따라서 이들 값의 유도는 실시예 2 및 도 11에 기술한 것과 유사하다. 도 24b에서, log(EC50)이 상기 데이터에 대한 적합화(fit)로부터 얻어졌으며, 천연형(서열번호 2), V264I/I332E(서열번호 38), 및 S239D/I332E(서열번호 95) 알렘투주맵에 대하여 각각 0.99, 0.60, 및 0.49이었고, 그러므로 그들 각각의 EC50은 9.9, 4.0, 및 3.0이었다. 따라서 V264I/I332E(서열번호 38) 및 S239E/I332E(서열번호 95)는 PBMC를 발현하는 이형접합체 V158/F158 FcγRIIIa를 사용한 천연형 알렘투주맵에 비하여 ADCC에서 각각 2.5배 및 3.3 배 증진을 제공한다. 이들 데이터를 하기 표 65에 요약하였다.

표 65

이들 ADCC 증진이 항체에 넓게 적용될 수 있는지를 결정하기 위하여, 선택된 Fc 변이체를 트라스투주맵 및 리툭시맵의 문맥에서 평가하였다. ADCC 분석은 두개의 유방암 표적 세포주 BT474 및 Sk-Br-3를 사용하여 Fc 변이체 및 천연형 트라스투주맵에 대하여 수행하였다. 도 25a는 1ng/ml antibody에서 ADCC를 설명하는 막대 그래프이다. 결과는 AlphaScreen^TM 및 SPR에 의하여 나타낸 바와 같은, 그들의 결합 향상에 비례하는 상대적 ADCC 증진과 함께, V264I(서열번호 11) 및 V264I/I332E(서열번호 38) 트라스투주맵는 천연형 트라스투주맵에 비교하여 실질적으로 증진된 ADCC를 제공한다는 것을 나타낸다. 도 25b 및 25c는 선택된 Fc 변이체에 대한 항체 농도에 대한 ADCC의 용량 의존성을 나타내는 것이다. 이들 데이터의 적합화(fit) 및 ADCC에서의 상대적 배수-향상으로부터 얻어진 EC50은 하기 표 66에 제공하였다. 유의한 ADCC 향상은 A330L(서열번호 65) 및 A330Y(서열번호 66)과 함께 조합되는 경우, I332E(서열번호 30) 트라스투주맵에 대하여 관찰되었다. 더욱이, S239D/A330L/I332E(서열번호 214)는 AlphaScreen^TM 분석 및 SPR에 의하여 관찰된 FcγR 결합 데이터와 일관되는, 천연형 트라스투주맵 및 S298A/E333A/K334A(서열번호 45)에 대하여 상대적으로, 동형접합 F158/F158 FcγRIIIa를 발현하는 PBMC에 대하여 300 배보다 더 큰 실질적인 ADCC 증진을 제공한다.

표 66

V264I/I332E(서열번호 38), 천연형(서열번호 2) 및 S298A/D333A/K334A(서열번호 45) 리툭시맵에 대하여 WIL2-S 림프종 표적 세포를 사용하여 ADCC 분석을 수행하였다. 도 26a는 1ng/ml 항체에서 이들 단백질의 ADCC를 나타내는 막대 그래프이다. 결과는, V264I/I332E(서열번호 38) 리툭시맵가 AlphaScreenTM 및 SPR에 의하여 관찰된 상기 FcγRIIIa 결합 향상과 일관되는, 천연형 리툭시맵에 비하여 실질적으로 증진된 ADCC 뿐만 아니라 S298A/D333A/K334A(서열번호 45)에 대하여 우수한 ADCC를 제공한다는 것을 나타낸다. 도 26b 및 26c는 선택된 Fc 변이체에 대하여 ADCC의 항체 농도에 대한 용량 의존성을 나타내는 것이다. 이들 데이터의 상기 적합화 및 ADCC에서 상대적 배수-향상으로부터 얻어진 EC50을 하기 표 67에 제공하였다. 나타낸 바와 같이, S239D/I332E/A330L(서열번호 214) 리툭시맵는 동형접합형 F158/F158 FcγRIIIa를 발현하는 PBMC에 대하여 천연형에 비하여 900 배 증진보다 큰 EC50의 증진을 제공한다. 알렘투주맵, 트라스투주맵, 및 리툭시맵에 대하여 관찰된 ADCC 증진의 차이는 다른 PBMC, 다른 항체 및 다른 표적 세포주를 사용하였기 때문인 것처럼 보인다.

표 67

지금까지, ADCC 데이터는 표준화되어, 각각 일반적으로 가장 낮은 및 가장 높은 항체 농도에서의 형광 신호인 각 Fc 폴리펩티드의 상기 낮은 및 상단 기저선이 최소 및 최대 형광 신호로 설정되도록 하였다. 이 일에 상기 데이터를 제공함으로써 다른 항체의 상대적 EC50를 간단하게 육안으로 비교할 수 있게 될지라도(따라 이런 식으로 그들을 제공하는 이유), 각 Fc 폴리펩티드에 의하여 달성된 작용체 기능의 절대적 수준에 관한 중요한 정보는 상실된다. 도 27a 및 27b는, PBMC 단독(항체 없음)의 존재하에서 표적 세포의 형광 신호에 의하여 제공된, 상기 분석에 대하여 절대적 최소 파쇄 및 Triton X1000의 존재하에서 표적 세포의 형광 신호에 의하여 제공된, 상기 분석에 대하여 절대적 최대 파쇄에 따라 표준화된 각각 트라스투주맵 및 리툭시맵에 대한 세포-기초한 ADCC 데이터를 나타낸다. 상기 그래프는 상기 항체가 그들의 상대적 강도(potency)를 반영하는 그들의 EC50에서 뿐만 아 니라, 그들의 상대적 효능을 반응하는, 포화 농도에서 상기 항체에 의하여 얻어질 수 있는 ADCC의 최대 수준에서도 또한 다르다는 것을 나타낸다. 지금까지 이들 두 용어, 강도(potency) 및 효능(efficacy)는 원하는 임상 특성을 나타내기 위하여 느슨하게 사용되었다. 그러나, 현재의 실험 문맥에서, 그들은 특이적인 양으로 나타내어지며, 그러므로 여기서는 명확하게 정의되어진다. 본 실험적 문맥에서 사용된 바와 같은 "강도(potency)"란 항체 또는 Fc 융합체의 EC50을 의미한다. 본 실험적 문맥에서 사용된 바와 같은 "효능(efficacy)"이란 포화 수준에서 항체 또는 Fc 융합체의 최대 가능한 작용체 기능을 의미한다. 지금까지 기술된 강도에 대한 실질적 증진에 더하여, 도 27a 및 27b는 본 발명의 Fc 변이체가 천연형 트라스투주맵 및 리툭시맵에 비하여 효능에 있어서 100% 보다 큰 증진을 제공한다는 것을 나타낸다.

항암 항체의 임상적 효능을 다스리는 중요한 파라미터는 종양 세포의 표면 상의 표적 항원의 발현 수준이다. 그리하여, ADCC를 증진하는 Fc 변이체의 주요한 임상적인 이점은 항원의 더 낮은 수준을 발현하는 종양의 표적화를 가능하게 하는 것일 수 있다. 상기 가설을 시험하기 위해, WT 및 Fc 변이체 트라스투주맵 항체를 다양한 수준의 Her2/neu 표적 항원을 발현하는 상이한 세포주에 대한 ADCC를 매개하는 이의 능력에 대해 시험하였다. DELFIA EuTDA 세포독성 키트(PerkinElmer, Boston, MA)를 이용하여, Sk-Br-3(1x10⁶ 카피), SkOV3(∼1x10⁵), OVCAR3(∼1x10⁴), 및 MCF-7(~3x10³ 카피)를 포함하는, 낮은 수준으로 증폭된 Her2/neu 리셉터를 발현 하는 다양한 세포주를 이용한 ADCC 분석을 수행하였다. 표적 세포를 25분 동안 배취에서 BATDA로 로딩하고, 배지로 복수로 세정하고, 96-웰 플레이트에서 웰당 10,000개 세포로 접종하였다. 표적 세포를 다양한 항체 및 농도(무처리 대조군을 포함하는, 1/2 로그 단계에서 100 ng/ml 내지 0.0316 ng/ml 범위의 최종 농도)로 15분 동안 옵소닌 처리하였다. 버피-코트(buffy-coat)로부터 분리되고, 동형접합의 F158/F158FcγRIIIa로서 동종이형의 인간 PBMC를 이어서 25배 과량으로 옵소닌 처리된 세포에 첨가하고, 4시간 동안 37℃에서 동시 배양하였다. 이후에, 플레이트를 원심분리하고, 상층액을 제거하고, Eu3+ 용액으로 처리하고, 상대적인 형광 단위(세포 용해의 수준과 관련)를 Packard Fusion^TM-FP HT 해독기(PerkinElmer, Boston, MA)를 이용하여 측정하였다. 상기 실험을 삼중으로 수행하였다. 도 28은 4개의 상이한 Her2/neu⁺ 세포주에 대한 WT 및 Fc 변이체 트라스투주맵을 비교하는 ADCC 데이타를 보여준다. S239D/I332E(서열번호 95) 및 S239D/I332E/A330L(서열번호 214) 변이체는 표적 항원의 고, 중간, 및 저 발현 수준에서 WT 트라스투주맵에 대해 실질적인 ADCC 증진을 제공한다. 상기 결과는 본 발명의 Fc 변이체가 항암 항체의 치료 창을 넓힐 수 있다는 것을 제시한다.

천연 킬러(NK) 세포는 ADCC에서 현저한 역할을 하는 것으로 생각되는 PBMC에 존재하는 세포의 아집단이다. 선택된 Fc 변이체를 PBMC 보다 천연 킬러(NK) 세포를 작용체 세포로서 이용한 세포 기재 ADCC 분석에서 시험하였다. 상기 분석에서, EuTDA 보다 내재하는 락토오스 탈수소효소(LDH)의 방출은 세포 용해를 모니터링하 기 위해 이용되었다. 도 29는 Fc 변이체가 NK 세포가 작용체 세포로서 이용될 때 실질적인 ADCC 증진을 보여준다는 것을 보여준다. 더욱이, 이전의 분속과 함께, 상기 결과는 본 발명의 Fc 변이체가 작용체 세포 또는 이용된 검출 방법과 무관하게 실질적인 ADCC 증진을 보여준다는 것을 나타낸다.

실시예 8. Fc 변이체의 ADCP

또 다른 중요한 FcγR 매개 작용체 기능은 ADCP이다. 표적 암세포의 식작용은 표적 세포의 즉각적인 파괴를 초래할 뿐만 아니라, 식작용은 항원 흡수 및 항원 제시 세포에 의한 가공에 대한 잠재적인 기작이므로, 증가된 ADCP는 또한 적응 면역 반응을 유도하는 항체 또는 Fc 융합의 능력을 향상할 수 있다. ADCP를 매개하는 본 발명의 Fc 변이체의 능력은 그러므로 조사되었다. 단핵구를 퍼콜 구배를 이용하여 이형접합 V158/F158 FcγRIIIa PBMC로부터 분리하였다. 0.1 ng/ml의 존재하의 배양물에 1주 후에, 분화된 대식세포를 EDTA/PBS를 이용하여 떼어내고, 제조자의 절차에 따라(Sigma, St Louis, Mo) 친유성 형광단인 PKH26로 표지하였다. Sk-Br-3 표적 세포를 PKH67(Sigma, St Louis, Mo)로 표지하고, 웰당 20,000개 세포로 96-웰 플레이트에 접종하고, 지정된 최종 농도의 WT 또는 Fc 변이체 트라스투주맵(trastuzumab) 표지된 대식세포를 이어서 웰당 20,000개 세포로 옵소닌 처리된(opsonized), 표지된 Sk-Br-3 세포에 첨가하고, 상기 세포를 이중 표지 유세포 분석을 위해 세포를 가공하기 전에 18시간 동안 함께 배양하였다. 식작용(%)을 10,000 카운트 후에 집단(식작용된 + 식작용되지 않은)에서 Sk-Br-3의 총수에 대해 PKH76 및 PKH26(대식세포 + Sk-Br-3)로 함께 표지된 세포의 수로서 측정하였다. 도 30은 다양한 항체 농도에서 WT 및 Fc 변이체 트라스투주맵을 비교하는 데이타를 보여준다. 결과는 S239D/I332E/A330L(서열번호 214) 변이체가 WT 트라스투주맵에 대해 ADCP의 현저한 증가를 제공한다는 것을 나타낸다.

실시예 9. Fc 변이체에 의한 보체 결합 및 활성화

보체 단백질 C1q는 FcγR 결합 자리에 근접한 Fc 상의 자리에 결합하므로, Fc 변이체가 보체를 강화하고 활성화하는 이의 능력을 유지할지를 결정하는 것을 신중하였다. AlphaScreen^TM 분석을 이용하여 보체 단백질 C1q에 대한 선택적인 Fc 변이체의 결합을 측정하였다. 상기 분석을 실시예 2에 기재된 스트렙트아비딘 공여자 비드에 부착된 바이오티닐화된 WT 알렘투주맵(alemtuzumab) 항체, 및 리셉터 비드에 직접 커플링된 C1q를 이용하여 수행하였다. 도 31a에 보여준 V264I(서열번호 11), I332E(서열번호 30), S239E(서열번호 48), 및 V264I/I332E(서열번호 38) 리툭시맵(rituximab)의 결합 데이타는 C1q 결합이 손상되지 않는다는 것을 나타낸다. 세포 기재 CDC 분석을 또한 Fc 변이체가 보체를 활성화시키는 능력을 유지하는지를 조사하기 위해 선택된 Fc 변이체 상에서 수행하였다. 알라마르 블루(Alamar Blue)를 이용하여 인간 혈청 보체(Quidel, San Diego, CA)에 의한 Fc 변이체 및 WT 리툭시맵-옵소닌 처리된 WIL2-S 림프종 세포의 용해를 모니터링하였다. 도 31b의 데이타는 CDC가 Fc 변이체 S239E(서열번호 48), V264I(서열번호 11), 및 V264I/I332E(서열번호 38) 리툭시맵에 대해 손상받지 않는다는 것을 보여준다. 대조적으로, 도 31c는 Fc 변이체 S239D/I332E/A330L(서열번호 214)의 CDC가 완전히 감소된 반면, S239D/I332E(서열번호 95) 변이체가 WT 리툭시맵에 필적할만한 CDC를 매개한다는 것을 보여준다. 상기 결과는 단백질 공학이 상이한 작용체 기능 사이를 구별하기 위해 이용될 수 있다는 것을 나탄내다. 상기 조절은 항체의 생성 및 원하는 임상 결과를 위해 맞추어진 특성을 갖는 Fc 융합을 가능하게 할 뿐만 아니라, 작용체 기능 생물학을 실험적으로 조사하기 위해 이용하는 단일 세트의 시약을 제공할 것이다.

실시예 10. Fc 변이체에 의한 단백질 A 및 FcRn 결합

논의된 바와 같이, 박테리아 단백질 A 및 G 및 신생아 Fc 리셉터 FcRn은 Cγ2 및 Cγ3 도메인 사이의 Fc 도메인에 결합한다. 단백질 A는 항체 정제에 자주 이용되며, FcRn은 항체 약동학 및 수송에 주요한 역할을 한다. 그러므로, 단백질 A 및 FcRn에 결합하는 본 발명의 Fc 변이체의 능력을 조사하는 것은 중요하였다. AlphaScreen^TM 분석을 이용하여 실시예 2에 기재된 스트렙트아비딘 공여자 비드에 부착된 바이오티닐화된 WT 알렘투주맵 항체, 및 리셉터 비드에 직접 커플링된 단백질 A 및 FcRn을 이용하여 단백질 A 및 인간 FcRn에 대한 선택된 Fc 변이체의 결합을 측정하였다. 결합 데이타를 단백질 A에 대해서는 도 32에, FcRn에 대해서는 도 33에 보여준다. 상기 결과는 Cγ2-Cγ3 힌지 도메인이 Fc 치환에 의해 영향을 받지 않으며, 중요하게 단백질 A 및 FcRn에 결합하는 Fc 변이체의 능력은 손상을 받지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 11. 마우스 FcγRs에 결합하는 Fc 변이체의 능력

비인간 FcγRs에 대한 Fc의 최적화는 동물 모델에서 Fc 변이체를 실험적으로 시험하는데 유용할 수 있다. 예를 들면, 마우스(예를 들면 누드 마우스, SCID 마우스, 이종이식 마우스, 및/또는 형질전환 마우스)에서 시험할 때, 하나 이상의 마우스 FcγRs에 대해 최적화된 Fc 변이체를 포함하는 항체 및 Fc 융합은 임상 효능, 작용 기작 등에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있다. 본 발명의 Fc 변이체가 상기 실험에서 유용할 수 있는지를 평가하기 위해, 마우스 FcγRIII에 대한 선택된 Fc 변이체의 친화성을 AlphaScreen^TM 분석을 이용하여 측정하였다. AlphaScreen^TM 분석을 실시예 2에 기재된 스트렙트아비딘 공여자 비드에 부착된 바이오티닐화된 WT 알렘투주맵, 및 글루타티온 킬레이트 리셉터 비드에 결합된 GST-태깅된 마우스 FcγRIII를 이용하여 수행하고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 발현하고, 정제하였다. 상기 결합 데이타는 각각 알렘투주맵 및 트라스투주맵의 내용에서 도 34a 및 34b에 보여준다. 결과는 인간 FcγRIIIa에 대한 결합을 증가시키는 특정 Fc 변이체가 또한 마우스 FcγRIII에 대한 결합을 증가시킨다는 것을 보여준다. Fc 변이체에 의한 마우스 작용체 기능의 증진은 인간 PBMC's 보다 오히려 마우스를 이용한 전술한 세포 기재 ADCC 분석을 수행함으로써 조사하였다. 도 35는 S239D/I332E/A330L(서열번호 214) 트라스투주맵 변이체가 마우스 면역 세포의 존재하에 WT 에 대해 실제적인 ADCC 증진을 제공한다는 것을 보여준다. 상기 결과는 본 발명의 Fc 변이체, 또는 비인간 FcγRs에 대해 최적화된 기타 Fc 변이체가 동물 모델을 이용하는 실험에서 이용할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 12. CHO 세포에서 발현된 Fc 변이체의 확인

본 발명의 Fc 변이체가 스크리닝 목적으로 293T 세포에서 발현된 반면, 항체의 대규모 생산은 전형적으로 중국비단털랫난소(CHO) 세포주에서 발현에 의해 수행한다. CHO-발현된 Fc 변이체의 특성을 평가하기 위해, 선택된 Fc 변이체 및 WT 알렘투주맵을 CHO 세포에서 발현하고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제하였다. 도 36은 인간 V158 FcγRIIIa에 대한 CHO- 및 293T-발현된 Fc 변이체 및 WT 알렘투주맵의 결합을 비교하는 AlphaScreen^TM 데이타를 보여준다. 상기 결과는 본 발명의 Fc 변이체가 293T 또는 CHO에서 발현되든지 간에 필적할만한 FcγR 결합 증진을 보여준다는 것을 나타낸다.

실시예 13. 푸코오스 마이너스(Minus) 균주에서 Fc 변이체의 증진.

*본 발명의 Fc 변이체와 기타 Fc 변형의 조합이 최적화된 특성을 갖는 신규 항체 또는 Fc 융합을 생성할 목적으로 고려된다. 본 발명의 Fc 변이체와 작용체 기능 또는 하나 이상의 Fc 리간드와의 상호작용을 변경하는 변형을 포함하는 기타 Fc 변형을 조합하는 것이 유리할 수 있다. 상기 조합은 항체 또는 Fc 융합에서 첨가, 상승 효과, 또는 신규 특성을 제공할 수 있다. 예를 들면, 작용체 기능을 변경하는 Fc의 상이한 당형태를 조작하는 수많은 방법이 존재한다. 조작된 당형태는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 생성될 수 있으며, 상기 많은 기술은 Fc 도메인에 공유적으로 부착된 푸코실화되고/되거나 이분화된 올리고당의 수준을 조절하 는 것에 기초한다. Fc 당형태를 조작하는 하나의 방법은 변경된 당형태를 생성하는 세포주, 예를 들면, Lec-13 CHO 세포에서 Fc 폴리펩티드를 발현하는 것이다. 조작된 당형태와 조합된 Fc 변이체의 특성을 조사하기 위해, WT 및 V209(S239D/I332E/A330L(서열번호 214)) 트라스투주맵을 Lec-13 CHO 세포에서 발현하고, 전술한 바와 같이 정제하였다. 도 37a는 293T, CHO, 및 Lec-13 세포에서 발현된 WT 및 V209 트라스투주맵에 의한 인간 V158 FcγRIIIa에 대한 결합을 비교하는 AlphaScreen^TM 결합 데이타를 보여준다. 상기 결과는 상기 세포주 및 본 발명의 Fc 변이체에 의해 생성된 조작된 당형태 사이의 실질적인 상승효과가 있다는 것을 보여준다. 도 37b에 보여준 세포 기재 ADCC 분석은 상기 결과를 지지한다. 상기 데이타는 모두 기타 Fc 변형, 특히 조작된 당형태가 최적화된 작용체 기능을 갖는 항체 및 Fc 융합을 생성하기 위해 본 발명의 Fc 변이체와 조합될 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 14. Fc 변이체의 치료 적용

본 발명에 기재된 수많은 Fc 변이체는 항암 항체의 치료 효능을 향상하는 현저한 잠재력을 가진다. 예시 목적으로, 수많은 본 발명의 Fc 변이체는 항체 리툭시맵의 서열 내로 통합되었다. US 5,736,137에 기재된 WT 리툭시맵 경쇄(서열번호 3) 및 중쇄(서열번호 4)는 도 38a 및 38b에 보여준다. 향상된 항-CD20 항체 서열(서열번호 5)을 도 38c에 제공한다. 향상된 항-CD20 항체 서열은 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, 및 X₈로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 비-WT 아미노산을 포함한다. 상기 향상된 항-CD20 항체 서열은 또한 치환 Z₁ 및/또는 Z₂를 포함할 수 있다. 여기에서 리툭시맵의 이용은 오로지 실시예에 있으며, 상기 항체 또는 임의의 기타 특정 항체에 대한 Fc 변이체 또는 Fc 융합의 적용을 제한하는 의미는 아니다.

실시예 15. Fc/Fc 리간드 특이성의 완전한 구조/기능 분석

단백질 공학이 이의 생물학적 기능 및 특이성을 현저하게 변경하는 Fc 치환을 채굴하는(mining) 강력한 도구라는 것은 상기 실험 결과로부터 명백하다. 항체 및 Fc 융합의 심오한 임상학적 가치를 제공한다면, 상기 의미는 본 발명의 단백질 공학 방법이 상기 중요한 생물치료의 임상학적 특성을 조율하기 위해 이용될 수 있다는 것이다.

그러나, 상기 능력은 Fc 및 Fc 리간드의 구조 및 기능 사이의 관계의 더욱 완전한 이해를 요구한다. 게다가, Fc/Fc 리간드 특이성의 결정자에 관한 유용한 정보의 부족은 표적 목적으로서 모든 원하는 특성을 갖는 Fc 변이체를 활동적으로 디자인하는 것이 가능하지 않다는 것을 의미한다. 그리하여, 본 발명에 기재된 공격적인 실험 노력에도 불구하고, 채굴되지 않은 치료학적으로 유용한 Fc 변이체, 및 발견되지 않은 Fc 변이체의 생화학적 특성이 존재할 것 같다. 생물치료 적용에 대한 신규 Fc 변이체를 수득하는데 동일하게 중요한 것은 디자인 방법의 예상가능성을 향상하여, 더욱 효율적으로 확인되는 변이체를 허용하는 능력이다. 상기 목적을 향해, Fc/Fc 리간드 생물학의 더욱 철저한 규명을 수행하였다. 이는 하기를 포함하였다: 1) 모든 관련된 Fc 리간드를 포함하기 위한 1차 스크린의 확장, 및 2) 모든 관련된 Fc 위치에서 더 큰 치환 세트를 개발하기 위한 Fc 변이체의 수의 증가. 상기 폭넓은 접근은 함께 유용한 Fc 변이체의 더욱 철저한 채굴을 가능하게 하며, Fc/Fc 리간드 특이성 및 생물학의 더 큰 이해를 제공하며, 디자인 방법의 예상가능성의 엄한 정량적인 평가를 가능하게 하는 더 큰 데이타 세트를 제공할 것이다.

1차 스크린의 확장

Fc 특이성의 구조적 및 기능적 결정자를 더욱 잘 규명하기 위해, 1차 스크린을 모든 관련된 Fc 리간드를 포함하도록 확장하였다. 그리하여, 모든 Fc 변이체를 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa(Va1158 이성질형), FcRn, 및 C1q에 대한 결합에 대해 병렬적으로 시험하였다. AlphaScreen^TM 분석을 전술한 바와 같이 이용하였다. 모든 Fc 변이체를 표 62에 따라 알렘투주맵 또는 트라스투주맵의 내용에서 스크리닝하였다. 표 68은 Fc 위치 234 및 235에서 치환의 세트에 대한 병렬 스크린의 실시예를 보여준다. 상기 표에서, 연한 회색은 Fc 변이체/Fc 리간드 친화성이 WT 보다 0.5배 이하이며, 중간 회색은 Fc 변이체/Fc 리간드 친화성이 WT의 0.5-2.0 이내이며, 진회색은 Fc 변이체/Fc 리간드 친화성이 2배 이상 증가된 것을 나타내며, 백색은 Fc 변이체/Fc 리간드 상호작용이 측정되지 않거나 또는 데이타가 친화성의 정확한 측정을 허용하지 않는다는 것을 나타낸다. 그리하여, Fc 변이체는 현저하게 감소시키는 것, 실질적으로 변경하지 않는 것, 및 제시된 Fc 리간드에 대한 결합을 현저하게 증가시키는 것으로 분류된다. 상기 방식으 로 데이타를 보면, Fc의 구조/기능 맵을 제공하며, 각 위치에 대한 결과의 직접적인 해석을 가능하게 하여, 유용하고 흥미있는 변이체가 효율적으로 확인될 수 있으며, 디자인 방법의 예상가능성이 실제적인 방식으로 평가될 수 있다.

표 68

위치 234 및 235에서 수많은 치환은 다양한 Fc 리간드에 대한 결합에 대한 상이한 특이성을 보여준다. 일부 경우에 상기 차이가 미미하지만, 상기 결과는 수 많은 매우 상동성 리셉터가 동일한 자리에 결합하는 FcγR 경계면에서조차, 상이한 Fc 리간드에 대한 Fc 특이성을 조작하는 것이 정말로 가능하다는 것을 나타낸다. 가장 독특한 친화성 차이를 제공하는 기타 Fc 변이체가 표 69에 표시된다.

표 69

상기 데이타는 종종 매우 미묘한 돌연변이 차이를 이용함으로써, Fc 리간드 특이성에 대한 Fc를 조율하는 것이 가능하다는 것을 더욱 설득력 있게 보여준다. 예를 들면, A330Y/I332E(서열번호 112) 변이체는 C1q에 대한 결합을 유지하면서, 모든 FcγRs, 특히 FcγRIIIa 뿐만 아니라, FcRn에 대한 결합을 증진한다. 그러나, A300L/I332E(서열번호 114) 변이체는 FcγRI 및 FcγRIIIa에 대한 증진된 결합을 보여주나, FcγRII's에 대한 WT 친화성을 가진다. 대조적으로, L328에서 돌연변이는 FcγRs 및 FcγRIIIa에 대해 FcγRII's의 우선적인 증진을 제공한다. L328E/I332E(서열번호 172) 변이체의 경우에, 모든 FcγRII's에 대한 친화성은 증가된 반면, L328T/I332E(서열번호 176)는 FcγRIIc > FcγRIIb > FcγRIIa의 명확한 증진 특이성 프로필을 제공한다. 대조적으로, L328A는 FcγRIIa에 대한 결합을 현저하게 증진시키나, FcγRIIb 및 FcγRIIc를 포함하는 모든 기타 FcγR's에 대한 WT 친화성을 제공한다. 상기 결과로부터, 매우 미묘한 돌연변이 차이가 특이성에서 실질적인 차이를 제공할 수 있다는 것은 명백하다. 따라서, 상기와 같은 Fc 변이체의 집합은 원하는 결과에 대해 맞추어진 작용체 기능을 갖는 항체 및 Fc 융합의 생성을 가능하게 할 뿐만 아니라, 작용체 기능 생물학을 실험적으로 조사하고, 규명하기 위해 이용할 단일 세트의 시약을 제공할 것이다.

Fc 변이체 세트의 확장

Fc/Fc 리간드 상호작용의 구조적 및 기능적 결정자에 관한 불완전한 정보 때문에, 모든 원하는 최적화 목적을 위해 활동적으로 Fc를 조작하는 것이 가능하지 않았다. 다양한 FcγRs에 대해 표 68 및 69에서 관찰된 독특한 특이성 차이는 본 발명의 공격적인 스크리닝 접근에 기인하였으며; 상이한 FcγRs에 대한 Fc 의 결합에 대한 구조적 정보의 부족 뿐만 아니라, 힌지의 구조 및 유연성이 FcγR 결합에 영향을 주는 방법의 이해의 부족에 기인하여 표적 목적으로서 이의 특정 특성을 갖는 상기 Fc 변이체는 활동적으로 디자인되지 않았다. 정말로, 상기 위치 234 및 235에서 수많은 다양한 치환을 개발하는 결정은 이들이 Fc/FcγR 결합 자리 근처인가, 상기 위치에서 돌연변이가 FcγR 결합에 영향을 주는가, 및 컴퓨터 스크리닝 계산에 따라, 수많은 다양한 치환이 상기 위치에서 허용가능한지에 대한 지식에 기초한다. 전반적으로, Fc/FcγR 특이성의 결정자에 관한 구조적 정보의 부족, Fc/C1q 복합체의 고해상도 구조적 정보의 부족, 및 Fc/Fc 리간드 결합에 관한 치환의 간접적 효과를 설명하지 못하는 것은 모든 흥미있고 잠재적으로 유용한 Fc 변이 체가 현재 조작 방법을 이용하여 개발되지 않을 것이라는 확신을 갖게 한다. 유용한 Fc 변이체를 충분히 채굴할 뿐만 아니라, Fc/Fc 리간드 상호작용의 구조적 및 기능적 결정자의 더욱 완전한 그림을 수득하기 위해, Fc 변이체 세트를 더 폭넓은 세트의 돌연변이를 개발하기 위해 확장되었다. 유용한 구조의 시각적 조사에 의해 선택되고, 이전의 Fc 변이체 스크리닝의 결과에 의해 제공된 정보를 이용하여, FcγR's 및 C1q에 대한 결합 자리에서 또는 근처에서 모든 Fc 위치는 포화되어, 이전에 검사되지 않은 모든 치환이 구축되었다. FcγR 및 C1q 결합 자리에서 현저하게 먼 Fc 위치에서, 서브세트의 선택된 치환이 이전에 기재된 컴퓨터 스크리닝 계산에서 예상된 에너지, 및 기존의 Fc 변이체로부터 유용한 데이타에 기초하여 디자인되었다. 상기 신규 세트의 Fc 변이체인 총 576개를 표 70에 제공한다.

표 70

* 297위치의 치환은 S239D/I332내에서 이루어졌다.

모든 참고문헌은 본원에 원용에 의해 포함된다.

본 발명의 특정 예가 예시 목적으로 상기에 기재되었지만, 상세한 것의 수많은 변이가 첨부된 청구범위에 기재된 본 발명으로부터 벗어나지 않고 행해질 수 있다는 것을 당업자는 인식할 것이다.

도 1. 항체의 구조와 기능. 도시한 내용은 전장 인간 IgG1 항체의 모형으로서, pdb 기탁 코드 1CE1(James 외, 1999, J Mol Biol 289:293~301)로부터 얻은 인간화된 Fab 구조와 pdb 기탁 코드(DeLano 외, 2000, Science 287:1279~1283)로부터 얻은 인간 IgG1 Fc 구조를 나타낸다. Fab와 Fc를 연결하는 유연한 경첩부는 도시하지 않았다. IgG1 이종이량체들의 동종이량체인데, 경쇄 둘과 중쇄 둘로 만들어진다. 항체를 이루는 Ig 도메인을 표시하였는데, 이에는 경쇄의 VL과 CL, 중쇄의 Cγ1, Cγ2, Cγ3와 VH가 포함된다. Fc 도메인을 표시하였다. 관련된 단백질의 결합 자리를 표시하였는데, 가변부위의 항원 결합 자리, FcγR, FcRn, C1q와 단백질 A와 단백질 G가 Fc 부위에서 결합하는 자리도 포함된다.

도 2. Fc/FcγRIIIb 복합체 구조 1IIS. Fc는 회색의 리본 모식도로 나타내었고, FcγRIIb는 검은색 리본으로 나타내었다. N297 탄수화물은 검은 막대로 나타내었다.

도 3. 알렘투주맵항체(Campath^®, Ilex Pharmaceuticals LP의 등록 상표)(서열번호 1)의 중쇄 아미노산 서열을 나타내며, Kabat와 같이 EU 인덱스에 따라서(아미노산 서열 두 줄 아래), 그리고 순서대로 잔기 위치의 번호를 매겼다(아미노산 서열 두 줄 위). Ig의 V_H1, Cγ1, Cγ2, Cγ3, 경첩부가 시작하는 대략적 위치도 위 서열 번호 위에 나타내었다. 수많은 Fc의 잔기 위치에서 다형성을 관측되었는데 여기에는 Kabat을 포함하지만 이에 국한되지는 않으며 270, 272, 312, 315, 356, 358이고 따라서 본 명세서에서 제시한 서열과 선행기술의 서열에서 약간 차이가 있을 수 있다.

도 4. Fc/FcγRIIIb 복합체 구조 1IIS에 대해 작성된 실험 라이브러리 잔기들. Fc는 회색 리본 모식도로, FcγRIIIb는 검은색 리본으로 나타내었다. 실험 라이브러리 잔기는 검은색으로, N297 탄수화물은 회색으로 나타내었다.

도 5. Fc 변이체 실험 라이브러리 설계에 관련된 잔기 위치를 보여 주는 인간 IgG1 Fc 서열(서열번호 2). 이 서열은 경첩부, Cγ2 도메인, Cγ3 도메인을 포함한다. 잔기 번호는 Kabat과 같이 EU 인덱스를 따른다. 실험 라이브러리에 관련된 잔기 위치는 밑줄이 쳐져 있다. 몇몇 Fc 잔기 위치에서 관측된 다형성(polymorphic) 치환 때문에 본 명세서의 서열과 종래 문헌 서열과는 약간 다를 수 있다.

도 6. 293T 세포에서 알렘투주맵항체의 천연형(wild-type)과 Fc 변이체 단백질을 발현하였다. 알렘투주맵중쇄 유전자(천연형이나 변이형)를 가지는 플라스미드와 aletuzumab 경쇄 유전자를 가지는 플라스미드로 공동 형질감염(co-transfection)을 수행하였다. 형질감염 5일 후 배양액을 수집하였다. 각 형질감염 시료마다 배양액 10μL를 SDS-PAGE에 처하여 웨스턴 분석을 행하였다. 웨스턴 탐지자는 과산화효소 접합 염소 항인간IgG 항체(peroxidase-conjugated goat anti-human IgG, Jackson Immuno-Research社 카탈로그 번호 109-035-088)였다. WT: 천연형 알렘투주맵, 1-10: 알렘투주맵 변이체들, H와 L은 각각 항체 중쇄와 경쇄를 가리킨다.

도 7. 단백질 A 크로마토그래피를 이용한 알렘투주맵의 정제. 천연형 알렘투주맵 단백질을 293T 세포에서 발현하였고 그 배양액을 형질감염일로부터 5일 후에 수집하였다. PBS로 배양액을 1:1 비율로 희석하고 단백질 A(Pierce, 카탈로그 번호 20334) 정제하였다. O: 정제 전의 원래 시료, FT: 유출액(flow-through), E: 용리액(elution), C: 농축한 최종 시료. 왼쪽 사진은 Simple Blue로 염색한 SDS-PAGE 겔을이고 오른쪽은 과산화효소 접합 염소 항인간IgG 항체로 표지한 웨스턴 흡입법 결과이다.

도 8. 탈당화 항체의 생산. 천연형과 변이형 알렘투주맵을 293T 세포에서 발현시켜 단백질 A 크로마토그래피로 정제하였다. 이 항체를 펩티드 N-글리코시다아제(peptide N-glycosidase, PNGase F)와 함께 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 각 항체별로 PNGase 없이 모의 처리한 시료(-PNGase F)도 병행하였다. WT: 천연형 알렘투주맵, #15, #16, #17, #18과 #22: 각각 alemetuzumab의 F241E/F243R/V262E/V264R, F241E/F243Q/V262T/V264E, F241R/F243Q/V262T/V264R, F241E/F243Y/V262T/V264R와 I332E 변이체들이다. PNGase F로 처리한 시료가 모의 처리한 시료보다 더 빨리 이동한다는 점이 중쇄에서 탈당화 일어난 것을 나타낸다.

도 9. 293T 세포에서 발현된 알렘투주맵 항체는 그 항원과 결합한다. 항원성이 있는 CD52 펩티드를 GST와 융합하여 대장균 BL21(DE3)에서 IPTG 유도로써 발현하였다. 유도된 시료와 유도되지 않은 시료 모두를 SDS-PAGE 겔에 건 뒤, PVDF 막으로 전이시켰다. 웨스턴 분석을 위하여 Sotec사의 알렘투주맵(α-CD52)(최종 농도 2.5 ng/μL) 또는 형질감염된 293T 세포(Xencor사, Campath)의 배양액(최종 알렘투주맵 농도는 약 0.1~0.2 ng/μL)을 1차 항체로 사용하였고, 과산화효소 접합 염소 항인간IgG를 2차 효소로 사용하였다. M: 미리 염색된 마커, U : 비유도 GST-CD52 시료, I: 유도된 GST-CD52 시료

도 10. 인간 V158 FcγRIIIa의 세포외 부위의 발현과 정제. 표지한 FcγRIIIa으로 293T 세포에 형질감염한 다음 분비된 FcγRIIIa를 포함하는 배양액을 그 3일 후에 수집하여 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 1: 배양액, 2: 유출액, 3: 세척액, 4~8: 연속된 용리액. 심플 블루(Simple blue) 염색한 SDS-PAGE와 웨스턴 결과를 모두 나타내었다. 웨스턴 흡입법의 경우 그 막은 항GST 항체로 검사하였다.

도 11. 상기 실험 라이브러리에서 선택한 알렘투주맵 Fc 변이체가 인간 V158 FcγRIIIa에 결합하는 것을 AlphaScreen^TM(상표명) 검사법으로 감지한 결과, 실시예 2에서 기재한다. 경쟁 항체(Fc 변이체나 천연형 알렘투주맵)의 존재하에서 발광 신호가 줄어드는 것으로부터 특징적인 억제 곡선을 관측하였다. 인산 완충 식염수(PBS, phosphate buffered saline)만으로 음성 대조군을 삼았다. 결합 데이터는 각 특정 곡선마다 최대와 최저 발광 신호에 대하여 표준화(normalization)하였는데, 각각 항체의 낮은 농도와 높은 농도 조건에서 그 기저선(baseline)을 기준으로 하였다. 이 곡선은 비선형 회귀법을 사용하여 단일 결합 자리 경쟁 모형에 맞춰 얻은 근사 곡선이다. 이 근사곡선은 각 항체별 IC₅₀을 제공하는데, 천연형과 S239D에 대하여 점선으로 도시하였다.

도 12. 선택된 Fc 변이체 알렘투주맵들의 인간 FcγRIIb에 대한 결합을 AlphaScreen^TM으로 검사한 결과. 결합 데이터는 각 항체별 상부와 하부 기저선을 기준으로 표준화하였으며, 단일 결합 자리 경쟁 모형에 맞춰 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 13a 및 13b. 선택된 알렘투주맵(도 13a)과 트라스투주맵(도 13b) Fc 변이체들의 인간 Val158 FcγRIIIa에 대한 결합을 AlphaScreen^TM으로 검사한 결과. 이 결합 데이터는 각 항체별 상부와 하부 기저선을 기준으로 표준화하였으며, 단일 결합 자리 경쟁 모형에 맞춰 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 14a 및 14b. 선택된 트라스투주맵 Fc 변이체들의 인간 Val158 FcγRIIIa에 대한 결합을 AlphaScreen^TM으로 검사한 결과. 이 결합 데이터는 각 항체별 상부와 하부 기저선을 기준으로 표준화하였으며, 단일 결합 자리 경쟁 모형에 맞춰 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 15a 및 15b. 선택된 리툭시맵(도 15a)과 세투시맵(도 15b) Fc 변이체들의 인간 Val158 FcγRIIIa에 대한 결합을 AlphaScreen^TM으로 검사한 결과. 이 결합 데이터는 각 항체별 상부와 하부 기저선을 기준으로 표준화하였으며, 단일 결합 자리 경쟁 모형에 맞춰 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 16a 및 16b. 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체들의 인간 Val158 FcγRIIIa(도 16a)와 인간 FcγRIIb(도 16b)에 대한 결합을 AlphaScreen^TM으로 검사한 결과. 이 결합 데이터는 각 항체별 상부와 하부 기저선을 기준으로 표준화하였으며, 단일 결합 자리 경쟁 모형에 맞춰 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 17. 선택된 트라스투주맵 Fc 변이체들의 인간 Val158 Fcγ대한 결합을 AlphaScreen^TM으로 검사한 결과. 이 결합 데이터는 각 항체별 상부와 하부 기저선을 기준으로 표준화하였으며, 단일 결합 자리 경쟁 모형에 맞춰 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 18. 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체들의 인간 R131 FcγRIIa에 대한 결합을 AlphaScreen^TM으로 검사한 결과. 이 결합 데이터는 각 항체별 상부와 하부 기저선을 기준으로 표준화하였으며, 단일 결합 자리 경쟁 모형에 맞춰 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 19a 및 19b. 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체들의 인간 Val158 FcγRIIIa에 대한 결합을 AlphaScreen^TM으로 검사한 결과. 이 결합 데이터는 각 항체별 상부와 하부 기저선을 기준으로 표준화하였으며, 단일 결합 자리 경쟁 모형에 맞춰 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 20. 당화되지 않은 알렘투주맵 Fc 변이체들의 인간 V158 FcγRIIIa)에 대한 결합을 AlphaScreen^TM으로 검사한 결과. 이 결합 데이터는 각 항체별 상부와 하 부 기저선을 기준으로 표준화하였으며, 단일 결합 자리 경쟁 모형에 맞춰 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 21. 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체들의 당화 형태(속이 찬 기호와 실선)와 탈당화된 형태(속이 빈 기호와 점선)가 인간 V158 FcγRIIIa)와 결합하는 것을 AlphaScreen^TM으로 검사한 결과. 이 결합 데이터는 각 항체별 상부와 하부 기저선을 기준으로 표준화하였으며, 단일 결합 자리 경쟁 모형에 맞춰 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 22a 및 22b. 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체들이 인간 FcγRIIIa의 V158(도 22a)과 F158(도 22b) 동종이형에 결합하는 것을 AlphaScreen^TM으로 검사한 결과. 이 결합 데이터는 각 항체별 상부와 하부 기저선을 기준으로 표준화하였으며, 단일 결합 자리 경쟁 모형에 맞춰 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 23a, 23b, 23c 및 23d. 도 23a 및 23b는 SPR K_d와 AlphaScreen^TM으로 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체들이 인간 V158 FcγRIIIa(도 23a)와 F158 FcγRIIIa(도 23b)에 결합할 때 측정한 IC₅₀와의 상관관계를 보여준다. 도 23c와 도 23d는 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체가 V158 FcγRIIIa(도 23c)와 F158 FcRIIIa(도 23d)에 결합할 때 AlphaScreen^TM으로 검사한 결합 정도의 증가 배율과 SPR 사이의 상관 관계를 도시한다. 결합 데이터는 표 63에 나타내었다. 데이터를 잇는 직선은 데이터 에 대하여 선형으로 근사한 것이며, r² 값은 이 근사의 유의도를 가리킨다.

도 24a 및 도 24b. 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체들의 ADCC 현상을 세포기반 검사 방법으로 분석하였다. ADCC는 실시예 7에서 기술한대로 DELFIA® EuTDA 기반 세포독성 검사법(미국 매사추세츠주 Perkin Elmer社)으로 분석하였으며, DoHH-2 림프구 표적 세포와 50배 과량의 인간 PBMC를 사용하였다. 도 24a는 표시한 알렘투주맵 항체가 10 ng/μL일 때 가공 않은 형광 데이터를 보여 주는 막대 그래프이다. PBMC 막대는 항체가 없을 때의 바닥 수준의 세포독성을 나타낸다. 도 24b는 표시한 알렘투주맵 항체의 농도와 ADCC 사이의 용량 의존성을 보여주는데, 여기에서 항체의 농도가 낮거나 높을 때의 기저선으로부터 각각 최소와 최대 형광 신호를 구하여 이를 기준으로 각 곡선마다 크기를 표준화하였다. 이 곡선은 비선형 회귀법을 사용하여 데이터를 S자형 용량 의존성 모형에 맞춰 근사한 것이다.

도 25a, 25b 및 25c. 선택된 트라스투주맵 Fc 변이체들을 세포기반 ADCC 검사법으로 분석한 결과. ADCC는 실시예 7에 기재한대로 DELFIA EuTDA 기반 세포독성 검사법을 이용하여 BT474와 Sk-Br-3 유방암 세포주를 표적세포로, 인간 PBMC를 50배 과량으로 하여 측정하였다. 도 25는 트라스투주맵 항체가 1 ng/μL일 때 가공 않은 형광 데이터를 보여 주는 막대 그래프이다. PBMC 막대는 항체가 없을 때의 바닥 수준의 세포독성을 나타낸다. 도 25a 및 25b는 표시한 트라스투주맵 항체의 농도와 ADCC 사이의 용량 의존성을 보여주는데, 여기에서 항체의 농도가 낮거나 높을 때의 기저선으로부터 각각 최소와 최대 형광 신호를 구하여 이를 기준으로 각 곡선마다 크기를 표준화하였다. 이 곡선은 비선형 회귀법을 사용하여 데이터를 S자형 용량 의존성 모형에 맞춰 근사한 것이다.

도 26a, 26b 및 26c. 선택된 리툭시맵 Fc 변이체들을 세포기반 ADCC 검사법으로 분석한 결과. ADCC는 실시예 7에 기재한대로 DELFIA EuTDA 기반 세포독성 검사법을 이용하여 WIL2-S 림프종 세포주를 표적세포로, 인간 PBMC를 50배 과량으로 하여 측정하였다. 도 26a는 리툭시맵 항체가 1 ng/μL일 때 가공 않은 형광 데이터를 보여 주는 막대 그래프이다. PBMC 막대는 항체가 없을 때의 바닥 수준의 세포독성을 나타낸다. 도 26b와 26c는 표시한 리툭시맵 항체의 농도와 ADCC 사이의 용량 의존성을 보여주는데, 여기에서 항체의 농도가 낮거나 높을 때의 기저선으로부터 각각 최소와 최대 형광 신호를 구하여 이를 기준으로 각 곡선마다 크기를 표준화하였다. 이 곡선은 비선형 회귀법을 사용하여 데이터를 S자형 용량 의존성 모형에 맞춰 근사한 것이다.

도 27a 및 27b. ADCC 현상의 세기와 효능의 향상이 있는 선택된 트라스투주맵 Fc 변이체(도 27a)와 리툭시맵 Fc 변이체(도 27b)들을 세포기반 검사법으로 분석한 결과. 두 측정 실험 모두 F158/F158 FcγRIIIa PBMC 동종접합체를 작용체로 하여 표적 세포보다 25배 과량으로 사용하였는데, 표적세포는 트라스투주맵 분석에 Sk-Br-3, 리툭시맵 분석에 WIL2-S를 사용하였다. 데이터는 실시예 7에서 기재한대로, PBMC만으로 처리(항체 없음)한 표적 세포의 형광 신호에서 구할 수 있는 절대 최소 세포용해 조건과 Triton X-1000 존재하에 표적 세포의 형광 신호에서 구할 수 있는 절대 최대 세포용해 조건을 기준으로 표준화하였다.

도 28. 서로 다른 수준의 Her2/neu 표적 항원을 발현하는 다양한 세포주에 대하여 선택된 트라스투주맵 Fc 변이체들이 일으키는 ADCC를 세포기반 검사법으로 분석한 결과. ADCC 검사법은 실시예 7에 기재된 대로 실행하였는데, Her/neu 리셉터를 확대된 수준에서 또는 낮은 수준에서 발현하는 다양한 세포주를 대상으로 하였다. 이에는 Sk-Br-3 (약 1x10⁶ 리셉터), SkOV3 (약 1X10⁵), OVCAR3 (약 1x10⁵), 및 MCF-7 (약 3x10³)이 포함된다. F158/F158 FcγRIIIa로 그 동종이형이 밝혀진 인간 PBMC를 표적 세포에 대하여 25배 과량으로 사용하였다. 막대 그래프는 천연형과 Fc 변이체가 표시한 세포주에 대하여 일으키는 ADCC 데이터를 나타내는데, 데이터는 최소 세포용해 조건(PBMC만 가함)과 최대 세포용해 조건(Triton X-1000)으로 정하여지는 형광 신호의 최소값과 최대값을 기준으로 표준화하였다.

도 29. 선택된 트라스투주맵 Fc 변이체의 ADCC 검사에 있어서 자연 세포독성 세포를 작용체로 사용하고 LDH 방출을 측정하여 세포 용해를 관측함으로써 세포기반 둔 분석 방법으로 수행하였다. 자연 세포독성 세포의 동종이형은 V158/F158 FcγRIIIa였고, 그 양은 Sk-Br-3 유방암 표적 세포에 대하여 8배 과량이었다. 세포독성은 LDH 세포독성 감지 키트(독일 Penzberg 소재 Roche Diagnostics社)를 제조사의 설명대로 사용하여 측정하였다. 그래프는 표시한 트라스투주맵 항체에 있어서 항체 농도와 ADCC 사이의 용량 의존성을 보여주는데, 데이터를 각각 항체 농도가 낮거나 높을 때의 기저선에서 얻은 형광 신호의 최소값과 최대값을 기준으로 표준화하였다. 그림의 곡선은 비선형 회귀법을 사용하여 데이터를 S자형 용량 반응 모형(sigmoidal dose-response model)에 맞춰 근사한 것이다.

도 30. 세포기반 선택된 변이체의 ADCP 분석. ADCP 분석법은 실시예 8에 나타난 대로, 공동 표지 방식을 유동세포 분석과 결합하여 수행하였다. 분화된 대식세포(macrophage)를 작용체로 사용하였고, Sk-Br-3 세포를 표적 세포로 사용하였다. 퍼센트 식세포작용은 Sk-Br-3의 총수(포식된 세포와 되지 않은 것)에서 공동표지된 세포(대식세포 + Sk-Br-3)의 수가 차지하는 분율을 나타낸다.

도 31a, 31b 및. 31c. 선택된 Fc 변이체가 보체의 결합과 활성화를 매개하는 능력. 도 31a는 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체가 C1q에 결합하는 것을 AlphaScreen^TM 검사법으로 측정한 결과를 보여준다. 결합 데이터는 각 항체마다 상부와 하부의 기저선을 기준으로 표준화하였고, 그림의 곡선은 단일 결합자리 경쟁 모형에 맞춰 데이터를 근사한 것이다. 도 31b와 31c는 선택된 리툭시맵 Fc 변이체가 CDC를 매개하는 능력을 세포기반 검사법으로 측정한 것이다. CDC 검사법은 Alamar Blue를 사용하여 천연형 또는 Fc 변이체 리툭시맵으로 옵소닌화(opsonization)한 WIL2-S 림프종 세포에 대하여 인간 혈청 보체로 세포 용해하는 것을 관찰하여 수행하였다(캘리포니아 샌디에고 소재 Quidel社). 보체 매개 세포 용해의 항체 농도에 따른 용량반응성을 표시한 리툭시맵 항체에 대하여 나타내고 있는데, 데이터는 각각 항체 농도가 낮거나 높을 때의 기저선에서 얻은 형광 신호의 최소값과 최대값을 기준으로 표준화하였다. 그림의 곡선은 비선형 회귀법을 사용하여 데이터를 S자형 용량 반응 모형(sigmoidal dose-response model)에 맞춰 근 사한 것이다.

도 32. 실시예 10에서 기재된 바와 같이, 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체가 단백질 A에 결합하는 것을 AlphaScreen^TM 검사법으로 분석한 결과. 결합 데이터는 각 항체마다 상부와 하부의 기저선을 기준으로 표준화하였고, 그림의 곡선은 단일 결합자리 경쟁 모형에 맞춰 데이터를 근사한 것이다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 33. 실시예 10에서 기재된 바와 같이, 알렘투주맵 Fc 변이체가 인간 FcRn에 결합하는 것을 AlphaScreen^TM 검사법으로 분석한 결과.

도 34a 및 34b. 실시예 11에 나타낸 바와 같이, 선택된 select알렘투주맵(도 34a)과 트라스투주맵(도 34b) Fc 변이체가 마우스 FcγRIIIa에 결합하는 것을 AlphaScreen^TM 검사법으로 측정하였다. 결합 데이터는 각 항체마다 상부와 하부의 기저선을 기준으로 표준화하였고, 그림의 곡선은 단일 결합자리 경쟁 모형에 맞춰 데이터를 근사한 것이다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 35. 선택된 트라스투주맵 Fc 변이체가 일으키는 ADCC를 마우스 PBMC를 작용체로 사용하여 세포기반 분석법으로 측정하였다. ADCC는 실시예 7에서 기술한대로 DELFIA® EuTDA 기반 세포독성 검사법으로 분석하였으며, Sk-Br-3 유방암 표적 세포와 8배 과량의 마우스 PBMC를 사용하였다. 막대그래프는 표시한 트라스투주맵 항체가 10 ng/μL일 때 가공 않은 형광 데이터를 보여 준다. PBMC 막대는 항체가 없을 때의 바닥 수준의 세포독성을 나타내고, TX는 Triton X-1000의 존재하 완전한 세포 용해를 나타낸다.

도 36. 실시예 12에 기재한 대로, 선택된 트라스투주맵 Fc 변이체를 293T와 CHO 세포에서 발현시켜 인간 V158 FcγRIIIa와의 결합을 AlphaScreen^TM 검사법으로 측정하였다. 결합 데이터는 각 항체마다 상부와 하부의 기저선을 기준으로 표준화하였고, 그림의 곡선은 단일 결합자리 경쟁 모형에 맞춰 데이터를 근사한 것이다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 37a 및 37b. Fc 변이체와 가공된 당결합형 단백질 사이의 상승효과. 도 37a는 선택된 트라스투주맵 천연형과 Fc 변이체(V209, S239/I332E/A330L)를 293T와 CHO, 그리고 L33-13 CHO 세포에서 발현시켜 V158 Fcγ결합을 AlphaScreen^TM 검사법으로 측정하였다. 결합 데이터는 각 항체마다 상부와 하부의 기저선을 기준으로 표준화하였고, 그림의 곡선은 단일 결합자리 경쟁 모형에 맞춰 데이터를 근사한 것이다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다. 도 37b에서는 293T, CHO, Lee-13 CHO 세포에서 발현된 선택된 트라스투주맵 천연형과 V209 돌연변이체이 ADCC를 매개하는 능력을 세포기반 ADCC 검사법으로 측정하였다. ADCC는 실시예 7에서 기술한대로 DELFIA® EuTDA 기반 세포독성 검사법으로 분석하였으며, Sk-Br-3 유방암 표적 세포를 사용하였다. 그림은 표시한 트라스투주맵 항체에 있어서 항체 농도와 ADCC 사이의 용량 의존성을 보여주는데, 데이터를 각각 항체 농도가 낮거나 높을 때의 기저선에서 얻은 형광 신호의 최소값과 최대값을 기준으로 표준화하였다. 그림의 곡선은 비선형 회귀법을 사용하여 데이터를 S자형 용량 반응 모형에 맞춰 근사한 것이다.

도 38a, 38b와 38c. 향상된 항CD20 항체를 이루는 서열을 도시한다. 리툭시맵의 경쇄와 중쇄(서열번호 3 및 4)를 각각 도 38a 및 38에 나타내었는데, 이는 미국 특허 5,736,137호의 해석된 서열번호 3으로부터 취하였다. 도 38b에서 관련된 위치는 굵은 글씨로 표시하였는데, 이에는 S239, V240, V264I, E272, K274, N297, S298, K326, A330, I332이 포함된다. 도 38c는 향상된 항CD20 항체 중쇄 서열을 도시하고 있는데, 가변 위치를 굵은 글씨로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, X₈, Z₁, Z₂(서열번호 5)와 같이 타내었다. 서열 아래 있는 표는 이 가변 위치에 가능한 치환을 나타낸다. 향상된 항CD20 항체 서열은 가능한 치환군 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 또는 X8로부터 선택되는 비천연형 아미노산을 적어도 하나 갖추고 있다. 이 향상된 항CD20 항체 서열은 Z1 또는 Z2 치환을 추가적으로 구비할 수도 있다. 이 위치의 번호는 Kabat와 같이 EU 인덱스에 따르며 그 서열 자체의 순서에 따르지 않는다.

SEQUENCE LISTING <110> Xencor Lazar, Gregory Alan Chirino, Arthur J. Dang, Wei Desjarlais, John R. Doberstein, Stephen Kohl Hayes, Robert J. Karki, Sher Bahadur Vafa, Omid <120> OPTIMIZED Fc VARIANTS AND METHODS FOR THEIR GENERATION <130> FP-71386-8-PC <140> PCT/US 2004/009298 <141> 2004-03-26 <150> US 10/672,280 <151> 2003-09-26 <150> US 60/477,839 <151> 2003-06-12 <150> US 60/467,606 <151> 2003-05-02 <160> 308 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 451 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 70 75 80 Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 2 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 3 <211> 213 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 4 <211> 451 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 5 <211> 451 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (243)..(243) <223> Xaa can be one of the following amino acids: serine, aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine or threonine <220> <221> misc_feature <222> (244)..(244) <223> Xaa can be one of the following amino acids: valine, isoleucine or methionine <220> <221> misc_feature <222> (268)..(268) <223> Xaa can be one of the following amino acids: valine, isoleucine, threonine or tyrosine <220> <221> misc_feature <222> (276)..(276) <223> Xaa can be one of the following amino acids: glutamic acid or tyrosine <220> <221> misc_feature <222> (278)..(278) <223> Xaa can be one of the following amino acids: lysine or glutamic acid <220> <221> misc_feature <222> (301)..(301) <223> Xaa can be one of the following amino acids: asparagine or aspartic acid <220> <221> misc_feature <222> (302)..(302) <223> Xaa can be one of the following amino acids: serine or alanine <220> <221> misc_feature <222> (330)..(330) <223> Xaa can be one of the following amino acids: lysine, glutamic acid or threonine <220> <221> misc_feature <222> (334)..(334) <223> Xaa can be one of the following amino acids: alanine, tyrosine, leucine or isoleucine <220> <221> misc_feature <222> (336)..(336) <223> Xaa can be one of the following amino acids: isoleucine, aspartic acid, glutamic acid, asparagine or glutamine <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 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Claims

모체 Fc 부위의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드로서,

상기 Fc 변이체는 상기 모체 Fc 부위에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 치환은 243W, 243L, 243E, 243Y, 243R, 243Q 및 243H로 이루어진 군으로부터 선택되며,

상기 Fc 변이체의 폴리펩타이드는 상기 모체 Fc 부위에 비해 FcγR에 대해 변경된 결합성을 가지며,

상기 위치 번호는 EU 인덱스에 따른 것인 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 치환이 243W, 243E, 243Y, 243R, 243Q 또는 243H인 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 치환이 243L인 폴리펩타이드.
인간 IgG1 Fc 부위의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 Fc 부위는 천연 IgG1 Fc 부위에 비해 1 내지 5 개의 치환을 포함하되, 상기 치환 중 적어도 하나는 243번 위치에서 일어나며, 상기 위치 번호는 EU 인덱스에 따른 것이고, 상기 변이체 Fc 부위는 천연 IgG1 Fc 부위에 비해 FcγR에 대해 더 높은 친화도로 결합하는 것인 폴리펩타이드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 부위에서 적어도 하나의 치환을 더 포함하되, 상기 치환은 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336 및 337로 구성되는 군으로부터 선택되는 한 위치에서 일어나며, 상기 위치 번호는 EU 인덱스에 따른 것인 폴리펩타이드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 변이체는 상기 Fc 부위에서 적어도 하나의 치환을 더 포함하되, 상기 치환은 227E, 227K, 227Y, 227G, 228E, 228K, 228Y, 228G, 230A, 230E, 230Y, 230G, 231E, 231K, 231Y, 231P, 231G, 232E, 232K, 232Y, 232G, 233D, 233N, 233Q, 233K, 233R, 233S, 233T, 233H, 233A, 233V, 233L, 233I, 233F, 233M, 233Y, 233W, 233G, 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 234K, 234R, 234S, 234A, 234M, 234W, 234P, 234G, 235D, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 235E, 235K, 235R, 235A, 235M, 235W, 235P, 235G, 236D, 236E, 236N, 236Q, 236K, 236R, 236S, 236T, 236H, 236A, 236V, 236L, 236I, 236F, 236M, 236Y, 236W, 236P, 237D, 237E, 237N, 237Q, 237K, 237R, 237S, 237T, 237H, 237V, 237L, 237I, 237F, 237M, 237Y, 237W, 237P, 238D, 238E, 238N, 238Q, 238K, 238R, 238S, 238T, 238H, 238V, 238L, 238I, 238F, 238M, 238Y, 238W, 238G, 239E, 239Q, 239D, 239N, 239F, 239T, 239H, 239Y, 239K, 239R, 239V, 239L, 239I, 239M, 239W, 239P, 239G, 240I, 240A, 240T, 240M, 241W, 241L, 241Y, 241E, 241R, 241D, 241S, 244H, 245A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247V, 247G, 249Q, 249H, 249Y, 255E, 255Y, 258S, 258H, 258Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262E, 262F, 262I, 262A, 262T, 263I, 263A, 263T, 263M, 264A, 264L, 264I, 264T, 264F, 264M, 264Y, 264E, 264D, 264N, 264Q, 264K, 264R, 264S, 264H, 264W, 264P, 264G, 265G, 265N, 265Y, 265F, 265Q, 265K, 265R, 265S, 265T, 265H, 265V, 265L, 265I, 265M, 265W, 265P, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 267T, 267H, 267D, 267N, 267E, 267K, 267R, 267V, 267I, 267F, 267M, 267Y, 267W, 267P, 268D, 268E, 268Q, 268K, 268R, 268T, 268V, 268L, 268I, 268F, 268M, 268W, 268P, 268G, 269H, 269Y, 269F, 269R, 269T, 269L, 269N, 269K, 269S, 269V, 269I, 269M, 269W, 269P, 269G, 270Q, 270T, 270H, 270R, 270S, 270L, 270I, 270F, 270M, 270Y, 270W, 270P, 270G, 271D, 271E, 271N, 271Q, 271K, 271R, 271S, 271T, 271H, 271A, 271V, 271L, 271I, 271F, 271M, 271Y, 271W, 271G, 272S, 272K, 272I, 272Y, 272D, 272R, 272T, 272H, 272V, 272L, 272F, 272M, 272W, 272P, 272G, 273I, 274T, 274E, 274R, 274L, 274Y, 274D, 274N, 274H, 274V, 274I, 274F, 274M, 274W, 274P, 274G, 275W, 275L, 276S, 276E, 276R, 276L, 276Y, 276D, 276T, 276H, 276V, 276I, 276F, 276M, 276W, 276P, 276G, 278T, 278E, 278K, 278W, 278D, 278N, 278Q, 278R, 278S, 278H, 278V, 278L, 278I, 278M, 278P, 278G, 280K, 280L, 280W, 280P, 280G, 281D, 281K, 281Y, 281P, 282E, 282K, 282Y, 282P, 282G, 283R, 283K, 283H, 283L, 283Y, 283P, 283G, 284E, 284N, 284T, 284L, 284Y, 285D, 285E, 285Q, 285K, 285Y, 285W, 286E, 286Y, 286P, 286G, 288D, 288E, 288Y, 290D, 290N, 290H, 290L, 290W, 291D, 291E, 291Q, 291T, 291H, 291I, 291G, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293N, 293R, 293S, 293T, 293H, 293V, 293L, 293I, 293F, 293M, 293Y, 293W, 293P, 293G, 294K, 294R, 294S, 294T, 294H, 294V, 294L, 294I, 294F, 294M, 294Y, 294W, 294P, 294G, 295D, 295E, 295N, 295R, 295S, 295T, 295H, 295V, 295I, 295F, 295M, 295Y, 295W, 295P, 295G, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296K, 296R, 296A, 296V, 296M, 296G, 296H, 297S, 297D, 297E, 297Q, 297K, 297R, 297T, 297H, 297V, 297L, 297I, 297F, 297M, 297Y, 297W, 297P, 297G, 298A, 298T, 298N, 298H, 298D, 298E, 298Q, 298K, 298R, 298I, 298F, 298M, 298Y, 298W, 299I, 299A, 299S, 299V, 299H, 299D, 299E, 299N, 299Q, 299K, 299R, 299L, 299F, 299M, 299Y, 299W, 299P, 299G, 300D, 300E, 300N, 300Q, 300K, 300R, 300S, 300T, 300H, 300A, 300V, 300M, 300W, 300P, 300G, 301D, 301E, 301H, 301Y, 302I, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304N, 304T, 304H, 304L, 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E, 317Q, 318R, 318Q, 318H, 318L, 318Y, 320T, 320D, 320I, 320N, 320S, 320H, 320V, 320L, 320F, 320Y, 320W, 320P, 320G, 322T, 322H, 322D, 322S, 322V, 322I, 322F, 322Y, 322W, 322P, 322G, 323I, 324T, 324D, 324R, 324I, 324V, 324L, 324Y, 324H, 324F, 324M, 324W, 324P, 324G, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 325K, 325R, 325S, 325F, 325M, 325Y, 325W, 325P, 325G, 326E, 326L, 326I, 326T, 326P, 327S, 327N, 327L, 327D, 327T, 327E, 327K, 327R, 327H, 327V, 327I, 327F, 327M, 327Y, 327W, 327P, 328M, 328E, 328F, 328I, 328Q, 328D, 328N, 328V, 328T, 328H, 328A, 328K, 328R, 328S, 328Y, 328W, 328P, 328G, 329F, 329D, 329E, 329N, 329Q, 329K, 329R, 329S, 329T, 329H, 329V, 329L, 329I, 329M, 329Y, 329W, 329G, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 330S, 330W, 330M, 330E, 330N, 330T, 330P, 330G, 331V, 331H, 331D, 331Q, 331R, 331T, 331L, 331I, 331F, 331M, 331Y, 331W, 332E, 332D, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 332K, 332R, 332S, 332V, 332L, 332F, 332M, 332W, 332P, 333T, 333H, 333I, 333Y, 333L, 333F, 333M, 333P, 333A, 334I, 334T, 334F, 334P, 334A, 335D, 335R, 335Y, 335N, 335S, 335H, 335V, 335L, 335I, 335F, 335M, 335W, 335P, 335G, 336E, 336K, 336Y, 337E, 337N 및 337H로 구성되는 군으로부터 선택되며, 상기 위치 번호는 EU 인덱스에 따른 것인 폴리펩타이드.
인간 IgG1 항체의 변이체로서, 상기 변이체는 천연 IgG1에 비해 불변 중쇄에서 1 내지 10 개의 치환을 포함하되, 상기 치환 중 적어도 하나는 상기 불변 중쇄의 243번 위치에서 일어나며, 상기 위치 번호는 EU 인덱스에 따른 것이고, 상기 변이체 항체는 천연 인간 IgG1 항체에 비해 FcγR에 대해 더 높은 친화도로 결합하는 것인 인간 IgG1 항체의 변이체.
제7항에 있어서, 상기 치환 중 적어도 하나는 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 275, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336 및 337로 구성되는 군으로부터 선택되는 한 위치에서 일어나며, 상기 위치번호는 EU 인덱스에 따른 것인 변이체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변경된 결합성은 인간 FcγR에 대한 상기 Fc 변이체의 친화도의 증가인 폴리펩타이드.
제1항 내지 제4항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcγR은 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc 및 FcγRIIIa로 구성되는 군으로부터 선택되는 인간 FcγR인 폴리펩타이드.
제1항 내지 제4항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 변이체는 조작된 당형태(engineered glycoform)를 더 포함하되, 상기 조작된 당형태는 상기 모체 폴리펩타이드에 비해 푸코실화(fucosylation) 또는 양분성(bisecting) 올리고당을 변경된 수준으로 포함하는 것인 폴리펩타이드.
제1항 내지 제4항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 변이체는 상기 모체 폴리펩타이드에 비해 작용체 기능(effector function)을 조절하는 것인 폴리펩타이드.
제12항에 있어서, 상기 작용체 기능은 항체 의존적 세포-중재 세포독성(ADCC: antibody dependent cell-mediated cytotoxicity)인 폴리펩타이드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 CD2, CD3, CD3E, CD4, CD11, CD11a, CD14, CD16, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33 (p67 단백질), CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD80, CD147, GD3, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마; TNF-알파, TNF베타2, TNFc, TNF알파베타, TNF-RI, TNF-RII, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEGI, OX40L, TRAIL 수용체-1, A1 아데노신 수용체, 림포톡신 베타 수용체, TACI, BAFF-R, EPO; LFA-3, ICAM-1, ICAM-3, EpCAM, 인테그린 베타1, 인테그린 베타2, 인테그린 알파4/베타7, 인테그린 알파2, 인테그린 알파3, 인테그린 알파4, 인테그린 알파5, 인테그린 알파6, 인테그린 알파v, 알파V베타3 인테그린, FGFR-3, 케라티노사이트 성장인자, VLA-1, VLA-4, L-셀렉틴, 항-Id, E-셀렉틴, HLA, HLA-DR, CTLA-4, T 세포 수용체, B7-1, B7-2, VNR인테그린, TGF베타1, TGF베타2, 이오탁신(eotaxin)1, BLyS (B-림프구 자극체), 보체 C5, IgE, 인자 VII, CD64, CBL, NCA 90, EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), 조직인자, VEGF, VEGFR, 엔도텔린 수용체, VLA-4, 합텐 NP-cap 또는 NIP-cap, T 세포 수용체 알파/베타, E-셀렉틴, 다이곡신, 플래센탈 알칼라인 포스파타아제(placental alkaline phosphatase: PLAP) 및 고환(testicular) PLAP-유사체 알칼린 포스파타제, 트랜스페린 수용체(transferrin receptor), 암배항원(Carcinoembryonic antigen: CEA), CEACAM5, HMFG PEM, 뮤신(mucin) MUC1, MUC18, 헤파라나제(Heparanase) I, 인간 심장 미오신(human cardiac myosin), 종양-관련 당단백-72(tumor-associated glycoprotein-72)(TAG-72), 종양-관련 항원(tumor-associated antigen) CA 125, 전립선 특이적 막 항원(prostate specific membrane antigen)(PSMA), 고분자량 흑색종-관련 항원(High molecular weight melanoma-associated antigen) (HMW-MAA), 암-관련 항원(carcinoma-associated antigen), Gcoprotein IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), 종양-관련 항원 발현 루이스 Y 연관된 탄수화물(tumor-associated antigen expressing Lewis Y related carbohydrate), 인간 사이토메가바이러스(HCMV) gH 엔벨로프 당단백질, HIV gp120, HCMV, 호흡기 신시탈 바이러스(respiratory syncital virus) RSV F, RSVF Fgp, VNR인테그린, IL-8, 사이토케라틴 종양-관련 항원(cytokeratin tumor-associated antigen), Hep B gp120, CMV, gpIIbIIIa, HIV IIIB gp120 V3 루프(loop), 호흡기 신시탈 바이러스(respiratory syncytial virus) (RSV) Fgp, 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) (HSV) gD 당단백질, HSV gB 당단백질, HCMV gB 엔벨로프 당단백질, 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 톡신(Clostridium perfringens toxin)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 타겟 항원에 대한 특이성을 가지는 것인 폴리펩타이드.
제 1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 Fc 융합체 또는 항체인 폴리펩타이드.
제15항에 있어서, 상기 항체는 인간 IgG인 폴리펩타이드.
제15항에 있어서, 상기 모체 Fc 부위는 인간 IgG1 Fc 부위인 폴리펩타이드.
제15항에 있어서, 상기 모체 Fc 부위는 인간 IgG2 Fc 부위인 폴리펩타이드.
제1항 내지 제4항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 폴리펩타이드와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 자가면역 질환(autoimmune disease), 면역학적 질환(immunological disease), 감염성 질환(infectious disease), 염증성 질환(inflammatory disease), 신경학적 질환(neurological disease), 및 종양학적(oncological) 및 신생(neoplastic) 질환을 포함하는 군으로부터 선택되는 질환의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
제1항 내지 제4항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드의 약제학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환(autoimmune disease), 면역학적 질환(immunological disease), 감염성 질환(infectious disease), 염증성 질환(inflammatory disease), 신경학적 질환(neurological disease), 및 종양학적(oncological) 및 신생(neoplastic) 질환을 포함하는 군으로부터 선택되는 질환의 치료를 요하는, 인간을 제외한 포유 동물의 치료 방법.