ES2707297T3 - Inmunoconjugados novedosos - Google Patents
Inmunoconjugados novedosos Download PDFInfo
- Publication number
- ES2707297T3 ES2707297T3 ES12717674T ES12717674T ES2707297T3 ES 2707297 T3 ES2707297 T3 ES 2707297T3 ES 12717674 T ES12717674 T ES 12717674T ES 12717674 T ES12717674 T ES 12717674T ES 2707297 T3 ES2707297 T3 ES 2707297T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- seq
- immunoconjugate
- domain
- sequence
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 title claims abstract description 545
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 302
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims abstract description 286
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 282
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 272
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 263
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 226
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 225
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 225
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 125
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims abstract description 90
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims abstract description 90
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 78
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 71
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 108700004922 F42A Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102220495631 Putative uncharacterized protein LOC645739_F42A_mutation Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 102220610852 Thialysine N-epsilon-acetyltransferase_L72G_mutation Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 claims abstract description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 141
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 141
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 141
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 101
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 86
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 86
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 68
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 62
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 59
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 59
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 59
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 claims description 52
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 claims description 52
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 52
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 41
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 41
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 35
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 33
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 21
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 19
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 claims description 17
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims description 15
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims description 15
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 12
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 102220505697 Palmitoyl-protein thioesterase 1_Y45F_mutation Human genes 0.000 abstract description 6
- 102200013599 rs452472 Human genes 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 195
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 144
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 85
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 81
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 73
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 62
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 62
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 58
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 57
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 56
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 43
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 42
- 230000006870 function Effects 0.000 description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 40
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 34
- RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N (3beta,5beta,7alpha)-3,7-Dihydroxycholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)CC2 RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 30
- -1 Invitrogen Substances 0.000 description 29
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 29
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 28
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 27
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 26
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 24
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 24
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 24
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 24
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 22
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 22
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 22
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 22
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 21
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 21
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 21
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 17
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 17
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 17
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 17
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 16
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 16
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 16
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 16
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 16
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 16
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 16
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 16
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 15
- 238000012435 analytical chromatography Methods 0.000 description 15
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 15
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 14
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 14
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 14
- 101000666340 Homo sapiens Tenascin Proteins 0.000 description 13
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 13
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 13
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 13
- 102100038126 Tenascin Human genes 0.000 description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 13
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 13
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 13
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 13
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 12
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 12
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 12
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 12
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 12
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 12
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 11
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 11
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 9
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 9
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 8
- 102100020773 Immunoglobulin kappa variable 1-12 Human genes 0.000 description 8
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 8
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 8
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 8
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 8
- 230000005888 antibody-dependent cellular phagocytosis Effects 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 230000025545 Golgi localization Effects 0.000 description 7
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 7
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 7
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 7
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 6
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 6
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 101001001642 Xenopus laevis Serine/threonine-protein kinase pim-3 Proteins 0.000 description 6
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 6
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 6
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 6
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 6
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 6
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 6
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 6
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 6
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 5
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 5
- 108010017535 Interleukin-15 Receptors Proteins 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 5
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 5
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 5
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 4
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 4
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 4
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 4
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 4
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 4
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 4
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 4
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 230000006786 activation induced cell death Effects 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 4
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 108010083819 mannosyl-oligosaccharide 1,3 - 1,6-alpha-mannosidase Proteins 0.000 description 4
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 4
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 4
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 4
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 102200132690 rs2001345 Human genes 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 102100021761 Alpha-mannosidase 2 Human genes 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 108010055629 Glucosyltransferases Proteins 0.000 description 3
- 102000000340 Glucosyltransferases Human genes 0.000 description 3
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 3
- 101100274557 Heterodera glycines CLE1 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000916489 Homo sapiens Chondroitin sulfate proteoglycan 4 Proteins 0.000 description 3
- 101001055157 Homo sapiens Interleukin-15 Proteins 0.000 description 3
- 101000829725 Homo sapiens Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 101001056234 Homo sapiens Sperm mitochondrial-associated cysteine-rich protein Proteins 0.000 description 3
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 3
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000004556 Interleukin-15 Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 3
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 3
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 3
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 3
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 3
- 102100026503 Sperm mitochondrial-associated cysteine-rich protein Human genes 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 3
- 102000045442 glycosyltransferase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000056003 human IL15 Human genes 0.000 description 3
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022622 Alpha-1,3-mannosyl-glycoprotein 2-beta-N-acetylglucosaminyltransferase Human genes 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 102100022716 Atypical chemokine receptor 3 Human genes 0.000 description 2
- 102100024775 Beta-1,4-mannosyl-glycoprotein 4-beta-N-acetylglucosaminyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 2
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 2
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 2
- 108010059480 Chondroitin Sulfate Proteoglycans Proteins 0.000 description 2
- 102000005598 Chondroitin Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 102100025012 Dipeptidyl peptidase 4 Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108010019236 Fucosyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 102000006471 Fucosyltransferases Human genes 0.000 description 2
- 102100040578 G antigen 7 Human genes 0.000 description 2
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 description 2
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 2
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 2
- 101000972916 Homo sapiens Alpha-1,3-mannosyl-glycoprotein 2-beta-N-acetylglucosaminyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 101000678890 Homo sapiens Atypical chemokine receptor 3 Proteins 0.000 description 2
- 101000893968 Homo sapiens G antigen 7 Proteins 0.000 description 2
- 101001083151 Homo sapiens Interleukin-10 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000666856 Homo sapiens Vasoactive intestinal polypeptide receptor 1 Proteins 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical class C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 102000010781 Interleukin-6 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical group C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000000440 Melanoma-associated antigen Human genes 0.000 description 2
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Natural products OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000006690 co-activation Effects 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000004041 dendritic cell maturation Effects 0.000 description 2
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 2
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 108010072257 fibroblast activation protein alpha Proteins 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 2
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 2
- AQIXEPGDORPWBJ-UHFFFAOYSA-N pentan-3-ol Chemical compound CCC(O)CC AQIXEPGDORPWBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 2
- 231100000440 toxicity profile Toxicity 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N (4S)-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[(2S)-2-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(1S)-4-carbamimidamido-1-carboxybutyl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2,6-diaminohexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N 0.000 description 1
- WEYNBWVKOYCCQT-UHFFFAOYSA-N 1-(3-chloro-4-methylphenyl)-3-{2-[({5-[(dimethylamino)methyl]-2-furyl}methyl)thio]ethyl}urea Chemical compound O1C(CN(C)C)=CC=C1CSCCNC(=O)NC1=CC=C(C)C(Cl)=C1 WEYNBWVKOYCCQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 3-Methylhistidine Natural products CN1C=NC(CC(N)C(O)=O)=C1 BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 229940117976 5-hydroxylysine Drugs 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 101710137115 Adenylyl cyclase-associated protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100021879 Adenylyl cyclase-associated protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710137132 Adenylyl cyclase-associated protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 1
- 101710098531 Alpha-mannosidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710186585 Alpha-mannosidase 2x Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 102220478542 Apoptosis regulator Bcl-2_E53A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101100504181 Arabidopsis thaliana GCS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100035526 B melanoma antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 108030001771 Beta-1,4-mannosyl-glycoprotein 4-beta-N-acetylglucosaminyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100039510 Cancer/testis antigen 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102100028906 Catenin delta-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000016362 Catenins Human genes 0.000 description 1
- 108010067316 Catenins Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000013701 Cyclin-Dependent Kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000012625 DNA intercalator Substances 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 101100216227 Dictyostelium discoideum anapc3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 102100027581 Forkhead box protein P3 Human genes 0.000 description 1
- 102100039717 G antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100039699 G antigen 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100039698 G antigen 5 Human genes 0.000 description 1
- 101710092267 G antigen 5 Proteins 0.000 description 1
- 102100039713 G antigen 6 Human genes 0.000 description 1
- 101710092269 G antigen 6 Proteins 0.000 description 1
- 102000040452 GAGE family Human genes 0.000 description 1
- 108091072337 GAGE family Proteins 0.000 description 1
- 101710203794 GDP-fucose transporter Proteins 0.000 description 1
- 102100029974 GTPase HRas Human genes 0.000 description 1
- 101710091881 GTPase HRas Proteins 0.000 description 1
- 102100030525 Gap junction alpha-4 protein Human genes 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000007390 Glycogen Phosphorylase Human genes 0.000 description 1
- 108010046163 Glycogen Phosphorylase Proteins 0.000 description 1
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 102100024025 Heparanase Human genes 0.000 description 1
- 108010073141 Hepatitis C virus glycoprotein E2 Proteins 0.000 description 1
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 1
- 101000690301 Homo sapiens Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 1
- 101000874316 Homo sapiens B melanoma antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000889345 Homo sapiens Cancer/testis antigen 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 1
- 101000861452 Homo sapiens Forkhead box protein P3 Proteins 0.000 description 1
- 101000886137 Homo sapiens G antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000886678 Homo sapiens G antigen 2D Proteins 0.000 description 1
- 101000886136 Homo sapiens G antigen 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 1
- 101000878602 Homo sapiens Immunoglobulin alpha Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 1
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001036406 Homo sapiens Melanoma-associated antigen C1 Proteins 0.000 description 1
- 101001057156 Homo sapiens Melanoma-associated antigen C2 Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001114057 Homo sapiens P antigen family member 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001116548 Homo sapiens Protein CBFA2T1 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001062222 Homo sapiens Receptor-binding cancer antigen expressed on SiSo cells Proteins 0.000 description 1
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100038005 Immunoglobulin alpha Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 238000012695 Interfacial polymerization Methods 0.000 description 1
- 108010078049 Interferon alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 101710146672 Interleukin-10 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 102100030236 Interleukin-10 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000004560 Interleukin-12 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017515 Interleukin-12 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 1
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 239000004907 Macro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 1
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 1
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100039447 Melanoma-associated antigen C1 Human genes 0.000 description 1
- 102100027252 Melanoma-associated antigen C2 Human genes 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 108010050619 Monokines Proteins 0.000 description 1
- 102000013967 Monokines Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N N(pros)-methyl-L-histidine Chemical compound CN1C=NC=C1C[C@H](N)C(O)=O JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000005650 Notch Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010070047 Notch Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 description 1
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100023219 P antigen family member 1 Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100034640 PWWP domain-containing DNA repair factor 3A Human genes 0.000 description 1
- 108050007154 PWWP domain-containing DNA repair factor 3A Proteins 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102100040283 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B Human genes 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006994 Precancerous Conditions Diseases 0.000 description 1
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 101710100968 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100029165 Receptor-binding cancer antigen expressed on SiSo cells Human genes 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 102000001712 STAT5 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010029477 STAT5 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101710143177 Synaptonemal complex protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036234 Synaptonemal complex protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000019361 Syndecan Human genes 0.000 description 1
- 108050006774 Syndecan Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 102100033082 TNF receptor-associated factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 description 1
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 244000000188 Vaccinium ovalifolium Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M benzethonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(C(C)(C)CC(C)(C)C)=CC=C1OCCOCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960001950 benzethonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010087667 beta-1,4-mannosyl-glycoprotein beta-1,4-N-acetylglucosaminyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- HUTDDBSSHVOYJR-UHFFFAOYSA-H bis[(2-oxo-1,3,2$l^{5},4$l^{2}-dioxaphosphaplumbetan-2-yl)oxy]lead Chemical compound [Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O HUTDDBSSHVOYJR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N butyl alcohol Substances CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004640 cellular pathway Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000005354 coacervation Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 108010015408 connexin 37 Proteins 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N cyclandelate Chemical class C1C(C)(C)CC(C)CC1OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N cyclohexanol Chemical compound OC1CCCCC1 HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010048032 cyclophilin B Proteins 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 108010031971 delta catenin Proteins 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003534 dna topoisomerase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 210000003372 endocrine gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 1
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 1
- 108010006620 fodrin Proteins 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 108010037536 heparanase Proteins 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N homoserine Chemical compound OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 102000054751 human RUNX1T1 Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 235000011167 hydrochloric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 108040006870 interleukin-10 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 150000008146 mannosides Chemical class 0.000 description 1
- 108010009689 mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha-mannosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Chemical class 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000001167 myeloblast Anatomy 0.000 description 1
- PUPNJSIFIXXJCH-UHFFFAOYSA-N n-(4-hydroxyphenyl)-2-(1,1,3-trioxo-1,2-benzothiazol-2-yl)acetamide Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1NC(=O)CN1S(=O)(=O)C2=CC=CC=C2C1=O PUPNJSIFIXXJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- DIOQZVSQGTUSAI-UHFFFAOYSA-N n-butylhexane Natural products CCCCCCCCCC DIOQZVSQGTUSAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000025020 negative regulation of T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000019079 negative regulation of cytokine secretion Effects 0.000 description 1
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000012053 oil suspension Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N p-hydroxybenzoic acid methyl ester Natural products COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000849 parathyroid Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000004197 pelvis Anatomy 0.000 description 1
- 108010044156 peptidyl-prolyl cis-trans isomerase b Proteins 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 208000015768 polyposis Diseases 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003586 protic polar solvent Substances 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 238000007420 radioactive assay Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000015347 renal cell adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- SFVFIFLLYFPGHH-UHFFFAOYSA-M stearalkonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 SFVFIFLLYFPGHH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 239000004308 thiabendazole Substances 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 229940044693 topoisomerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2013—IL-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
- A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
- A61K47/6853—Carcino-embryonic antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5428—IL-10
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5434—IL-12
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
- C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
- C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/524—CH2 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Mycology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Un inmunoconjugado que comprende (i) una molécula de inmunoglobulina que comprende una primera y una segunda molécula de Fab de unión a antígeno y un dominio Fc que consta de dos subunidades, y (ii) un resto efector, en el que no está presente más de un resto efector; y en el que dicha primera y dicha segunda molécula de Fab se dirigen al ACE y comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 191, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 189; y dicho resto efector es un polipéptido de interleucina-2 (IL-2) humana mutante que comprende las sustituciones de aminoácidos T3A, F42A, Y45A, L72G (numeración con relación a la secuencia de la IL-2 humana en la SEQ ID NO: 2); y dicho dominio Fc comprende las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G (numeración de la UE) en cada una de sus subunidades.
Description
DESCRIPCIÓN
Inmunoconjugados novedosos
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a inmunoconjugados específicos de antígeno para administrar selectivamente restos efectores que influyen en la actividad celular. Además, la presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican dichos inmunoconjugados, y a células anfitrionas que contienen dichos polinucleótidos. La invención se refiere además a procedimientos para producir los inmunoconjugados de la invención, y a estos inmunoconjugados para su uso en el tratamiento de enfermedades.
Antecedentes
La destrucción selectiva de una célula individual o de un tipo específico de células es deseable a menudo en diversos entornos clínicos. Por ejemplo, un objetivo principal del tratamiento del cáncer es destruir específicamente las células tumorales, dejando las células y tejidos sanos intactos y sin daños. Numerosas vías de transducción de señales de la célula están vinculadas a la supervivencia y/o la muerte celular. Por consiguiente, el suministro directo de un factor de vía involucrado en la supervivencia o muerte celular puede usarse para contribuir al mantenimiento o destrucción de la célula. De forma similar, se pueden administrar factores específicos que estimulan las células efectoras inmunitarias en un microambiente tumoral, como los linfocitos citolíticos naturales (NK) o los linfocitos T citotóxicos (LTC), para atacar y destruir las células tumorales.
Las citocinas son moléculas de señalización celular que participan en la regulación del sistema inmunitario. Cuando se utilizan en el tratamiento del cáncer, las citocinas pueden actuar como inmunomoduladores que tienen efectos antitumorales y que pueden aumentar la inmunogenicidad de algunos tipos de tumores. Sin embargo, el aclaramiento rápido de la sangre y la falta de especificidad tumoral requieren la administración sistémica de altas dosis de la citocina a fin de lograr una concentración de la citocina en el sitio del tumor suficiente para activar una respuesta inmunitaria o tener un efecto antitumoral. Estos altos niveles de citocina sistémica pueden ocasionar una toxicidad intensa y reacciones adversas.
Para su uso terapéutico, por lo tanto, es deseable administrar específicamente un factor de las vías de transducción de señales, como una citocina, a un sitio específico in vivo (p. ej., un tumor o un microentorno tumoral en el caso del tratamiento del cáncer). Esto se puede lograr conjugando el factor con un resto dirigido, p. ej. un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, específico para el sitio. Las primeras estrategias dirigidas a administrar factores de las vías de transducción de señales, como las citocinas, a un sitio específico in vivo incluían cadenas pesadas de inmunoglobulina conjugadas a diversas citocinas, incluida la linfotoxina, el factor de necrosis tumoral-a (FNT-a), la interleucina-2 (IL-2) y el factor estimulante de las colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF; revisado, p. ej., en Lode et al., Pharmacol Ther 80, 277-292 [1998]).
Los investigadores observaron que no solo podían dirigir citocinas a sitios específicos in vivo, sino que también podían aprovechar el hecho de que los anticuerpos monoclonales tienen una semivida sérica más larga que la mayoría de las demás proteínas. Dada la toxicidad sistémica asociada con altas dosis de ciertas citocinas no conjugadas, p. ej. la IL-2, la capacidad de una proteína de fusión inmunoglobulina-citocina para maximizar las actividades biológicas terapéuticamente beneficiosas en un sitio deseado, p. ej. en un tumor, mientras minimiza los efectos secundarios sistémicos a una dosis más baja, condujo a los investigadores a creer que los inmunoconjugados de inmunoglobulina-citocina eran agentes terapéuticos óptimos.
Sin embargo, existen ciertas desventajas asociadas con los inmunoconjugados de inmunoglobulina-citocina conocidos en la técnica. Por ejemplo, estos inmunoconjugados tienen al menos una citocina acoplada a cada una de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina, lo que da lugar a un inmunoconjugado con unión a diana bivalente y dos o más restos de citocina (revisado, p. ej., en Chang et al., Expert Opin Drug Discovery 4, 181-194 [2009], o en Ortiz-Sánchez et al., Expert Opin Biol Ther 8, 609-632 [2008]). La figura 1 representa un inmunoconjugado de inmunoglobulina-citocina convencional tal como se conoce en la técnica, donde una citocina se fusiona con el extremo C de cada una de las dos cadenas pesadas de anticuerpo. Debido a la presencia de dos o más restos de citocinas, dicho inmunoconjugado tiene una gran avidez por el respectivo receptor de citocinas (por ejemplo, afinidad picomolar en el caso de la IL-2), y por lo tanto está dirigido más bien a las células efectoras inmunitarias que expresan el receptor de citocinas que al antígeno destinatario de la inmunoglobulina (afinidad nM) al que está ligada la citocina. Además, se sabe que los inmunoconjugados convencionales se asocian a reacciones a la infusión (véase, p. ej., King et al., J Clin Oncol 22, 4463-4473 [2004]), resultantes al menos parcialmente de la activación de los receptores de citocinas en células efectoras inmunitarias de la sangre periférica por los restos de citocinas del inmunoconjugado.
Además, a través de su dominio Fc, los inmunoconjugados de inmunoglobulina-citocina pueden activar el complemento e interactuar con los receptores Fc. Esta característica inherente de las inmunoglobulinas se ha considerado de forma desfavorable porque los inmunoconjugados terapéuticos pueden dirigirse a células que expresan receptores Fc en lugar de hacerlo a las células preferentes portadoras de antígenos. Además, la activación
simultánea de los receptores de citocinas y de las vías de señalización de los receptores Fc que ocasionan la liberación de citocinas, especialmente en combinación con la larga semivida de las proteínas de fusión de inmunoglobulinas, dificulta su aplicación en un entorno terapéutico debido a la toxicidad sistémica.
Un abordaje para superar este problema es el uso de fragmentos de inmunoglobulina desprovistos del dominio Fc, como los fragmentos scFv o Fab, en los inmunoconjugados. Entre los ejemplos de inmunoconjugados de fragmentos de inmunoglobulina y citocinas figuran el inmunoconjugado scFv-IL-2, como se expone en la publicación de PCT WO 2001/062298, el inmunoconjugado scFv-IL-12-scFv, como se establece en la publicación de PCT WO 2006/119897 (en el que cada uno de los dos fragmentos scFv está conectado a una subunidad del heterodímero IL-12, que se mantiene unido por uno o más enlaces disulfuro) o los inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab, como se establece en la publicación de PCT WO 2011/020783. Tanto la reactividad de unión a tumores de la molécula original de inmunoglobulina como la actividad funcional de la citocina se mantienen en la mayoría de estos tipos de inmunoconjugados; sin embargo, la semivida de dichas construcciones es considerablemente más corta que la de las proteínas de fusión de inmunoglobulinas.
Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de inmunoconjugados con propiedades mejoradas, para obtener mayor eficacia terapéutica y una reducción del número y la gravedad de los efectos secundarios de estos productos (p. ej., toxicidad, destrucción de células no tumorales, etc.).
La presente divulgación proporciona inmunoconjugados similares a inmunoglobulinas que presentan una eficacia mejorada, alta especificidad de acción, toxicidad reducida y una semivida y una estabilidad mejoradas en sangre con respecto a los inmunoconjugados conocidos.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a los siguientes inmunoconjugados, polinucleótidos, células anfitrionas, procedimientos de producción de inmunoconjugados y composiciones farmacéuticas:
[1] Un inmunoconjugado que comprende (i) una molécula de inmunoglobulina que comprende una primera y una segunda molécula de Fab de unión a antígeno y un dominio Fc que consta de dos subunidades, y (ii) un resto efector, en el que no está presente más de un resto efector; y en el que
dicha primera y dicha segunda molécula de Fab se dirigen al ACE y comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 191, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 189; y
dicho resto efector es un polipéptido de interleucina-2 (IL-2) humana mutante que comprende las sustituciones de aminoácidos T3A, F42A, Y45A, L72G (numeración con relación a la secuencia de la IL-2 humana en la SEQ ID NO: 2); y
dicho dominio Fc comprende las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G (numeración de la UE) en cada una de sus subunidades.
[2] El inmunoconjugado de [1], en el que dicho dominio Fc es un dominio Fc de IgG, en particular un dominio Fc de IgG1 humana.
[3] El inmunoconjugado de [1] o [2], en el que dicho dominio Fc comprende una modificación que promueve la heterodimerización de dos cadenas polipeptídicas no idénticas.
[4] El inmunoconjugado de [3], en el que dicha modificación es una modificación de botón en ojal, que comprende una modificación de botón en una de las dos subunidades del dominio Fc y una modificación de ojal en la otra de las dos subunidades del dominio Fc, en el que dicha modificación de botón comprende la sustitución de aminoácido T366W, y dicha modificación de ojal comprende las sustituciones de aminoácidos T366S, L368A e Y407V (numeración de la UE).
[5] El inmunoconjugado de uno cualquiera de [1] a [4], en el que dicho dominio Fc comprende una o más mutaciones aminoacídicas que reducen la unión del dominio Fc a un receptor Fc, en particular un receptor Fcy.
[6] El inmunoconjugado de [5], en el que dicha mutación de aminoácido es una sustitución de aminoácido en la posición P329 (numeración de la UE).
[7] El inmunoconjugado de uno cualquiera de [1] a [6], en el que dicha molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la clase IgG.
[8] El inmunoconjugado de uno cualquiera de [1] a [7], en el que dicho resto efector se fusiona con el aminoácido carboxiterminal de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, opcionalmente a través de un péptido conector.
[9] El inmunoconjugado de uno cualquiera de [1] a [8], en el que dicho polipéptido de interleucina-2 (IL-2) humana muíante comprende además la sustitución de aminoácido C125A.
[10] El inmunoconjugado de uno cualquiera de [1] a [9], en el que dicho polipéptido de interleucina-2 (IL-2) humana mutante comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 3.
[11] El inmunoconjugado de uno cualquiera de [1] a [10], que comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281 y SEQ ID NO: 283.
[12] Un polinucleótido aislado que codifica el inmunoconjugado de uno cualquiera de [1] a [11].
[13] Una célula anfitriona que comprende el polinucleótido aislado de [12].
[14] Un procedimiento para producir un inmunoconjugado, que comprende cultivar la célula anfitriona de [13] en condiciones adecuadas para la expresión del inmunoconjugado y opcionalmente recuperar el inmunoconjugado.
[15] Un inmunoconjugado que comprende (i) una molécula de inmunoglobulina que comprende una primera y una segunda molécula de Fab de unión a antígeno y un dominio Fc que consta de dos subunidades, y (ii) un resto efector, en el que no está presente más de un resto efector, en el que se produce dicho inmunoconjugado por el procedimiento de [14].
[16] Una composición farmacéutica que comprende el inmunoconjugado de uno cualquiera de [1] a [11] o [15] y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
[17] El inmunoconjugado de uno cualquiera de [1] a [11] o [15], o la composición farmacéutica de [16], para su uso en el tratamiento de una enfermedad en una persona que necesita del mismo.
[18] El inmunoconjugado o la composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad de [17], en el que dicha enfermedad es el cáncer.
La presente invención se basa, en parte, en el reconocimiento por parte de los inventores de que los inmunoconjugados que comprenden más de un resto efector, tal como, p. ej., una citocina, pueden dirigirse al respectivo receptor del resto efector en lugar de hacerlo al antígeno destinatario del resto de unión a antígeno del inmunoconjugado. Por lo tanto, en un aspecto, la divulgación proporciona un inmunoconjugado que comprende un primer resto de unión a antígeno, un dominio Fc que consta de dos subunidades y un resto efector, en el que no está presente más de un resto efector. En un modo de realización, el resto efector se fusiona con el aminoácido aminoterminal o carboxiterminal de una de las dos subunidades del dominio Fc, opcionalmente a través de un péptido conector. En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno se fusiona con el aminoácido aminoterminal de una de las dos subunidades del dominio Fc, opcionalmente a través de un péptido conector o de una región bisagra de inmunoglobulina.
En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo. En un modo de realización determinado, el primer resto de unión a antígeno es una molécula de Fab. En ciertos modos de realización, el dominio Fc comprende una modificación que promueve la heterodimerización de dos cadenas polipeptídicas no idénticas. En un modo de realización específico, dicha modificación es una modificación de botón en ojal, que comprende una modificación de botón en una de las subunidades del dominio Fc y una modificación de ojal en la otra de las dos subunidades del dominio Fc. En un modo de realización determinado, el resto efector se fusiona con el aminoácido aminoterminal o carboxiterminal de la subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de botón.
En un modo de realización, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG, en particular un dominio Fc de IgG1. En un modo de realización determinado, el dominio Fc es humano.
En ciertos modos de realización de la divulgación, el dominio Fc se genomanipula para tener una unión alterada a un receptor Fc, específicamente una unión alterada a un receptor Fcy, y/o una función efectora alterada, específicamente una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) alterada.
Aunque la presencia de un dominio Fc es esencial para prolongar la semivida del inmunoconjugado, los inventores se dan cuenta de que en algunas situaciones será beneficioso eliminar las funciones efectoras asociadas con la interacción de los receptores Fc con el dominio Fc. Por lo tanto, en determinados modos de realización, la alteración de la unión a un receptor Fc y/o de la función efectora es una reducción de la unión y/o de la función efectora. En un modo de realización específico de este tipo, el dominio Fc comprende una o más mutaciones aminoacídicas que reducen la unión del dominio Fc a un receptor Fc, en particular a un receptor Fcy. Preferiblemente, dicha mutación aminoacídica no reduce la unión a los receptores FcRn. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una
sustitución de aminoácido en la posición P329. En modos de realización más determinados, el dominio Fc comprende las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G en cada una de sus subunidades.
Por otro lado, puede haber situaciones en las que sea deseable mejorar las funciones efectoras de los inmunoconjugados. Por lo tanto, en ciertos modos de realización, el dominio Fc del inmunoconjugado descrito en el presente documento se genomanipula para tener una unión alterada a un receptor Fc, específicamente a un receptor Fcy, más específicamente a un receptor FcYlIIa, y/o una función efectora alterada, en la que la alteración de la unión y/o de la función efectora es un aumento de la unión y/o de la función efectora. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc se genomanipula para tener una estructura de oligosacáridos alterada en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En un modo de realización determinado de este tipo, el dominio Fc comprende una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En un modo de realización más específico, el dominio Fc comprende al menos 20 %, en particular al menos 50 %, más en particular al menos 70 % de oligosacáridos no fucosilados. En otro modo de realización específico, el dominio Fc comprende una proporción incrementada de oligosacáridos bisecados en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En otro modo de realización específico más, el dominio Fc comprende una proporción incrementada de oligosacáridos bisecados no fucosilados en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En algunos modos de realización, dicha estructura de oligosacáridos alterada se debe al aumento de la actividad de la p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII) en una célula anfitriona utilizada para la expresión del inmunoconjugado.
En un aspecto determinado, la divulgación proporciona inmunoconjugados que comprenden un primer y un segundo resto de unión a antígeno, un dominio Fc que consta de dos subunidades y un resto efector, en el que no está presente más de un resto efector. En un modo de realización, el primer y el segundo resto de unión a antígeno y el dominio Fc forman parte de una molécula de inmunoglobulina. En ciertos modos de realización, el inmunoconjugado consiste esencialmente en una molécula de inmunoglobulina y un resto efector y opcionalmente una o más secuencias conectoras. En un modo de realización determinado, la molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la clase IgG. En un modo de realización aún más determinado, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG1 . En un modo de realización, el resto efector se fusiona con el aminoácido carboxiterminal de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, opcionalmente a través de un péptido conector.
En un modo de realización determinado, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una molécula de inmunoglobulina que comprende dos restos de unión a antígeno y un dominio Fc, y un resto efector fusionado al aminoácido carboxiterminal de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, en el que no hay más de un resto efector presente y en el que el dominio Fc se genomanipula para tener una unión reducida a un receptor Fc, específicamente una unión alterada a un receptor Fcy y/o una función efectora reducida.
En ciertos modos de realización, dicho primer resto de unión a antígeno, o dicho primer y dicho segundo resto de unión a antígeno, se dirigen a un antígeno asociado con un proceso patológico, tal como un antígeno presentado en una célula tumoral o en un entorno de células tumorales, en un sitio de inflamación, o en una célula infectada por virus. En un modo de realización más específico, dicho antígeno se selecciona del grupo de proteína de activación de fibroblastos (FAP), el dominio A1 de la tenascina C (TNC A1), el dominio A2 de la tenascina C (TNC A2), el dominio adicional B de la fibronectina (EDB), antígeno carcinoembrionario (ACE) y proteoglucano de sulfato de condroitina asociado al melanoma (MCSP).
En ciertos modos de realización, el resto efector es un resto efector monocatenario. En un modo de realización determinado, el resto efector es una citocina. En un modo de realización, dicha citocina se selecciona del grupo de la IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IFN-a e IFN-y. En un modo de realización determinado, dicha citocina es IL-2. En un modo de realización aún más determinado, dicha citocina es un polipéptido de la IL-2 mutante que tiene una afinidad de unión reducida a la subunidad a del receptor de la IL-2. En un modo de realización específico, dicho polipéptido de la IL-2 mutante comprende una sustitución de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas de entre las posiciones correspondientes a los residuos 42, 45 y 72 de la IL-2 humana. En otro modo de realización determinado, la citocina es IL-10. En otro modo de realización más, la citocina es IL-15, en particular un polipéptido de la IL-15 mutante que tiene una afinidad de unión reducida a la subunidad a del receptor de la IL-15. En otro modo de realización, la citocina es IFN-a.
Según otro aspecto de la divulgación, se proporciona un polinucleótido aislado que codifica un inmunoconjugado como se describe en el presente documento o un fragmento del mismo. La divulgación proporciona además un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado descrito en el presente documento, y una célula anfitriona que comprende el polinucleótido aislado o el vector de expresión descrito en el presente documento. En algunos modos de realización, la célula anfitriona es una célula eucariota, en particular una célula de mamífero. En algunos modos de realización, las células anfitrionas se han manipulado para expresar mayores niveles de uno o más polipéptidos que tienen actividad p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII). En un modo de realización de este tipo, las células anfitrionas se han manipulado adicionalmente para expresar mayores niveles de uno o más polipéptidos que tienen actividad a-manosidasa II (ManII).
En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para producir los inmunoconjugados descritos en el presente documento, que comprende las etapas de a) cultivar la célula anfitriona de la invención en condiciones adecuadas para la expresión del inmunoconjugado y b) recuperar el inmunoconjugado. La divulgación también engloba un inmunoconjugado producido por el procedimiento descrito en el presente documento.
La divulgación proporciona además una composición farmacéutica que comprende un inmunoconjugado como se describe en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La divulgación también engloba procedimientos para usar los inmunoconjugados y las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. En un aspecto, la divulgación proporciona un inmunoconjugado o una composición farmacéutica como se describe en el presente documento para uso como medicamento. En un aspecto se proporciona un inmunoconjugado o una composición farmacéutica como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesita. En un modo de realización específico, la enfermedad es cáncer. En otros modos de realización, la enfermedad es un trastorno inflamatorio. En un modo de realización determinado de este tipo, el inmunoconjugado comprende un resto efector de la IL-10.
También se proporciona el uso de un inmunoconjugado como se describe en el presente documento para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesite; así como un procedimiento para tratar una enfermedad en un individuo, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende el inmunoconjugado descrito en el presente documento en una forma farmacéuticamente aceptable. En un modo de realización específico, la enfermedad es cáncer. En otros modos de realización, la enfermedad es un trastorno inflamatorio. En un modo de realización determinado de este tipo, el inmunoconjugado comprende un resto efector de la IL-10.
En cualquiera de los modos de realización anteriores, el individuo es preferiblemente un mamífero, en particular un ser humano.
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un conjugado que comprende una primera molécula de Fab que no se une específicamente a ningún antígeno, un dominio Fc que consta de dos subunidades y un resto efector, en el que no está presente más de un resto efector. En un modo de realización determinado, la primera molécula de Fab comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 299 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 297. En un modo de realización, el conjugado comprende (i) una molécula de inmunoglobulina, que comprende una primera y una segunda molécula de Fab que no se unen específicamente a ningún antígeno y un dominio Fc, y (ii) un resto efector, en el que no está presente más de un resto efector. En un modo de realización, la molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la clase IgG, en particular una inmunoglobulina de la subclase IgG1. En un modo de realización determinado, la molécula de inmunoglobulina comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 299 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 297. Específicamente, la secuencia de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 299 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 297 están comprendidas en la primera y la segunda molécula de Fab de la molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización, el resto efector se fusiona con el aminoácido carboxiterminal de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, opcionalmente a través de un péptido conector. En algunos modos de realización, el dominio Fc del conjugado se genomanipula para tener una unión reducida a un receptor Fc, una unión específicamente reducida a un receptor Fcy, y/o una función efectora reducida, específicamente CCDA reducida. En un modo de realización determinado, el dominio Fc del conjugado comprende las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G en cada una de sus subunidades. En ciertos modos de realización, el dominio Fc del conjugado comprende una modificación que promueve la heterodimerización de las cadenas polipeptídicas no idénticas. En un modo de realización específico, dicha modificación es una modificación de botón en ojal, que comprende una modificación de botón en una de las subunidades del dominio Fc y una modificación de ojal en la otra de las dos subunidades del dominio Fc. En un modo de realización determinado, el resto efector se fusiona con el aminoácido aminoterminal o carboxiterminal de la subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de botón. En un modo de realización, el resto efector es una citocina, en particular IL-2. Además, el conjugado puede incorporar, solo o en combinación, cualquiera de las características descritas en el presente documento en relación con los formatos, el dominio Fc o el resto efector de los inmunoconjugados de la invención.
La divulgación también proporciona un polinucleótido aislado que codifica el conjugado de la invención o un fragmento del mismo. En un modo de realización específico, el polinucleótido aislado comprende una secuencia que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 298 o de la SEQ ID NO: 300. La divulgación proporciona además un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado, y una célula anfitriona que comprende el polinucleótido aislado o el vector de expresión de la invención. En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para producir el conjugado de la divulgación, que comprende las etapas de a) cultivar la célula anfitriona de la invención en condiciones adecuadas para la expresión del conjugado y b) recuperar el conjugado. La divulgación también engloba un conjugado producido por el procedimiento de la divulgación.
La divulgación proporciona además una composición farmacéutica que comprende el conjugado como se describe en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, el conjugado se puede emplear en los procedimientos de uso descritos en el presente documento para los inmunoconjugados descritos en el presente documento.
Breve descripción de los dibujos
FIGURA 1. Representación esquemática del inmunoconjugado típico de inmunoglobulina-citocina como se conoce en la técnica, con una citocina (punteada) fusionada al extremo C de cada una de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina.
FIGURA 2. Representación esquemática de nuevos inmunoconjugados descritos en el presente documento, que comprenden no más de un resto efector (punteado). El resto efector se fusiona, opcionalmente a través de un péptido conector (recuadros grises) al aminoácido carboxiterminal (formato A y B) o al aminoterminal (formato C) del dominio Fc. El inmunoconjugado comprende uno (formato B y C) o más (típicamente dos, formato A) restos de unión a antígeno, que pueden ser fragmentos Fab que comprenden dominios variables de la cadena pesada y ligera de anticuerpo (rayados). El dominio Fc puede comprender una modificación que promueve la heterodimerización de dos cadenas polipeptídicas no idénticas (punto negro) y/o una modificación que altera la unión al receptor Fc y/o la función efectora (estrella negra).
FIGURA 3. Purificación del inmunoconjugado dirigido a FAP IgG basada en 4G8-IL-2 mutante cuádruple (qm). A) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de afinidad de la proteína A. B) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño. C) SDS-PAGE analítica (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen, amortiguador de migración MOPS) del producto final. D) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño del producto final en una columna Superdex 200 (contenido en monómero de un 97 %).
FIGURA 4. Purificación del inmunoconjugado dirigido a FAP IgG basada en 28H1-IL-2 qm. A) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de afinidad de la proteína A. B) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño. C) SDS-PAGE analítica (reducida: NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen, amortiguador de migración MOPS; no reducida: NuPAGE Tris-Acetate, Invitrogen, amortiguador de migración TRIS-acetato) del producto final. D) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño del producto final en una columna Superdex 200 (contenido en monómero de un 100 %).
FIGURA 5. Purificación del inmunoconjugado dirigido a FAP IgG basada en 28H1-IL-2 qm. A) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de afinidad de la proteína A. B) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño. C) SDS-PAGE analítica (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen, amortiguador de migración MOPS) del producto final. D) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño del producto final en una columna Superdex 200 (contenido en monómero de un 100 %).
FIGURA 6. Purificación del inmunoconjugado dirigido a FAP IgG basada en 4B9-IL-2 qm. A) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de afinidad de la proteína A. B) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño. C) SDS-PAGE analítica (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen, amortiguador de migración MOPS) del producto final. D) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño del producto final en una columna Superdex 200 (contenido en monómero de un 100 %).
FIGURA 7. Purificación del inmunoconjugado dirigido a ACE IgG basada en CH1A1A 98/992F1-IL-2 qm. A) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de afinidad de la proteína A. B) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño. C) Electroforesis capilar analítica SDS (Caliper) del producto final. D) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño del producto final en una columna TSKgel G3000 SW XL (contenido en monómero de un 98,8 %).
FIGURA 8. Purificación del inmunoconjugado dirigido a TNC A2 IgG basada en 2B10-IL-2 qm. A) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de afinidad de la proteína A. B) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño. C) Electroforesis capilar analítica SDS (Caliper) del producto final. D) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño del producto final en una columna TSKgel G3000 SW XL (contenido en monómero de un 100 %).
FIGURA 9. Purificación del inmunoconjugado no dirigido IgG basada en DP47GS-IL-2 qm. A) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de afinidad de la proteína A. B) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño. C) SDS-PAGE analítica (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen, amortiguador de migración MOPS) del producto final. D) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño del producto final en una columna Superdex 200 (contenido en monómero de un 100 %).
FIGURA 10. Unión del inmunoconjugado dirigido a FAP IgG basada en 4G8-IL-2 qm a la FAP humana expresada en células REH 293 transfectadas de forma estable como se mide por FACS, en comparación con la correspondiente construcción Fab-IL-2 qm-Fab.
FIGURA 11. Liberación de interferón (IFN)-y en linfocitos NK92 inducida por el inmunoconjugado dirigido a FAP IgG basada en 4G8-IL-2 qm en solución, en comparación con la construcción Fab basado en 28H1-IL-2 qm-Fab.
FIGURA 12. Detección de STAT5 fosforilado por FACS en diferentes tipos celulares después de su estimulación durante 20 min con el inmunoconjugado dirigido a FAP IgG basada en 4G8-IL-2 qm en solución, en comparación con las construcciones Fab basado en 28H1-IL-2-Fab y Fab-IL-2 qm-Fab, así como proleucina. A) Linfocitos NK (CD3'CD56+); B) linfocitos T CD8+ (CD3+CD8+); C) linfocitos T CD4+ (CD3+CD4+CD25'CD127+); D) linfocitos T reguladores (CD4+CD25+FOXP3+).
FIGURA 13. Unión de IgG 2B10 dirigida a TNC A2-IL-2 qm y la correspondiente IgG no conjugada a células U87MG que expresan TNC A2, según se mide por FACS.
FIGURA 14. Inducción de la proliferación de linfocitos NK92 por los inmunoconjugados IgG 2B10-IL-2 qm dirigido a TNC A2, IgG CH1A1A 98/992F1-IL-2 qm e IgG CH1A1A 98/992F1-IL-2 wt dirigidos a ACE.
FIGURA 15. Inducción de la proliferación de linfocitos NK92 por los inmunoconjugados dirigidos a FAP IgG 4B9-IL-2 qm e IgG 4B9-IL-2 wt.
FIGURA 16. Citólisis (medida por la liberación de LDH) de células tumorales A549 que sobreexpresan ACE por CMSP a través de CCDA mediada por los inmunoconjugados IgG CH1A1A-IL-2 qm glucomanipulada (ge) y natural (wt), en comparación con IgG CH1A1A glucomanipulada sin conjugar.
FIGURA 17. Purificación del inmunoconjugado no dirigido IgG DP47GS-IL-2 wt. A) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de afinidad de la proteína A. B) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño. C) SDS-PAGE analítica (NuPAGe Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen, amortiguador de migración MOPS) del producto final. D) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño del producto final en una columna Superdex 200 (contenido en monómero de un 99,6 %).
FIGURA 18. Purificación del inmunoconjugado dirigido a FAP IgG basada en 28H1-IL-2 wt 28H1. A) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de afinidad de la proteína A. B) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño. C) SDS-PAGE analítica (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen, amortiguador de migración MOPS) del producto final. D) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño del producto final en una columna Superdex 200 (contenido en monómero de un 99,6 %).
FIGURA 19. Purificación del inmunoconjugado dirigido a ACE IgG basada en CH1A1A 98/992F1-IL-2 wt. A) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de afinidad de la proteína A. B) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño. C) Electroforesis capilar analítica SDS (Caliper) del producto final. D) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño del producto final en una columna TSKgel G3000 sW XL (contenido en monómero de un 100 %).
FIGURA 20. Purificación del inmunoconjugado dirigido a FAP IgG basada en 4B9-IL-2 wt. A) Perfil de elución de la cromatografía de exclusión por tamaño y afinidad de la proteína A combinada. B) Ampliación del perfil de elución de la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño en A. C) SDS-PAGE analítica (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen, amortiguador de migración MOPS) del producto final. D) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño del producto final en una columna TSKgel G3000 Sw XL (contenido en monómero de un 98,5 %).
FIGURA 21. A) SDS-PAGE analítica (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen), amortiguador de muestra NuPAGE LDS (4x), calentado durante 10 min a 70 ° C, amortiguador MOPS, 160 V, 60 min, marcador MW Mark 12, estándar sin teñir (Invitrogen, M) de la IgG 2B10-IL-10M1 reducida (1) y no reducida (2). B) Determinación de afinidad basada en SPR (ProteOn XPR36) de la IgG 2B10-IL-10M1 a TNC a 2 humana ajustada globalmente a un modelo de interacción 1:1.
(chip: NLC; ligando: TNCA2 (250 UR); analito: IgG 2B10-IL-10M1 TNCA2164 kDa; rango de concentración del analito: 50, 10, 2, 0,4, 0,08, 0 nM; tiempo de asociación: 180 s; tiempo de disociación: 600 s; caudal: 50 pl/min; kas 1,80 x 106 1/Ms; kdis: 9,35 x 10'51/s; Kd: 52 pM). C) Determinación de afinidad basada en SPR (ProteOn XPR36) de la IgG 2B10-IL-10M1 a IL-10R1 humana ajustada globalmente a un modelo de interacción 1:1 (chip: NLC; ligando: IL-10R1 [1600 UR]; analito: IgG 2B10-IL-10M1 TNCA2 164 kDa; rango de concentración del analito: 50, 10, 2, 0,4, 0,08, 0 nM; tiempo de asociación: 180 s; tiempo de disociación: 600 s; caudal: 50 pl/min; kas 5,56 x 1051/Ms; kdis: 2,89 x 10'41/s; Kd: 520 pM).
FIGURA 22. A) SDS-PAGE analítica (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen), amortiguador de muestra NuPAGE LDS (4x), calentado durante 10 min a 70 ° C, amortiguador MOPS, 160 V, 60 min, marcador MW Mark 12, estándar sin teñir (Invitrogen, M) de la IgG 4G8-IL-10M1 reducida (1) y no reducida (2). B) Determinación de afinidad basada en SPR (ProteOn XPR36) de la IgG 4G8-IL-10M1 a FAP humana ajustada globalmente a un modelo de interacción 1:1 (chip: GLM; ligando: huFAP [500 UR]; analito: IgG 4G8-IL-10M1 FAP 164 kDa; rango de concentración del analito: 10, 2, 0,4, 0,08, 0 nM; tiempo de asociación: 180 s; tiempo de disociación: 600 s; caudal: 50 pl/min; kas 6,68 x 1051/Ms; kdis: 1,75 x 10'51/s; Kd: 26 pM). C) Determinación de afinidad basada en SPR (ProteOn XPR36) de la IgG
4G8-IL-10M1 a IL-10R1 humana ajustada globalmente a un modelo de interacción 1:1 (chip: NLC; ligando: IL 10R1 [1600 UR]; analito: IgG 4G8-IL-10M1 FAP 164 kDa; rango de concentración del analito: 50, 10, 2, 0,4, 0,08, 0 nM; tiempo de asociación: 180 s; tiempo de disociación: 600 s; caudal: 50 pl/min; kas: 3,64 x 1051/Ms; kdis: 2,96 x 10-41/s; Kd: 815 pM).
FIGURA 23. Purificación del inmunoconjugado dirigido a FAP IgG basada en 4B9-IL-2 qm "1 1". A) Perfil de elución de la cromatografía de exclusión por tamaño y afinidad de la proteína A combinada. B) SDS-PAGE analítica (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen, amortiguador de migración MOPS) del producto final. C) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño del producto final en una columna TSKgel G3000 SW XL (contenido en monómero de un 99,2 %).
FIGURA 24. Purificación del inmunoconjugado dirigido a FAP IgG basada en 28H1-IL-2 qm "1 1". A) Perfil de elución de la cromatografía de exclusión por tamaño y afinidad de la proteína A combinada. B) SDS-PAGE analítica (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen, amortiguador de migración MOPS) del producto final. C) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño del producto final en una columna TSKgel G3000 SW XL (contenido en monómero de un 100 %).
FIGURA 25. Purificación del inmunoconjugado dirigido a FAP IgG basada en 4B9-IL-7 "1 1". A) Perfil de elución de la cromatografía de exclusión por tamaño y afinidad de la proteína A combinada. B) Electroforesis capilar analítica SDS (Caliper) del producto final. C) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño del producto final en una columna TSKgel G3000 SW XL (contenido en monómero de un 98,6 %).
FIGURA 26. Purificación del inmunoconjugado dirigido a FAP IgG basada en 4B9-IFN-a "1 1". A) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de afinidad de la proteína A. B) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño. C) Electroforesis capilar analítica SDS (Caliper) del producto final. D) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño del producto final en una columna TSKgel G3000 SW XL (contenido en monómero de un 92,8 %).
FIGURA 27. Inducción de la proliferación de linfocitos NK92 por los inmunoconjugados dirigidos a FAP IgG 4B9-IL-2 qm "1+1" e IgG 28H1-IL-2 wt "1 1" en comparación con las construcciones correspondientes de IgG-IL-2.
FIGURA 28. Proliferación de linfocitos T activados por PHA (A) CD4 y (B) CD8 inducidos por los inmunoconjugados IgG 4B9-IL-7 "1 1" e IgG 4B9-IL-2 qm "1 1", en comparación con las construcciones IgG-IL-2 qm e IgG-IL-2 wt.
FIGURA 29. Inducción de la proliferación de células de Daudi por IgG 4B9-IFN-a "1 1", en comparación con Roferon A.
FIGURA 30. Concentraciones séricas de inmunoconjugados de IL-2 después de una administración i.v. única de construcciones de IgG-IL-2 dirigidas a FAP (A) y no dirigidas (B) que comprenden IL-2 natural (wt) o bien mutante cuádruple (qm).
FIGURA 31. Distribución tisular de la IgG 28H1-IL dirigida a FAP en comparación con la IgG 28H1 y la IgG 4B9 dirigidas a FAP no conjugadas, así como la IgG DP47GS no dirigida, 24 horas después de la inyección i.v.
FIGURA 32. Unión de los inmunoconjugados IgG 28H1-IL-2 qm e IgG 28H1-(IL-2 qm)2 a linfocitos NK92 según lo determinado por FACS.
FIGURA 33. Proliferación de linfocitos NK después de la incubación con diferentes inmunoconjugados de IL-228H1 dirigidos a FAP o proleucina durante 4 (A), 5 (B) o 6 (C) días.
FIGURA 34. Proliferación de linfocitos T CD4 después de la incubación con diferentes inmunoconjugados de IL-2 28H1 dirigidos a FAP o proleucina durante 4 (A), 5 (B) o 6 (C) días.
FIGURA 35. Proliferación de linfocitos T CD8 después de la incubación con diferentes inmunoconjugados de IL-2 28H1 dirigidos a FAP o proleucina durante 4 (A), 5 (B) o 6 (C) días.
FIGURA 36. Proliferación de linfocitos T CD8 (A) y CD4 (B) preactivados después de seis días de incubación con diferentes inmunoconjugados de IL-2.
FIGURA 37. Apoptosis inducida por la activación de linfocitos T CD3+ después de seis días de incubación con diferentes inmunoconjugados de IL-2 y tratamiento durante la noche con anticuerpo anti-Fas.
FIGURA 38. Concentraciones séricas de inmunoconjugados de IL-2 después de una administración i.v. única de construcciones de IgG DP47GS-IL-2 no dirigidas que comprenden IL-2 natural (A) o bien mutante cuádruple (B).
FIGURA 39. Unión de IgG DP47GS a diferentes antígenos. La unión se detectó en un ensayo basado en ELISA con los antígenos capturados en la placa. Se utilizó como control positivo un anticuerpo IgG1 humano que muestra una unión inespecífica a casi todos los antígenos capturados; las matrices de la muestra no contenían ningún anticuerpo.
FIGURA 40. Unión de IgG DP47GS con o sin la mutación LALA P329G en el dominio Fc a subconjuntos de CMSP humanas frescas (A), activadas por PHA-L (B) y reestimuladas (C), según lo determinado por el análisis FACS. Panel superior izquierdo: linfocitos B (en A, B) o linfocitos T CD4+ (en C); panel superior derecho: linfocitos T CD8+; panel inferior izquierdo: linfocitos NK; panel inferior derecho: linfocitos CD14+ (monocitos/neutrófilos).
Descripción detallada de los modos de realización
Definiciones
Los términos se usan en el presente documento como se usan en general en la técnica, a menos que se defina de otro modo a continuación.
Como se usa en el presente documento, el término "conjugado" se refiere a una molécula polipeptídica de fusión que incluye un resto efector y una molécula peptídica adicional, en particular una molécula de inmunoglobulina.
Como se usa en el presente documento, el término "inmunoconjugado" se refiere a una molécula polipeptídica de fusión que incluye un resto efector, al menos un resto de unión a antígeno y un dominio Fc, siempre que no esté presente más de un resto efector. En ciertos modos de realización, el inmunoconjugado comprende un resto efector, dos restos de unión a antígeno y un dominio Fc. Determinados inmunoconjugados descritos en el presente documento consisten esencialmente en un resto efector, dos restos de unión a antígeno y un dominio Fc, unidos por una o más secuencias conectoras. El resto de unión a antígeno y el resto efector se pueden unir al dominio Fc por diversas interacciones y en diversas configuraciones como se describe en el presente documento. En un modo de realización determinado, los dos restos de unión a antígeno y el dominio Fc se unen entre sí en una configuración para formar una molécula de inmunoglobulina completa. Un inmunoconjugado como se menciona en el presente documento es una proteína de fusión, es decir, los componentes del inmunoconjugado están unidos entre sí por enlaces peptídicos, ya sea directamente o a través de péptidos conectores.
Como se usa en el presente documento, el término "resto de unión a antígeno" se refiere a una molécula polipeptídica que se une específicamente a un determinante antigénico. En un modo de realización, un resto de unión a antígeno puede dirigir la entidad a la que se une (p. ej., un resto efector o un segundo resto de unión a antígeno) a un sitio destinatario, por ejemplo a un tipo específico de célula tumoral o estroma tumoral que porte el determinante antigénico. Los restos de unión a antígeno incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos, como se define adicionalmente en el presente documento. Determinados restos de unión a antígeno incluyen un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, que comprende una región variable de la cadena pesada de anticuerpo y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo. En ciertos modos de realización, los restos de unión a antígeno pueden comprender regiones constantes de anticuerpo, como se define adicionalmente en el presente documento y es conocido en la técnica. Las regiones constantes de la cadena pesada útiles incluyen cualquiera de los cinco isotipos: a, ó, £, y o p. Las regiones constantes de la cadena ligera útiles incluyen cualquiera de los dos isotipos: k y A.
Como se usa en el presente documento, el término "determinante antigénico" es sinónimo de "antígeno" y "epítopo" y se refiere a un sitio (p. ej., una secuencia correlativa de aminoácidos o una configuración conformacional compuesta por diferentes regiones de aminoácidos no contiguos) en una macromolécula polipeptídica a la que se une un resto de unión a antígeno, formando un complejo de resto de unión a antígeno-antígeno. Se pueden encontrar determinantes antigénicos útiles, por ejemplo, en la superficie de células tumorales, en la superficie de células infectadas por virus, en la superficie de otras células enfermas, libres en el suero sanguíneo y/o en la matriz extracelular (MEC). En un modo de realización determinado, el determinante antigénico es un antígeno humano.
Por "se une específicamente" se quiere decir que la unión es selectiva para el antígeno y se puede discriminar de interacciones no deseadas o inespecíficas. La capacidad de un resto de unión a antígeno para unirse a un determinante antigénico específico se puede medir a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien con otras técnicas conocidas para un experto en la técnica, p. ej., la técnica de resonancia de plasmón superficial (SPR; analizada en un instrumento BIAcore; Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 [2000]), y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 [2002]). En un modo de realización, el grado de unión de un resto de unión a antígeno a una proteína no relacionada es inferior a aproximadamente un 10 % de la unión del resto de unión a antígeno al antígeno medida, p. ej., mediante SPR. En ciertos modos de realización, un anticuerpo que se une a un resto de unión a antígeno, o un inmunoconjugado que comprende dicho resto de unión a antígeno, tiene una constante de disociación (Kd) de <1 pM, <100 nM, <10 nM, <1 nM, <0,1 nM, <0,01 nM o <0,001 nM (p. ej., 10-8 M o menos, p. ej., de 10'8 M a 10'13 M, p. ej., de 10'9 M a 10'13 M).
"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (p. ej., un receptor) y su correlato de unión (p. ej., un ligando). A menos que se indique otra cosa, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una
interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (p. ej., receptor y ligando). La afinidad de una molécula X por su ligando Y se puede representar en general mediante la constante de disociación (Kd), que es la proporción de las constantes de velocidad de disociación y asociación (kdis y kas, respectivamente). Por tanto, las afinidades equivalentes pueden comprender diferentes constantes de velocidad, siempre que la proporción de las constantes de velocidad permanezca igual. La afinidad se puede medir por procedimientos bien establecidos conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Un procedimiento determinado para medir la afinidad es la resonancia de plasmón superficial (SPR).
"Unión reducida", por ejemplo unión reducida a un receptor Fc o a CD25, se refiere a una disminución en la afinidad por la interacción respectiva, medida por ejemplo por SPR. Para mayor claridad, el término incluye también la reducción de la afinidad a cero (o por debajo del límite de detección del procedimiento analítico), es decir, la anulación completa de la interacción. Por el contrario, "unión incrementada" se refiere a un incremento en la afinidad de unión para la interacción respectiva.
Como se usa en el presente documento, los términos "primero" y "segundo" con respecto a los restos de unión a antígeno, etc., se usan por comodidad para distinguir cuando hay más de uno de cada tipo de resto. El uso de estos términos no pretende conferir un orden u orientación específica del inmunoconjugado a menos que así se indique explícitamente.
Como se usa en el presente documento, el término "resto efector" se refiere a un polipéptido, p. ej., una proteína o glucoproteína, que influye en la actividad celular, por ejemplo, a través de la transducción de señales u otras vías celulares. En consecuencia, el resto efector descrito en el presente documento se puede asociar a la señalización mediada por receptor que transmite una señal desde el exterior de la membrana celular para modular una respuesta en una célula que porta uno o más receptores para el resto efector. En un modo de realización, un resto efector puede provocar una respuesta citotóxica en células que portan uno o más receptores para el resto efector. En otro modo de realización, un resto efector puede provocar una respuesta proliferativa en células que portan uno o más receptores para el resto efector. En otro modo de realización, un resto efector puede provocar la diferenciación en células que portan receptores para el resto efector. En otro modo de realización, un resto efector puede alterar la expresión (es decir, regular por incremento o regular por disminución) de una proteína celular endógena en células que portan receptores para el resto efector. Los ejemplos de restos efectores incluyen, entre otros, citocinas, factores de crecimiento, hormonas, enzimas, sustratos y cofactores. El resto efector se puede asociar con un resto de unión a antígeno o con un dominio Fc en diversas configuraciones para formar un inmunoconjugado.
Como se usa en el presente documento, el término "citocina" se refiere a una molécula que media y/o regula una función o proceso biológico o celular (p. ej., inmunidad, inflamación y hematopoyesis). El término "citocina" como se usa en el presente documento incluye "linfocinas", "quimiocinas", "monocinas" e "interleucinas". Los ejemplos de citocinas útiles incluyen, entre otros, GM-CSF, IL-1a, IL-1p, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-a, IFN-p, IFN-y, PIM-la, PIM-1 p, FCT-p, FNT-a y FNT-p. Citocinas concretas son IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IFN-a e IFN-y. En determinados modos de realización, el antígeno es un antígeno humano. El término "citocina" como se usa en el presente documento también incluye variantes de citocinas que comprenden una o más mutaciones aminoacídicas en las secuencias de aminoácidos de la correspondiente citocina natural, tal como por ejemplo las variantes de la IL-2 descritas en Sauvé et al., Proc Natl Acad Sci USA 88, 4636-40 (1991); Hu et al., Blood 101, 4853-4861 (2003) y la publicación de patente de EE. UU. n.° 2003/0124678; Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000); Heaton et al., Cancer Res 53, 2597-602 (1993) y la patente de EE. UU. n.° 5.229.109; la publicación de patente de EE. UU. n.° 2007/0036752; el documento WO 2008/0034473; el documento WO 2009/061853; o la publicación de solicitud de patente de PCT n.° WO 2012/107417. En el presente documento se describen otras variantes de citocinas, por ejemplo, variantes de la IL-15. En ciertos modos de realización, las citocinas se han mutado para eliminar la glucosilación.
Como se usa en el presente documento, el término "monocatenario" se refiere a una molécula que comprende monómeros de aminoácidos unidos linealmente por enlaces peptídicos. En un modo de realización, el resto efector es un resto efector monocatenario. Los ejemplos de restos efectores monocatenarios incluyen, entre otros, citocinas, factores de crecimiento, hormonas, enzimas, sustratos y cofactores. Cuando el resto efector es una citocina y la citocina de interés se encuentra normalmente como un multímero en la naturaleza, cada subunidad de la citocina multimérica se codifica secuencialmente por la cadena sencilla del resto efector. En consecuencia, los ejemplos de restos efectores monocatenarios útiles incluyen, entre otros, GM-CSF, IL-1 a, IL-1 p, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-15, IFN-a, IFN-p, IFN-y, PIM-1a, PIM-1 p, FCT-p, FNT-a y FNT-p.
Como se usa en el presente documento, el término "resto efector de control" se refiere a un resto efector no conjugado. Por ejemplo, cuando se compara un inmunoconjugado de IL-2 como se describe en el presente documento con un resto efector de control, el resto efector de control es IL-2 libre no conjugada. Asimismo, p. ej., cuando se compara un inmunoconjugado de IL-12 con un resto efector de control, el resto efector de control es IL-12 libre, no conjugada (p. ej., existente como una proteína heterodimérica en la que las subunidades p40 y p35 comparten solo enlace[s] disulfuro).
Como se usa en el presente documento, el término "receptor de resto efector" se refiere a una molécula de polipéptido que se puede unir específicamente a un resto efector. Por ejemplo, cuando IL-2 es el resto efector, el receptor del resto efector que se une a una molécula de IL-2 (p. ej., un inmunoconjugado que comprende la IL-2) es el receptor de la IL-2. De forma similar, p. ej., cuando IL-12 es el resto efector de un inmunoconjugado, el receptor del resto efector es el receptor de la IL-12. Cuando un resto efector se une específicamente a más de un receptor, todos los receptores que se unen específicamente al resto efector son "receptores del resto efector" para ese resto efector.
El término "molécula de inmunoglobulina" se refiere a una proteína que tiene la estructura de un anticuerpo natural. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la clase IgG son glucoproteínas heterotetraméricas de unos 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que se unen con enlaces disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio variable pesado o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), también llamados regiones constantes de la cadena pesada. De manera similar, desde el extremo N al extremo C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio variable ligero o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio constante ligero (CL), también llamado región constante de la cadena ligera. La cadena pesada de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de cinco tipos, llamados a (IgA), 6 (IgD), £ (IgE), y (IgG) o p (IgM), algunos de los cuales se pueden dividir adicionalmente en subtipos, p. ej. Y1 (IgG1), Y2 (IgG2), Y3 (IgG3), Y4 (IgG4), a1 (IgA1) y a2 (IgA2). La cadena ligera de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), basados en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante. Una inmunoglobulina consiste esencialmente en dos moléculas Fab y un dominio Fc, unidos por medio de la región bisagra de inmunoglobulina.
El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluso, entre otras, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y fragmentos de anticuerpo, siempre que manifiesten la actividad de unión a antígeno deseada.
Un “fragmento de anticuerpo” se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo inalterado que comprende una porción de un anticuerpo inalterado que se une al antígeno al que se une el anticuerpo inalterado. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, entre otros, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenario (p. ej., scFv) y anticuerpos de dominio único. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson, et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, p. ej., Plückthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994); véase también el documento WO 93/16185; y las patentes de e E. UU. n.° 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos del epítopo de unión al receptor de rescate y que tienen una semivida in vivo incrementada, véase la patente de EE. UU. n.° 5.869.046. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo el dominio variable de la cadena pesada o una porción del mismo o todo el dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo o una porción del mismo. En ciertos modos de realización, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, p. ej., la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1). Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluso, entre otras, la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células anfitrionas recombinantes (p. ej., E. coli o fago), como se describe en el presente documento.
El término "dominio de unión a antígeno" se refiere a la parte de un anticuerpo que comprende el área que se une específicamente a una parte o a la totalidad de un antígeno y es complementaria a ella. Por ejemplo, uno o más dominios variables de anticuerpo (también llamados regiones variables de anticuerpo) pueden proporcionar un dominio de unión a antígeno. En particular, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH).
El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera (Vh y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural en general tienen estructuras similares, y cada dominio comprende cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). Véase, p. ej., Kindt et al., Kuby Immunology, 6,a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno.
El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). En general, los anticuerpos tetracatenarios naturales comprenden seis HVR; tres en la VH (H1, H2, H3) y tres en la VL (L1, L2, L3). Las HVR comprenden en general residuos aminoacídicos de los bucles hipervariables y/o de las regiones determinantes de la complementariedad (RDC), siendo estas últimas las de mayor variabilidad de secuencia y/o las implicadas en el reconocimiento antigénico. Con la excepción de RDC1 en la VH, las RDC comprenden en general los residuos aminoacídicos que forman los bucles hipervariables. Las regiones hipervariables (HVR) también se denominan "regiones determinantes de la
complementariedad" (RDC), y estos términos se usan en el presente documento de manera intercambiable en referencia a porciones de la región variable que forman las regiones de unión a antígeno. Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) y Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987) han descrito esta región concreta, donde las definiciones incluyen residuos aminoacídicos superpuestos o subconjuntos de los mismos cuando se comparan entre sí. No obstante, se pretende que la aplicación de cualquier definición para referirse a una RDC de un anticuerpo o variantes de la misma esté dentro del alcance del término tal como se define y se usa en el presente documento. Los residuos aminoacídicos apropiados que engloban las RDC, como se definen en cada una de las referencias citadas anteriormente, se exponen a continuación en la tabla 1 a modo de comparación. Los números de residuos exactos que engloba una RDC determinada variarán en función de la secuencia y tamaño de la RDC. Los expertos en la técnica pueden determinar de forma rutinaria qué residuos comprende una RDC determinada dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.
TABLA 1. Definiciones de RDC1
convenciones de numeración expuestas por Kabat et al. (véase a continuación).
2 "AbM" con una "b" minúscula, como se usa en la tabla 1, se refiere a las RDC como se definen por el programa informático de modelado de anticuerpos "AbM" de Oxford Molecular.
Kabat et al. también definieron un sistema de numeración para secuencias de la región variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto normal en la técnica puede asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de la región variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la secuencia misma. Como se usa en el presente documento, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que se especifique otra cosa, las referencias a la numeración de posiciones de residuos aminoacídicos específicas en una región variable de anticuerpo están de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.
Las secuencias polipeptídicas del listado de secuencias (es decir, SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31 etc.) no están numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, está dentro de la habilidad del experto normal en la técnica convertir la numeración de las secuencias del listado de secuencias a la numeración de Kabat.
“Región estructural” o “FR” se refiere a los residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consta en general de cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen en general en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
La "clase" de un anticuerpo o inmunoglobulina se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 6, £, y y M, respectivamente.
El término "dominio Fc" o "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región carboxiterminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de IgG podrían variar ligeramente, la extensión de la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define normalmente desde Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxiterminal de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina carboxiterminal (Lys447) de la región Fc puede o no estar presente. A menos que se especifique otra cosa en el presente documento, la numeración de los residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante se realiza de acuerdo con el sistema de numeración UE, también llamado índice UE, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Una "subunidad" de un dominio Fc, como se usa en el presente documento, se refiere a uno de los dos polipéptidos que forman el dominio Fc dimérico, es decir, un polipéptido que comprende regiones constantes carboxiterminales de una cadena pesada de inmunoglobulina, que puede crear una autoasociación estable. Por ejemplo, una subunidad de un dominio Fc de IgG comprende un dominio constante CH2 de IgG y un dominio constante CH3 de IgG.
Una "modificación que promueve la heterodimerización" es una manipulación del esqueleto peptídico o de las modificaciones postraduccionales de un polipéptido que reduce o impide la asociación del polipéptido con un
polipéptido idéntico para formar un homodímero. Una modificación que promueve la heterodimerización como se usa en el presente documento incluye en particular las modificaciones separadas hechas a cada uno de dos polipéptidos con los que se desea formar un dímero, en que las modificaciones son complementarias entre sí para promover la asociación de los dos polipéptidos. Por ejemplo, una modificación que promueve la heterodimerización puede alterar la estructura o la carga de uno o ambos de los polipéptidos con los que se desea formar un dímero para hacer su asociación estérica o electrostáticamente favorable, respectivamente. La heterodimerización se produce entre dos polipéptidos no idénticos, tales como dos subunidades de un dominio Fc en las que otros componentes inmunoconjugados fusionados a cada una de las subunidades (p. ej., el resto de unión a antígeno, el resto efector) no son iguales. En los inmunoconjugados descritos en el presente documento, la modificación que promueve la heterodimerización está en el dominio Fc. En algunos modos de realización, la modificación que promueve la heterodimerización comprende una mutación aminoacídica, específicamente una sustitución de aminoácido. En un modo de realización determinado, la modificación que promueve la heterodimerización comprende una mutación aminoacídica separada, específicamente una sustitución de aminoácido, en cada una de las dos subunidades del dominio Fc.
El término "funciones efectoras" se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Entre los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos figuran: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión al receptor Fc, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de citocinas, captación de antígenos por las células presentadoras de antígenos mediada por inmunocomplejos, regulación negativa de receptores de la superficie celular (p. ej., receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.
Como se usa en el presente documento, se considera que los términos "genomanipular, genomanipulado, genomanipulación" incluyen cualquier manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de un polipéptido natural o recombinante o fragmento del mismo. La genomanipulación incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos, del patrón de glucosilación, o del grupo de cadena lateral de aminoácidos individuales, así como combinaciones de estos enfoques. La "genomanipulación", en particular con el prefijo "gluco", así como el término "genomanipulación de la glucosilación" incluye la genomanipulación metabólica de la maquinaria de glucosilación de una célula, incluyendo las manipulaciones genéticas de las vías de síntesis de los oligosacáridos para lograr una alteración de la glucosilación de las glucoproteínas expresadas en las células. Además, la genomanipulación de la glucosilación incluye los efectos de las mutaciones y del entorno celular sobre la glucosilación. En un modo de realización, la genomanipulación de la glucosilación es una alteración en la actividad glucosiltransferasa. En un modo de realización determinado, la modificación da como resultado una alteración de la actividad glucosaminiltransferasa y/o de la actividad fucosiltransferasa. La genomanipulación de la glucosilación se puede utilizar para obtener una "célula anfitriona que tiene mayor actividad de GnTIII", una "célula anfitriona que tiene mayor actividad de ManlI", o una "célula anfitriona que tiene una actividad de a (1,6) fucosiltransferasa reducida".
El término "mutación aminoacídica", como se usa en el presente documento, pretende englobar sustituciones, deleciones, inserciones y modificaciones aminoacídicas. Se puede realizar cualquier combinación de sustitución, deleción, inserción y modificación para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, p. ej., unión reducida a un receptor Fc o unión reducida a CD25. Las deleciones e inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen deleciones e inserciones de aminoácidos aminoterminales y/o carboxiterminales. Las mutaciones aminoacídicas concretas son sustituciones de aminoácidos. Para el fin de alterar, p. ej., las características de unión de una región Fc o de una citocina como IL-2, son preferentes en particular las sustituciones de aminoácidos no conservadoras, es decir, reemplazar un aminoácido por otro aminoácido que tenga diferentes propiedades estructurales y/o químicas. Las sustituciones de aminoácidos incluyen el reemplazo por aminoácidos no naturales o por derivados aminoacídicos naturales de los veinte aminoácidos convencionales (p. ej., 4-hidroxiprolina, 3-metilhistidina, ornitina, homoserina, 5-hidroxilisina). Se pueden generar mutaciones aminoacídicas usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis dirigida a sitio, RCP, síntesis génica y similares. Se contempla que también pueden ser útiles procedimientos de alteración del grupo de cadena lateral de un aminoácido por procedimientos distintos de la genomanipulación, tales como la modificación química. Se pueden usar diversas designaciones en el presente documento para indicar la misma mutación de aminoácido. Por ejemplo, una sustitución de prolina en la posición 329 del dominio Fc por glicina se puede indicar como 329G, G329, G329, P329G o Pro329Gly.
Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces amida (también llamados enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. Por tanto, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término usado para referirse a una cadena de dos o más aminoácidos se incluyen dentro de la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" se puede usar en lugar de cualquiera de estos términos, o de forma intercambiable con ellos. El término "polipéptido" también pretende referirse a los productos de modificaciones del polipéptido posteriores a la expresión, incluyendo entre otras, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos no naturales. Un polipéptido se puede derivar de una fuente biológica natural o se puede producir por tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácido nucleico designada. Se puede generar de cualquier modo,
incluyendo la síntesis química. Un polipéptido como se describe en el presente documento puede tener un tamaño de unos 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1000 o más, o 2000 o más aminoácidos. Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, aunque no tienen necesariamente dicha estructura. Los polipéptidos con una estructura tridimensional definida se denominan polipéptidos plegados, y los polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida, sino que pueden adoptar un gran número de conformaciones diferentes, se denominan polipéptidos desplegados.
Por un polipéptido "aislado" o una variante o un derivado del mismo, se entiende un polipéptido que no está en su medio natural. No se requiere ningún nivel determinado de purificación. Por ejemplo, un polipéptido aislado se puede retirar de su entorno original o natural. Los polipéptidos y proteínas producidos de manera recombinante expresados en células anfitrionas se consideran aislados para los fines de la presente divulgación, ya que son polipéptidos naturales o recombinantes que se han separado, fraccionado o parcial o sustancialmente purificado mediante cualquier técnica adecuada.
“Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos de una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos de la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin tener en consideración ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Hay varias formas de lograr la alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos que están dentro de los conocimientos de la técnica, por ejemplo, el uso de un programa informático públicamente disponible, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr una alineación máxima en toda la longitud de las secuencias que se comparan. Para los fines en el presente documento, sin embargo, los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2. El creador del programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2 fue Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. Uu ., Washington D.C., 20559, donde está registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible en Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. El programa ALIGN-2 establece todos los parámetros de comparación de secuencias, que no varían. En situaciones en las que se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a una secuencia de aminoácidos dada B, con ella o frente a ella (que, de forma alternativa, se puede parafrasear como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a una secuencia de aminoácidos dada B, con ella o frente a ella) se calcula del siguiente modo:
100 veces la fracción X/Y
donde X es el número de residuos aminoacídicos calificados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación de A y B realizada por el programa, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos en B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se indique específicamente otra cosa, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa de ordenador ALIGN-2.
El término "polinucleótido" se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislada, p. ej., ARN mensajero (ARNm), ARN derivado de virus o ADN de plásmido (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (p. ej., un enlace amida, tal como se encuentra en los ácidos peptidonucleicos [APN]). El término "molécula de ácido nucleico" se refiere a uno cualquiera o más segmentos de ácido nucleico, p. ej., fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido.
Por molécula de ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN que se ha retirado de su entorno natural. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido terapéutico contenido en un vector se considera aislado para los fines de la presente divulgación. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células anfitrionas heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Un polinucleótido aislado incluye una molécula polinucleotídica contenida en células que contienen normalmente la molécula polinucleotídica, pero la molécula polinucleotídica está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural. Las moléculas de ARN aislado incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro como se describe en el presente documento, así como formas de hebra positiva y negativa, y formas bicatenarias. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados como se describen en el presente documento incluyen adicionalmente
dichas moléculas producidas de forma sintética. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico pueden ser o pueden incluir un elemento regulador tal como un promotor, sitio de unión al ribosoma o un finalizador de la transcripción.
Por un ácido nucleico o polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, un 95 % "idéntica" a la secuencia de nucleótidos de referencia descrita en el presente documento, se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos al menos un 95 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta un 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia se puede eliminar o sustituir por otro nucleótido, o varios nucleótidos hasta un 5 % de los nucleótidos totales de la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Como una cuestión práctica, se puede determinar de forma convencional si cualquier secuencia polinucleotídica determinada es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos descrita en el presente documento, usando programas de ordenador conocidos, tales como los analizados anteriormente para polipéptidos (p. ej., ALIGN-2).
El término "casete de expresión" se refiere a un polinucleótido generado de forma recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico determinado en una célula destinataria. El casete de expresión recombinante se puede incorporar en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN de plástido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción de casete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir y un promotor. En ciertos modos de realización, el casete de expresión descrito en el presente documento comprende secuencias polinucleotídicas que codifican inmunoconjugados como los descritos en el presente documento o fragmentos de los mismos.
El término "vector" o "vector de expresión" es sinónimo de "construcción de expresión" y se refiere a una molécula de ADN que se usa para introducir y dirigir la expresión de un gen específico al que se asocia operativamente en una célula destinataria. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula anfitriona en la que se ha introducido. El vector de expresión descrito en el presente documento comprende un casete de expresión. Los vectores de expresión permiten la transcripción de grandes cantidades de ARNm estable. Una vez que el vector de expresión está dentro de la célula destinataria, se produce la molécula de ácido ribonucleico o proteína que codifica el gen por el mecanismo celular de transcripción y/o traducción. En un modo de realización, el vector de expresión descrito en el presente documento comprende un casete de expresión que comprende secuencias polinucleotídicas que codifican inmunoconjugados como los descritos en el presente documento o fragmentos de los mismos.
El término "artificial" se refiere a una composición sintética o no derivada de células anfitrionas, p. ej., un oligonucleótido sintetizado químicamente.
Los términos "célula anfitriona", "línea celular anfitriona" y "cultivo de células anfitrionas" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células anfitrionas incluyen “transformantes” y “células transformadas”, que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica a una célula original en su contenido de ácido nucleico, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento. Una célula anfitriona es cualquier tipo de sistema celular que se puede usar para generar los inmunoconjugados descritos en el presente documento. En un modo de realización, la célula anfitriona se genomanipula para permitir la producción de un inmunoconjugado con oligosacáridos modificados en su región Fc. En ciertos modos de realización, las células anfitrionas se han manipulado para expresar mayores niveles de uno o más polipéptidos que tienen actividad p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII). En ciertos modos de realización, las células anfitrionas se han manipulado adicionalmente para expresar mayores niveles de uno o más polipéptidos que tienen actividad a-manosidasa II (ManII). Las células anfitrionas incluyen células cultivadas, p. ej., células cultivadas de mamíferos, tales como células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura , células de insectos y células vegetales, por nombrar solo algunas, pero también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o tejido vegetal o animal cultivado.
Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido que tiene actividad GnTIII" se refiere a polipéptidos que pueden catalizar la adición de un residuo de N-acetilglucosamina (GlcNAc) en un enlace p-1,4 al manósido unido a p del núcleo de trimanosilo de oligosacáridos unidos a N. Esto incluye polipéptidos de fusión que presentan actividad enzimática similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad de la p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III, también llamada p-1,4-manosil-glucoproteína 4-beta-N-acetilglucosaminil-transferasa (EC 2.4.1.144), de acuerdo con el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB), medida en un
ensayo biológico determinado, con o sin dependencia de la dosis. En el caso de que exista dependencia de la dosis, no necesita ser idéntica a la de GnTIII, sino en su lugar, sustancialmente similar a la dependencia de la dosis en una actividad dada en comparación con la GnTIII (es decir, el polipéptido candidato presentará mayor actividad o no más de unas 25 veces menos y, preferentemente, no más de unas diez veces menos actividad, y lo más preferentemente, no más de unas tres veces menos actividad en relación con la GnTIII). En ciertos modos de realización, el polipéptido que tiene actividad GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnTIII y el dominio de localización de Golgi de un polipéptido heterólogo residente en Golgi. En particular, el dominio de localización de Golgi es el dominio de localización de manosidasa II o GnTI, más en particular el dominio de localización de manosidasa II. De forma alternativa, el dominio de localización de Golgi se selecciona del grupo que consta de: el dominio de localización de manosidasa I, el dominio de localización de GnTII y el dominio de localización de la a-1,6-fucosiltransferasa del núcleo. Los procedimientos para generar dichos polipéptidos de fusión y usarlos para producir anticuerpos con funciones efectoras incrementadas se divulgan en el documento WO2004/065540 y en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0241817.
Como se usa en el presente documento, el término "dominio de localización de Golgi" se refiere a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido residente en Golgi que es responsable de anclar el polipéptido a una ubicación dentro del aparato de Golgi. En general, los dominios de localización comprenden "colas" aminoterminales de una enzima.
Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido que tiene actividad ManII" se refiere a polipéptidos que pueden catalizar la hidrólisis de residuos terminales de a-D-manosa unidos a 1,3 y 1,6 en el producto ramificado de manosa GlcNAcMansGlcNAc2 intermedio de oligosacáridos unidos a N. Esto incluye polipéptidos que presentan una actividad enzimática similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad de la a-manosidasa II de Golgi, también llamada oligosacárido de manosilo 1,3-1,6-a-manosidasa II (EC 3.2.1.114), de acuerdo con el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB).
Un "receptor Fc activador" es un receptor Fc que, después de la interacción con una región Fc de un anticuerpo (o de un inmunoconjugado), provoca eventos de señalización que estimulan a la célula portadora del receptor para realizar funciones efectoras. Los receptores Fc activadores incluyen FcYRIIIa (CD16a), FcyRI (CD64), FcYRIIa (CD32) y FcaRI (CD89).
La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) es un mecanismo inmunitario que da lugar a la lisis de células destinatarias recubiertas de anticuerpo por células efectoras inmunitarias. Las células destinatarias son células a las que se unen específicamente anticuerpos o fragmentos de los mismos que comprenden una región Fc, en general por medio de la parte de proteína que está en el extremo N de la región Fc. Como se usa en el presente documento, el término "CCDA incrementada" se define bien como un incremento del número de células destinatarias que se lisan en un tiempo dado, a una concentración dada de inmunoconjugado en el medio que rodea las células destinatarias, por el mecanismo de CCDA definido anteriormente, y/o una reducción de la concentración de inmunoconjugado, en el medio que rodea las células destinatarias, requerida para lograr la lisis de un número dado de células destinatarias en un tiempo dado, por el mecanismo de CCDA. El incremento de la CCDA es con relación a la CCDA mediada por el mismo inmunoconjugado, producido por el mismo tipo de células anfitrionas, usando los mismos procedimientos convencionales de producción, purificación, formulación y almacenamiento (conocidos por los expertos en la técnica), pero que no se ha genomanipulado. Por ejemplo, el incremento de la CCDA mediada por un inmunoconjugado producido por células anfitrionas genomanipuladas para que tengan un patrón alterado de glucosilación (p. ej., para expresar la glucosiltransferasa, GnTIII, u otras glucosiltransferasas) mediante los procedimientos descritos en el presente documento, es con relación a la CCDA mediada por el mismo inmunoconjugado producido por el mismo tipo de células anfitrionas no genomanipuladas.
Por "inmunoconjugado que tiene citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) incrementada" se entiende un inmunoconjugado que tiene una CCDA incrementada determinada por cualquier procedimiento adecuado conocido por los expertos normales en la técnica. Un ensayo de CCDA in vitro aceptado es como sigue:
1) En el ensayo se usan células destinatarias que expresan el antígeno destinatario reconocido por la región de unión a antígeno del inmunoconjugado.
2) El ensayo usa como células efectoras células mononucleares de sangre periférica humana (CMSP), aisladas a partir de la sangre de un donante sano elegido al azar.
3) El ensayo se lleva a cabo de acuerdo con el protocolo siguiente:
i) Las CMSP se aíslan usando procedimientos convencionales de centrifugación por densidad y se suspenden a 5 x 106 células/ml en medio de cultivo celular RPMI.
ii) Las células destinatarias se cultivan por procedimientos convencionales de cultivo de tejidos, se extraen de la fase de crecimiento exponencial con una viabilidad superior a un 90 %, se lavan en medio de cultivo celular RPMI, se marcan con 100 microcurios de 51Cr, se lavan dos veces con medio de cultivo celular y se suspenden de nuevo en medio de cultivo celular a una densidad de 105 células/ml.
iii) Se trasvasan 100 microlitros de la anterior suspensión final de células destinatarias a cada pocilio de una placa de microvaloración de 96 pocillos.
iv) El inmunoconjugado se diluye en serie desde 4000 ng/ml hasta 0,04 ng/ml en medio de cultivo celular y se agregan 50 microlitros de las soluciones de inmunoconjugado resultantes a las células destinatarias en la placa de microtitulación de 96 pocillos, sometiendo a prueba por triplicado varias concentraciones de inmunoconjugado que engloban la totalidad del intervalo de concentraciones anterior.
v) Para los controles de liberación máxima (MR), 3 pocillos adicionales de la placa que contienen las células destinatarias marcadas reciben 50 microlitros de una solución acuosa al 2 % (v/v) de un detergente no iónico (Nonidet, Sigma, St. Louis), en lugar de la solución de inmunoconjugado (punto iv anterior).
vi) Para los controles de liberación espontánea (SR), 3 pocillos adicionales de la placa que contienen las células destinatarias marcadas reciben 50 microlitros de medio de cultivo celular RPMl en lugar de la solución de inmunoconjugado (punto iv anterior).
vii) A continuación, se centrifuga la placa de microvaloración de 96 pocillos a 50 x g durante 1 minuto y se incuba a 4 °C durante 1 hora.
viii) Se agregan 50 microlitros de la suspensión de CMSP (punto i anterior) a cada pocillo para obtener una proporción de células efectoras:destinatarias de 25:1 y se introducen las placas en una estufa de incubación en una atmósfera con un 5 % de CO2 a 37 °C durante 4 horas.
ix) Se extrae el sobrenadante sin células de cada pocillo y se cuantifica la radioactividad liberada experimentalmente (ER) usando un contador gamma.
x) Se calcula el porcentaje de lisis específica para cada concentración de inmunoconjugado de acuerdo con la fórmula (ER-MR)/(MR-SR) x 100, donde ER es el promedio de radioactividad cuantificada (véase el punto ix anterior) para esa concentración de inmunoconjugado, MR es el promedio de radioactividad cuantificada (véase el punto ix anterior) para los controles MR (véase el punto v anterior) y SR es el promedio de radioactividad cuantificada (véase el punto ix anterior) para los controles SR (véase el punto vi anterior).
4) "CCDA aumentada" se define como un incremento del porcentaje máximo de lisis específica observado en el intervalo de concentraciones de inmunoconjugado sometido a prueba antes y/o como una reducción de la concentración de inmunoconjugado necesaria para alcanzar la mitad del porcentaje máximo de lisis específica observado en el intervalo de concentraciones de inmunoconjugado sometido a prueba antes. El incremento de la CCDA es con relación a la CCDA, medida con el ensayo anterior, mediada por el mismo inmunoconjugado, producida por el mismo tipo de células anfitrionas, usando los mismos procedimientos convencionales de producción, purificación, formulación y almacenamiento, que conocen los expertos en la técnica, pero que no se ha genomanipulado.
Una "cantidad eficaz" de un agente se refiere a la cantidad necesaria para dar como resultado un cambio fisiológico en la célula o tejido al que se administra.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, p. ej., una composición farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los plazos necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente, por ejemplo, elimina, disminuye, retrasa, minimiza o evita efectos adversos de una enfermedad.
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, entre otros, animales domesticados (p. ej., vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (p. ej., seres humanos y primates no humanos tales como los monos), conejos y roedores (p. ej., ratones y ratas). En particular, el individuo o sujeto es un ser humano.
El término "composición farmacéutica" se refiere a un preparado que está en una forma que permite que la actividad biológica de un principio activo contenido en el mismo sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente, en una composición farmacéutica, distinto de un principio activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, entre otros, un amortiguador, excipiente, estabilizante o conservante.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural de una enfermedad en el individuo tratado, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante la evolución de una patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, entre otros, la prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, el
alivio de los síntomas, la disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la prevención de metástasis, la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o atenuación de la enfermedad y la remisión o el pronóstico mejorado. En algunos modos de realización, se usan inmunoconjugados como se describe en el presente documento para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.
El término “prospecto” se usa para hacer referencia a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias con respecto al uso de dichos productos terapéuticos.
Descripción detallada de los modos de realización
En un primer aspecto, la divulgación proporciona un inmunoconjugado que comprende un primer resto de unión a antígeno, un dominio Fc que consta de dos subunidades y un resto efector, en el que no está presente más de un resto efector. La ausencia de otros restos efectores puede reducir el direccionamiento del inmunoconjugado a los sitios donde se presenta el receptor del resto efector respectivo, mejorando así el direccionamiento y la acumulación en los sitios donde se presenta el antígeno destinatario real del inmunoconjugado, que reconoce el resto de unión a antígeno. Además, la ausencia de un efecto de avidez por el receptor del resto efector respectivo puede reducir la activación de células positivas para el receptor del resto efector en la sangre periférica tras la administración intravenosa del inmunoconjugado. Además, la semivida en el suero de los inmunoconjugados que comprenden solo un único resto efector parece ser más larga en comparación con los inmunoconjugados que comprenden dos o más restos efectores.
Formatos de inmunoconjugados
Los componentes del inmunoconjugado se pueden fusionar entre sí en diversas configuraciones. En la figura 2 se representan ejemplos de configuraciones. En un modo de realización, el resto efector se fusiona con el aminoácido aminoterminal o carboxiterminal de una de las dos subunidades del dominio Fc. En un modo de realización, el resto efector se fusiona con el aminoácido carboxiterminal de una de las dos subunidades del dominio Fc. El resto efector se puede fusionar al dominio Fc directamente o a través de un péptido conector, que comprende uno o más aminoácidos, típicamente alrededor de 2-20 aminoácidos. Los péptidos conectores son conocidos en la técnica o se describen en el presente documento. Entre los péptidos conectores adecuados, no inmunogénicos, figuran, por ejemplo, los péptidos conectores (G4S)n, (SG4)n o G4(SG4)n. "N" es generalmente un número entre 1 y 10, típicamente entre 2 y 4. Alternativamente, cuando el resto efector está unido al extremo N de una subunidad del dominio Fc, se puede unir a través de una región bisagra de inmunoglobulina o una porción de la misma, con o sin un péptido conector adicional.
De manera similar, el primer resto de unión a antígeno puede fusionarse al aminoácido aminoterminal o carboxiterminal de una de las dos subunidades del dominio Fc. En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno se fusiona al aminoácido aminoterminal de una de las dos subunidades del dominio Fc. El primer resto de unión a antígeno puede fusionarse al dominio Fc directamente o a través de un péptido conector. En un modo de realización determinado, el primer resto de unión a antígeno se fusiona al dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina. En un modo de realización específico, la región bisagra de inmunoglobulina es una región bisagra IgG1 humana.
En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, que comprende una región variable de la cadena pesada del anticuerpo y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo. En un modo de realización determinado, el primer resto de unión a antígeno es una molécula de Fab. En un modo de realización, la molécula de Fab se fusiona por su extremo carboxílico de la cadena pesada o ligera al aminoácido aminoterminal de una de las dos subunidades del dominio Fc. En un modo de realización determinado, la molécula de Fab se fusiona por su extremo carboxílico de la cadena pesada al aminoácido aminoterminal de una de las dos subunidades del dominio Fc. En un modo de realización más determinado, la molécula de Fab se fusiona con el dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina. En un modo de realización específico, la región bisagra de inmunoglobulina es una región bisagra IgG1 humana.
En un modo de realización, el inmunoconjugado consiste esencialmente en un resto de unión a antígeno, un dominio Fc que consta de dos subunidades, un resto efector, y opcionalmente uno o más péptidos conectores, en el que dicho dominio de unión a antígeno es una molécula de Fab y se fusiona por su extremo carboxílico de la cadena pesada al aminoácido aminoterminal de una de las dos subunidades del dominio Fc, y en el que dicho resto efector está fusionado (i) con el aminoácido aminoterminal de la otra de las dos subunidades del dominio Fc , o (ii) al aminoácido carboxiterminal de una de las dos subunidades del dominio Fc. En este último caso, tanto el resto efector como el primer resto de unión al antígeno pueden fusionarse a la misma subunidad del dominio Fc, o cada uno puede fusionarse con una diferente de las dos subunidades del dominio Fc.
Un formato de inmunoconjugado con un único resto de unión a antígeno (por ejemplo, como se muestra en la figura 2B y 2C) es útil, especialmente en los casos en que se espera la internalización del antígeno destinatario después de la unión de un resto de unión a antígeno de alta afinidad. En tales casos, la presencia de más de un resto de unión a
antígeno por inmunoconjugado puede mejorar la internalización, reduciendo así la disponibilidad del antígeno destinatario.
En muchos otros casos, sin embargo, será ventajoso tener un inmunoconjugado que comprenda dos o más restos de unión a antígeno y un único resto efector para optimizar el direccionamiento al antígeno destinatario frente al receptor del resto efector, y el margen farmacéutico del inmunoconjugado.
Así, en un modo de realización determinado, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende un primer y un segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización, cada uno de dichos primer y segundo restos de unión a antígeno se fusiona con el aminoácido aminoterminal de una de las dos subunidades del dominio Fc. El primer y segundo restos de unión a antígeno pueden fusionarse al dominio Fc directamente o a través de un péptido conector. En un modo de realización determinado, cada uno de dichos primer y segundo restos de unión a antígeno se fusiona a una subunidad del dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina. En un modo de realización específico, la región bisagra de inmunoglobulina es una región bisagra IgG1 humana.
En un modo de realización, cada uno de dichos primer y segundo restos de unión a antígeno comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, que comprende una región variable de la cadena pesada del anticuerpo y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo. En un modo de realización determinado, cada uno de dichos primer y segundo restos de unión a antígeno es una molécula de Fab. En un modo de realización, cada una de dichas moléculas Fab se fusiona por su extremo carboxílico de la cadena pesada o ligera al aminoácido aminoterminal de una de las dos subunidades del dominio Fc. En un modo de realización determinado, cada una de dichas moléculas Fab se fusiona por su extremo carboxílico de la cadena pesada al aminoácido aminoterminal de una de las dos subunidades del dominio Fc. En un modo de realización más determinado, cada una de dichas moléculas Fab se fusiona a una subunidad del dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina. En un modo de realización específico, la región bisagra de inmunoglobulina es una región bisagra IgG1 humana.
En un modo de realización, el primer y el segundo resto de unión a antígeno y el dominio Fc forman parte de una molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización determinado, la molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la clase IgG. En un modo de realización aún más determinado, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG1 . En otro modo de realización determinado, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana. En otros modos de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina quimérica o una inmunoglobulina humanizada. En un modo de realización, el resto efector se fusiona al aminoácido carboxiterminal de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina. El resto efector se puede fusionar a la cadena pesada de inmunoglobulina directamente o a través de un péptido conector. En un modo de realización determinado, el inmunoconjugado consiste esencialmente en una molécula de inmunoglobulina, un resto efector fusionado al aminoácido carboxiterminal de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, y opcionalmente uno o más péptidos conectores.
En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende un polipéptido en el que una cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc, y un polipéptido en el que una subunidad del dominio Fc comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de un resto efector. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende un polipéptido en el que una primera cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc, y un polipéptido en el que una segunda cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de un resto efector. En un modo de realización adicional, el inmunoconjugado comprende un polipéptido en el que una cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc, y un polipéptido en el que un polipéptido de un resto efector comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc. En algunos modos de realización, el inmunoconjugado comprende además un polipéptido de cadena ligera de Fab. En ciertos modos de realización, los polipéptidos se unen covalentemente, p. ej., por un enlace disulfuro.
De acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores, los componentes del inmunoconjugado (p. ej., resto efector, resto de unión a antígeno, dominio Fc) se pueden unir directamente o a través de diversos conectores, en particular conectores peptídicos que comprenden uno o más aminoácidos, típicamente unos 2-20 aminoácidos, que se describen en el presente documento o son conocidos en la técnica. Entre los péptidos conectores adecuados, no inmunogénicos, figuran, por ejemplo, los péptidos conectores (G4S)n, (SG4)n o G4(SG4)n, en los que n es por lo general un número entre 1 y 10, típicamente entre 2 y 4.
Dominio Fc
El dominio Fc del inmunoconjugado consta de un par de cadenas polipeptídicas que comprenden dominios de la cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina. Por ejemplo, el dominio Fc de una molécula de inmunoglobulina G (IgG) es un dímero, y cada subunidad del mismo comprende los dominios constantes de la cadena pesada de IgG CH2 y CH3. Las dos subunidades del dominio Fc pueden crear una asociación estable entre sí. En un modo de realización, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende no más de un dominio Fc.
En un modo de realización, el dominio Fc del inmunoconjugado es un dominio Fc de IgG. En un modo de realización determinado, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1. En otro modo de realización, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4. En otro modo de realización determinado, el dominio Fc es humano. En la SEQ ID NO: 1 se presenta un ejemplo de secuencia de una región Fc de IgG1 humana.
El dominio Fc confiere al inmunoconjugado una semivida en suero muy prolongada en comparación con los formatos de inmunoconjugado que carecen de un dominio Fc. En particular cuando el inmunoconjugado comprende un resto efector de actividad más bien débil (pero, p. ej., de toxicidad reducida), una semivida larga puede ser esencial para lograr una eficacia óptima in vivo. Además, el dominio Fc puede mediar funciones efectoras, como se explicará más adelante.
Modificaciones del dominio Fc que promueven la heterodimerización
Los inmunoconjugados descritos en el presente documento comprenden solo un único resto efector, fusionado a una de las dos subunidades del dominio Fc, por lo que comprenden dos cadenas polipeptídicas no idénticas. La expresión conjunta recombinante de estos polipéptidos y su posterior dimerización conducen a varias combinaciones posibles de los dos polipéptidos, de los cuales solo los heterodímeros de los dos polipéptidos no idénticos son útiles aquí. Para mejorar el rendimiento y la pureza de los inmunoconjugados en la producción recombinante, puede ser ventajoso por tanto introducir en el dominio Fc del inmunoconjugado una modificación que dificulte la formación de homodímeros de dos polipéptidos idénticos (es decir, dos polipéptidos que comprenden un resto efector, o dos polipéptidos que carecen de un resto efector) y/o que promueva la formación de heterodímeros de un polipéptido que comprende un resto efector y un polipéptido que carece de un resto efector.
En consecuencia, en ciertos modos de realización en el presente documento, el dominio Fc del inmunoconjugado comprende una modificación que promueve la heterodimerización de dos cadenas polipeptídicas no idénticas. El sitio de interacción proteína-proteína más extensa entre las dos cadenas polipeptídicas de un dominio Fc de IgG humana es en el dominio CH3 del dominio Fc. Por tanto, en un modo de realización, dicha modificación está en el dominio CH3 del dominio Fc.
En un modo de realización específico, dicha modificación es una modificación de botón en ojal, que comprende una modificación de botón en una de las dos subunidades del dominio Fc y una modificación de ojal en la otra de las dos subunidades del dominio Fc.
La tecnología de botón en ojal se describe, p. ej., en los documentos US 5.731.168, US 7.695.936, Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) y Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfaz de un primer polipéptido y una cavidad correspondiente ("ojal") en la interfaz de un segundo polipéptido, de modo que la protuberancia se puede situar en la cavidad para promover la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la interfaz del primer polipéptido por cadenas laterales más grandes (p. ej., tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfaz del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácido grandes por otras más pequeñas (p. ej., alanina o treonina). La protuberancia y la cavidad se pueden realizar alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, p. ej., por mutagénesis específica de sitio o por síntesis peptídica. En un modo de realización específico, una modificación de botón comprende la sustitución de aminoácido T366W en una de las dos subunidades del dominio Fc, y la modificación de ojal comprende las sustituciones de aminoácidos T366S, L368A e Y407V en la otra de las dos subunidades del dominio Fc. En otro modo de realización específico, la subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de botón comprende adicionalmente la sustitución de aminoácido S354C, y la subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de ojal comprende adicionalmente la sustitución de aminoácido Y349C. La introducción de estos dos residuos de cisteína da como resultado la formación de un puente de disulfuro entre las dos subunidades de la región Fc, estabilizando más aún el dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 [2001]).
En un modo de realización alternativo, una modificación que promueve la heterodimerización de dos cadenas polipeptídicas no idénticas comprende una modificación que media en los efectos de conducción electrostática, p. ej., como se describe en la publicación de PCT WO 2009/089004. En general, este procedimiento implica el reemplazo de uno o más residuos aminoacídicos en la interfaz de las dos cadenas polipeptídicas por residuos aminoacídicos cargados de modo que la formación de homodímeros se vuelve electrostáticamente desfavorable y la heterodimerización se vuelve electrostáticamente favorable.
En un modo de realización determinado, el resto efector se fusiona con el aminoácido aminoterminal o carboxiterminal de la subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de botón. Sin querer limitarse por ninguna teoría, la fusión del resto efector con la subunidad del dominio Fc que contiene el botón reducirá al mínimo la generación de inmunoconjugados homodiméricos que comprenden dos grupos efectores (choque estérico de dos polipéptidos que contienen botones).
Modificaciones del dominio Fc que alteran la unión al receptor Fc
En ciertos modos de realización en el presente documento, el dominio Fc del inmunoconjugado se genomanipula para que tenga una afinidad de unión alterada a un receptor Fc, específicamente una afinidad de unión alterada a un receptor Fcy, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado.
La unión a los receptores Fc se puede determinar fácilmente, p. ej., mediante ELISA, o mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) usando instrumentación habitual tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores Fc tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. En el presente documento se describe un ensayo de unión adecuado de este tipo. De forma alternativa, se puede evaluar la afinidad de unión de los dominios Fc o de los inmunoconjugados que comprenden un dominio Fc por los receptores Fc usando estirpes celulares que han demostrado expresar determinados receptores Fc, tales como linfocitos NK que expresan el receptor FcYlIIa.
En algunos modos de realización, el dominio Fc del inmunoconjugado se genomanipula para que tenga funciones efectoras alteradas, en particular una CCDA alterada, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado.
La función efectora de un dominio Fc, o de un inmunoconjugado que comprende un dominio Fc, se puede medir por procedimientos conocidos en la técnica. En el presente documento se describe un ensayo adecuado para medir la CCDA. En la patente de EE. UU. n.° 5.500.362, Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) y Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985), en la patente de EE. UU. n.° 5.821.337, Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987) se describen otros ejemplos de ensayos in vitro para evaluar la actividad de CCDA de una molécula de interés. De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radioactivo (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo [CelITechnology, Inc. Mountain View, CA] y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® [Promega, Madison, WI]). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicional, la actividad de CCDA de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, p. ej., en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).
En algunos modos de realización se altera la unión del dominio Fc a un componente del complemento, específicamente a C1q. Por consiguiente, en algunos modos de realización en los que el dominio Fc está genomanipulado para que tenga una función efectora alterada, dicha función efectora alterada incluye CDC alterada. Se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para determinar si el inmunoconjugado se puede unir a C1q y, por consiguiente, tiene actividad CDC. Véase, p. ej., ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento se puede realizar un ensayo de CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 [1996], Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 {2003] y Cragg y Glennie, Blood 103, 2738-2743 [2004]).
a) Unión al receptor Fc y/o función efectora disminuidas
Un dominio Fc confiere al inmunoconjugado propiedades farmacocinéticas favorables, incluyendo una semivida en suero larga, lo que contribuye a una buena acumulación en el tejido destinatario y una proporción de distribución tejido-sangre favorable. Al mismo tiempo, sin embargo, puede dar lugar a un direccionamiento indeseable del inmunoconjugado a células que expresan receptores Fc en lugar de hacerlo a las células preferentes portadoras de antígenos. Además, la coactivación de las vías de señalización del receptor Fc puede dar lugar a la liberación de citocinas que, en combinación con el resto efector y la larga semivida del inmunoconjugado, da como resultado una activación excesiva de los receptores de citocinas y efectos secundarios graves tras la administración sistémica. De acuerdo con esto, se ha descrito que los inmunoconjugados de IgG-IL-2 convencionales se asocian con reacciones a la infusión (véase, p. ej., King et al., J Clin Oncol 22, 4463-4473 [2004]).
En consecuencia, en determinados modos de realización en el presente documento, el dominio Fc del inmunoconjugado se genomanipula para que tanga una afinidad de unión reducida a un receptor Fc. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc comprende una o más mutaciones aminoacídicas que reducen la afinidad de unión del dominio Fc a un receptor Fc. Típicamente, la misma o más mutaciones aminoacídicas están presentes en cada una de las dos subunidades del dominio Fc. En un modo de realización, dicha mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del inmunoconjugado al receptor Fc en al menos 2 veces, al menos 5 veces o al menos 10 veces. En modos de realización donde existe más de una mutación aminoacídica que reduce la afinidad de unión del dominio Fc al receptor Fc, la combinación de estas mutaciones aminoacídicas puede reducir la afinidad de unión del dominio Fc al receptor Fc en al menos 10 veces, al menos 20 veces o incluso al menos 50 veces. En un modo de realización, el inmunoconjugado que comprende un dominio Fc genomanipulado presenta menos de un 20 %, en particular menos de un 10 %, más en particular menos de un 5 % de la afinidad de unión a un receptor Fc en comparación con un inmunoconjugado que comprende un dominio Fc no genomanipulado. En un modo de realización, el receptor Fc es un receptor Fc activador. En un modo de realización específico, el receptor Fc es un receptor Fcy, más específicamente un receptor FcYRIIIa, FcyRI o FcYRIIa. Preferentemente, la unión a cada uno de estos receptores está reducida. En algunos modos de realización también está reducida la afinidad de unión a un componente del complemento, específicamente la afinidad de unión a C1q. En un modo de realización, no está reducida la afinidad de unión al receptor Fc neonatal (FcRn). Se logra una unión sustancialmente similar a FcRn, es decir, la conservación de la
afinidad de unión del dominio Fc a dicho receptor, cuando el dominio Fc (o el inmunoconjugado que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 % de la afinidad de unión de una forma no genomanipulada del dominio Fc (o el inmunoconjugado que comprende dicha forma no genomanipulada del dominio Fc) a FcRn. Los dominios Fc, o los inmunoconjugados como se describen en el presente documento que comprenden dichos dominios Fc, pueden presentar más de aproximadamente un 80 % e incluso más de aproximadamente un 90 % de dicha afinidad. En un modo de realización, la mutación aminoacídica es una sustitución de aminoácido. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución de aminoácido en la posición P329. En un modo de realización más específico, la sustitución de aminoácido es P329A o P329G, en particular P329G. En un modo de realización, el dominio Fc comprende otra sustitución de aminoácido en una posición seleccionada de entre S228, E233, L234, L235, N297 y P331. En un modo de realización más específico, la otra sustitución de aminoácido es S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S. En un modo de realización determinado, el dominio Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones P329, L234 y L235. En un modo de realización más determinado, el dominio Fc comprende las mutaciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G (LALA P329G). Esta combinación de sustituciones de aminoácidos suprime casi completamente la unión de un dominio Fc de IgG humana a un receptor Fcy, como se describe en la publicación de solicitud de patente de PCT n.° WO 2012/130831. El documento WO 2012/130831 también describe procedimientos de preparación de dichos dominios Fc mutantes y procedimientos para determinar sus propiedades tales como la unión al receptor Fc o funciones efectoras.
Los dominios Fc mutantes se pueden preparar por deleción, sustitución, inserción o modificación de aminoácidos usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, RCP, síntesis génica y similares. Los cambios correctos de nucleótidos se pueden verificar, por ejemplo, por secuenciación.
En un modo de realización, el dominio Fc se genomanipula para que tenga una función efectora disminuida en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. La función efectora disminuida puede incluir, entre otras, una o más de las siguientes cosas: citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) disminuida, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) disminuida, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) disminuida, secreción de citocinas disminuida, captación de antígenos por las células presentadoras de antígenos mediada por inmunocomplejos disminuida, unión a linfocitos NK disminuida, unión a macrófagos disminuida, unión a monocitos disminuida, unión a células polimorfonucleares disminuida, señalización directa que induce apoptosis disminuida, entrecruzamiento de anticuerpos unidos a la diana disminuido, maduración de células dendríticas disminuida o activación de linfocitos T disminuida.
En un modo de realización, la función efectora disminuida es una o más seleccionadas del grupo de CDC disminuida, CCDA disminuida, ADCP disminuida y secreción de citocinas disminuida. En un modo de realización determinado, la función efectora disminuida es una CCDA disminuida. En un modo de realización, la CCDA disminuida es inferior a un 20 % de la CCDA inducida por un dominio Fc no genomanipulado (o un inmunoconjugado que comprende un dominio Fc no genomanipulado).
Además de los dominios Fc descritos anteriormente en el presente documento y en la publicación de solicitud de patente de PCT n.° WO 2012/130831, los dominios Fc con unión a receptor Fc y/o función efectora reducidas también incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 del dominio Fc (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácido 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante de Fc “DANA” con sustitución de los residuos 265 y 297 a alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).
Los anticuerpos IgG4 manifiestan una reducida afinidad de unión a receptores Fc y reducidas funciones efectoras en comparación con los anticuerpos IgG1. Por lo tanto, en algunos modos de realización, el dominio Fc de los inmunoconjugados descritos en el presente documento es un dominio Fc de IgG4, en particular un dominio Fc de IgG4 humana. En un modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición S228, específicamente la sustitución de aminoácido S228P. Para reducir adicionalmente su afinidad de unión a un receptor Fc y/o su función efectora, en un modo de realización el dominio Fc de IgG4 comprende una sustitución de aminoácido en la posición L235, específicamente la sustitución de aminoácido L235E. En otro modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende una sustitución de aminoácido en la posición P329, específicamente la sustitución de aminoácido P329G. En un modo de realización determinado, el dominio Fc de IgG4 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones S228, L235 y P329, específicamente las sustituciones de aminoácidos S228P, L235E y P329G. Dichos dominios Fc de IgG4 mutantes y sus propiedades de unión al receptor Fcy se describen en la publicación de solicitud de patente de PCT n.° WO 2012/130831.
b) Unión al receptor Fc y/o función efectora incrementadas
Por el contrario, puede haber situaciones donde es deseable mantener o incluso potenciar la unión al receptor Fc y/o las funciones efectoras de los inmunoconjugados, por ejemplo cuando el inmunoconjugado está dirigido a un antígeno tumoral altamente específico. Por lo tanto, en ciertos modos de realización, el dominio Fc de los inmunoconjugados descritos en el presente documento se genomanipula para que tenga una afinidad de unión incrementada a un receptor Fc. La afinidad de unión incrementada puede ser un incremento de la afinidad de unión del dominio Fc al
receptor Fc de al menos 2 veces, al menos 5 veces o al menos 10 veces. En un modo de realización, el receptor Fc es un receptor Fc activador. En un modo de realización determinado, el receptor Fc es un receptor Fcy.
En un modo de realización, el receptor Fc se selecciona del grupo de FcYRIIIa, FcyRI y FcYRIIa. En un modo de realización determinado, el receptor Fc es FcYRIIIa.
En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc se genomanipula para que tenga una estructura de oligosacáridos alterada en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En un modo de realización determinado de este tipo, el dominio Fc comprende una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En un modo de realización más específico, al menos aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 55 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o aproximadamente un 100 %, en particular al menos aproximadamente un 50 %, más en particular al menos aproximadamente un 70 %, de los oligosacáridos unidos a N del dominio Fc del inmunoconjugado no están fucosilados. Los oligosacáridos no fucosilados pueden ser del tipo híbrido o complejo. En otro modo de realización específico, el dominio Fc comprende una proporción incrementada de oligosacáridos bisecados en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En un modo de realización más específico, al menos aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 15 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 55 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o aproximadamente un 100 %, en particular al menos aproximadamente un 50 %, más en particular al menos aproximadamente un 70 %, de los oligosacáridos unidos a N del dominio Fc del inmunoconjugado están bisecados. Los oligosacáridos bisecados pueden ser del tipo híbrido o complejo. En otro modo de realización específico más, el dominio Fc comprende una proporción incrementada de oligosacáridos bisecados no fucosilados en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En un modo de realización más específico, al menos aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 15 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 55 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o aproximadamente un 100 %, en particular al menos aproximadamente un 15 %, más en particular al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 35 % o al menos aproximadamente un 50 % de los oligosacáridos unidos a N del dominio Fc del inmunoconjugado están bisecados y no fucosilados. Los oligosacáridos bisecados no fucosilados pueden ser del tipo híbrido o complejo.
Las estructuras de oligosacáridos del dominio Fc del inmunoconjugado se pueden analizar por procedimientos bien conocidos en la técnica, p. ej., mediante espectrometría de masas MALDI t Of como se describe en Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999) o Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006). El porcentaje de oligosacáridos no fucosilados es la cantidad de oligosacáridos que carecen de residuos de fucosa, con respecto a todos los oligosacáridos unidos a Asn 297 (p. ej., estructuras complejas, híbridas y con alto contenido de manosa) e identificados por EM MALDI TOF en una muestra tratada con N-glucosidasa F. Asn 297 se refiere al residuo de asparagina situado aproximadamente en la posición 297 del dominio Fc (numeración UE de los residuos de la región Fc); sin embargo, la Asn297 también puede estar situada aproximadamente ±3 aminoácidos en dirección 5' o en dirección 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a pequeñas variaciones de secuencia en las inmunoglobulinas. El porcentaje de oligosacáridos bisecados o bisecados no fucosilados se determina de forma análoga.
La modificación de la glucosilación en el dominio Fc del inmunoconjugado puede derivarse de la producción del inmunoconjugado en una célula anfitriona que se ha manipulado para expresar niveles alterados de uno o más polipéptidos que tienen actividad glucosiltransferasa.
En un modo de realización, el dominio Fc del inmunoconjugado se genomanipula para que tenga una estructura de oligosacáridos alterada en comparación con un dominio Fc no genomanipulado, produciendo el inmunoconjugado en una célula anfitriona que tiene actividad alterada de una o más glucosiltransferasas. Las glucosiltransferasas incluyen, por ejemplo, p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), p(1,4)-galactosiltransferasa (GalT), p(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa I (GnTI), p(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa II (GnTII) y a(1,6)-fucosiltransferasa. En un modo de realización específico, el dominio Fc del inmunoconjugado se genomanipula para que comprenda una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en comparación con un dominio Fc no genomanipulado, produciendo el inmunoconjugado en una célula anfitriona que tiene actividad p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII) incrementada. En un modo de realización aún más específico, la célula anfitriona tiene adicionalmente actividad a-manosidasa II (Manll) incrementada. La metodología de glucomanipulación que se puede usar para glucomanipular inmunoconjugados como los descritos en el presente documento se ha descrito con mayor detalle en Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999), Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006), el documento WO 99/54342 (patente de EE. UU. n.° 6.602.684, documento EP
1071700), el documento WO 2004/065540 (publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0241817, documento EP 1587921), el documento w O 03/011878 (publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2003/0175884).
En general, se puede usar cualquier tipo de estirpe celular cultivada, incluyendo las estirpes celulares analizadas en el presente documento, para generar estirpes celulares para la producción de inmunoconjugados con un patrón de glucosilación alterado. Las estirpes celulares concretas incluyen células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, y otras células de mamíferos. En ciertos modos de realización, las células anfitrionas se han manipulado para expresar mayores niveles de uno o más polipéptidos que tienen actividad p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII). En ciertos modos de realización, las células anfitrionas se han manipulado adicionalmente para expresar mayores niveles de uno o más polipéptidos que tienen actividad a-manosidasa II (ManII). En un modo de realización específico, el polipéptido que tiene actividad GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnTIII y el dominio de localización de Golgi de un polipéptido heterólogo residente en Golgi. En particular, dicho dominio de localización de Golgi es el dominio de localización de Golgi de manosidasa II. Los procedimientos para generar dichos polipéptidos de fusión y usarlos para producir anticuerpos con funciones efectoras incrementadas se divulgan en Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006) y en el documento WO 2004/065540.
Las células anfitrionas que contienen una secuencia codificante de un inmunoconjugado como los descritos en el presente documento y/o una secuencia codificante de un polipéptido que tiene actividad glucosiltransferasa, y que expresan los productos génicos biológicamente activos, se pueden identificar, p. ej., mediante hibridación ADN-ADN o ADN-ARN, la presencia o ausencia de funciones génicas "marcadoras", evaluando el nivel de transcripción medido por la expresión de los respectivos transcritos de ARNm en la célula anfitriona o la detección del producto génico medido por inmunoensayo o por su actividad biológica; procedimientos que son bien conocidos en la técnica. La actividad GnTIII o ManII se puede detectar, p. ej., empleando una lectina que se une a productos de biosíntesis de GnTIII o ManII, respectivamente. Un ejemplo de dicha lectina es la lectina E4-PHA que se une preferentemente a oligosacáridos que contienen GlcNAc bisecante. Los productos de biosíntesis (es decir, estructuras de oligosacáridos específicas) de polipéptidos que tienen actividad GnTIII o ManII también se pueden detectar mediante análisis de espectrometría de masas de los oligosacáridos liberados a partir de glucoproteínas producidas por células que expresan dichos polipéptidos. De forma alternativa, se puede usar un ensayo funcional que mide la función efectora incrementada y/o la unión al receptor Fc incrementada, mediada por inmunoconjugados producidos por las células genomanipuladas con el polipéptido que tiene actividad GnTIII o ManII.
En otro modo de realización, el dominio Fc se genomanipula para que comprenda una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en comparación con un dominio Fc no genomanipulado, produciendo el inmunoconjugado en una célula anfitriona que tiene actividad a(1,6)-fucosiltransferasa disminuida. Una célula anfitriona que tiene actividad a(1,6)-fucosiltransferasa disminuida puede ser una célula en la que el gen de la a(1,6)-fucosiltransferasa se ha inactivado o desactivado de otro modo, p. ej., se ha suprimido (véase Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng 87, 614 [2004], Kanda et al., Biotechnol Bioeng 94[4], 680-688 [2006], Niwa et al., J Immunol Methods 306, 151-160 [2006]).
Otros ejemplos de estirpes celulares que pueden producir inmunoconjugados desfucosilados incluyen células CHO Lec13 deficientes en fucosilación de proteínas (Ripka et al., Arch Biochem Biophys 249, 533-545 [1986], solicitud de patente de EE. UU. n.° 2003/0157108 y el documento WO 2004/056312, especialmente en el ejemplo 11). De forma alternativa, los inmunoconjugado descritos en el presente documento se pueden glucomanipular para que tengan residuos de fucosa reducidos en el dominio Fc de acuerdo con las técnicas divulgadas en los documentos EP 1176 195 A1, WO 03/084570, WO 03/085119 y en las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. n.°s 2003/0115614, 2004/093621, 2004/110282, 2004/110704, 2004/132140, en la patente de EE. UU. n.° 6.946.292 (Kyowa), p. ej., reduciendo o suprimiendo la actividad de una proteína transportadora de GDP-fucosa en las células anfitrionas usadas para la producción de inmunoconjugados.
Los inmunoconjugados glucomanipulados también se pueden producir en sistemas de expresión que producen glucoproteínas modificadas, tales como los mostrados en el documento WO 2003/056914 (GlycoFi, Inc.) o en los documentos WO 2004/057002 y WO 2004/024927 (Greenovation).
En un modo de realización, el dominio Fc del inmunoconjugado se genomanipula para que tenga una función efectora incrementada en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. La función efectora incrementada puede incluir, entre otras, una o más de las siguientes cosas: citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) incrementada, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) incrementada, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) incrementada, secreción de citocinas incrementada, captación de antígenos por las células presentadoras de antígenos mediada por inmunocomplejos incrementada, unión a linfocitos NK incrementada, unión a macrófagos incrementada, unión a monocitos incrementada, unión a células polimorfonucleares incrementada, señalización directa que induce apoptosis incrementada, entrecruzamiento de anticuerpos unidos a la diana incrementado, maduración de células dendríticas incrementada o activación de linfocitos T incrementada.
En un modo de realización, la función efectora incrementada es una o más seleccionadas del grupo de CDC incrementada, CCDA incrementada, ADCP incrementada y secreción de citocinas incrementada. En un modo de realización determinado, la función efectora incrementada es una CCDA incrementada. En un modo de realización, la CCDA inducida por un dominio Fc genomanipulado (o un inmunoconjugado que comprende un dominio Fc genomanipulado) está incrementada al menos 2 veces en comparación con la CCDA inducida por un dominio Fc no genomanipulado (o un inmunoconjugado que comprende un dominio Fc no genomanipulado).
Restos efectores
Los restos efectores para su uso en el presente documento son, en general, polipéptidos que influyen en la actividad celular, por ejemplo, a través de vías de transducción de señales. En consecuencia, el resto efector del inmunoconjugado descrito en el presente documento se puede asociar a la señalización mediada por receptor que transmite una señal desde el exterior de la membrana celular para modular una respuesta dentro de la célula. Por ejemplo, un resto efector del inmunoconjugado puede ser una citocina. En determinados modos de realización, el resto efector es humano.
En ciertos modos de realización, el resto efector es un resto efector monocatenario. En un modo de realización determinado, el resto efector es una citocina. Los ejemplos de citocinas útiles incluyen, entre otros, GM-CSF, IL-1a, IL-1 p, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-21, IFN-a, IFN-p, IFN-y, PIM-1a, PIM-1 p, FCT-p, FNT-a y FNT-p. En un modo de realización, el resto efector del inmunoconjugado es una citocina seleccionada del grupo de GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21, IFN-a, IFN-y, PIM-1a, PIM-1 p y FCT-p. En un modo de realización, el resto efector del inmunoconjugado es una citocina seleccionada del grupo de la IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IFN-a e IFN-y. En ciertos modos de realización, el resto efector de citocina se muta para eliminar los sitios de glucosilación N u O. La eliminación de la glucosilación aumenta la homogeneidad del producto obtenible en la producción recombinante.
En un modo de realización determinado, el resto efector del inmunoconjugado es IL-2. En un modo de realización específico, el resto efector de la IL-2 puede provocar una o más de las respuestas celulares seleccionadas del grupo que consta de: proliferación en un linfocito T activado, diferenciación en un linfocito T activado, actividad de linfocitos T citotóxicos (LTC), proliferación en un linfocito B activado, diferenciación en un linfocito B activado, proliferación en un linfocito citolítico natural (NK), diferenciación en un linfocito NK, secreción de citocinas por un linfocito T activado o un linfocito NK, y citotoxicidad antitumoral de linfocitos NK activados por linfocinas (LAK). En otro modo de realización determinado, el resto efector de la IL-2 es un resto efector de la IL-2 mutante que tiene una afinidad de unión reducida a la subunidad a del receptor de la IL-2. Junto con las subunidades p y y (también llamadas CD122 y CD132, respectivamente), la subunidad a (también llamada CD25) forma el receptor heterotrimérico de la IL-2 de alta afinidad, mientras que el receptor dimérico consistente solo en las subunidades p y y se denomina receptor de la IL-2 de afinidad intermedia. Como se describe en la publicación de solicitud de patente de PCT n.° WO 2012/107417, un polipéptido de la IL-2 mutante con unión reducida a la subunidad a del receptor de la IL-2 tiene una capacidad reducida para inducir la señalización de la IL-2 en linfocitos T reguladores, induce menos muerte celular inducida por activación (AICD) en linfocitos T y tiene un perfil de toxicidad reducido in vivo, en comparación con un polipéptido de la IL-2 natural. El uso de dicho resto efector con toxicidad reducida es especialmente ventajoso en un inmunoconjugado como se describe en el presente documento, que tiene una larga semivida en suero debido a la presencia de un dominio Fc. En un modo de realización, el resto efector de la IL-2 mutante del inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende al menos una mutación aminoacídica que reduce o anula la afinidad del resto efector de la IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de la IL-2 (CD25) pero conserva la afinidad del resto efector de la IL-2 mutante por el receptor de la IL-2 de afinidad intermedia (que consta de las subunidades p y y del receptor de la IL-2), en comparación con el resto efector de la IL-2 no mutado. En un modo de realización, la mutación o mutaciones aminoacídicas son sustituciones de aminoácidos. En un modo de realización específico, el resto efector de la IL-2 mutante comprende una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en una, dos o tres posiciones seleccionadas de entre las posiciones correspondientes al residuo 42, 45 y 72 de la IL-2 humana. En un modo de realización más específico, el resto efector de la IL-2 mutante comprende tres sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes al residuo 42, 45 y 72 de la IL-2 humana. En un modo de realización aún más específico, el resto efector de la IL-2 mutante es IL-2 humana que comprende las sustituciones de aminoácidos F42A, Y45A y L72G. En un modo de realización, el resto efector de la IL-2 mutante comprende adicionalmente una mutación aminoacídica en una posición correspondiente a la posición 3 de la IL-2 humana, que elimina el sitio de O-glucosilación de la IL-2. En particular, dicha mutación aminoacídica adicional es una sustitución de aminoácido que reemplaza un residuo de treonina por un residuo de alanina. Un resto efector de la IL-2 mutante determinado, útil en el presente documento, comprende cuatro sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a los residuos 3, 42, 45 y 72 de la IL-2 humana. Las sustituciones de aminoácidos específicas son T3A, F42A, Y45A y L72G. Como se demuestra en la publicación de solicitud de patente de PCT n.° WO 2012/107417 y en los ejemplos adjuntos, dicho polipéptido de la IL-2 mutante cuádruple (IL-2 qm) no presenta ninguna unión detectable al CD25, tiene capacidad reducida para inducir la apoptosis en linfocitos T, capacidad reducida para inducir la señalización de la IL-2 en linfocitos Treg y un perfil de toxicidad reducido in vivo. Sin embargo, conserva la capacidad de activar la señalización de la IL-2 en células efectoras, para inducir la proliferación de células efectoras y para generar IFN-y por linfocitos NK como una citocina secundaria.
El resto efector de la IL-2 o IL-2 muíante de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede comprender mutaciones adicionales que proporcionan ventajas adicionales tales como un aumento de la expresión o de la estabilidad. Por ejemplo, la cisteína en la posición 125 puede reemplazarse por un aminoácido neutro como la alanina, para evitar la formación de dímeros de IL-2 con puentes de disulfuro. Por tanto, en ciertos modos de realización, el resto efector de la IL-2 o IL-2 mutante del inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una mutación aminoacídica adicional en una posición correspondiente al residuo 125 de la IL-2 humana. En un modo de realización, dicha mutación aminoacídica adicional es la sustitución de aminoácido C125A.
En un modo de realización específico, el resto efector de la IL-2 mutante comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En otro modo de realización específico, el resto efector de la IL-2 del inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 3.
En otro modo de realización, el resto efector del inmunoconjugado es IL-12. En un modo de realización específico, dicho resto efector de la IL-12 es un resto efector monocatenario de la IL-12. En un modo de realización aún más específico, el resto efector monocatenario de la IL-12 comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 4. En un modo de realización, el resto efector de la IL-12 puede provocar una o más de las respuestas celulares seleccionadas del grupo que consta de: proliferación en un linfocito NK, diferenciación en un linfocito NK, proliferación en un linfocito T y diferenciación en un linfocito T.
En otro modo de realización, el resto efector del inmunoconjugado es IL-10. En un modo de realización específico, dicho resto efector de la IL-10 es un resto efector monocatenario de la IL-10. En un modo de realización aún más específico, el resto efector monocatenario de la IL-10 comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 5. En otro modo de realización específico, el resto efector de la IL-10 es un resto efector monomérico de la IL-10. En un modo de realización más específico, el resto efector monomérico de la IL-10 comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 6. En un modo de realización, el resto efector de la IL-10 puede provocar una o más de las respuestas celulares seleccionadas del grupo que consta de: inhibición de la secreción de citocinas, inhibición de la presentación de antígenos por células presentadoras de antígenos, reducción de la liberación de radicales de oxígeno e inhibición de la proliferación de linfocitos T. Un inmunoconjugado como se describe en el presente documento en el que el resto efector es IL-10 es especialmente útil para la regulación negativa de la inflamación, p. ej., en el tratamiento de un trastorno inflamatorio.
En otro modo de realización, el resto efector del inmunoconjugado es IL-15. En un modo de realización específico, dicho resto efector de la IL-15 es un resto efector de la IL-15 mutante que tiene una afinidad de unión reducida a la subunidad a del receptor de la IL-15. Sin querer limitarse por ninguna teoría, un polipéptido de la IL-15 mutante con unión reducida a la subunidad a del receptor de la IL-15 tiene una capacidad reducida para unirse a los fibroblastos en todo el organismo, lo que da lugar a un mejor perfil farmacocinético y de toxicidad, en comparación con un polipéptido de la IL-15 natural. El uso de un resto efector con toxicidad reducida, tal como los restos efectores de la IL-2 mutante y de la IL-15 mutante descritos, es especialmente ventajoso en un inmunoconjugado como se describe en el presente documento, que tiene una larga semivida en suero debido a la presencia de un dominio Fc. En un modo de realización el resto efector de la IL-15 mutante del inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende al menos una mutación aminoacídica que reduce o anula la afinidad del resto efector de la IL-15 mutante a la subunidad a del receptor de la IL-15, pero conserva la afinidad del resto efector de la IL-15 mutante al receptor de la IL-15/IL-2 de afinidad intermedia (que consta de las subunidades p y y del receptor de la IL-15/IL-2), en comparación con el resto efector de la IL-15 no mutado. En un modo de realización, la mutación aminoacídica es una sustitución de aminoácido. En un modo de realización específico, el resto efector de la IL-15 mutante comprende una sustitución de aminoácido en la posición correspondiente al residuo 53 de la IL-15 humana. En un modo de realización más específico, el resto efector de la IL-15 mutante es IL-15 humana que comprende la sustitución de aminoácido E53A. En un modo de realización, el resto efector de la IL-15 mutante comprende adicionalmente una mutación aminoacídica en una posición correspondiente a la posición 79 de la IL-15 humana, que elimina el sitio de N-glucosilación de la IL-15. En particular, dicha mutación aminoacídica adicional es una sustitución de aminoácido que reemplaza un residuo de asparagina por un residuo de alanina. En un modo de realización aún más específico, el resto efector de la IL-15 comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 7. En un modo de realización, el resto efector de la IL-15 puede provocar una o más de las respuestas celulares seleccionadas del grupo que consta de: proliferación en un linfocito T activado, diferenciación en un linfocito T activado, actividad de linfocitos T citotóxicos (LTC), proliferación en un linfocito B activado, diferenciación en un linfocito B activado, proliferación en un linfocito citolítico natural (NK), diferenciación en un linfocito NK, secreción de citocinas por un linfocito T activado o un linfocito NK, y citotoxicidad antitumoral de linfocitos NK activados por linfocinas (LAK).
Las moléculas de citocinas mutantes útiles como restos efectores en los inmunoconjugados se pueden preparar por deleción, sustitución, inserción o modificación usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, RCP, síntesis génica y similares. Los cambios correctos de nucleótidos se pueden verificar, por ejemplo, por secuenciación. La sustitución o inserción puede implicar residuos aminoacídicos naturales así como no naturales. La modificación de aminoácidos incluye procedimientos bien conocidos de modificación química tales como la adición o eliminación de sitios de glucosilación o uniones de glúcidos, y similares.
En un modo de realización, el resto efector, en particular un resto efector monocatenario, del ¡nmunoconjugado es GM-CSF. En un modo de realización específico, el resto efector GM-CSF puede provocar la proliferación y/o diferenciación en un granulocito, un monocito o una célula dendrítica. En un modo de realización, el resto efector, en particular un resto efector monocatenario, del inmunoconjugado es IFN-a. En un modo de realización específico, el resto efector IFN-a puede provocar una o más de las respuestas celulares seleccionadas del grupo que consta de: inhibir la replicación vírica en una célula infectada por virus y regular por incremento la expresión del complejo principal de histocompatibilidad I (CPH I). En otro modo de realización específico, el resto efector IFN-a puede inhibir la proliferación en una célula tumoral. En un modo de realización, el resto efector, en particular un resto efector monocatenario, del inmunoconjugado es IFN-y. En un modo de realización específico, el resto efector IFN-y puede provocar una o más de las respuestas celulares seleccionadas del grupo de: mayor actividad de macrófagos, mayor expresión de moléculas del CpH y mayor actividad de linfocitos NK. En un modo de realización, el resto efector, en particular un resto efector monocatenario, del inmunoconjugado es IL-7. En un modo de realización específico, el resto efector IL-7 puede provocar la proliferación de linfocitos T y/o B. En un modo de realización, el resto efector, en particular un resto efector monocatenario, del inmunoconjugado es IL-8. En un modo de realización específico, el resto efector IL-8 puede provocar quimiotaxia en neutrófilos. En un modo de realización, el resto efector, en particular un resto efector monocatenario, del inmunoconjugado, es PIM-1a. En un modo de realización específico, el resto efector PIM-1a puede provocar quimiotaxia en monocitos y linfocitos T. En un modo de realización, el resto efector, en particular un resto efector monocatenario, del inmunoconjugado es PIM-1 p. En un modo de realización específico, el resto efector PIM-1 p puede provocar quimiotaxia en monocitos y linfocitos T. En un modo de realización, el resto efector, en particular un resto efector monocatenario, del inmunoconjugado es FCT-p. En un modo de realización específico, el resto efector FCT-p puede provocar una o más de las respuestas celulares seleccionadas del grupo que consta de: quimiotaxia en monocitos, quimiotaxia en macrófagos, regulación por incremento de la expresión de la IL-1 en macrófagos activados y regulación por incremento de la expresión de la IgA en linfocitos B activados.
En un modo de realización, el inmunoconjugado descrito en el presente documento se une a un receptor del resto efector con una constante de disociación (Kd) que es al menos aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 o 10 veces mayor que la de un resto efector de control. En otro modo de realización, el inmunoconjugado se une a un receptor del resto efector con una Kd que es al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces mayor que la de una molécula de inmunoconjugado correspondiente que comprende dos o más restos efectores. En otro modo de realización, el inmunoconjugado se une a un receptor del resto efector con una constante de disociación Kd que es unas 10 veces mayor que la de una molécula de inmunoconjugado correspondiente que comprende dos o más restos efectores.
Restos de unión a antígeno
Los inmunoconjugados descritos en el presente documento comprenden al menos un resto de unión a antígeno. En determinados modos de realización, los inmunoconjugados comprenden dos restos de unión a antígeno, a saber, un primer y un segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende no más de dos restos de unión a antígeno.
El resto de unión a antígeno del inmunoconjugado descrito en el presente documento es en general una molécula polipeptídica que se une a un determinante antigénico específico y puede dirigir la entidad a la que está unida (p. ej., un resto efector y un dominio Fc) a un sitio destinatario, por ejemplo a un tipo específico de célula tumoral o estroma tumoral que porta el determinante antigénico. El inmunoconjugado se puede unir a determinantes antigénicos hallados, por ejemplo, en la superficie de células tumorales, en la superficie de células infectadas por virus, en la superficie de otras células enfermas, libres en suero sanguíneo y/o en la matriz extracelular (MEC).
En ciertos modos de realización, el resto de unión a antígeno se refiere a un antígeno asociado con un proceso patológico, tal como un antígeno presentado en una célula tumoral o en un entorno de células tumorales, en un sitio de inflamación o en una célula infectada por virus.
Los ejemplos de antígenos tumorales incluyen, entre otros, MAGE, MART-1/melan A, gp100, dipeptidilpeptidasa IV (DPPIV), proteína de unión a adenosinadesaminasa (ADAbp), ciclofilina b, antígeno colorrectal (CRC)-C017-1A/GA733, antígeno carcinoembrionario (ACE) y sus epítopos inmunogénicos CAP-1 y CAP-2, etv6, aml1, antígeno prostático específico (PSA) y sus epítopos inmunogénicos PSA-1, PSA-2 y p SA-3, antígeno membranario específico de la próstata (AMEP), familia MAGE de antígenos tumorales (p. ej., MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 [MAGE-B2], MAGE-Xp3 [MAGE-B3], MAGE-Xp4 [MAGE-B4], MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), familia GAGE de antígenos tumorales (p. ej., GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinasa, p53, familia MUC, HER2/neu, p21ras, RCAS1, a-fetoproteína, E-cadherina, a-catenina, p-catenina y Y-catenina, p120ctn, gp100 Pmel117, p Ra ME, NY-ESO-1, cdc27, proteína de la poliposis colónica adenomatosa (PCA), fodrina, conexina 37, idiotipo de Ig, pl5, gp75, gangliósidos GM2 y GD2, productos víricos tales como proteínas del papilomavirus humano, familia Smad de antígenos tumorales, plm-1, P1A, antígeno nuclear codificado por el VEB (ANEB)-1, glucógeno fosforilasa cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 y CT-7, y c-erbB-2.
Los ejemplos de antígenos víricos incluyen, entre otros, hemaglutinina del virus de la gripe, PLM-1 del virus de Epstein-Barr, glucoproteína E2 del virus de la hepatitis C, gp160 del VIH y gp120 del VIH.
Los ejemplos de antígenos de la MEC incluyen, entre otros, sindecano, heparanasa, integrinas, osteopontina, enlace, cadherinas, laminina, EGF de tipo laminina, lectina, fibronectina, Notch, tenascina y matrixina.
Los inmunoconjugados descritos en el presente documento se pueden unir a los siguientes ejemplos específicos de antígenos de la superficie celular, entre otros: FAP, Her2, EGFR, FCI-1R, CD22 (receptor de linfocitos B), CD23 (receptor de IgE de baja afinidad), CD30 (receptor de citocinas), CD33 (antígeno de superficie de los mieloblastos), CD40 (receptor del factor de necrosis tumoral), IL-6R (receptor de la IL6), CD20, MCSP y PDGFpR (receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas p). En determinados modos de realización, el antígeno es un antígeno humano.
En ciertos modos de realización, dicho resto de unión a antígeno se refiere a un antígeno presentado en una célula tumoral o en un entorno de células tumorales. En otros modos de realización, el resto de unión a antígeno se refiere a un antígeno presentado en un sitio de inflamación. En un modo de realización específico, el resto de unión a antígeno se refiere a un antígeno seleccionado del grupo de proteína de activación de fibroblastos (FAP), el dominio A1 de la tenascina C (TNC A1), el dominio A2 de la tenascina C (TNC A2), el dominio adicional B de la fibronectina (EDB), antígeno carcinoembrionario (ACE) y proteoglucano de sulfato de condroitina asociado al melanoma (MCSP).
En un modo de realización, el inmunoconjugado descrito en el presente documento, comprende dos o más restos de unión a antígeno, en el que cada uno de estos restos de unión a antígeno se une específicamente al mismo determinante antigénico.
El resto de unión a antígeno puede ser cualquier tipo de anticuerpo o fragmento del mismo que conserve la unión específica a un determinante antigénico. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, entre otros, fragmentos VH, fragmentos VL, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos scFv, fragmentos Fv, minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos (véase, p. ej., Hudson y Souriau, Nature Med 9, 129-134 [2003]). En un modo de realización determinado, el resto de unión a antígeno es una molécula de Fab. En un modo de realización, dicha molécula de Fab es humana. En otro modo de realización, dicha molécula de Fab está humanizada. En otro modo de realización más, dicha molécula de Fab comprende regiones constantes de las cadenas pesadas y ligeras humanas.
En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que son específicos para el dominio adicional B de la fibronectina (EDB). En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que pueden competir con el anticuerpo monoclonal L19 por la unión a un epítopo de EDB. Véase, p. ej., la publicación de PCT WO 2007/128563 A1.
En otro modo de realización más, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19 comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de botón, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de la IL-2. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 215 o una variante de la misma que conserva la funcionalidad. En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19 comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de ojal. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 213 o una variante de la misma que conserva la funcionalidad. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una cadena ligera de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 217 o una variante de la misma que conserva la funcionalidad. En otro modo de realización más, el inmunoconjugado comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 215 y SEQ ID NO: 217, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización específico, los polipéptidos se unen covalentemente, p. ej., por un enlace disulfuro. En algunos modos de realización, las subunidades del dominio Fc comprenden cada una las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G.
En un modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 216. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 216. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 214. En otro modo de realización específico más, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 214. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la
secuencia de la SEQ ID NO: 218. En otro modo de realización específico más, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 218.
En un modo de realización, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que son específicos para el dominio A1 de la tenascina C (TNC-A1).
En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que pueden competir con el anticuerpo monoclonal F16 por la unión a un epítopo de la TNC-A1. Véase, p. ej., la publicación de PCT w O 2007/128563 A1. En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que son específicos para el dominio A1 y/o A4 de la tenascina C (TNC-A1 o TNC-A4 o TNC-A1/A4).
En un modo de realización específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 33 o bien a SEQ ID NO: 35, o a variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 29 o bien a SEQ ID NO: 31, o a variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realización más específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 33 o bien a SEQ ID NO: 35 o a variantes de las mismas que conservan la funcionalidad, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID No : 29 o bien a SEQ ID NO: 31, o a variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena pesada de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a SEQ ID NO: 34 o bien a SEQ ID NO: 36. En otro modo de realización específico más, la secuencia de la región variable de la cadena pesada de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 34 o bien de la SEQ ID NO: 36. En otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena ligera de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a SEQ ID NO: 30 o bien a SEQ ID NO: 32. En otro modo de realización específico más, la secuencia de la región variable de la cadena ligera de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 30 o bien de la SEQ ID NO: 32.
En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de Fab específica para el dominio A1 de la tenascina C comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de botón, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de la IL-2. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de Fab específica para el dominio A1 de la tenascina C comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de ojal. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado comprende ambas secuencias polipeptídicas. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende además una cadena ligera de Fab específica para el dominio A1 de la tenascina C. En otro modo de realización específico, los polipéptidos están unidos covalentemente, p. ej., por un enlace disulfuro. En algunos modos de realización, las subunidades del dominio Fc comprenden cada una las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G.
En un modo de realización determinado, el inmunoconjugado comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que son específicos para el dominio A2 de la tenascina C (TNC-A2). En un modo de realización específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO:
167, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO:175, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 183 y SEQ ID NO: 187, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 181 y SEQ ID NO: 185, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realización más específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 183 y SEQ ID NO: 187, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 173, SEQ
ID NO: 177, SEQ ID NO: 181 y SEQ ID NO: 185, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realización determinado, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden la secuencia de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 27 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 25.
En otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena pesada de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 184 y SEQ ID NO: 188. En otro modo de realización específico más, la secuencia de la región variable de la cadena pesada de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 184 y SEQ ID NO: 188. En otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena ligera de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 182 y SEQ ID NO: 186. En otro modo de realización específico más, la secuencia de la región variable de la cadena ligera de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 182 y SEQ ID NO: 186.
En otro modo de realización más, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de Fab específica para el dominio A2 de la tenascina C comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de ojal, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de la IL-10. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 235 o de la SEQ ID NO: 237, o una variante de las mismas que conserva la funcionalidad. En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de Fab específica para el dominio A2 de la tenascina C comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de botón. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 233 o una variante de la misma que conserva la funcionalidad. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una cadena ligera de Fab específica para el dominio A2 de la tenascina C. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 239 o una variante de la misma que conserva la funcionalidad. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 235 y SEQ ID NO: 239 o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización más, el inmunoconjugado comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237 y SEQ ID NO: 239 o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización específico, los polipéptidos se unen covalentemente, p. ej., por un enlace disulfuro. En algunos modos de realización, las subunidades del dominio Fc comprenden cada una las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G.
En un modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 236 o de la SEQ ID NO: 238. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 236 o de la SEQ ID NO: 238. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 234. En otro modo de realización específico más, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 234. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 240. En otro modo de realización específico más, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 240.
En otro modo de realización más, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de Fab específica para el dominio A2 de la tenascina C comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de botón, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de la IL-2. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 285 o una variante de la misma que conserva la funcionalidad. En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de Fab específica para el dominio A2 de la tenascina C comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de ojal. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 287 o una variante de la misma que conserva la funcionalidad. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una cadena ligera de Fab
específica para el dominio A2 de la tenascina C. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado
comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 239 o una variante de la misma que conserva la funcionalidad.
En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 285,
SEQ ID NO: 287 y SEQ ID NO: 239 o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de
realización específico, los polipéptidos se unen covalentemente, p. ej., por un enlace disulfuro. En algunos modos de
realización, las subunidades del dominio Fc comprenden cada una las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y
P329G.
En un modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una
secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %
idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 286. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende
una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 286. En otro modo de
realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia
polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la
secuencia de la SEQ ID NO: 288. En otro modo de realización específico más, el inmunoconjugado comprende una
secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 288. En otro modo de
realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia
polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la
secuencia de la SEQ ID NO: 240. En otro modo de realización específico más, el inmunoconjugado comprende una
secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 240.
En un modo de realización determinado, el inmunoconjugado comprende al menos uno, típicamente dos o más restos
de unión a antígeno que son específicos para la proteína de activación de fibroblastos (FAP). En un modo de
realización específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región
variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %
o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO:
47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75,
SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103,
SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO:
131, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 151 y SEQ ID NO: 155, o
variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización específico, los restos de unión a
antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos
aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia
seleccionada del grupo que consta de: SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO:
53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 81,
SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109,
SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO:
137, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 149 y SEQ ID NO: 153, o variantes de las mismas que conservan
la funcionalidad. En un modo de realización más específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado
comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %,
85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consta de
SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO:
119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ
ID NO: 147, SEQ ID NO: 151 y SEQ ID NO: 155, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad, y una
secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %,
96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consta de: SEQ ID NO: 37,
SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 61, SEQ SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO:
121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ
ID NO: 149 y SEQ ID NO: 153, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realización
determinado, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden la secuencia de la región variable de la
cadena pesada de la SEQ ID NO: 111 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 109.
En otro modo de realización determinado, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden la
secuencia de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 143 y la secuencia de la región variable de la
cadena ligera de la SEQ ID NO: 141. En otro modo de realización determinado más, los restos de unión a antígeno del
inmunoconjugado comprenden la secuencia de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 51 y la
secuencia de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 49.
En otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena pesada de los restos de unión
a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un
80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consta de:
SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64,
SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 92,
SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 152 y SEQ ID NO: 156. En otro modo de realización específico más, la secuencia de la región variable de la cadena pesada de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consta de: SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 152 y SEQ ID NO: 156. En otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena ligera de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consta de: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 150 y SEQ ID NO: 154. En otro modo de realización específico más, la secuencia de la región variable de la cadena ligera de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consta de: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 150 y SEQ ID NO: 154.
En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de Fab específica para la FAP comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de botón, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de la IL-2. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 271 y SEQ ID NO: 273, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de Fab específica para la FAP comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de botón, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de la IL-15. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 199 o una variante de la misma que conserva la funcionalidad. En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de Fab específica para la FAP comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de ojal. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 201 y SEQ ID NO: 207, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una cadena ligera de Fab específica para la FAP. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 205 o de la SEQ ID NO: 211, o una variante de las mismas que conserva la funcionalidad. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 205, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 193 y una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 195, SEQ ID No : 197, la SEQ ID NO: 199 y SEQ ID NO: 269, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización más, el inmunoconjugado comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203 y SEQ ID NO: 205, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización más, el inmunoconjugado comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209 y SEQ ID NO: 211, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización más, el inmunoconjugado comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 193 y SEQ ID NO: 269, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización más, el inmunoconjugado comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 207 y SEQ ID NO: 271, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización más, el inmunoconjugado comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 207 y SEQ ID NO: 273, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización específico, los polipéptidos se unen covalentemente, p. ej., por un enlace disulfuro. En algunos modos de realización, las subunidades del dominio Fc comprenden cada una las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G.
En otro modo de realización más, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de Fab específica para FAP comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de ojal, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de la IL-10. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 243 o de la SEQ ID NO: 245, o una variante de las mismas que conserva la funcionalidad. En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de Fab específica para la FAP comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de botón. En un modo de realización más específico, el
inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 241 o una variante de la misma que conserva la funcionalidad. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una cadena ligera de Fab específica para la FAP. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 205 o una variante de la misma que conserva la funcionalidad. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 241 y SEQ ID NO: 243, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización más, el inmunoconjugado comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 241 y SEQ ID NO: 245, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización específico, los polipéptidos se unen covalentemente, p. ej., por un enlace disulfuro. En algunos modos de realización, las subunidades del dominio Fc comprenden cada una las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G.
En un modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 272 y SEQ ID NO: 274. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 272 y SEQ ID NO: 274. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 208 y SEQ ID NO: 242. En otro modo de realización específico más, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 208 y SEQ ID NO: 242. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 206 o de la SEQ ID NO: 212. En otro modo de realización específico más, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 206 o de la SEQ ID NO: 212.
En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que son específicos para el antígeno carcinoembrionario (ACE). En un modo de realización específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 191 o de la SEQ ID NO: 295, o una variante de las mismas que conserva la funcionalidad. En otro modo de realización específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 189 o de la SEQ ID NO: 293, o una variante de las mismas que conserva la funcionalidad. En un modo de realización específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 191, o una variante de la misma que conserva la funcionalidad, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 189, o una variante de la misma que conserva la funcionalidad. En otro modo de realización específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 295, o una variante de la misma que conserva la funcionalidad, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 293, o una variante de la misma que conserva la funcionalidad.
En otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena pesada de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 192 o de la SEQ ID NO: 296. En otro modo de realización específico más, la secuencia de la región variable de la cadena pesada de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 192 o de la SEQ ID NO: 296. En otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena ligera de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 190 o de la SEQ ID NO: 294. En otro modo de realización específico más, la secuencia de la región variable de la cadena ligera de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 190 o de la SEQ ID NO: 294.
En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de Fab específica para el ACE comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de botón, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de la IL-2. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica
seleccionada del grupo que consta de la SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 277 y SEQ ID NO: 279, o una variante de las mismas que conserva la funcionalidad. En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de Fab específica para el ACE comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de ojal. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 227 o de la SEQ ID NO: 281, o una variante de las mismas que conserva la funcionalidad. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una cadena ligera de Fab específica para el ACE. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 231 o de la SEQ ID NO: 283, o una variante de las mismas que conserva la funcionalidad. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 229 y SEQ ID NO: 231, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 281 y SEQ ID NO: 283, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281 y SEQ ID NO: 283, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 281 y SEQ ID NO: 283, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización específico, los polipéptidos se unen covalentemente, p. ej., por un enlace disulfuro. En algunos modos de realización, las cadenas polipeptídicas del dominio Fc comprenden las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G.
En un modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consta de la SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 278 y SEQ ID NO: 280. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consta de la SEQ ID NO: 230, Se Q ID NO: 276, SEQ ID NO: 278 y SEQ ID NO: 280. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 228 o de la SEQ ID NO: 282. En otro modo de realización específico más, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 228 o de la SEQ ID NO: 282. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 232 o de la SEQ ID NO: 284. En otro modo de realización específico más, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 232 o de la SEQ ID NO: 284.
En algunos modos de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que un polipéptido del resto efector comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de botón. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 247, Se Q ID NO: 249 y SEQ ID NO: 251, o una variante de las mismas que conserva la funcionalidad. En un modo de realización de este tipo, el inmunoconjugado comprende además una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de Fab específica para la FAP comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de ojal. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado comprende además una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 201 y SEQ ID NO: 207, o una variante de las mismas que conserva la funcionalidad. En otro modo de realización de este tipo, el inmunoconjugado comprende además una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de Fab específica para EDB, TNC A1, TNC A2 o ACE comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de ojal. En algunos modos de realización, las subunidades del dominio Fc comprenden cada una las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G. De acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores, el inmunoconjugado puede comprender además una cadena ligera de Fab específica para el antígeno correspondiente.
Los inmunoconjugados descritos en el presente documento incluyen aquellos que tienen secuencias que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31,33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47, 49, 51,53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71,73, 75, 77, 79, 81,83, 85, 87, 89, 91,93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191,293, 295, 193, 195, 197, 199, 201,203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241,243, 245, 247, 249, 251,269, 271,273, 275, 277, 279, 281,283, 285 y 287, incluidos los fragmentos funcionales o variantes de los mismos. La divulgación también engloba inmunoconjugados que comprenden estas secuencias con sustituciones de aminoácidos conservadoras.
Polinucleótidos
La divulgación proporciona además polinucleótidos aislados que codifican un inmunoconjugado como se describe en el presente documento o un fragmento del mismo.
Los polinucleótidos descritos en el presente documento incluyen aquellos que son al menos aproximadamente un
80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticos a las secuencias expuestas en las SEQ ID NO:
24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136,
138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 294, 296, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286 y 288, incluyendo los fragmentos
funcionales o variantes de los mismos.
Los polinucleótidos que codifican inmunoconjugados como se describe en el presente documento se pueden expresar
como un único polinucleótido que codifica el inmunoconjugado completo o como varios (p. ej., dos o más)
polinucleótidos que se expresan conjuntamente. Los polipéptidos codificados por polinucleótidos que se expresan
conjuntamente se pueden asociar, p. ej., a través de enlaces disulfuro u otros medios para formar un inmunoconjugado
funcional. Por ejemplo, la porción de la cadena ligera de un resto de unión a antígeno puede estar codificada por un
polinucleótido diferente de la porción del inmunoconjugado que comprende la porción de la cadena pesada del resto
de unión a antígeno, una subunidad del dominio Fc y opcionalmente el resto efector. Cuando se expresen
conjuntamente, los polipéptidos de la cadena pesada se asociarán con los polipéptidos de la cadena ligera para formar
el resto de unión a antígeno. En otro ejemplo, la porción del inmunoconjugado que comprende la porción de la cadena
pesada de un primer resto de unión a antígeno, una de las dos subunidades del dominio Fc y el resto efector podrían
estar codificados por un polinucleótido diferente de la porción del inmunoconjugado que comprende la porción de la
cadena pesada de un segundo resto de unión a antígeno y la otra de las dos subunidades del dominio Fc. Cuando se
expresen conjuntamente, las subunidades del dominio Fc se asociarán para formar el dominio Fc.
En un modo de realización, un polinucleótido aislado como se describe en el presente documento codifica un
fragmento de un inmunoconjugado que comprende un primer resto de unión a antígeno, un dominio Fc que consta de
dos subunidades y un solo resto efector, en el que el resto de unión a antígeno es un dominio de unión a antígeno que
comprende una región variable de la cadena y una región variable de la cadena ligera, en particular una molécula
de Fab. En un modo de realización, un polinucleótido aislado como se describe en el presente documento codifica la
cadena pesada del primer resto de unión a antígeno, una subunidad del dominio Fc y el resto efector. En otro modo de
realización, un polinucleótido aislado como se describe en el presente documento codifica la cadena pesada del primer
resto de unión a antígeno y una subunidad del dominio Fc. En otro modo de realización más, un polinucleótido aislado
como se describe en el presente documento codifica una subunidad del dominio Fc y el resto efector. En un modo de
realización más específico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una cadena pesada de Fab
comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc. En otro modo de realización
específico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una subunidad del dominio Fc comparte un
enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido del resto efector. En otro modo de realización específico más, el
polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico
carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un
polipéptido del resto efector. En otro modo de realización específico más, el polinucleótido aislado codifica un
polipéptido en el que un polipéptido del resto efector comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad
del dominio Fc.
En otro modo de realización, la presente divulgación se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un
inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una
secuencia de la región variable como se muestra en la Se Q ID NO: 23, 25, 27, 29, 31,33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47, 49,
51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109,
111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157,
159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 293 o 295. En otro modo de
realización, la presente divulgación se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un inmunoconjugado o
fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia polipeptídica
como se muestra en la SEQ ID NO: 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 227, 229, 231,
233, 235, 237, 239, 241,243, 245, 247, 249, 251,269, 271,273, 275, 277, 279, 281,283, 285 o 287. En otro modo de
realización, la divulgación se refiere además a un polinucleótido aislado que codifica un inmunoconjugado o fragmento
del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %,
90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 24, 26, 28,
30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92,
94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140,
142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188,
190, 192, 294, 296, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240,
242, 244, 246, 248, 250, 252, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286 o 288. En otro modo de realización, la
divulgación se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el
polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38,
40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100,
102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148,
150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 294, 296,
194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248,
250, 252, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286 o 288. En otro modo de realización, la divulgación se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de la región variable que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61,63, 65, 67, 69, 71,73, 75, 77, 79, 81,83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 293 o 295. En otro modo de realización, la divulgación se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia polipeptídica que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285 o 287. La divulgación engloba un polinucleótido aislado que codifica un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica las secuencias de la región variable de la SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31,33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51,53, 55, 57, 59, 61,63, 65, 67, 69, 71,73, 75, 77, 79, 81,83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 293 o 295 con sustituciones de aminoácidos conservadoras. La divulgación también engloba un polinucleótido aislado que codifica un inmunoconjugado como se describe en el presente documento, o fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 193, 195, 197, 199, 201,203, 205, 207, 209, 211,213, 215, 217, 227, 229, 231,233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 269, 271,273, 275, 277, 279, 281, 283, 285 o 287 con sustituciones de aminoácidos conservadoras.
En ciertos modos de realización, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En otros modos de realización, un polinucleótido como se describe en el presente documento es ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm). El ARN como se describe en el presente documento puede ser monocatenario o bicatenario.
Conjugados no dirigidos
La divulgación proporciona no solo inmunoconjugados dirigidos a un antígeno específico (p. ej., un antígeno tumoral) sino también conjugados no dirigidos que comprenden una o más moléculas de Fab que no se unen específicamente a ningún antígeno, en particular no se unen a ningún antígeno humano. La ausencia de unión específica de estos conjugados a ningún antígeno (es decir, la ausencia de cualquier unión que se pueda discriminar de una interacción inespecífica) puede medirse, p. ej., mediante ELISA o resonancia de plasmón superficial como se describe en el presente documento. Dichos conjugados son especialmente útiles, p. ej., para mejorar la semivida en suero del resto efector que comprenden, en comparación con la semivida en suero del resto efector no conjugado, donde no se desea el direccionamiento a un tejido determinado.
Específicamente, la divulgación proporciona un conjugado que comprende una primera molécula de Fab que no se une específicamente a ningún antígeno, un dominio Fc que consta de dos subunidades y un resto efector, en el que no está presente más de un resto efector. Más específicamente, la divulgación proporciona un conjugado que comprende una primera molécula de Fab que comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 299 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 297, un dominio Fc que consta de dos subunidades y un resto efector, en el que no está presente más de un resto efector. Al igual que los inmunoconjugados de la divulgación, los conjugados pueden tener diversas configuraciones, como se ha descrito anteriormente en "Formatos de inmunoconjugados" (el resto de unión a antígeno del inmunoconjugado se reemplaza por una molécula de Fab que no se une específicamente a ningún antígeno, como una molécula de Fab que comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 299 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 297). Del mismo modo, las características del dominio Fc, así como del resto efector como se ha descrito anteriormente en "Dominio Fc" y "Restos efectores" para los inmunoconjugados de la divulgación, se aplican igualmente, solas o en combinación, a los conjugados no dirigidos de la divulgación.
En un modo de realización determinado, el conjugado comprende (i) una molécula de inmunoglobulina, que comprende una primera y una segunda molécula de Fab que no se unen específicamente a ningún antígeno y un dominio Fc, y (ii) un resto efector, en el que no está presente más de un resto efector y en el que la molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana de la subclase IgG1; el dominio Fc comprende una modificación de botón en una de sus dos subunidades y una modificación de ojal en la otra, y las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G en cada una de sus subunidades; y el resto efector es una molécula de IL-2 fusionada al aminoácido carboxiterminal de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, opcionalmente a través de un péptido conector. En un modo de realización específico, el conjugado comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 299 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 297.
En ciertos modos de realización, el conjugado comprende (i) una molécula de inmunoglobulina, que comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 299 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 297, y (ii) un resto efector, en el que no está presente más de un resto efector. En un modo de realización de este tipo, la molécula de inmunoglobulina es una molécula de inmunoglobulina humana de la
subclase IgG1. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc comprende una modificación de botón en una de sus dos subunidades y una modificación de ojal en la otra. En un modo de realización específico de este tipo, el dominio Fc comprende las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G en cada una de sus subunidades. En otro modo de realización más de este tipo, el resto efector es una molécula de IL-2 fusionada al aminoácido carboxiterminal de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, opcionalmente a través de un péptido conector.
En un modo de realización, el conjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de Fab que no se une específicamente a ningún antígeno comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de botón, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de la IL-2. En un modo de realización más específico, el conjugado comprende una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 221, SEQ iD NO: 223, Se Q ID NO: 289 y SEQ ID NO: 291, o una variante de la misma que conserva la funcionalidad. En un modo de realización, el conjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de Fab que no se une específicamente a ningún antígeno comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de ojal. En un modo de realización más específico, el conjugado comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 219 o una variante de la misma que conserva la funcionalidad. En otro modo de realización, el conjugado comprende una cadena ligera de Fab que no se une específicamente a ningún antígeno. En un modo de realización más específico, el conjugado comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 225 o una variante de la misma que conserva la funcionalidad. En otro modo de realización, el conjugado comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 221 y SEQ ID NO: 225, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización, el conjugado comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223 y SEQ ID NO: 225, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización, el conjugado comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 289 y SEQ ID NO: 225, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización, el conjugado comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 291 y SEQ ID NO: 225, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización específico, los polipéptidos se unen covalentemente, p. ej., por un enlace disulfuro. En algunos modos de realización, las cadenas polipeptídicas del dominio Fc comprenden las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G.
En un modo de realización específico, el conjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consta de la SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 290 y SEQ ID NO: 292. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consta de la SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 290 y SEQ ID NO: 292.
La divulgación también proporciona un polinucleótido aislado que codifica el conjugado de la divulgación o un fragmento del mismo. En un modo de realización específico, el polinucleótido aislado comprende una secuencia que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 290 y SEQ ID NO: 292. La divulgación proporciona además un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado, y una célula anfitriona que comprende el polinucleótido aislado o el vector de expresión de la divulgación. En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para producir el conjugado de la divulgación, que comprende las etapas de a) cultivar la célula anfitriona de la divulgación en condiciones adecuadas para la expresión del conjugado y b) recuperar el conjugado. La divulgación también engloba un conjugado producido por el procedimiento de la divulgación. La divulgación proporcionada en el presente documento en relación con los procedimientos para producir los inmunoconjugados de la divulgación (véase, p. ej., "Procedimientos recombinantes") se puede aplicar igualmente a los conjugados de la divulgación.
La divulgación proporciona adicionalmente una composición farmacéutica que comprende el conjugado de la divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La divulgación proporcionada en el presente documento en relación con composiciones farmacéuticas de los inmunoconjugados de la divulgación (véase, p. ej., "Composiciones, formulaciones y vías de administración") puede aplicarse igualmente a los conjugados de la divulgación. Además, el conjugado puede emplearse en los procedimientos de uso descritos en el presente documento para los inmunoconjugados de la divulgación. La divulgación proporcionada en el presente documento en relación con los procedimientos de uso de los inmunoconjugados de la divulgación en el tratamiento de enfermedades (véase, p. ej., "Composiciones y procedimientos terapéuticos", "Otros agentes y tratamientos" y "Artículos de elaboración") puede aplicarse igualmente a los conjugados de la divulgación.
Procedimientos recombinantes
Los inmunoconjugados descritos en el presente documento se pueden obtener, por ejemplo, mediante síntesis de péptidos en estado sólido (p. ej., síntesis en fase sólida de Merrifield) o producción recombinante. Para la producción recombinante, uno o más polinucleótidos que codifican el inmunoconjugado (fragmento), p. ej., como se ha descrito anteriormente, se aíslan e insertan en uno o más vectores para su clonación y/o expresión adicional en una célula
anfitriona. Dicho polinucleótido se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales. En un modo de realización, se proporciona un vector, preferentemente un vector de expresión, que comprende uno o más de los polinucleótidos descritos en el presente documento. Se pueden usar procedimientos que conocen bien los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificante de un inmunoconjugado (fragmento) junto con señales de control de la transcripción/traducción apropiadas. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación/recombinación genética in vivo. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); y Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, un virus o puede ser un fragmento de ácido nucleico. El vector de expresión incluye un casete de expresión en el que el polinucleótido que codifica el inmunoconjugado (fragmento; es decir, la región codificante) se clona en asociación operativa con un promotor u otros elementos de control de transcripción y/o traducción. Como se usa en el presente documento, una "región codificante" es una porción de ácido nucleico que consta de codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón finalizador" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, se puede considerar que forma parte de una región codificante, si está presente, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo promotores, sitios de unión a ribosomas, finalizadores de la transcripción, intrones, regiones no traducidas 5' y 3' y similares, no forma parte de una región codificante. Pueden estar presentes dos o más regiones codificantes en una única construcción de polinucleótido, p. ej., en un único vector, o en construcciones de polinucleótidos diferentes, p. ej., en vectores independientes (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región codificante, o puede comprender dos o más regiones codificantes, p. ej., un vector como se describe en el presente documento puede codificar uno o más polipéptidos, que se separan de forma postraduccional o cotraduccional en las proteínas finales a través de escisión proteolítica. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico como se describe en el presente documento puede codificar regiones codificantes heterólogas, fusionadas o no fusionadas a un polinucleótido que codifica el inmunoconjugado (fragmento) descrito en el presente documento, o variantes o derivados del mismo. Las regiones codificantes heterólogas incluyen, entre otras cosas, elementos o motivos especializados, tales como un péptido señalizador secretor o un dominio funcional heterólogo. Se produce una asociación operativa cuando una región codificante para un producto génico, p. ej., un polipéptido, está asociada con una o más secuencias reguladoras de tal manera que coloca la expresión del producto génico bajo la influencia o el control de la(s) secuencia(s) reguladora(s). Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de polipéptidos y un promotor asociado a la misma) se "asocian operativamente" si la inducción de la función promotora da como resultado la transcripción del ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza del enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfiere en la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión de dirigir la expresión del producto génico ni interfiere en la capacidad de transcripción del molde de ADN. Por tanto, una región promotora se asociaría operativamente con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor pudiera efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor con especificidad celular que dirige una transcripción considerable del ADN solo en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo potenciadores, operadores, represores y señales de finalización de la transcripción, se pueden asociar operativamente con el polinucleótido para dirigir la transcripción con especificidad celular. En el presente documento se divulgan promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción. Los expertos en la técnica conocen diversas regiones de control de la transcripción. Estas incluyen, entre otras, regiones de control de la transcripción que funcionan en células de vertebrados, tales como, entre otras, segmentos promotores y estimuladores de citomegalovirus (p. ej., el activador temprano inmediato, junto con el intrón A), el virus 40 símico (p. ej., el activador temprano) y retrovirus (tales como, p. ej., el virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de la transcripción incluyen las derivadas de genes de vertebrados tales como actina, proteína de choque térmico, hormona del crecimiento bovina y a-globina de conejo, así como otras secuencias que pueden controlar la expresión génica en células eucariotas. Otras regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y estimuladores específicos de tejido, así como promotores inducibles (p. ej., promotores inducibles por tetraciclinas). De manera similar, los expertos normales en la técnica conocen diversos elementos de control de la traducción. Estos incluyen, entre otros, sitios de unión a ribosomas, codones de inicio y finalización de la traducción y elementos derivados de sistemas víricos (en particular un sitio interno de entrada al ribosoma o IRES, también denominado secuencia CITE). El casete de expresión también puede incluir otros elementos tales como un origen de replicación, y/o elementos de integración cromosómica tales como repeticiones terminales largas (RTL) retrovíricas, o repeticiones terminales invertidas (RTI) víricas adenoasociadas (VAA).
Las regiones codificantes de polinucleótidos y ácidos nucleicos como se describe en el presente documento se pueden asociar a regiones codificantes adicionales que codifican péptidos secretores o señalizadores, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido como se describe en el presente documento. Por ejemplo, si se desea la secreción del inmunoconjugado, se puede colocar el ADN que codifica una secuencia señalizadora en dirección 5' del ácido nucleico que codifica un inmunoconjugado como se describe en el presente documento o un fragmento del mismo. De acuerdo con la hipótesis de la señal, las proteínas segregadas por células de mamífero tienen un péptido señalizador o secuencia líder secretora que se escinde de la proteína terminada una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de proteína en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. Los expertos normales en la técnica saben que los polipéptidos segregados por células de vertebrados en general tienen un péptido señalizador fusionado al extremo N del polipéptido, que se escinde del polipéptido traducido para producir una forma segregada o "terminada" del polipéptido. En ciertos modos de realización se usa el péptido señalizador natural, p. ej., un péptido señalizador de la cadena pesada o de la cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado
funcional de esa secuencia que conserva la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido que está operativamente asociado a él. De forma alternativa, se puede usar un péptido señalizador heterólogo de mamífero, o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia líder natural se puede sustituir por la secuencia líder del activador del plasminógeno tisular (APT) humano o de la p-glucuronidasa de ratón. En SEQ ID NO: 8-16 se muestran ejemplos de secuencias de aminoácidos y de los polinucleótidos correspondientes de péptidos señalizadores secretores.
El ADN que codifica una secuencia proteica corta que se podría usar para facilitar la purificación posterior (p. ej., un marcador de histidina) o ayudar a marcar el inmunoconjugado se puede incluir dentro del polinucleótido que codifica el inmunoconjugado (fragmento) o en sus extremos.
En un modo de realización adicional, se proporciona una célula anfitriona que comprende uno o más polinucleótidos como se describe en el presente documento. En ciertos modos de realización, se proporciona una célula anfitriona que comprende uno o más vectores como se describe en el presente documento. Los polinucleótidos y vectores pueden incorporar cualquiera de los elementos, individualmente o en combinación, descritos en el presente documento en relación con polinucleótidos y vectores, respectivamente. En un modo de realización de este tipo, una célula anfitriona comprende (p. ej., se ha transformado o transfectado con) un vector que comprende un polinucleótido que codifica (parte de) un inmunoconjugado como se describe en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el término "célula anfitriona" se refiere a cualquier tipo de sistema celular que se puede genomanipular para generar los inmunoconjugados descritos en el presente documento o fragmentos de los mismos. Las células anfitrionas adecuadas para replicar y para soportar la expresión de inmunoconjugados se conocen bien en la técnica. Dichas células se pueden transfectar o transducir según sea apropiado con el vector de expresión concreto y se pueden cultivar grandes cantidades de células que contienen vectores para sembrar fermentadores a gran escala para obtener cantidades suficientes de los inmunoconjugados para aplicaciones clínicas. Las células anfitrionas adecuadas incluyen microorganismos procariotas, tales como E. coli, o diversas células eucariotas, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto o similares. Por ejemplo, se pueden producir polipéptidos en bacterias, en especial cuando no se necesita glucosilación. Después de la expresión, se puede aislar el polipéptido a partir de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente. Además de los procariotas, ciertos microbios eucariotas tales como los hongos filamentosos o las levaduras son anfitriones de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican polipéptidos, incluyendo cepas de hongos y levaduras en los que las vías de glucosilación se han "humanizado", lo que da como resultado la producción de un polipéptido con un patrón de glucosilación parcial o totalmente humano. Véase Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), y Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). Las células anfitrionas adecuadas para la expresión de polipéptidos (glucosilados) también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Entre los ejemplos de células de invertebrado figuran células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar conjuntamente con células de insectos, en especial para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como anfitriones. Véase, p. ej., las patentes de EE. UU. n.° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas). También se pueden usar células de vertebrados como anfitriones. Por ejemplo, pueden ser útiles estirpes celulares de mamíferos que se adaptan para crecer en suspensión. Otros ejemplos de estirpes celulares anfitrionas de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7), la línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293T como se describe, p. ej., en Graham et al., J Gen Virol 36, 59 [1977]), las células de riñón de cría de hámster (BHK), las células de Sertoli de ratón (linfocitos TM4 como se describe, p. ej., en Mather, Biol Reprod 23, 243-251 [1980]), las células de riñón de mono (CV1), las células de riñón de mono verde africano (VERO-76), las células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA), las células de riñón canino (MDCK), las células de hígado de rata búfalo (BRL 3A), las células de pulmón humano (W138), las células hepáticas humanas (Hep G2), las células de tumor mamario de ratón (MMT 060562), los linfocitos TRI (como se describe, p. ej., en Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 [1982]), las células MRC 5 y las células FS4. Otras estirpes celulares anfitrionas de mamíferos útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluso células CHO dhfr- (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 [1980]) y estirpes celulares de mieloma tales como YO, NS0, P3X63 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas estirpes celulares anfitrionas de mamíferos adecuadas para la producción de proteínas, véase, p. ej., Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003). Las células anfitrionas incluyen células cultivadas, p. ej., células cultivadas de mamífero, células de levadura, células de insecto, células bacterianas y células vegetales, por citar solo algunas, pero también células comprendidas en un animal transgénico, vegetal transgénico o tejido animal o vegetal cultivado. En un modo de realización, la célula anfitriona es una célula eucariota, preferentemente una célula de mamífero, tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de riñón embrionario humano (REH) o una célula linfoide (p. ej., célula Y0, NS0, Sp20). En la técnica se conocen tecnologías convencionales para expresar genes exógenos en estos sistemas. Las células que expresan un polipéptido que comprende la cadena pesada o la cadena ligera de un dominio de unión a antígeno tal como un anticuerpo se pueden genomanipular para expresar también la otra cadena del anticuerpo, de manera que el producto expresado sea un anticuerpo que tiene tanto una cadena pesada como una ligera.
En un modo de realización, se proporciona un procedimiento para producir un inmunoconjugado como se describe en el presente documento, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula anfitriona que comprende un polinucleótido que codifica el inmunoconjugado, como se proporciona en el presente documento, en condiciones
adecuadas para la expresión del inmunoconjugado, y recuperar el inmunoconjugado de la célula anfitriona (o del medio de cultivo de células anfitrionas).
Los componentes del inmunoconjugado están genéticamente fusionados entre sí. El inmunoconjugado se puede diseñar de manera que sus componentes se fusionen directamente entre sí o indirectamente a través de una secuencia conectora. La composición y longitud del conector se pueden determinar de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica y se pueden someter a prueba para determinar su eficacia. Ejemplos de secuencias conectoras entre el resto efector y el dominio Fc se encuentran en las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 195, 197, 199, 203, 209, 215, 229, 235, 237, 243, 245, 247, 249, 251, 269, 271, 273, 275, 277, 279 y 285. Si se desea, también se pueden incluir secuencias adicionales para incorporar un sitio de escisión para separar los componentes individuales de la fusión, por ejemplo una secuencia de reconocimiento de endopeptidasas.
En ciertos modos de realización, uno o más restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden al menos una región variable del anticuerpo que se puede unir a un determinante antigénico. Las regiones variables pueden formar parte de anticuerpos naturales o no naturales y fragmentos de los mismos, y derivarse de los mismos. Los procedimientos para producir anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica (véase, p. ej. Harlow y Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Los anticuerpos no naturales se pueden construir usando síntesis de péptidos en fase sólida, se pueden producir de manera recombinante (p. ej., como se describe en la patente de e E. UU. n.° 4.186.567) o se pueden obtener, por ejemplo, cribando colecciones combinatorias que comprenden cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables (véase, p. ej., la patente de EE. UU. n.° 5.969.108 concedida a McCafferty). Los restos de unión a antígeno y procedimientos para producir los mismos también se describen con detalle en la publicación de PCT n.° WO 2011/020783.
Se puede usar cualquier especie animal de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, dominio de unión a antígeno o región variable en los inmunoconjugados descritos en el presente documento. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, dominios de unión a antígeno o regiones variables, sin limitación, útiles en el presente documento pueden ser de origen murino, de primates o humano. Si el inmunoconjugado está destinado para uso humano, se puede usar una forma quimérica de anticuerpo en la que las regiones constantes del anticuerpo procedan de un ser humano. También se puede preparar una forma humanizada o totalmente humana del anticuerpo de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., la patente de EE. UU. n.° 5.565.332 concedida a Winter). La humanización se puede lograr mediante diversos procedimientos que incluyen, entre otros (a) injertar las RDC no humanas (p. ej., anticuerpos donantes) en regiones estructurales y constantes humanas (p. ej., anticuerpos receptores) con o sin conservación de residuos estructurales críticos (p. ej., los que son importantes para conservar buenas funciones de afinidad de unión a antígeno o de anticuerpos), (b) injertar solo las regiones determinantes de la especificidad (SDR o a-RDC; los residuos críticos para la interacción anticuerpo-antígeno) no humanas en regiones estructurales y constantes humanas, o (c) trasplantar los dominios variables no humanos completos, pero "enmascararlos" con una sección humanoide mediante el reemplazo de residuos superficiales. Los anticuerpos humanizados y procedimientos para prepararlos se revisan, p. ej., en Almagro y Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), y se describen además, p. ej., en Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); patentes de EE. UU. n.° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005; que describen un injerto de SDR [a-RDC]); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991; que describe el "rebamizado"); Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005; que describen el "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) y Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000; que describen el enfoque de "selección guiada" al reordenamiento de FR). Se pueden producir anticuerpos humanos y regiones variables humanas usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen en general en van Dijk y van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) y Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Las regiones variables humanas pueden formar parte de anticuerpos monoclonales humanos preparados por el procedimiento de hibridoma y derivarse de los mismos (véase, p. ej., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.
51-63 [Marcel Dekker, Inc., New York, 1987]). También se pueden preparar anticuerpos humanos y regiones variables humanas administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos inalterados o anticuerpos inalterados con regiones variables humanas en respuesta a la exposición antigénica (véase, p. ej., Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 [2005]). También se pueden generar anticuerpos humanos y regiones variables humanas aislando secuencias de la región variable del clon Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de seres humanos (véase, p. ej., Hoogenboom et al., en Methods in Molecular Biology 178, 1-37 [O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001] y McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 [1991]). Típicamente, los fagos presentan fragmentos de anticuerpo, bien como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab. Puede hallarse una descripción detallada de la preparación de restos de unión a antígeno para inmunoconjugados por presentación en fagos en los ejemplos adjuntos a la publicación de PCT n.° WO 2011/020783.
En ciertos modos de realización, los restos de unión a antígeno útiles en el presente documento están genomanipulados para que tengan una afinidad de unión potenciada de acuerdo, por ejemplo, con los procedimientos divulgados en la publicación de PCT n.° WO 2011/020783 (véase los ejemplos relativos a maduración por afinidad) o la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0132066. Se puede medir la capacidad del inmunoconjugado
descrito en el presente documento para unirse a un determinante antigénico específico a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien por otras técnicas conocidas para un experto en la técnica, p. ej., la técnica de resonancia de plasmón superficial (analizada en un sistema BIACORE T100; Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 [2000]), y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 [2002]). Se pueden usar ensayos de competencia para identificar un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, dominio de unión a antígeno o dominio variable que compite con un anticuerpo de referencia por la unión a un antígeno determinado, p. ej., un anticuerpo que compite con el anticuerpo L19 por la unión al dominio adicional B de la fibronectina (EDB). En ciertos modos de realización, un anticuerpo competidor de este tipo se une al mismo epítopo (p. ej., un epítopo lineal o conformacional) al que se une el anticuerpo de referencia. Se proporcionan ejemplos detallados de procedimientos para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo en Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols”, en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). En un ejemplo de ensayo de competencia, se incuba un antígeno inmovilizado (p. ej., EDB) en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une al antígeno (p. ej., anticuerpo L19) y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a prueba para determinar su capacidad para competir con el primer anticuerpo por la unión al antígeno. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba el antígeno inmovilizado en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo al antígeno, se retira el exceso de anticuerpo no unido, y se mide la cantidad de marcador asociada con el antígeno inmovilizado. Si la cantidad de marcador asociado con el antígeno inmovilizado se reduce sustancialmente en la muestra de prueba con relación a la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por la unión al antígeno. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Los inmunoconjugados preparados como se describe en el presente documento se pueden purificar mediante técnicas conocidas en la técnica tales como cromatografía de líquidos de alto rendimiento, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño y similares. Las condiciones reales usadas para purificar una proteína determinada dependerán, en parte, de factores tales como carga neta, hidrofobia, hidrofilia, etc., y serán evidentes para los expertos en la técnica. Para la purificación por cromatografía de afinidad se puede usar un anticuerpo, ligando, receptor o antígeno al que se une el inmunoconjugado. Por ejemplo, para la purificación por cromatografía de afinidad de inmunoconjugados como los descritos en el presente documento se puede usar una matriz de proteína A o proteína G. Se pueden usar cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de afinidad de proteína A o G secuenciales para aislar un inmunoconjugado esencialmente como se describe en los ejemplos. La pureza del inmunoconjugado se puede determinar mediante cualquiera de diversos procedimientos analíticos bien conocidos que incluyen electroforesis en gel, cromatografía líquida de alta presión y similares. Por ejemplo, se demostró que las proteínas de fusión de la cadena pesada expresadas como se describe en los ejemplos estaban intactas y debidamente ensambladas como se demostró por SDS-PAGE reductora (véase p. ej., la figura 4). Se resolvieron tres bandas a unos 25.000 Mr, 50.000 Mr y 60.000 Mr, correspondientes a los pesos moleculares previstos de la cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina y de la proteína de fusión de la cadena pesada/resto efector.
Ensayos
Los inmunoconjugados proporcionados en el presente documento se pueden identificar, cribar o caracterizar para determinar sus propiedades físicas/químicas y/o su actividad biológica mediante diversos ensayos conocidos en la técnica.
Ensayos de afinidad
La afinidad del inmunoconjugado por un receptor del resto efector (p. ej. IL-10R o diversas formas de IL-2R), un receptor Fc o un antígeno destinatario se puede determinar de acuerdo con los procedimientos expuestos en los ejemplos mediante resonancia de plasmón superficial (SPR), usando instrumentación habitual tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare) y receptores o proteínas destinatarias tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. De forma alternativa, la unión de inmunoconjugados para diferentes receptores o antígenos destinatarios se puede evaluar usando estirpes celulares que expresan el receptor o el antígeno destinatario concreto, por ejemplo mediante citometría de flujo (FACS). Se describe a continuación y en los ejemplos siguientes un ejemplo ilustrativo de un modo de realización específico para medir la afinidad de unión.
De acuerdo con un modo de realización, KD se mide por resonancia de plasmón superficial usando un aparato BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25 °C con el ligando (p. ej., receptor del resto efector, receptor Fc o antígeno destinatario) inmovilizado en chips CM5. En resumen, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, GE Healthcare) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El ligando recombinante se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 5,5, a 0,5-30 pg/ml antes de la inyección a una caudal de 10 pl/minuto para lograr unas 100-5000 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del ligando, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie de tres a cinco veces del inmunoconjugado (intervalo entre ~0,01 nM y 300 nM) en HBS-EP+ (GE Healthcare, HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %, pH 7,4) a 25 °C a un caudal de unos 30-50 pl/min. Se calculan las
velocidades de asociación (kas) y velocidades de disociación (kd¡s) usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno sencillo (programa informático de evaluación BIACORE ® T100 versión 1.1.1) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proporción kdis/kas. Véase, p. ej., Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999).
Ensayos de actividad
La actividad biológica de los inmunoconjugados descritos en el presente documento puede medirse mediante diversos ensayos como se describe en los ejemplos. Las actividades biológicas pueden incluir, por ejemplo, la inducción de la proliferación de células portadoras del receptor del resto efector, la inducción de la señalización en las células portadoras del receptor del resto efector, la inducción de la secreción de citocinas por parte de las células portadoras del receptor del resto efector, y la inducción de la regresión tumoral y/o la mejora de la supervivencia.
Composiciones, formulaciones y vías de administración
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los inmunoconjugados proporcionados en el presente documento, p. ej., para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos indicados a continuación. En un modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de los inmunoconjugados proporcionados en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de los inmunoconjugados proporcionados en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, p. ej., como se describe a continuación.
También se proporciona un procedimiento de producción de un inmunoconjugado como se describe en el presente documento en una forma adecuada para su administración in vivo, el cual procedimiento comprende (a) obtener un inmunoconjugado como se describe en el presente documento, y (b) formular el inmunoconjugado con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, por el que se formula un preparado de inmunoconjugado para su administración in vivo.
Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más inmunoconjugados disueltos o dispersados en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las frases "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refieren a entidades moleculares y composiciones que en general no son tóxicas para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, es decir, no producen reacciones adversas, alérgicas u otros efectos indeseables cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según corresponda. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos un inmunoconjugado y opcionalmente un principio activo adicional será conocida por los expertos en la técnica a la vista de la presente divulgación, como se demuestra en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990. Además, para administración animal (p. ej., humana), se entenderá que los preparados deben cumplir las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza como exige la Oficina de Normas Biológicas de la FDA o las autoridades correspondientes en otros países. Las composiciones preferentes son formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, amortiguadores, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (p. ej., antibacterianos, antifúngicos), isotónicos, retardantes de la absorción, sales, proteínas, fármacos, estabilizadores de fármacos, polímeros, geles, aglutinantes, excipientes, disgregantes, lubricantes, edulcorantes, saborizantes, colorantes, materiales similares y combinaciones de los mismos, como conocerá un experto normal en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329). Excepto en la medida en que cualquier vehículo convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.
La composición puede comprender diferentes tipos de vehículos en función de si se va a administrar en forma sólida, líquida o aerosol, y si es necesario que sea estéril para vías de administración tales como la inyección. Se pueden administrar inmunoconjugados como se describe en el presente documento (y cualquier agente terapéutico adicional) por vía intravenosa, intradérmica, intrarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intrarticular, intraprostática, intraesplénica, intrarrenal, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarrectal, intratumoral, intramuscular, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosal, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, local, por inhalación (p. ej., inhalación por aerosol), inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada con baño directo de células destinatarias, por medio de un catéter, por medio de un lavado, en cremas, en composiciones lipídicas (p. ej., liposomas), o por otro procedimiento o cualquier combinación de los anteriores como conocerá un experto normal en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990). La administración parenteral, en particular la inyección intravenosa, se usa con más frecuencia para administrar moléculas polipeptídicas tales como los inmunoconjugados descritos en el presente documento.
Las composiciones parenterales incluyen las diseñadas para su administración por inyección, p. ej., inyección subcutánea, intradérmica, intralesional, intravenosa, intrarterial, intramuscular, intratecal o intraperitoneal. Para inyección, los inmunoconjugados descritos en el presente documento se pueden formular en soluciones acuosas,
preferentemente en amortiguadores fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer o solución salina fisiológica amortiguada. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. De forma alternativa, los inmunoconjugados pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, p. ej., agua apirógena estéril, antes de su uso. Se preparan soluciones inyectables estériles incorporando los inmunoconjugados descritos en el presente documento en la cantidad necesaria en el disolvente apropiado con varios de los demás ingredientes enumerados a continuación, según sea necesario. Se puede lograr fácilmente la esterilidad, p. ej., por filtración a través de membranas de filtración estériles. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los demás ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones, suspensiones o emulsiones inyectables estériles, los procedimientos preferentes de preparación son técnicas de secado al vacío o liofilización que proporcionan un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de un medio líquido previamente filtrado estéril del mismo. Se debe amortiguar adecuadamente el medio líquido si es necesario y volver isotónico primero el diluyente líquido antes de la inyección con solución salina o glucosa suficiente. La composición debe ser estable en las condiciones de elaboración y almacenamiento, y conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación por endotoxinas se debe minimizar hasta un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, entre otros: amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de unos 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (p. ej., complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Las suspensiones acuosas inyectables pueden contener compuestos que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, dextrano, o similares. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones oleosas inyectables apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleatos de etilo o triglicéridos, o liposomas.
Los ingredientes activos se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences (18.a ed. Mack Printing Company, 1990). Se pueden preparar preparados de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparados de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. En determinados modos de realización, se puede conseguir una absorción prolongada de una composición inyectable mediante el uso en las composiciones de retardantes de la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.
Además de las composiciones descritas anteriormente, los inmunoconjugados también se pueden formular como un preparado de liberación lenta. Dichas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por tanto, por ejemplo, los inmunoconjugados se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden los inmunoconjugados descritos en el presente documento se pueden elaborar mediante procedimientos convencionales de mezcla, disolución, emulsión, encapsulación, compresión o liofilización. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o coadyuvantes fisiológicamente aceptables que facilitan el procesamiento de las proteínas para formar preparados que se pueden usar farmacéuticamente. La formulación adecuada depende de la vía de administración elegida.
Los inmunoconjugados se pueden formular en una composición en forma de ácido o base libre, neutra o sal. Las sales farmacéuticamente aceptables son sales que conservan sustancialmente la actividad biológica del ácido o base libre. Estas incluyen las sales de adición de ácido, p. ej., las formadas con los grupos amino libres de una composición proteica, o que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. También se pueden derivar sales formadas con los grupos carboxilo libres de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o
hierro; o bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en disolventes acuosos y otros disolventes próticos que las correspondientes formas de base libre.
Composiciones y procedimientos terapéuticos
Cualquiera de los inmunoconjugados proporcionados en el presente documento se puede usar en procedimientos terapéuticos. Los inmunoconjugados como se describe en el presente documento se pueden usar como agentes inmunoterápicos, por ejemplo, en el tratamiento de cánceres.
Para su uso en procedimientos terapéuticos, los inmunoconjugados descritos en el presente documento se formularían, dosificarían y administrarían de forma compatible con la buena práctica médica. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno concreto que se está tratando, el mamífero concreto que se está tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el lugar de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración, y otros factores conocidos por los médicos.
En un aspecto, se proporcionan inmunoconjugados como los descritos en el presente documento para su uso como medicamento. En otros aspectos, se proporcionan inmunoconjugados como los descritos en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En ciertos modos de realización, se proporcionan inmunoconjugados como los descritos en el presente documento para su uso en un procedimiento de tratamiento. En un modo de realización se proporciona un inmunoconjugado como los descritos en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesita. En ciertos modos de realización se proporciona un inmunoconjugado como los descritos en el presente documento para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad, lo que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz del inmunoconjugado. En ciertos modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización determinado, la enfermedad es cáncer. En otros modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno inflamatorio. En ciertos modos de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, p. ej., un antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es un mamífero, preferentemente un ser humano.
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona el uso de un inmunoconjugado como se describe en el presente documento en la elaboración o preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesita. En un modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad que comprende administrar a un individuo que tiene la enfermedad una cantidad terapéuticamente eficaz del medicamento. En ciertos modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización determinado, la enfermedad es cáncer. En otros modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno inflamatorio. En un modo de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, p. ej., un antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano.
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad en un individuo que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un inmunoconjugado como se describe en el presente documento. En un modo de realización se administra una composición a dicho individuo, que comprende un inmunoconjugado como se describe en el presente documento en una forma farmacéuticamente aceptable. En ciertos modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización determinado, la enfermedad es cáncer. En otros modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno inflamatorio. En ciertos modos de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, p. ej., un antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano.
En ciertos modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo, en particular cáncer. Los ejemplos de cánceres incluyen entre otros cáncer de vejiga, cáncer cerebral, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer uterino, cáncer del cuello uterino, cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de próstata, neoplasia hemática, cáncer de piel, carcinoma espinocelular, cáncer de huesos y cáncer de riñón. Otros trastornos de proliferación celular que se pueden tratar usando un inmunoconjugado como se describe en el presente documento incluyen, entre otros, neoplasias localizadas en: abdomen, hueso, mama, aparato digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenales, paratiroideas, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroides), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pelvis, piel, tejidos blandos, bazo, región torácica y aparato genitourinario. También se incluyen afecciones o lesiones precancerosas y metástasis de cáncer. En ciertos modos de realización, el cáncer se elige del grupo que consta de cáncer de células renales, cáncer de piel, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer cerebral, cáncer de cabeza y cuello. En algunos modos de realización, en particular cuando el resto efector del inmunoconjugado es IL-10, la enfermedad a tratar es un trastorno
inflamatorio. Los ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen, entre otros, la artritis reumatoide, la psoriasis o la enfermedad de Crohn. Un experto en la técnica reconoce fácilmente que en muchos casos puede ser que los inmunoconjugados no proporcionen una curación sino que solo proporcionen un beneficio parcial. En algunos modos de realización, un cambio fisiológico que tiene algún beneficio también se considera terapéuticamente beneficioso. Por tanto, en algunos modos de realización, una cantidad de inmunoconjugado que proporciona un cambio fisiológico se considera una "cantidad eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz". El sujeto, paciente o individuo que necesita tratamiento es típicamente un mamífero, más específicamente un ser humano.
Los inmunoconjugados descritos en el presente documento también son útiles como reactivos de diagnóstico. La unión de un inmunoconjugado a un determinante antigénico se puede detectar fácilmente usando un anticuerpo secundario específico para el resto efector. En un modo de realización, el anticuerpo secundario y el inmunoconjugado facilitan la detección de la unión del inmunoconjugado a un determinante antigénico situado en la superficie de una célula o tejido.
En algunos modos de realización, se administra una cantidad eficaz de un inmunoconjugado como los descritos en el presente documento a una célula. En otros modos de realización, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un inmunoconjugado como los descritos en el presente documento a un individuo para el tratamiento de la enfermedad.
Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación adecuada de un inmunoconjugado como los descritos en el presente documento (cuando se usa solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, la vía de administración, el peso corporal del paciente, el tipo de inmunoconjugado, la gravedad y evolución de la enfermedad, si el inmunoconjugado se administra con fines preventivos o terapéuticos, intervenciones terapéuticas anteriores o coincidentes, antecedentes del paciente y respuesta al inmunoconjugado, y el criterio del facultativo. El profesional responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la concentración del/de los principio(s) activo(s) en una composición y la(s) dosis adecuada(s) para el sujeto individual. En el presente documento se contemplan diversas pautas de dosificación que incluyen, entre otras, administraciones individuales o múltiples durante diversos momentos, administración intravenosa rápida e infusión pulsada.
El inmunoconjugado se administra de forma adecuada al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. En función del tipo y de la gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 pg/kg a 15 mg/kg (p. ej., 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de inmunoconjugado puede ser una dosis inicial candidata para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica podría oscilar desde aproximadamente 1 pg/kg hasta 100 mg/kg o más, en función de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, en función de la afección, el tratamiento se mantendrá en general hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosificación ilustrativa del inmunoconjugado estaría en el intervalo de unos 0,005 mg/kg a unos 10 mg/kg. En otros ejemplos, una dosis también puede comprender, entre otros, desde aproximadamente 1 pg/kg de peso corporal, unos 5 pg/kg de peso corporal, unos 10 pg/kg de peso corporal, unos 50 pg/kg de peso corporal, unos 100 pg/kg de peso corporal, unos 200 pg/kg de peso corporal, unos 350 pg/kg de peso corporal, unos 500 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, unos 5 mg/kg de peso corporal, unos 10 mg/kg de peso corporal, unos 50 mg/kg de peso corporal, unos 100 mg/kg de peso corporal, unos 200 mg/kg de peso corporal, unos 350 mg/kg de peso corporal, unos 500 mg/kg de peso corporal, hasta unos 1000 mg/kg de peso corporal o más por administración, y cualquier intervalo derivable de los mismos. En ejemplos, entre otros, de un intervalo derivable de los números enumerados en el presente documento, basándose los números descritos anteriormente se puede administrar un intervalo de unos 5 mg/kg de peso corporal a unos 100 mg/kg de peso corporal, unos 5 pg/kg de peso corporal a unos 500 mg/kg de peso corporal, etc. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de unos 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, p. ej., cada semana o cada tres semanas (p. ej., de modo que el paciente reciba de unas dos a unas veinte, o p. ej., unas seis dosis del inmunoconjugado). Se puede administrar una dosis de carga inicial mayor, seguida de una o más dosis menores. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas de dosificación. La evolución de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.
Los inmunoconjugados descritos en el presente documento se usarán en general en una cantidad eficaz para lograr el fin propuesto. Para su uso para tratar o prevenir un estado de enfermedad, los inmunoconjugados descritos en el presente documento, o composiciones farmacéuticas de los mismos, se administran o se aplican en una cantidad terapéuticamente eficaz. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, en especial en vista de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.
Para la administración sistémica, se puede estimar inicialmente una dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayos in vitro, tales como ensayos de cultivo celular. A continuación se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en circulación que incluya la CI50 como se determina en cultivo celular. Se puede usar dicha información para determinar con más exactitud dosis útiles en seres humanos.
Las dosificaciones iniciales también se pueden estimar a partir de datos in vivo, p. ej., modelos animales, usando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Un experto normal en la técnica podrá optimizar fácilmente la administración en seres humanos basándose en datos de animales.
Se pueden ajustar individualmente la cantidad e intervalo de dosificación para proporcionar niveles plasmáticos de los inmunoconjugados que sean suficientes para mantener el efecto terapéutico. Las dosificaciones de paciente habituales para administración por inyección varían desde unos 0,1 hasta 50 mg/kg/día, típicamente desde unos 0,5 hasta 1 mg/kg/día. Se pueden lograr niveles plasmáticos terapéuticamente eficaces administrando dosis múltiples cada día. Los niveles en plasma se pueden determinar, por ejemplo, por HPLC.
En los casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz de los inmunoconjugados puede no estar relacionada con la concentración plasmática. Un experto en la técnica podrá optimizar dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin excesiva experimentación.
Una dosis terapéuticamente eficaz de los inmunoconjugados descritos en el presente documento proporcionará en general beneficio terapéutico sin provocar toxicidad sustancial. La toxicidad y la eficacia terapéutica de un inmunoconjugado se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos habituales en cultivos celulares o animales experimentales. Se pueden usar ensayos de cultivo celular y estudios en animales para determinar la DL50 (la dosis letal para un 50 % de una población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en un 50 % de una población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, que se puede expresar como la proporción DL50/DE50. Los inmunoconjugados que presentan índices terapéuticos grandes son preferentes. En un modo de realización, el inmunoconjugado descrito en el presente documento presenta un índice terapéutico alto. Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificaciones adecuado para su uso en seres humanos. Preferentemente, la dosificación se encuentra dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo en función de diversos factores, p. ej., la forma de dosificación empleada, la vía de administración utilizada, la afección del sujeto y similares. El médico individual puede elegir la formulación exacta, la vía de administración y la dosificación a la vista del estado del paciente (véase, p. ej., Fingl et al., 1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics, cap. 1, p. 1).
El médico especialista para pacientes tratados con inmunoconjugados como los descritos en el presente documento sabrá cómo y cuándo finalizar, interrumpir o ajustar la administración debido a la toxicidad, disfunción orgánica y similares. A la inversa, el médico especialista también sabrá ajustar el tratamiento a niveles mayores si la respuesta clínica no fuera adecuada (excluyendo la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el abordaje del trastorno de interés variará con la gravedad de la afección que se va a tratar, con la vía de administración y similares. La gravedad de la afección, por ejemplo, se puede evaluar, en parte, por procedimientos de evaluación de pronóstico convencionales. Además, la dosis y quizás la frecuencia de administración también variarán de acuerdo con la edad, peso corporal y respuesta del paciente individual.
Otros agentes y tratamientos
Los inmunoconjugados descritos en el presente documento se pueden administrar en combinación con uno o más agentes adicionales en el tratamiento. Por ejemplo, un inmunoconjugado como los descritos en el presente documento se puede coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional. El término "agente terapéutico" engloba cualquier agente administrado para tratar un síntoma o enfermedad en un individuo que necesita dicho tratamiento. Dicho agente terapéutico adicional puede comprender cualquier principio activo adecuado para la indicación concreta que se está tratando, preferentemente los que tienen actividades complementarias que no se afectan entre sí de manera adversa. En ciertos modos de realización, un agente terapéutico adicional es un inmunomodulador, un citostático, un inhibidor de la adhesión celular, un citotóxico, un activador de la apoptosis celular o un agente que incrementa la sensibilidad de las células a los inductores apoptóticos. En un modo de realización determinado, el agente terapéutico adicional es un antineoplásico, por ejemplo, un alterador de los microtúbulos, un antimetabolito, un inhibidor de las topoisomerasas, un intercalador de ADN, un alquilante, un tratamiento hormonal, un inhibidor de las cinasas, un antagonista de receptores, un activador de la apoptosis de células tumorales, o un antiangiogénico.
Dichos agentes adicionales están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para los fines propuestos. La cantidad eficaz de dichos agentes adicionales depende de la cantidad de inmunoconjugado usada, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores analizados anteriormente. Los inmunoconjugados se usan, en general, en las mismas dosificaciones y por las vías de administración que se describen en el presente documento, o aproximadamente desde un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y mediante cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que sea adecuada.
Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (en la que se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones separadas) y la administración separada, en cuyo caso la administración del inmunoconjugado puede tener lugar antes, simultáneamente y/o después de la administración del agente terapéutico y/o adyuvante adicional. También se pueden usar inmunoconjugados como los descritos en el presente documento en combinación con radioterapia.
Artículos de elaboración
En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un artículo de elaboración que contiene materiales útiles para el tratamiento, la prevención y/o el diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de elaboración comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto en el recipiente o asociado con el mismo. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas con solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar de distintos materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz por sí misma o combinada con otra composición para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa con solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja para inyección hipodérmica). Al menos un agente activo de la composición es un inmunoconjugado como los descritos en el presente documento. La ficha técnica o prospecto indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Es más, el artículo de elaboración puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un inmunoconjugado como los descritos en el presente documento; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende otro agente citotóxico o de otro modo terapéutico. El artículo de elaboración en este modo de realización de la divulgación puede comprender además un prospecto que indica que las composiciones se pueden usar para tratar una afección determinada. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de elaboración puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprenda un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática inyectable (BWFI), solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.
Ejemplos
Ejemplo 1
Procedimientos generales
Técnicas de ADN recombinante
Se usaron procedimientos convencionales para manipular ADN como se describe en Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se ofrece información general sobre las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas humanas en: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta ed., publicación de los NIH n.° 91-3242.
Secuenciación de ADN
Se determinaron secuencias de ADN por secuenciación de doble hebra.
Síntesis génica
Se generaron segmentos de genes deseados, cuando fue necesario, por RCP usando moldes apropiados o bien los sintetizó Geneart AG (Regensburg, Alemania) a partir de oligonucleótidos sintéticos y productos de RCP por síntesis génica automatizada. En los casos donde no estaba disponible ninguna secuencia génica exacta, se diseñaron cebadores oligonucleotídicos basados en las secuencias de los homólogos más cercanos y se aislaron los genes por RCP-RT a partir del ARN originado en el tejido adecuado. Se clonaron los segmentos génicos flanqueados por sitios de escisión de endonucleasas de restricción singulares en vectores de clonación/secuenciación convencionales. Se purificó el ADN plasmídico a partir de bacterias transformadas y se determinó la concentración por espectroscopia UV. Se confirmó la secuencia de ADN de los fragmentos génicos subclonados por secuenciación de ADN. Los segmentos de genes se diseñaron con sitios de restricción adecuados para permitir la subclonación en los respectivos vectores de expresión. Se diseñaron todas las construcciones con una secuencia de ADN del extremo 5' que codifica un péptido líder que se dirige a proteínas para su secreción en células eucariotas. SEQ ID NO: 8-16 ofrecen ejemplos de péptidos líder y las secuencias polinucleotídicas que los codifican.
Preparación de fusiones de la subunidad Py de la IL-2R y Fc y fusión de la subunidad a de la IL-2R y Fc
Para estudiar la afinidad de unión por el receptor de la IL-2, se generó un instrumento que permitió la expresión de un receptor de la IL-2 heterodimérica; se fusionó la subunidad p del receptor de la IL-2 a una molécula de Fc que se genomanipuló para heterodimerizar (Fcjojalj; véase SEQ ID NO: 17 y 18) usando la tecnología de "botones en ojales" (Merchant et al., Nat Biotech. 16, 677-681 [1998]). A continuación se fusionó la subunidad y del receptor de la IL-2 a la variante de Fc(botón) (véase SEQ ID NO: 19 y 20), que se heterodimerizó con Fc(ojal). A continuación se usó esta proteína de fusión a Fc heterodimérica como sustrato para analizar la interacción IL-2/receptor de la IL-2. Se expresó la
subunidad a de la IL-2R como una cadena monomérica con un sitio de escisión AcTev y una marca Avi-His (SEQ ID NO: 21 y 22). Se expresaron de forma transitoria las respectivas subunidades de la IL-2R en ANEB REH 293 con suero para la construcción de la subunidad Py de la IL-2R y sin suero para la construcción de la subunidad a. Se purificó la construcción de la subunidad Py de la IL-2R en proteína A (GE Healthcare), seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (GE Healthcare, Superdex 200). Se purificó la subunidad a de la IL-2R por medio de la marca His en una columna NiNTA (Qiagen) seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (GE Healthcare, Superdex 75). El aminoácido y las secuencias de nucleótidos correspondientes de varias construcciones de receptores se dan en las SEQ ID NO: 17-22 y 255-268.
Preparación de inmunoconjugados
Los detalles sobre la generación y la maduración por afinidad de los restos de unión a antígeno dirigidos a la FAP se pueden hallar en los ejemplos adjuntos a la publicación de la solicitud de patente de PCT n.° WO 2012/020006. Como se describe en la misma, se han generado diversos dominios de unión a antígeno dirigidos a la FAP por presentación en fagos, incluyendo los designados como 4G8, 28H1 y 4B9 usados en los siguientes ejemplos. El clon 28H1 es un anticuerpo madurado por afinidad basado en el clon original 4G8, mientras que el clon 4B9 es un anticuerpo madurado por afinidad basado en el clon original 3F2. El dominio de unión a antígeno designado 2B10 usado aquí se refiere al dominio A2 de la tenascina C (TNC A2). Los detalles sobre este y otros restos de unión a antígeno dirigidos contra TNC A2 se pueden hallar en la publicación de solicitud de patente de PCT n.° WO 2012/020038. El dominio de unión a antígeno designado L19, dirigido contra el dominio adicional B (EDB) de la fibronectina, se deriva del anticuerpo L19 descrito en la publicación de PCT WO 2007/128563. El dominio de unión a antígeno designado CH1A1A 98/992F1 usado aquí se dirige al ACE, y se describe con más detalle en la publicación de solicitud de patente de PCT n.° WO 2012/117002.
El mutante cuádruple de la IL-2 (qm) utilizado como resto efector en algunos de los siguientes ejemplos se describe con detalle en la publicación de solicitud de patente de PCT n.° WO 2012/107417. Brevemente, la IL-2 qm se caracteriza por las siguientes mutaciones:
1. T3A: inactivación del sitio de O-glucosilación previsto.
2. F42A: inactivación de la interacción IL-2/IL-2R a.
3. Y45A: inactivación de la interacción IL-2/IL-2R a.
4. L72G: inactivación de la interacción IL-2/IL-2R a.
5. C125A: mutación para evitar dímeros de la IL-2 con puentes disulfuro.
Se eligió la mutación T3A para eliminar el sitio de O-glucosilación y obtener un producto proteico con mayor homogeneidad y pureza cuando el polipéptido de la IL-2 qm o un inmunoconjugado que lo comprende se expresa en células eucarióticas como las células c Ho o REH293. Se eligieron las tres mutaciones F42A, Y45A y L72G para interferir con la unión a CD25, la subunidad a del receptor de la IL-2. La reducción o supresión de la unión a CD25 da como resultado una reducción de la muerte celular inducida por activación (AICD), falta de activación preferencial de los linfocitos T reguladores, así como una toxicidad reducida (como se describe en el documento WO 2012/107417).
Se generaron secuencias de ADN por síntesis génica y/o técnicas de biología molecular clásicas y se subclonaron en vectores de expresión de mamífero bajo el control de un promotor VSMP y hacia 5' de un sitio poliA sintético, portando cada vector una secuencia OriP del v Eb . Se produjeron inmunoconjugados como se aplica en los ejemplos siguientes cotransfectando exponencialmente células ANEB-REH293 en crecimiento con los vectores de expresión de mamífero usando transfección con fosfato de calcio. De forma alternativa, se transfectaron por polietilenimina (PEI) células REH293 en crecimiento en suspensión con los respectivos vectores de expresión. De forma alternativa, se usaron grupos de células CHO transfectadas de forma estable o clones de células CHO para la producción en medio sin suero. Posteriormente se purificaron las proteínas de fusión IgG-citocina a partir del sobrenadante. En resumen, se purificaron proteínas de fusión IgG-citocina por una etapa de afinidad con proteína A (HiTrap ProtA, GE Healthcare) equilibrada en fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5. Después de cargar el sobrenadante, se lavó primero la columna con fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5 y posteriormente se lavó con fosfato de sodio 13,3 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 mM, pH 5,45. Se eluyó la proteína de fusión IgG-citocina con citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, glicina 100 mM, pH 3. Se neutralizaron las fracciones y se agruparon y purificaron por cromatografía de exclusión por tamaño (HiLoad 16/60 Superdex 200, GE Healthcare) en el amortiguador de formulación final: fosfato de potasio 25 mM, cloruro de sodio 125 mM, glicina 100 mM, pH 6,7. Se ofrecen a continuación ejemplos de los procedimientos de purificación detallados y los resultados para construcciones seleccionadas. Se determinó la concentración de proteína de las muestras de proteínas purificadas midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado basándose en la secuencia de aminoácidos. Se analizaron la pureza y el peso molecular de los inmunoconjugados por SDS-PAGE en presencia y ausencia de un agente reductor (1,4-ditiotreitol 5 mM) y se tiñeron con azul de Coomassie (SimpleBlue™ SafeStain, Invitrogen). Se usó el sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante
(geles Tris-glicina al 4-20 % o Bis-Tris al 3-12 %). Se analizó el contenido agregado de muestras de inmunoconjugado utilizando una columna analítica de exclusión por tamaño Superdex 200 10 / 300GL (GE Healthcare) en MOPS 2 mM, NaCl 150 mM, NaN3 al 0,02 %, pH 7,3 en amortiguador de migración a 25 °C. La integridad de la cadena principal de aminoácidos de las cadenas ligeras y pesadas reducidas de los anticuerpos puede verificarse mediante espectrometría de masas NanoElectrospray Q-TOF después de la eliminación de N-polisacáridos mediante tratamiento enzimático con péptido-N glucosidasa F (Roche Molecular Biochemicals). Los oligosacáridos unidos al dominio Fc de los inmunoconjugados se analizan mediante MALDI TOF-MS como se describe a continuación. Los oligosacáridos se liberan enzimáticamente de los inmunoconjugados mediante digestión con PNGasaF. La solución de digestión resultante que contiene los oligosacáridos liberados se prepara directamente para su análisis por MALDI TOF-MS o se digiere más con EndoH glucosidasa antes de la preparación de la muestra para su análisis por MALDI TOF-MS.
Ejemplo 2
Se generaron proteínas de fusión IgG-IL-2 qm dirigidas a FAP basadas en los anticuerpos de FAP 4G8, 28H1 y 4B9, en las que se fusionó una única IL-2 mutante cuádruple (qm) al extremo C de una cadena pesada heterodimérica como se muestra en la figura 2A. Se logra el direccionamiento al estroma tumoral donde se expresa selectivamente la FAP por medio de la región bivalente Fab del anticuerpo (efecto de avidez). Se logra la heterodimerización que da como resultado la presencia de una única IL-2 mutante cuádruple por aplicación de la tecnología de botón en ojal. Para minimizar la generación de fusiones homodiméricas de IgG-citocina, se fusionó la citocina al extremo C (con deleción del residuo Lys carboxiterminal) de la cadena pesada de IgG que contiene un botón a través de un conector (G4S)3 o G4-(SG4)2. La fusión anticuerpo-citocina tiene propiedades similares a IgG. Para reducir la unión a FcYR/función efectora y evitar la coactivación de FcR, se introdujeron mutaciones P329G L234A L235A (LALA) en el dominio Fc. Las secuencias de estos inmunoconjugados reciben las SEQ ID NO: 193, 269 y 205 (28H1 con el conector [G4S]3), SEQ ID NO: 193, 195 y 205 (28H1 con el conector G4-[SG4^), SEQ. ID NO: 201, 203 y 205 (4G8 con el conector G4-[SG4fc), SEQ ID NO: 207, 209 y 211 (4B9 con el conector G4-[SG4^) y SEQ ID NO: 207, 271 y 211 (4B9 con el conector [G4S]3).
Además, se generaron una proteína de fusión IgG-IL-2 qm dirigida a ACE basada en el anticuerpo anti-ACE CH1A1A 98/992F1, una proteína de fusión IgG-IL-2 qm no dirigida DP47GS de control en la que la IgG no se une a una diana especificada, así como una proteína de fusión IgG-IL-2 qm basada en el estroma tumoral específico 2B10 dirigida contra el dominio A2 de la tenascina-C. Las secuencias de estos inmunoconjugados se presentan en las SEQ ID NO: 275, 281 y 283 (CH1A1A 98/992F1 con el conector G4-[SG4^), SEQ ID NO: 277, 281 y 283 (CH1A1A 98/992F1 con el conector [G4SI3), SEQ ID NO: 219, 221 y 225 (DP47GS con el conector G4-[SG4b), SEQ ID NO: 219, 289 y 225 (DP47GS con el conector [G4S]3), SEQ ID NO: 285, 287 y 239 (2B10 con el conector [G4S]3). Las construcciones se generaron mediante expresión transitoria en células ANEB REH293 y se purificaron como se ha descrito anteriormente. En las figuras 3 a 9 se muestran cromatogramas y perfiles de elución ilustrativos de la purificación (A, B) así como las cromatografías de SDS-PAGE analítica y de exclusión por tamaño de las construcciones purificadas finales (C, D). Los rendimientos de la expresión transitoria fueron de 42 mg/l para el inmunoconjugado de IgG-IL-2 qm basado en 4G8, 20 mg/l para el basado en 28H1, 10 mg/l para el basado en 4B9, 5,3 mg/l para el basado en CH1A1A 98/992F1, 36,7 mg/l para el basado en 2B10 y 13,8 mg/l para el basado en DP47GS.
Además, se está generando un inmunoconjugado de IgG-IL-15 dirigido a FAP basado en 28H1, cuyas secuencias se presentan en las SEQ ID NO: 193, 199 y 205. En la secuencia del polipéptido de la IL-15, el residuo de ácido glutámico en la posición 53 se reemplaza por alanina para reducir la unión a la subunidad a del receptor de la IL-15, y el residuo de asparagina en la posición 79 se reemplaza por alanina para suprimir la glucosilación. La proteína de fusión IgG-IL-15 se genera por expresión transitoria y se purifica como se ha descrito anteriormente.
Afinidad de unión a la FAP
Se determinaron las actividades de unión a FAP de los inmunoconjugados IgG-IL-2 qm basados en anticuerpos anti-FAP 4G8 y 28H1 por resonancia de plasmón superficial (SPR) en un aparato Biacore en comparación con los correspondientes anticuerpos de IgG no modificados. En resumen, se inmovilizó un anticuerpo anti-His (Penta-His, Qiagen 34660) en chips CM5 para capturar FAP humana con marca His 10 nM (20 s). La temperatura fue de 25 °C y se usó HBS-EP como amortiguador. La concentración de analito fue desde 50 nM hasta 0,05 nM a un caudal de 50 pl/min (asociación: 300 s, disociación: 900 s, regeneración: 60 s con glicina 10 mM, pH 2). Se realizó el ajuste basándose en un modelo de unión 1:1, RI = 0, Rmáx = local (debido al formato de captura). En la siguiente tabla se presentan las afinidades bivalentes aparentes estimadas (avidez en pM) como se determina por SPR ajustada con unión 1:1, RI = 0, Rmáx = local.
Los datos muestran que dentro del error del procedimiento, la afinidad por la FAP humana se conserva para el inmunoconjugado basado en 28H1 o solo disminuye ligeramente para el inmunoconjugado basado en 4G8 en comparación con los correspondientes anticuerpos no modificados.
De manera similar, se determinó la afinidad (Kd) de la IgG 4B9-IL-2 qm (16 pM), IgG CH1A1A 98/99 2F1-IL-2 qm (400 pM), IgG CH1A1A 98/99 2F1-IL-2 wt (véase ejemplo 4; 470 pM) e IgG 2B10-IL-2 qm (150 pM, frente a 300 pM para IgG 2B10 no conjugada) a la FAP, ACE y TNC A2 humanas, respectivamente, mediante SpR a 25 °C. También se confirmó la reactividad cruzada de los anticuerpos 4B9 y 2B10 a la FAP o la TNC A2 humanas, murinas y de macacos de Java, respectivamente.
Posteriormente, se determinaron las afinidades de los inmunoconjugados IgG basada en 4G8 y 28H1-IL-2 qm al heterodímero Py de la IL-2R y la subunidad a de la IL-2R por resonancia de plasmón superficial (SPR) en comparación directa con el formato de inmunoconjugado Fab-IL-2 qm-Fab descrito en la publicación de solicitud de patente de PCT n.° WO 2012/107417. En resumen, se inmovilizaron los ligandos (la subunidad a de la IL-2R humana o bien el heterodímero Py de la IL-2R humana) en un chip CM5. Posteriormente, se aplicaron al chip como analitos los inmunoconjugados IgG basada en 4G8 y 28H1-IL-2 qm o los inmunoconjugados Fab basado en 4G8 y 28H1-IL-2 qm-Fab en comparación a 25 °C en amortiguador HBS-EP en concentraciones que oscilaban desde 300 nM hasta 1,2 nM (dil. 1:3). El caudal fue de 30 pl/min y se aplicaron las siguientes condiciones para la asociación: 180 s, disociación: 300 s, y regeneración: 2 x 30 s con MgCl23 M para el heterodímero Py de la IL-2R, 10 s con NaOH 50 mM para la subunidad a de la IL-2R. Se aplicó una unión 1:1 para el ajuste (unión 1:1, RI t 0, Rmáx = local para Py de la IL-2R, Kd aparente, unión 1:1, RI = 0, Rmáx = local para a de la IL-2R). Los respectivos valores de Kd se indican en la tabla siguiente.
Los datos muestran que los inmunoconjugados IgG basada en 4G8 y 28H1-IL-2 qm se unen con una afinidad al menos tan buena como los inmunoconjugados Fab-IL-2 qm-Fab al heterodímero Py de la IL-2R, mientras que no se unen a la subunidad a de la IL-2R debido a la introducción de las mutaciones que interfieren con la unión a CD25. En comparación con los correspondientes inmunoconjugados Fab-IL-2 qm-Fab, la afinidad de las proteínas de fusión IgG-IL-2 qm parece que se potencia ligeramente dentro del error del procedimiento.
De manera similar, la afinidad de construcciones adicionales (4B9, DP47GS, 2B10, CH1A1A 98/99 2F1) que comprenden IL-2 wt (véase ejemplo 4) o IL-2 qm al heterodímero Py de la IL-2R y la subunidad a de la IL-2R se determinó por SPR a 25 °C. Para todas las construcciones, la Kd aparente para el heterodímero Py de la IL-2R humana era entre 6 y 12 nM (con independencia de que la construcción comprendiese IL-2 wt o IL-2 qm), mientras que solo las construcciones que comprendían IL-2 wt se unían a la subunidad a de la IL-2R (Kd para la IL-2R a humana alrededor de 20 nM).
Ensayos de actividad biológica con inmunoconjugados de citocinas IgG
La actividad biológica de las fusiones de IgG basada en 4G8-IL-2 qm dirigidas a FAP se investigó en varios ensayos celulares en comparación con IL-2 comercialmente disponible (proleucina, Novartis/Chiron) y/o los inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab descritos en el documento WO 2012/107417.
Unión a células que expresan FAP
Se midió la unión del inmunoconjugados dirigido a FAP IgG basada en 4G8-IL-2 qm a la FAP humana expresada en células REH293 transfectadas de forma estable por FACS. En resumen, se incubaron 250.000 células por pocillo con la concentración indicada del inmunoconjugado en una placa de 96 pocillos de fondo redondo, se incubó durante 30 min a 4 °C, y se lavó una vez con PBS/SAB al 0,1 %. El inmunoconjugado unido se detectó después de la incubación durante 30 min a 4 °C con fragmento de F(ab')2 de cabra antihumano específico de F(ab')2 AffiniPure conjugado con ITCF (Jackson Immuno Research Lab n.° 109-096-097, solución de trabajo: diluido 1:20 en PBS/SAB al 0,1 %, recién preparado) utilizando un FACS CantoII (Software FACS Diva). Los resultados se muestran en la figura 10. Los datos muestran que el inmunoconjugado IgG-IL-2 qm se une a células que expresan FAP con un valor de CE50 de 0,9 nM, similar al de la correspondiente construcción Fab basado en 4G8-IL-2 qm-Fab (0,7 nM).
Liberación de IFN-y por linfocitos NK (en solución)
Posteriormente se estudió el inmunoconjugado dirigido a FAP IgG basada en 4G8-IL-2 qm para determinar la inducción de la liberación de IFN-y por linfocitos NK92 inducida por la activación de la señalización de Py de la IL-2R. En resumen, se incubaron linfocitos NK92 privados de IL-2 (100.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos en U) con diferentes concentraciones de inmunoconjugado de IL-2, que comprendía IL-2 mutante cuádruple, durante 24 h en medio NK (MEM alfa de Invitrogen [n.° 22561-021] complementado con SBF al 10 %, suero de caballo al 10 %, 2-mercaptoetanol 0,1 mM, inositol 0,2 mM y ácido fólico 0,02 mM). Se recogieron los sobrenadantes y se analizó la liberación de IFN-y usando el kit de ELISA II de IFN-y antihumano de Becton Dickinson (n.° 550612). Sirvieron como control positivo la proleucina (Novartis) y Fab basado en 28H1-IL-2 qm-Fab para la activación de los linfocitos mediada por IL-2. En la figura 11 se muestra que el inmunoconjugado dirigido a FAP IgG basada en 4G8-IL-2 qm es igualmente eficaz para inducir la liberación de IFN-y que el inmunoconjugado Fab basado en 28H1-IL-2 qm-Fab madurado por afinidad.
Ensayo de fosforilación de STAT5
En una última serie de experimentos se estudiaron también los efectos del inmunoconjugado dirigido a FAP IgG basada en 4G8-IL-2 qm sobre la inducción de la fosforilación de STAT5 en comparación con los inmunoconjugados Fab basado en 28H1-IL-2 qm-Fab y Fab-IL-2 wt-Fab así como proleucina en linfocitos NK humanos, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ y linfocitos Treg de CMSP humanas. En resumen, se extrajo sangre de voluntarios sanos con jeringuillas que contenían heparina y se aislaron CMSP. Las CMSP se trataron con los inmunoconjugados indicados a las concentraciones indicadas o con proleucina (Novartis) como control. Después de 20 min de incubación a 37 °C, se fijaron las CMSP con amortiguador Cytofix precalentado (Becton Dickinson n.° 554655) durante 10 min a 37 °C, seguido de permeabilización con amortiguador Phosflow Perm Buffer III (Becton Dickinson n.° 558050) durante 30 min a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con PBS que contenía SAB al 0,1 % antes de realizar la tinción para FACS usando mezclas de anticuerpos de citometría de flujo para la detección de diferentes poblaciones celulares y la fosforilación del STAT5. Se analizaron muestras usando un FACSCantoII con HTS de Becton Dickinson. Se definieron linfocitos NK como CD3'CD56+, se definieron linfocitos T CD8 positivos como CD3+CD8+, se definieron linfocitos T CD4 positivos como CD4+CD25'CD127+ y se definieron linfocitos Treg como CD4+CD25+FoxP3+. Para los linfocitos NK y los linfocitos T CD8+ que muestran una expresión de CD25 nula o muy baja (lo que significa que la señalización de la IL-2R está mediada principalmente a través del heterodímero Py de la IL-2R) los resultados muestran que el inmunoconjugado IgG basada en 4G8-IL-2 qm fue <10 veces menos potente en la inducción de la fosforilación de STAT5 que la proleucina, pero ligeramente más potente que los inmunoconjugados Fab basado en 28H1-IL-2-Fab y Fab-IL-2 qm-Fab. En los linfocitos T CD4+, que muestran una rápida regulación por incremento de CD25 tras la estimulación, el inmunoconjugado IgG basada en 4G8-IL-2 qm fue menos potente que el inmunoconjugado Fab 28H1-IL-2 wt-Fab, pero ligeramente más potente que el inmunoconjugado Fab 28H1-IL-2 qm-Fab, y todavía mostró inducción de la señalización de la IL-2R en concentraciones de saturación similares a la proleucina y a Fab 28H1-IL-2 wt-Fab. Esto contrasta con los linfocitos Treg donde la potencia del inmunoconjugado IgG basada en 4G8-IL-2 qm se redujo significativamente en comparación con el inmunoconjugado Fab-IL-2-Fab debido a la alta expresión de CD25 en linfocitos Treg y la baja afinidad de unión del inmunoconjugado IgG basada en 4G8-IL-2 qm por c D25. Como consecuencia de la anulación de la unión a CD25 en el inmunoconjugado IgG basada en 4G8-IL-2 qm, la señalización de la IL-2 en linfocitos Treg solo se activa por medio del heterodímero Py de la IL-2R a concentraciones donde se activa la señalización de la IL-2R en células efectoras negativas para CD25 a través del heterodímero Py de la IL-2R. Tomado conjuntamente, el inmunoconjugado IgG basada en 4G8-IL-2 qm descrito aquí puede activar la señalización de la IL-2r a través del heterodímero Py de la IL-2R, pero no da como resultado una estimulación preferencial de los linfocitos Treg sobre otras células efectoras. Los resultados de estos experimentos se muestran en la figura 12.
Unión de IgG 2B10-IL-2 qm a células que expresan TNC A2
La unión del inmunoconjugado dirigido a TNC A2 IgG basada en 2B10-IL-2 qm al TNC A2 humano expresado en células U87MG se determinó mediante FACS. En resumen, se incubaron 200.000 células por pocillo con la concentración indicada de los inmunoconjugados en una placa de 96 pocillos de fondo redondo, se incubaron durante 30 min a 4 °C, y se lavó una vez con PBS/SAB al 0,1 %. El inmunoconjugado unido se detectó después de la incubación durante 30 min a 4 °C con fragmento de F(ab')2 de cabra específico anti-FcY de IgG humana de AffiniPure conjugado con ITCF (Jackson Immuno Research Lab n.° 109-096-098, solución de trabajo: diluido 1:20 en PBS/SAB al 0,1 %, recién preparado) utilizando un FACS CantoII (Software FACS Diva). Los resultados se muestran en la figura 13. Los datos muestran que el inmunoconjugado IgG 2B10-IL-2 qm se une a las células U87MG que expresan TNC A2 igualmente bien que la correspondiente IgG no conjugada.
Inducción de la proliferación de linfocitos NK92 por inmunoconjugados de IgG-IL-2
Se analizaron los inmunoconjugados IgG 2B10-IL-2 qm, IgG CH1A1A 98/99 2F1-IL-2 qm, IgG CH1A1A 98/99 2F1-IL-2 wt, IgG 4B9-IL-2 qm e IgG 4B9-IL-2 wt para determinar su capacidad para inducir la proliferación de linfocitos NK92. Para los ensayos de proliferación, los linfocitos NK92 se privaron en medio libre de IL-2 durante 2 horas, se sembraron 10000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo plano y luego se incubaron durante 3 días en una incubadora humidificada a 37 °C, 5 % de CO2 en presencia de los inmunoconjugados de IL-2 (). Al cabo de 3 días, se determinó el contenido de ATP de los lisados celulares usando el ensayo CellTiter-Glo Luminescent Cell
Viability Assay de Promega (n.° G7571/2/3). Se calculó el porcentaje de crecimiento estableciendo una concentración de proleucina (Novartis) de 1,1 mg/ml a una proliferación de un 100 % y las células no tratadas sin estímulo de IL-2 a una proliferación de un 0 %. Los resultados se muestran en las figuras 14 y 15. Los datos muestran que todas las construcciones fueron capaces de inducir la proliferación de linfocitos NK92, siendo las construcciones basadas en CH1A1A 98/99 2F1 más activas que el inmunoconjugado IgG 2B10-IL-2 qm, y las construcciones que comprenden IL-2 wt más activas que las construcciones correspondientes con IL-2 qm.
Ejemplo 3
En general, se introducen las mutaciones P329G LALA que suprimen casi por completo la interacción FcyR de los anticuerpos IgG1 humanos (véase la publicación de solicitud de patente de PCT n° WO 2012/130831) para reducir la unión a FcYR/función efectora y, por lo tanto, evitar la liberación excesiva de citocinas cuando los respectivos receptores de citocinas se activan conjuntamente con la señalización de FcyR. En casos específicos, por ejemplo cuando el anticuerpo se dirige a un antígeno altamente específico del tumor, las funciones efectoras del Fc pueden conservarse utilizando un dominio Fc de la IgG no modificado, o se pueden mejorar aún más mediante glucomanipulación del dominio Fc de la IgG.
Como ejemplo de ello, generamos un inmunoconjugado dirigido a ACE IgG-IL-2 qm donde se fusionó una única IL-2 mutante cuádruple al extremo C de una cadena pesada heterodimérica a través de un conector (SG4)3 basado en el clon de anticuerpo anti-ACE CH1A1A 98/992F1. En este inmunoconjugado, no se incluyó la mutación P329G LALA (véase secuencias de las SEQ ID NO: 227, 229 y 231). El inmunoconjugado se expresó y purificó como IgG humana sin mutaciones o proteína de fusión IgG-IL-2 qm glucomanipulada como se describe a continuación.
Preparación del inmunoconjugado IgG-IL-2 qm (glucomanipulado)
El inmunoconjugado dirigido a ACE IgG basada en 2F1 CH1A1A 98/99-IL-2 qm se produjo cotransfectando células ANEB-REH293 con los vectores de expresión de anticuerpos de mamíferos. Se transfectaron células ANEB-REH293 de crecimiento exponencial usando el procedimiento del fosfato de calcio. Alternativamente, se transfectan con polietilenimina células REH293 que crecen en suspensión. Para la producción del inmunoconjugado IgG-IL-2 qm no modificado y no glucomanipulado, las células se transfectaron solo con los vectores de expresión de la cadena pesada y ligera del anticuerpo en una relación 1:1 (en el que el vector de la cadena pesada del anticuerpo es una mezcla 1:1 de dos vectores: un vector para la cadena pesada con el resto efector, y un vector para la cadena pesada sin el resto efector).
Para la producción del inmunoconjugado dirigido a ACE y glucomanipulado IgG-IL-2 qm, las células se cotransfectaron con dos plásmidos adicionales, uno para la expresión de un polipéptido de fusión GnTIII (un vector de expresión de GnT-III) y el otro para la expresión de la manosidasa II (un vector de expresión de la manosidasa II de Golgi) en una proporción de 4:4:1:1, respectivamente. Las células se cultivaron en cultivos monocapa adherentes en matraces en T usando medio de cultivo DMEM complementado con SBF al 10 % y se transfectaron cuando tenían confluencia entre un 50 y un 80 %. Para la transfección de un matraz T150, se sembraron 15 millones de células 24 horas antes de la transfección en 25 ml de medio de cultivo DMEM complementado con FCS (al 10 % v/v final), y las células se colocaron a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de 5 % de CO2 durante la noche. Para cada matraz T150 que se iba a transfectar se preparó una solución de ADN, CaCl2 y agua mezclando 94 pg de ADN total del vector plasmídico divididos por igual entre los vectores de expresión de la cadena ligera y pesada, agua hasta un volumen final de 469 pl y 469 pl de una solución 1 M de CaCl2. A esta solución se agregaron 938 pl de una solución de HEPES 50 mM, NaCl 280 mM y Na2HPO4 1,5 mM a pH 7,05, se mezcló inmediatamente durante 10 s y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 20 s. La suspensión se diluyó con 10 ml de DMEM complementado con SBF al 2 % y se agregó al matraz T150 en lugar del medio existente. Posteriormente, se agregaron 13 ml adicionales de medio de transfección. Las células se incubaron a 37 °C, 5 % de CO2 durante unas 17 a 20 horas antes de reemplazar el medio con 25 ml de DMEM con SBF al 10 %. El medio de cultivo acondicionado se recogió unos 7 días después del intercambio de medios mediante centrifugación durante 15 min a 210 x g. La solución se filtró en condiciones estériles (filtro de 0,22 pm), se agregó acida sódica con una concentración final del 0,01 % p/v y se conservó a 4 °C.
Los inmunoconjugados IgG ACE-IL-2 qm sin mutaciones o glucomanipulados segregados se purificaron a partir de sobrenadantes de los cultivos celulares mediante cromatografía de afinidad de proteína A, seguida de una etapa cromatográfica de exclusión por tamaño en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) como se ha descrito anteriormente. La concentración de proteínas, la pureza, el peso molecular, el contenido agregado y la integridad se analizaron como se ha descrito anteriormente.
Análisis de la estructura de oligosacáridos de los inmunoconjugados IgG-IL-2 qm (glucomanipulados)
Para la determinación de las proporciones relativas de las estructuras de oligosacáridos que contienen fucosa y no fucosiladas, se analizan los polisacáridos liberados de material inmunoconjugado purificado mediante espectrometría de masas MALDI TOF. La muestra de inmunoconjugado (unos 50 pg) se incuba durante la noche a 37 °C con 5 mU de N-glucosidasa F (QAbio; PNGaseF: E-PNG01) en Tris 2 mM, pH 7,0, para liberar el oligosacárido de la cadena principal de la proteína. Para la desaminación de polisacáridos se agrega ácido acético a una concentración final de
150 mM y se incuba durante 1 hora a 37 °C. Para el análisis por espectrometría de masas MALDI TOF, se mezclan 2 pl de la muestra en la diana MALDI con 2 pl de solución de la matriz de DHB (ácido 2, 5-dihidroxibenzoico [Bruker Daltonics n.° 201346] disuelta en etanol al 50 %/NaCl 5 mM a 4 mg/ml) y se analiza con el instrumento MAl Di TOF Mass Spectrometer Autoflex II (Bruker Daltonics). Rutinariamente, se registran 50-300 tomas y se resumen en un solo experimento. Los espectros obtenidos se evalúan mediante el software de análisis de flexión (Bruker Daltonics) y se determinan las masas para cada uno de los picos detectados. Posteriormente, los picos se asignan a estructuras de hidratos de carbono que contienen fucosa o no fucosiladas comparando las masas calculadas y las masas teóricamente esperadas para las estructuras respectivas (p. ej., compleja, híbrida y con bajo y alto contenido de manosa, respectivamente, con y sin fucosa).
Para la determinación de la proporción de estructuras híbridas, las muestras de anticuerpos se digieren con N-glucosidasa F y endoglucosidasa H [QAbio; EndoH: E-EH02] de forma concomitante. La N-glucosidasa F libera todas las estructuras de polisacárido ligadas a N (estructuras complejas, híbridas y con bajo y alto contenido de manosa) de la cadena principal de la proteína y la endoglucosidasa H escinde además todos los polisacáridos de tipo híbrido entre los dos residuos de N-acetilglucosamina (GlcNAc) en el extremo reductor del polisacárido. Esta digestión se trata y analiza posteriormente mediante espectrometría de masas MALDI TOF de la misma manera que se describió anteriormente para la muestra digerida con N-glucosidasa F. Al comparar el patrón de la digestión con N-glucosidasa F y la digestión combinada con N-glucosidasa F/endo H, se utiliza el grado de reducción de las señales de una estructura de hidrato de carbono específica para estimar el contenido relativo de estructuras híbridas. La cantidad relativa de cada estructura de hidrato de carbono se calcula a partir de la relación entre la altura del pico de una estructura individual y la suma de las alturas de los picos de todos los oligosacáridos detectados. La cantidad de fucosa es el porcentaje de estructuras que contienen fucosa con relación a todas las estructuras de hidratos de carbono identificadas en la muestra tratada con N-glucosidasa F (p. ej., estructuras complejas, híbridas y con bajo y alto contenido de manosa). El grado de no fucosilación es el porcentaje de estructuras que carecen de fucosa con relación a todos los hidratos de carbono identificados en la muestra tratada con N-glucosidasa F (p. ej., estructuras complejas, híbridas y con bajo y alto contenido de manosa).
Ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos
Se compararon inmunoconjugados dirigidos a ACE IgG CH1A1A 98/99 2F1-IL-2 qm sin mutaciones y glucomanipulado en ensayos de CCDA para determinar su potencial para mediar la citotoxicidad celular mediada por anticuerpos. Brevemente, se recogieron células tumorales humanas A549 que sobreexpresan ACE como células destinatarias, se lavaron y se suspendieron de nuevo en medio de cultivo, se tiñeron con Calcein AM (sondas moleculares) recién preparada a 37 °C durante 30 min, se lavaron tres veces, se contaron y se diluyeron hasta 300.000 células/ml. Esta suspensión se transfirió a una placa de 96 pocillos de fondo redondo (30000 células/pocillo), se agregó la dilución del inmunoconjugado respectivo y se incubó durante 10 min para permitir la unión del inmunoconjugado analizado a las células antes del contacto con células efectoras. La proporción de efector a diana fue de 25 a 1 para CMSP recién aisladas. La incubación conjunta se realizó durante 4 horas. Se utilizaron dos sistemas de lectura diferentes: la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) en el sobrenadante después de la desintegración de las células atacadas, y la retención de calceína en las células vivas restantes. Se recogió LDH del sobrenadante de cultivo conjunto y se analizó con un kit de detección de LDH (Roche Applied Science). Se determinó la conversión del sustrato por la enzima LDH con un lector de absorbancia ELISA (software SoftMaxPro, longitudes de onda de referencia: 490 nm frente a 650 nm). Se analizó la calceína residual en células vivas en un lector de fluorescencia (Wallac VICTOR3 1420 Multilabel COUNTER [Perkin Elmer]) después de eliminar el resto del sobrenadante de las células granuladas, una etapa de lavado en PBS antes de la lisis y la fijación de las células con amortiguador de borato (borato 50 mM, tritón al 0,1 %).
En la figura 16 se muestra el resultado basado en la detección de LDH. Se obtuvo un resultado similar basado en la retención de calceína (no se muestra). Ambas construcciones fueron capaces de mediar la CCDA, pues la construcción glucomanipulada tenía una actividad similar a la correspondiente IgG glucomanipulada no conjugada. Como se esperaba, la construcción no glucomanipulada mostró una actividad reducida en comparación con la construcción glucomanipulada.
Ejemplo 4
Se generaron inmunoconjugados dirigidos a FAP IgG basada en 28H1 o 4B9, dirigidos a ACE IgG basada en CH1A1A 98/99 2F1, y no dirigidos IgG basada en DP47GS-IL-2, en los que se fusiona un único polipéptido de IL-2 sin mutaciones al extremo C de una cadena pesada heterodimérica. Se logró la heterodimerización que da como resultado un inmunoconjugado con un único resto de IL-2 por aplicación de la tecnología de botón en ojal. Para minimizar la generación de proteínas de fusión homodiméricas IgG-IL-2, se fusionó la citocina a la cadena pesada que contiene el botón (con deleción del residuo Lys carboxiterminal) por medio de un conector G4-(SG4)2 o (G4S)3. Las secuencias de estos inmunoconjugados se presentan en la SEQ ID NO: 193, 197 y 205 (28H1 con conector G4-[SG4]2), SEQ ID NO: 207, 273 y 211 (4B9 con conector [G4SI3), SEQ ID NO: 277, 279 y 283 (CH1A1A 98/992F1 con conector [G4S]a), SEQ ID NO: 219, 223 y 225 (DP47GS con conector G4-[SG4]2), SEQ ID NO: 219, 293 y 225 (DP47GS con conector [G4S]3). La fusión anticuerpo-citocina tiene propiedades similares a IgG. Para reducir la unión a FcYR/función efectora y evitar la coactivación de FcR, se introdujeron mutaciones P329G LALA en el dominio Fc. Ambas
construcciones se purificaron de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente. La purificación final se realizó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (HiLoad 26/60 Superdex 200, GE Healthcare) en el amortiguador de formulación final, histidina 20 mM, cloruro sódico 140 mM, pH 6. En las figuras 17 a 20 se muestran los respectivos cromatogramas y perfiles de elución de la purificación (A, B) así como las cromatografías de SDS-PAGE analítica y de exclusión por tamaño de las construcciones purificadas finales (C, D). El rendimiento fue de 15.6 mg/l para el inmunoconjugado no dirigido IgG DP47GS-IL-2, 26,7 mg/ml para el inmunoconjugado IgG 28H1-IL-2, 4.6 mg/l para el inmunoconjugado IgG CH1A1A 98/992F1-IL-2 y 11 mg/l para el inmunoconjugado de IgG 4B9-IL-2.
Posteriormente se determinaron por SPR sus propiedades de unión a FAP, respectivamente la falta de unión, así como la unión a la cadena Py de la IL-2R y a la cadena a de la IL-2R, como se ha descrito anteriormente (véase ejemplo 2). También se estudió la actividad celular en las poblaciones de células efectoras inmunitarias y los efectos farmacodinámicos in vivo.
Ejemplo 5
Se construyeron inmunoconjugados dirigidos a FAP IgG basada en 4G8 y también dirigidos a TNC A2 IgG basada en 2B10-IL-10 fusionando dos formatos de citocinas IL-10 diferentes al extremo C de la cadena pesada de la IgG heterodimérica que comprende una modificación de ojal: bien una IL-10 monocatenaria en la que se insertó un conector (G4S)4 de 20 unidades entre dos moléculas de IL-10, o bien una IL-10 monomérica genomanipulada (Josephson et al., J Biol Chem 275, 13552-7 [2000]). Ambas moléculas se fusionaron mediante un conector (G4S)3 de 15 unidades al extremo C de la cadena pesada que comprende una modificación de ojal, con la eliminación del residuo Lys carboxiterminal. Se logró la heterodimerización que dio lugar a una sola cadena pesada portadora de un resto de IL-10 mediante la aplicación de la tecnología de botón en ojal. La fusión IgG-citocina tiene propiedades similares a IgG. Para reducir la unión a FcYR/función efectora y evitar la coactivación de FcR, se introdujeron mutaciones P329G LALA en el dominio Fc del inmunoconjugado. Las secuencias de las respectivas construcciones se presentan en la SEQ ID NO: 233, 235 y 239 (2B10 con scIL-10), SEQ ID NO: 233, 237 y 239 (2B10 con IL-10 monomérica “ IL-10M1”), SEQ ID NO: 241, 243 y 205 (4G8 con scIL-10), SEQ ID NO: 241, 245 y 205 (4G8 con IL-10M1). Todos estos inmunoconjugados se purificaron de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente. Posteriormente se determinaron sus propiedades de unión a FAP o TNC A2, respectivamente, así como sus afinidades a la IL-10R1 humana mediante SPR utilizando el biosensor ProteOn XPR36. Brevemente, las dianas FAP o TNC A2, así como la IL-10R1 humana se inmovilizaron en orientación vertical en la superficie del chip sensor (la FAP mediante acoplamiento convencional de aminas, la TNC A2 y la IL-10R1 humana [ambas biotiniladas a través de una marca Avi carboxiterminal] por captura de neutravidina). Posteriormente se inyectaron los inmunoconjugados de IgG-IL-10 en seis concentraciones diferentes, incluida una concentración cero, como analitos en orientación horizontal. Después de una doble referencia, los sensogramas se ajustaron a un modelo de interacción 1:1 para determinar las constantes y afinidades de la velocidad cinética. Los resultados del análisis por SDS PAGE analítica y las determinaciones de afinidad basadas en SPR para los antígenos destinatarios, así como para el receptor de la IL-10 se muestran en las figuras 21 y 22. Los datos muestran que los inmunoconjugados se unen a TNC A2 o FAP con valores de Kd de 52 o 26 pM, respectivamente, mientras que los valores de Kd para el receptor de IL-10 son de 520 y 815 pM.
Ejemplo 6
De acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente, se generaron y expresaron proteínas de fusión IgG-citocina consistentes en una sola región Fab basada en 28H1 o basada en 4B9 dirigida a FAP fusionada al extremo N de una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de ojal, mientras que la segunda región Fab de la cadena pesada de IgG con la modificación de botón se reemplazó por un resto de citocina a través de un conector (G4S)n (n = 1). Consulte la figura 2C para ver una representación esquemática de este formato de inmunoconjugado (también llamado formato "1 1"). Los restos de citocinas utilizados fueron la IL-2 mutante cuádruple descrita anteriormente y en la publicación de la solicitud de patente de PCT n.° WO 2012/107417 (véase SEQ ID NO: 3), la IL-7 y el IFN-a. Las secuencias correspondientes de los polipéptidos de fusión que comprenden el resto de citocina, fusionado con el extremo N de una subunidad del dominio Fc que comprende una modificación de botón a través de un péptido conector, se presentan en la SEQ ID NO: 247 (que comprende la IL-2 mutante cuádruple), 249 (que comprende la IL-7) y 251 (que comprende el IFN-a). En estas construcciones, el direccionamiento del inmunoconjugado se logra a través de la región Fab monovalente de alta afinidad. Este formato puede recomendarse en los casos en que la internalización del antígeno puede reducirse utilizando un aglutinante monovalente. Los inmunoconjugados se produjeron, purificaron y analizaron como se ha descrito anteriormente. Para construcciones que comprenden IL-2 qm o IL-7, se combinaron la cromatografía de afinidad de proteína A y la cromatografía de exclusión por tamaño en una sola prueba. Se usó histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, como amortiguador de cromatografía de exclusión por tamaño y de formulación final. En las figuras 23-26 se muestran los perfiles de elución y los cromatogramas de las purificaciones, así como los cromatogramas de SDS-PAGE analítica y de exclusión por tamaño de las construcciones purificadas finales. Los rendimientos fueron de 11 mg/l para la construcción IgG 4B9-IL-2 qm "1 1", 43 mg/l para la IgG 28H1-IL-2 qm "1 1", 20,5 mg/l para la IgG 4B9-IL-7 "1 1" y 10,5 mg/l para la IgG 4B9--IFN-a "1+1".
Se probó la capacidad de las construcciones "1 1" que comprenden IL-2 qm para inducir la proliferación de linfocitos NK, en comparación con los inmunoconjugados de IgG-IL-2 qm. Se privó a linfocitos NK-92 durante 2 h antes
d e s e m b ra r 10.000 c é lu la s /p o c il lo e n p la c a s d e 96 p o c il io s d e fo n d o t ra n s p a re n te n e g ro p la n o . S e v a lo ra ro n los in m u n o c o n ju g a d o s e n lo s l in fo c ito s N K -92 s e m b ra d a s . D e s p u é s d e 72 h, se d e te rm in ó e l c o n te n id o en A T P p a ra d e te rm in a r e l n ú m e ro d e c é lu la s v ia b le s u s a n d o e l k it " C e llT ite r -G lo L u m in e s c e n t C e ll V ia b il i ty A s s a y " d e P ro m e g a d e a c u e rd o c o n la s in s tru c c io n e s d e l fa b r ic a n te . E n la f ig u ra 27 s e m u e s tra q u e la s c o n s tru c c io n e s "1 1 " s o n c a p a c e s d e in d u c ir la p ro life ra c ió n d e lin fo c ito s N K -92 , s ie n d o lig e ra m e n te m e n o s a c t iv a s q u e la s c o n s tru c c io n e s c o r re s p o n d ie n te s d e Ig G - IL -2 qm .
L a s c o n s tru c c io n e s "1 1" b a s a d a s e n 4 B 9 q u e c o m p re n d e n IL -2 q m o IL -7 s e p ro b a ro n p a ra d e te rm in a r su c a p a c id a d p a ra in d u c ir la p ro life ra c ió n d e lin fo c ito s T, e n c o m p a ra c ió n co n lo s in m u n o c o n ju g a d o s d e Ig G -IL -2. S e p re p a ra ro n c é lu la s m o n o n u c le a re s d e s a n g re p e r ifé r ic a (C M S P ) u s a n d o H is to p a q u e -1077 (S ig m a D ia g n o s t ic s Inc ., S t. L o u is , M O , E E . U U .). E n re s u m e n , s e d ilu y ó s a n g re d e la c a p a le u c o c ita r ia 5:1 c o n P B S s in c a lc io n i m a g n e s io , y se e s tra t if ic ó en H is to p a q u e -1077. S e c e n tr ifu g ó e l g ra d ie n te a 450 x g d u ra n te 30 m in a te m p e ra tu ra a m b ie n te (T A ) s in in te r ru p c ió n . S e re c o g ió la in te r fa z q u e c o n te n ía la s C M S P y s e la v ó t re s v e c e s c o n P B S (350 x g s e g u id o d e 300 x g d u ra n te 10 m in a T A ). L a s C M S P se e s t im u la ro n p re v ia m e n te co n 1 p g /m l d e P H A -M (S ig m a A ld r ic h n .° L 8902 ) d u ra n te la n o c h e , a n te s d e m a rc a r la s c o n C F S E (é s te r s u c c in im id í l ic o d e c a rb o x if lu o re s c e ín a ) 100 nM d u ra n te 15 m in a 37 °C . L a s c é lu la s se la v a ro n c o n 20 m l d e m e d io a n te s d e re c u p e ra r la s C M S P m a rc a d a s d u ra n te 30 m in a 37 °C . L a s c é lu la s s e la v a ro n , se c o n ta ro n y s e s e m b ra ro n 100.000 c é lu la s en p la c a s d e 96 p o c il lo s d e fo n d o e n U. L o s in m u n o c o n ju g a d o s s e v a lo ra ro n e n la s c é lu la s s e m b ra d a s d u ra n te un t ie m p o d e in c u b a c ió n d e 6 d ía s . D e s p u é s , la s c é lu la s s e la v a ro n , se t iñ e ro n co n m a rc a d o re s d e s u p e r f ic ie c e lu la r a p ro p ia d o s y s e a n a liz a ro n p o r F A C S u s a n d o un F A C S C a n to II d e B D . L o s lin fo c ito s T C D 4 s e d e f in ie ro n c o m o C D 3 /C D 8 - y lo s l in fo c ito s T C D 8 c o m o C D 3+ /C D 8+ .
E n la f ig u ra 28 s e m u e s tra q u e la s c o n s tru c c io n e s "1 1" q u e c o m p re n d e n IL -2 q m o IL -7 s o n c a p a c e s d e in d u c ir la p ro life ra c ió n d e l in fo c ito s T C D 4 (A ) y C D 8 (B ) a c t iv a d o s p o r P H A . E n c u a n to a lo s l in fo c ito s N K , la c o n s tru c c ió n "1 1 " q u e c o m p re n d e la IL -2 q m e s lig e ra m e n te m e n o s a c t iv a q u e u n a c o n s tru c c ió n Ig G - IL -2 qm .
S e p ro b ó la c o n s tru c c ió n "1 1" b a s a d a en 4 B 9 q u e c o m p re n d e IF N -a p a ra d e te rm in a r su c a p a c id a d p a ra in h ib ir la p ro life ra c ió n d e c é lu la s D a u d i, e n c o m p a ra c ió n c o n R o fe ro n A (R o c h e ). B re v e m e n te , la s c é lu la s D a u d i s e m a rc a ro n c o n C F S E 100 nM y s e s e m b ra ro n e n u n a p la c a d e 96 p o c il lo s c o n fo n d o e n U (50.000 c é lu la s /p o c il lo ) . L a s m o lé c u la s s e a g re g a ro n a la s c o n c e n tra c io n e s in d ic a d a s , s e g u id o d e in c u b a c ió n d u ra n te 3 d ía s a 37 °C . L a p ro life ra c ió n s e m id ió m e d ia n te e l a n á lis is d e la d ilu c ió n d e C F S E , e x c lu y e n d o la s c é lu la s m u e r ta s d e l a n á lis is m e d ia n te e l u s o d e t in c ió n v iv o /m u e r to .
E n la f ig u ra 29 se m u e s tra q u e la c o n s tru c c ió n fu e c a p a z d e in h ib ir la p ro life ra c ió n d e c é lu la s D a u d i, a l m e n o s co n ta n ta p o te n c ia c o m o R o fe ro n A .
Ejemplo 7
S e re a liz ó un e s tu d io fa rm a c o c in é t ic o (F C ) d e d o s is ú n ic a e n 129 ra to n e s in m u n o c o m p e te n te s s in tu m o re s p a ra in m u n o c o n ju g a d o s Ig G -IL 2 d ir ig id o s a F A P q u e c o m p re n d ía n IL -2 s in m u ta c io n e s o b ie n m u ta n te c u á d ru p le , e in m u n o c o n ju g a d o s Ig G - IL 2 n o d ir ig id o s q u e c o m p re n d ía n IL -2 s in m u ta c io n e s o b ie n m u ta n te c u á d ru p le .
A l p r in c ip io d e l e x p e r im e n to s e m a n tu v o a 129 ra to n e s h e m b ra (H a r la n , R e in o U n id o ), d e 8 -9 s e m a n a s , en c o n d ic io n e s s in p a tó g e n o s e s p e c íf ic o s co n c ic lo s d ia r io s d e 12 h d e lu z /12 h d e o s c u r id a d d e a c u e rd o co n la s d ire c tr ic e s a c o rd a d a s (G V -S o la s ; F e la s a ; T ie rs c h G ) . E l G o b ie rn o lo c a l re v is ó e l p ro to c o lo d e l e s tu d io e x p e r im e n ta l y lo a p ro b ó (P 2008016 ). D e s p u é s d e su lle g a d a , s e m a n tu v o a lo s a n im a le s d u ra n te u n a s e m a n a p a ra q u e s e a c o s tu m b ra ra n a l n u e v o e n to rn o y p a ra su o b s e rv a c ió n . S e lle v ó a c a b o un s e g u im ie n to d e s a lu d c o n t in u o d e m a n e ra re g u la r .
S e in y e c tó a lo s ra to n e s i.v . u n a v e z Ig G 28 H 1 - IL 2 w t (2 ,5 m g /k g ) o Ig G 28 H 1 - IL 2 q m (5 m g /k g ) d ir ig id o a F A P , o Ig G D P 47 G S - IL 2 w t (5 m g /k g ) o Ig G D P 47 G S - IL 2 q m (5 m g /k g ) no d ir ig id o . S e in y e c ta ro n a to d o s lo s ra to n e s 200 pL i.v . d e la s o lu c ió n a p ro p ia d a . P a ra o b te n e r la c a n t id a d a p ro p ia d a d e in m u n o c o n ju g a d o p o r c a d a 200 pl, s e d ilu y e ro n las s o lu c io n e s m a d re c o n P B S c u a n d o fu e n e c e s a r io .
S e e x tra jo s a n g re a lo s ra to n e s a l c a b o d e 1, 8, 24 , 48 , 72 , 96 h, y en a d e la n te c a d a 2 d ía s d u ra n te 3 s e m a n a s . S e e x tra je ro n lo s s u e ro s y s e a lm a c e n a ro n a -20 °C h a s ta su a n á lis is p o r E L IS A . S e d e te rm in a ro n la s c o n c e n tra c io n e s d e in m u n o c o n ju g a d o s e n s u e ro u s a n d o un E L IS A p a ra la c u a n t if ic a c ió n d e l a n t ic u e rp o in m u n o c o n ju g a d o d e IL -2 (R o c h e -P e n z b e rg ) . S e m id ió la a b s o rc ió n u s a n d o u n a lo n g itu d d e o n d a d e m e d ic ió n d e 405 n m y u n a lo n g itu d d e o n d a d e re fe re n c ia d e 492 n m ( le c to r d e m ic ro p la c a s a ju s ta b le V e rs a M a x , M o le c u la r D e v ic e s ) .
E n la f ig u ra 30 s e m u e s tra la fa rm a c o c in é t ic a d e e s to s in m u n o c o n ju g a d o s d e IL -2. A m b a s c o n s tru c c io n e s de Ig G -IL 2 q m d ir ig id a a F A P (A ) y n o d ir ig id a (B ) t ie n e n u n a s e m iv id a e n s u e ro m á s la rg a (a p ro x . 30 h ) q u e las c o r re s p o n d ie n te s c o n s tru c c io n e s d e Ig G - IL 2 w t (a p ro x . 15 h). E s d e d e s ta c a r q u e , a u n q u e la s c o n d ic io n e s e x p e r im e n ta le s n o s o n d ire c ta m e n te c o m p a ra b le s , la s e m iv id a e n s u e ro d e lo s in m u n o c o n ju g a d o s d e IL -2 d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to p a re c e s e r m á s la rg a q u e la s e m iv id a e n s u e ro d e lo s in m u n o c o n ju g a d o s d e Ig G - IL -2 "2 2 " c o n o c id o s e n la té c n ic a (v é a s e la f ig u ra 1) c o m o s e in fo rm ó , p. e j., e n G ill ie s e t a l., C lin C a n c e r R e s 8, 210 -216 (2002 ).
Ejemplo 8
Se realizó un estudio de biodistribución para evaluar la orientación tumoral de los inmunoconjugados descritos en el presente documento. La IgG basada en 28H1-IL-2 qm dirigida a FAP se comparó con la IgG 28H1 y la IgG 4B9 no conjugada dirigida a FAP, y la IgG DP47GS no dirigida. Además, se realizó un estudio de imagen SPECT/CT con IgG 4B9-IL-2 qm, en comparación con IgG DP47GS-IL-2 qm, IgG 4B9 e IgG DP47GS.
Conjugación con DTPA y marcado con 111In
Se dializaron soluciones de IgG 28H1-IL-2 qm, IgG128H1, IgG 4B9-IL-2 qm, IgG14B9 e IgG1 DP47 frente a solución salina amortiguada con fosfato (PBS, 15 mM). Se conjugaron dos mg de las construcciones (5 mg/ml) con ácido isotiocianatobencil-dietilentriaminopentaacético (ITC-DTPA, Macrocyclis, Dallas, TX) en NaHCO30,1 M, pH 8,2, bajo estrictas condiciones sin metales, mediante incubación con exceso molar de 5 veces de ITC-DTPA durante una hora a temperatura ambiente (TA). El ITC-DTPA no conjugado se eliminó mediante diálisis frente a un amortiguador de ácido 2-(W-morfolino) etanosulfónico (MES) 0,1 M, pH 5,5.
Los conjugados purificados se radiomarcaron por incubación con 111In (Covidien BV, Petten, Países Bajos) en un amortiguador MES 0,1 M, pH 5,5 que contenía seroalbúmina bovina (SAB) al 0,05 % y Tween-80 al 0,05 %, a TA, bajo estrictas condiciones sin metales durante 30 min. Después de la radiomarcación, se agregó ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a una concentración final de 5 mM para quelar el 111In no unido. Los productos marcados con 111In se purificaron mediante filtración en gel en columnas G25M desechables (PD10, Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia). Se determinó la pureza radioquímica del 111In purificado en construcciones marcadas mediante cromatografía instantánea de capa fina (ITLC) en tiras de cromatografía de control TEC (Biodex, Shirley, NY), utilizando amortiguador de citrato 0,1 M, pH 6,0, como fase móvil. La actividad específica de los preparados marcadas con 111In fue de 0,6-4,6 MBq/pg.
Ensayo de Lindmo
Se determinó la fracción inmunorreactiva de 111In en los preparados de anticuerpos marcados como se describió anteriormente (Lindmo et al. [1984] J Immunol Methods 72, 77-89). Brevemente, se incubó una serie de dilución en serie de células de riñón embrionario humano (REH) transfectadas con ADNc de la proteína de activación de fibroblastos (FAP; células REH-FAP) con 200 Bq de la construcción marcada con 111In a 37 °C durante 1 hora. Se incubó un duplicado de la concentración celular más baja en presencia de un exceso de construcción no marcada para corregir por la unión inespecífica. Después de la incubación, las células se lavaron, se centrifugaron y se determinó la radioactividad asociada a las células en la pastilla celular en un contador gamma (Wallac Wizzard 3 '' 1480 Y-counter automático, Pharmacia LKB). La fracción inmunorreactiva de los preparados osciló entre el 75-94 %.
Animales
Se adquirieron ratones desnudos BALB/c hembras (8-9 semanas, /-20 g) a Janvier y se alojaron en el Animalario Central del Centro Médico de Nimega de la Universidad Radboud en condiciones convencionales con 5 animales en jaulas ventiladas individualmente con acceso ad lib a alimento y agua. Después de una semana de aclimatación, se inocularon a los animales s.c. 10 x 106 células REH-FAP en matrigel (1:3) en el flanco izquierdo y opcionalmente 5 x 106 células REH-293 en matrigel (1:3) en el derecho flanco. Se controló el crecimiento del xenoinjerto mediante medición con calibre (volumen = [4/3n][1/2 longitud][1/2anchura][1/2altura]). Cuando los xenoinjertos alcanzaron un volumen de 100 mm3, se inyectaron a los ratones i.v. las construcciones marcadas con 111In.
Biodistribución (IgG 28H1-IL-2 qm, IgGi 28H1, IgGi 4B9 e IgGi DP47GS)
Se inyectaron construcciones marcadas con 111In (5 MBq, 150 |jg, 200 |jl) i.v. a través de la vena caudal. Veinticuatro horas después de la inyección se sacrificó a los animales por asfixia en atmósfera de CO2/O2. Se recogieron sangre, músculo, xenoinjerto, pulmón, bazo, páncreas, riñón, estómago (vacío), duodeno (vacío) e hígado, se pesaron y se determinó la radioactividad en un contador gamma (Wallac Wizard). Se contaron simultáneamente patrones de la dosis inyectada (1 %) y se calculó la captación en los tejidos como % de la dosis inyectada por gramo de tejido (%DI/g).
Análisis SPECT-TAC (IgG 4B9-IL-2 qm, IgG
1
4B9, IgG DP47GS-IL-2 qm e IgG
1
DP47GS)
Se inyectaron i.v. IgG-4B9-IL-2 qm, IgG1-4B9, IgG-DP47GS-IL-2 qm e IgG1-DP47GS marcados con 111In. (20 MBq, 50, 150, 300 jg , 200 jl). A las 4, 24, 72 y 144 horas de la inyección, se anestesió a los animales con isoflurano/02 y se escanearon durante 30 a 60 min en una cámara microSPECT/TAC U-SPECT II (MILabs, Utrecht, Países Bajos) equipada con un colimador de ratón de 1,0 mm. Inmediatamente después de la SPECT se realizó una tomografía computarizada (TAC). Tanto la exploración por SPECT (tamaño de vóxel de 0,4 mm) como por TAC se reconstruyeron con el software MILabs y ambas se registraron conjuntamente para determinar la ubicación exacta de la radioseñal. Se crearon imágenes en 3D usando el software Siemens Inveon Research Workplace.
En la figura 31 se muestra que no hay una diferencia significativa entre la distribución tisular y la orientación tumoral de la IgG1 28H1 y 4B9 y la IgG 28H1-IL-2 qm a las 24 horas (por lo tanto, la citocina no altera significativamente la distribución tisular y las propiedades de direccionamiento tumoral de los inmunoconjugados), y que las proporciones de tumor a sangre para las construcciones dirigidas a FAP son significativamente mayores que para la IgG DP47GS de control no dirigida.
Estos resultados se confirmaron en imágenes SPECT/TAC para el inmunoconjugado IgG 4B9-IL-2 qm (datos no mostrados). La IgG 4B9-IL-2 qm se localizó en la REH-FAP positiva para FAP pero no en los tumores de control de REH-293 negativos para FAP, mientras que el inmunoconjugado DP47GS no dirigido no se localizó en ninguno de los tumores. A diferencia de las IgG no conjugadas, también se observó una absorción débil de IgG 4B9-IL-2 qm en el bazo.
Ejemplo 9
Se comparó la unión de la IgG basada en 28H1-IL-2 qm y de una IgG basada en 28H1-(IL-2 qm)2 (es decir, un inmunoconjugado de formato "2+2" como se muestra en la figura 1; las secuencias se muestran en las SEQ ID NO: 253 y 205) a los linfocitos NK 92. Se sembraron 200.000 linfocitos NK92 por pocillo en una placa de 96 pocillos. Los inmunoconjugados se valoraron en los linfocitos NK92 y se incubaron durante 30 min a 4 °C para permitir la unión. Las células se lavaron dos veces con PBS que contenía sAb al 0,1 % para eliminar las construcciones no unidas. Para la detección de los inmunoconjugados, se agregó un anticuerpo específico anti-Fc humano marcado con ITCF durante 30 min a 4 °C. Las células se lavaron de nuevo dos veces con PBS que contenía SAB al 0,1 % y se analizaron mediante FACS utilizando un FACSCantoII de BD.
Como se ilustra en la figura 32, el inmunoconjugado "2+2" muestra una mejor unión a los linfocitos NK 92 que la construcción "2+1" correspondiente.
Ejemplo 10
Inducción de la proliferación de CMSP humanas por inmunoconjugados de IL-2
Se prepararon células mononucleares de sangre periférica (CMSP) usando Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO, EE. UU.). En resumen, se extrajo sangre venosa de voluntarios sanos en jeringuillas heparinizadas. Se diluyó la sangre 2:1 con PBS sin calcio ni magnesio, y se estratificó en Histopaque-1077. Se centrifugó el gradiente a 450 x g durante 30 min a temperatura ambiente (TA) sin interrupción. Se recogió la interfaz que contenía las CMSP y se lavó tres veces con PBS (350 x g seguido de 300 x g durante 10 min a TA).
Posteriormente, se marcaron las CMSP con CFSE (éster succinimidílico de carboxifluoresceína) 40 nM durante 15 min a 37 °C. Las células se lavaron con 20 ml de medio antes de recuperar las CMSP marcadas durante 30 min a 37 °C. Las células se lavaron, se contaron, y se sembraron 100.000 células en placas de 96 pocillos con fondo en U. Se valoraron proleucina prediluida (IL-2 natural comercialmente disponible) o inmunoconjugados de IL-2 sobre células sembradas que se incubaron durante los plazos indicados. Después de 4-6 días, las células se lavaron, se tiñeron con marcadores de superficie celular apropiados, y se analizaron por FACS usando un FACSCantoII de BD. Se definieron linfocitos NK como CD37CD56+, linfocitos T CD4 como CD3+/CD8- y linfocitos T CD8 como CD3+/CD8+.
En la figura 33 se muestra la proliferación de linfocitos NK después de la incubación con diferentes inmunoconjugados de IL-2 28H1 dirigidos a FAP durante 4 (A), 5 (B) o 6 (C) días. Todas las construcciones analizadas indujeron la proliferación de linfocitos NK de manera dependiente de la concentración. La proleucina fue más eficaz que los inmunoconjugados a menores concentraciones, si bien esta diferencia ya no existió a mayores concentraciones. En
momentos más tempranos (día 4), las construcciones de IgG-IL-2 parecieron ligeramente más potentes que las construcciones de Fab-IL-2-Fab. En momentos más tardíos (día 6), todas las construcciones tuvieron una eficacia similar, siendo la construcción Fab-IL-2 qm-Fab la menos potente a las concentraciones bajas.
En la figura 34 se muestra la proliferación de linfocitos T CD4 después de la incubación con diferentes inmunoconjugados de IL-228H1 dirigidos a FAP durante 4 (A), 5 (B) o 6 (C) días. Todas las construcciones analizadas indujeron la proliferación de linfocitos T CD4 de manera dependiente de la concentración. La proleucina tuvo mayor actividad que los inmunoconjugados, y los inmunoconjugados que comprenden IL-2 natural fueron ligeramente más potentes que los que comprenden IL-2 mutante cuádruple. Como para los linfocitos NK, la construcción Fab-IL-2 qm-Fab tuvo la menor actividad. Lo más probable es que los linfocitos T CD4 en proliferación sean parcialmente linfocitos T reguladores, al menos para las construcciones de la IL-2 natural.
En la figura 35 se muestra la proliferación de linfocitos T CD8 después de la incubación con diferentes inmunoconjugados de IL-228H1 dirigidos a FAP durante 4 (A), 5 (B) o 6 (C) días. Todas las construcciones analizadas indujeron la proliferación de linfocitos T CD8 de manera dependiente de la concentración. La proleucina tuvo mayor actividad que los inmunoconjugados, y los inmunoconjugados que comprenden IL-2 natural fueron ligeramente más potentes que los que comprenden IL-2 mutante cuádruple. Como para los linfocitos NK y T CD4, la construcción Fab-IL-2 qm-Fab tuvo la menor actividad.
Ejemplo 11
Muerte celular inducida por proliferación y activación de CMSP activadas por IL-2
Se preactivaron CMSP recién aisladas de donantes sanos durante la noche con PHA-M a 1 pg/ml en RPMI1640 con SBF al 10 % y glutamina al 1 %. Después de la preactivación, se recogieron las células CMSP, se marcaron con CFSE 40 nM en PBS y se sembraron en placas de 96 pocillos a 100.000 células/pocillo. Se estimularon las CMSP preactivadas con diferentes concentraciones de inmunoconjugados de IL-2 (IgG 4B9-IL-2 wt, IgG 4B9-IL-2 qm, Fab 4B9-IL-2 wt-Fab y Fab 4B9-IL-2 qm-Fab). Después de seis días de tratamiento con IL-2, se trataron las CMSP con 0,5 pg/ml de anticuerpo anti-Fas activador durante la noche. Se analizó la proliferación de linfocitos T CD4 (CD3'CD8‘) y CD8 (CD3+CD8+) después de seis días por dilución con CFSE. Se determinó el porcentaje de linfocitos T vivos después del tratamiento anti-Fas por selección en linfocitos CD3+ vivos negativos para anexina V.
Como se muestra en la figura 36, todas las construcciones indujeron la proliferación de linfocitos T preactivados. A bajas concentraciones, las construcciones que comprenden IL-2 wt natural fueron más activas que las construcciones que comprenden IL-2 qm. IgG-IL-2 wt, Fab-IL-2 wt-Fab y proleucina tuvieron una actividad similar. Fab-IL-2 qm-Fab fue ligeramente menos activa que IgG-IL-2 qm. Las construcciones que comprenden IL-2 natural fueron más activas sobre linfocitos T CD4 que sobre linfocitos T CD8, debido muy probablemente a la activación de linfocitos T reguladores. Las construcciones que comprenden IL-2 mutante cuádruple fueron similarmente activas sobre linfocitos T CD8 y CD4.
Como se muestra en la figura 37, los linfocitos T estimulados con altas concentraciones de la IL-2 natural son más sensibles a la apoptosis inducida por anti-Fas que los linfocitos T tratados con IL-2 mutante cuádruple.
Ejemplo 12
Se caracterizó adicionalmente la construcción DP47GS no dirigida (véase SEQ ID NO: 299 y 297 para las secuencias VH y VL, respectivamente). Como se describió anteriormente, se elaboraron conjugados de IgG DP47GS con IL-2 natural o mutante cuádruple. Estas construcciones mostraron una unión a IL-2R e inducción de la proliferación de células inmunitarias (p. ej., linfocitos NK, linfocitos CD8+ y linfocitos CD4+) in vitro similar a las construcciones dirigidas correspondientes (datos no mostrados). Sin embargo, en contraste con los inmunoconjugados dirigidos a un antígeno tumoral, no se acumularon en el tejido tumoral (véase ejemplo 8).
Se realizó un estudio farmacocinético adicional (además del que se muestra en el ejemplo 7) con construcciones de IgG DP47GS-IL-2 no dirigidas que comprenden IL-2 natural o mutante cuádruple. Se inyectaron i.v. a ratones C57BL/6J machos (n = 6 por grupo) 0,3, 1, 3 o 10 mg/kg de IgG DP47GS-IL-2 wt o IgG DP47GS-IL-2 qm. El volumen de inyección fue de 1 ml para todos los ratones. Se tomaron muestras de sangre 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96 y 168 horas después de la inyección (de 3 ratones en cada momento de evaluación) y se almacenaron a -20 °C hasta su análisis. Las construcciones se cuantificaron en las muestras de suero mediante ELISA, utilizando anticuerpos anti-Fab para la captura y detección de las construcciones. T odas las muestras y patrones de calibración se diluyeron 1:25 en suero de ratón (obtenido de Bioreclamation) antes del análisis. Brevemente, las placas de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina (Roche) se lavaron tres veces durante 10 segundos con PBS/Tween 20 al 0,05 %, antes de su incubación con 100 pl/pocillo (0,5 pg/ml) de anticuerpo Fab antihumano biotinilado (M-1.7.10; Roche Diagnostics) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de volver a lavar la placa tres veces con PBS/Tween 20 al 0,05 %, se agregaron 50 pl/pocillo de las muestras de suero o patrones de calibración y 50 pl/pocillo de PBS/SAB al 0,5 % para dar una dilución final de la muestra de 1:50. Las muestras se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de lavado de la placa de nuevo tres veces con PBS/Tween 20 al 0,05 %. A continuación, la placa se incubó
con 100 pl/pocillo (0,5 pg/ml) de anticuerpo Fab antihumano marcado con digoxigenina (M-1.19.31; Roche Diagnostics) durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavó, se incubó con 100 pl/pocillo de PO antidigoxigenina (Roche Diagnostics n.° de cat. 11633716001) durante 1 hora a temperatura ambiente y se volvió a lavar. Finalmente, se agregaron 100 pl/pocillo de sustrato de peroxidasa TMB (Roche Diagnostics n.° de cat. 11484281001) durante unos 5 minutos, antes de detener la reacción del sustrato con 50 pl/pocillo de HCl 2 N. La placa se leyó en el plazo de 2 minutos después de detener la reacción a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 650 nm.
La curva de calibración resultante se muestra en la figura 38. Ambas construcciones mostraron una semivida sérica larga, y la construcción que comprende la IL-2 mutante cuádruple (B) tiene una vida aún más prolongada que la que comprende la IL-2 natural (A).
Además, se confirmó la falta de unión de IgG DP47GS a diversas proteínas y células humanas (CMSP).
La especificidad de unión (o su ausencia) del anticuerpo DP47GS se evaluó en un sistema analítico basado en ELISA con un grupo de diferentes antígenos no relacionados. La prueba se realizó en placas de microtitulación MaxiSorp™ de 384 pocillos (Thermo Scientific Nunc, n.° de cat. 460372). Después de cada etapa de incubación, las placas se lavaron tres veces con PBS/Tween-20 al 0,05 %. Primero, los diferentes antígenos, diluidos en PBS, se recubrieron en placas durante la noche a 6 °C. Las concentraciones de prueba y la información detallada de los antígenos usados se enumeran en la tabla siguiente.
Después de eso, los pocillos se bloquearon con gelatina al 2 % en agua durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). El anticuerpo DP47GS (1 pg/ml en PBS) se incubó con el grupo de antígenos capturados durante 1,5 horas a TA. El anticuerpo unido se detectó utilizando un conjugado de anticuerpo anti-IgG humano-PRP (GE Healthcare, n.° de cat.
9330V; diluido 1:1000 en PBS con Tween-20 al 0,2 % y gelatina al 0,5 %). Después de 1 hora de incubación, las placas se lavaron 6 veces con PBS/Tween-20 al 0,05 % y se revelaron con solución de sustrato de PO azul BM recién preparada (azul BM: 3,3'-5,5'-tetrametilbencidina, Roche Diagnostics, n.° de cat. 11484281001) durante 30 min a TA. La absorbancia se midió a 370 nm. El valor en blanco se definió sin adición de anticuerpo. Un anticuerpo IgG1 humano interno que muestra una unión inespecífica a casi todos los antígenos capturados sirvió como control positivo.
Los resultados de estos experimentos se muestran en la figura 39. El anticuerpo DP47GS no mostró unión a ninguno de los antígenos capturados. Las señales detectadas estaban en el intervalo de las muestras de control sin anticuerpo.
Finalmente, se evaluó la unión del anticuerpo DP47GS a las CMSP humanas. Dado que en el curso de una respuesta inmunitaria típica la combinación de proteínas de la superficie celular cambia espectacularmente, la unión se analizó en CMSP inmediatamente después de su aislamiento de adultos sanos, así como después de la activación in vitro con dos estímulos diferentes.
Se aislaron CMSP humanas mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll a partir de capas leucocitarias o de sangre fresca heparinizada de voluntarios sanos utilizando Histopaque 1077 (Sigma-Aldrich, Alemania). Las CMSP se sometieron directamente a ensayos de unión (CMSP frescas) o se cultivaron y se estimularon adicionalmente. Se cultivaron CMSP a una densidad celular de 2 x 106 células/ml en medio de linfocitos T que consta
de RPMI 1640 (Gibco) complementado con SBF inactivado por calor al 10 % (v/v; PAA Laboratories), piruvato de sodio 1 mM (Sigma-Aldrich), L-alanil-L-glutamina al 1 % (v/v; Biochrom) y p-mercaptoetanol 10 nM (Sigma-Aldrich) a 37 °C. Para la estimulación in vitro, se agregaron proleucina (200 U/ml, Novartis) y fitohemaglutinina (PHA-L; 2 pg/ml, Sigma-Aldrich) durante los seis días de cultivo (CMSP activadas con PHA-L). Para la reestimulación in vitro, se recubrieron placas de cultivo celular de 6 pocillos con anticuerpos de ratón anti-CD3 humano (clon KT3, 1 pg/ml) y anti-CD28 humano (clon 28.2, 2 pg/ml, ambos de eBioscience) y se agregaron CMSP activadas con PHA-L durante 24 horas adicionales (CMSP reestimuladas). La unión del anticuerpo DP47GS (con o sin la mutación L234A L235A [LALA] P329G en el dominio Fc) a las proteínas de la superficie celular se controló para una serie de dilución en serie de cinco veces (concentración máxima 200 nM) utilizando un anticuerpo secundario de cabra específico anti-Fc de IgG humana conjugado con isotiocianato de fluoresceína (ITCF; Jackson Laboratories) y análisis de citometría de flujo. Todos los ensayos se realizaron a 4 °C para evitar la internalización de las proteínas de superficie. La incubación del anticuerpo primario y secundario fue de 2 horas y de 1 hora, respectivamente. Para permitir la tipificación simultánea de leucocitos, se agregaron al anticuerpo secundario combinaciones de ratón marcadas con fluorocromo anti-CD14, CD15, CD4, CD19 (todo Biolegend), NKp46, CD3, CD56, CD8 humanas (todo BD Pharmingen). Se agregó yoduro de propidio (1 pg/ml) inmediatamente antes de la medición en un dispositivo FACSCantolI que ejecuta el software FACS Diva (ambos BD Bioscience) para excluir las células muertas permeables. Las células vivas negativas para yoduro de propidio se seleccionaron para linfocitos T (CD14'CD3+Cd 4+/CD8+), linfocitos B (CD14'CD19+), linfocitos NK (CD14'NKp46+/CD56+) o monocitos/neutrófilos (Cd 3'CD56'CD14+/CD15+). Se determinó la mediana de fluorescencia de ITCF de los distintos tipos de leucocitos como indicador para el anticuerpo primario unido y se transfirió frente a la concentración del anticuerpo primario usando Prism4 (software GraphPad).
Como se muestra en la figura 40, el anticuerpo IgG DP47GS sin mutación Fc mostró unión solamente a las células portadoras del receptor Fcy, p. ej., linfocitos NK y monocitos/neutrófilos. No se detectó unión de DP47GS (LALA P329G) en CMSP humanas, independientemente de su estado de activación. La mutación LALA P329G en el dominio Fc suprimió también completamente la unión a las células portadoras del receptor Fcy.
Claims (18)
1. Un inmunoconjugado que comprende (i) una molécula de inmunoglobulina que comprende una primera y una segunda molécula de Fab de unión a antígeno y un dominio Fc que consta de dos subunidades, y (ii) un resto efector, en el que no está presente más de un resto efector; y en el que
dicha primera y dicha segunda molécula de Fab se dirigen al ACE y comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 191, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 189; y
dicho resto efector es un polipéptido de interleucina-2 (IL-2) humana mutante que comprende las sustituciones de aminoácidos T3A, F42A, Y45a , L72G (numeración con relación a la secuencia de la IL-2 humana en la SEQ ID NO: 2); y
dicho dominio Fc comprende las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G (numeración de la UE) en cada una de sus subunidades.
2. El inmunoconjugado de la reivindicación 1, en el que dicho dominio Fc es un dominio Fc de IgG, en particular un dominio Fc de IgG1 humana.
3. El inmunoconjugado de la reivindicación 1 o 2, en el que dicho dominio Fc comprende una modificación que promueve la heterodimerización de dos cadenas polipeptídicas no idénticas.
4. El inmunoconjugado de la reivindicación 3, en el que dicha modificación es una modificación de botón en ojal, que comprende una modificación de botón en una de las dos subunidades del dominio Fc y una modificación de ojal en la otra de las dos subunidades del dominio Fc, en el que dicha modificación de botón comprende la sustitución de aminoácido T366W, y dicha modificación de ojal comprende las sustituciones de aminoácidos T366S, L368A e Y407V (numeración de la UE).
5. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho dominio Fc comprende una o más mutaciones aminoacídicas que reducen la unión del dominio Fc a un receptor Fc, en particular un receptor Fcy.
6. El inmunoconjugado de la reivindicación 5, en el que dicha mutación de aminoácido es una sustitución de aminoácido en la posición P329 (numeración de la UE).
7. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la clase IgG.
8. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho resto efector se fusiona con el aminoácido carboxiterminal de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, opcionalmente a través de un péptido conector.
9. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho polipéptido de interleucina-2 (IL-2) humana mutante comprende además la sustitución de aminoácido C125A.
10. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho polipéptido de interleucina-2 (IL-2) humana mutante comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 3.
11. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281 y SEQ ID NO: 283, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad.
12. Un polinucleótido aislado que codifica el inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. Una célula anfitriona que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 12.
14. Un procedimiento para producir un inmunoconjugado, que comprende cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 13 en condiciones adecuadas para la expresión del inmunoconjugado y opcionalmente recuperar el inmunoconjugado.
15. Un inmunoconjugado que comprende (i) una molécula de inmunoglobulina que comprende una primera y una segunda molécula de Fab de unión a antígeno y un dominio Fc que consta de dos subunidades, y (ii) un resto efector, en el que no está presente más de un resto efector, en el que se produce dicho inmunoconjugado por el procedimiento de la reivindicación 14.
16. Una composición farmacéutica que comprende el inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o la reivindicación 15 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
17. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o la reivindicación 15, o la composición farmacéutica de la reivindicación 16, para su uso en el tratamiento de una enfermedad en una persona que necesita del mismo.
18. El inmunoconjugado o la composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad de la reivindicación 17, en el que dicha enfermedad es el cáncer.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP11164237 | 2011-04-29 | ||
PCT/EP2012/057587 WO2012146628A1 (en) | 2011-04-29 | 2012-04-26 | Novel immunoconjugates |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2707297T3 true ES2707297T3 (es) | 2019-04-03 |
Family
ID=46022216
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES12717674T Active ES2707297T3 (es) | 2011-04-29 | 2012-04-26 | Inmunoconjugados novedosos |
Country Status (34)
Country | Link |
---|---|
US (6) | US9447159B2 (es) |
EP (1) | EP2702074B1 (es) |
JP (3) | JP5972355B2 (es) |
KR (1) | KR101715445B1 (es) |
CN (2) | CN103649114B (es) |
AR (1) | AR086075A1 (es) |
AU (2) | AU2012247548B2 (es) |
BR (1) | BR112013025127A2 (es) |
CA (1) | CA2831008C (es) |
CL (1) | CL2013003064A1 (es) |
CO (1) | CO6801645A2 (es) |
CR (1) | CR20130480A (es) |
DK (1) | DK2702074T3 (es) |
EA (3) | EA201892619A1 (es) |
EC (1) | ECSP13013002A (es) |
ES (1) | ES2707297T3 (es) |
HK (1) | HK1259474A1 (es) |
HR (1) | HRP20190118T1 (es) |
HU (1) | HUE042187T2 (es) |
IL (2) | IL229006B (es) |
LT (1) | LT2702074T (es) |
MX (2) | MX2013012413A (es) |
MY (2) | MY164661A (es) |
PE (2) | PE20181202A1 (es) |
PL (1) | PL2702074T3 (es) |
PT (1) | PT2702074T (es) |
RS (1) | RS58295B1 (es) |
SG (2) | SG10201606300XA (es) |
SI (1) | SI2702074T1 (es) |
TR (1) | TR201818974T4 (es) |
TW (1) | TWI592424B (es) |
UA (1) | UA115034C2 (es) |
WO (1) | WO2012146628A1 (es) |
ZA (1) | ZA201306820B (es) |
Families Citing this family (178)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011005772A1 (en) | 2009-07-06 | 2011-01-13 | Variation Biotechnologies, Inc. | Methods for preparing vesicles and formulations produced therefrom |
AU2010270722B2 (en) | 2009-07-06 | 2015-06-04 | Variation Biotechnologies, Inc. | Methods for preparing vesicles and formulations produced therefrom |
US9493578B2 (en) | 2009-09-02 | 2016-11-15 | Xencor, Inc. | Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens |
CA2840079C (en) * | 2010-07-06 | 2018-07-03 | Variation Biotechnologies Inc. | Compositions and methods for treating influenza |
EP2598530A2 (en) | 2010-07-29 | 2013-06-05 | Xencor, Inc. | Antibodies with modified isoelectric points |
EP3333194B1 (en) | 2010-08-13 | 2021-03-17 | Roche Glycart AG | Anti-fap antibodies and methods of use |
BR112013017939B1 (pt) | 2011-01-13 | 2022-11-16 | Variation Biotechnologies Inc | Composição imunogênica liofilizada termoestável, uso e método para preparação da mesma |
DK3489255T3 (da) | 2011-02-10 | 2021-08-23 | Roche Glycart Ag | Muterede interleukin-2-polypeptider |
UA115030C2 (uk) * | 2011-03-02 | 2017-09-11 | Рош Глікарт Аг | Антитіло, яке зв'язується зі зв'язаним з мембраною карциноембріональним антигеном (сеа) |
PT2691417T (pt) | 2011-03-29 | 2018-10-31 | Roche Glycart Ag | Variantes de fc de anticorpos |
JP5977814B2 (ja) | 2011-04-08 | 2016-08-24 | アムジエン・インコーポレーテツド | 増殖分化因子15(gdf−15)を使用して代謝障害を治療または改善する方法 |
EA201892619A1 (ru) | 2011-04-29 | 2019-04-30 | Роше Гликарт Аг | Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2 |
EP2537933A1 (en) | 2011-06-24 | 2012-12-26 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) | An IL-15 and IL-15Ralpha sushi domain based immunocytokines |
KR101870555B1 (ko) | 2011-08-23 | 2018-06-22 | 로슈 글리카트 아게 | T 세포 활성화 항원 및 종양 항원에 대해 특이적인 이중특이적 항체 및 이의 사용 방법 |
US10851178B2 (en) | 2011-10-10 | 2020-12-01 | Xencor, Inc. | Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications |
WO2013104995A2 (en) | 2012-01-12 | 2013-07-18 | Variation Biotechnologies, Inc. | Compositions and methods for treating viral infections |
BR112014018575A2 (pt) | 2012-01-26 | 2017-07-04 | Amgen Inc | polipetídeos de fator de diferenciação de crescimento 15 (gdf-15) |
CA2894467A1 (en) | 2012-01-27 | 2013-08-01 | Variation Biotechnologies Inc. | Methods for preparing thermostable compositions comprising a lipid component and thermolabile therapeutic agents |
ES2896493T3 (es) | 2012-07-13 | 2022-02-24 | Roche Glycart Ag | Anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-ANG-2 y su uso en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares |
AR092044A1 (es) | 2012-08-07 | 2015-03-18 | Roche Glycart Ag | Inmunoterapia mejorada |
BR112015002085A2 (pt) | 2012-08-08 | 2017-12-19 | Roche Glycart Ag | proteína, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método para produzir a proteína, composição farmacêutica, uso da proteína, método de tratamento e invenção |
US20140044675A1 (en) | 2012-08-10 | 2014-02-13 | Roche Glycart Ag | Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof |
RU2015117393A (ru) | 2012-10-08 | 2016-12-10 | Роше Гликарт Аг | Лишенные fc антитела, содержащие два Fab-фрагмента, и способы их применения |
US9701759B2 (en) | 2013-01-14 | 2017-07-11 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
CN105051069B (zh) | 2013-01-14 | 2019-12-10 | Xencor股份有限公司 | 新型异二聚体蛋白 |
US10131710B2 (en) | 2013-01-14 | 2018-11-20 | Xencor, Inc. | Optimized antibody variable regions |
US10968276B2 (en) | 2013-03-12 | 2021-04-06 | Xencor, Inc. | Optimized anti-CD3 variable regions |
US9605084B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-03-28 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US10487155B2 (en) | 2013-01-14 | 2019-11-26 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US11053316B2 (en) | 2013-01-14 | 2021-07-06 | Xencor, Inc. | Optimized antibody variable regions |
CA2897987A1 (en) | 2013-01-15 | 2014-07-24 | Xencor, Inc. | Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies |
WO2014122143A1 (en) | 2013-02-05 | 2014-08-14 | Engmab Ag | Method for the selection of antibodies against bcma |
CN105143270B (zh) * | 2013-02-26 | 2019-11-12 | 罗切格利卡特公司 | 双特异性t细胞活化抗原结合分子 |
KR20210094673A (ko) | 2013-02-26 | 2021-07-29 | 로슈 글리카트 아게 | 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자 |
US9546203B2 (en) * | 2013-03-14 | 2017-01-17 | Amgen Inc. | Aglycosylated Fc-containing polypeptides with cysteine substitutions |
US10106624B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-10-23 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US10519242B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-12-31 | Xencor, Inc. | Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins |
US10858417B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-12-08 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
AU2014232416B2 (en) * | 2013-03-15 | 2017-09-28 | Xencor, Inc. | Modulation of T Cells with Bispecific Antibodies and FC Fusions |
UA118028C2 (uk) | 2013-04-03 | 2018-11-12 | Рош Глікарт Аг | Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування |
EP3027642B1 (en) * | 2013-07-31 | 2020-08-19 | Amgen Inc. | Growth differentiation factor 15 (gdf-15) constructs |
BR112016013562A2 (pt) | 2013-12-20 | 2017-10-03 | Hoffmann La Roche | Anticorpos anti-tau(ps422) humanizados, seus usos, e formulações farmacêuticas |
WO2015103928A1 (zh) * | 2014-01-08 | 2015-07-16 | 上海恒瑞医药有限公司 | Il-15异源二聚体蛋白及其用途 |
HRP20220214T1 (hr) * | 2014-01-15 | 2022-04-29 | Kadmon Corporation, Llc | Imunomodulacijska sredstva |
WO2015117930A1 (en) * | 2014-02-06 | 2015-08-13 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Interleukine 10 immunoconjugates |
DK3102595T3 (en) * | 2014-02-06 | 2019-02-04 | Hoffmann La Roche | Interleukin-2 fusion proteins and their applications |
GB201403775D0 (en) | 2014-03-04 | 2014-04-16 | Kymab Ltd | Antibodies, uses & methods |
EA201691925A1 (ru) | 2014-03-28 | 2017-06-30 | Ксенкор, Инк. | Биспецифические антитела, которые связываются с cd38 и cd3 |
AR100978A1 (es) | 2014-06-26 | 2016-11-16 | Hoffmann La Roche | LANZADERAS CEREBRALES DE ANTICUERPO HUMANIZADO ANTI-Tau(pS422) Y USOS DE LAS MISMAS |
JP6768633B2 (ja) * | 2014-07-21 | 2020-10-14 | デリニア, インコーポレイテッド | 自己免疫疾患を治療するために調節性t細胞を選択的に活性化する分子 |
HUE044814T2 (hu) | 2014-08-04 | 2019-11-28 | Hoffmann La Roche | Bispecifikus, T-sejt-aktiváló antigénkötõ molekulák |
CN113234138A (zh) | 2014-08-11 | 2021-08-10 | 德里尼亚公司 | 选择性地活化调节性t细胞用于治疗自身免疫病的修饰的il-2变体 |
LT3186283T (lt) * | 2014-08-29 | 2020-03-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Kombinuotoji terapija į naviką nutaikytais il-2 imunocitokinais ir antikūnais prieš žmogaus pd-l1 |
WO2016071377A1 (en) * | 2014-11-06 | 2016-05-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Fc-region variants with modified fcrn- and protein a-binding properties |
PL3789402T3 (pl) | 2014-11-20 | 2022-10-17 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Terapia skojarzona składająca się z dwuswoistych cząsteczek wiążących antygen aktywujących limfocyty T oraz antagonistów wiązania osi PD-1 |
CN104403004B (zh) | 2014-11-24 | 2017-10-13 | 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 | 抗体‑干扰素异二聚体的制备和用途 |
PE20171103A1 (es) | 2014-11-26 | 2017-08-07 | Xencor Inc | Anticuerpos heterodimericos que se unen a cd3 y cd38 |
US10259887B2 (en) | 2014-11-26 | 2019-04-16 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens |
BR112017011092A2 (pt) | 2014-11-26 | 2017-12-26 | Xencor Inc | anticorpos heterodiméricos que ligam cd3 e antígenos de tumor |
JP6621478B2 (ja) | 2014-12-19 | 2019-12-18 | アルカーメス,インコーポレイテッド | 一本鎖Fc融合タンパク質 |
WO2016105450A2 (en) | 2014-12-22 | 2016-06-30 | Xencor, Inc. | Trispecific antibodies |
WO2016141387A1 (en) | 2015-03-05 | 2016-09-09 | Xencor, Inc. | Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions |
EP3744732A1 (en) | 2015-06-24 | 2020-12-02 | F. Hoffmann-La Roche AG | Humanized anti-tau(ps422) antibodies and methods of use |
AR106188A1 (es) | 2015-10-01 | 2017-12-20 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización |
MA43017A (fr) | 2015-10-02 | 2018-08-08 | Hoffmann La Roche | Anticorps bispécifiques spécifiques d'un récepteur de co-stimulation du tnf |
CA2990755A1 (en) | 2015-10-02 | 2017-04-06 | F. Hoffman-La Roche Ag | Bispecific anti-ceaxcd3 t cell activating antigen binding molecules |
SG11201804259UA (en) | 2015-12-04 | 2018-06-28 | Novartis Ag | Antibody cytokine engrafted compositions and methods of use for immunoregulation |
US10227410B2 (en) | 2015-12-07 | 2019-03-12 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind CD3 and PSMA |
CA2997406C (en) | 2015-12-09 | 2024-05-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies or cytokine release |
EP3178848A1 (en) | 2015-12-09 | 2017-06-14 | F. Hoffmann-La Roche AG | Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies |
WO2017118675A1 (en) | 2016-01-08 | 2017-07-13 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods of treating cea-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-cea/anti-cd3 bispecific antibodies |
US20170204154A1 (en) * | 2016-01-20 | 2017-07-20 | Delinia, Inc. | Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases |
HRP20230528T1 (hr) | 2016-03-22 | 2023-08-04 | F. Hoffmann - La Roche Ag | Bispecifične molekule t stanica aktivirane proteazom |
WO2017189959A1 (en) | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions for the treatment of disease |
WO2017189964A2 (en) | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions for the treatment of disease |
MX2018015592A (es) | 2016-06-14 | 2019-04-24 | Xencor Inc | Anticuerpos inhibidores de puntos de control biespecificos. |
US9567399B1 (en) | 2016-06-20 | 2017-02-14 | Kymab Limited | Antibodies and immunocytokines |
CA3026393C (en) * | 2016-06-22 | 2023-03-14 | Alkermes, Inc. | Compositions and methods for modulating il-10 immunostimulatory and anti-inflammatory properties |
JP7021127B2 (ja) | 2016-06-28 | 2022-02-16 | ゼンコア インコーポレイテッド | ソマトスタチン受容体2に結合するヘテロ二量体抗体 |
KR102050463B1 (ko) | 2016-08-10 | 2019-11-29 | 아주대학교산학협력단 | 항체 중쇄불변부위 이종이중체 (heterodimeric Fc)에 융합된 사이토카인 (heterodimeric Fc-fused cytokine) 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 |
US10793632B2 (en) | 2016-08-30 | 2020-10-06 | Xencor, Inc. | Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors |
EP3519437B1 (en) | 2016-09-30 | 2021-09-08 | F. Hoffmann-La Roche AG | Bispecific antibodies against p95her2 |
MX2019004327A (es) | 2016-10-14 | 2019-10-14 | Xencor Inc | Proteinas de fusion heterodimericas biespecificas que contienen proteinas de fusion fc il-15/il-15ra y fragmentos de anticuerpo pd-1. |
SG11201903400WA (en) * | 2016-10-17 | 2019-05-30 | Pfizer | Anti-edb antibodies and antibody-drug conjugates |
CN109952370B (zh) * | 2016-10-19 | 2023-09-08 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于产生免疫缀合物的方法 |
WO2018083248A1 (en) | 2016-11-03 | 2018-05-11 | Kymab Limited | Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods |
AU2017359172A1 (en) | 2016-11-08 | 2019-05-16 | Delinia, Inc. | IL-2 variants for the treatment of autoimmune diseases |
CN116970061A (zh) | 2016-12-22 | 2023-10-31 | 库尔生物制药有限公司 | T细胞调节性多聚体多肽及其使用方法 |
WO2018128931A1 (en) * | 2017-01-03 | 2018-07-12 | National Health Research Institutes | Compositions and methods for enhancement of immune responses |
WO2018152326A1 (en) * | 2017-02-17 | 2018-08-23 | Denali Therapeutics Inc. | Engineered transferrin receptor binding polypeptides |
US20200010528A1 (en) * | 2017-03-15 | 2020-01-09 | Cue Biopharma, Inc. | Methods for modulating an immune response |
BR112019018915A2 (pt) | 2017-03-15 | 2020-04-14 | Pandion Therapeutics Inc | imunotolerância direcionada |
CN110382525B (zh) * | 2017-04-03 | 2023-10-20 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 免疫缀合物 |
KR20190121816A (ko) | 2017-04-03 | 2019-10-28 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 항-pd-1 항체와 돌연변이 il-2 또는 il-15의 면역접합체 |
AU2018250875A1 (en) | 2017-04-13 | 2019-10-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | An interleukin-2 immunoconjugate, a CD40 agonist, and optionally a PD-1 axis binding antagonist for use in methods of treating cancer |
MX2019013517A (es) | 2017-05-24 | 2020-08-17 | Pandion Operations Inc | Inmunotolerancia dirigida. |
JOP20190271A1 (ar) | 2017-05-24 | 2019-11-21 | Novartis Ag | بروتينات مطعّمة بسيتوكين- الجسم المضاد وطرق الاستخدام للاضطرابات المتعلقة بالمناعة |
WO2018215936A1 (en) | 2017-05-24 | 2018-11-29 | Novartis Ag | Antibody-cytokine engrafted proteins and methods of use in the treatment of cancer |
AU2018279105A1 (en) * | 2017-06-07 | 2019-12-19 | Silverback Therapeutics, Inc. | Antibody conjugates of immune-modulatory compounds and uses thereof |
AU2018291497A1 (en) | 2017-06-30 | 2020-01-16 | Xencor, Inc. | Targeted heterodimeric Fc fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra and antigen binding domains |
DK3661954T3 (da) | 2017-08-03 | 2022-04-19 | Amgen Inc | Interleukin-21-muteiner og fremgangsmåder til behandling |
BR112020002271A2 (pt) | 2017-08-03 | 2020-07-28 | Synthorx, Inc. | conjugados de citocina para o tratamento de doenças proliferativas e infecciosas |
SI3665192T1 (sl) * | 2017-08-10 | 2023-11-30 | Denali Therapeutics Inc. | Inženiring polipeptidov, ki se vežejo na receptorje za transferine |
US11883503B2 (en) | 2017-09-25 | 2024-01-30 | Dingfu Biotarget Co., Ltd. | Methods and compositions for cancer treatment |
JP2021500857A (ja) | 2017-10-02 | 2021-01-14 | デナリ セラピューティクス インコーポレイテッドDenali Therapeutics Inc. | 酵素補充療法用酵素を含む融合タンパク質 |
US10981992B2 (en) | 2017-11-08 | 2021-04-20 | Xencor, Inc. | Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors |
AU2018366199A1 (en) | 2017-11-08 | 2020-05-28 | Xencor, Inc. | Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-PD-1 sequences |
BR112020010020A2 (pt) * | 2017-11-20 | 2020-11-10 | Taizhou Mabtech Pharmaceutical Co., Ltd | uma proteína de fusão bifuncional direcionada a cd47 e pd-l1 |
US10946068B2 (en) | 2017-12-06 | 2021-03-16 | Pandion Operations, Inc. | IL-2 muteins and uses thereof |
US10174092B1 (en) | 2017-12-06 | 2019-01-08 | Pandion Therapeutics, Inc. | IL-2 muteins |
JP2021506291A (ja) | 2017-12-19 | 2021-02-22 | ゼンコア インコーポレイテッド | 改変されたil−2 fc融合タンパク質 |
KR20200110358A (ko) | 2018-01-12 | 2020-09-23 | 암젠 인크 | 항-pd-1 항체 및 치료 방법 |
AU2019215440A1 (en) | 2018-02-05 | 2020-08-27 | Orionis Biosciences, Inc. | Fibroblast binding agents and use thereof |
CA3089287A1 (en) | 2018-02-08 | 2019-08-15 | Genentech, Inc. | Bispecific antigen-binding molecules and methods of use |
CN113166220A (zh) * | 2018-03-09 | 2021-07-23 | 奥美药业有限公司 | 创新细胞因子前药 |
US10982006B2 (en) | 2018-04-04 | 2021-04-20 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein |
AU2019253462A1 (en) | 2018-04-09 | 2020-11-26 | Amgen Inc. | Growth differentiation factor 15 fusion proteins |
SG11202010163QA (en) | 2018-04-18 | 2020-11-27 | Xencor Inc | Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof |
CA3097741A1 (en) * | 2018-04-18 | 2019-10-24 | Xencor, Inc. | Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains |
CA3097649A1 (en) * | 2018-04-18 | 2019-10-24 | Xencor, Inc. | Lag-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and lag-3 antigen binding domains |
AU2019297451A1 (en) | 2018-07-03 | 2021-01-28 | Marengo Therapeutics, Inc. | Anti-TCR antibody molecules and uses thereof |
KR102201086B1 (ko) * | 2018-09-17 | 2021-01-11 | (주)지아이이노베이션 | Il-2 단백질 및 cd80 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 |
AR114732A1 (es) | 2018-09-18 | 2020-10-07 | Hoffmann La Roche | Utilización de un inhibidor de catepsina s contra la formación de anticuerpos antifármaco |
MX2021003548A (es) * | 2018-10-01 | 2021-05-27 | Hoffmann La Roche | Moleculas de union a antigeno biespecificas que comprenden el clon 212 anti-fap. |
EP3861016A2 (en) | 2018-10-03 | 2021-08-11 | Xencor, Inc. | Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins |
CA3116188A1 (en) | 2018-10-12 | 2020-04-16 | Xencor, Inc. | Pd-1 targeted il-15/il-15ralpha fc fusion proteins and uses in combination therapies thereof |
AU2019366956A1 (en) | 2018-10-23 | 2021-05-20 | Dragonfly Therapeutics, Inc. | Heterodimeric Fc-fused proteins |
CN112955168A (zh) * | 2018-11-09 | 2021-06-11 | 尼克塔治疗公司 | 与另一种药理活性剂组合的长效白介素-15受体激动剂 |
JP2022513043A (ja) * | 2018-11-14 | 2022-02-07 | ルーブリック・セラピューティクス・インコーポレイテッド | 操作されたcd25ポリペプチドおよびその使用 |
EP3897853A1 (en) | 2018-12-20 | 2021-10-27 | Xencor, Inc. | Targeted heterodimeric fc fusion proteins containing il-15/il-15ra and nkg2d antigen binding domains |
CN113286821A (zh) | 2018-12-21 | 2021-08-20 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 靶向肿瘤的激动性cd28抗原结合分子 |
WO2020127628A1 (en) * | 2018-12-21 | 2020-06-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Tumor-targeted superagonistic cd28 antigen binding molecules |
US11529402B2 (en) | 2019-01-14 | 2022-12-20 | Ignite Immunotherapy, Inc. | Recombinant vaccinia virus and methods of use thereof |
US12006345B2 (en) | 2019-02-21 | 2024-06-11 | Xencor, Inc. | Untargeted and targeted IL-10 Fc-fusion proteins |
CN114173875A (zh) | 2019-03-01 | 2022-03-11 | Xencor股份有限公司 | 结合enpp3和cd3的异二聚抗体 |
TW202110885A (zh) | 2019-05-20 | 2021-03-16 | 美商潘迪恩治療公司 | 靶向MAdCAM之免疫耐受性 |
CA3136992A1 (en) * | 2019-05-24 | 2020-12-03 | Proviva Therapeutics (Hong Kong) Limited | Il-2 compositions and methods of use thereof |
KR20220020879A (ko) | 2019-06-12 | 2022-02-21 | 에스크진 파마, 아이엔씨. | 새로운 il-15 프로드럭 및 이를 사용하는 방법 |
WO2020249757A1 (en) * | 2019-06-14 | 2020-12-17 | Philogen S.P.A | Immunoconjugates comprising a single chain diabody and interleukin-15 or interleukin-15 and a sushi domain of interleukin-15 receptor alpha |
TW202115115A (zh) | 2019-07-02 | 2021-04-16 | 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 | 免疫結合物 |
TW202128757A (zh) | 2019-10-11 | 2021-08-01 | 美商建南德克公司 | 具有改善之特性的 PD-1 標靶 IL-15/IL-15Rα FC 融合蛋白 |
BR112022012112A2 (pt) | 2019-12-20 | 2022-09-06 | Regeneron Pharma | Agonistas de il2 e métodos de uso dos mesmos |
BR112022012230A2 (pt) | 2019-12-23 | 2022-08-30 | Denali Therapeutics Inc | Variantes de progranulina |
US20210252142A1 (en) * | 2020-02-06 | 2021-08-19 | Aetio Biotherapy, Inc. | Compositions and methods for treating viral infections |
EP4107187A4 (en) | 2020-02-21 | 2024-07-03 | Pandion Operations Inc | TISSUE-TARGETED IMMUNOTOLERANCE WITH A CD39 EFFECTOR |
CN115667523A (zh) | 2020-04-10 | 2023-01-31 | 西托姆克斯治疗公司 | 可活化细胞因子构建体和相关组合物以及方法 |
WO2021209402A2 (en) | 2020-04-15 | 2021-10-21 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Immunoconjugates |
US11673930B2 (en) | 2020-05-12 | 2023-06-13 | Regeneran Pharmaceuticals, Inc. | IL10 agonists and methods of use thereof |
CA3177843A1 (en) | 2020-05-13 | 2021-11-18 | John Thomas MULLIGAN | Compositions of protein complexes and methods of use thereof |
WO2021231976A1 (en) | 2020-05-14 | 2021-11-18 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3 |
US11780920B2 (en) | 2020-06-19 | 2023-10-10 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antibodies binding to CD3 and CD19 |
CA3184746A1 (en) * | 2020-06-23 | 2021-12-30 | Kadmon Corporation, Llc | Anti-pd-1 antibodies and fusion proteins |
CA3186753A1 (en) | 2020-07-20 | 2022-01-27 | John Mumm | Dual cytokine fusion proteins comprising il-10 |
EP4198050A4 (en) * | 2020-08-11 | 2024-05-01 | Kanaph Therapeutics Inc. | FUSION PROTEIN WITH IL-12 AND ANTI-CD20 ANTIBODIES AND USE THEREOF |
CA3192204A1 (en) | 2020-08-19 | 2022-02-24 | Xencor, Inc. | Anti-cd28 and/or anti-b7h3 compositions |
WO2022056014A1 (en) | 2020-09-09 | 2022-03-17 | Cue Biopharma, Inc. | Mhc class ii t-cell modulatory multimeric polypeptides for treating type 1 diabetes mellitus (t1d) and methods of use thereof |
US11865082B2 (en) | 2020-09-09 | 2024-01-09 | Hoffmann-La Roche Inc. | Combination therapy of PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokines and antibodies against human PD-L1 |
EP4232071A1 (en) | 2020-10-23 | 2023-08-30 | Asher Biotherapeutics, Inc. | Fusions with cd8 antigen binding molecules for modulating immune cell function |
AU2021402065A1 (en) * | 2020-12-17 | 2023-06-29 | Ose Immunotherapeutics | Bifunctional anti-pd1/il-7 molecules |
WO2022148853A1 (en) | 2021-01-11 | 2022-07-14 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Immunoconjugates |
WO2022159508A1 (en) * | 2021-01-19 | 2022-07-28 | Seneca Therapeutics, Inc. | Armed seneca valley virus oncolytic therapy compositions and methods thereof |
WO2022189380A1 (en) | 2021-03-09 | 2022-09-15 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Combination therapy of pd-1-targeted il-2 variant immunoconjugate and anti-tyrp1/anti-cd3 bispecific antibodies |
CA3209640A1 (en) | 2021-03-09 | 2022-09-15 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Combination therapy of pd-1-targeted il-2 variant immunoconjugates and fap/4-1bb binding molecules |
CA3212665A1 (en) | 2021-03-09 | 2022-09-15 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6 |
KR20230154311A (ko) | 2021-03-10 | 2023-11-07 | 젠코어 인코포레이티드 | Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체 |
TW202304958A (zh) | 2021-03-16 | 2023-02-01 | 美商Cytomx生物製藥公司 | 經遮蔽之可活化之細胞介素構築體及相關之組成物及方法 |
BR112023019138A2 (pt) | 2021-03-26 | 2023-10-24 | Innate Pharma | Proteína multiespecífica, composição farmacêutica, célula recombinante, método de preparação de uma composição de célula nk, composição de células nk, uso de uma proteína ou composição, métodos e uso |
JP2024515263A (ja) * | 2021-04-09 | 2024-04-08 | オーエスイー・イミュノセラピューティクス | 改善された特性を有する二機能性分子のための新規足場構造 |
WO2022258691A1 (en) | 2021-06-09 | 2022-12-15 | Innate Pharma | Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a |
BR112023025476A2 (pt) | 2021-06-09 | 2024-02-27 | Innate Pharma | Proteína de ligação multimérica e seu método de produção, composição farmacêutica, molécula de ácido nucleico isolada, vetor de expressão, célula isolada e proteína de ligação para uso |
WO2022258678A1 (en) | 2021-06-09 | 2022-12-15 | Innate Pharma | Multispecific proteins binding to nkp30, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a |
EP4352098A1 (en) | 2021-06-09 | 2024-04-17 | Innate Pharma | Multispecific proteins binding to nkp46, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a |
AU2022362681A1 (en) | 2021-10-14 | 2024-04-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | New interleukin-7 immunoconjugates |
WO2023062048A1 (en) | 2021-10-14 | 2023-04-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Alternative pd1-il7v immunoconjugates for the treatment of cancer |
TW202325746A (zh) * | 2021-11-02 | 2023-07-01 | 大陸商廣東菲鵬製藥股份有限公司 中國廣東省東莞市松山湖園區桃園路1號10棟301室 郵編:523808 | Il10單體融合蛋白及其應用 |
WO2023094569A1 (en) | 2021-11-26 | 2023-06-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Combination therapy of anti-tyrp1/anti-cd3 bispecific antibodies and tyrp1-specific antibodies |
KR20230121685A (ko) * | 2022-02-11 | 2023-08-21 | 주식회사 카나프테라퓨틱스 | Il-12 및 항-fap 항체를 포함하는 융합단백질 및 항암제를 포함하는 암 치료용 약학 조성물 |
CN116178526B (zh) * | 2023-03-16 | 2024-06-04 | 中山大学肿瘤防治中心(中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所) | 一种识别EB病毒gp42蛋白的单克隆抗体2C1及其应用 |
Family Cites Families (123)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT1156905B (it) | 1977-04-18 | 1987-02-04 | Hitachi Metals Ltd | Articolo di ornamento atto ad essere fissato mediante un magnete permanente |
WO1985000817A1 (en) | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of interleukin ii |
US6548640B1 (en) | 1986-03-27 | 2003-04-15 | Btg International Limited | Altered antibodies |
IL85035A0 (en) | 1987-01-08 | 1988-06-30 | Int Genetic Eng | Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same |
DE3883899T3 (de) | 1987-03-18 | 1999-04-22 | Sb2, Inc., Danville, Calif. | Geänderte antikörper. |
DE68913658T3 (de) | 1988-11-11 | 2005-07-21 | Stratagene, La Jolla | Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen |
DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
US5959177A (en) | 1989-10-27 | 1999-09-28 | The Scripps Research Institute | Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
US5650150A (en) | 1990-11-09 | 1997-07-22 | Gillies; Stephen D. | Recombinant antibody cytokine fusion proteins |
US5571894A (en) | 1991-02-05 | 1996-11-05 | Ciba-Geigy Corporation | Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor |
DK0590058T3 (da) | 1991-06-14 | 2004-03-29 | Genentech Inc | Humaniseret heregulin-antistof |
GB9114948D0 (en) | 1991-07-11 | 1991-08-28 | Pfizer Ltd | Process for preparing sertraline intermediates |
ES2136092T3 (es) | 1991-09-23 | 1999-11-16 | Medical Res Council | Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados. |
US5587458A (en) | 1991-10-07 | 1996-12-24 | Aronex Pharmaceuticals, Inc. | Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof |
EP0625200B1 (en) | 1992-02-06 | 2005-05-11 | Chiron Corporation | Biosynthetic binding protein for cancer marker |
US5229109A (en) | 1992-04-14 | 1993-07-20 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Low toxicity interleukin-2 analogues for use in immunotherapy |
GB9317423D0 (en) | 1993-08-21 | 1993-10-06 | Imp Cancer Res Tech | Monoclonal antibodies |
US5874540A (en) | 1994-10-05 | 1999-02-23 | Immunomedics, Inc. | CDR-grafted type III anti-CEA humanized mouse monoclonal antibodies |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
US5869046A (en) | 1995-04-14 | 1999-02-09 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
IT1282692B1 (it) * | 1996-02-27 | 1998-03-31 | San Raffaele Centro Fond | Citochine modificate per l'uso in terapia |
DE19607751A1 (de) | 1996-02-29 | 1997-09-04 | Henkel Kgaa | Neue Aminophenol-Derivate und deren Verwendung |
KR100628846B1 (ko) | 1996-10-18 | 2006-09-29 | 제넨테크, 인크. | 항-ErbB2 항체 |
US6417337B1 (en) | 1996-10-31 | 2002-07-09 | The Dow Chemical Company | High affinity humanized anti-CEA monoclonal antibodies |
US6040498A (en) | 1998-08-11 | 2000-03-21 | North Caroline State University | Genetically engineered duckweed |
JP4460155B2 (ja) | 1997-12-05 | 2010-05-12 | ザ・スクリプス・リサーチ・インステイチユート | マウス抗体のヒト化 |
AU758240B2 (en) | 1998-02-25 | 2003-03-20 | Merck Patent Gmbh | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins |
WO1999043817A1 (en) | 1998-02-25 | 1999-09-02 | The Dow Chemical Company | High affinity humanized anti-cea monoclonal antibodies |
ES2532910T3 (es) | 1998-04-02 | 2015-04-01 | Genentech, Inc. | Variantes de anticuerpos y fragmentos de los mismos |
DK2180007T4 (da) | 1998-04-20 | 2017-11-27 | Roche Glycart Ag | Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet |
US6955807B1 (en) | 1998-05-15 | 2005-10-18 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | IL-2 selective agonists and antagonists |
DZ2788A1 (fr) | 1998-05-15 | 2003-12-01 | Bayer Ag | Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2. |
FR2783605A1 (fr) | 1998-09-23 | 2000-03-24 | Digibio | Procede, systeme et dispositif pour produire a partir d'une substance des signaux, notamment des signaux electriques, caracteristiques de l'activite biologique et/ou chimique de ladite substance |
US6737056B1 (en) | 1999-01-15 | 2004-05-18 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
SK287357B6 (sk) | 1999-02-12 | 2010-08-09 | The Scripps Research Institute | Použitie antagonistu alfa v beta 3 na prípravu farmaceutickej kompozície na liečbu tumorových buniek a terapeutická kompozícia a súprava na liečenie tumoru alebo tumorových metastáz |
ES2571230T3 (es) | 1999-04-09 | 2016-05-24 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional |
AU782626B2 (en) | 1999-10-04 | 2005-08-18 | Medicago Inc. | Method for regulating transcription of foreign genes |
US7125978B1 (en) | 1999-10-04 | 2006-10-24 | Medicago Inc. | Promoter for regulating expression of foreign genes |
US6962696B1 (en) | 1999-10-04 | 2005-11-08 | Vion Pharmaceuticals Inc. | Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules |
ATE526039T1 (de) | 2000-02-24 | 2011-10-15 | Philogen Spa | Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von angiogenese in pathologischen schädigungen |
US6946292B2 (en) | 2000-10-06 | 2005-09-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity |
US7396917B2 (en) | 2000-12-05 | 2008-07-08 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Rationally designed antibodies |
WO2002083854A2 (en) | 2001-04-13 | 2002-10-24 | Biogen, Inc. | Antibodies to vla-1 |
US7916388B2 (en) | 2007-12-20 | 2011-03-29 | Cymer, Inc. | Drive laser for EUV light source |
EP1423510A4 (en) | 2001-08-03 | 2005-06-01 | Glycart Biotechnology Ag | ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED CELL CYTOTOXICITY DEPENDENT OF ANTIBODIES |
EP1476180A4 (en) | 2001-08-13 | 2005-04-20 | Univ Southern California | INTERLEUKIN-2 MUTANTS WITH REDUCED TOXICITY |
HUP0600342A3 (en) | 2001-10-25 | 2011-03-28 | Genentech Inc | Glycoprotein compositions |
PT1454138E (pt) * | 2001-12-04 | 2012-03-28 | Merck Patent Gmbh | Imunocitoquinas com seletividade modulada |
US20040093621A1 (en) | 2001-12-25 | 2004-05-13 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd | Antibody composition which specifically binds to CD20 |
KR101001243B1 (ko) | 2001-12-27 | 2010-12-17 | 글리코파이, 인크. | 포유동물-유형 탄수화물 구조의 설계 방법 |
US7432063B2 (en) | 2002-02-14 | 2008-10-07 | Kalobios Pharmaceuticals, Inc. | Methods for affinity maturation |
CA2481657A1 (en) | 2002-04-09 | 2003-10-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Cells of which genome is modified |
WO2003084570A1 (fr) | 2002-04-09 | 2003-10-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Medicament contenant une composition d'anticorps appropriee au patient souffrant de polymorphisme fc$g(g)riiia |
US20040259150A1 (en) | 2002-04-09 | 2004-12-23 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method of enhancing of binding activity of antibody composition to Fcgamma receptor IIIa |
US20040132140A1 (en) | 2002-04-09 | 2004-07-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Production process for antibody composition |
US7749753B2 (en) | 2002-04-09 | 2010-07-06 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd | Cells in which activity of the protein involved in transportation of GDP-fucose is reduced or lost |
EP1539966B1 (en) | 2002-09-12 | 2010-06-30 | Greenovation Biotech GmbH | Protein production method |
EP1572744B1 (en) | 2002-12-16 | 2010-06-09 | Genentech, Inc. | Immunoglobulin variants and uses thereof |
RU2366664C2 (ru) | 2002-12-17 | 2009-09-10 | Мерк Патент Гмбх | Гуманизированное антитело (н14.18) на основании антитела 14.18 мыши, связывающееся с gd2, и его слияние с il-2 |
WO2004057002A2 (en) | 2002-12-20 | 2004-07-08 | Greenovation Biotech Gmbh | Production of heterologous glycosylated proteins in bryophyte cells |
EP1587923B1 (en) | 2003-01-22 | 2011-08-24 | Duke University | Improved constructs for expressing lysosomal polypeptides |
ES2542885T3 (es) | 2003-01-22 | 2015-08-12 | Roche Glycart Ag | Constructos de fusión y uso de los mismos para producir anticuerpos con mayor afinidad de unión al receptor de Fc y función efectora |
TWI353991B (en) * | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
EP1627062A1 (en) | 2003-05-14 | 2006-02-22 | Domantis Limited | A process for recovering polypeptides that unfold reversibly from a polypeptide repertoire |
AR045563A1 (es) * | 2003-09-10 | 2005-11-02 | Warner Lambert Co | Anticuerpos dirigidos a m-csf |
JP2007515185A (ja) | 2003-12-22 | 2007-06-14 | カイロン コーポレイション | 免疫応答障害に対する処置ストラテジーのための診断法としてのFcレセプター多型の使用 |
KR20070003934A (ko) | 2004-03-05 | 2007-01-05 | 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 인코포레이티드 | 치료제의 환자 내약성을 예측하기 위한 시험관 내 테스트시스템 |
CN1930300A (zh) * | 2004-03-05 | 2007-03-14 | 希龙公司 | 预测患者治疗药物耐受性的体外试验系统 |
ZA200608130B (en) | 2004-03-31 | 2008-12-31 | Genentech Inc | Humanized anti-TGF-beta antibodies |
PT1737891E (pt) | 2004-04-13 | 2013-04-16 | Hoffmann La Roche | Anticorpos anti p-selectina |
SI2471813T1 (sl) | 2004-07-15 | 2015-03-31 | Xencor, Inc. | Optimirane Fc variante |
TWI309240B (en) | 2004-09-17 | 2009-05-01 | Hoffmann La Roche | Anti-ox40l antibodies |
CA2587572A1 (en) | 2004-11-24 | 2006-06-01 | Schering Corporation | Dap-10 and uses thereof |
EP2395026B1 (en) | 2005-02-08 | 2018-01-24 | The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Method for improving antibody |
CA2601858A1 (en) * | 2005-03-25 | 2006-09-28 | Glycart Biotechnology Ag | Antigen binding molecules directed to mcsp and having increased fc receptor binding affinity and effector function |
AU2006246061A1 (en) | 2005-05-11 | 2006-11-16 | Philogen S.P.A. | Fusion protein of antibody L19 against fibronectin ED-B and interleukin 12 |
EP1806365A1 (en) | 2006-01-05 | 2007-07-11 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them |
JP2009536170A (ja) | 2006-05-08 | 2009-10-08 | フィロジェン・エッセペア | 治療用の抗体標的指向サイトカイン |
DE102006031143A1 (de) | 2006-07-04 | 2008-01-24 | Merck Patent Gmbh | Fluortenside |
WO2008003473A2 (en) | 2006-07-06 | 2008-01-10 | Merck Patent Gmbh | Compositions and methods for enhancing the efficacy of il-2 mediated immune responses |
AR062223A1 (es) | 2006-08-09 | 2008-10-22 | Glycart Biotechnology Ag | Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas |
EP2120998B1 (en) | 2006-11-28 | 2013-08-07 | HanAll Biopharma Co., Ltd. | Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment |
WO2008143954A2 (en) | 2007-05-14 | 2008-11-27 | Biogen Idec Ma Inc. | Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto |
CA2694396A1 (en) | 2007-07-25 | 2009-01-29 | Astrazeneca Ab | Targeted binding agents directed to kdr and uses thereof - 035 |
US8906356B2 (en) | 2007-11-05 | 2014-12-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Mutant interleukin-2 (IL-2) polypeptides |
AU2008343589A1 (en) | 2007-12-19 | 2009-07-09 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Design and generation of human de novo pIX phage display libraries via fusion to pIX or pVII, vectors, antibodies and methods |
JP6157046B2 (ja) | 2008-01-07 | 2017-07-05 | アムジェン インコーポレイテッド | 静電的ステアリング(electrostaticsteering)効果を用いた抗体Fcヘテロ二量体分子を作製するための方法 |
ATE548052T1 (de) | 2008-01-17 | 2012-03-15 | Philogen Spa | Kombination aus einem anti-edb-fibronectin- antikörper-il-2-fusionsprotein und einem b-zellen bindenden molekül, b-zellen-vorläufern und/oder deren krebserregendem gegenspieler |
EP2271364B1 (en) * | 2008-04-10 | 2016-08-10 | IBC Pharmaceuticals, Inc. | Modular method to prepare tetrameric cytokines with improved pharmacokinetics by the dock-and-lock (dnl) technology |
RS52460B (en) * | 2008-05-13 | 2013-02-28 | Molmed Spa | CONJUGATES FOR THE TREATMENT OF MESOTELIOMA |
CA2729093C (en) | 2008-06-26 | 2018-04-10 | Shin-Ichi Kanemaru | Agent for regenerating tympanic membrane or external auditory canal |
MX2011007647A (es) | 2009-01-21 | 2011-09-01 | Amgen Inc | Composiciones y metodos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes. |
RU2650594C1 (ru) * | 2009-01-29 | 2018-04-17 | Медиммун, Ллк | Человеческие анти-il-6 антитела с пролонгированным периодом выведения in vivo и их применение при лечении онкологических, аутоиммунных заболеваний и воспалительных заболеваний |
US8460660B2 (en) | 2009-03-24 | 2013-06-11 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Anti-mesothelin antibodies |
WO2010117448A2 (en) | 2009-04-05 | 2010-10-14 | Provenance Biopharmaceuticals Corp. | Chimeric immunocytokines and methods of use thereof |
US8703132B2 (en) * | 2009-06-18 | 2014-04-22 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Bispecific, tetravalent antigen binding proteins |
EP2448599A1 (en) | 2009-06-30 | 2012-05-09 | Philogen S.p.A. | Immunocytokines in combination with anti-erbb antibodies for the treatment of cancer |
JP5322227B2 (ja) | 2009-07-13 | 2013-10-23 | Kddi株式会社 | 光直交周波数分割多重通信装置及び通信方法 |
RU2583876C2 (ru) | 2009-08-17 | 2016-05-10 | Роше Гликарт Аг | Иммуноконъюгаты направленного действия |
MX339608B (es) * | 2009-08-31 | 2016-05-31 | Roche Glycart Ag | Anticuerpos del antigeno carcinoembrionario (cea). |
CA2773515C (en) | 2009-09-29 | 2015-04-28 | Roche Glycart Ag | Bispecific death receptor agonistic antibodies |
KR101653030B1 (ko) | 2010-08-13 | 2016-08-31 | 로슈 글리카트 아게 | 항-테나신-c a2 항체 및 이의 사용 방법 |
EP3333194B1 (en) | 2010-08-13 | 2021-03-17 | Roche Glycart AG | Anti-fap antibodies and methods of use |
CU23923B1 (es) | 2010-11-12 | 2013-07-31 | Ct De Inmunología Molecular | Polipéptidos derivados de la il-2 con actividad agonista |
JP5700778B2 (ja) | 2010-11-17 | 2015-04-15 | ニチハ株式会社 | 胴縁留め付け部材及びそれを用いた施工構造 |
JP5740260B2 (ja) | 2011-02-02 | 2015-06-24 | 株式会社日立ソリューションズ | セキュリティポリシー管理サーバ、セキュリティ監視システム |
DK3489255T3 (da) | 2011-02-10 | 2021-08-23 | Roche Glycart Ag | Muterede interleukin-2-polypeptider |
UA115030C2 (uk) | 2011-03-02 | 2017-09-11 | Рош Глікарт Аг | Антитіло, яке зв'язується зі зв'язаним з мембраною карциноембріональним антигеном (сеа) |
PT2691417T (pt) | 2011-03-29 | 2018-10-31 | Roche Glycart Ag | Variantes de fc de anticorpos |
EA201892619A1 (ru) | 2011-04-29 | 2019-04-30 | Роше Гликарт Аг | Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2 |
CA2844143C (en) | 2011-08-23 | 2018-07-31 | Roche Glycart Ag | Fc-free antibodies comprising two fab fragments and methods of use |
KR101870555B1 (ko) | 2011-08-23 | 2018-06-22 | 로슈 글리카트 아게 | T 세포 활성화 항원 및 종양 항원에 대해 특이적인 이중특이적 항체 및 이의 사용 방법 |
HUE038225T2 (hu) | 2011-08-23 | 2018-10-29 | Roche Glycart Ag | Bispecifikus, T-sejtaktiváló antigénkötõ, molekulák |
MX349095B (es) | 2011-08-23 | 2017-07-11 | Roche Glycart Ag | Moleculas biespecificas de union a antigeno. |
AR092044A1 (es) | 2012-08-07 | 2015-03-18 | Roche Glycart Ag | Inmunoterapia mejorada |
US20140044675A1 (en) | 2012-08-10 | 2014-02-13 | Roche Glycart Ag | Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof |
RU2015117393A (ru) | 2012-10-08 | 2016-12-10 | Роше Гликарт Аг | Лишенные fc антитела, содержащие два Fab-фрагмента, и способы их применения |
US9546203B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-01-17 | Amgen Inc. | Aglycosylated Fc-containing polypeptides with cysteine substitutions |
DK3102595T3 (en) | 2014-02-06 | 2019-02-04 | Hoffmann La Roche | Interleukin-2 fusion proteins and their applications |
LT3186283T (lt) | 2014-08-29 | 2020-03-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Kombinuotoji terapija į naviką nutaikytais il-2 imunocitokinais ir antikūnais prieš žmogaus pd-l1 |
CA2997406C (en) | 2015-12-09 | 2024-05-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies or cytokine release |
JP6966740B2 (ja) | 2018-10-23 | 2021-11-17 | Tdk株式会社 | ショットキーバリアダイオード |
-
2012
- 2012-02-07 EA EA201892619A patent/EA201892619A1/ru unknown
- 2012-04-26 MY MYPI2013702028A patent/MY164661A/en unknown
- 2012-04-26 CN CN201280032533.7A patent/CN103649114B/zh active Active
- 2012-04-26 AU AU2012247548A patent/AU2012247548B2/en active Active
- 2012-04-26 ES ES12717674T patent/ES2707297T3/es active Active
- 2012-04-26 PL PL12717674T patent/PL2702074T3/pl unknown
- 2012-04-26 BR BR112013025127A patent/BR112013025127A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2012-04-26 DK DK12717674.1T patent/DK2702074T3/en active
- 2012-04-26 PE PE2018000424A patent/PE20181202A1/es unknown
- 2012-04-26 PT PT12717674T patent/PT2702074T/pt unknown
- 2012-04-26 HU HUE12717674A patent/HUE042187T2/hu unknown
- 2012-04-26 US US13/457,039 patent/US9447159B2/en active Active
- 2012-04-26 KR KR1020137028345A patent/KR101715445B1/ko active IP Right Grant
- 2012-04-26 RS RS20190095A patent/RS58295B1/sr unknown
- 2012-04-26 SG SG10201606300XA patent/SG10201606300XA/en unknown
- 2012-04-26 MX MX2013012413A patent/MX2013012413A/es not_active Application Discontinuation
- 2012-04-26 MY MYPI2017000406A patent/MY181961A/en unknown
- 2012-04-26 CN CN201810315322.3A patent/CN108503713A/zh active Pending
- 2012-04-26 WO PCT/EP2012/057587 patent/WO2012146628A1/en active Application Filing
- 2012-04-26 EA EA201301208A patent/EA025851B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2012-04-26 AR ARP120101449 patent/AR086075A1/es unknown
- 2012-04-26 CA CA2831008A patent/CA2831008C/en active Active
- 2012-04-26 UA UAA201313703A patent/UA115034C2/uk unknown
- 2012-04-26 PE PE2013002424A patent/PE20141019A1/es active IP Right Grant
- 2012-04-26 JP JP2014506852A patent/JP5972355B2/ja active Active
- 2012-04-26 SG SG2013076013A patent/SG194465A1/en unknown
- 2012-04-26 LT LTEP12717674.1T patent/LT2702074T/lt unknown
- 2012-04-26 TR TR2018/18974T patent/TR201818974T4/tr unknown
- 2012-04-26 EP EP12717674.1A patent/EP2702074B1/en active Active
- 2012-04-26 SI SI201231506T patent/SI2702074T1/sl unknown
- 2012-04-26 EA EA201600418A patent/EA034251B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2012-04-26 MX MX2015015971A patent/MX354868B/es unknown
- 2012-04-27 TW TW101115308A patent/TWI592424B/zh active
-
2013
- 2013-09-10 ZA ZA2013/06820A patent/ZA201306820B/en unknown
- 2013-09-24 CR CR20130480A patent/CR20130480A/es unknown
- 2013-10-21 IL IL22900613A patent/IL229006B/en active IP Right Grant
- 2013-10-22 CL CL2013003064A patent/CL2013003064A1/es unknown
- 2013-10-28 EC ECSP13013002 patent/ECSP13013002A/es unknown
- 2013-10-29 CO CO13256654A patent/CO6801645A2/es unknown
-
2014
- 2014-06-12 HK HK19101880.0A patent/HK1259474A1/zh unknown
-
2016
- 2016-01-15 US US14/996,893 patent/US10316104B2/en active Active
- 2016-04-15 JP JP2016081782A patent/JP6559607B2/ja active Active
- 2016-07-01 US US15/200,507 patent/US10202464B2/en active Active
-
2017
- 2017-04-12 AU AU2017202437A patent/AU2017202437B2/en active Active
-
2018
- 2018-07-27 JP JP2018140801A patent/JP2018198606A/ja active Pending
- 2018-12-10 US US16/215,375 patent/US20190322763A1/en not_active Abandoned
-
2019
- 2019-01-18 HR HRP20190118TT patent/HRP20190118T1/hr unknown
- 2019-06-03 US US16/430,301 patent/US11130822B2/en active Active
- 2019-09-26 IL IL26968219A patent/IL269682A/en unknown
-
2021
- 2021-09-27 US US17/486,766 patent/US20220242971A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2707297T3 (es) | Inmunoconjugados novedosos | |
ES2883371T3 (es) | Polipéptidos de interleucina 2 mutantes | |
ES2848732T3 (es) | Inmunoterapia mejorada | |
US20240092853A1 (en) | Ph-dependent mutant interleukin-2 polypeptides | |
NZ614955B2 (en) | Novel immunoconjugates |