KR101653030B1 - 항-테나신-c a２ 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 테나신-C의 A2 도메인에 대한 항체 및 이를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

항-테나신-C A２ 항체 및 이의 사용 방법{ANTI-TENASCIN-C A2 ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
본 발명은 테나신(tenascin)-C의 A2 도메인(TNC A2)에 대해 특이적인 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 상기 항체를 제조하는 방법 및 질환의 치료에 있어서 상기 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
테나신-C 및 항-테나신-C 항체
테나신은 척추동물에서 발견되는 큰 다량체 세포외 매트릭스(ECM) 당단백질의 고도로 보존된 패밀리(family)이다. 테나신-C, 테나신-R, 테나신-X 및 테나신-W로 지칭되는 4종의 테나신 파랄로그(paralogue)가 포유동물에서 확인되었다. 테나신 패밀리 단백질들은 N-말단 헵타드 반복부(repeat), 표피 성장 인자(EGF) 유사 반복부, 피브로넥틴 III형 도메인 반복부 및 C-말단 피브리노겐 유사 구형 도메인을 포함하는 공통된 일차 구조를 갖는다. 개개의 하위단위들은 N-말단 올리고머화 도메인을 통해 삼량체로 조립되거나 (테나신-C의 경우) 심지어 육량체로 조립된다.
포유동물 테나신-C 단량체는 전형적으로 모든 테나신-C 동형체(isoform)들에 의해 공유되는 14.5개의 EGF 유사 반복부 및 8개의 피브로넥틴 III형 도메인 반복부를 갖는다. 그러나, 최대 9개의 추가 피브로넥틴 III형 도메인 반복부(도메인 A1 내지 D)가 대안적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 독립적으로 포함되거나 배제되어 많은 수의 테나신-C 동형체들을 발생시킬 수 있다(예를 들면, 문헌(Hsia and Schwarzbauer, J Biol Chem 280, 26641-26644 (2005)) 참조).
테나신-C는 발생하는 배아에서 일시적으로 발현되지만 성체 조직에는 사실상 존재하지 않는다. 그러나, 상기 단백질은 일부 병리학적 상태, 예컨대, 상처 치유, 염증 및 암을 포함하는 리모델링 과정을 겪는 조직에서 다시 나타난다(문헌(Chiquet-Ehrismann & Chiquet, J Pathol 200, 488-499 (2003))에서 검토됨).
중요하게는, 테나신-C는 뇌, 유방, 결장, 폐, 피부 및 다른 기관의 종양을 포함하는 대다수의 악성 고형 종양들에서 고도로 발현되고(문헌(Orend and Chiquet-Ehrismann, Cancer Letters 244, 143-163 (2006))에서 검토됨), 상기 종양들에서 상기 단백질은 형질전환된 상피 세포에 의해 발현될 수 있을 뿐만 아니라 종양 미세환경 내의 간질(stromal) 세포에 의해서도 발현될 수 있다(문헌(Yoshida et al., J Pathol 182, 421-428 (1997), Hanamura et al., Int J Cancer 73, 10-15 (1997))). 구체적으로, 대안적으로 스플라이싱된 도메인 A1 내지 D를 함유하는 테나신-C의 "큰 동형체"는 침윤성 암종에서 발현되지만, 건강한 성체 조직에서는 거의 검출될 수 없다(문헌(Borsi et al., Int J Cancer 52, 688-692 (1992), Carnemolla et al., Eur J Biochem 205, 561-567 (1992))).
테나신-C, 특히 이의 대안적으로 스플라이싱된 도메인은 이의 발현 패턴으로 인해 종양 표적화 적용을 위한 기대되는 항원이므로, 상기 단백질의 여러 도메인들에 대한 다수의 항체들이 개발되고 있다(예를 들면, 테나신-C의 A1 도메인에 대한 항체를 기재하는 문헌(Brack et al., Clin Cancer Res 12, 3200-3208 (2006)) 또는 유럽 특허 제1 817 345호; 테나신-C의 C 도메인에 대한 항체를 기재하는 문헌(Silacci et al., Prot Eng Des Sel 19, 471-478 (2006)) 또는 유럽 특허 제1 173 766호; 테나신-C의 D 도메인에 대한 항체를 기재하는 문헌(Wang et al., Hybridoma 29, 13-16 (2010)); 또는 인간 테나신의 상이한 도메인들에 대한 여러 항체를 기재하는 문헌(Balza et al., FEBS 332, 39-43 (1993)) 참조).
최근에, 인간 테나신-C의 A2 도메인 내의 특정 에피토프를 인식하는 항체도 기재되었다(국제 특허출원 공개 제WO 2009/089998호).
항체 글리코실화
올리고사카라이드 성분은 물리적 안정성, 프로테아제(protease) 공격에 대한 저항성, 면역 시스템과의 상호작용, 약물동력학 및 특이적 생물학적 활성을 포함하는, 치료 당단백질의 효능과 관련된 성질에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 이러한 성질들은 올리고사카라이드의 존재 또는 부재에 의해 좌우될 수 있을 뿐만 아니라 올리고사카라이드의 특이적 구조에 의해서도 좌우될 수 있다. 올리고사카라이드 구조와 당단백질 기능 사이의 몇몇 일반화가 만들어질 수 있다. 예를 들면, 일부 올리고사카라이드 구조는 특이적 탄수화물 결합 단백질과의 상호작용을 통해 혈류로부터의 당단백질의 신속한 제거를 매개하지만, 다른 올리고사카라이드 구조는 항체에 의해 결합되어 원치 않는 면역 반응을 유발할 수 있다(문헌(Jenkins et al., Nature Biotechnol 14, 975-81 (1996))).
암 면역요법에서 가장 통상적으로 사용되는 항체인 IgG1 유형의 항체는 각각의 CH2 도메인 내의 Asn297에서 보존된 N-연결된 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297에 부착된 2개의 복합 바이안테나리(biantennary) 올리고사카라이드가 CH2 도메인들 사이에 묻혀 폴리펩타이드 주쇄와의 광범위한 접촉부를 형성하고, 이들의 존재는 항체가 이펙터 기능, 예컨대, 항체 의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 매개하는 데에 있어서 필수적이다(문헌(Lifely et al., Glycobiology 5, 813-822 (1995); Jefferis et al., Immunol Rev 163, 59-76 (1998); Wright and Morrison, Trends Biotechnol 15, 26-32 (1997))). 단백질 조작 연구는 FcγR들이 IgG CH2 도메인의 보다 낮은 힌지 영역과 상호작용한다는 것을 보여주었다(문헌(Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996))). 그러나, FcγR 결합은 CH2 영역 내의 올리고사카라이드의 존재도 필요로 한다. 문헌(Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996)); 및 문헌(Wright and Morrison, Trends Biotech. 15:26-31 (1997))은 올리고사카라이드 및 폴리펩타이드 둘다 상호작용 부위에 직접적으로 기여한다는 것, 또는 올리고사카라이드가 활성 CH2 폴리펩타이드 입체구조를 유지하는 데에 필요하다는 것을 암시한다. 따라서, 올리고사카라이드 구조의 변형은 IgG1과 FcγR 사이의 상호작용의 친화성을 증가시키고 IgG1의 ADCC 활성을 증가시키기 위한 수단으로서 연구될 수 있다.
단일클론 항체들의 효능을 크게 증가시키는 방법은 그들의 올리고사카라이드 성분을 문헌(Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999)) 및 미국 특허 제6,602,684호(국제 특허출원 공개 제WO 99/54342호)(이들의 내용은 전체적으로 본원에 참고로 도입됨)에 기재된 바와 같이 조작함으로써 그들의 천연 세포 매개된 이펙터 기능을 향상시키는 것이다. 우마나 등(Umana et al)은 이등분된 올리고사카라이드의 형성을 촉매작용하는 글리코실트랜스퍼라제(glycosyltransferase)인 β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII)을 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 내에서 과다발현시킨 것이 이들 세포 내에서 제조된 항체의 시험관내 ADCC 활성을 상당히 증가시킨다는 것을 보여주었다. 제조 세포주 내에서의 GnTIII의 과다발현은 일반적으로 비-푸코실화되어 있고 하이브리드 유형인 이등분된 올리고사카라이드가 풍부한 항체를 발생시킨다. GnTIII 이외에 만노시다제(mannosidase) II(ManII)가 제조 세포주에서 과다발현되는 경우, 결합체 유형의 이등분되고 비-푸코실화된 올리고사카라이드가 풍부한 항체가 수득된다(문헌(Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006))). 두 유형의 항체들은 비-변형된 글리칸을 갖는 항체에 비해 강하게 향상된 ADCC를 보이지만, N-글리칸의 대다수가 결합체 유형인 항체만이 상당한 보체 의존적 세포독성을 유도할 수 있다(문헌(Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006))). Asn297 탄수화물의 조성에서의 변경 또는 이의 제거는 ADCC 및 CDC 각각에 중요한, 항체 Fc 도메인과 Fcγ 수용체(FcγR) 및 보체 C1q 단백질의 결합에도 영향을 미친다(문헌(Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Davies et al., Biotechnol Bioeng 74, 288-294 (2001); Mimura et al., J Biol Chem 276, 45539-45547 (2001); Radaev et al., J Biol Chem 276, 16478-16483 (2001); Shields et al., J Biol Chem 276, 6591-6604 (2001); Shields et al., J Biol Chem 277, 26733-26740 (2002); Simmons et al., J Immunol Methods 263, 133-147 (2002))).
본 발명은 높은 친화성 및/또는 향상된 이펙터 기능을 갖는, 테나신-C의 A2 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45 및 서열번호 47에 기재된 하나 이상(즉, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는, TNC A2에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45 및 서열번호 47로부터 선택된 3개의 중쇄 CDR(즉, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및/또는 3개의 경쇄 CDR(즉, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 59, 서열번호 61, 서열번호 63, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 79, 서열번호 81, 서열번호 83, 서열번호 85, 서열번호 87, 서열번호 89 및 서열번호 91에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 서열들로부터 선택된 항체 중쇄 가변 영역 및/또는 항체 경쇄 가변 영역, 특히 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 둘다를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 Fc 영역, 특히 IgG Fc 영역을 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 항체는 전장 항체, 특히 IgG 클래스 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 인간 항체 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 인간 항체이다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 Fc 영역 내에서 변형된 올리고사카라이드를 갖도록 당조작되어 있다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 비-당조작된 항체에 비해 Fc 영역 내에서 증가된 비율의 비-푸코실화된 및/또는 이등분된 올리고사카라이드를 갖는다. 추가 실시양태에서, 상기 항체는 증가된 이펙터 기능 및/또는 증가된 Fc 수용체 결합 친화성을 갖는다. 구체적인 실시양태에서, 증가된 이펙터 기능은 증가된 항체 의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC)이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 약 1 μM 미만, 바람직하게는 약 100 nM 미만, 가장 바람직하게는 약 1 nM 미만의 KD 값으로 인간 TNC A2에 결합한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 친화 성숙되어 있다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 인간 조직 내의 TNC A2에 결합한다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 항체와 관련된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 숙주 세포 및 발현 벡터에 관한 것이다. 추가 양태에서, 본 발명은 상기 항체의 제조 방법에 관한 것이다. 추가 양태에서, 본 발명은 특히 TNC A2의 발현을 특징으로 하는 질환, 예컨대, 암의 치료를 위해 상기 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 인간(hu) TNC A2에 결합하는 친화 성숙된 항-TNC A2 Fab 단편의 표면 플라스몬 공명(SPR)-기초 동역학적 분석을 보여준다. 클론 2B10_C3B6(A), 클론 2B10_6A12(B), 클론 2B10_C3A6(C), 클론 2B10_O7D8(D), 클론 2B10_O1F7(E) 및 클론 2B10_6H10(F)에 대한 프로세싱된 동역학적 데이터 세트가 제시되어 있다. 매끄러운 선은 1:1 상호작용 모델에의 상기 데이터의 전반적 피트(fit)를 나타낸다.
도 2a는 인간, 뮤린 및 사이노몰거스(cynomolgus) TNC A2에 결합하는 2B10 항-TNC A2 Fab 단편의 SPR-기초 동역학적 분석을 보여준다. 도 2b는 실시예 7에 기재된 바와 같은, 인간, 뮤린 및 사이노몰거스 TNC A2에 결합하는 2B10 항-TNC A2 인간 IgG의 SPR-기초 동역학적 분석을 보여준다.
도 3a는 FLAG 단편에 융합된 Fab 단편 내의 2B10 가변 영역(SHD2B10-FLAG)으로 염색된 정상 인간 자궁 조직(상부 패널) 및 종양 인간 자궁 조직(하부 패널)의 100배(좌측 패널) 및 400배(중간 패널) 확대된 면역조직화학적 영상을 보여준다. 우측 패널: 대조군, 100배 확대. 도 3b는 FLAG 단편에 융합된 Fab 단편 내의 2B10 가변 영역(SHD2B10-FLAG)으로 염색된 면역형광 표면적의 % 면에서 다양한 인간 조직 샘플 중의 TNC A2의 발현 수준을 보여준다. 건강한 개체 및 암 환자로부터의 다양한 인간 조직 샘플들이 실시예 8에 기재된 바와 같이 SHD2B10-FLAG Fab 단편으로 염색되었다.
도 4a 내지 4n은 실시예 8에 기재된 바와 같이 SHD2B10-마우스 IgG로 염색된 인간 조직의 100배(좌측 패널) 및 400배(중간 패널) 확대된 면역조직화학적 영상을 보여준다. 동종형(isotype) 대조군 항체를 사용한 염색은 100배 확대되어 나타나 있다(우측 패널). 상부 패널: 정상 조직, 하부 패널: 종양 조직. 도 4a: 뇌, 도 4b: 유방, 도 4c: 결장, 도 4d: 신장, 도 4e: 간, 도 4f: 폐, 도 4g: 난소, 도 4h: 췌장, 도 4i: 전립선, 도 4j: 골격근, 도 4k: 피부, 도 4l: 소장, 도 4m: 위, 도 4n: 자궁.
도 5는 유동세포분석(flow cytometry)에 의해 측정된, 2B10으로부터 유도된 인간 IgG와 U87MG 아교모세포종 종양 상에서 발현된 TNC A2의 결합을 보여준다(실시예 9 참조). 비-처리된 세포 및 이차 항체로만 염색된 세포(음성 대조군)에 비해 상이한 농도의 2B10 IgG로 처리된 세포의 평균 형광 광도가 나타나 있다.
도 6은 야생형 2B10 인간 IgG의 정제 및 분석을 보여준다. A) 단백질 A 친화 크로마토그래피 정제 단계. B) 크기 배제 크로마토그래피 정제 단계. C) 분석 SDS-PAGE. 실험 절차는 실시예 1에 기재되어 있다.
도 7은 당조작된 2B10 인간 IgG의 정제 및 분석을 보여준다. A) 단백질 A 친화 크로마토그래피 정제 단계. B) 크기 배제 크로마토그래피 정제 단계. C) 분석 SDS-PAGE. 실험 절차는 실시예 1에 기재되어 있다.
도 8은 야생형(wt) 및 당조작된(ge) 버전으로서의 항-TNC A2 항체 2B10과 U87MG 세포 상의 TNC A2의 결합을 보여준다.
I. 정의
본원의 목적상 "수용자 인간 골격"은 하기 정의된 바와 같이 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센서스 골격으로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 골격 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 골격의 아미노산 서열을 포함하는 골격이다. 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센서스 골격"으로부터 유래된" 수용자 인간 골격은 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하 또는 2 이하이다. 몇몇 실시양태에서, VL 수용자 인간 골격은 서열 면에서 VL 인간 면역글로불린 골격 서열 또는 인간 컨센서스 골격 서열과 동일하다.
"친화성"은 분자(예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들면, 항원) 사이의 비-공유 상호작용의 총 합계의 강도를 의미한다. 달리 명시되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원들(예를 들면, 항체와 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 의미한다. 그의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 속도 상수와 결합 속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비인 해리 상수(KD)로 표시될 수 있다. 따라서, 상기 속도 상수들의 비가 동일하게 유지되는 한, 동등한 친화성은 상이한 속도 상수를 포함할 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 방법들을 포함하는 당업계에서 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화성의 측정을 위한 구체적인 설명적 및 예시적 실시양태들이 후술되어 있다.
"친화 성숙된" 항체는 하나 이상의 변경, 예컨대, 항원에 대한 항체의 친화성을 개선시키는 변경을 보유하지 않는 모 항체에 비해 하나 이상의 초가변 영역(HVR)(예를 들면, CDR) 내에서 하나 이상의 변경(예를 들면, 아미노산 돌연변이)을 갖는 항체를 의미한다. 전형적으로, 친화 성숙된 항체는 모 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
용어 "항-TNC A2 항체" 및 "테나신-C의 A2 도메인에 결합하는 항체"는 항체가 TNC A2를 표적화하는 데 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하기에 충분한 친화성으로 TNC A2에 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 한 실시양태에서, 항-TNC A2 항체와 관련없는 비-TNC A2 단백질의 결합 정도는 예를 들면, 방사성면역분석(RIA)에 의해 측정되었을 때 상기 항체와 TNC A2의 결합의 약 10% 미만이다. 일부 실시양태에서, TNC A2에 결합하는 항체는 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하 또는 0.001 nM 이하(예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-TNC A2 항체는 상이한 종들로부터의 TNC A2 사이에 보존되어 있는 TNC A2의 에피토프에 결합한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 단일클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 항체 구조체를 포괄하되, 이들은 목적 항원 결합 활성을 나타내어야 한다. Fc 영역을 갖는 항체 단편, 및 면역글로불린의 Fc 영역에 상응하는 영역을 포함하는 융합 단백질도 포함된다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 상기 온전한 항체의 일부를 포함하는, 온전한 항체 이외의 분자를 의미한다. 항체 단편의 예에는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 단일 쇄 항체 분자(예를 들면, scFv), 다이아바디, 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함되나 이들로 한정되지 않는다.
기준 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 분석에서 기준 항체와 이의 항원의 결합을 50% 이상만큼 차단하는 항체를 의미하고, 역으로 상기 기준 항체는 경쟁 분석에서 항체와 이의 항원의 결합을 50% 이상만큼 차단한다. 예시적 경쟁 분석이 본원에 제공되어 있다.
용어 "항원 결합 도메인"은 항원에 특이적으로 결합하고 항원의 일부 또는 전부에 상보적인 영역을 포함하는 항원 결합 분자의 일부를 의미한다. 항원이 큰 경우, 항원 결합 분자는 에피토프로 지칭되는, 항원의 특정 부위에만 결합할 수 있다. 항원 결합 도메인은 예를 들면, 하나 이상의 항체 가변 도메인(항체 가변 영역으로도 지칭됨)에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되지만 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 의미한다. 키메라 항체의 경우, 예를 들면, 비-항원 결합 성분은 영장류, 예컨대, 침팬지 및 인간을 포함하는 광범위한 종으로부터 유래될 수 있다. 인간화된 항체는 키메라 항체의 특히 바람직한 형태이다.
항체의 "클래스"는 이의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 의미한다. 5종의 주요 클래스의 항체, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위클래스(동종형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 세분될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스들에 상응하는 중쇄 불변 도메인들은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제하거나 방해하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 야기하는 물질을 의미한다. 세포독성제는 방사성 동위원소(예를 들면, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학치료제 또는 약물(예를 들면, 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamicin), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids)(빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 에토포사이드(etoposide)), 독소루비신(doxorubicin), 멜팔란(melphalan), 미토마이신 C(mitomycin C), 클로람부실(chlorambucil), 다우노루비신(daunorubicin) 또는 다른 인터칼레이팅제); 성장 억제제; 효소 및 이의 단편, 예컨대, 핵분해 효소; 항생제; 세균, 진균, 식물 또는 동물 유래의 독소, 예컨대, 소분자 독소 또는 효소 활성 독소(이들의 단편 및/또는 변이체를 포함함); 및 하기 개시된 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
"이펙터 기능"은 항체 동형체에 따라 상이한, 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 의미한다. 항체 이펙터 기능의 예에는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC); 식균작용; 사이토카인 분비; 항원 제시 세포에 의한 면역결합체 매개된 항원 섭취; 세포 표면 수용체(예를 들면, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화가 포함된다.
약제, 예를 들면, 약학 제제의 "유효량"은 필요한 기간 동안 필요한 투여량에서 목적 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 효과적인 양을 의미한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실 말단까지 걸쳐 있다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 특정되어 있지 않은 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)에 기재된 바와 같은, EU 지수로도 지칭되는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
"면역글로불린의 Fc 영역에 상응하는 영역"은 면역글로불린의 Fc 영역의 천연 대립형질 변이체뿐만 아니라, 치환, 부가 또는 결실을 발생시키되, 이펙터 기능(예컨대, 항체 의존적 세포성 세포독성)을 매개하는 면역글로불린의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 변경을 갖는 변이체도 포함하기 위한 것이다. 예를 들면, 하나 이상의 아미노산이 생물학적 기능의 실질적 상실 없이 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단으로부터 제거될 수 있다. 이러한 변이체는 활성에 최소한으로 영향을 미치도록 당업계에서 공지된 일반적 규칙에 따라 선택될 수 있다(예를 들면, 문헌(Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)) 참조).
"골격" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR)(또는 CDR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 의미한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 도메인, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전체 항체"는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본원에서 정의된 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 외래 핵산이 도입되어 있는 세포(이러한 세포의 자손을 포함함)를 의미한다. 숙주 세포는 일차 형질전환된 세포 및 계대배양 수와 관계없이 이로부터 유래된 자손을 포함하는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 핵산 함량 면에서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으나 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 기능 또는 생물학적 활성과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 본원에 포함된다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 변형된 올리고사카라이드를 갖는 항체를 생성하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트래스퍼라제 III(GnIII) 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩타이드를 증가된 수준으로 발현하도록 추가로 조작되어 있다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들면, 포유동물 배양된 세포, 예컨대, 몇몇을 나열하자면 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포 및 식물 세포뿐만 아니라, 형질전환 동물, 형질전환 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포도 포함한다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 항체이다. 인간 항체의 이 정의는 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특히 배제한다.
"인간 컨센서스 골격"은 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 골격 서열의 선별에 있어서 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 골격이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선별은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터의 선별이다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3)에 기재된 바와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우, 하위군은 상기 카바트 등(Kabat et al.)에 기재된 바와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우, 하위군은 상기 카바트 등에 기재된 바와 같은 하위군 III이다.
"인간화된" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 의미한다. 일부 실시양태에서, 인간화된 항체는 실질적으로 모든 하나 이상의, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이고, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 HVR(예를 들면, CDR)이 비-인간 항체의 HVR에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 항체의 FR에 상응한다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 경험한 항체를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR" 은 서열 면에서 초가변성을 나타내고/내거나 구조적으로 정의된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역 각각을 의미한다. 일반적으로, 천연 4쇄 항체는 6개의 HVR, 즉 VH에서 3개의 HVR(H1, H2 및 H3) 및 VL에서 3개의 HVR(L1, L2 및 L3)을 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기 및/또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하고, 후자는 가장 높은 서열 가변성을 나타내고/내거나 항원 인식에 관여한다. VH 내의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 초가변 영역(HVR)은 상보성 결정 영역(CDR)으로도 지칭되고, 이들 용어들은 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 일부를 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이 특정 영역은 문헌(Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)) 및 문헌(Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))에 기재되어 있고, 이 문헌에서 정의는 서로에 대해 비교되었을 때 아미노산 잔기의 중복 또는 하위세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 의미하기 위한 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용된 용어의 범위 내에 있다. 상기 인용된 참고문헌 각각에 의해 정의된 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 하기 표 1에 기재되어 있다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열이 주어졌을 때 어떤 잔기들이 특정 CDR을 구성하는지를 상용적으로 확인할 수 있다.
[표 1]
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카바트 등은 임의의 항체에 적용될 수 있는 가변 영역 서열에 대한 넘버링 시스템도 정의하였다. 당업자는 서열 자체 이외의 임의의 실험적 데이터에 의존하지 않으면서 이 "카바트 넘버링" 시스템을 임의의 가변 영역 서열에 분명하게 적용할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "카바트 넘버링"은 문헌(Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983))에 기재된 넘버링 시스템을 의미한다. 달리 특정되어 있지 않은 한, 항체 가변 영역 내의 특정 아미노산 잔기 위치의 넘버링의 언급은 카바트 넘버링 시스템에 따른다.
CDR은 항원과 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"도 포함한다. SDR은 약어 CDR 또는 a-CDR로 지칭되는 CDR의 영역 내에 함유되어 있다. 일반적으로, 주어진 CDR 내의 잔기들의 5분의 1 내지 3분의 1만이 항원 결합에 참여한다. 특정 CDR 내의 특이성 결정 잔기는 예를 들면, 3차원적 모델링으로부터의 원자간 접촉의 계산 및 문헌(Padlan et al., FASEB J. 9(1):133-139 (1995))에 기재된 방법에 따른 주어진 잔기 위치에서의 서열 가변성의 측정에 의해 확인될 수 있다. 예시적 a-CDR(a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31 내지 34, L2의 아미노산 잔기 50 내지 55, L3의 아미노산 잔기 89 내지 96, H1의 아미노산 잔기 31 내지 35B, H2의 아미노산 잔기 50 내지 58 및 H3의 아미노산 잔기 95 내지 102에 존재한다(문헌(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)) 참조). 달리 명시되어 있지 않은 한, 가변 도메인 내의 HVR 잔기 및 다른 잔기(예를 들면, FR 잔기)는 본원에서 상기 카바트 등의 문헌에 따라 넘버링된다.
"항체 접합체"는 세포독성제에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축(예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들면, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대, 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
"단리된" 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리되어 있는 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 예를 들면, 전기영동(예를 들면, SDS-PAGE, 등전점 포커싱(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 방법에 의해 측정되었을 때 95% 또는 99% 초과의 순도까지 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해서는 예를 들면, 문헌(Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007))을 참조한다.
"단리된" 폴리뉴클레오타이드는 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리되어 있는 폴리뉴클레오타이드 분자를 의미한다. 단리된 폴리뉴클레오타이드는 통상적으로 폴리뉴클레오타이드 분자를 함유하는 세포 내에 함유된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하지만, 상기 폴리뉴클레오타이드 분자는 염색체 외부에 존재하거나 이의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-TNC A2 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드"는 항체 중쇄 및 경쇄(또는 이의 단편)를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 분자(단일 벡터 또는 분리된 벡터 내의 이러한 폴리뉴클레오타이드 분자, 및 숙주 세포 내의 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함함)를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 의미하고, 즉 상기 집단을 구성하는 개별 항체들은 일반적으로 소량으로 존재하는 가능한 변이체 항체, 예를 들면, 천연 돌연변이를 함유하거나 단일클론 항체 제제의 제조 동안 발생하는 변이체 항체를 제외하고 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자들(에피토프들)에 대해 유도된 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 특징을 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득된 것으로서 표시하고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용될 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 표시 방법, 및 인간 면역글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 함유하는 형질전환 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 기법에 의해 제조될 수 있고, 이러한 방법 및 단일클론 항체의 다른 예시적 제조 방법은 본원에 기재되어 있다.
"네이키드(naked) 항체"는 이종 모이어티(moiety)(예를 들면, 세포독성 모이어티) 또는 방사성 표지에 접합되어 있지 않은 항체를 의미한다. 네이키드 항체는 약학 제제에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 면역글로불린 분자를 의미한다. 예를 들면, 천연 IgG 항체는 이황화 결합에 의해 결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N-말단부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 지칭되는 가변 영역(VH)에 이어서 중쇄 불변 영역으로도 지칭되는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 지칭되는 가변 영역(VL)에 이어서 경쇄 불변 영역으로도 지칭되는 불변 경쇄 도메인(CL)을 갖는다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 지칭되는 2종의 유형 중 하나로 배정될 수 있다.
"실질적인 교차 반응성 없음"은 특히 표적 항원과 비교되었을 때 분자(예를 들면, 항체)가 이 분자의 실제 표적 항원과 상이한 항원(예를 들면, 표적 항원과 밀접하게 관련된 항원)을 인식하거나 이러한 상이한 항원에 특이적으로 결합하지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들면, 항체는 실제 표적 항원과 상이한 항원에 약 10% 미만 내지 약 5% 미만으로 결합할 수 있거나, 약 10%, 9%, 8% 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 및 0.1% 미만, 바람직하게는 약 2%, 1% 및 0.5% 미만으로 구성된 군으로부터 선택된 양으로 실제 표적 항원과 상이한 상기 항원, 가장 바람직하게는 약 0.2% 또는 0.1% 미만으로 실제 표적 항원과 상이한 항원에 결합할 수 있다.
용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 상업적 포장물 내에 통상적으로 포함되는 설명서로서, 증상, 용법, 투여량, 투여, 병용 요법, 사용금지사유, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고에 대한 정보를 함유하는 설명서를 의미하기 위해 사용된다.
용어 "모"항체는 변이체의 제조를 위한 출발점 또는 기초로서 사용되는 항체를 의미한다.
"퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고 필요하다면 간극(gap)을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한 후 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않고 기준 폴리펩타이드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위한 정렬은 당업자의 기술 내에 있는 다양한 방식, 예를 들면, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어의 이용을 통해 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2의 이용을 통해 발생된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 만들어졌고, 소스 코드는 미국 저작권 협회(U.S. Copyright Office, 미국 워싱톤 디씨 20559 소재)에 사용자 문서로 출원되었고, 상기 미국 저작권 협회에서 상기 코드는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재)로부터 공개적으로 입수될 수 있거나 상기 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 작동 시스템 상에서 사용을 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터들은 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변경되지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(대안적으로 주어진 아미노산 서열 B에 대한 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100 곱하기 분율 X/Y
여기서, X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 정렬에서 상기 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 일치(match)로서 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에 존재하는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않은 경우, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동등하지 않을 것임이 인식될 것이다. 달리 구체적으로 명시되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값들은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램의 이용을 통해 직전 단락에 기재된 바와 같이 수득된다.
유사하게, 본 발명의 기준 뉴클레오타이드 서열과 예를 들면 95% 이상 "동일한" 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 기준 뉴클레오타이드 서열의 각각 100개 뉴클레오타이드 당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 점을 제외하고 상기 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 기준 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 다시 말해, 기준 뉴클레오타이드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 수득하기 위해, 기준 서열 내에서 5% 이하의 뉴클레오타이드가 결실될 수 있거나 또 다른 뉴클레오타이드로 치환될 수 있거나, 또는 기준 서열 내의 총 뉴클레오타이드의 5% 이하를 차지하는 다수의 뉴클레오타이드가 기준 서열 내로 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 변경은 기준 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 일어날 수 있거나 이들 말단 위치들 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있거나, 기준 서열 내의 잔기들 사이에 개별적으로 산재되어 있을 수 있거나, 또는 기준 서열 내에서 하나 이상의 인접한 군으로 산재되어 있을 수 있다. 실질적 문제로서 임의의 특정 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 또는 폴리펩타이드 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한지를 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대, 상기 나열된 프로그램을 이용하여 통상적으로 확인할 수 있다.
용어 "약학 제제"는 내부에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이게 하는 형태로 존재하고 상기 제제가 투여될 대상체에게 허용불가능한 독성을 나타내는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 의미한다.
용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 대상체에게 독성을 나타내지 않는, 활성 성분 이외의 약학 제제의 성분을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "테나신-C의 A2 도메인(TNC A2)"은, 달리 명시되어 있지 않은 한, 포유동물, 예컨대, 영장류(예를 들면, 인간) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터 유래된 임의의 천연 TNC A2를 의미한다. 상기 용어는 프로세싱되지 않은 "전장" TNC A2뿐만 아니라 세포 내에서의 프로세싱으로부터 발생된 TNC A2의 임의의 형태도 포함한다. 또한, 상기 용어는 TNC A2의 천연 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다. (C-말단 avi-태그 및 6x His-태그를 갖는) 예시적 인간 TNC A2의 아미노산 서열은 서열번호 97에 나타나 있다. 인간 테나신-C 분자에서, A2 도메인은 불변 피브로넥틴 III형 도메인의 제5 도메인과 제6 도메인 사이에 삽입될 수 있는, 9개 이하의 대안적으로 스플라이싱된 피브로넥틴 III형 도메인들 중 (N-말단으로부터 세었을 때) 제2 도메인이다(테나신-C의 도메인 구조의 개략적 표시에 대해서는 예를 들면, 문헌(Orend and Chiquet-Ehrismann, Cancer Letters 244, 143-163 (2006)) 참조). 유사하게, 마우스 테나신-C 분자에서 A2는 6개 이하의 대안적으로 스플라이싱된 피브로넥틴 III형 도메인들 중 제2 도메인이다(예를 들면, 문헌(Joestner and Faissner, J Biol Chem 274, 17144-17151 (1999))에 기재되어 있음).
본원에서 사용된 바와 같이, "치료"(및 이의 문법적 어미변화, 예컨대, "치료한다" 또는 "치료하는")는 치료될 개체의 질환의 천연 경과를 변경시키기 위한 시도에서의 임상적 중재를 의미하고 예방을 위해 또는 임상적 병리학의 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발병 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 완화 또는 진정, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체와 항원의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 골격 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다(예를 들면, 문헌(Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)) 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 나아가, 특정 항원에 결합하는 항체는 상기 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 상보적 VL 또는 VH 도메인 각각의 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)) 및 문헌(Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991))을 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 그 자신에 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 상기 용어는 자가 복제 핵산 구조체로서의 벡터뿐만 아니라 그 자신이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 혼입된 벡터도 포함한다. 일부 벡터는 그 자신에 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드"는 β-1-4 연결에서 N-아세틸글루코스아민(GlcNAc) 잔기가 N-연결된 올리고사카라이드의 트라이만노실 코어의 β-연결된 만노사이드에 부가되는 것을 촉매작용할 수 있는 폴리펩타이드를 의미한다. 이것은 특정 생물학적 분석에서 측정되었을 때 국제 생화학 및 분자생물학 연합회의 명명위원회(NC-IUBMB)에 따라 β-1,4-만노실-당단백질 4-베타-N-아세틸글루코스아미닐-트랜스퍼라제(EC 2.4.1.144)로도 공지된 β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III의 활성과 투여량 의존적 또는 비-의존적으로 유사한(그러나 반드시 동일하지는 않은) 효소 활성을 나타내는 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 투여량 의존성이 존재하는 경우, 이것은 GnTIII의 투여량 의존성과 동일할 필요는 없고, 오히려 GnTIII에 비해 주어진 활성에서의 투여량 의존성과 실질적으로 유사하다(즉, 후보 폴리펩타이드는 GnTIII에 비해 상대적으로 더 높은 활성 또는 약 25배 이하 적은, 바람직하게는 약 10배 이하 적은 활성, 가장 바람직하게는 약 3배 이하 적은 활성을 나타낼 것이다).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "골지(Golgi) 국소화 도메인"은 골지 체류 폴리펩타이드를 골지 결합체 내의 일정 위치에 고착시키는 것을 담당하는 골지 체류 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 의미한다. 일반적으로, 국소화 도메인은 효소의 아미노 말단 "꼬리"를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 특히 접두사 "당"을 갖는 용어 "조작하다, 조작된, 조작하는" 및 용어 "글리코실화 조작"은 천연 또는 재조합 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 글리코실화 패턴의 임의의 조작을 포함하는 것으로 간주된다. 글리코실화 조작은 세포 내에서 발현된 당단백질의 변경된 글리코실화를 달성하기 위한 올리고사카라이드 합성 경로의 유전적 조작을 포함하는, 세포의 글리코실화 기구의 대사적 조작을 포함한다. 나아가, 글리코실화 조작은 글리코실화에 대한 돌연변이 및 세포 환경의 효과를 포함한다. 한 실시양태에서, 글리코실화 조작은 글리코실트랜스퍼라제 활성에서의 변경이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 조작은 글루코스아미닐트랜스퍼라제 활성 및/또는 푸코실트랜스퍼라제 활성을 변경시킨다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Fc 매개된 세포성 세포독성"은 항체 의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC), 및 인간 Fc 영역을 함유하는 가용성 Fc-융합 단백질에 의해 매개되는 세포성 세포독성을 포함한다. 이것은 "인간 면역 이펙터 세포"에 의한 "표적화된 세포"의 용해를 초래하는 면역 기작이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간 면역 이펙터 세포"는 그들의 표면 상에 Fc 수용체를 표시하는 백혈구의 집단을 의미하고, 이들은 상기 Fc 수용체를 통해 항체 또는 Fc-융합 단백질의 Fc 영역에 결합하고 이펙터 기능을 수행한다. 이러한 집단은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및/또는 천연 살해(NK) 세포를 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적화된 세포"는 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자(예를 들면, Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편) 또는 Fc-융합 단백질이 특이적으로 결합하는 세포를 의미한다. 항원 결합 분자 또는 Fc 융합-단백질은 Fc 영역을 기준으로 N-말단에 존재하는 단백질 부분을 통해 표적 세포에 결합한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "증가된 Fc 매개된 세포성 세포독성"은 표적 세포를 둘러싸는 배지 중의 항체 또는 Fc-융합 단백질의 주어진 농도에서 주어진 시간 이내에 상기 정의된 Fc 매개된 세포성 세포독성의 기작에 의해 파괴되는 "표적화된 세포"의 수의 증가로서, 및/또는 주어진 시간 이내에 Fc 매개된 세포성 세포독성의 기작에 의해 주어진 수의 "표적화된 세포"의 용해를 달성하기 위해 필요한, 표적 세포를 둘러싸는 배지 중의 항체 또는 Fc-융합 단백질의 농도의 감소로서 정의된다. Fc 매개된 세포성 세포독성의 증가는 동일한 표준 제조, 정제, 제제화 및 저장 방법(이들은 당업자에게 공지되어 있음)을 이용하였을 때, 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성되되 본원에 기재된 방법에 의해 (예를 들면, 글리코실트랜스퍼라제 GnTIII 또는 다른 글리코실트랜스퍼라제를 발현하도록) 변경된 글리코실화 패턴을 갖도록 조작된 숙주 세포에 의해 생성되지 않은 동일한 항원 결합 분자 또는 Fc-융합 단백질에 의해 매개된 세포성 세포독성을 기준으로 한다.
본원에서 정의된 바와 같이, 용어 "증가된 항체 의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 갖는 항체"는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 측정되었을 때 증가된 ADCC를 갖는 항체를 의미한다. 하나의 허용되는 시험관내 ADCC 분석은 다음과 같다:
1) 상기 분석은 항체의 항원 결합 영역에 의해 인식되는 표적 항원을 발현하는 것으로 공지된 표적 세포를 사용하고;
2) 상기 분석은 무작위적으로 선택된 건강한 공여자의 혈액으로부터 단리된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 이펙터 세포로서 사용하고;
3) 상기 분석은 하기 프로토콜에 따라 수행되고:
i) PBMC를 표준 밀도 원심분리 절차를 이용하여 단리하고 RPMI 세포 배양 배지 중에 5 x 106개 세포/㎖의 밀도로 현탁하고;
ii) 표적 세포를 표준 조직 배양 방법으로 성장시키고 90% 초과의 생존력을 갖는 지수 성장기로부터 회수하고 RPMI 세포 배양 배지로 세척하고 100 마이크로큐리의 51Cr로 표지하고, 세포 배양 배지로 2회 세척하고 105개 세포/㎖의 밀도로 세포 배양 배지에 재현탁하고;
iii) 100 ㎕의 최종 표적 세포 현탁액을 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰로 옮기고;
iv) 항체를 세포 배양 배지 중에 4000 ng/㎖ 내지 0.04 ng/㎖로 연속적으로 희석하고, 50 ㎕의 생성된 항체 용액을 96-웰 마이크로타이터 플레이트 내의 표적 세포에 첨가하고, 상기 전체 농도 범위를 포함하는 다양한 항체 농도를 삼중으로 반복 시험하고;
v) 최대 방출(MR) 대조군을 위해, 표지된 표적 세포를 함유하는 플레이트 내의 3개 추가 웰은 항체 용액(상기 iv) 대신에 50 ㎕의 2%(부피/부피) 비-이온성 세제(노니데트(Nonidet), 시그마(Sigma), 미국 세인트 루이스 소재) 수용액을 제공받고;
vi) 자연발생적 방출(SR) 대조군을 위해, 표지된 표적 세포를 함유하는 플레이트 내의 3개 추가 웰은 항체 용액(상기 iv) 대신에 50 ㎕의 RPMI 세포 배양 배지를 제공받고;
vii) 그 다음, 상기 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 50 x g에서 1분 동안 원심분리하고 4℃에서 1시간 동안 항온처리하고;
viii) 50 ㎕의 PBMC 현탁액(상기 i)을 각각의 웰에 첨가하여 25:1의 이펙터:표적 세포 비를 달성하고, 상기 플레이트를 37℃에서 5% CO2 대기 하에 항온처리기 내에 4시간 동안 넣어 두고;
ix) 각각의 웰로부터 세포 무함유 상청액을 회수하고, 감마 카운터를 이용하여 실험적으로 방출된 방사성(ER)을 정량하고;
x) 각각의 항체 농도에 대한 특이적 용해의 백분율을 수학식 (ER-MR)/(MR-SR) x 100에 따라 계산하는데, 상기 식에서 ER은 해당 항체 농도에 대해 정량된 평균 방사성(상기 ix 참조)이고, MR은 MR 대조군(상기 v 참조)에 대해 정량된 평균 방사성(상기 ix 참조)이고, SR은 SR 대조군(상기 vi 참조)에 대해 정량된 평균 방사성(상기 ix 참조)이고;
4) "증가된 ADCC"는 상기 시험된 항체 농도 범위 내에서 관찰된 특이적 용해의 최대 백분율의 증가로서, 및/또는 상기 시험된 항체 농도 범위 내에서 관찰된 특이적 용해의 최대 백분율의 절반을 달성하기 위해 필요한 항체의 농도의 감소로서 정의된다. ADCC의 증가는 당업자에게 공지된 동일한 표준 제조, 정제, 제제화 및 저장 방법을 이용하였을 때 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성되되 GnTIII을 과다발현하도록 조작된 숙주 세포에 의해 생성되지 않은 동일한 항체에 의해 매개된, 상기 분석에 의해 측정된 ADCC를 기준으로 한다.
II. 조성물 및 방법
테나신-C, 특히 테나신-C의 A2 도메인 및 다른 대안적으로 스플라이싱된 도메인은 일부 병리학적 상태에서 특이적으로 발현되지만 본질적으로 건강한 성체 조직에는 존재하지 않으므로, 이 항원을 표적화하는 항체는 높은 치료 잠재력을 갖는다. 본 발명은 테나신-C의 A2 도메인에 결합하는 항체, 특히 높은 친화성 및 강한 이펙터 기능을 갖는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 예를 들면, TNC A2의 발현을 특징으로 하는 질환, 예컨대, 암의 진단 또는 치료에 유용하다.
A. 예시적 항-TNC A2 항체
본 발명은 테나신-C의 A2 도메인(TNC A2)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 TNC A2에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하고, 이때 상기 항체는 증가된 이펙터 기능을 갖도록 당조작되어 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-TNC A2 항체는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45 및 서열번호 47로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 중쇄 또는 경쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 적어도 상기 CDR에 대한 특이성 결정 잔기(SDR)를 함유하는 이의 변이체 또는 절두된(truncated) 형태를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-TNC A2 항체는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45 및 서열번호 47로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 중쇄 또는 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고, 이때 상기 항체는 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1(HCDR1), 서열번호 9, 서열번호 15 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2(HCDR2), 서열번호 27의 중쇄 CDR3(HCDR3), 서열번호 29의 경쇄 CDR1(LCDR1), 서열번호 35의 경쇄 CDR2(LCDR2) 및 서열번호 47의 경쇄 CDR4(LCDR3)의 조합을 포함하지 않는다.
한 실시양태에서, 상기 하나 이상의 CDR은 중쇄 CDR, 특히 서열번호 27의 중쇄 CDR3이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 하나 이상의 중쇄 CDR 및 하나 이상의 경쇄 CDR, 특히 서열번호 27의 중쇄 CDR3 및 서열번호 47의 경쇄 CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 (a) 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; (b) 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23 및 서열번호 25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 모든 3개의 중쇄 CDR(HCDR) 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1; (b) 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23 및 서열번호 25로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2; 및 (c) 서열번호 27의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 적어도 상기 CDR에 대한 SDR을 함유하는 이의 변이체 또는 절두된 형태를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 (a) 서열번호 29, 서열번호 31 및 서열번호 33으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; (b) 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 및 서열번호 45로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및 (c) 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 모든 3개의 경쇄 CDR(LCDR) 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 29, 서열번호 31 및 서열번호 33으로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1; (b) 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 및 서열번호 45로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2; 및 (c) 서열번호 47의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 상기 CDR에 대한 SDR을 함유하는 이의 변이체 또는 절두된 형태를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23 및 서열번호 25로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2, 및 서열번호 27의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 29, 서열번호 31 및 서열번호 33으로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 및 서열번호 45로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2, 및 서열번호 47의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 적어도 상기 CDR에 대한 SDR을 함유하는 이의 변이체 또는 절두된 형태를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23 및 서열번호 25로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2, 및 서열번호 27의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 29, 서열번호 31 및 서열번호 33으로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 및 서열번호 45로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2, 및 서열번호 47의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때 상기 항체는 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1(HCDR1), 서열번호 9, 서열번호 15 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2(HCDR2), 서열번호 27의 중쇄 CDR3(HCDR3), 서열번호 29의 경쇄 CDR1(LCDR1), 서열번호 35의 경쇄 CDR2(LCDR2) 및 서열번호 47의 경쇄 CDR3(LCDR3)의 조합을 포함하지 않는다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 23 및 서열번호 25로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2, 및 서열번호 27의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 29의 경쇄 CDR1, 서열번호 35의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 47의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1, 서열번호 9, 서열번호 15 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2, 및 서열번호 27의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 29, 서열번호 31 및 서열번호 33으로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 및 서열번호 45로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2, 및 서열번호 47의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1, 서열번호 9, 서열번호 15 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2, 및 서열번호 27의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 29의 경쇄 CDR1, 서열번호 35의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 47의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열번호 59, 서열번호 67 및 서열번호 63으로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 대해 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 59, 서열번호 67 및 서열번호 63으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비해 상대적으로 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-TNC A2 항체는 TNC A2에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 실시양태에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열번호 59, 서열번호 63 또는 서열번호 67에서 치환되어 있고/있거나, 삽입되어 있고/있거나, 결실되어 있다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 또는 CDR 외부 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 임의적으로, 본 발명에 따른 항-TNC A2 항체는 서열번호 59, 서열번호 63 또는 서열번호 67의 VH 서열(이 서열의 번역 후 변형물을 포함함)을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, VH는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25 및 서열번호 27에 기재된 서열들로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 중쇄 CDR을 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로서 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85 및 서열번호 89로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 대해 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85 및 서열번호 89로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비해 상대적으로 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-TNC A2 항체는 TNC A2에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 실시양태에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85 또는 서열번호 89에서 치환되어 있고/있거나, 삽입되어 있고/있거나, 결실되어 있다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 또는 CDR 외부 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 임의적으로, 본 발명의 항-TNC A2 항체는 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85 또는 서열번호 89의 VL 서열(이 서열의 번역 후 변형물을 포함함)을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, VL은 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45 및 서열번호 47에 기재된 서열들로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 경쇄 CDR을 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로서 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-TNC A2 항체가 제공되고, 이때 상기 항체는 상기 제공된 실시양태들 중 임의의 실시양태에서 기재된 VH 및 상기 제공된 실시양태들 중 임의의 실시양태에서 기재된 VL을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 59, 서열번호 67 및 서열번호 63으로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85 및 서열번호 89로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 각각 서열번호 59, 서열번호 63 또는 서열번호 67의 VH 서열, 및 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85 또는 서열번호 89의 VL 서열(이 서열들의 번역 후 변형물을 포함함)을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 59, 서열번호 67 및 서열번호 63으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85 및 서열번호 89로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때 상기 항체는 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열번호 55 또는 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하지 않는다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85 및 서열번호 89로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열번호 63 또는 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 55 또는 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 항체는 Fc 영역 또는 면역글로불린의 Fc 영역에 상응하는 영역을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 Fc 영역, 특히 IgG Fc 영역, 가장 특히 IgG1 Fc 영역을 포함한다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항체는 전장 항체, 특히 IgG 클래스 항체, 가장 특히 IgG1 동종형 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 scFv 단편, Fv 단편, Fab 단편 및 F(ab')2 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편이다. 추가 실시양태에서, 본 발명의 항체는 Fc 영역을 갖는 항체 단편, 또는 면역글로불린의 Fc 영역에 상응하는 영역을 포함하는 융합 단백질이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 키메라, 보다 구체적으로 인간화된 항체이다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 Fc 영역, 바람직하게는 인간 IgG Fc 영역, 가장 특히 인간 IgG1 Fc 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 이때 상기 중쇄 불변 영역은 Fc 영역을 포함하는 인간 IgG 불변 영역, 특히 인간 IgG1 불변 영역이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역, 및 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명은 TNC A2에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하고, 이때 상기 항체는 a) 서열번호 59, 서열번호 67 및 서열번호 63으로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85 및 서열번호 89로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합; 및 b) Fc 영역 또는 면역글로불린의 Fc 영역에 상응하는 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 Fc 영역을 포함하고, 이때 상기 Fc 영역은 당조작된 Fc 영역이다. 추가 실시양태에서, 본 발명의 항체는 Fc 영역 내에서 변형된 올리고사카라이드를 갖도록 당조작된다. 구체적인 실시양태에서, 상기 항체는 비-당조작된 항체에 비해 Fc 영역 내에서 증가된 비율의 이등분된 올리고사카라이드를 갖는다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 항체의 Fc 영역 내에서 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 이상, 바람직하게는 약 50% 이상, 보다 바람직하게는 약 70% 이상의 N-연결된 올리고사카라이드가 이등분된다. 상기 이등분된 올리고사카라이드는 하이브리드 또는 결합체 유형의 올리고사카라이드일 수 있다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항체는 비-당조작된 항체에 비해 Fc 영역 내에서 증가된 비율의 비-푸코실화된 올리고사카라이드를 갖는다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 항체의 Fc 영역 내에서 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 이상, 바람직하게는 약 50% 이상, 보다 바람직하게는 약 70% 이상의 N-연결된 올리고사카라이드가 비-푸코실화된다. 상기 비-푸코실화된 올리고사카라이드는 하이브리드 또는 결합체 유형의 올리고사카라이드일 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항체는 비-당조작된 항체에 비해 Fc 영역 내에서 증가된 비율의 이등분되고 비-푸코실화된 올리고사카라이드를 갖는다. 구체적으로, 상기 항체는 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 이상, 바람직하게는 약 15% 이상, 보다 바람직하게는 약 25% 이상, 약 35% 이상 또는 약 50% 이상의 N-연결된 올리고사카라이드가 이등분되고 비-푸코실화된다. 상기 이등분되고 비-푸코실화된 올리고사카라이드는 하이브리드 또는 결합체 유형의 올리고사카라이드일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 증가된 이펙터 기능 및/또는 증가된 Fc 수용체 결합 친화성을 갖는다. 증가된 이펙터 기능 및/또는 증가된 Fc 수용체 결합은 예를 들면, 항체의 당조작 및/또는 친화 성숙으로부터 비롯될 수 있다. 한 실시양태에서, 증가된 이펙터 기능 및/또는 증가된 Fc 수용체 결합은 항체의 Fc 영역의 당조작의 결과이다. 또 다른 실시양태에서, 증가된 이펙터 기능 및/또는 증가된 Fc 수용체 결합은 증가된 친화성과 당조작의 조합의 결과이다. 증가된 이펙터 기능은 하기 기능들 중 하나 이상의 기능을 포함할 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다: 증가된 Fc 매개된 세포성 세포독성(증가된 항체 의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 포함함), 증가된 항체 의존적 세포성 식균작용(ADCP), 증가된 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 증가된 면역결합체 매개된 항원 섭취, NK 세포와의 증가된 결합, 대식세포와의 증가된 결합, 단핵구와의 증가된 결합, 다형핵 세포(PMNC)와의 증가된 결합, 증가된 직접적 신호전달 유도 세포사멸, 표적 결합된 항체의 증가된 가교결합, 증가된 수지상 세포 성숙, 및 증가된 T 세포 프라이밍(priming). 구체적인 실시양태에서, 증가된 이펙터 기능은 증가된 ADCC이다. 증가된 Fc 수용체 결합은 바람직하게는 활성화 Fc 수용체, 가장 바람직하게는 FcγRIIIa와의 증가된 결합이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 치료적 유효량으로 개체에게 투여되었을 때 임상적으로 유의한 수준의 독성을 야기하지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 친화 성숙된다. 추가 실시양태에서, 본 발명의 항체는 약 1 μM 내지 약 0.001 nM 미만의 해리 상수(KD) 값, 특히 약 100 nM 미만, 약 20 nM 미만, 약 10 nM 미만 또는 약 1 nM 미만의 KD 값으로 테나신-C의 A2 도메인(TNC A2)에 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간, 마우스 및 사이노몰거스 TNC A2의 A2 도메인에 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 및 사이노몰거스 TNC A2의 A2 도메인에 결합한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항체는 약 20 nM 미만, 약 10 nM 미만 또는 약 1 nM 미만의 KD 값으로 인간 및 사이노몰거스 TNC A2의 A2 도메인에 결합한다. KD 값은 Fab 또는 IgG, 특히 IgG로서 항체를 사용하는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-TNC A2 항체는 인간 조직 내의 TNC A2에 결합한다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명은 테나신-C의 A2 도메인(TNC A2)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하고, 이때 상기 항체는 서열번호 59, 서열번호 67 및 서열번호 63으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85 및 서열번호 89로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 인간 IgG Fc 영역을 포함하고, 이때 임의적으로 상기 항체는 증가된 이펙터 기능 및/또는 Fc 수용체 결합 친화성을 갖도록 당조작된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 테나신-C의 A2 도메인(TNC A2)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하고, 이때 상기 항체는 서열번호 59, 서열번호 67 및 서열번호 63으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85 및 서열번호 89로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 인간 IgG Fc 영역을 포함하고, 이때 상기 항체는 상기 Fc 영역 내에서 증가된 비율의 비-푸코실화된 올리고사카라이드 및/또는 증가된 비율의 이등분된 올리고사카라이드를 갖는다.
한 양태에서, 본 발명은 테나신-C의 A2 도메인(TNC A2)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하고, 이때 상기 항체는 서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 9의 중쇄 CDR2, 서열번호 27의 중쇄 CDR3, 서열번호 29의 경쇄 CDR1, 서열번호 35의 경쇄 CDR2 및 서열번호 47의 경쇄 CDR3을 포함하는 모 항체로부터 유도되고, 상기 항체는 모 항체의 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 CDR 내에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들면, 상기 항체는 모 항체의 하나 이상의 초가변 영역 또는 CDR(즉, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 초가변 영역 또는 CDR) 내에서 하나 이상, 예를 들면, 약 1개 내지 약 10개(즉, 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개), 특히 약 2개 내지 약 5개의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 제공된 바와 같은 모 항체의 임의의 하나 이상의 아미노산이 하기 CDR 위치들에서 치환된다:
- 중쇄 CDR2(서열번호 9): 위치 1, 6 및 8
- 경쇄 CDR1(서열번호 29): 위치 5 및 9
- 경쇄 CDR1(서열번호 35): 위치 1, 2 및 3
일부 실시양태에서, 치환은 본원에서 제공된 바와 같은 보존적 치환이다. 일부 실시양태에서, 하기 치환들 중 임의의 하나 이상의 치환이 임의의 조합으로 만들어질 수 있다:
- 중쇄 CDR2(서열번호 9): G1A 또는 V, F6L, T8I
- 경쇄 CDR1(서열번호 29): G5S, D9V
- 경쇄 CDR1(서열번호 35): A1D, A2S 또는 V, S3Y 또는 T
추가로, 상기 항체는 모 항체에 비해 중쇄 또는 경쇄의 하나 이상의 골격 영역 내에서 하나 이상의 부가, 결실 및/또는 치환을 포함할 수도 있다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 CDR 내의 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 이의 모 항체에 비해 항체의 증가된 결합 친화성에 기여한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 (동일한 형식, 예를 들면, Fab 형식으로 본 발명의 항체와 모 항체를 비교하였을 때) 모 항체보다 TNC A2에 대해 약 2배 내지 약 10배 더 높은 친화성을 갖는다. 추가로, 모 항체로부터 유도된 항체는 본 발명의 항체와 관련하여 이전 단락에 기재된 특징들 중 임의의 특징을 단독으로 또는 조합으로 포함할 수 있다.
본 발명은 테나신-C의 A2 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드도 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 전술된 본 발명에 따른 항-TNC A2 항체의 일부를 형성하는 폴리펩타이드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드는 전술된 본 발명에 따른 항-TNC A2 항체의 일부를 형성하는 항체 중쇄 및/또는 항체 경쇄를 코딩한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45 및 서열번호 47에 기재된 하나 이상(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 중쇄 또는 경쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 적어도 상기 CDR에 대한 특이성 결정 잔기(SDR)를 함유하는 이의 변이체 또는 절두된 형태를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45 및 서열번호 47로부터 선택된 3개의 중쇄 CDR(예를 들면, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 또는 3개의 경쇄 CDR(예를 들면, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3), 또는 적어도 상기 3개의 상보성 결정 영역 각각에 대한 SDR을 함유하는 이의 변이체 또는 절두된 형태를 코딩하는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45 및 서열번호 47로부터 선택된 3개의 중쇄 CDR(예를 들면, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 또는 3개의 경쇄 CDR(예를 들면, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 코딩하는 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 하나 이상의 CDR을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53 및 서열번호 54의 CDR 뉴클레오타이드 서열들 중 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열과 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 동일한 서열을 포함한다.
추가 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 59, 서열번호 67 및 서열번호 63으로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열, 및/또는 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85 및 서열번호 89로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60, 서열번호 62, 서열번호 64, 서열번호 66, 서열번호 68, 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 76, 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84, 서열번호 86, 서열번호 88, 서열번호 90 및 서열번호 92로 구성된 가변 영역 뉴클레오타이드 서열 군으로부터 선택된 서열, 또는 이들의 조합을 포함한다.
구체적인 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 59, 서열번호 67 및 서열번호 63으로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열, 및 중쇄 불변 영역, 특히 인간 중쇄 불변 영역을 코딩하는 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 중쇄 불변 영역은 Fc 영역을 포함하는 인간 IgG 중쇄 불변 영역, 구체적으로 인간 IgG1 중쇄 불변 영역이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 중쇄 불변 영역은 서열번호 93의 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85 및 서열번호 89로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열, 및 경쇄 불변 영역, 특히 인간 경쇄 불변 영역을 코딩하는 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 경쇄 불변 영역은 서열번호 95의 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 59, 서열번호 67 및 서열번호 63으로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 단리된 폴리뉴클레오타이드, 및 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85 및 서열번호 89로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 60, 서열번호 68 및 서열번호 64로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 동일한 서열을 포함하는 제1 단리된 폴리뉴클레오타이드, 및 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 70, 서열번호 74, 서열번호 78, 서열번호 82, 서열번호 86 및 서열번호 90으로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 동일한 서열을 포함하는 제2 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 발명은 또한 전술된 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드들 중 임의의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 단리된 폴리펩타이드에 관한 것이다.
추가 양태에서, 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 항-TNC A2 항체는 하기 단락 1 내지 6에 기재된 바와 같은 특징들 중 임의의 특징을 단독으로 또는 조합으로 포함할 수 있다.
1. 항체 친화성
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하 또는 0.001 nM 이하(예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다. 바람직하게는, 본원에서 제공된 항체는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정되었을 때 1 nM 미만의 KD 값으로 테나신-C의 A2 도메인(TNC A2), 특히 인간 TNC A2에 결합한다.
한 실시양태에 따라, KD를 표면 플라스몬 공명을 이용하여 측정한다. 예를 들면, 약 80 반응 유닛(RU)으로 스트렙타비딘 칩 상에 고정된 바이오티닐화된 항원과 함께 25℃에서 비아코어(BIACORE: 등록상표) T100 기계(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))를 이용하여 이러한 분석을 수행할 수 있다. 요약하건대, 고정을 위해 항원을 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.05% 계면활성제 P20(pH 7.4)으로 0.1 ㎍/㎖까지 희석한 후 10 ㎕/분의 유속으로 주입하여 약 80 반응 유닛(RU)의 커플링된 단백질을 달성한다. 적합한 항원 구축물의 단백질 및 DNA 서열은 서열번호 99 내지 서열번호 104에 나타나 있다. 동역학적 측정을 위해, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.05% 계면활성제 P20(pH 7.4) 중의 Fab(1.56 nM 내지 100 nM) 또는 IgG(0.39 nM 내지 25 nM)의 2배 연속 희석물을 25℃에서 약 50 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 결합 및 해리 시간은 180초이고, 10 mM 글리신(pH 1.5)을 사용한 재생을 주기 사이에 60초 동안 수행한다. 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순 1-대-1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(비아코어(등록상표) T100 평가 소프트웨어 버전 1.1.1)을 이용하여 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)를 계산한다. 평형 해리 상수(KD)를 비 koff/kon으로서 계산한다. 예를 들면, 문헌(Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999))을 참조한다.
2. 항체 단편
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 후술된 다른 단편을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 항체 단편의 검토를 위해서는 문헌(Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)) 또는 문헌(Carter, Nat. Rev. Immunol. 6:343-357 (2006))을 참조한다.
단일 쇄 Fv 또는 scFv 단편은 VH 도메인 및 VL 도메인을 단일 폴리펩타이드 쇄로서 포함한다. 전형적으로, VH 도메인과 VL 도메인은 링커 서열에 의해 연결된다. scFv 단편의 검토를 위해서는 예를 들면, 문헌(Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994))을 참조하고, 국제 특허출원 공개 제WO 93/16185호; 및 미국 특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호도 참조한다. 살비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의를 위해서는 미국 특허 제5,869,046호를 참조한다.
다이아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들면, 유럽 특허 제404,097호; 국제 특허출원 공개 제WO 1993/01161호; 문헌(Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)); 및 문헌(Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993))을 참조한다. 트라이아바디 및 테트라바디도 문헌(Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003))에 기재되어 있다.
미니바디는 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 보다 바람직하게는 IgG1의 불변 영역, 전형적으로 CH3 영역을 이량체화 영역으로서 함유하는 2가 동종이량체성 scFv 유도체이다. 일반적으로, 불변 영역은 힌지 영역 및/또는 링커 영역을 통해 scFv에 연결된다. 미니바디 단백질의 예는 문헌(Hu et al., Cancer Res. 56: 3055-61 (1996))에서 발견될 수 있다.
단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다(도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.), 미국 매사추세츠주 왈쌈 소재; 예를 들면, 미국 특허 제6,248,516 B1호 참조).
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이 온전한 항체의 단백질용해성 분해 및 재조합 숙주 세포(예를 들면, 에스케리키아 콜라이(E. coli) 또는 파지)에 의한 제조를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 기법에 의해 제조될 수 있다.
3. 키메라 항체 및 인간화된 항체
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 키메라 항체이다. 일부 키메라 항체들은 예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호 및 문헌(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대, 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 하위클래스가 모 항체의 클래스 또는 하위클래스로부터 변화되어 있는 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 보유하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR, 예를 들면, CDR(또는 이의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고 FR(또는 이의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 불변 영역의 적어도 일부도 포함할 것이다. 몇몇 실시양태에서, 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화성을 회복하거나 개선하기 위해 인간화된 항체 내의 몇몇 FR 잔기들은 비-인간 항체(예를 들면, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다. 인간화는 (a) 전체 비-인간 가변 도메인을 인간 불변 영역 상으로 이식시켜 키메라 항체를 발생시키는 방법, (b) 중요한 골격 잔기(예를 들면, 우수한 항원 결합 친화성 또는 항체 기능을 보유하는 데 있어서 중요한 골격 잔기)를 보유하거나 보유하지 않으면서 비-인간(예를 들면, 공여자 항체) CDR만을 인간(예를 들면, 수용자 항체) 골격 및 불변 영역 상으로 이식시키는 방법, (c) 비-인간 특이성 결정 영역(SDR 또는 a-CDR; 항체-항원 상호작용에 중요한 잔기)만을 인간 골격 및 불변 영역 상으로 이식시키는 방법, 및 (d) 전체 비-인간 가변 도메인들을 이식시키되, 표면 잔기의 치환을 통해 이들을 인간 유사 구획으로 "은폐시키는" 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 인간화된 항체 및 이의 제조 방법은 예를 들면, 문헌(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))에서 검토되어 있고, 예를 들면, 문헌(Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)); 문헌(Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)); 미국 특허 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호 및 제7,087,409호; 문헌(Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)); 문헌(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984)); 문헌(Morrison and Oi, Adv. Immunol. 44:65-92 (1988)); 문헌(Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)); 문헌(Padlan, Molec. Immun. 31(3):169-217 (1994)); 문헌(Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005))(SDR(a-CDR) 이식을 기재함); 문헌(Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991))("표면치환술(resurfacing)"을 기재함); 문헌(Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005))("FR 셔플링"을 기재함); 및 문헌(Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005)) 및 문헌(Klimka et al., Br. J. Cancer 83:252-260 (2000))(FR 셔플링에 대한 "안내된 선별" 방법을 기재함)에 추가로 기재되어 있다.
인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 골격 영역은 "최적-피트" 방법을 이용하여 선택한 골격 영역(예를 들면, 문헌(Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)) 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 골격 영역(예를 들면, 문헌(Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)) 및 문헌(Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)) 참조); 인간 성숙(체세포 돌연변이된) 골격 영역 또는 인간 생식세포주 골격 영역(예를 들면, 문헌(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)) 참조); 및 FR 라이브러리의 스크리닝으로부터 유래된 골격 영역(예를 들면, 문헌(Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)) 및 문헌(Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)) 참조)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
4. 인간 항체
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 인간 항체이다. 당업계에서 공지된 다양한 기법을 이용하여 인간 항체를 제조할 수 있다. 인간 항체는 문헌(van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)) 및 문헌(Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008))에 일반적으로 기재되어 있다.
항원 공격(challenge)에 반응하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생성하도록 변형된 형질전환 동물에게 면역원을 투여함으로써 인간 항체를 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 면역글로불린 좌위를 치환시키는 인간 면역글로불린 좌위, 또는 염색체 외부에 존재하거나 동물의 염색체 내로 무작위적으로 삽입된 인간 면역글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 형질전환 마우스에서, 내인성 면역글로불린 좌위는 일반적으로 불활성화되어 있다. 형질전환 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해서는 문헌(Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005))을 참조한다. 또한, 예를 들면, 제노마우스(XENOMOUSE: 상표) 기술을 기재하는 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호; HUMAB(등록상표) 기술을 기재하는 미국 특허 제5,770,429호; K-M 마우스(등록상표) 기술을 기재하는 미국 특허 제7,041,870호; 및 벨로시마우스(VELOCIMOUSE: 등록상표) 기술을 기재하는 미국 특허출원 공개 제2007/0061900호를 참조한다. 이러한 동물에 의해 발생된 온전한 항체로부터의 인간 가변 영역은 예를 들면, 상이한 인간 불변 영역과의 조합에 의해 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 하이브리도마-기초 방법에 의해 만들어질 수도 있다. 인간 단일클론 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다(예를 들면, 문헌(Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)); 문헌(Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)); 및 문헌(Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)) 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 발생된 인간 항체는 문헌(Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006))에도 기재되어 있다. 추가 방법은 예를 들면, 미국 특허 제7,189,826호(하이브리도마 세포주로부터 단일클론 인간 IgM 항체를 제조하는 방법을 기재함) 및 문헌(Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006))(인간-인간 하이브리도마를 기재함)에 기재된 방법들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(트라이오마(Trioma) 기술)도 문헌(Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)) 및 문헌(Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005))에 기재되어 있다.
인간으로부터 유래된 파지 표시 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 인간 항체를 발생시킬 수도 있다. 그 다음, 이러한 가변 도메인 서열을 목적 인간 불변 도메인과 조합할 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기법은 후술되어 있다.
5. 라이브러리로부터 유래된 항체
목적 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 본 발명의 항체를 단리할 수 있다. 예를 들면, 파지 표시 라이브러리를 발생시키고 목적 결합 특성을 보유하는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법들이 당업계에서 공지되어 있다. 이러한 방법들은 예를 들면, 문헌(Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001))에서 검토되어 있고, 예를 들면, 문헌(McCafferty et al., Nature 348:552-554); 문헌(Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)); 문헌(Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)); 문헌(Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)); 문헌(Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)); 문헌(Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)); 문헌(Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)); 및 문헌(Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004))에 추가로 기재되어 있다.
일부 파지 표시 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리를 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 별도로 클로닝하고 파지 라이브러리에서 무작위적으로 재조합한 후, 문헌(Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994))에 기재된 바와 같이 상기 라이브러리를 항원 결합 파지에 대해 스크리닝할 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일 쇄 Fv(scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 표시한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 것을 요구하지 않으면서 면역원에 대한 높은 친화성 항체를 제공한다. 대안적으로, 문헌(Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993))에 기재된 바와 같이 천연 레퍼토리를 (예를 들면, 인간으로부터) 클로닝하여 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 항원 및 자가 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 문헌(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992))에 기재된 바와 같이, 재배열되지 않은 V 유전자 분절을 줄기 세포로부터 클로닝하고, 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 이용하여 고도 가변성 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열을 달성함으로써 천연 라이브러리를 합성적으로 제조할 수도 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하는 특허 공보는 예를 들면, 하기 공보들을 포함한다: 미국 특허 제5,750,373호; 및 미국 특허 공개 제2005/0079574호, 제2005/0119455호, 제2005/0266000호, 제2007/0117126호, 제2007/0160598호, 제2007/0237764호, 제2007/0292936호 및 제2009/0002360호.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로서 간주된다.
6. 다중특이적 항체
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 TNC A2에 대한 결합 특이성이고, 나머지는 임의의 다른 항원에 대한 결합 특이성이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 TNC A2의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 세포독성제를, TNC A2를 발현하는 세포에 국소화시키는 데에 사용될 수도 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체의 제조 기법은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시-발현(예를 들면, 문헌(Milstein and Cuello, Nature 305:537 (1983)), 국제 특허출원 공개 제WO 93/08829호 및 문헌(Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991)) 참조), 및 "크놉-인-홀(knob-in-hole)" 조작(예를 들면, 미국 특허 제5,731,168호 참조)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다중특이적 항체는 항체 Fc-이종이량체성 분자의 제조를 위한 정전 스티어링(electrostatic steering) 효과의 조작(국제 특허출원 공개 제WO 2009/089004A1호); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교결합(예를 들면, 미국 특허 제4,676,980호 및 문헌(Brennan et al., Science 229:81 (1985)) 참조); 이중특이적 항체의 제조를 위한 류신 지퍼의 사용(예를 들면, 문헌(Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)) 참조); 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 "다이아바디" 기술의 이용(예를 들면, 문헌(Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)) 참조); 단일 쇄 Fv(sFv) 이량체의 사용(예를 들면, 문헌(Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)) 참조); 및 예를 들면, 문헌(Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991))에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수도 있다.
"옥토퍼스 항체"를 포함하는, 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체도 본원에 포함된다(예를 들면, 미국 특허출원 공개 제2006/0025576A1호 참조).
본원에서 항체 또는 단편은 TNC A2뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에도 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"도 포함한다(예를 들면, 미국 특허출원 공개 제2008/0069820호 참조).
7. 항체 변이체
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들면, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 적절한 변형을 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 내로 도입함으로써, 또는 펩타이드 합성을 통해 항체의 아미노산 서열 변이체를 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들면, 항체의 아미노산 서열로부터의 결실, 항체의 아미노산 서열 내로의 삽입, 및/또는 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 치환을 포함한다. 최종 구축물에 도달하도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 만들 수 있되, 상기 최종 구축물은 목적 특성, 예를 들면, 항원 결합을 보유한다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 있는 부위는 HVR 및 FR을 포함한다.
아미노산 치환은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것, 예를 들면, 보존적 아미노산 치환일 수 있다. "보존적" 아미노산 치환은 관여된 잔기의 극성, 전하, 가용성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성에서의 유사성에 기초하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 비-극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산은 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"이라는 제목 하에 표 2에 제시되어 있다. 보다 실질적인 변화는 "예시적 치환"이라는 제목 하에 표 2에 제공되어 있고 아미노산 측쇄 클래스와 관련하여 추가로 후술되어 있다. 아미노산 치환을 관심 있는 항체 내로 도입할 수 있고, 생성물을 목적 활성, 예를 들면, 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝할 수 있다.
[표 2]
Figure 112013021306347-pct00002
아미노산은 공통된 측쇄 성질에 따라 군으로 나누어질 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 측쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 클래스들 중 한 클래스의 구성원을 또 다른 클래스의 구성원으로 교체하는 것을 수반한다. 예를 들면, 아미노산 치환은 한 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것, 예를 들면, 한 군(예를 들면, 극성)으로부터의 아미노산을 상이한 군(예를 들면, 염기성)으로부터의 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것일 수도 있다. 재조합 DNA 기법을 이용하여 폴리펩타이드 분자에서 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 만들고 생성된 재조합 변이체를 활성에 대해 분석함으로써 허용되는 변경을 실험적으로 확인할 수 있다. 한 유형의 치환 변이체는 모 항체(예를 들면, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위한 선택된 생성된 변이체는 모 항체에 비해 상대적으로 일부 생물학적 성질의 변형(예를 들면, 개선)(예를 들면, 증가된 친화성, 감소된 면역원성)을 가질 것이고/이거나 모 항체의 일부 생물학적 성질을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적 치환 변이체는 예를 들면, 파지 표시-기초 친화 성숙 기법, 예컨대, 본원에 기재된 친화 성숙 기법을 이용하여 편리하게 발생시킬 수 있는 친화 성숙된 항체이다. 요약하건대, 하나 이상의 HVR 잔기를 돌연변이시키고, 변이체 항체를 파지 상에서 표시하고 특정 생물학적 활성(예를 들면, 결합 친화성)에 대해 스크리닝한다.
예를 들면, 항체 친화성을 개선하도록 변경(예를 들면, 치환)을 HVR 내에서 만들 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스폿(hotspot)", 즉 체세포 성숙 과정 동안 고 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 코딩된 잔기(예를 들면, 문헌(Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) 참조), 및/또는 SDR(a-CDR) 내에서 만들어질 수 있고, 이때 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대해 시험된다. 제2 라이브러리로부터의 구축 및 재선별에 의한 친화 성숙은 예를 들면, 문헌(Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에 기재되어 있다. 친화 성숙의 몇몇 실시양태에서, 다양한 방법들 중 임의의 방법(예를 들면, 오류 유발 PCR, 연쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오타이드 지정된 돌연변이유발)으로 다양성을 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내로 도입한다. 그 다음, 제2 라이브러리를 생성한다. 그 다음, 상기 라이브러리를 스크리닝하여 목적 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 여러 HVR 잔기(예를 들면, 한번에 4개 내지 6개의 잔기)가 무작위화되는 HVR 지정된 방식을 포함한다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기를 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 구체적으로 확인할 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
일부 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은, 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들면, 본원에서 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR 내에서 만들어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스폿" 또는 SDR 외부에서 존재할 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 일부 실시양태에서, 각각의 HVR은 비-변경되거나 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 문헌(Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085)에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 지칭된다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기(예를 들면, 하전된 잔기, 예컨대, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu)의 군을 확인하고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들면, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환시켜 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지를 확인한다. 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에서 추가 치환을 도입할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항원-항체 결합체의 결정 구조를 분석하여 상기 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 인접하는 잔기는 치환을 위한 후보 잔기로서 표적화될 수 있거나 제거될 수 있다. 변이체들을 스크리닝하여 이들이 원하는 성질을 갖는지를 확인할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입뿐만 아니라, 길이에 있어서 1개 잔기부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드까지 이르는 아미노-말단 및/또는 카복실-말단 융합도 포함한다. 말단 삽입의 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체가 포함된다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 N-말단 또는 C-말단과, 상기 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소(예를 들면, ADEPT) 또는 폴리펩타이드의 융합체를 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
몇몇 실시양태에서, 일부 개선된 성질을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 본 발명의 항체에서 올리고사카라이드의 변형을 만들 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 항체 의존적 세포성 세포독성을 포함하는 증가된 이펙터 기능을 갖는 항-TNC A2 항체의 당형태(glycoform)를 제공한다. 항체의 글리코실화 조작은 이미 기재되어 있다. 예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,602,684호를 참조한다. 글리코실화에 관여하는 유전자의 변경된 활성을 갖는 숙주 세포로부터 항-TNC A2 항체를 제조하는 방법도 본원에 상세히 기재되어 있다(예를 들면, 하기 "재조합 방법 및 조성물"이라는 표제를 갖는 단락 참조). IgG 분자는 이의 Fc 영역 내에서 2개(각각의 중쇄 상에서 1개씩)의 N-연결된 올리고사카라이드를 보유한다. 임의의 당단백질로서 항체는 동일한 폴리펩타이드 주쇄를 공유하지만 글리코실화 부위에 부착된 상이한 올리고사카라이드를 갖는 당형태의 집단으로서 생성된다. 혈청 IgG의 Fc 영역에서 통상적으로 발견되는 올리고사카라이드는 낮은 수준의 말단 시알산 및 이등분 N-아세틸글루코스아민(GlcNAc), 및 다양한 정도의 말단 갈락토실화 및 코어 푸코실화(바이안테나리 올리고사카라이드 구조의 "줄기"에서 GlcNAc 잔기에 부착된 푸코스)를 갖는 결합체 바이안테나리 유형의 올리고사카라이드이다(문헌(Wormald et al., Biochemistry 36:130-38 (1997))). 몇몇 연구는 FcγR 결합을 위해 필요한 최소한의 탄수화물 구조가 올리고사카라이드 코어 내에 존재한다고 암시한다(문헌(Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996))).
항체의 제조를 위해 산업 및 학계에서 사용되는 마우스 또는 햄스터 유래의 세포주는 통상적으로 필요한 올리고사카라이드 결정인자를 Fc 부위에 부착시킨다. 그러나, 이들 세포주들에서 발현된 IgG는 혈청 IgG에서 소량으로 발견되는 이등분 GlcNAc를 결여한다(문헌(Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995))). N-연결된 글리코실화 경로에서, 이등분 GlcNAc는 GnTIII에 의해 부가된다(문헌(Schachter, Biochem. Cell Biol. 64:163-81 (1986))). 우마나 등(Umana et al.)은 다양한 수준의 클로닝된 GnTIII 효소 유전자를 외부적으로 조절된 방식으로 발현하도록 이미 조작되어 있는 단일 항체 생성 CHO 세포주를 사용하였다(문헌(Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999))). 이 방식은 글리코실트랜스퍼라제(예를 들면, GnTIII)의 발현과 변형된 항체의 ADCC 활성 사이의 강한 상관관계를 처음으로 확립하였다. 따라서, 본 발명은 항체 생성 숙주 세포에서 글리코실트랜스퍼라제 유전자의 발현 수준을 변화시킴으로써 발생된 변경된 글리코실화를 갖는 Fc 영역 또는 이 Fc 영역에 상응하는 영역을 포함하는 항-TNC A2 항체를 고려한다. 구체적인 실시양태에서, 유전자 발현 수준의 변화는 GnTIII 활성의 증가이다. 증가된 GnTIII 활성은 항체의 Fc 영역 내에서 푸코실화된 올리고사카라이드의 백분율을 감소시킬뿐만 아니라 이등분된 올리고사카라이드의 백분율을 증가시킨다. 이 항체 또는 이의 단편은 증가된 Fc 수용체 결합 친화성 및 증가된 이펙터 기능을 갖는다.
예를 들면, 항체의 Fc 영역에 부착된 바이안테나리 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분되는 이등분된 올리고사카라이드가 항체에 제공된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 2003/011878호(Jean-Mairet et al.), 미국 특허 제6,602,684호(Umana et al.) 및 미국 특허출원 공개 제2005/0123546호(Umana et al.)에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-TNC A2 항체는 본 발명의 방법에 의한 그의 올리고사카라이드의 변형의 결과로서 Fc 영역 내에서 증가된 비율의 이등분된 올리고사카라이드를 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-TNC A2 항체의 Fc 영역 내에서 이등분된 N-연결된 올리고사카라이드의 백분율은 총 올리고사카라이드의 약 10% 내지 약 100% 이상, 구체적으로 약 50% 이상, 보다 구체적으로 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상 또는 약 90% 내지 95% 이상이다. 상기 이등분된 올리고사카라이드는 하이브리드 또는 결합체 유형의 올리고사카라이드일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-TNC A2 항체는 본 발명의 방법에 의한 그의 올리고사카라이드의 변형의 결과로서 Fc 영역 내에서 증가된 비율의 비-푸코실화된 올리고사카라이드를 갖는다. 한 실시양태에서, 비-푸코실화된 올리고사카라이드의 백분율은 약 20% 내지 약 100% 이상, 구체적으로 약 50% 이상, 약 60% 내지 약 70% 이상, 보다 구체적으로 약 75% 이상이다. 상기 비-푸코실화된 올리고사카라이드는 하이브리드 또는 결합체 유형의 올리고사카라이드일 수 있다.
푸코스의 양은 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 2008/077546호에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정되었을 때 Asn297에 부착된 모든 당구조체(예를 들면, 결합체, 하이브리드 및 고-만노스 구조체)의 합계를 기준으로 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 측정된다. Asn297은 Fc 영역 내의 약 위치 297에 존재하는 아스파라긴 잔기를 의미하나(Fc 영역 잔기의 EU 넘버링), Asn297은 항체 내의 소수의 서열 변경으로 인해 위치 297의 약 ± 3개 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294와 300 사이에 존재할 수도 있다. 푸코스의 상대적인 양은 MALDI-TOF MS에 의해 N-글리코시다제 F 처리된 샘플에서 확인된 모든 당구조체(예를 들면, 결합체, 하이브리드 및 고-만노스 구조체)와 관련된 푸코스 함유 구조체의 백분율이다. 이러한 푸코실 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다.
본 발명의 항-TNC A2 항체와 함께 이용될 수 있는 당조작 방법은 미국 특허 제6,602,684호, 미국 특허출원 공개 제2004/0241817 A1호, 미국 특허출원 공개 제2003/0175884 A1호, 미국 가특허출원 제60/441,307호 및 국제 특허출원 공개 제WO 2004/065540호(이들 각각의 전체 내용은 전체적으로 본원에 참고로 도입됨)에 보다 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 항-TNC A2 항체는 대안적으로 미국 특허출원 공개 제2003/0157108호(제넨테크); 유럽 특허 제1 176 195 A1호; 국제 특허출원 공개 제WO 03/084570호 및 제WO 03/085119호; 미국 특허출원 공개 제2003/0115614호, 제2004/093621호, 제2004/110282호, 제2004/110704호 및 제2004/132140호; 문헌(Niwa et al., J Immunol Methods 306, 151/160 (2006)); 및 미국 특허 제6,946,292호(교와(Kyowa))에 개시된 기법에 따라 Fc 영역 내에서 감소된 푸코스 잔기를 갖도록 당조작될 수 있다. 본 발명의 당조작된 항-TNC A2 항체는 변형된 당단백질을 생성하는 발현 시스템, 예컨대, 미국 특허출원 제60/344,169호, 및 국제 특허출원 공개 제WO 03/056914호(글리코파이 인코포레이티드(GlycoFi, Inc.)), 제WO 2004/057002호 및 제WO 2004/024927호(그리노베이션(Greenovation))에 교시된 발현 시스템 내에서 생성될 수도 있다.
"탈푸코실화된" 또는 "푸코스 결여" 항체 변이체에 관한 공개문헌의 추가 예에는 하기 공개문헌들이 포함된다: 국제 특허출원 공개 제WO 2000/61739호; 국제 특허출원 공개 제WO 2001/29246호; 미국 특허출원 공개 제2002/0164328호; 미국 특허출원 공개 제2004/0109865호; 국제 특허출원 공개 제WO 2005/035586호; 국제 특허출원 공개 제WO 2005/035778호; 국제 특허출원 공개 제WO2005/053742호; 국제 특허출원 공개 제WO2002/031140호; 문헌(Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)); 및 문헌(Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)). 탈푸코실화된 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예에는 단백질 푸코실화를 결여하는 Lec13 CHO 세포(문헌(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)); 미국 특허출원 공개 제2003/0157108 A1호(Presta, L); 및 국제 특허출원 공개 제WO 2004/056312 A1호(Adams et al.), 특히 실시예 11), 및 넉아웃(knockout) 세포주, 예컨대, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자인 FUT8 넉아웃 CHO 세포(예를 들면, 문헌(Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)); 문헌(Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)); 및 국제 특허출원 공개 제WO 2003/085107호 참조)가 포함된다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항-TNC A2 항체는 Fc 영역 내에서 증가된 비율의 이등분되고 비-푸코실화된 올리고사카라이드를 갖는다. 상기 이등분되고 비-푸코실화된 올리고사카라이드는 하이브리드 또는 결합체일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 방법은 항원 결합 분자의 Fc 영역 내에서 약 10% 내지 약 100% 이상, 구체적으로 약 15% 이상, 보다 구체적으로 약 20% 내지 약 25% 이상, 보다 구체적으로 약 30% 내지 약 35% 이상의 올리고사카라이드가 이등분되고 비-푸코실화되어 있는 항-TNC A2 항체를 제조하는 데에 이용될 수 있다. 본 발명의 항-TNC A2 항체는 항체의 Fc 영역 내에서 약 10% 내지 약 100% 이상, 구체적으로 약 15% 이상, 보다 구체적으로 약 20% 내지 약 25% 이상, 보다 구체적으로 약 30% 내지 약 35% 이상의 올리고사카라이드가 이등분되고 비-푸코실화된 하이브리드인 Fc 영역도 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 글리코실화 부위를 항체에 부가하거나 글리코실화 부위를 항체로부터 결실시키는 것은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내의 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체도 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 1997/30087호(Patel et al.), 제WO 1998/58964호(Raju, S.) 및 제WO 1999/22764호(Raju, S.)에 기재되어 있다.
본 발명의 항-TNC A2 항체의 ADCC 또는 다른 이펙터 기능의 증가는 예를 들면, 친화 성숙 또는 다른 친화성 개선 방법에 의한 TNC A2에 대한 항원 결합 분자의 친화성의 증가(예를 들면, 문헌(Tang et al., J. Immunol. 2007, 179:2815-2823) 참조), 또는 후술된 바와 같은 Fc 영역 내에서의 아미노산 변형에 의해 달성될 수도 있다. 이들 방법들의 조합도 본 발명에 포함된다.
c) Fc 영역 변이체
일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형을 본원에서 제공된 항체의 Fc 영역 내로 도입하여 Fc 영역 변이체를 발생시킬 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들면, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 몇몇 이펙터 기능을 보유하되 모든 이펙터 기능을 보유하지는 않아, 항체의 생체내 반감기가 중요하지만 일부 이펙터 기능(예컨대, 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 유해한 적용분야를 위한 바람직한 후보물질이 되는 항체 변이체를 고려한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체(FcR) 결합 분석을 수행하여, 항체가 FcγR 결합을 결여하되(이로써 ADCC 활성을 결여할 가능성이 높음) FcRn 결합 능력을 보유하는 것을 확인할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌(Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991))의 제464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심 있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비-한정적 예는 미국 특허 제5,500,362호(예를 들면, 문헌(Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) 및 문헌(Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)) 참조); 및 미국 특허 제5,821,337호(문헌(Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)) 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 방법이 이용될 수 있다(예를 들면, 유동세포분석을 위한 ACTI(상표) 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 참조). 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 있는 분자의 ADCC 활성을 생체내, 예를 들면, 동물 모델, 예컨대, 문헌(Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998))에 개시된 동물 모델에서 평가할 수 있다. 또한, C1q 결합 분석을 수행하여 항체가 C1q에 결합할 수 없어 CDC 활성을 결여하는지를 확인할 수 있다. 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 2006/029879호 및 제WO 2005/100402호에 기재된 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석을 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌(Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)); 문헌(Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)); 및 문헌(Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)) 참조). 당업계에서 공지된 방법을 이용하여 FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 측정도 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌(Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)) 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 잔기의 치환을 갖는 항체를 포함한다(미국 특허 제6,737,056호). 이러한 Fc 변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상의 위치에서 치환을 갖는 Fc 변이체(잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 변이체를 포함함)를 포함한다(미국 특허 제7,332,581호).
FcRn과의 개선된 또는 감소된 결합을 갖는 일부 항체 변이체가 기재되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제6,737,056호, 국제 특허출원 공개 제WO 2004/056312호 및 문헌(Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)) 참조).
일부 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들면, Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334(잔기의 EU 넘버링)에 존재하는 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 예를 들면, 미국 특허 제6,194,551호, 국제 특허출원 공개 제WO 99/51642호 및 문헌(Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000))에 기재된 바와 같이 C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 변화시키는(즉, 개선하거나 감소시키는) 변경이 Fc 영역 내에서 만들어진다.
증가된 반감기 및 신생아 Fc 수용체(FcRn)와의 개선된 결합(상기 수용체는 모 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당함(문헌(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)))을 갖는 항체는 미국 특허출원 공개 제2005/0014934A1호(Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체들은 Fc 영역과 FcRn의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 내부에 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 및 434 중 하나 이상의 잔기에서 치환을 갖는, 예를 들면, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 변이체를 포함한다(미국 특허 제7,371,826호).
Fc 영역 변이체에 관한 추가 예에 대해서는 미국 특허출원 제60/439,498호, 제60/456,041호 및 제60/514,549호; 국제 특허출원 공개 제WO 2004/063351호(아미노산 변형으로 인해 증가된 결합 친화성을 갖는 변이체 Fc 영역); 미국 특허출원 제10/672,280호 또는 국제 특허출원 공개 제WO 2004/099249호(아미노산 변형으로 인해 FcγR과의 변경된 결합을 갖는 Fc 변이체); 문헌(Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)); 미국 특허 제5,648,260호 및 제5,624,821호; 및 국제 특허출원 공개 제WO 94/29351호를 참조한다.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
일부 실시양태에서, 시스테인 조작된 항체, 예를 들면, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 "티오MAbs"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 치환된 잔기들은 항체의 접근가능한 부위에서 존재한다. 이들 잔기들이 시스테인으로 치환됨으로써 반응성 티올 기는 항체의 접근가능한 부위에 위치하고, 본원에 추가로 기재된 바와 같이 항체와 다른 모이어티, 예컨대, 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티를 접합시켜 항체 접합체를 생성하는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하기 잔기들 중 임의의 하나 이상의 잔기를 시스테인으로 치환시킬 수 있다: 경쇄의 V205(카바트 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는 예를 들면, 미국 특허 제7,521,541호에 기재된 바와 같이 발생될 수 있다.
e) 항체 유도체
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 당업계에서 공지되어 있고 용이하게 입수될 수 있는 추가 비-단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이로 한정되지 않는다. 수용성 중합체의 비-한정적 예에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들면, 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물이 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물에서의 그의 안정성으로 인해 제조에 있어서 이점을 가질 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고 분지될 수 있거나 비-분지될 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 상이할 수 있고, 하나 초과의 중합체가 부착된 경우, 이들은 동일한 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 구체적인 성질 또는 기능, 항체 유도체가 정의된 조건 하에 요법에서 사용될 것인지 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 고려사항들에 기초하여 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체와, 방사선에의 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비-단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 비-단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다(문헌(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))). 방사선은 임의의 파장의 방사선일 수 있고 일반 세포에 유해하지 않으나 항체-비-단백질성 모이어티에 근접한 세포가 사멸되는 온도까지 상기 비-단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나 이로 한정되지 않는다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체는 예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 이용함으로써 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TNC A2 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 항체(예를 들면, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 상기 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 추가 실시양태에서, 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들면, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터(예를 들면, 폴리시스트론 벡터), 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터, 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터를 포함한다(예를 들면, 이들 벡터로 형질전환되어 있다). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 특히 포유동물 세포, 예를 들면, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포 또는 림프 세포(예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 항-TNC A2 항체의 제조 방법이 제공되고, 이때 상기 방법은 항체의 발현에 적합한 조건 하에 상기 제공된 바와 같은, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 임의적으로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
항-TNC A2 항체의 재조합 제조를 위해, 예를 들면, 전술된 바와 같은 항체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 단리하고 숙주 세포 내에서의 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입한다. 당업자에게 잘 공지된 방법들을 이용하여 적절한 전사/번역 조절 신호와 함께 항-TNC A2 항체의 코딩 서열을 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법들은 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 재조합/유전적 재조합을 포함한다. 예를 들면, 문헌(Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)) 및 문헌(Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989))에 기재된 기법을 참조한다.
한 실시양태에서, 항-TNC A2 항체를 코딩하는 1개 또는 여러 개의 폴리뉴클레오타이드는 항시적(constitutive) 프로모터의 조절 하에 또는 대안적으로 조절된 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 적합한 조절된 발현 시스템은 테트라사이클린 조절된 발현 시스템, 엑디손(ecdyson) 유도성 발현 시스템, lac 스위치 발현 시스템, 글루코코르티코이드 유도성 발현 시스템, 온도 유도성 프로모터 시스템 및 메탈로티오네인 금속 유도성 발현 시스템을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 항체를 코딩하는 여러 상이한 폴리뉴클레오타이드들이 숙주 세포 시스템 내에 포함되는 경우, 이들 중 몇몇은 항시적 프로모터의 조절 하에 발현될 수 있는 반면, 나머지는 조절된 프로모터의 조절 하에 발현된다.
항체 코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들면, 항체는 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우 세균 내에서 생성될 수 있다. 세균 내에서의 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현에 대해서는 예를 들면, 미국 특허 제5,648,237호, 제5,789,199호 및 제5,840,523호를 참조한다. (에스케리키아 콜라이 내에서의 항체 단편의 발현을 기재하는 문헌(Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254)도 참조한다). 발현 후, 항체는 세균 세포 페이스트로부터 가용성 분획으로 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 있어 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생성하는 진균 및 효모 균주를 포함하는 진핵 미생물, 예컨대, 사상 진균 또는 효모가 항체 코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌(Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)), 및 문헌(Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006))을 참조한다. 이러한 발현 시스템은 미국 특허출원 제60/344,169호 및 국제 특허출원 공개 제WO 03/056914호(비-인간 진핵 숙주 세포 내에서 인간 유사 당단백질을 제조하는 방법)에도 교시되어 있다.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터도 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 세포 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 확인되었다. 식물 세포 배양물도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호 및 제6,417,429호(형질전환 식물 내에서 항체를 생성하는 플랜트바디스(PLANTIBODIES: 상표) 기술을 기재함)를 참조한다.
척추동물 세포도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액 중에서 성장하도록 개조된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포주(예를 들면, 문헌(Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977))에 기재된 바와 같은 293 또는 293T 세포); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들면, 문헌(Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980))에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경막암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유선 종양(MMT 060562); 예를 들면, 문헌(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982))에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(DHFR- CHO 세포(문헌(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)))를 포함함); 및 골수종 세포주, 예컨대, Y0, NS0 및 Sp2/0를 포함한다. 항체 제조에 적합한 일부 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는 예를 들면, 문헌(Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003))을 참조한다.
안정한 발현은 보다 재현가능한 결과를 달성하고 대규모 제조에 보다 적합하기 때문에 일시적 발현보다 일반적으로 바람직하지만, 일시적 발현이 특정 상황의 경우 더 우수한지를 결정하는 것은 당업자의 기술 내에 있다.
추가로, 본 발명은 항-TNC A2 항체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 및 글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드들을 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에서 발현시키는 단계를 포함하는, 상기 숙주 세포에 의해 생성된 본 발명의 항-TNC A2 항체의 글리코실화 프로파일을 변형시키는 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 상기 논의된 세포주를 포함하는 임의의 유형의 배양된 세포주를 사용하여 변경된 글리코실화 패턴을 갖는 항-TNC A2 항체의 생성을 위한 세포주를 발생시킬 수 있다. 바람직한 세포주는 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 및 다른 포유동물 세포를 포함한다. 글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII), α-만노시다제 II(ManII), β(1,4)-갈락토실트랜스퍼라제(GalT), β(1,2)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 I(GnTI) 및 β(1,2)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 II(GnTII)를 포함한다. 한 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 조합물(예를 들면, GnTIII 및 ManII)이 숙주 세포 내에서 발현된다. 마찬가지로, 상기 방법은 글리코실트랜스퍼라제 유전자가 파괴되었거나 아니면 불활성화되어 있는 숙주 세포(예를 들면, α1,6 코어 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자의 활성이 넉아웃된 숙주 세포) 내에서 항-TNC A2 항체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 단계도 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항-TNC A2 항체는 상기 항체의 글리코실화 패턴을 변형시키기 위해 GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 발현하는 숙주 세포 내에서 생성될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드는 골지 체류 폴리펩타이드의 골지 국소화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 숙주 세포 내에서의 본 발명의 항-TNC A2 항체의 발현은 증가된 Fc 수용체 결합 친화성 및/또는 증가된 이펙터 기능을 갖는 항-TNC A2 항체를 발생시킨다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 (a) GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오타이드; 및 (b) 본 발명의 항-TNC A2 항체를 코딩하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 구체적인 실시양태에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드는 GnTIII의 촉매 도메인 및 이종 골지 체류 폴리펩타이드의 골지 국소화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드이다. 구체적으로, 상기 골지 국소화 도메인은 만노시다제 II의 골지 국소화 도메인이다. 이러한 융합 폴리펩타이드를 발생시키는 방법, 및 이를 이용하여 증가된 이펙터 기능을 갖는 항체를 제조하는 방법은 국제 특허출원 공개 제WO 2004/065540호, 미국 가특허출원 제60/495,142호 및 미국 특허출원 공개 제2004/0241817호(이들의 전체 내용은 본원에 명백히 참고로 도입됨)에 개시되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 만노시다제 II(ManII) 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 항-TNC A2 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 항시적 프로모터의 조절 하에 또는 대안적으로 조절된 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 이러한 시스템은 당업계에서 잘 공지되어 있고 상기 논의된 시스템들을 포함한다.
항-TNC A2 항체의 코딩 서열 및/또는 글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 코딩 서열을 함유하고 생물학적 활성 유전자 생성물을 발현하는 숙주 세포는 예를 들면, DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화; "마커" 유전자 기능의 존재 또는 부재; 숙주 세포 내에서의 각각의 mRNA 전사체의 발현에 의해 측정된 전사 수준의 평가; 또는 면역분석 또는 그의 생물학적 활성에 의해 측정된 유전자 생성물의 검출에 의해 확인될 수 있다(이들 방법들은 당업계에서 잘 공지되어 있다). GnTIII 또는 ManII 활성을 예를 들면, GnTIII 또는 ManII 각각의 생합성 생성물에 결합하는 렉틴을 사용함으로써 검출할 수 있다. 이러한 렉틴의 일례는 이등분 GlcNAc를 함유하는 올리고사카라이드에 우선적으로 결합하는 E4-PHA 렉틴이다. GnTIII 또는 ManII 활성을 갖는 폴리펩타이드의 생합성 생성물(즉, 특정 올리고사카라이드 구조체)도 상기 폴리펩타이드를 발현하는 세포에 의해 생성된 당단백질로부터 방출된 올리고사카라이드의 질량 분광측정 분석에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 조작된 세포에 의해 생성된 항체에 의해 매개된 증가된 Fc 수용체 결합 또는 증가된 이펙터 기능을 측정하는 기능 분석이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 항-TNC A2 항체의 제조를 허용하는 조건 하에 글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 발현하도록 조작된 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 이때 상기 글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩타이드가 상기 숙주 세포에 의해 생성된 상기 항-TNC A2 항체의 Fc 영역 내의 올리고사카라이드를 변형시키기에 충분한 양으로 발현되는 단계; 및 (b) 상기 항-TNC A2 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 변형된 올리고사카라이드를 갖는 항-TNC A2 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 GnTIII이다. 또 다른 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 2개의 폴리펩타이드가 존재한다. 구체적인 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 2개의 펩타이드는 GnTIII 및 ManII이다. 또 다른 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 GnTIII의 촉매 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 융합 폴리펩타이드는 골지 체류 폴리펩타이드의 골지 국소화 도메인을 추가로 포함한다. 구체적으로, 골지 국소화 도메인은 만노시다제 II 또는 GnTI의 국소화 도메인, 가장 구체적으로 만노시다제 II의 국소화 도메인이다. 대안적으로, 골지 국소화 도메인은 만노시다제 I의 국소화 도메인, GnTII의 국소화 도메인 및 α1,6 코어 푸코실트랜스퍼라제의 국소화 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된다.
구체적인 실시양태에서, 전술된 숙주 세포 또는 방법에 의해 제조된 변형된 항-TNC A2 항체는 IgG 불변 영역 또는 Fc 영역을 포함하는 이의 단편을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 항-TNC A2 항체는 인간화된 또는 인간 항체, 또는 Fc 영역을 포함하는 이의 단편이다.
전술된 숙주 세포 또는 방법에 의해 제조된, 변경된 글리코실화를 갖는 항-TNC A2 항체는 전형적으로 (예를 들면, 글리코실트랜스퍼라제 유전자의 발현에 의한) 상기 숙주 세포의 변형의 결과로서 증가된 Fc 수용체 결합 친화성 및/또는 증가된 이펙터 기능을 나타낸다. 바람직하게는, 증가된 Fc 수용체 결합 친화성은 활성화 Fcγ 수용체, 가장 바람직하게는 FcγRIIIa 수용체와의 증가된 결합이다. 증가된 이펙터 기능은 바람직하게는 하기 기능들 중 하나 이상의 기능의 증가이다: 증가된 항체 의존적 세포성 세포독성, 증가된 항체 의존적 세포성 식균작용(ADCP), 증가된 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 증가된 면역결합체 매개된 항원 섭취, 증가된 Fc 매개된 세포성 세포독성, NK 세포와의 증가된 결합, 대식세포와의 증가된 결합, 다형핵 세포(PMNC)와의 증가된 결합, 단핵구와의 증가된 결합, 표적 결합된 항체의 증가된 가교결합, 증가된 직접적 신호전달 유도 세포사멸, 증가된 수지상 세포 성숙, 및 증가된 T 세포 프라이밍.
C. 분석
본원에서 제공된 항-TNC A2 항체는 당업계에서 공지된 다양한 분석에 의한 그의 물리/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인될 수 있거나, 스크리닝될 수 있거나 특징규명될 수 있다.
1. 결합 분석 및 다른 분석
한 양태에서, 본 발명의 항체는 예를 들면, 공지된 방법, 예컨대, ELISA, 웨스턴 블롯 등에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 시험된다.
또 다른 양태에서, 경쟁 분석을 이용하여 TNC A2와의 결합에 대해 또 다른 특이적 항-TNC A2 항체와 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 상기 다른 특이적 항-TNC A2 항체에 의해 결합되는 에피토프와 동일한 에피토프(예를 들면, 선형 또는 입체구조적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하기 위한 상세한 예시적 방법은 문헌(Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ))에 제공되어 있다.
예시적 경쟁 분석에서, TNC A2에 결합하는 제1 표지된 항체(예를 들면, 실시예에 기재된 2B10 항체) 및 TNC A2와의 결합에 대해 상기 제1 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험될 제2 비-표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 고정된 TNC A2를 항온처리한다. 상기 제2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 상기 제1 표지된 항체를 포함하되 상기 제2 비-표지된 항체를 포함하지 않는 용액 중에서 고정된 TNC A2를 항온처리한다. 상기 제1 항체와 TNC A2의 결합을 허용하는 조건 하에 항온처리한 후, 과량의 비-결합된 항체를 제거하고, 고정된 TNC A2와 연결된 표지의 양을 측정한다. 고정된 TNC A2와 연결된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 상대적으로 시험 샘플에서 실질적으로 감소된 경우, 이것은 상기 제2 항체가 TNC A2와의 결합에 대해 제1 항체와 경쟁한다는 것을 표시한다. 문헌(Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY))을 참조한다.
2. 활성 분석
한 양태에서, 생물학적 활성을 갖는 이의 항-TNC A2 항체를 확인하는 분석이 제공된다. 생물학적 활성은 예를 들면, 표적화된 세포의 용해, 항체 의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC), 보체 의존적 세포독성(CDC) 또는 세포사멸의 유도를 포함할 수 있다. 생체 및/또는 시험관 내에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체도 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 이러한 생물학적 활성에 대해 시험된다. ADCC를 시험하는 예시적 분석은 본원의 앞부분("정의" 부분 참조: "증가된 ADCC를 갖는 항체") 및 실시예 11에 기재되어 있다. (예를 들면, LDH 방출을 측정함으로써) 세포 용해를 검출하거나 (예를 들면, TUNEL 분석을 이용하여) 세포사멸을 검출하는 분석은 당업계에서 잘 공지되어 있다. ADCC 또는 CDC를 측정하는 분석도 국제 특허출원 공개 제WO 2004/065540호(실시예 1 참조)(이의 전체 내용은 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다.
D. 항체 접합체
본 발명은 하나 이상의 세포독성제, 예컨대, 화학치료제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들면, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소 활성 독소, 또는 이들의 단편) 또는 방사성 동위원소에 접합된 본원의 항-TNC A2 항체를 포함하는 접합체도 제공한다.
한 실시양태에서, 항체-약물 접합체(ADC)에서 항체는 하기 약물들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 약물과 접합되어 있다: 메이탄시노이드(미국 특허 제5,208,020호 및 제5,416,064호, 및 유럽 특허 제0 425 235 B1호 참조); 아우리스타틴, 예컨대, 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국 특허 제5,635,483호, 제5,780,588호 및 제7,498,298호 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 이의 유도체(예를 들면, 미국 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호 및 제5,877,296호; 문헌(Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)); 및 문헌(Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)) 참조); 안쓰라사이클린, 예컨대, 다우노마이신 또는 독소루비신(문헌(Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)); 문헌(Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)); 문헌(Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)); 문헌(Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)); 문헌(Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)); 문헌(King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)); 및 미국 특허 제6,630,579호 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예컨대, 독세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트라이코테센; 및 CC1065.
또 다른 실시양태에서, 항체 접합체는 하기 물질들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 효소 활성 독소 또는 이의 단편에 접합된 본원에 기재된 항체를 포함한다: 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, (슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 애브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 파이토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신(curcin), 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트라이코테센.
또 다른 실시양태에서, 항체 접합체는 방사성 원자에 접합되어 방사성접합체를 형성하는 본원에 기재된 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소들이 방사성접합체의 제조에 이용될 수 있다. 예에는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 방사성접합체가 검출에 사용되는 경우, 이 접합체는 신티그래픽 연구용 방사성 원자, 예를 들면, tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명(NMR) 영상화(자기 공명 영상화(mri)로도 공지되어 있음)용 스핀 표지, 예컨대, 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체와 세포독성제의 접합체는 다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예컨대, N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체(예컨대, 다이메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스터(예컨대, 다이석신이미딜 수버레이트), 알데하이드(예컨대, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스 (p-아지도벤조일)헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이이소시아네이트(예컨대, 톨루엔 2,6-다이이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예컨대, 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠)을 사용함으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 문헌(Vitetta et al., Science 238:1098 (1987))에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14로 표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성뉴클레오타이드와 항체의 접합을 위한 예시적 킬레이팅제이다. 국제 특허출원 공보 제WO 94/11026호를 참조한다. 링커(linker)는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "전달가능한 링커"일 수 있다. 예를 들면, 산 불안정성 링커, 펩티다제 민감성 링커, 광불안정성 링커, 다이메틸 링커 또는 다이설파이드 함유 링커(문헌(Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)); 미국 특허 제5,208,020호)가 사용될 수 있다.
본원의 항체 접합체는 상업적으로(예를 들면, 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc.), 미국 일리노이주 록포드 소재로부터) 입수가능한 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 설포-SMPB 및 SVSB(석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 가교결합제 시약에 의해 제조된 이러한 접합체를 명확히 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항-TNC A2 항체 중 임의의 항-TNC A2 항체는 생물학적 샘플 중의 TNC A2의 존재를 검출하는 데에 유용하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대, 뇌, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 전립선, 골격근, 피부, 소장, 위 또는 자궁으로부터의 세포 또는 조직(이들 기관들의 세포 또는 조직 종양도 포함함)을 포함한다.
한 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에서 사용될 항-TNC A2 항체가 제공된다. 추가 양태에서, 생물학적 샘플 중의 TNC A2의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 항-TNC A2 항체와 TNC A2의 결합을 허용하는 조건 하에 임의적으로 대조군 샘플과 함께 생물학적 샘플을 본원에 기재된 항-TNC A2 항체와 접촉시키는 단계, 및 항-TNC A2 항체와 TNC A2 사이에 결합체가 형성되는지를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-TNC A2 항체는 예를 들면, TNC A2가 환자의 선별을 위한 생체마커인 경우 항-TNC A2 항체를 사용한 요법에 적격인 대상체를 선별하는 데에 사용된다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단할 수 있는 예시적 장애는 TNC A2의 발현과 관련된 장애, 예컨대, 암 및 염증성 병태를 포함한다.
한 양태에서, 유효량의 진단제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 질환을 진단하는 방법으로서, 이때 상기 진단제가 본원에 기재된 항-TNC A2 항체, 및 상기 진단제와 TNC A2의 결합체의 검출을 허용하는 표지, 전형적으로 조영제를 포함하는, 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 표지된 항-TNC A2 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티(예컨대, 형광, 발색, 전자-조밀, 화학발광 및 방사성 표지)뿐만 아니라, 예를 들면, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예컨대, 효소 또는 리간드도 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 예시적 표지는 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예컨대, 희토 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 댄실(dansyl), 움벨리페론(umbelliferone), 루세리퍼라제(luceriferases), 예를 들면, 초파리 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제(미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진다이온, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들면, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 과산화수소를 사용하여 안료 전구체, 예컨대, HRP를 산화시키는 효소와 커플링된 헤테로사이클릭 옥시다제, 예컨대, 유리카제(uricase) 및 잔틴 옥시다제, 락토퍼록시다제, 또는 마이크로퍼록시다제, 바이오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
F. 약학 제제
본원에 기재된 바와 같은 항-TNC A2 항체의 약학 제제는 원하는 순도를 갖는 상기 항체를 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 하나 이상의 임의적 약학적으로 허용가능한 담체(문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)))와 혼합함으로써 제조된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성을 나타내고 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 보존제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 다이사카라이드 및 다른 탄수화물(글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함함); 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착물(예를 들면, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본원에서 예시적 약학적으로 허용가능한 담체는 간질 약물 분산제, 예컨대, 가용성 중성 활성 하이알루로니다제(hyaluronidase) 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질, 예컨대, rHuPH20(HYLENEX(등록상표), 박스터 인터네이셔날 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하는 일부 예시적 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허출원 공개 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가 글리코스아미노글리카나제, 예컨대, 콘드로이티나제와 병용된다.
예시적 동결건조된 항체 제제는 미국 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수성 항체 제제는 미국 특허 제6,171,586호 및 국제 특허출원 공개 제WO2006/044908호에 기재된 수성 항체 제제(히스티딘-아세테이트 완충제를 포함하는 제제)를 포함한다.
본원의 제제는 치료될 구체적인 증상에 필요한 하나 초과의 활성 성분들, 바람직하게는 서로에 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 활성 성분들을 함유할 수도 있다. 예를 들면, 치료될 질환이 암인 경우, 하나 초과의 항암제, 예를 들면, 화학치료제, 종양 세포 증식의 억제제 또는 종양 세포 세포사멸의 활성화제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 활성 성분들은 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 함께 존재한다.
활성 성분은 예를 들면, 코아세르베이션 기법 또는 계면 중합에 의해 제조된 미세캡슐, 예를 들면, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민 미세구, 미세에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 거대에멀젼 중의 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기법들은 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))에 개시되어 있다.
지속 방출 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 상기 매트릭스는 성형된 제품, 예를 들면, 필름 또는 미세캡슐의 형태로 존재한다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 멸균되어 있다. 멸균성은 예를 들면, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
본원에 기재된 분자는 액체 용액 또는 현탁액, 정제, 환제, 산제, 좌제, 중합체성 미세캡슐 또는 미세소포, 리포좀, 및 주사가능한 또는 관주가능한 용액을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 투약 제형으로 존재할 수 있다. 바람직한 제형은 투여 방식 및 치료 적용분야에 의해 좌우되지만 전형적으로 주사가능한 또는 관주가능한 용액일 것이다.
G. 치료 방법 및 조성물
본원에서 제공된 항-TNC A2 항체를 포함하는 임의의 항-TNC A2 항체 또는 약학 제제가 치료 방법에서 사용될 수 있다.
본원에서 제공된 항-TNC A2 항체는 TNC A2 발현, 특히 동일한 세포 유형의 정상 조직에 비해 TNC A2의 비정상적인 발현(예를 들면, 과다발현, 또는 세포 내에서의 상이한 패턴으로의 발현)을 특징으로 하는 질환의 치료에 사용될 수 있다. TNC A2는 동일한 세포 유형의 비-종양 조직에 비해 많은 인간 종양에서 비정상적으로 발현(예를 들면, 과다발현)된다. 따라서, 본원에서 제공된 항-TNC A2 항체는 종양 형성의 예방, 종양의 박멸 및 종양 성장 또는 전이의 억제에 특히 유용하다. 본원에서 제공된 항-TNC A2 항체는 TNC A2를 발현하는 임의의 종양을 치료하는 데에 사용될 수 있다. 본원에서 제공된 항-TNC A2 항체에 의해 치료될 수 있는 구체적인 악성종양은 예를 들면, 폐암, 결장암, 위암, 유방암, 두경부암, 피부암, 간암, 신장암, 전립선암, 췌장암, 뇌암 및 골격근암을 포함한다.
본원에서 개시된 항-TNC A2 항체는 종양 성장의 억제 또는 종양 세포의 사멸을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 항-TNC A2 항체는 암세포(종양 세포 또는 종양 간질의 세포)의 막 또는 세포 표면 상에 존재하는 TNC A2에 결합할 수 있고 예를 들면, ADCC 또는 다른 이펙터 매개된 암세포의 사멸을 유발할 수 있다.
대안적으로, 상기 항-TNC A2 항체는 특히, TNC A2와 또 다른 화합물의 결합을 물리적으로 방해함으로써 TNC A2의 기능을 차단하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 항원 결합 분자는 TNC A2 매개된 세포 부착, 전파 또는 이동을 차단하는 데에 사용될 수 있다.
한 양태에서, 약제로서 사용되는 항-TNC A2 항체가 제공된다. 추가 양태에서, TNC A2의 발현을 특징으로 하는 질환의 치료에 사용되는 항-TNC A2 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 치료 방법에서 사용되는 항-TNC A2 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 항-TNC A2 항체를, TNC A2의 발현을 특징으로 하는 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, TNC A2의 발현을 특징으로 하는 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법에서 사용되는 항-TNC A2 항체를 제공한다. 이러한 한 실시양태에서, 상기 방법은 예를 들면, 후술된 바와 같은 유효량의 하나 이상의 추가 치료제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 세포의 용해를 유도하는 데에 사용되는 항-TNC A2 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 항-TNC A2 항체를 개체에게 투여하여 세포의 용해를 유도하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 세포의 용해를 유도하는 방법에서 사용되는 항-TNC A2 항체를 제공한다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "TNC A2의 발현을 특징으로 하는 질환"은 바람직하게는 암, 가장 바람직하게는 폐암, 결장암, 위암, 유방암, 두경부암, 피부암, 간암, 신장암, 전립선암, 췌장암, 뇌암 및 골격근암으로 구성된 군으로부터 선택된 암이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "세포"는 바람직하게는 종양에 존재하는 세포, 예컨대, 종양 세포 또는 종양 간질의 세포, 가장 바람직하게는 종양 세포이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "TNC A2 발현"은 바람직하게는 동일한 세포 유형의 정상 조직에 비해 비정상적인 발현, 예컨대, 과다발현 또는 세포 내에서의 상이한 패턴으로의 발현이다.
추가 양태에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에 있어서 항-TNC A2 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 약제는 TNC A2의 발현을 특징으로 하는 질환의 치료를 위한 것이다. 추가 실시양태에서, 상기 약제는 유효량의 상기 약제를, TNC A2의 발현을 특징으로 하는 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, TNC A2의 발현을 특징으로 하는 질환의 치료 방법에서 사용된다. 이러한 한 실시양태에서, 상기 방법은 예를 들면, 후술된 바와 같은 유효량의 하나 이상의 추가 치료제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 약제는 세포의 용해를 유도하기 위한 것이다. 추가 실시양태에서, 상기 약제는 유효량의 상기 약제를 개체에게 투여하여 세포의 용해를 유도하는 단계를 포함하는, 개체에서 세포의 용해를 유도하는 방법에서 사용된다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "TNC A2의 발현을 특징으로 하는 질환"은 바람직하게는 암, 가장 바람직하게는 폐암, 결장암, 위암, 유방암, 피부암, 간암, 신장암, 전립선암, 췌장암, 뇌암 및 골격근암으로 구성된 군으로부터 선택된 암이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "세포"는 바람직하게는 종양에 존재하는 세포, 예컨대, 종양 세포 또는 종양 간질의 세포, 가장 바람직하게는 종양 세포이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "TNC A2 발현"은 바람직하게는 동일한 세포 유형의 정상 조직에 비해 비정상적인 발현, 예컨대, 과다발현 또는 세포 내에서의 상이한 패턴으로의 발현이다.
추가 양태에서, 본 발명은 TNC A2의 발현을 특징으로 하는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 유효량의 항-TNC A2 항체를, TNC A2의 발현을 특징으로 하는 상기 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 한 실시양태에서, 상기 방법은 후술된 바와 같은 유효량의 하나 이상의 추가 치료제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 세포의 용해를 유도하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 유효량의 항-TNC A2 항체를 상기 개체에게 투여하여 세포의 용해를 유도하는 단계를 포함한다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "TNC A2의 발현을 특징으로 하는 질환"은 바람직하게는 암, 가장 바람직하게는 폐암, 결장암, 위암, 유방암, 피부암, 간암, 신장암, 전립선암, 췌장암, 뇌암 및 골격근암으로 구성된 군으로부터 선택된 암이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "세포"는 바람직하게는 종양에 존재하는 세포, 예컨대, 종양 세포 또는 종양 간질의 세포, 가장 바람직하게는 종양 세포이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "TNC A2 발현"은 바람직하게는 동일한 세포 유형의 정상 조직에 비해 비정상적인 발현, 예컨대, 과다발현 또는 세포 내에서의 상이한 패턴으로의 발현이다.
추가 양태에서, 본 발명은 예를 들면, 상기 치료 방법들 중 임의의 치료 방법에서 사용되는, 본원에서 제공된 항-TNC A2 항체들 중 임의의 항-TNC A2 항체를 포함하는 약학 제제를 제공한다. 한 실시양태에서, 약학 제제는 본원에서 제공된 항-TNC A2 항체들 중 임의의 항-TNC A2 항체 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 제제는 본원에서 제공된 항-TNC A2 항체들 중 임의의 항-TNC A2 항체 및 예를 들면, 후술된 바와 같은 하나 이상의 추가 치료제를 포함한다. 본 발명의 항체는 요법에서 단독으로 또는 다른 약제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 병행투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 항암제이다. 적합한 항암제는 예를 들면, 화학치료제, 종양 세포 증식의 억제제 또는 종양 세포 세포사멸의 활성화제이다.
전술된 이러한 병용 요법은 병용된 투여(이때, 2개 이상의 치료제가 동일한 또는 분리된 제제에 포함되어 있음) 및 분리된 투여를 포함하고, 각각의 경우 본 발명의 항체의 투여는 추가 치료제 및/또는 보조제의 투여 전에, 추가 치료제 및/또는 보조제의 투여와 동시에, 및/또는 추가 치료제 및/또는 보조제의 투여 후에 일어날 수 있다. 본 발명의 항체는 방사선 요법과 함께 사용될 수도 있다.
본 발명의 항체(및 임의의 추가 치료제)는 비경구 투여, 폐내 투여 및 비내 투여, 및 국소 치료가 요구되는 경우 병소내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 투여는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 정맥내 투여가 전형적으로 바람직하다. 그러나, 복강내 경로는 예를 들면, 대장 종양의 치료에 특히 유용할 것으로 기대된다. 투약은 부분적으로 투여가 단기 투여인지 아니면 장기 투여인지에 따라 임의의 적합한 경로, 예를 들면, 주사, 예컨대, 정맥내 또는 피하 주사에 의해 달성될 수 있다. 단회 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다회 투여, 볼루스 투여 및 펄스 관주를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 투약 스케쥴이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체는 우수한 의학적 관행에 일치하는 방식으로 제제화되고 조제되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려될 인자는 치료될 구체적인 장애, 치료될 구체적인 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴 및 의료인에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체는 해당 장애의 예방 또는 치료를 위해 현재 사용되는 하나 이상의 약제와 함께 제제화될 필요는 없지만 임의적으로 이러한 약제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 약제의 유효량은 제제에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형 및 상기 논의된 다른 인자에 의해 좌우된다. 이들은 일반적으로 동일한 투여량으로 본원에 기재된 투여 경로를 통해 사용되거나, 본원에 기재된 투여량의 약 1% 내지 99% 또는 임의의 투여량으로 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 확인된 임의의 경로를 통해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가 치료제와 함께 사용될 때) 본 발명의 항체의 적절한 투여량은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 목적으로 투여되는지 아니면 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의해 좌우될 것이다. 항체는 적합하게는 한 시점에서 환자에게 투여되거나 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들면, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체가 예를 들면, 1회 이상의 분리된 투여 또는 연속 관주에 의해 환자에게 투여될 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 전형적인 1일 투여량은 전술된 인자들에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상일 것이다. 여러 날 이상의 기간에 걸친 반복된 투여를 위해, 상태에 따라 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. 항체의 한 예시적 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합)의 1회분 이상의 투여량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 투여량은 (예를 들면, 환자가 약 2회분 내지 약 20회분, 또는 예를 들면, 약 6회분 투여량의 항체를 제공받도록) 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다. 초기 보다 높은 적재 투여량 후 1회분 이상의 보다 낮은 투여량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투약 섭생법이 유용할 수 있다. 이 요법의 진행은 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.
항-TNC A2 항체 대신에 또는 항-TNC A2 항체 이외에 본 발명의 항체 접합체를 사용하여 상기 제제들 또는 치료 방법들 중 임의의 제제 또는 치료 방법을 수행할 수 있다는 것이 이해된다.
H. 제품
본 발명의 또 다른 양태에서, 전술된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기, 및 용기 상의 또는 용기에 부착된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 그 자체로 존재하는 조성물, 또는 증상의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 병용되는 조성물을 보유하고 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백일 수 있거나 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 하나 이상의 활성 약제는 본 발명의 항체이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 증상의 치료에 사용된다는 것을 표시한다. 나아가, 제품은 (a) 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 내부에 함유하는 제1 용기; 및 (b) 추가 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 내부에 함유하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 실시양태에서 제품은 조성물이 특정 증상의 치료에 사용될 수 있다는 것을 표시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제품은 약학적으로 허용가능한 완충제, 예컨대, 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 볼 때 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 제품들 중 임의의 제품이 항-TNC A2 항체 대신에 또는 항-TNC A2 항체 이외에 본 발명의 항체 접합체를 포함할 수 있다는 것이 이해된다.
III. 실시예
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적인 설명이 주어진 한, 다양한 다른 실시양태가 실시될 수 있다는 것이 이해된다.
실시예 1
재조합 DNA 기법
표준 방법을 이용하여 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)에 기재된 바와 같이 DNA를 조작하였다. 분자 생물학 시약을 제조자의 설명서에 따라 사용하였다. 이중 가닥 서열분석으로 DNA 서열을 확인하였다. 몇몇 경우, 진아트 아게(Geneart AG, 독일 레젠스버그 소재)가 자동화된 유전자 합성으로 합성 올리고뉴클레오타이드 및 PCR 생성물로부터 원하는 유전자 분절을 제조하였다. 양 말단에 단일 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 절단 부위를 갖는 유전자 분절을 pGA18(ampR) 플라스미드 내로 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 세균으로부터 정제하고 농도를 UV 분광법으로 측정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석으로 확인하였다. 각각의 발현 벡터 내로의 서브클로닝을 허용하기에 적합한 제한 부위를 갖는 유전자 분절을 디자인하였다.
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오타이드 서열에 관한 일반적인 정보는 문헌(Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242)에 제시되어 있다. 발현을 위해, 모든 구축물들은 진핵세포 내에서의 분비를 위해 단백질을 표적화하는 리더 펩타이드를 코딩하는 5'-말단 DNA 서열을 함유하였다. 예시적 리더 펩타이드들 및 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열들은 서열번호 107 내지 서열번호 115에 제시되어 있다.
(당조작된) 항체의 제조
각각의 수용자 포유동물 발현 벡터 내로 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄와 인 프레임(in frame)으로 가변 영역을 서브클로닝하여 전체 항체 중쇄 및 경쇄 DNA 서열을 수득하였다. 항체 발현을 MPSV 프로모터로 유도하였고, 벡터는 CDS의 3' 말단에서 합성 폴리A 신호 서열을 보유한다. 추가로, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유한다.
인산칼슘 형질감염을 이용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유동물 항체 발현 벡터로 동시-형질감염시킴으로써 항체를 제조하였다. 기하급수적으로 성장하는 HEK293-EBNA 세포를 인산칼슘 방법으로 형질감염시켰다. 대안적으로, 현탁액 중에서 성장하는 HEK293 세포를 폴리에틸렌이민으로 형질감염시켰다. 비-변형된 비-당조작된 항체의 제조를 위해, 세포를 1:1 비의 항체 중쇄 발현 벡터 및 경쇄 발현 벡터만으로 형질감염시켰다.
당조작된 항체의 제조를 위해, 2개의 추가 플라스미드, 즉 융합 GnTIII 폴리펩타이드 발현을 위한 추가 플라스미드(GnT-III 발현 벡터) 및 만노시다제 II 발현을 위한 추가 플라스미드(골지 만노시다제 II 발현 벡터)를 각각 4:4:1:1의 비로 사용하여 세포를 동시-형질감염시켰다. 10% FCS로 보충된 DMEM 배양 배지를 사용하여 세포를 T 플라스크 내에서 부착된 단일층 배양물로서 성장시키고, 세포가 50% 내지 80% 전면성장(confluent) 상태일 때 상기 세포를 형질감염시켰다. T150 플라스크의 형질감염을 위해, 1500만개의 세포들을 형질감염 24시간 전에 FCS(최종 10% 부피/부피)로 보충된 25 ㎖의 DMEM 배양 배지에 시딩하고, 상기 세포들을 5% CO2 대기를 갖는 37℃의 항온처리기 내에 밤새 넣어 두었다. 각각의 T150 플라스크가 형질감염되도록, 경쇄 발현 벡터와 중쇄 발현 벡터 사이에 동일하게 나누어진 총 94 ㎍의 플라스미드 벡터 DNA, 469 ㎕의 최종 부피까지의 물 및 469 ㎕의 1 M CaCl2 용액을 혼합하여 DNA, CaCl2 및 물로 구성된 용액을 제조하였다. 이 용액에 938 ㎕의 50 mM HEPES, 280 mM NaCl 및 1.5 mM Na2HPO4 용액(pH 7.05)을 첨가하고, 즉시 10초 동안 혼합하고 실온에서 20초 동안 방치하였다. 생성된 현탁액을 2% FCS로 보충된 10 ㎖의 DMEM으로 희석하고 기존 배지 대신에 T150에 첨가하였다. 이어서, 추가 13 ㎖의 형질감염 배지를 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 약 17시간 내지 20시간 동안 항온처리한 후, 배지를 25 ㎖의 DMEM(10% FCS)으로 교체하였다. 배지를 교체한 지 약 7일 후 210 x g에서 15분 동안 원심분리하여 컨디셔닝된 배양 배지를 수거하고, 용액을 멸균 여과하고(0.22 ㎛ 필터), 나트륨 아지드를 0.01 중량/부피%의 최종 농도로 첨가하고 4℃에서 유지하였다.
단백질 A(HiTrap ProtA, 지이 헬쓰케어) 친화 크로마토그래피를 이용한 친화 크로마토그래피로 세포 배양 상청액으로부터 분비된 야생형 또는 당조작된 푸코스 결여 항체를 정제하였다. 요약하건대, 컬럼을 20 mM 인산나트륨 및 20 mM 시트르산나트륨(pH 7.5)으로 평형화시키고, 세포 상청액을 적재한 후, 20 mM 인산나트륨 및 20 mM 시트르산나트륨(pH 7.5)을 사용한 제1 세척 및 13.3 mM 인산나트륨, 20 mM 시트르산나트륨 및 500 mM 염화나트륨(pH 5.45)을 사용한 제2 세척을 수행하였다. 항체를 20 mM 시트르산나트륨, 100 mM 염화나트륨 및 100 mM 글리신(pH 3)으로 용출하였다. 하이로드 수퍼덱스(HiLoad Superdex) 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에서의 후속 크기 배제 크로마토그래피 단계에서, 완충제를 25 mM 인산칼륨, 125 mM 염화나트륨 및 100 mM 글리신 용액(pH 6.7), 또는 대안적으로 140 mM 염화나트륨 및 20 mM 히스티딘(pH 6.0)으로 교체하고, 순수한 단량체성 IgG1 항체를 수집하였다. 필요한 경우, 추가 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 상기 2개의 표준 정제 단계 사이에 포함시킨다. 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 측정한다. 환원제(5 mM 1,4-다이티오트레이톨)의 존재 및 부재 하에서의 SDS-PAGE 및 코마시에(인비트로겐(Invitrogen)으로부터의 심플블루(SimpleBlue: 상표) 세이프스테인(SafeStain))를 사용한 염색으로 항체의 순도 및 분자량을 분석한다. NuPAGE(등록상표) 프리-캐스트(Pre-Cast) 겔 시스템(인비트로겐, 미국 소재)을 제조자의 설명서에 따라 사용한다(4% 내지 20% 트라이스-글리신 겔 또는 3% 내지 12% 비스-트라이스). 25℃에서 2 mM MOPS, 150 mM NaCl 및 0.02% NaN3 런닝 완충제(pH 7.3) 중에서 수퍼덱스 200 10/300GL 분석 크기-배제 컬럼(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재)을 이용하여 항체 샘플의 응집체 함량을 분석한다. 환원된 항체 경쇄 및 중쇄의 아미노산 주쇄의 무결성을, 펩타이드-N 글리코시다제 F(로슈 몰레큘라 바이오케미칼스(Roche Molecular Biochemicals))를 사용한 효소 처리에 의한 N-글리칸의 제거 후 나노전기분무 Q-TOF 질량 분광측정법으로 검증한다.
야생형 및 당조작된 2B10 인간 IgG 항체의 정제 및 분석의 결과는 도 6 및 7에 제시되어 있다.
항체의 Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드를 후술된 바와 같이 MALDI TOF-MS로 분석하였다. PNGaseF 분해를 이용하여 항체로부터 올리고사카라이드를 효소적으로 방출시킨다. 방출된 올리고사카라이드를 함유하는 생성된 분해 용액을, MALDI TOF-MS 분석을 위해 직접적으로 제조하거나 MALDI TOF-MS 분석용 샘플 제조 전에 엔도 H 글리코시다제로 더 분해하였다.
( 당조작된 ) 항체의 당구조의 분석
푸코스 함유 올리고사카라이드 구조체와 푸코스 무함유(푸코스 결여) 올리고사카라이드 구조체의 상대적 비의 측정을 위해, 정제된 항체 물질의 방출된 글리칸을 MALDI TOF 질량 분광측정법으로 분석하였다. 단백질 주쇄로부터 올리고사카라이드를 방출시키기 위해 항체 샘플(약 50 ㎍)을 37℃에서 2 mM 트라이스(pH 7.0) 중의 5 mU N-글리코시다제 F(QAbio; PNGaseF: E-PNG01)와 함께 밤새 항온처리하였다. 글리칸의 탈아민화를 위해, 아세트산을 150 mM의 최종 농도로 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. MALDI TOF 질량 분광측정법에 의한 분석을 위해, 2 ㎕의 샘플을 MALDI 표적 상에서 2 ㎕의 DHB 매트릭스 용액(50% 에탄올/5 mM NaCl에 4 mg/㎖의 농도로 용해된 2,5-다이하이드록시벤조산[브루커 달토닉스(Bruker Daltonics) #201346])과 혼합하고 MALDI TOF 질량 분광측정기 오토플렉스(Autoflex) II 기계[브루커 달토닉스]로 분석하였다. 통상적으로, 50 내지 300 쇼트(shot)가 기록되고 단일 실험으로 합산되었다. 수득된 스펙트럼을 플렉스 분석 소프트웨어(브루커 달토닉스)로 평가하고, 검출된 피크 각각에 대해 질량을 측정하였다. 이어서, 각각의 구조체(예를 들면, 푸코스를 갖거나 갖지 않은 결합체, 하이브리드 및 올리고- 또는 고-만노스 각각)에 대해 계산된 질량을 이론적으로 예측된 질량과 비교함으로써 피크를 푸코스 함유 또는 푸코스 결여(푸코스 무함유) 탄수화물로 배정하였다.
하이브리드 구조체의 비율을 측정하기 위해, 항체 샘플을 N-글리코시다제 F 및 엔도-글리코시다제 H[QAbio; 엔도 H: E-EH02]로 동시에 분해하였다. N-글리코시다제 F는 단백질 주쇄로부터 모든 N-연결된 글리칸 구조체(결합체, 하이브리드 및 올리고- 및 고-만노스 구조체)를 방출시키고, 엔도-글리코시다제 H는 글리칸의 환원 말단에서 2개의 N-아세틸글루코스아민(GlcNAc) 잔기들 사이에서 하이브리드 유형의 글리칸을 추가로 절단한다. 이 분해물을 후속 처리하고 N-글리코시다제 F에 의해 분해된 샘플에 대해 전술된 방식과 동일한 방식으로 MALDI TOF 질량 분광측정법으로 분석하였다. N-글리코시다제 F 분해물 및 병용된 N-글리코시다제 F/엔도 H 분해물로부터의 패턴을 비교함으로써 특정 탄수화물 구조체의 신호의 감소도를 이용하여 하이브리드 구조체의 상대적 함량을 평가하였다. 각각의 탄수화물 구조체의 상대적 양을 개별 구조체의 피크 높이의 비 및 검출된 모든 올리고사카라이드의 피크 높이의 합으로부터 계산하였다. 푸코스의 양은 N-글리코시다제 F로 처리된 샘플에서 확인된 모든 탄수화물 구조체(예를 들면, 결합체, 하이브리드 및 올리고- 또는 고-만노스 구조체 각각)와 관련된 푸코스 함유 구조체의 백분율이다. 비-푸코실화의 양은 N-글리코시다제 F로 처리된 샘플에서 확인된 모든 탄수화물 구조체(예를 들면, 결합체, 하이브리드 및 올리고- 및 고-만노스 구조체 각각)와 관련된 푸코스 결여 구조체의 백분율이다.
2B10 인간 IgG 항체에 대한 MALDI-TOF MS에 의해 측정된 비-푸코실화도는 야생형 버전의 경우 8.1%이었고 당조작된 버전의 경우 83%이었다.
실시예 2
일반적인 Fab 라이브러리의 구축
하기 V 도메인 페어링을 이용하여 인간 생식세포주 유전자에 기초하여 Fab 형식의 일반적인 항체 라이브러리를 구축하였다: DP47-3 라이브러리를 위한 VH3_23 중쇄와 함께 Vk3_20 카파 경쇄, 및 DP88-3 라이브러리를 위한 VH1_69 중쇄와 함께 Vk1_17 카파 경쇄. 하기 서열번호 1 및 서열번호 2를 참조한다.
상기 두 라이브러리는 경쇄(L3)의 CDR3 및 중쇄(H3)의 CDR3 면에서 무작위화되었고 중첩 연장에 의한 스플라이싱(SOE) PCR에 의해 라이브러리 당 3개의 단편으로부터 조립되었다. 단편 1은 무작위화된 L3을 포함하는 항체 유전자의 5' 말단을 포함하고, 단편 2는 L3부터 H3까지 걸쳐 있는 중심 불변 단편인 반면, 단편 3은 무작위화된 H3 및 항체 유전자의 3' 부분을 포함한다.
하기 프라이머 조합물을 사용하여 DP47-3 라이브러리를 위한 라이브러리 단편을 발생시켰다: 단편 1(LMB3 - LibL1b_new), 단편 2(MS63 - MS64), 단편 3(Lib2H - fdseqlong). 표 3을 참조한다. 하기 프라이머 조합물을 사용하여 DP88-3 라이브러리를 위한 라이브러리 단편을 발생시켰다: 단편 1(LMB3 - RJH_LIB3), 단편 2(RJH31 - RJH32) 및 단편 3(LIB88_2 - fdseqlong). 표 4를 참조한다.
[표 3]
Figure 112013021306347-pct00003
[표 4]
Figure 112013021306347-pct00004
라이브러리 단편들의 제조를 위한 PCR 프로토콜은 하기 절차를 포함하였다: 94℃에서 5분 동안 초기 변성; 94℃에서 1분, 58℃에서 1분 및 72℃에서 1분으로 구성된 25 주기; 및 72℃에서 10분 동안 말단 연장. 조립 PCR을 위해, 등몰 비의 상기 3개의 단편들을 주형으로서 사용하였다. 조립 PCR 프로토콜은 하기 절차를 포함하였다: 94℃에서 3분 동안 초기 변성; 및 94℃에서 30초, 58℃에서 1분 및 72℃에서 2분으로 구성된 5 주기. 이 단계에서, 단편 1 내지 3 외부의 서열에 상보적인 프라이머들을 첨가하였고, 추가 20 주기를 수행한 후, 72℃에서 10분 동안 말단 연장을 수행하였다. 충분한 양의 전장 무작위화된 Fab 구축물의 조립 후, 유사하게 처리된 수용체 파지미드 벡터와 함께 DP47-3 라이브러리용 Fab 구축물을 NcoI/NotI으로 분해하였고 DP88-3 라이브러리용 Fab 구축물을 NcoI/NheI으로 분해하였다. DP47-3 라이브러리를 위해, 22.8 ㎍의 Fab 라이브러리를 16.2 ㎍의 파지미드 벡터와 라이게이션시켰다. DP88-3 라이브러리를 위해, 30.6 ㎍의 Fab 라이브러리를 30.6 ㎍의 파지미드 벡터와 라이게이션시켰다.
정제된 라이게이션물을 사용하여 DP47-3 라이브러리를 위해 68회 형질전환 및 DP88-3 라이브러리를 위해 64회 형질전환을 수행함으로써 DP47-3을 위해 4.2 x 1010의 최종 라이브러리 크기 및 DP88-3을 위해 3.3 x 109의 최종 라이브러리 크기를 수득하였다. Fab 라이브러리를 표시하는 파지미드 입자를 레스큐(rescue)하고 선별에 사용하기 위해 PEG/NaCl 정제로 정제하였다.
실시예 3
항-TNC A2 클론 2B10의 선별(일차 선별)
avi-태그 및 6xhis-태그의 5'에 서브클로닝된 에스케리키아 콜라이-발현된 인간 TNC A2에 대한 선별을 수행하였다. 서열번호 97을 참조한다.
항원은 발현 시 생체 내에서 바이오티닐화되었다. 하기 프로토콜에 따라 용액 중에서 선별을 수행하였다: (i) 총 1 ㎖의 부피로 라이브러리 DP88-3의 약 1012개 파지미드 입자와 100 nM의 바이오티닐화된 인간 TNC A2를 0.5시간 동안 결합시키는 단계; (ii) 5.4 x 107개의 스트렙타비딘-코팅된 자기 입자를 첨가하여 바이오티닐화된 인간 TNC A2 및 부착된 파지를 10분 동안 포획하는 단계; (iii) 1 ㎖의 PBS/트윈(Tween)-20을 5회 사용하고 1 ㎖의 PBS를 5회 사용하여 비드를 세척하는 단계; (iv) 1 ㎖의 100 mM TEA(트라이에틸아민)를 첨가하여 10분 동안 파지 입자를 용출하고 500 ㎕의 1 M 트라이스/HCl(pH 7.4)을 첨가하여 중화시키는 단계; 및 (v) 대수기(log-phase) 에스케리키아 콜라이 TG1 세포를 재감염시키고, 헬퍼파지 VCSM13으로 감염시킨 후, 후속 선별 라운드에서 사용될 파지미드 입자의 PEG/NaCl 침전을 수행하는 단계.
100 nM의 불변 항원 농도를 이용하여 3 라운드에 걸쳐 선별을 수행하였다. 라운드 2에서, 항원:파지 결합체의 포획을 스트렙타비딘 비드 대신에 뉴트라비딘 플레이트 상에서 수행하였다. 다음과 같이 ELISA로 특이적 결합제를 확인하였다: 100 ㎕의 100 nM 바이오티닐화된 인간 TNC A2를 뉴트라비딘 플레이트의 각각의 웰 내에 코팅하였다.
Fab 함유 세균 상청액을 첨가하고, 항-FLAG/HRP 이차 항체를 사용하여 결합 Fab를 그의 FLAG-태그를 통해 검출하였다. 일단 확인되면, 클론 2B10을 0.5 ℓ 배양 부피로 세균 내에서 발현시키고, 친화 정제하고 비아코어(BIACORE) T100을 이용하는 SPR 분석으로 더 특징규명하였다. 서열번호 56 및 60을 참조한다.
실시예 4
클론 2B10에 기초한 항-TNC A2 친화 성숙 라이브러리의 구축
일차 TNC A2 선별로부터 미리 선택된 항체에 기초하여 친화 성숙 라이브러리를 구축하였다. 보다 정확하게는, 상기 라이브러리는 모 클론 2B10에 기초한 것이고 하기 2개의 하위라이브러리로 구성되었다: 1) 경쇄(L1/L2)의 CDR1 및 CDR2에서 무작위화된 VL 하위라이브러리, 및 2) 중쇄(H1/H2)의 CDR1 및 CDR2에서 무작위화된 VH 하위라이브러리. 이들 하위라이브러리들을 형질전환 시 풀링하였다. 이들 하위라이브러리들 각각을 증폭 및 조립의 4개 후속 단계로 구축하였다. L1/L2 라이브러리의 경우: 1) 단편 1(LMB3 - AM_Vk1A30_L1_ba) 및 단편 2(RJH50(Vk1A30_L1/L2_fo) - RJH51(Vk1A30_BsiWI_ba))를 증폭하고, 2) 외부 프라이머 LMB3 및 RJH51(Vk1A30_BsiWI_ba)을 사용하여 단편 1과 2를 조립하여, 3) 단편 3(LMB3 - AM_Vk1A30_L2_ba) 및 단편 4(RJH52(Vk1A30_L2/L3) - RJH51(Vk1A30_BsiWI_ba))의 증폭을 위한 주형을 생성하고, 4) 상기 외부 프라이머와 동일한 외부 프라이머를 사용하여 단편 3과 4를 최종 조립한다. H1/H2 라이브러리의 경우: 1) 단편 1(RJH53 - AM_DP88_H1_ba_opt) 및 단편 2(RJH54(DP88_H1/H2_fo) - MS52)를 증폭하고, 2) 외부 프라이머 RJH53 및 MS52를 사용하여 단편 1과 2를 조립하여, 3) 단편 3(RJH53 - AM_DP88_H2_ba) 및 단편 4(RJH55(DP88_H2H3_fo) - MS52)의 증폭을 위한 주형을 생성하고, 4) 상기 외부 프라이머와 동일한 외부 프라이머를 사용하여 단편 3과 4를 최종 조립한다. VL 하위라이브러리를 위해 최종 조립 생성물을 NcoI/BsiWI로 분해하였고 VH 하위라이브러리를 위해 최종 조립 생성물을 MunI 및 NheI로 분해하였고 유사하게 분해된 수용체 벡터 내로 클로닝하였다. 라이브러리 크기는 1.16 x 1010개의 독립 클론을 발생시켰다.
[표 5]
Figure 112013021306347-pct00005
[표 6]
Figure 112013021306347-pct00006
실시예 5
친화 성숙된 항-TNC A2 클론의 선별
avi-태그 및 6xhis-태그의 상류에 클로닝된 에스케리키아 콜라이-발현된 인간 TNC A2에 대한 선별을 수행하였다(서열번호 97 참조). 항원은 발현 시 생체 내에서 바이오티닐화되었다. 100 nM부터 2 nM까지 감소하는 농도의 인간 TNC A2를 사용하여 일차 TNC A2 선별에 대해 기재된 바와 같이 용액 중에서 선별을 수행하였다. 친화 성숙된 클론을 ELISA로 확인한 후, 프로테온(ProteOn) XPR36 바이오센서(바이오라드)를 이용하여 이차 스크리닝을 수행하고, 친화 정제된 Fab 제제를 동일한 기계에서 분석하여 반응 속도 상수 및 친화성을 측정하였다. NLC 센서 칩(바이오라드) 상에 고정된 항원과 함께 프로테온 XPR36 기계(바이오라드)를 25℃에서 이용하여 표면 플라스몬 공명으로 KD를 측정하였다. 요약하건대, 재조합 항원을 PBS/0.005% 트윈-20(pH 7.4)으로 10 ㎍/㎖까지 희석하고 100초 내지 300초 동안 30 ㎍/분의 속도로 주입하여 약 200 내지 800 반응 유닛(RU)의 커플링된 항원을 달성하였다. 1-샷(shot) 동역학적 측정을 위해, 정제된 Fab의 2배 연속 희석물(약 0.01 nM 내지 25 nM의 농도 범위)을 100 ㎕/분의 유속으로 주입하였다. 결합 시간은 210초이었고, 해리 시간은 600초이었다. 50 mM NaOH를 100 ㎕/분의 유속으로 18초 동안 주입하여 센서 칩을 재생시켰다. 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순 1-대-1 랭뮤어 결합 모델(프로테온 매니저 소프트웨어 버전 2.1)을 이용하여 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)를 계산하였다. 평형 해리 상수(KD)를 비 koff/kon로서 계산하였다.
하기 친화 성숙된 클론들이 확인되었다: 2B10_O1F7(서열번호 85 및 87 참조), 2B10_6H10(서열번호 89 및 서열번호 91 참조), 2B10_C3A6(서열번호 69 및 71 참조), 2B10_D1A2(서열번호 73 및 75 참조) 및 2B10_O7D8(서열번호 81 및 83 참조)(이들 모두 VL 하위라이브러리로부터 유래됨), 및 2B10_C3B6(서열번호 61 및 63 참조) 및 2B10_6A12(서열번호 65 및 67 참조)(이들 2개의 클론은 VH 하위라이브러리로부터 유래됨). 나아가, 클론 2B10_D1A2에 대해, V32D 변이체를 발생시켰다(서열번호 77 및 79 참조)(카바트에 따른 넘버링).
도 1은 고정된 TNC A2에 결합하는 선택된 친화 성숙된 Fab의 표면 플라스몬 공명 센서그램을 보여주고, 표 7은 유도된 각각의 친화성을 제공한다. 선택된 Fab는 pM 범위 내의 높은 친화성을 갖는다.
[표 7]
Figure 112013021306347-pct00007
실시예 6
TNC A2에 결합하는 2B10 Fab의 IgG 전환
모 2B10 Fab 및 친화 성숙된 2B10 Fab 유도체를 인간 IgG1 형식, 마우스 IgG2a 형식 및 중쇄의 C-말단에 융합된 Avi 태그를 갖는 인간 IgG1 형식으로 전환시켰다. 친화 성숙된 2B10 Fab를 마우스 IgG로 전환시켜 면역조직화학적 분석을 가능하게 하였다(실시예 8 참조).
상이한 수용자 포유동물 발현 벡터들 내로 미리 삽입된 각각의 불변 중쇄 및 불변 경쇄 영역들과 인 프레임으로 가변 영역을 서브클로닝하여 전체 항체 중쇄 및 경쇄 DNA 서열들을 수득하거나, 수용자 벡터 삽입 부위에 대한 상동성을 나타내는 짧은 서열 스트레치를 융합시켜 전체 항체 중쇄 및 경쇄 DNA 서열들을 재조합하였다. 상기 재조합을 인비트로겐으로부터의 "인-퓨젼 클로닝 시스템(In-Fusion Cloning System)"에 따라 수행하였다.
모든 벡터들에서, 항체 발현은 MPSV 프로모터에 의해 유도되고, 모든 벡터들은 CDS의 3' 말단에서 합성 폴리A 신호를 보유한다. 또한, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유한다.
실시예 7
TNC A2에 대한 2B10 Fab 및 IgG의 친화성의 측정
인간, 뮤린 및 사이노몰거스 TNC A2 도메인에 대한 TNC A2 2B10 Fab 단편의 친화성 및 인간 IgG1로 전환된 TNC A2 2B10 항체의 친화성을, 25℃에서 비아코어(등록상표) T100 기계(지이 헬쓰케어)를 이용하여 표면 플라스몬 공명으로 후속적으로 측정하고 확인하였다. 이를 위해, 바이오티닐화된 항원(에스케리키아 콜라이에서 발현됨, 그러나 글리코실화되지 않은 항원)을 스트렙타비딘 칩 상에 고정시키고, 구축물을 분석물로서 사용하였다. 고정을 위해, 상기 항원을 HBS-EP+(지이 헬쓰케어, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4)로 0.1 ㎍/㎖까지 희석한 후 10 ㎕/분의 유속으로 주입하여 약 80 반응 유닛(RU)의 커플링된 단백질을 달성하였다. 인간, 마우스 및 사이노몰거스 원숭이로부터의 TNC A2 도메인을 도메인 A1 및 A3과 함께 발현시켰다. 인간 TNC의 제5 피브로넥틴 III형 도메인(Fn5), 인간, 뮤린 또는 사이노몰거스 TNC의 A1 및 A2 도메인, 및 인간 TNC의 A3 도메인(TNC Fn5-A1-인간/ 뮤린 / 사이노 A2-A3)을 포함하는 항원 구축물이 서열번호 99 내지 서열번호 104에 나타나 있다.
동역학적 측정을 위해, HBS-EP+ 중의 Fab 단편(1.56 nM 내지 100 nM의 범위) 또는 IgG(0.39 nM 내지 25 nM의 범위)의 2배 연속 희석물을 25℃에서 50 ㎕/분의 유속으로 주입하였다. 결합 및 해리 시간은 180초이었고, 10 mM 글리신(pH 1.5)을 사용한 재생을 주기 사이에 60초 동안 수행하였다. 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순 1-대-1 랭뮤어 결합 모델(비아코어(등록상표) T100 평가 소프트웨어 버전 1.1.1)을 이용하여 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)를 계산하였다. 평형 해리 상수(KD)를 비 koff/kon로서 계산하였다. 예를 들면, 문헌(Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999))을 참조한다.
HEK에서 제조된 TNC 도메인 1 내지 8은 음성 대조군으로서 작용하였다(서열번호 105 및 서열번호 106 참조). 결합의 KD 값은 표 8에 제시되어 있다. 도 2a 및 2b는 상응하는 SPR-기초 동역학적 분석을 보여준다.
[표 8]
Figure 112013021306347-pct00008
실시예 8
항-TNC A2 항체와 인간 종양 조직 대 정상 조직 절편의 결합
인간 테나신의 A2 도메인(TNC A2)에 대한 선택된 2B10 Fab의 특이성을 조사하고 종양 조직 대 정상 조직에 선택적으로 결합하는 그의 능력을 평가하기 위해, 면역조직화학적 분석을 수행하였다. 요약하건대, Fab 단편 내의 2B10 가변 영역을 FLAG 단편에 융합시켰다(SHD2B10-FLAG). 면역화학적 염색을 위해 건강한 인간 자궁 조직 샘플 및 암성 인간 자궁 조직 샘플을 준비하였다. 그 다음, 상기 샘플들을 SHD2B10-FLAG Fab 단편과 함께 항온처리하였다. 이어서, 상기 샘플들을 세척하고 FLAG 에피토프에 대해 특이적인 형광 항체와 함께 항온처리하였다. 암성 조직 샘플은 건강한 조직 샘플에 비해 TNC A2의 보다 높은 발현 수준을 나타내었다(도 3a). 건강한 개체 및 암 환자로부터의 다양한 인간 조직 샘플들을 전술된 바와 같이 SHD2B10-FLAG Fab 단편과 함께 항온처리하였다. 도 3b는 면역형광 표면적의 % 면에서 다양한 인간 조직 샘플 중의 TNC A2의 정량된 발현 수준을 제공한다. 또 다른 실험 세트에서, 2B10 가변 영역을 마우스 IgG 형식으로 사용하였다. 면역조직화학적 염색을 위해 상이한 기관들로부터의 건강한 인간 조직 샘플 및 암성 인간 조직 샘플을 준비하였다. 그 다음, 상기 샘플들을 SHD2B10-마우스 IgG와 함께 항온처리하였다. 이어서, 상기 샘플들을 세척하고 퍼록시다제 현상 시스템과 함께 항온처리하였다. 도 4a 내지 4n은 암성 조직 샘플이 건강한 조직 샘플에 비해 TNC A2의 보다 높은 발현 수준을 나타내었다는 것을 보여준다.
실시예 9
항- TNC A2 항체와 U87MG 아교모세포종 세포 상의 테나신 -C의 결합
2B10 Fab를 인간 IgG1 항체로 전환하고 FACS를 이용하여 U87MG 아교모세포종 종양 세포 상에서 발현된 TNC A2와의 결합에 대해 시험하였다. 요약하건대, 웰 당 200,000개의 세포를 환저 96-웰 플레이트 내에서 표시된 농도의 항-TNC A2 항체 2B10과 함께 항온처리하고 4℃에서 30분 동안 항온처리하고 PBS/0.1% BSA로 1회 세척하였다. 4℃에서 30분 동안 항온처리한 후, FACS 캔토(Canto)II(소프트웨어 FACS 디바)를 이용하여 결합된 항체를 FITC-접합된 아피니퓨어(AffiniPure) F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fcγ 특이적 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩(Jackson Immuno Research Lab) #109-096-098, 작업 용액: PBS/0.1% BSA 중에 1:20으로 희석되고 즉석 제조됨)로 검출하였다. 도 5는 비-처리된 세포 및 이차 항체로만 염색된 세포와 비교하여 투여량 의존적 방식으로 결합의 평균 형광 강도를 보여준다.
동일한 실험 절차를 이용하여, 당조작된 2B10 인간 IgG 항체를 야생형 2B10 인간 IgG 항체와 비교하여 U87MG 세포 상의 TNC A2와의 결합에 대해 시험하였다. 도 8은 야생형 및 당조작된 2B10 항체 둘다가 U87MG 세포 상의 TNC A2에 결합한다는 것을 보여준다.
실시예 10
친화 성숙된 항-TNC A2 항체와 종양 세포 상의 테나신-C의 결합
친화 성숙된 2B10 Fab로부터 유도된 인간 IgG1 항체와 U87MG 아교모세포종 세포 또는 SK-Mel5 흑색종 세포 상의 인간 TNC A2의 결합을 FACS로 측정하였다. 요약하건대, 웰 당 200,000개의 세포를 환저 96-웰 플레이트 내에서 표시된 농도의 2B10-유도된 항-TNC A2 항체와 함께 항온처리하고 4℃에서 30분 동안 항온처리하고 PBS/0.1% BSA로 1회 세척하였다. 4℃에서 30분 동안 항온처리한 후, FACS 캔토II(소프트웨어 FACS 디바)를 이용하여 결합된 항체를 FITC-접합된 아피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fcγ 특이적 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩 #109-096-098, 작업 용액: PBS/0.1% BSA 중에 1:20으로 희석되고 즉석 제조됨)로 검출하였다.
실시예 11
당조작된 항-TNC A2 IgG1 항체에 의해 매개된 항체 의존적 세포 매개된 세포독성
2B10으로부터 유도된 TNC A2에 대한 인간 IgG1 항체를, 실시예 1에 기재된 바와 같이 GnTIII 및 ManII를 코딩하는 플라스미드로 동시-형질감염시켜 당조작하였다. 이어서, 당조작된 2B10 모 항체 및 2B10으로부터 유도된 친화 성숙된 인간 IgG1 항체를, 그들의 비-당조작된 야생형 버전에 비해 더 우수한 항체 매개된 세포성 세포독성을 매개하는 그들의 잠재력에 대해 ADCC 분석에서 비교하였다. 요약하건대, U87MG 아교모세포종 세포 또는 SK-Mel5 흑색종 세포를 표적 세포로서 수집하고 세척하고 배양 배지에 재현탁하고 37℃에서 즉석 제조된 칼세인(Calcein) AM(몰레큘라 프로브스(Molecular Probes))으로 30분 동안 염색하고 3회 세척하고 카운팅하고 300,000개의 세포/㎖까지 희석하였다. 이 현탁액을 환저 96-웰 플레이트로 옮기고(30,000개의 세포/웰), 각각의 항체 희석물을 첨가하고 10분 동안 항온처리하여 이펙터 세포와의 접촉 전에 시험된 항체와 세포의 결합을 촉진하였다. 이펙터 대 표적의 비는 PBMC의 경우 30 대 1이고, 대안적으로 NK92 세포가 적용될 수 있다. 동시-항온처리를 4시간 동안 수행하였다. 공격받은 세포의 붕해 후 상청액 내로의 락테이트 데하이드로게나제(LDH)의 방출을 판독치로서 사용하였다. 동시-배양 상청액으로부터 LDH를 수집하고 LDH 검출 키트(로슈 어플라이드 사이언스)로 분석하였다. LDH 효소에 의한 기질 전환을 ELISA 흡광 판독기(소프트맥스프로(SoftMaxPro) 소프트웨어, 기준 파장: 490 nm 대 650 nm)로 측정하였다.
상기 발명은 명확한 이해를 목적으로 설명 및 실시예에 의해 다소 상세히 기재되어 있지만, 설명 및 실시예가 본 발명의 범위를 한정하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 본원에서 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 전체적으로 명백히 참고로 도입된다.
<110> Roche Glycart AG <120> Anti-Tenascin-C A2 Antibodies and Methods of Use <130> 26952 <140> PCT/EP2011/063734 <141> 2011-08-10 <150> EP 10172841.8 <151> 2010-08-13 <160> 136 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1611 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Library Template for DP47-3 library <400> 1 atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60 atggccgaaa tcgtgttaac gcagtctcca ggcaccctgt ctttgtctcc aggggaaaga 120 gccaccctct cttgcagggc cagtcagagt gttagcagca gctacttagc ctggtaccag 180 cagaaacctg gccaggctcc caggctcctc atctatggag catccagcag ggccactggc 240 atcccagaca ggttcagtgg cagtggatcc gggacagact tcactctcac catcagcaga 300 ctggagcctg aagattttgc agtgtattac tgtcagcagt atggtagctc accgctgacg 360 ttcggccagg ggaccaaagt ggaaatcaaa cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420 ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480 aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540 aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag 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tatacagtct ccatctatgg ggtgatccag ggctatagaa caccagtgct ctctgctgag 1380 gcctccacag gcgaaacacc gaacctgggc gaagtggtgg tggcggaagt gggttgggat 1440 gcgctgaaac tgaactggac cgcgccggaa ggcgcgtatg aatatttttt catccaggtg 1500 caggaagcgg ataccgttga agcggcgcag aacctgaccg ttccgggcgg tctgcgtagc 1560 accgatctgc cgggcctgaa agcggcgacc cattatacca ttaccatccg tggggtgacc 1620 caggacttct ctaccacccc tctgagcgtg gaggtgctga ccgaggaggt acccgacatg 1680 ggcaacctga ccgtgaccga ggtgtcctgg gacgccctgc ggctgaactg gaccaccccc 1740 gacggcacct acgaccagtt cacaatccag gtgcaggaag ccgaccaggt cgaagaggcc 1800 cacaatctga cagtgccagg cagcctgcgg agcatggaaa tccccggcct gagagccggc 1860 accccctaca ccgtgaccct gcacggcgaa gtgcggggcc acagcaccag acccctggcc 1920 gtggaagtgg tcacagctag cggcctgaac gacatcttcg aggctcagaa aatcgaatgg 1980 cacgaaggta cccatcacca tcaccaccac taa 2013 <210> 101 <211> 670 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TNC Fn5 cyA1A2 huA3 avi his biotin from E. coli = pETR7478 <400> 101 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile 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600 tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660 ggttcaacta gtggttctgg tcatcaccat caccatcact ccgcgggtct ggtgccacgc 720 ggtagtactg caattggtat gaaagaaacc gctgctgcta aattcgaacg ccagcacatg 780 gacagcccag atctgggtac cggtggtggc tccggtattg agggacgcgg gtccatggga 840 tatcggggat ccgagctgga cacccccaag gacctgcagg tgtccgagac agccgagaca 900 agcctgaccc tgctgtggaa aacccccctg gccaagttcg accggtacag actgaactac 960 agcctgccca ctggacagtg ggtcggcgtg cagctgcccc ggaacaccac ctcctacgtg 1020 ctgcggggcc tggaacccgg ccaggaatac aacgtcctgc tgacggccga gaagggcaga 1080 cacaagagca agcccgccag agtgaaggcc agcaccgagc aggcccccga gctggaaaac 1140 ctgaccgtga ccgaagtggg ctgggacggc ctgagactga actggacagc cgccgaccag 1200 gcttatgagc acttcgtgat ccaggtgcag gaagccaaca aggtcgaggc cgcccagaat 1260 ctgaccgtgc ccggcaacct gagagccgtg gacatccctg gcctgaaggc tgccaccccc 1320 tacaccgtgt ccatctacgg cgtgattcag ggctaccgga cccctgtgct gtctgccgag 1380 gccagcacag gcgagacacc caacctgggc gaagtgatgg tgtctgaagt gggatgggat 1440 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cgggcctgaa agcggcgacc cgttattaca ttaccctgcg tggcgtgacc 1620 caggattttg gcaccgcgcc gctgtctgtg gaagtgctga ccgaggaggt acccgacatg 1680 ggcaacctga ccgtgaccga ggtgtcctgg gacgccctgc ggctgaactg gaccaccccc 1740 gacggcacct acgaccagtt cacaatccag gtgcaggaag ccgaccaggt cgaagaggcc 1800 cacaatctga cagtgccagg cagcctgcgg agcatggaaa tccccggcct gagagccggc 1860 accccctaca ccgtgaccct gcacggcgaa gtgcggggcc acagcaccag acccctggcc 1920 gtggaagtgg tcacagctag cggcctgaac gacatcttcg aggctcagaa aatcgaatgg 1980 cacgaaggta cccatcacca tcaccaccac taa 2013 <210> 105 <211> 773 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HEK human TNC 1-8 <400> 105 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Ser Pro Pro Lys Asp Leu Val Val Thr Glu Val 20 25 30 Thr Glu Glu Thr Val Asn Leu Ala Trp Asp Asn Glu Met Arg Val Thr 35 40 45 Glu Tyr Leu Val Val Tyr Thr Pro Thr His Glu Gly Gly Leu Glu Met 50 55 60 Gln Phe Arg Val Pro Gly Asp Gln Thr Ser Thr Ile Ile Arg Glu Leu 65 70 75 80 Glu Pro Gly Val Glu Tyr Phe Ile Arg Val Phe Ala Ile Leu Glu Asn 85 90 95 Lys Lys Ser Ile Pro Val Ser Ala Arg Val Ala Thr Tyr Leu Pro Ala 100 105 110 Pro Glu Gly Leu Lys Phe Lys Ser Ile Lys Glu Thr Ser Val Glu Val 115 120 125 Glu Trp Asp Pro Leu Asp Ile Ala Phe Glu Thr Trp Glu Ile Ile Phe 130 135 140 Arg Asn Met Asn Lys Glu Asp Glu Gly Glu Ile Thr Lys Ser Leu Arg 145 150 155 160 Arg Pro Glu Thr Ser Tyr Arg Gln Thr Gly Leu Ala Pro Gly Gln Glu 165 170 175 Tyr Glu Ile Ser Leu His Ile Val Lys Asn Asn Thr Arg Gly Pro Gly 180 185 190 Leu Lys Arg Val Thr Thr Thr Arg Leu Asp Ala Pro Ser Gln Ile Glu 195 200 205 Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Phe Lys Pro 210 215 220 Leu Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val 225 230 235 240 Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Thr Glu Asp Glu Asn Gln Tyr 245 250 255 Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile 260 265 270 Ser Arg Arg Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr 275 280 285 Thr Gly Leu Asp Ala Pro Arg Asn Leu Arg Arg Val Ser Gln Thr Asp 290 295 300 Asn Ser Ile Thr Leu Glu Trp Arg Asn Gly Lys Ala Ala Ile Asp Ser 305 310 315 320 Tyr Arg Ile Lys Tyr Ala Pro Ile Ser Gly Gly Asp His Ala Glu Val 325 330 335 Asp Val Pro Lys Ser Gln Gln Ala Thr Thr Lys Thr Thr Leu Thr Gly 340 345 350 Leu Arg Pro Gly Thr Glu Tyr Gly Ile Gly Val Ser Ala Val Lys Glu 355 360 365 Asp Lys Glu Ser Asn Pro Ala Thr Ile Asn Ala Ala Thr Glu Leu Asp 370 375 380 Thr Pro Lys Asp Leu Gln Val Ser Glu Thr Ala Glu Thr Ser Leu Thr 385 390 395 400 Leu Leu Trp Lys Thr Pro Leu Ala Lys Phe Asp Arg Tyr Arg Leu Asn 405 410 415 Tyr Ser Leu Pro Thr Gly Gln Trp Val Gly Val Gln Leu Pro Arg Asn 420 425 430 Thr Thr Ser Tyr Val Leu Arg Gly Leu Glu Pro Gly Gln Glu Tyr Asn 435 440 445 Val Leu Leu Thr Ala Glu Lys Gly Arg His Lys Ser Lys Pro Ala Arg 450 455 460 Val Lys Ala Ser Thr Glu Gln Ala Ala Met Gly Ser Pro Lys Glu Val 465 470 475 480 Ile Phe Ser Asp Ile Thr Glu Asn Ser Ala Thr Val Ser Trp Arg Ala 485 490 495 Pro Thr Ala Gln Val Glu Ser Phe Arg Ile Thr Tyr Val Pro Ile Thr 500 505 510 Gly Gly Thr Pro Ser Met Val Thr Val Asp Gly Thr Lys Thr Gln Thr 515 520 525 Arg Leu Val Lys Leu Ile Pro Gly Val Glu Tyr Leu Val Ser Ile Ile 530 535 540 Ala Met Lys Gly Phe Glu Glu Ser Glu Pro Val Ser Gly Ser Phe Thr 545 550 555 560 Thr Ala Leu Asp Gly Pro Ser Gly Leu Val Thr Ala Asn Ile Thr Asp 565 570 575 Ser Glu Ala Leu Ala Arg Trp Gln Pro Ala Ile Ala Thr Val Asp Ser 580 585 590 Tyr Val Ile Ser Tyr Thr Gly Glu Lys Val Pro Glu Ile Thr Arg Thr 595 600 605 Val Ser Gly Asn Thr Val Glu Tyr Ala Leu Thr Asp Leu Glu Pro Ala 610 615 620 Thr Glu Tyr Thr Leu Arg Ile Phe Ala Glu Lys Gly Pro Gln Lys Ser 625 630 635 640 Ser Thr Ile Thr Ala Lys Phe Thr Thr Asp Leu Asp Ser Pro Arg Asp 645 650 655 Leu Thr Ala Thr Glu Val Gln Ser Glu Thr Ala Leu Leu Thr Trp Arg 660 665 670 Pro Pro Arg Ala Ser Val Thr Gly Tyr Leu Leu Val Tyr Glu Ser Val 675 680 685 Asp Gly Thr Val Lys Glu Val Ile Val Gly Pro Asp Thr Thr Ser Tyr 690 695 700 Ser Leu Ala Asp Leu Ser Pro Ser Thr His Tyr Thr Ala Lys Ile Gln 705 710 715 720 Ala Leu Asn Gly Pro Leu Arg Ser Asn Met Ile Gln Thr Ile Phe Thr 725 730 735 Thr Val Asp Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Ser Gly Leu Asn 740 745 750 Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Ala Arg Ala His 755 760 765 His His His His His 770 <210> 106 <211> 2322 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HEK human TNC 1-8 (DNA) <400> 106 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60 gtgtctcctc ccaaagacct cgttgtgaca gaagtgacgg aagagacggt caacctggcc 120 tgggacaatg agatgcgggt cacagagtac cttgtcgtgt acacgcccac ccacgagggt 180 ggtctggaaa tgcagttccg tgtgcctggg gaccagacgt ccaccatcat ccgggagctg 240 gagcctggtg tggagtactt tatccgtgta tttgccatcc tggagaacaa gaagagcatt 300 cctgtcagcg ccagggtggc cacgtactta cctgcacctg aaggcctgaa attcaagtcc 360 atcaaggaga catctgtgga agtggagtgg gatcctctag acattgcttt tgaaacctgg 420 gagatcatct tccggaatat gaataaagaa gatgagggag agatcaccaa aagcctgagg 480 aggccagaga cctcttaccg gcaaactggt ctagctcctg ggcaagagta tgagatatct 540 ctgcacatag tgaaaaacaa tacccggggc cctggcctga agagggtgac caccacacgc 600 ttggatgccc ccagccagat cgaggtgaaa gatgtcacag acaccactgc cttgatcacc 660 tggttcaagc ccctggctga gatcgatggc attgagctga cctacggcat caaagacgtg 720 ccaggagacc gtaccaccat cgatctcaca gaggacgaga accagtactc catcgggaac 780 ctgaagcctg acactgagta cgaggtgtcc ctcatctccc gcagaggtga catgtcaagc 840 aacccagcca aagagacctt cacaacaggc ctcgatgctc ccaggaatct tcgacgtgtt 900 tcccagacag ataacagcat caccctggaa tggaggaatg gcaaggcagc tattgacagt 960 tacagaatta agtatgcccc catctctgga ggggaccacg ctgaggttga tgttccaaag 1020 agccaacaag ccacaaccaa aaccacactc acaggtctga ggccgggaac tgaatatggg 1080 attggagttt ctgctgtgaa ggaagacaag gagagcaatc cagcgaccat caacgcagcc 1140 acagagttgg acacgcccaa ggaccttcag gtttctgaaa ctgcagagac cagcctgacc 1200 ctgctctgga agacaccgtt ggccaaattt gaccgctacc gcctcaatta cagtctcccc 1260 acaggccagt gggtgggagt gcagcttcca agaaacacca cttcctatgt cctgagaggc 1320 ctggaaccag gacaggagta caatgtcctc ctgacagccg agaaaggcag acacaagagc 1380 aagcccgcac gtgtgaaggc atccactgaa caagccgcca tgggctcccc aaaggaagtc 1440 attttctcag acatcactga aaattcggct actgtcagct ggagggcacc cacagcccaa 1500 gtggagagct tccggattac ctatgtgccc attacaggag gtacaccctc catggtaact 1560 gtggacggaa ccaagactca gaccaggctg gtgaaactca tacctggcgt ggagtacctt 1620 gtcagcatca tcgccatgaa gggctttgag gaaagtgaac ctgtctcagg gtcattcacc 1680 acagctctgg atggcccatc tggcctggtg acagccaaca tcactgactc agaagccttg 1740 gccaggtggc agccagccat tgccactgtg gacagttatg tcatctccta cacaggcgag 1800 aaagtgccag aaattacacg cacggtgtcc gggaacacag tggagtatgc tctgaccgac 1860 ctcgagcctg ccacggaata cacactgaga atctttgcag agaaagggcc ccagaagagc 1920 tcaaccatca ctgccaagtt cacaacagac ctcgattctc caagagactt gactgctact 1980 gaggttcagt cggaaactgc cctccttacc tggcgacccc cccgggcatc agtcaccggt 2040 tacctgctgg tctatgaatc agtggatggc acagtcaagg aagtcattgt gggtccagat 2100 accacctcct acagcctggc agacctgagc ccatccaccc actacacagc caagatccag 2160 gcactcaatg ggcccctgag gagcaatatg atccagacca tcttcaccac agtcgacctg 2220 gaagttctgt tccaggggcc cggctcaggc ctgaacgaca tcttcgaggc ccagaagatc 2280 gagtggcacg aggctcgagc tcaccaccat caccatcact ga 2322 <210> 107 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader Sequence 1 <400> 107 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser <210> 108 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader Sequence 1 (DNA1) <400> 108 atggactgga cctggagaat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactcc 57 <210> 109 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader Sequence 1 (DNA 2) <400> 109 atggactgga cctggaggat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactcc 57 <210> 110 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader Sequence 2 <400> 110 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ala Arg Cys 20 <210> 111 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader Sequence 2 (DNA) <400> 111 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg ggcctcctgc tgctctggtt cccaggtgcc 60 aggtgt 66 <210> 112 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader Sequence 3 <400> 112 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 113 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader Sequence 3 (DNA 1) <400> 113 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattcc 57 <210> 114 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader Sequence 3 (DNA 1) <400> 114 atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggctaccg ccactggagt gcattcc 57 <210> 115 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader Sequence 3 (DNA 3) <400> 115 atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtcgccacag ccaccggcgt gcactct 57 <210> 116 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMB3 <400> 116 caggaaacag ctatgaccat gattac 26 <210> 117 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LibL1b_new <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (35)..(36) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (38)..(39) <223> n is a, c, g, or t <400> 117 cactttggtc ccctggccga acgtmnnggg mnnmnnmnna ccctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 118 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MS63 <400> 118 tttcgcacag taatatacgg ccgtgtcc 28 <210> 119 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MS64 <400> 119 acgttcggcc aggggaccaa agtgg 25 <210> 120 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lib2H <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (35)..(36) <223> n is a, c, g, or t <400> 120 ggccgtatat tactgtgcga aannknnknn knnknnkttt gactactggg gccaaggaac 60 <210> 121 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fdseqlong <400> 121 gacgttagta aatgaatttt ctgtatgagg 30 <210> 122 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RJH_LIB3 <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (35)..(36) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (41)..(42) <223> n is a, c, g, or t <400> 122 gactttggtg ccctggccaa acgtmnnggg mnnmnnaccm nnctgcaagc agtaataggt 60 ggcaaaatc 69 <210> 123 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RJH31 <400> 123 acgtttggcc agggcaccaa agtcgag 27 <210> 124 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RJH32 <400> 124 tctcgcacag taatacacgg cggtgtcc 28 <210> 125 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LIB88_2 <220> <221> misc_difference <222> (29)..(55) <223> (33% GAC Asp; 26% GGT Gly; 10% GAA Glu; 9% CGT Arg; 7% Lys; 6% GTT Val; 5% TCT Ser; 4% CTG Leu)1 - (23% GGT Gly; 17% TAC Tyr; 16% TCT Ser; 11% GCT Ala; 9% CGT Arg; 7% AAC Asn; 6% ACT Thr; 6% GTT Val; 5% CCG Pro)8 <220> <221> misc_feature <222> (30)..(33) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (35)..(36) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (38)..(39) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (41)..(42) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (47)..(48) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (50)..(51) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (53)..(54) <223> n is a, c, g, or t <400> 125 ggacaccgcc gtgtattact gtgcgagabn nnnbnnbnnb nnbnnbnnbn nbnnbtttga 60 ctactggggc caagggacca ccgtgaccgt ctcc 94 <210> 126 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AM_Vk1A30_L1_ba <400> 126 cctggcttct gctggtacca gcctaaatca ttacgaatgc cctgacttgc ccggcaggtg 60 atg 63 <210> 127 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RJH50(Vk1A30_L1/L2_fo) <400> 127 gctggtacca gcagaagcca gggaaag 27 <210> 128 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RJH51(Vk1A30_BsiWI_ba) <400> 128 ggtgcagcca ccgtacgctt gatctc 26 <210> 129 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AM_Vk1A30_L2_ba <400> 129 cttgatggga cgccactctg caaactggac gcagcataga tcaggcgctt aggggctttc 60 c 61 <210> 130 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RJH52(Vk1A30_L2/L3) <400> 130 ttgcagagtg gcgtcccatc aaggttc 27 <210> 131 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RJH53 <400> 131 catcagggcc tgagctcgcc cgtcac 26 <210> 132 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AM_DP88_H1_ba_opt <400> 132 gtccaggggc ctgtcgcacc cagcttatag cgtagctgct gaatgtgcct ccggaggcct 60 tg 62 <210> 133 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RJH54(DP88_H1/H2_fo) <400> 133 ataagctggg tgcgacaggc ccctggac 28 <210> 134 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MS52 <400> 134 gaagaccgat gggcctttgg tgctag 26 <210> 135 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AM_DP88_H2_ba <400> 135 gaccctgccc tggaacttct gtgcgtagtt tgcggtacca aagataggga tgatccctcc 60 catccactcg agcccttgtc cag 83 <210> 136 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RJH55 (DP88_H2H3_fo) <400> 136 tacgcacaga agttccaggg cagggtcac 29

Claims (53)

  1. 삭제
  2. 테나신-C의 A2 도메인(TNC A2)에 특이적으로 결합하는 항체로서,
    (a) 서열번호 59의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85 및 서열번호 89로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
    (b) 서열번호 63 또는 서열번호 67의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 57의 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    서열번호 63 또는 서열번호 67의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 57의 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  4. 제 2 항에 있어서,
    서열번호 59의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85 및 서열번호 89로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  5. 제 2 항에 있어서,
    Fc 영역 또는 면역글로불린의 Fc 영역에 동등한 영역을 포함하는, 항체.
  6. 삭제
  7. 테나신-C의 A2 도메인(TNC A2)에 특이적으로 결합하는 항체로서,
    서열번호 59의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 55 또는 서열번호 57의 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함하고, Fc 영역 또는 면역글로불린의 Fc 영역에 동등한 영역을 포함하는, 항체.
  8. 제 5 항 또는 제 7 항에 있어서,
    Fc 영역이 IgG Fc 영역인, 항체.
  9. 제 2 항 또는 제 7 항에 있어서,
    전장 IgG 클래스 항체인, 항체.
  10. 제 2 항 또는 제 7 항에 있어서,
    인간 불변 영역을 포함하는, 항체.
  11. 제 2 항 또는 제 7 항에 있어서,
    인간 항체인, 항체.
  12. 제 2 항 또는 제 7 항에 있어서,
    당조작된 Fc 영역을 포함하는, 항체.
  13. 제 12 항에 있어서,
    비-당조작된 항체에 비해 Fc 영역 내에서 증가된 비율의 비-푸코실화된 올리고사카라이드를 갖는, 항체.
  14. 제 12 항에 있어서,
    Fc 영역 내에서 20% 내지 100%의 N-연결된 올리고사카라이드가 비-푸코실화되어 있는, 항체.
  15. 제 12 항에 있어서,
    비-당조작된 항체에 비해 Fc 영역 내에서 증가된 비율의 이등분된 올리고사카라이드를 갖는, 항체.
  16. 제 12 항에 있어서,
    Fc 영역 내에서 20% 내지 100%의 N-연결된 올리고사카라이드가 이등분되어 있는, 항체.
  17. 제 12 항에 있어서,
    Fc 영역 내에서 20% 내지 50%의 N-연결된 올리고사카라이드가 이등분되고 비-푸코실화되어 있는, 항체.
  18. 제 2 항 또는 제 7 항에 있어서,
    증가된 이펙터 기능 및/또는 증가된 Fc 수용체 결합 친화성을 갖는, 항체.
  19. 제 18 항에 있어서,
    증가된 이펙터 기능이 증가된 ADCC인, 항체.
  20. 제 2 항 또는 제 7 항에 있어서,
    친화 성숙된, 항체.
  21. 제 2 항 또는 제 7 항에 있어서,
    1 μM 미만의 KD 값으로 인간 TNC A2에 결합하는, 항체.
  22. 제 2 항 또는 제 7 항에 있어서,
    인간 조직 내의 TNC A2에 결합하는, 항체.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. (a) 서열번호 59의 서열로 구성된 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 단리된 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85 및 서열번호 89로 구성된 군으로부터 선택된 서열로 구성된 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나;
    (b) 서열번호 67 및 서열번호 63으로 구성된 군으로부터 선택된 서열로 구성된 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 단리된 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호 57의 서열로 구성된 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  26. 삭제
  27. 제 2 항 또는 제 7 항에 따른 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 복수의 폴리뉴클레오타이드, 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 복수의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 또는 제 25 항의 조성물을 포함하는 숙주 세포.
  28. 제 27 항에 있어서,
    GnTIII(β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III) 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩타이드를 증가된 수준으로 발현하도록 조작된, 숙주 세포.
  29. 제 28 항에 있어서,
    GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드가 GnTIII의 촉매 도메인 및 ManII(만노시다제(mannosidase) II)의 골지(Golgi) 국소화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드인, 숙주 세포.
  30. 제 28 항에 있어서,
    ManII 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩타이드를 증가된 수준으로 발현하도록 추가로 조작된, 숙주 세포.
  31. 테나신-C의 A2 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법으로서,
    (a) 상기 항체의 발현을 허용하는 조건 하에 배지 중에서 제 27 항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
    (b) 상기 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  32. 테나신-C의 A2 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법으로서,
    (a) 상기 항체의 발현, 및 GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드에 의한 상기 항체의 Fc 영역 상에 존재하는 올리고사카라이드의 변형을 허용하는 조건 하에, 배지 중에서 제 28 항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
    (b) 상기 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  33. 테나신-C의 A2 도메인에 특이적으로 결합하는 항체로서, 제 31 항의 방법에 의해 제조된 항체.
  34. 제 2 항 또는 제 7 항의 항체 및 세포독성제를 포함하는 항체 접합체.
  35. 제 2 항 또는 제 7 항의 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암 치료를 위한 약학 제제.
  36. 제 35 항에 있어서,
    추가 치료제를 추가로 포함하는, 약학 제제.
  37. 제 2 항 또는 제 7 항에 있어서
    약제로서 사용되는, 항체.
  38. 제 2 항 또는 제 7 항에 있어서,
    TNC A2의 발현을 특징으로 하는 질환의 치료를 위한, 항체.
  39. 제 38 항에 있어서,
    상기 질환이 암인, 항체.
  40. 제 2 항 또는 제 7 항에 있어서,
    종양 세포 또는 종양의 간질(stromal) 세포의 세포 용해를 유도하는 데에 사용되는, 항체.
  41. 제 2 항 또는 제 7 항의 항체를 포함하는, 암 치료를 위한 약학 제제.
  42. 삭제
  43. 유효량의 제 2 항 또는 제 7 항의 항체; 제 2 항 또는 제 7 항의 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제제; 또는 제 2 항 또는 제 7 항의 항체, 약학적으로 허용가능한 담체 및 추가 치료제를 포함하는 약학 제제를 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, TNC A2 발현을 특징으로 하는 질환을 갖는 인간을 제외한 동물을 치료하는 방법.
  44. 제 43 항에 있어서,
    추가 치료제를 상기 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  45. 제 43 항에 있어서,
    상기 질환이 암인, 방법.
  46. 인간을 제외한 동물에서 종양 세포 또는 종양의 간질 세포의 세포 용해를 유도하는 방법으로서, 상기 종양 세포 또는 간질 세포를 제 2 항 또는 제 7 항의 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  47. 제 46 항에 있어서,
    세포 용해가 항체의 항체 의존적 세포독성에 의해 유도되는, 방법.
  48. 유효량의 진단제를 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 인간을 제외한 동물에서 질환을 진단하는 방법으로서, 이때 상기 진단제는 제 2 항 또는 제 7 항의 항체, 및 상기 진단제와 TNC A2의 결합체의 검출을 허용하는 표지를 포함하는, 방법.
  49. 테나신-C의 A2 도메인에 특이적으로 결합하는 항체로서, 제 32 항의 방법에 의해 제조된 항체.
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
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