MX2007015107A

MX2007015107A - Metodo para producir anticuerpos con funcion mejorada.

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Publication number: MX2007015107A
Application number: MX2007015107A
Authority: MX
Inventors: Henry B Lowman; John C Joly; Domingos Ng; Amy Y Shen; Bradley R Snedecor
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2005-06-03
Filing date: 2006-06-05
Publication date: 2008-02-15
Also published as: IL187308A0; AU2006255085A1; WO2006133148A3; WO2006133148A2; JP2008541770A; US20090208500A1; CA2608818A1; KR20080032065A; EP1888638A2

Abstract

La invencion proporciona metodos para controlar niveles de fucolasilacion y mejorada actividad DAC en anticuerpos.

Description

MÉTODO PARA PRODUCIR ANTICUERPOS CON FUNCIÓN MEJORADA Esta solicitud reclama el beneficio de las solicitudes de patentes provisionales de los E.U.A. No. de Serie 60/687,625, presentada en junio 3, 2005, y No. de Serie 60/736,982, presentada en noviembre 14, 2005, todas las descripciones de las cuales aquí se incorporan por referencia. CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a la producción de anticuerpos con función Fc mejorada y fucosa reducida. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteínas terapéuticas recombinantes se producen comúnmente en varias líneas celulares anfitrionas de mamífero incluyendo células NSO de mieloma murino y de Ovario de Hámster Chino (CHO = Chínese Hámster Ovary) (Anderson and Krummen, 2002; Chu and Robinson, 2001). Cada línea celular tiene ventajas y desventajas en términos de productividad y las características de las proteínas producidas por las células. Las selecciones de líneas celulares de producción comercial a menudo equilibran la necesidad por alta productividad con la capacidad por suministrar los atributos de calidad de producto requeridos de un producto determinado. Una clase importante de proteínas recombinantes terapéuticas que a menudo requiere procesos de alto título son anticuerpos monoclonales. Algunos anticuerpos monoclonales requieren funciones efectoras, mediadas a través de la región Fc, para producir sus funciones biológicas. Un ejemplo es Rituximab (Rituxan™, Genentech and Biogen- Idee) , un anticuerpo monoclonal quimérico que liga a CD-20 de superficie celular y resulta en agotamiento de células B (Cartón et al., 2002; Idusogie et al., 2000) . Otros anticuerpos, tales como Bevacizumab (AvastinTM, Genentech) , un anticuerpo anti-VEGF humanizado (factor de crecimiento endotelial vascular) , no requieren funciones efectoras Fc por su actividad. Anticuerpos monoclonales producidos en células anfitrionas de mamífero contienen un sitio de glicosilación -enlazado en Asn297 de cada cadena pesada (dos por molécula de anticuerpo intacta) . Glicanos en anticuerpos son típicamente estructuras biantenarias complejas típicamente con N-acetilglucosamina no bisectante (GlcNAc bisectante) y altos niveles de fucosilación núcleo (Saba et al., 2002). Los extremos glicano contienen muy bajo o nada de ácido siálico terminal y cantidades variables de galactosa. Para una revisión de glicosilación en función de anticuerpo, ver, por ejemplo Wright & Morrison Trend Biotechnol. 15:26-31 (1997) . Trabajo considerable muestra que cambios a la composición de azúcar de la estructura glicano anticuerpo pueden alterar las funciones efectoras Fc (Kumpel et al., 1994; Kumpel et al., 1995; Schuster et al., 2005; Shields et al., 2002; Umana et al., 1999). Las estructuras de carbohidratos importantes que contribuyen a la actividad de anticuerpo se consideran que son los residuos fucosa conectados mediante enlace a 1 , 6 a los residuos más internos N-acetilglucosamina (GlacNAc) de los oligosacáridos N-enlazados de la región Fc (Shields et al., 2002; Shinkawa et al. J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473 (2003)). El enlace Fc^R requiere la presencia de oligosacáridos conectados covalentemente en el Asn297 conservado en la región Fc (Wright & Morrison (1997) ) . Recientemente estructuras no-fucosiladas se han asociado con una Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpo in vitro dramáticamente incrementada (ADCC) (Shields et al., 2002; Shinkawa et al., 2003). Varios laboratorios, incluyendo el propio, han empleado exitosamente interferencia de ARN (RNAi) o técnicas de eliminación (knock-out) para someter a ingeniería células CHO ya sea a disminución de los niveles de transcripción FUT8 en mRNA elimina la expresión de gen totalmente (Mori et al., 2004; Yamane-Ohnuki et al., 2004). Mori et al. 2004 describe convertir una línea celular productora de anticuerpo, establecida a una que produce anticuerpos ADCC mejorados por someter a ingeniería las células para expresar en forma constitutiva siRNA contra el gen FUT8 aplicando selección LCA. Mori demostró la producción de anticuerpos que contienen hasta 70% de glicano no fucosilado. Niwa R. et al. (Cáncer Res. 64 (6) : 2127-2133 (2004)), reportó que un anticuerpo anti-CD20 con menor contenido de fucosa puede prolongar la supervivencia del animal significativamente en el modelo de ratón injertado con PBMC humano . Históricamente, anticuerpos producidos en células de ovario de hámster chino (CHO) , uno de los anfitriones industriales más comúnmente empleados, contienen aproximadamente 2 a 6% en la población que no está fucosilada. YB2/0 (mieloma de rata) y la línea celular Lecl3 (un mutante de lectina de la línea CHO que tiene GDP-mannosa 4 , 6-dehidratasa deficiente lleva a la deficiencia de GDP-fucosa o intermediarios GDP-azúcar que son el substrato de 1, 6-fucosiltransferasa (Ripka et al., 1986)), sin embargo, pueden producir anticuerpos con especies no fucosiladas de 78 a 98%. Desafortunadamente, el rendimiento de anticuerpo de estas células es extremadamente deficiente y por lo tanto estas líneas celulares no son útiles para ser comercialmente productos de anticuerpo terapéuticos. El gen FUT8 codifica la enzima a 1 , 6-fucosiltransferasa que cataliza la transferencia de un residuo fucosilo de GDP-fucosa a la posición 6 de GlcNac enlazado Asn (N-enlazado) de un N-glicano (Yanagidani et al. 1997. J. Biochem 121:626-632). Se conoce que la a 1, 6-fucosiltransferasa es la única enzima responsable por agregar fucosa al carbohidrato biantenario N-enlazado en Asn297 en el dominio CH2 del anticuerpo IgG. Anticuerpos con una estructura carbohidrato madura que carecen de fucosa conectado a una región Fc del anticuerpo, se describen en la solicitud de patente de los E.U.A. No. 2003/0157108 (Presta, L.). Ejemplos de publicaciones relacionadas a anticuerpos "desfucosilados" o "deficientes fucosa" incluyendo anticuerpos anti-CD20 incluyen: la patente de los E.U.A. 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; patente de los E.U.A. No. 2003/0115614; patente de los E.U.A. No. 2002/0164328; patentes de los E.U.A. No. 2004/0093621, 2004/0132140 y patente de los E.U.A. No. 2004/0110704 (todas las 3 de Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd); patente de los E.U.A. No. 2004/0110282; patente de los E.U.A. No. 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; patente de los E.U.A. No. 2006/0063254; patente de los E.U.A. No. 2006/0064781; patente de los E.U.A. No. 2006/0078990; patente de los E.U.A. No. 2006/0078991; patente de los E.U.A. No. 6,602,684 y patente de los E.U.A. No. 2003/0175884 (Glycart Biotechnology); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Mori et al. Biotechnology y Bioengineering 88(7): 901-908 (2004); Li et al. (GlycoFi) en la publicación en línea de Nature Biology 22 de enero 2006; Niwa R. et al. Cáncer Res. 64 (6) : 2127-2133 (2004); Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Shinkawa et al. J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473 (2003). Ejemplos de líneas celulares que producen anticuerpos desfucosilados incluyen las células Lecl3 CHO deficientes en fucosilación de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); la solicitud de patente de los E.U.A. No. 2003/0157108 Al, Presta, L; y WO 2004/056312 Al, Adams et al., en especial en el Ejemplo 11), y las líneas celulares knockout, tales como el gen alfa-1, 6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO knockout (Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)).

Ver también patente de los E.U.A. No. 2005/0123546 (Umana et al.) en moléculas de enlace de antígeno con glicosilación modificada. La interferencia de ARN (RNAi) es un mecanismo de silenciado de genes post-transcripcional específico de secuencia que utiliza ARN de doble hebra (dsRNA) como una señal para activar la degradación de mRNA homólogo. Los mediadores de degradación mRNA específicos de secuencia son RNAs de interferencia pequeños (siRNAs) de 21- a 23-nt generados por escisión de ribonucleasa III de dsRNAs más largos. dsRNA es un inductor potente de síntesis de interferona I (IFN) y es el activador de dos clases de enzimas inducidas por IFN cuyos productos activan la RNase L ribonucleasa latente. Estas respuestas no específicas de dsRNA no son activadas por dsRNA más cortos que 30 bp . Los productos de procesamiento más predominantes son dúplex RNAs de 21- y 22-nt con sobresalientes 3' 2-nt simétricos, que también son los mediadores más eficientes de degradación de mRNA (Elbashir et al., Nature 411:494-498 (2001; Elbashir et al Methods 26: 199-213 (2002)). Patentes y publicaciones de patentes referentes a anticuerpos CD20 incluyen las patentes de los E.U.A. Nos. 5,776,456, 5,736,137, 5,843,439, 6,399,061 y 6,682,734, así como las solicitudes de patentes de los E.U.A. Nos. US 2002/0197255A1, US 2003/0021781A1 , US 2003/0082172 Al, US 2003/0095963 Al, US 2003/0147885 Al (Anderson et al.); la patente de los E.U.A. No. 6,455, 043B1 y WO00/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO00/27428 (Grillo-Lopez and White) ,- WO00/27433 (Grillo-Lopez and Leonard); WO00/44788 (Braslawsky et al.); WOOl/10462 (Rastetter, W.); WO01/10461 (Rastetter and White); WO01/10460 (White and Grillo-Lopez); US2001/0018041A1 , US2003/0180292A1, WOOl/34194 (Hanna and Hariharan); la solicitud de patente de los E.U.A. No. 2002/0006404 y WO 02/04021 (Hanna and Hariharan); patente de los E.U.A. No. 2002/0012665 Al y WO 01/74388 (Hanna, N.); la solicitud patente de los E.U.A. No. 2002/0058029 Al (Hanna, N.); la solicitud de patente de los E.U.A. No. 2003/0103971 Al (Hariharan and Hanna) ; la solicitud de patente de los E.U.A. No. 2002/0009444A1, y WO 01/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO 01/97858 (White, C); patente de los E.U.A. No. 2002/0128488A1 y WO 02/34790 (Reff, M.); WO 02/060955 (Braslawsky et al.); WO 2/096948 (Braslawsky et al.); WO 02/079255 (Reff and Davies) ; patente de los E.U.A. No. 6,171,586B1, y WO 98/56418 (Lam et al.); WO 98/58964 (Raju, S J ; WO 99/22764 (Raju, S . ) ; WO 99/51642, solicitud de patente de los E.U.A. No. 6,194,551B1, la solicitud de No. 6,242, 195B1, la solicitud de No. 6,528,624B1 y la patente de los E.U.A. No. 6,538,124 (Idusogie et al.); WO00/42072 (Presta, L.); WO00/67796 (Curd et al.); WO01/03734 (Grillo-Lopez et al.); patente de los E.U.A. No. 2002/0004587A1 y WO01/77342 (Miller and Presta); patente de los E.U.A. No. US2002/0197256 (Grewal, I.); patente de los E.U.A. No. 2003/0157108 Al (Presta, .) ; patentes de los E.U.A. Nos. 6,565,827B1, 6,090,365B1, 6,287, 537B1, 6,015,542, 5,843,398 y 5,595,721, (Kaminski et al . ) ; patentes de los E.U.A. Nos. 5,500,362, 5,677,180, 5,721,108, 6,120,767, 6,652,852B1 (Robinson et al.); patente de los E.U.A. No. 6,410,391B1 (Raubitschek et al.); patente de los E.U.A. No. 6,224, 866B1 y WO 00/20864 (Barbera-Guillem, E . ) ; WO 01/13945 (Barbera-Guillem, E . ) ; WO 00/67795 (Goldenberg); solicitud de patente de los E.U.A. No. 2003/0133930 Al y WO 00/74718 (Goldenberg and Hansen) ; WO 00/76542 (Golay et al.); WO 01/72333 (Wolin and Rosenblatt) ; patente de los E.U.A. No. 6,368,596B1 (Ghetie et al.); patente de los E.U.A. No. 6,306,393 y solicitud de patente de los E.U.A. No. US2002/0041847 Al, (Goldenberg, D J ; patente de los E.U.A. No. 2003/0026801A1 (Weiner and Hartmann) ; WO 02/102312 (Engleman, E.); solicitud de patente de los E.U.A. No. 2003/0068664 (Albitar et al.); WO 03/002607 (Leung, S J ; WO 03/049694, US 2002/0009427A1 , y US 2003/0185796 Al (Wolin et al.); WO03/061694 (Sing and Siegall); patente de los E.U.A. No. 2003/0219818 Al (Bohen et al.); patente de los E.U.A. No. 2003/0219433 Al y WO 03/068821 (Hansen et al.); US 2002/0136719A1 (Shenoy et al.); WO2004/032828 (Wahl et al.); WO2004/035607 (Teeling et al.); US2004/0093621 (Shitara et al.). Ver también patente de los E.U.A. No. 5,849,898 y EP solicitud No. 330,191 (Seed et al.); patente de los E.U.A. No. 4,861,579 y EP332,865A2 (Meyer and Weiss); WO 95/03770 (Bhat et al.), US 2001/0056066 (Bugelski et al.); WO 2004/035607 (Teeling et al.); WO 2004/056312 (Lowman et al.); patente de los E.U.A. No. 2004/0093621 (Shitara et al.); y WO 2004/103404 (Watkins et al.). Publicaciones referentes a anticuerpo CD20, incluyen: Teeling, J. et al. "Characterisation of new human CD20 monoclonal antibodies with potent cytolytic activity against non-Hodgkin ' s lymphomas" Blood, Jun 2004; 10.1182. En la línea celular knockout FUT8 como se describe en Yamane-Ohnuki 2004 y en las patentes de Kyowa Hakko, la producción de anticuerpos requiere transfección de los genes que codifican el anticuerpo deseado en la línea celular knockout establecida. Hay necesidad por un método eficiente para producir anticuerpos en una línea celular deseada mientras que se contra el contenido de fucosa de los anticuerpos de ingeniería recombinante sin someterse a proceso laborioso de crear un gen inoperativo knock-out FUT8 en una línea selecta cada vez. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona otras ventajas que serán aparentes en las siguientes descripciones detalladas. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Una forma de mejorar la afinidad de enlace de un anticuerpo a Fc^RIII es cambiar la o las secuencias de amino ácidos en la región Fc (ver Shields et al (2002)). Las variantes de anticuerpo anti-CD20 humanizadas mostradas en la Tabla 3, incorporan substituciones de amino ácido en Fc que mejoran el enlace Fe?' RUI y ADCC. La presente invención proporciona un método para producir anticuerpos con menor contenido de fucosa que cuando se combinan con los cambios de amino ácido que mejoran el enlace Fc^RIII en la región Fc muestran un efecto aditivo en afinidad para Fc^RIII y ADCC . La presente invención proporciona un método para producir un anticuerpo que comprende un IgG Fc en una célula anfitriona de mamífero mientras que reduce el contenido de fucosa del anticuerpo, que comprende introducir simultáneamente en la célula anfitriona, cuando menos un ácido nucleico que codifica un anticuerpo y un segundo ácido nucleico que codifica al menos dos siRNAs que hacen blanco en diferentes regiones de codificación de la secuencia de gen FUT8 de SEQ ID ?O. 1, en donde siR?As inhibe la expresión de FUT8 y reduce el nivel de fucosilación del anticuerpo. La presente invención también proporciona un método más eficiente para generar una línea celular para producción de anticuerpo con eliminación de fucosilación simultánea que produce anticuerpos con ADCC mejorado en comparación con anticuerpos sintetizados con niveles normales de fucosilación en la célula de mamífero. Este enfoque puede tomarse para construir líneas celulares que exhiben alta productividad de anticuerpo y niveles controlados de fucosilación. Esta línea celular es útil para producción de aumento en escala de anticuerpos como en producción comercial de anticuerpos terapéuticos. De esta manera, se proporciona un método para producir un anticuerpo IgG con ADCC mejorado, que comprende introducir simultáneamente en la célula anfitriona, al menos un ácido nucleico que codifica un anticuerpo y un segundo ácido nucleico que codifica al menos doe siRNAs que hacen blanco en diferentes regiones de codificación de la secuencia de gen FUT8 de SEQ ID NO. 1, en donde el anticuerpo y los siRNAs se expresan en la célula para producir un anticuerpo con reducida fucosilación e incrementada actividad ADCC en comparación con el anticuerpo producido en la célula en la ausencia de siRNAs . En una modalidad del método para producir un anticuerpo IgG con ADCC mejorada, el anticuerpo comprende al menos una alteración de amino ácido en la región Fc que mejora el enlace de anticuerpo para Fc/RIII y/o ADCC. El anticuerpo puede comprender la substituciones de amino ácido Fc de S298A, E333A, K334A.

La invención también proporciona métodos para producir composiciones de anticuerpos de enlace CD20 humanizados que carecen de fucosa. En una modalidad de los métodos de la presente invención, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo codifica tanto una cadena ligera (L) como una cadena pesada (H) del anticuerpo. En una modalidad, las cadenas H y L de anticuerpo y los siRNAs se codifican en el mismo vector de expresión. En una modalidad alterna, las cadenas H y L se codifican en vectores de expresión separados y además, cada uno de los vectores de expresión que codifican la cadena H y L también comprenden un ácido nucleico que codifica al menos dos siRNAs. En una modalidad de todos los métodos precedentes, los dos siRNAs se expresan bajo el control de promotores separados. Cuando los promotores Pol III se emplean para dirigir la transcripción de los siRNAs en los vectores de expresión, un siRNA puede expresarse bajo el promotor Hl mientras que el segundo siRNAi se expresa bajo un promotor Pol III diferente, U6. En una modalidad específica, el primero y segundo siRNA que hacen blanco en posiciones de nucleótido 733-751 y 1056-1074, respectivamente, de una secuencia del gen FUT8 de SEQ ID NO. 1. En cualquiera de las modalidades de los métodos anteriores, de preferencia el nivel de fucosilación de anticuerpo se reduce en al menos 90%, más preferible al menos 95%, aún más preferiblemente en al menos 99%. Se proporcionan anticuerpos producidos por los métodos anteriores. En una modalidad preferida, de todos los métodos precedentes, el anticuerpo es un anticuerpo terapéutico. En una modalidad, el anticuerpo liga CD20. En una modalidad, el anticuerpo liga BR3. En modalidades preferidas, el anticuerpo liga CD20 en humanos y otros primates. En una modalidad el anticuerpo de enlace CD20 es un anticuerpo humanizado. En modalidades preferidas, el anticuerpo humanizado es un anticuerpo 2H7 humanizado, de preferencia uno como se describe en las Tablas 3 y 4 siguientes. En modalidades separadas, el anticuerpo humanizado comprende uno de los pares de regiones de VL y VH: la secuencia de región variable de cadena L de SEQ ID NO.2 y la secuencia de región variable de cadena H de SEQ ID NO.8; la secuencia de región variable de cadena L de SEQ ID NO.25 y la secuencia de región variable de cadena H de SEQ ID NO.22; o la secuencia de región variable de cadena L de SEQ ID NO.25 y la secuencia de región variable de cadena H de SEQ ID NO.33. En modalidades específicas, el anticuerpo 2H7 humanizado comprende los pares de cadena L y H de SEQ ID NO. 13 y SEQ ID NO. 14; SEQ ID NO. 26 y SEQ ID NO. 27; y SEQ ID NO. 26 y SEQ ID NO. 34. Otras modalidades de anticuerpos humanizados anti-CD20 son hA20 (también conocidos como IMMU-106, o 90Y-hLL2; patente de los E.U.A. No. 2003/0219433, Immunomedics) ,- y AME-133 (patente de los E.U.A. No. 2005/0025764; Applied Molecular Evolution/Eli Lilly). En una modalidad diferente, el anticuerpo de enlace CD20 es un anticuerpo humano, de preferencia HUMAX-CD20TM (GenMab) . En todavía una modalidad separada, el anticuerpo de enlace CD20 es un anticuerpo quimérico, son modalidades preferidas rituximab (Genentech, Inc.) y el anticuerpo cA20 quimérico (descrito en la patente de los E.U.A. No. 2003/0219433, Immunomedics) . Todavía en otra modalidad, el anticuerpo producido por los métodos de la presente invención es un anticuerpo que liga BR3. La invención adicionalmente proporciona un ácido nucleico que comprende la secuencia de SEQ ID NO. 42 y SEQ ID NO. 43 que codifica dos siRNa complementarios a las dos regiones de codificación diferentes del gen FTU8. Se proporciona una composición que comprende anticuerpos de enlace CD20 humanizados que tiene una región Fc y un portador, en donde al menos 95% de los anticuerpos en la composición carecen de fucosa. En una modalidad preferida, la célula anfitriona es una célula de ovario de hámster chino (CHO) o su derivado. Otro aspecto es una célula anfitriona que comprende al menos un ácido nucleico que codifica un anticuerpo y un segundo ácido nucleico que codifica al menos dos siRNAs que hacen blanco en diferentes regiones de codificación de la secuencia de gen FTU8 de SEQ ID NO. 1 , en donde la célula anfitriona expresa el anticuerpo y los siRNAs. También se proporciona el uso de las composiciones de anticuerpo deficientes en fucosa precedentes para tratamiento de enfermedades. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIGURA 1 : Un GlcNac enlazado a Asn (N-enlazado) de un N-glicano con un residuo fucosilo conectado. FIGURA 2: Esquemático de tecnología RNAi para mediar la inhibición de expresión de gen. FIGURA 3: Diagrama de plásmido pSilencer3.1-H1 puro utilizado para generar siRNA especifica de FUT8. Ver Ejemplo 1. FIGURA 4: secuencia de sonda RNAi. Cinco secuencias se diseñaron de acuerdo con las reglas publicadas en la literatura. Las secuencias en negritas son complementarias entre si y denotan la porción de horquilla del RNA producido. Las sondas 1-5 corresponden a RNAi 1-5 en la Figura 5B . Ver Ejemplo 1. FIGURAS 5A y 5B : La FIGURA 5A muestra un esquemático de las construcciones de fusión flag-FUT8 y de longitud íntegra y las regiones sonda. LA FIGURA 5B muestra una inmunotransferencia utilizando el anticuerpo anti -flag M2 para detectar proteína FUT8 CHO parcial etiquetada con flag. Ver Ejemplo 1. FIGURA 6: Contenido de fucosa (como % de no fucosilación) de anticuerpos 2H7 a partir de células transfectadas transitoriamente con RNAi 2 y RNAi 4 como se describe en le Ejemplo 2. FIGURAS 7A-E: Actividades de enlace de anticuerpos 2H7 que tienen contenido menor de fucosa a diferentes receptores Fc/ : Fc/RI (Figura 7A) ; Fc/RIIA (Figura 7B) ,- Fc RIIB (Figura 7C) ; Fc^RIII F158 (Figura 7D) ; y Fc^RIII V158 (Figura 7E) , como se describe en el Ejemplo 2. FIGURA 8. Análisis de transferencia Northern. El mRNA FUT8 esta aproximadamente 3.5 kb similar en tamaño a FUT8 de rata. La pista 2 y la pista 3 muestran menos FUT8 que el control en la pista 1. Ver Ejemplo 2. FIGURAS 9A y 9B: Diagrama de flujo que perfila el proceso para desarrollo de ciónos con menos fucosilación. FIGURA 9A: Procedimiento de desarrollo de línea celular estándar. FIGURA 9B : Nuevo procedimiento de desarrollo de línea celular con unidad (es) RNAi incluidas en el plásmido de expresión. FIGURAS 10A, 10B y 10C. Configuración de plásmidos. FIGURA 10A: Plásmido de control establecido con el anticuerpo HC y LC en plásmidos separados; Figura 10B: Plásmidos de prueba con HC y LC en plásmidos separados que contienen una o dos unidades de transcripción RNAi; FIGURA 10C: Plásmidos de prueba con HC y LC en los mismos plásmidos que contienen uno o dos unidades de trascripción RNAi. Abreviaturas: HC, cadena pesada; LC, cadena ligera; CMV; promotores citomegalovirus y secuencia mejoradora; PUR-DHFR, puromicina y gen de fusión de dihidrofolato reductasa. Ver Ejemplo 4. FIGURAS HA y 11B: Niveles de expresión de anticuerpo de clono de transfección estable, como se describe en le Ejemplo 4. Por cada transfección de plásmido, 72 ciónos resistentes MTX se reconectaron y cribaron por ELISA para expresión de anticuerpo. FIGURA HA: Títulos de expresión de la transfección de plásmido CMV.PD.v511.RNAi4. FIGURA 11B: Títulos de expresión de la transfección de plásmido CMV. PD. v511. RNAÍ2.4.

FIGURA 12. Análisis Taqman de nivel mRNA FUT8. ARN total se purifica de ciónos derivados de CMV. PD. v511.R?AÍ4 y las transfecciones de plásmido CMV.PD.v511.R?Ai2.4. Niveles de mRNA FUT8 se midieron utilizando sebadores Taqman y sondas especificas al gen FUT8. Ver Ejemplo 4. FIGURA 13. Ensayo de densidad de siembra igual . Dos ciónos de control de la transfección de plásmido CMV.PD.v511, dos clones de transfección de plásmido CMV. PD.v511.RNAÍ4 con más baja no-fucosilación, y 4 ciónos de la transfección de plásmido CMV. PD. v511.RNAÍ2.4 con más baja no-fucosilación se sembraron a 5X104 células/pozo en una placa de 96 pozos para producción de anticuerpo. Los títulos de anticuerpos se determinan por ELISA. Ver Ejemplo 4. FIGURA 14. Niveles sin fucosilación de los anticuerpos 2H7.V511 humanizados producidos por ciónos transfectados con plásmidos RNAÍ4 o RNAÍ2.4. 2H7.v511 (v511 en la figura) con aproximadamente 5% de no fucosilación se incluye en el ensayo como control. Ver Ejemplo 4. FIGURAS 15A y 15B: Afinidades de enlace Fc^RIII de variantes de fucosilación de anticuerpo 2H7.v511 humanizado. La FIGURA 15A compara la afinidad de enlace de los anticuerpos con el isotipo de baja afinidad F158 del receptor FcRIII; Figura 15B compara la afinidad de enlace con el isotipo receptor de alta afinidad V158. El control fue h2H7.v511 con aproximadamente 5% de no fucosilación. Ver Ejemplo 4. FIGURAS 16A y 16B: Ensayo de actividad ADCC.

Dos variantes de 2H7 humanizado, es decir vl6 y v511 así como sus variantes sin fucosilación (NF) se compararon por actividad ADCC en un ensayo basado en células utilizando células WÍ12-S. Composiciones de anticuerpo 2h7.vl6 y .v511 tiene aproximadamente 5% sin fucosilación. Variantes de V16-NF y .V511-NF tiene aproximadamente 65-70% sin fucosilación. La FIGURA 16A muestra la actividad ADCC utilizando células NK donadoras VF158 en el ensayo y la Figura 16B muestra la actividad W518 utilizando células donadoras. La FIGURA 17 y muestra la secuencia de DNA (SEQ ID NO. 1) que codifica el CHO FUT8 de longitud íntegra. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE MODALIDADES PREFERIDAS El antígeno "CD20" es una fosfoproteína de transmembrana no-glicosilada con un peso molecular de aproximadamente 35 kD que se encuentra en la superficie de más de 90% de células B de sangre periférica u órganos linfoides. CD20 se expresa durante el desarrollo temprano de células pre-B y permanece hasta la diferenciación de células de plasma, no se encuentra en células madre humanas, células progenitoras linfoide o células de plasma normales. CD20 está presente tanto en células B normales como células B malignas. Otros nombres para CD20 en la literatura incluyen: antígeno de diferenciación restringido del linfocito B "B-lymphocyte-restricted differentiation antigen" y "Bp35". El antígeno CD20 se describe por ejemplo, Clark and Ledbetter, Adv. Can. Res. 52:81-149 (1989) and Valentine et al. J. Biol. Chem. 264 (19) : 11282-11287 (1989). El término "anticuerpo" se emplea en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud íntegra) , anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) , y fragmentos de anticuerpo, siempre que exhiban la actividad o función biológica deseada. La actividad biológica de los anticuerpos de enlace humanizados CD20 de la invención incluirá al menos enlace del anticuerpo a CD20 humano, más preferiblemente enlace a CD20 humano y otros de primate (incluyendo monos cinomolgus, monos rhesus, chimpancés, mandriles) . Los anticuerpos ligarán CD20 con un valor K<j no superior a 1 x 10~8, de preferencia un valor Ka no superior a aproximadamente 1 x 10"9, y son capaces de destruir o agotar células B in vivo, de preferencia en al menos 20% cuando se compara con el control negativo apropiado que no se trata con dicho anticuerpo. El agotamiento de célula B puede ser un resultado de uno o más de ADCC, CDC, apoptosis u otro mecanismo. En algunas modalidades presentes de tratamiento de enfermedad, funciones o mecanismos efectores específicos pueden ser convenientes frente a otras y ciertas variantes de 2H7 humanizado se prefieren para lograr esas funciones biológicas tales como ADCC. "Fv" es el fragmento anticuerpo mínimo que contienen un sitio de enlace y reconocimiento de antígeno completo. Este fragmento consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en una asociación cerrada, no covalente. Del plegado de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada uno de la cadena H y L) que contribuyen a los residuos amino ácido para antígenos que ligan y confieren especificidad de enlace de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable sencillo (o la mitad de un Fv que comprende solo los CDRs específicos para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y ligar antígeno, aunque una afinidad menor que el sitio de enlace completo. El término "anticuerpo monoclonal" como se emplea aquí se refiere a un anticuerpo de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos en secuencia de amino ácidos primaria y/o enlazan el o los mismos epítopes, excepto por variables posibles que pueden surgir durante producción del anticuerpo monoclonal, estas variantes en general están presente en cantidades menores. Este anticuerpo monoclonal típicamente incluye un anticuerpo que comprende una secuencia polipéptido que liga a un objetivo, en donde la secuencia de polipéptido que liga al objetivo se obtiene por un proceso que incluye la selección de una sola secuencia polipéptido de enlace del objetivo de una pluralidad de secuencias de polipéptido. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de ciónos, tales como un conjunto de ciónos de hibridoma, ciónos fago o ciónos de DNA recombinante. Habrá de entenderse que la secuencia de enlace objetivo selecta puede además ser alterada, por ejemplo para mejorar la afinidad para el objetivo para humanizar la secuencia de enlace objetivo para mejorar la producción en cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de enlace objetivo alterada también es un anticuerpo monoclonal de la invención. En contraste a las preparaciones de anticuerpo policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal se dirige contra una sola determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpo monoclonal son ventajosas ya que típicamente no están contaminadas por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población substancialmente homogénea de anticuerpos, y no se construye o considera como producción requerida del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, loa anticuerpos monoclonales a utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden elaborarse por una variedad de técnicas incluyendo por ejemplo, el método de hibridoma (por ejemplo, Kohier et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) ,-Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos DNA recombinantes (ver, por ejemplo la Patente de los E.U.A. No. 4,816,567), tecnologías de expresión en fago (ver por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2) : 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340 (5) :1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101 (34): 12467-12472 (2004); y Lee et al. J. Immunol. Methods 284 (1-2) : 119-132 (2004), y tecnologías para producir anticuerpos humanos y tipo humanos en animales que tienen parte o la totalidad de los sitios de inmunoglobulina humano o genes que codifican la secuencia de inmunoglobulina humana (ver por ejemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci.

USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255- 258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); Patentes de los E.U.A. No. 5,545,806; 5,569,825; 5,591,669 (todas de GenPharm) ; 5,545,807; WO 1997/17852; Patentes de los E.U.A. No. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); y Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol . , 13: 65-93 (1995) . "Fragmentos funcionales" de los anticuerpos de enlace CD20 de la invención son aquellos fragmentos que retienen enlace a CD20 substancialmente con la misma afinidad que la molécula de longitud íntegra intacta de la cual se derivan y muestran actividad biológica incluyendo agotar células B como se mide por ensayos in vi tro o in vivo tales como aquellos aquí descritos. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos. El dominio V media enlace de antígeno y define especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de la extensión de 110 amino ácidos de los dominios variables. Por el contrario, las regiones V consisten de tramos relativamente invariantes denominados regiones marco (FRs = framework regions) de 15 a 30 amino ácidos separados por regiones más cortas de extrema variabilidad denominadas "regiones hipervariables" cada una que son de 9 a 12 amino ácidos de largo. Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas cada uno comprenden cuatro FRs, que adoptan substancialmente una configuración de hoja ß , conectados por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan en algunos casos forman parte de la estructura de hoja ß . Las regiones hipervariables en cada cadena se sostienen unidas en proximidad inmediata por los FRs y con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace de antígeno de anticuerpos (ver Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) ) . Los dominios constantes no están involucrados directamente en el enlace de un anticuerpo con un antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . El término "región hipervariable" como se emplea aquí se refiere a los residuos amino ácido de un anticuerpo que son responsables para enlace de antígeno. La región hipervariable generalmente comprende residuos amino ácido de una "región de terminación de complementaria" o "CDR" (por ejemplo alrededor de aproximadamente los residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el VL, alrededor de aproximadamente 31-35B (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en la VH (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en la VL, y 26-32 (Hl) , 52A-55 (H2) y 96-101 (H3) en la VH (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) ) .

Como se refiere aquí, la "secuencia consenso" o secuencia de dominio V consenso, es una secuencia artificial derivada de una comparación de la secuencia amino ácido de secuencias de región variable de inmunoglobulina humana conocidas. Con base en estas comparaciones, secuencias de ácidos nucleicos recombinantes que codifican los amino ácidos de dominio V que son un consenso de las secuencias derivadas de los dominios IV del subgrupo III cadena H humana y K se prepararon. La secuencia consenso V no tiene ninguna especificidad o afinidad de enlace de anticuerpo conocida . Anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) tienen una porción de la cadena pesada y/o ligera idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la o las cadenas es idéntico con u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de estos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (patente de los E.U.A. número 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Anticuerpo humanizado como se emplea aquí, es un subconjunto de anticuerpos quiméricos. Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente o aceptor) en donde los residuos de región hipervariable del recipiente se reemplazan por residuos de región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tales como ratón, rata, conejo o primate no humano que tienen las deseadas especificidad, afinidad y capacidad. En algunos casos, los residuos de región marco Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo recipiente o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el desempeño de anticuerpo tal como afinidad de enlace. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno y típicamente dos dominios variables, en donde todo o substancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todo o substancialmente todas las regiones FR son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana aunque las regiones FR pueden incluir una o más substituciones de aminoácido que mejoran la afinidad de enlace. El número de estas substituciones de aminoácido en FR típicamente no son más que cs en la cadena H, y en la cadena L, no más a tres. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá cuando menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc) , típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para mayores detalles ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op . Struct. Biol. 2:593-596 (1992). "Funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o región Fc variante de secuencia de aminoácido) de un anticuerpo, y varían con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: enlace Clq y citotoxicidad dependiente de complemento; enlace receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC); fagocitosis, regulación de la baja de los receptores de superficie celular (por ejemplo receptor de célula B) ; y activación de célula B. "Citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en donde Ig secretado ligado en receptores Fc (FcRs) presente en ciertas células citotóxicas (por ejemplo células de estructuras naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) permiten a estas células efectuar citotóxicas ligar específicamente a una célula objetivo que contiene antígeno y extermina subsecuentemente a la célula objetivo con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" las células citotóxicas y se requieren absolutamente para este exterminio o destrucción. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan Fc RIII solamente, mientras que monocitos expresan Fc/RI, Fc/RII y Fc^RlII. La expresión FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para estimar la actividad ADCC de una molécula de interés, un ensayo ADCC in Vi tro, tal como el descrito en las patentes de los E.U.A. números 5,500,362 o 5,821,337 o de Presta la patente de los E.U.A. número No. 6,737,056 pueden realizarse. Células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC= peripheral blood mononuclear cells) y células de estructuras naturales (NK= natural killer) . En forma alterna, o adicionalmente la actividad ADCC de la molécula de interés puede estimarse in vivo, por ejemplo en un modelo de animal tal como el descrito en Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Cuando el anticuerpo es un anticuerpo de enlace CD20, la actividad ADCC puede probarse en ratones transgénicos que expresan CD20 mas CD16 humano (ratones hCD20+/hCD16+ Tg) como se describe a continuación. "Células efectoras humanas" son leucocitos que expresan una o más FcRs y realizan funciones efectoras. De preferencia, las células expresan al menos Fe/ RUI y realizan función efectora ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células de estructuras naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; con PBMCs y célula NK que se prefieren. Las células efectoras pueden ser aisladas de una fuente nativa, por ejemplo de sangre. "Receptor Fc" o "FcR" describe un receptor que liga a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Aún más, un FcR preferido es aquel que liga un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases Fc/RI, Fc/RII y Fe/ RUI incluyendo variantes alélicas y formas alternativamente de corte y empalme de estos receptores. Los receptores Fc/RII incluyen Fc/RIIA (un "receptor de activación") y Fc/RIIB (un "receptor de inhibición") que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren primordialmente en sus dominios citoplásmicos. Activar el receptor Fc/RIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunoreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico. El inhibir el receptor Fc/RIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina inmunoreceptora (ITIM) en su dominio citoplásmico (ver revisión M. in Daéron, Annu. Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)). FcRs se revisan en Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcRs incluyen aquellos a identificar en el futuro se abarcan por el término "FcR" aquí. El término también incluye el receptor neonatal FcRn que es responsable por la transferencia de IgGs maternales al feto (Guyer et al . , J. Immunol . 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol . 24:249 (1994)) y regula la homeostasis de inmunoglobulinas . WO00/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpo con enlace mejorado o disminuido a FcRs. El contenido de la publicación de patente se incorpora aquí específicamente por referencia. Ver también Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). Para afinidad de enlace a FcRn, en una modalidad, la EC50 o Kd aparente (a pH 6.0) del anticuerpo es <= 100 nM, más preferiblemente <^ 10 nM. Para afinidad de enlace incrementada a Fc/RIII (F158, i.e. isotipo de baja afinidad) en una modalidad, EC50 o Kd aparente <= 10 nM, y para FcgRIII (V158; alta afinidad) la EC50 o Kd aparente <= 3 nM. Métodos para medir enlace a FcRn se conocen (ver por ejemplo e.g., Ghetie 1997, Hinton 2004) así como se describe a continuación. El enlace a FcRn humano in vivo y la vida media en suero de polipéptidos de enlace de alta afinidad FcRn humanos puede ensayarse por ejemplo en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transfectadas que expresan FcRn humano o en primates administrados con polipéptidos variantes Fc . En ciertas modalidades, el anticuerpo 2H7 humanizado de la invención además comprende alteraciones de aminoácido en IgG Fc y exhibe incrementada afinidad de enlace para FcRn humano sobre un anticuerpo que tiene IgG Fc de tipo silvestre en al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, más preferible al menos 100 veces, de preferencia al menos 125 veces, aún más preferiblemente 150 veces hasta aproximadamente 170 veces. "Citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana u objetivo en la presencia de complemento. La activación de la ruta de complemento clásica se inicia por el enlace del primer componente del sistema de complemento (Clq) a anticuerpos (de la subclase apropiada) que se ligan a su antígeno conato. Para estimar activación de complemento, un ensayo CDC, por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202:163 (1996), puede realizarse . Variantes de polipéptido con secuencias de aminoácido de región Fc alteradas y capacidad de enlace Clq incrementada o disminuida, se describen en la patente de los E.U.A. número 6,194,551B1 y W099/51642. Los contenidos de estas publicaciones de patente se incorporan específicamente aquí por referencia. Ver también Idusogie et al. J. Immunol . 164: 4178-4184 (2000) . A través de la presente especificación y reivindicaciones, a menos que se indique de otra forma, la numeración de los residuos en los dominios constantes de una cadena pesada de inmunoglobulina es la del índice EU co o en Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) , que se incorpora expresamente aquí por referencia. El "índice EU como en Rabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo IgGl EU humano. Los residuos en la región V se numeran de acuerdo con la numeración Kabat a menos que se indique específicamente un sistema secuencial u otro de numeración. Ejemplos de anticuerpos CD20 incluyen: "C2B8", que ahora se denomina "rituximab" ( "RITUXAN®/MABTHERA®" ) (patente de los E.U.A. número 5,736,137), el anticuerpo murino 2B8 etiquetado con itrio- [90] designado "Y2B8" o "Ibritumomab Tiuxetan" (ZEVALIN®) comercialmente disponible de Biogen Idee, Inc. (por ejemplo, la patente de los E.U.A. número 5,736,137; 2B8 depositada con la ATCC bajo el número de acceso HB11388 en Junio 22, 1993); IgG2A murino "Bl", también denominado " Tositumomab" opcionalmente etiquetado con 131I para generar el anticuerpo "131I-BI" o "yodo 1131 tositumomab" (BEXXAR™) disponible comercialmente de Corixa (ver también la patente de los E.U.A. número 5,595,721); anticuerpo monoclonal murino "1F5" (por ejemplo Press et al. Blood 69 (2) : 584-591 (1987) y sus variantes incluyendo If5 humanizado o "parchado en cuadro" (e.g., WO 2003/002607, Leung, S.; ATCC depósito HB-96450) ,- anticuerpo 2H7 murino y 2H7 quimérico (por ejemplo en la patente de los E.U.A. número 5,677,180); un 2H7 humanizado (por ejemplo WO 2004/056312 (Lowman et al.) y como se establece a continuación) ; anticuerpo de alta afinidad totalmente humano HUMAX-CD20MR dirigido a la molécula CD20 en la membrana celular de células B (Genmab, Dinamarca; ver por ejemplo Glennie and van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) y Cragg et al., Blood 101: 1045-1052 (2003)),- los anticuerpos monoclonales humanos establecidos en WO 2004/035607 y WO 2005/103081 (Teeling et al., GenMab/Medarex) ,- los anticuerpos que tienen cadenas de azúcar enlazadas a N-glicósido complejas ligadas a la región Fc descrita en US 2004/0093621 (Shitara et al.); anticuerpos monoclonales y fragmentos de enlace de antígeno que ligan a CD20 (e.g., WO 2005/000901, Tedder et al.) tales como HB20-3, HB20-4, HB20-25, y MB20-11; proteínas de cadena sencilla que ligan a CD20 patente de los E.U.A. 2005/0186216 (Ledbetter and Hayden-Ledbetter); patente de los E.U.A. 2005/0202534 (Hayden-Ledbetter and Ledbetter) ; patente de los E.U.A. 2005/0202028 (Hayden-Ledbetter and Ledbetter) ; patente de los E.U.A. 2005/0202023 (Hayden-Ledbetter and Ledbetter) - Trubion Pharm Inc.); moléculas de enlace CD20 tales como la serie de anticuerpos AME, por ejemplo anticuerpos AME-133MR como se establece, por ejemplo en WO 2004/103404 y patente de los E.U.A. 2005/0025764 (Watkins et al., Applied Molecular Evolution, Inc.) y los anticuerpos CD20 con mutaciones Fc como se establece por ejemplo en WO 2005/070963 (Alian et al., Applied Molecular Evolution, Inc.); moléculas de enlace CD20 tales como aquellas descritas en WO 2005/016969 y patente de los E.U.A. 2005/0069545 (Carr et al.); anticuerpos biespecíficos como se establece por ejemplo en WO 2005/014618 (Chang et al . ) ; anticuerpos monoclonales LL2 humanizados como se describe por ejemplo en LA patente de los E.U.A. 2005/0106108 (Leung and Hansen; Immunomedics) ; anticuerpos B-Lyl quiméricos o humanizados a CD20 como se describe por ejemplo en WO2005/044859 y la patente de los E.U.A. número 2005/0123546 (Umana et al.; GlycArt Biotechnology AG) ; anticuerpo A20 o sus variantes tales como anticuerpo A20 quimérico o humanizado (cA20, hA20, respectivamente) y IMMUN-106 (e.g., patente de los E.U.A. 2003/0219433, Immunomedics) ; y anticuerpos monoclonales L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl o NU-B2 disponibles de International Leukocyte Typing Workshop (por ejemplo Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)). Los anticuerpos CD20 preferidos aquí son anticuerpos quiméricos humanizados o CD20 humanos más preferiblemente rituximab, un 2H7 humanizado, anticuerpo A20 quimérico o humanizado (Immunomedics) , anticuerpo CD20 humano HUMAX-CD20MR (Genmab) , e inmunoglobulinas/proteínas que enlazan a CD20 (Trubion Pharm Inc.) . Los términos "BR3", "polipéptido BR3 " o "receptor BR3 " cuando se utilizan aquí abarcan "polipéptidos BR3 de secuencia nativa". La secuencia BR3 humana (SEQ ID NO: 12) 1 RRGPRSLRG RDAPAPTPCV PAECFDLLVR HCVACGLLRT PRPKPAGASS PAPRTALQPQ 61 ESVGAGAGEA A P PGL FG APALLGLALV LALVLVGLVS WRRRQRRLRG ASSAEAPDGD 121 KDAPEP DKV IILSPGISDA TAPA PPPGE DPGTTPPGHS VPVPATELGS TELVTTKTAG 181 PEQQ Como se emplea aquí, "agotamiento de células B" se refiere a una reducción en niveles de células B en un humano o animal después de tratamiento con droga o anticuerpo en comparación con el nivel antes de tratamiento. Niveles de células B se miden utilizando ensayos bien conocidos tales como al obtener un conteo completo de sangre, por tinción de análisis FACS para marcadores de células B conocido y por métodos tales como se describe en los ejemplos experimentales. El agotamiento de células B puede ser parcial o completo. En una modalidad, el agotamiento de células B que expresa el CD20 es de al menos 25%. En un paciente que recibe una droga de agotamiento de células B, las células B en general se agotan por la duración de tiempo cuando la droga circula en el cuerpo del paciente y el tiempo para recuperación de las células B. Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirán con usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo y pueden incluir enzimas hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En modalidades preferidas, el anticuerpo será purificado (1) a más de 95% en peso del anticuerpo como se determina por el método Lowry, y más preferiblemente más de 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácido interna o N-terminal por el uso de un secuenciador de copa de centrifugado, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones de reducción o no reducción utilizando azul de Coomasie o de preferencia tinción de plata. Anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in si tu dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. En forma ordinaria, sin embargo, anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual se asocia ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico-anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislado es diferente en la forma o disposición en la que se encuentra en la naturaleza. Moléculas de ácido nucleico aisladas por lo tanto se distinguen de la molécula de ácido nucleico como existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que ordinariamente expresan el anticuerpo en donde por ejemplo la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosomal diferente de células naturales. La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de DNA necesarias para la expresión de una secuencia de codificación operativamente enlazada en un organismo anfitrión particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de enlace ribosoma. Células eucarióticas se conocen que utilizan promotores, señales de poliadenilación y mejoradores. Ácido nucleico se "enlaza operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para una pre-secuencia o líder secretorio se enlaza operativamente con DNA para un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador se enlaza operativamente con una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace ribosoma se enlaza operativamente a una secuencia de codificación si se ubica para facilitar la traducción. En general "enlazado operativamente" significa que las secuencias de DNA que se enlazan son contiguas y en el caso de un líder secretorio contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los mejoradores no tienen que ser contiguos. El enlace se logra por ligación en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, los adaptadores de oligonucleótidos sintéticos o enlazadores se utilizan de acuerdo con la práctica convencional . "Vector" incluye vectores transportadores y de expresión. Típicamente, la construcción de plásmido también incluirá un origen de replicación (por ejemplo el origen ColEl de replicación) y un marcador seleccionable (es decir de resistencia a tetraciclina o ampicilina) , para replicación y selección, respectivamente, de los plásmidos en bacterias. Un "vector de expresión" se refiere a un vector que contiene las secuencias de control o elementos regulatorios necesarios para expresión de los anticuerpos incluyendo fragmentos de anticuerpos de la invención, en células bacterianas o eucarióticas. Vectores convenientes se describen a continuación. La célula que produce un anticuerpo de enlace CD20 humanizado tal como un anticuerpo 2H7 humanizado de la invención incluirá las células anfitrionas bacteriales y eucarióticas en las cuales el ácido nucleico que codifica los aminoácidos se han introducido. Células anfitrionas convenientes se describen a continuación. La palabra "etiqueta" cuando se emplea aquí, se refiere a un compuesto o de composición detectable que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo. La etiqueta misma puede ser detectable por sí misma (por ejemplo etiquetas radioisótopo o etiquetas fluorescentes) o en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable. Métodos y Composiciones de la Invención Interferencia RNAi RNAs de doble hebra largos (dsRNAs ; típicamente >200 nt) pueden emplearse para silenciar la expresión de genes objetivo en una variedad de tipos de organismos y células (por ejemplo gusanos, moscas de las frutas y plantas) . Ante introducción, los dsR?As largos entran a una ruta celular que comúnmente se refiere como la ruta de interferencia R?A (R?Ai) . Primero, los dsR?As se procesan en R?As de interferencia pequeñas (siR?As) de 20 a 25 nucleótidos (nt) por una enzima tipo R?asa III denominada gaiser (etapa de iniciación) . Después, el siRNAs se ensamblan en complejos que contienen endoribonucleasa conocidos como complejos de silenciado inducidos por RNA (RISCs) , que se despliegan en el proceso. Las hebras siRNA subsecuentemente guían los RISCs a moléculas RNA complementarias, en donde escinden y destruyen el RN conato (etapa efectora) . La escisión de R?A conato se lleva a cabo cerca de la mitad de la región ligada por la hebra siRNA que lleva a silenciado de gen específico. Sin embargo, ya que la mayoría de las células de mamífero montan una potente respuesta antiviral caracterizada por inhibición no específica de síntesis de proteína y degradación de R?A anti introducción de dsR?A más largos que 30 bp, los investigadores transfectan células con siRNA de 21 a 23 bp para inducir R?Ai en estos sistemas, sin producir la respuesta antiviral. En el presente método de la invención al menos un RNA dsR?A específico se hace blanco en una transcripción de gen en particular (FUT8 en este caso) se utiliza para inducir la ruta R?Ai. El sR?A se suministra a la célula por cualquier sistema de suministro dsR?A conveniente. Un control negativo apropiado sería un dsRNA que no hace blanco en ninguna transcripción en el organismo (por ejemplo dsRNA que hace blanco en luciferasa) . En el presente método de la invención, al menos un dsRNA específico que hace blanco en una transcripción de gen particular (FUT8 en este caso) se utiliza para inducir la vía o ruta R?Ai. En células cultivadas de mamífero, R?Ai típicamente se induce por siR?A introducido directamente o expresado como una estructura de horquilla de una construcción D?A dentro de las células . Métodos para producir siR?A Hay 5 métodos comúnmente conocidos para generar siR?A para estudios de silenciado de genes: (i) síntesis química; (ii) transcripción in vi tro; (iii) digestión de dsR?A largos por una enzima de la familia R?asa III (por ejemplo Dicer, R?ase III); (iv) expresión en células de un plásmido de expresión siRNA o vector viral; y (vi) expresión en células de un cassettte de expresión siRNA derivado de PCR. Los primeros tres métodos involucran preparación in vitro de siRNAs que se introduce directamente en células de mamífero por lipofección, electroporación u otra técnica. Los últimos dos métodos se basan en la introducción de vectores basados en D?A y cassettes que expresan siRNAs dentro de las células. Todos estos métodos, excepto la creación de poblaciones de siR?As por digestión de dsR?As largos, requieren diseño cuidadoso del siR?As para llevar al máximo silenciado de gen objetivo mientras que se minimiza los efectos en genes fuera del objetivo. La síntesis química es el método preferido y más ampliamente empleado de preparación de siRNAs para transfección transitoria de células de mamífero cultivadas seguido por un ensayo corriente bajo para supervisar el efecto de RNAi. siRNAs son más fáciles de transfectar que los plásmidos. Vectores de expresión siRNA ejemplares son los vectores de expresión siRNA pSilencerMR de Ambion, Inc., (Austin, Texas) que expresan siRNA dentro de células de mamífero que utilizan un promotor U6 (Kunkel and Pederson, 1988; Miyashi and Taira, 2002) o promotor Hl Polimerasa III. Por ejemplo, pSilencer 3.0-H1 (componentes plásmidos no mostrados en la Figura 3) caracteriza al promotor Hl RNA (Hl RNA es un componente RNase P) . Diversos marcadores seleccionables tales como higromicina, neomicina, puromcina pueden incluirse en estos vectores. Los vectores de expresión pSilencer 2.0-U6 y 3.0-H1 siRNA son linearizados con BamH I y Hind III, que dejan salientes que facilitan la clonación direccional. Para producir silenciado, un pequeño inserto de DNA que codifica un RNA de horquilla corto que hace blanco al gen de interés se clona en el vector corriente abajo del promotor Pol III. Una vez transfectado en células de mamífero, el vector que contiene inserto expresa el RNA de horquilla corto que se procesa rápidamente por la maquinaria celular en siRNA. Suministro de siRNAs en Células Cultivadas Para muchas líneas celulares inmortalizadas, la transfección siRNA puede realizarse con un reactivo basado en lípido o amina, por ejemplo los agentes de transfección de lípido siPORTMR Lipid y de amina siPORTMR Amine de Ambion. Para suministro en células primarias y células de suspensión, electroporación que utiliza un amortiguador especializado, ligero en las células y condiciones de pulsado optimizadas en general resultan en un suministro de siRNA muy eficiente sin comprometer la viabilidad celular. Controles para Experimentos de siRNA Un control negativo que no hace blanco en ninguna transcripción endógena (por ejemplo dsRNA que hace blanco en luciferasa) es útil para controlar efectos no específicos en expresión de genes provocados al introducir cualquier siRNA. Controles positivos fáciles de ensayar son útiles para optimizar condiciones de transfección, asegurar que siRNAS se suministre de forma eficiente y evaluar que trabaje un ensayo corriente abajo particular. Ya que controles positivos se utilizan para muchos aspectos diferentes de un experimento RA i , a menudo más de un control se requiere. Para experimentación de optimización de transfección, GAPDH siRNA Silence1™ es un control positivo ideal. Este siRNA silencia eficientemente la expresión GAPDH y sus efectos pueden fácilmente supervisarse por qRT-PCR u otros métodos a nivel mRNA o por transferencia Western o immunofluorescencia al nivel de proteína. Ensayo para Efecto de R?Ai Hay varios ensayos para medir el efecto de RNAi . Ensayos que pueden emplearse para comprender los efectos biológicos de eliminación de un gen objetivo incluyen ensayos basados en células, ensayos enzimáticos, análisis de colecciones ordenadas. siRNA ejercen sus efectos al nivel mR?A. El ensayo más simple para validación y optimización y transfección de siR?A se basan en qRT-PCR para medir niveles de transcripción objetivo en células tratadas con siR?A específicas de gen contra células tratadas siR?A de control negativo. Ensayos de expresión de gen TaqMan® de Applied Biosystems ' , disponible para Genes Expression Assays, humanos, de ratón y de rata, también son útiles para este propósito. Base de datos siR?A de Ambion proporciona enlaces a ensayos individuales acoplados a siR?As Pre diseñados y Validados SilenceA1 específicos de gen. La extensión de eliminación a nivel de proteína también puede estimarse. Ya que la proteína nativa se recupera en la mayoría de los casos, ensayos enzimáticos también pueden realizarse. siRNA, mRNA objetivo y en niveles de proteína objetivo también pueden correlacionarse. Los anticuerpos de la invención comprenden regiones IgG Fc y ligan normalmente a Fc/RIIIA y exhiben ADCC in vitro e in vivo. La célula anfitriona de mamífero comúnmente empleada para producir anticuerpos que tienen una región IgG Fc o su fragmento que retienen un sitio de glicosilación Asn y función efectora ADCC, generalmente producen una población de anticuerpos de los cuales 94 a 98% de los anticuerpos monoclonales en la población se fucosilan. Las células transfectantes generadas por el método de la presente invención y expresan 2 o más siRNA hacen blanco al gen FUT8 producen una población del anticuerpo deseado que tiene un nivel de fucosilación reducido comparado con la población de anticuerpos producida por las células anfitrionas que tienen expresión FUT8 normal, sin modificar y como resultado, la población fucosilada reducida de anticuerpos como un todo es capaz de Fc/RIIIA mejorado y/o ADCC en la presencia de células efectoras apropiadas. En una modalidad, los anticuerpos de fucosilación reducidos producidos por el método de la invención ligan CD20, en particular CD20 de primate. En una modalidad, estos anticuerpos ligan CD20 humano. En una modalidad, la invención proporciona anticuerpos 2H7 humanizados que tienen fucosa reducida que se genera por los métodos de la invención. La generación de anticuerpos hu2H7 se describe en detalle en WO 04/056312 aquí incorporada por referencia en su totalidad. En modalidades específicas, la variante es 2H7.V16, hu2H7.v511 y hu2H7.vll4. En un anticuerpo de longitud íntegra, el anticuerpo de enlace CD20 humanizado de la invención comprenderá un dominio V humanizado unido a un dominio C de una inmunoglobulina humana. En una modalidad preferida, la región C de cadena H es de IgG humano, de preferencia IgGl o IgG3. El dominio C de cadena L de preferencia es de cadena K humana. Para los presentes propósitos, "2H7 humanizado" se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo intacto que comprende la secuencia ligera variable (VL) : DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 2) ; la secuencia pesada variable (VH) : EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGD TSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO : 8) En donde el anticuerpo 2H7 humanizado es un anticuerpo intacto, de preferencia comprende la secuencia de aminoácidos de cadena ligera vl6: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 13) ; y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGD TSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 14) . Una variante de 2H7 mAb humanizado precedente es 2H7v.31 que tiene la misma secuencia de cadena L que SEQ ID NO: 13 y comprende la secuencia de aminoácidos de cadena H: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP GKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR WY YSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEV KFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIA ATI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 15) . Otra variante del anticuerpo 2H7 humanizado precedente es aquélla que comprende la VL de SEQ ID NO. 25. DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO. 25) ; y la VH de SEQ ID NO. 22 de 2H7.vll4: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGA TSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSASYWYFDVWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO. 22) La secuencia de aminoácidos de cadena L completa de 2H7v.ll4 tiene la siguiente secuencia DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGV PSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPS DEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 26) La secuencia de aminoácidos de cadena H completa de 2H7v.ll4: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG YTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQM NSL RAEDTAVYYCARWYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTY ICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTC VWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRWSVLTVLHQDWLNGKE YKC SNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE W NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS L SPGK (SEQ ID NO: 27) Todavía otra variante es 2H7.vl38 que comprende la secuencia de aminoácidos de cadena H de SEQ ID NO. 26. Una variante adicional, 2El . v4.ll , comprende la VL de SEQ ID NO . 25 y la VH de SEQ ID NO . 22 y tiene la secuencia de aminoácidos de cadena H : EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG YTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQM NSL RAEDTAVYYCARWYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTY ICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTC VWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRWSVLTVLHQDWLNGKE YKC KVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHWHYTQ KSL SLSPGK (SEQ ID NO: 31) . Todavía otra variante del anticuerpo 2H7 humanizado precedente es aquélla que comprende la VL de SEQ ID NO. 25 y VH de SEQ ID NO. 33 de 2H7.v511 [ver Tabla 4] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGA TSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSYRYWYFDVW GQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 33) En una modalidad, el anticuerpo comprende la Cadena Ligera 2H7.V511 (SEQ ID NO.26) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGV PSR FSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI F PPS DEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Y l a Cadena Pesada 2H7 . v511 ( SEQ ID NO . 34 ) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGA TSY NQKFKGRFTI SVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSYRYWYFDVWGQGTL VTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELL GGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQ YNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLP PSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLSKLTVD KS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG La región V de todas las otras variantes con base en la versión 16 tendrá la secuencia de aminoácidos que vl6 excepto en las posiciones de sustituciones de aminoácido que se indican en la Tabla 3 siguiente. A menos que se indique de otra forma, las variantes 2H7 tendrán la misma cadena L que la de vl6. El anticuerpo humanizado 2H7v.l6 también se refiere como rhuMAb2H7, PRO70769 o Ocrelizumab. TABLA 3 S298A, E333A, K334A, E356D, 115 M32L, S92A D56A, NIOOA M358L S298A, K334A, 116 M32L, S92A D56A, NIOOA K322A S298A, E333A, 138 M32L, S92A D56A, NIOOA K334A, K326A S298A, E333A, K334A, K326A, 477 M32L, S92A D56A, NIOOA N434W 375 - - K334L D56A, N100Y, S298A, E333A, 511 M32L, S92A SlOOaR K334A, K326A, S298A, E333A, 588 - - K334A, K326A TABLA 4 La numeración de residuos es de acuerdo con Kabat et al . , Sequences of Immunological Interest . 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) , con inserciones mostradas como a, b, c, d y e y espacios mostrados como guiones en las figuras de secuencia. En el enlace CD20 anticuerpos que comprenden la región Fc, la lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fc pueden retirarse por ejemplo durante purificación de Ab o por ingeniería recombinante del ácido nucleico que codifica el polipéptidos de anticuerpo. De acuerdo con esto, una composición de anticuerpo 2H7 humanizada de ésta invención puede comprender el anticuerpo con K447, con todo K447 retirado, o una mezcla de anticuerpo con y sin el residuo K447. El sitio de N-glicosilación en IgG está en Asn297 en el dominio CH2. Composiciones de anticuerpo 2H7 humanizadas de la presente invención incluyen composiciones de cualquiera de los anticuerpos 2H7 humanizado precedentes que tiene una región Fc , en donde aproximadamente 80-100% (y de preferencia 90-99%) del anticuerpo en la composición comprenden una estructura carbohidrato núcleo madura que carece de fucosa, conectada a la región Fc de la glicoproteína. Estas composiciones aquí se demostró que exhiben una mejora sorprendente para ligar a Fc/ RIIIA(F158) , que no es tan efectiva como Fc/RIIIA (V158) para interactuar con IgG humano. Fc/RIIIA (F158) es más común que Fc/RIIIA (V158) en AfroAmericanos y Caucásicos normales, sanos. Ver Lehrnbecher et al. Blood 94:4220 (1999). Un anticuerpo 2H7 humanizado biespecífico abarca un anticuerpo en donde un brazo del anticuerpo tiene cuando menos una región de enlace de antígeno de la cadena H y/o L de un anticuerpo 2H7 humanizado de la invención, y el otro brazo tiene especificidad de enlace de región V para un segundo antígeno. En modalidades específicas, el segundo antígeno se elige del grupo que consiste de ligandos de activación CD3 , CD64 , CD32A, CD16, NKG2D u otro NK.

En ciertas modalidades, el anticuerpo 2H7 humanizado de la invención además comprende alteraciones de amino ácido en el IgG Fc y exhibe incrementada afinidad de enlace para FcRn humano sobre un anticuerpo que tiene IgG Fc de tipo silvestre, en al menos 60 veces, al menos 70 veces, en al menos 80 veces, más preferible al menos 100 veces, preferiblemente al menos 125 veces, aún más preferible al menos 150 veces hasta aproximadamente 170 veces. La expresión de FUT8 se inhibe o elimina si el nivel de transcripciones FUT8 o proteína en la célula transfectada siRNA se reduce en forma medible en comparación con el nivel en el mismo sin transfección y expresión del siRNA inhibitorio de FUT8. Transcripciones FUT8 o proteína en la célula y el contenido de fucosa de los anticuerpos producidos puede cuantificarse por los métodos descritos a continuación. De preferencia, el nivel de inhibición de la expresión FUT8 resulta en una reducción en el nivel de fucosilación de los anticuerpos en la composición por al menos 65%, de preferencia en 75-80%, más preferiblemente por 90%, aún más preferible por 95% o 99%. Promotores útiles para dirigir la expresión siRNA son promotores tipo Pol III tales como el promotor Hl o U6. También pueden emplearse promotores tRNA .

Células anfitrionas incluirán células eucarióticas tales como células de mamíferos y plantas.

De preferencia, la célula anfitriona es una célula de mamífero tal como una célula CHO pero se proporcionan otras células anfitrionas convenientes. Enlace Fc/RIII y/o ADCC se mejora si el anticuerpo exhibe un nivel de enlace y actividad ADCC incrementada sobre la del mismo anticuerpo producido en la célula huésped con función de gen FUT8 normal sin eliminación FUT8 y RNAi . Métodos para medir enlace Fc/R y ADCC se describen a continuación. Producción de Anticuerpos Anticuerpos Monoclonales Anticuerpos monoclonales pueden elaborarse utilizando el método de hibridoma primero descrito por Kohier et al., ?ature, 256:495 (1975), o pueden elaborarse por métodos de AD? recombinante (patente de los E.U.A. ?o. 4,816,567). En el método de hibridoma, un ratón u otro animal anfitrión apropiado, tal como un hámster, se inmuniza como se describió anteriormente para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que ligarán específicamente con la proteína utilizada para inmunización. En forma alterna, pueden inmunizarse linfocitos in vi tro . Después de inmunización, se aislan linfocitos y después se fusionan con una línea celular de mieloma utilizando un agente de fusión conveniente, tal como polietilen glicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Anticuerpos: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986) ) . Las células de hibridoma así preparadas se siembran y desarrollan en un medio de cultivo conveniente este medio de preferencia contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma precursoras no fusionadas (también referidas como socio de fusión) . Por ejemplo, si las células de mieloma precursoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo selectivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , estas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT. Células de mieloma socias de fusión preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan producción de alto nivel estable de anticuerpo por células que producen anticuerpos selectos, y son sensibles a un medio selectivo que elige contra células precursoras no fusionadas. Líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de mieloma murino, tales como aquellos derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y SP-2 y derivados por ejemplo células X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Líneas celulares de mieloma humano y heteromielo a de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984); and Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Medio de cultivo en donde células de hibridoma se desarrollan, se ensaya para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. De preferencia, la especificidad de enlace de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de enlace in vi tro, tal como radioin uno ensayo (RÍA) o ensayo inmunosorbente enlazado por enzima (ELISA) . La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede por ejemplo, ser determinada por análisis Scatchard descrito en Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980) . Una vez que las células de hibridoma que producen anticuerpos de las deseadas especificidad, afinidad y/o actividad se identifican, los ciónos pueden ser subclonados al limitar los procedimientos de dilución y crecimiento por métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Medios de cultivo convenientes para este propósito incluyen por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden desarrollarse in vivo como tumores de ascitos en un animal por ejemplo por inyección i.p. de las células en ratones. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclonos se separan convenientemente del medio de cultivo, fluido ascitos, o suero por procedimiento de purificación de anticuerpos convencionales tales como por ejemplo, cromatografía de afinidad (por ejemplo, utilizando proteína A o proteína G-Sepharose) o cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de hidroxilapatita, o electroforesis en gel, diálisis, etc. DNA que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al utilizar sondas oligonucleótido que son capaces de ligar específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos) . Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de este DNA. Una vez aislado, el DNA puede colocarse en vectores de expresión, que se transfectan entonces en células anfitrionas tales como células de E. coli , células COS de simio, células de Ovario de Hámster Chino (CHO) , o células de mieloma que de otra forma no producen proteína de anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células anfitrionas recombinantes. Artículos de revisión en expresión recombinante en bacterias de DNA que codifica el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol . , 5:256-262 (1993) and Plückthun, Immunol. Revs . , 130:151-188 (1992). En una modalidad adicional, anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de bibliotecas fago de anticuerpo generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen aislamiento de anticuerpos murinos y humanos respectivamente, utilizando bibliotecas fago. Publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) mediante entremezclado de cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construcción de bibliotecas fago muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). De esta manera, estas técnicas son alternativas viables a técnicas de hibridoma-anticuerpo monoclonal tradicionales para aislamiento de anticuerpos monoclonales. El DNA que codifica el anticuerpo puede ser modificado para producir polipéptidos de anticuerpo de fusión o quiméricos, por ejemplo al sustituir frecuencias de dominio constante de cadena pesada y cadena ligera (CH y CL) para las secuencias murina homologas (patente de los E.U.A. No. 4,816,567; y Morrison, et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o por fusión de la secuencia de codificación inmunoglobulina con todo o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no-inmunoglobulina (polipéptido heterólogo) . Las secuencias de polipéptido no-inmunoglobulina pueden sustituir los dominios constantes de un anticuerpo, o se substituyen por los dominios variables de otro sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente. Anticuerpos Humanizados Métodos para humanizar anticuerpos no humanos se han descrito en la técnica. De preferencia, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos amino ácidos introducidos en el de una fuente que no es humana. Estos residuos amino ácido no humanos a menudo se refieren como residuos de "importación", que típicamente se toman de un dominio variable de "importación". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), al sustituir secuencias de región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De acuerdo con esto, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de los E.U.A. No. 4,816,567) en donde substancialmente menos que un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no-humana. En la práctica, anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en donde algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. La selección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a utilizarse para producir los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad y respuesta HAMA (anticuerpo humano anti-ratón) cuando el anticuerpo se pretende para uso terapéutico humano. De acuerdo con el método de "mejor ajuste" así denominado, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo roedor se criba contra la biblioteca completa de secuencias de dominio variable humano conocidas. La secuencia de dominio V humano que es más cercana a la del roedor se identifica y la región marco humano (FR) en su interior aceptado para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol . , 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro método utiliza una región marco particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco puede utilizarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol . , 151:2623 (1993) ) . Además es importante que anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad de enlace para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, de acuerdo con un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de la secuencia precursora y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias precursoras y humanizadas. Modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para aquellos con destreza en la técnica. Programas de computadora están disponibles que ilustran y exhiben estructuras de conformación tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidato selectas. La inspección de estas exhibiciones permite análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, es decir el análisis de residuos que influencian la capacidad de inmunoglobulina candidato para ligar a su antígeno. De esta manera, residuos FR pueden seleccionarse y combinarse de las secuencias recipiente e importación de manera tal que la característica de anticuerpo deseada, tal como afinidad incrementada para el o los antígenos objetivo, se logra. En general, los residuos de región hipervariable están involucrados directa y más substancialmente para influenciar el enlace de antígeno. El anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como Fab, que se conjuga opcionalmente con uno o más agentes citotóxicos a fin de generar un inmunoconjugado . En forma alterna, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo de longitud íntegra, tal como un anticuerpo IgGl de longitud íntegra. Anticuerpos humanos y metodología de expresión en fago Como una alternativa a humanización, pueden generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, ante inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigota del gen de región de unión de cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones mutantes de línea germinal y quiméricos resulta en inhibición completa en la producción de anticuerpo endógena. La transferencia del conjunto de gen inmunoglobulina de línea germinal humana en estos ratones mutantes de línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos ante reto o prueba con antígeno. Ver, por ejemplo Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); patentes de los E.U.A. Nos. 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (all of GenPharm) ; 5,545,807; y WO 97/17852. En forma alterna, la tecnología de expresión en fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553

[1990]) puede utilizarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vi tro, a partir de repertorios de gen de dominio variable de inmunoglobulina (V) para donadores no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, genes de dominio de anticuerpo V se clonan en cuadro ya sea en un gen de proteína de revestimiento mayor o menor de bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y exhiben como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula fago. Debido a que la particular filamentosa contiene una copia de DNA de una sola hebra del genoma fago, selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe estas propiedades. De esta manera, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La expresión en fago puede realizarse en una variedad de formatos, revisada en Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J. , Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Varias fuentes de los segmentos de gen V pueden utilizarse para expresión en fago . Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aislan un conjunto diverso de anticuerpos anti -oxazolona de una pequeña biblioteca de combinación aleatoria de genes V deriva de los bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V de donadores humanos no inmunizados puede construirse y anticuerpos a un conjunto diverso de antígenos (incluyendo auto-antígenos) pueden aislarse esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Ver, también, las patentes de los E.U.A. Nos. 5,565,332 y 5,573,905. Como se discutió anteriormente, anticuerpos humanos también pueden ser generados por células B activadas in vi tro (ver Patentes de los E.U.A. números 5,567,610 y 5,229,275) . Fragmentos de Anticuerpo En ciertas circunstancias, hay ventajas de utilizar fragmentos de anticuerpo en vez de anticuerpos enteros. El tamaño menos de los fragmentos permite una liberación rápida y puede llevar a un acceso mejorado a tumores sólidos. Diversas técnicas se han desarrollado para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver por ejemplo Morimoto et al . , Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente por células anfitrionas recombinantes. Fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv todos pueden expresarse en y secretarse de E. coli , permitiendo de esta manera la fase y producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las bibliotecas fago de anticuerpos discutidas anteriormente. En forma alterna, fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y copiarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente de cultivo de células anfitrionas recombinantes. Fragmento Fab y F(ab')2 con un incremento en vida media in vivo que comprenden residuos de epítope de enlace de reciclaje o recuperación como se describe en la Patente de los E.U.A. número 5,869,046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán aparentes al practicante con destreza. En otras modalidades, el anticuerpo de selección es un fragmento Fv (scFv) de cadena sencilla. Ver WO 93/16185; Patente de los E.U.A. número 5,571,894; y Patente de los E.U.A. número 5,587,458. Fv y sFv son las únicas especies con sitios de comunicación intactos que están carentes de regiones constantes; de esta manera son adecuadas para enlace no especifico reducido durante uso in vivo . Proteínas de fusión svF pueden construirse para dar fusión de una proteína efectora, ya sea en el extremo amino o carboxi de un svF. Ver Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo linear", por ejemplo, como se describe en la Patente de los E.U.A. número por ejemplo.

Estos fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos. Anticuerpos biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace para al menos dos epítopes diferentes. Anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden ligar a dos epítopes diferentes de la proteína CD20. Otros de estos anticuerpos pueden combinar un sitio de enlace CD20 con un sitio de enlace para otra proteína. En forma alterna, un brazo anti-CD20 puede combinarse con un brazo que liga a una molécula de activación en un leucocito tal como una molécula receptora de célula T (por ejemplo CD3 ) , o receptores Fc para IgG (Fc/R), tales como Fc/RI (CD64), Fc/RII (CD32) y Fc/RIII (CD16) , o NKG2D u otro ligando de activación de célula NK, para enfocar y localizar mecanismos de defensa celular a la célula que expresa CD20. Anticuerpos biespecíficos también pueden emplearse para localizar agentes citotóxicos con células que expresan CD20. Estos anticuerpos poseen un brazo de enlace CD20 y un brazo que liga el agente citotóxico (por ejemplo saporina, anti-interferona- a , vinca alcaloide, cadena ricina A, metotrexato o hapteno isótopo radioactivo) . Anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud íntegra o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo anticuerpos biespecíficos F(ab')2). WO 96/16673 describe un anticuerpo anti-ErbB2/anti-Fc/ RUI biespecífico y la Patente de los E.U.A. número 5,837,234 describe un anticuerpo anti-ErbB2/anti-Fc/ Rl biespecífico. Un anticuerpo anti-ErbB2/Fc/ biespecífico se ilustra en WO98/02463. La Patente de los E.U.A. número 5,821,337 ilustra un anticuerpo anti-ErbB2/anti-CD3 biespecífico. Métodos para producir anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. Producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud íntegra se basa en la coexpresión de dos pares de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido al surtido al azar de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. Purificación de la molécula correcta, que usualmente se realiza por etapas de cromatografía de afinidad, es más bien problemática, y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares se describen en WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) .

De acuerdo con un enfoque diferente, dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación de antígeno-anticuerpo) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. De preferencia, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada Ig, que comprende al menos parte de las regiones bisagra CH2 , y CH3. Se refiere a tener la primer región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para el enlace de cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. DNAs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina, y si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan en una célula anfitriona conveniente. Esto proporciona mayor flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipéptido en modalidades en donde proporciones diferentes de las tres cadenas polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan el rendimiento óptimo del anticuerpo biespecífico deseado. Sin embargo es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas polipéptido en un solo vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipéptido en iguales proporciones resulta en alto rendimiento o cuando las proporciones no tienen efectos significante en el rendimiento de la combinación de cadena deseada . En una modalidad preferida de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de enlace en un brazo, y un par de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina híbrido (que proporciona una segunda especificidad de enlace) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena inmunoglobulina indeseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo la mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma fácil de separación. Este enfoque se describe en WO 94/04690. Para mayores detalles en generar anticuerpos biespecíficos ver por ejemplo Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986). De acuerdo con otro enfoque descrito en la Patente de los E.U.A. número 5,731,168, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo puede ser sometida a ingeniería para llevar al máximo el por ciento de heterodímeros que se recuperan de cultivo celular recombinante. La interfase preferida comprende cuando menos una parte del dominio CH3. En este método, una o más cadenas laterales aminoácido pequeñas de la interfase de la primer molécula de anticuerpo se reemplazan con más grandes cadenas laterales (por ejemplo tirosina o triptofano) . "Cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la o las cadenas laterales grandes se crean en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar grandes cadenas laterales de aminoácido con menores (por ejemplo alanina o trionina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales indeseados tales como homodímeros. Anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos entrelazados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse con avidina, el otro con biotina. Estos anticuerpos por ejemplo se ha propuesto que hacen blanco en células del sistema inmune con células indeseadas (Patente de los E.U.A. número 4,676,980), y para el tratamiento de infección HIV (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089). Anticuerpos heteroconjugados pueden elaborarse utilizando cualesquiera métodos de entrelazamiento convenientes. Agentes de entrelazamiento adecuado son bien conocidos en la técnica, y se describen en la Patente de los E.U.A. número 4,676,980, junto con una cantidad de técnicas de entrelazamiento . Técnicas para generar anticuerpos biespecíficos de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos pueden prepararse utilizando enlace químico. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describe un procedimiento en donde anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente acomplejante ditiol, arsenito de sodio, para estabilizar ditioles vecinales y evitar formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados después se convierten en derivados-tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab' -TNB después se convierte al Fab' -tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. El reciente avance ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E . coli , que puede acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describe la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico totalmente humanizada. Cada fragmento Fab' fue secretado separadamente de E. coli y sometido a acoplamiento químico dirigido in vi tro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de ligar a células que sobre expresan el receptor ErbB2 y células T humanas normales, así como disparar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos de tumor de mama humanos . Diversas técnicas para producir y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos directamente de cultivo celular recombinante también se han descrito. Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos se han producido utilizando cremalleras leucina. Kostelny et al., J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se ligaron con las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión de gen. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después reoxidan para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) , ha proporcionado un mecanismo alterno para producir fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Los fragmentos comprenden un VH conectado a un VL por un enlazador que es muy corto. Para permitir apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. De acuerdo con esto los dos dominios VH y V de un fragmento se fuerzan para aparear con los dominios complementarios VL y VH de otro fragmento, de esta manera formando dos sitios de enlace de antígeno. Otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpo biespecíficos por el uso de dímeros de cadena sencilla Fv (sFv) también se ha reportado. Ver Gruber et al., J. Immunol . , 152:5368 (1994) . Anticuerpos con más de dos valencias se contemplan. Por ejemplo, anticuerpos triespecífieos pueden prepararse. Tutt et al. J. Immunol . 147: 60 (1991) . Anticuerpos mul tivalentes Un anticuerpo multivalente puede ser internalizado (y/o catabolizado) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno a la cual ligan los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son diferentes a la clase IgM) con tres o más sitios de enlace de antígeno (por ejemplo anticuerpos tetravalentes) que pueden producirse fácilmente por expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de enlace de antígeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste de) una región Fc o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fc y tres o más sitios de enlace de antígeno aminoterminales a la región Fc . El anticuerpo multivalente preferido aquí comprende (o consiste de) tres a aproximadamente ocho, pero de preferencia cuatro sitios de enlace de antígeno. El anticuerpo multivalente comprende cuando menos una cadena polipéptido (y de preferencia dos cadenas polipéptido) en donde la o las cadenas polipéptido comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la o las cadenas polipéptido pueden comprender VDl-(Xl)n-VD2- (X2) n-Fc, en donde VDl es un primer dominio variable. VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una cadena polipéptido de una región Fc, XI y X2 representan un aminoácido o polipéptido y n es 0 o 1. Por ejemplo, la o las cadenas polipéptido pueden comprender: cadena de región VH-CH1 -enlazador flexible-VH-CHl-Fc, o cadena de región VH-CHl-VH-CHl-Fc . El anticuerpo multivalente aquí de preferencia además comprende cuando menos dos (y de preferencia cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente aquí por ejemplo puede comprender de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados aquí comprenden un dominio variable de cadena ligera y en forma óptima además comprenden un dominio CL. Otras modificaciones de secuencia de aminoácido Modificación (es) de secuencia de aminoácido de los anticuerpos de enlace CD20 aquí descritos se contemplan. Por ejemplo, puede ser conveniente el mejorar la afinidad de enlace y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Variantes de secuencia de aminoácido del anticuerpo CD20 se preparan al introducir cambios de nucleótido apropiados en el ácido nucleico de anticuerpo anti-CD20 o por síntesis de péptido. Estas modificaciones incluyen por ejemplo de lesiones de y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácido del anticuerpo anti-CD20. Cualquier combinación de deleción, inserción, y sustitución se hace para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también alteran los procesos post-traducción del anticuerpo anti-CD20, tales como cambiar el número o posición de sitios de glicosilación. Un método útil para identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo anti-CD20, que son sitios preferidos para mutagénesis se denomina "mutagénesis de exploración de alanina" como se describe por Cunningham and Wells in Science, 244:1081-1085 (1989) . Aquí, un residuo o grupo de residuos objetivo se identifican (por ejemplo residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y reemplazan por aminoácido cargado negativamente o neutro (más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con antígeno CD20. Esas ubicaciones aminoácido demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones son entonces refinadas al introducir más u otras variantes en, o para los sitios de sustitución. De esta manera, mientras que el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácido es predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no requiere ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio determinado, mutagénesis aleatoria o de exploración ala se conduce en el codón o región objetivo y las variantes de anticuerpo anti-CD20 expresadas son cribadas para la actividad deseada. Inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales en el rango de longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos así como inserciones intrasecuencia de residuos aminoácidos sencillos o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo anti-CD20 con un residuo metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo anti-CD20 incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo anti-CD20 a una enzima (por ejemplo ADEPT) o un polipéptido que incrementa la vida media en suero del anticuerpo . Otro tipo de variante es una variante de substitución de amino ácido. Estas variantes tienen cuando menos un residuo amino ácido en la molécula de anticuerpo anti-CD20 reemplazada por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para mutagenesis de substitución incluyen las regiones hipervariables, pero alteraciones FR también se contemplan. Substituciones conservadoras se ilustran en la Tabla siguiente bajo el encabezado de "substituciones preferidas". Si estas substituciones resultan en un cambio en actividad biológica, entonces cambios más substanciales, denominados "substituciones ejemplares" en la Tabla, o como se describe adicionalmente a continuación con referencia a las clases de amino ácido, podrán introducirse y los productos cribarse. TABLA de Substi tuciones de Amino Ácidos Modificaciones substanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se logran al seleccionar substituciones que difieren- significativamente en su efecto para mantener (a) la estructura principal del polipéptido en el área de la substitución, por ejemplo como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo o (c) el volumen de la cadena lateral. Residuos de origen natural se dividen en grupos con base en propiedades de cadena común: (1) hidrofóbica: norleucina met; ala; val; leu; ile; (2) hidrofílica neutra: cys, ser, thr; (3) acídica: asp; glu (4) básica: asn; gln; his; lys; arg; (5) residuos que influencian la orientación de cadena: gly, pro; y (6) aromática: trp, tyr, phe. Substituciones no conservadoras involucraran intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase . Cualquier residuo cisteína no involucrado para mantener la conformación adecuada del anticuerpo anti-CD20 también puede ser substituido, en general con serina para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar cruzamiento aberrante. Por el contrario, puede o pueden agregarse enlaces cisteína al aditivo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv) . Un tipo particularmente preferido de variantes de substitución involucra substituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo precursor (por ejemplo un anticuerpo humanizado o humano) . En general, la o las variantes resultantes seleccionadas para mayor desarrollo tendrán propiedades biológicas mejoradas respecto a el anticuerpo precursor del cual se generan. Una forma conveniente para generar estas variantes de substitución involucra maduración de afinidad utilizando expresión en fago. Brevemente, varios sitios de región hipervariable (por ejemplo los 6-7 sitios) son mutados para generar todas las substituciones amino posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas se exhiben en una forma monovalente de partículas fago filamentosas como fusiones al producto gen III de M13 empacado dentro de cada partícula. Las variantes exhibidas fago después se criban por su actividad biológica (por ejemplo afinidad de enlace) como se describe aquí. A fin de identificar sitios de región hipervariable candidatos para modificación, puede realizarse mutagenesis de exploración alanina para identificar residuos de región hipervariable que contribuyen en forma significativa a enlace de antígeno. En forma alterna o adicionalmente, puede ser benéfico analizar una estructura de cristal del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y CD20 humano. Estos residuos de contacto y residuos vecinos, son candidatos para substitución de acuerdo con las técnicas aquí elaboradas. Una vez que estas variantes se generan, el panel de variantes se somete a criba como se describe aquí y anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para mayor desarrollo. Otro tipo de variante amino ácido del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Por alterar se entiende eliminar uno o más porciones carbohidrato que se encuentran en el anticuerpo y/o agregar uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glicosilación de anticuerpos típicamente esta N-enlazada u O-enlazada. N-enlazada se refiere a la conexión de la porción carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier amino ácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para conexión enzimática de la porción carbohidrato a la cadena lateral asparagina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. Glicosilación O-enlazada se refiere a la conexión de uno de los azúcares N-aceilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiamino ácido, y más comúnmente serina o treonina, aunque 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisino también pueden emplearse . La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo, se lleva a cabo convenientemente alterando la secuencia amino ácidos tal que contenga una o más de las secuencias tripéptido anteriormente descritas (para sitios de glicosilación N-enlazados) . La alteración también puede realizarse por la adición de, o por substitución por, uno o más residuos serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación O-enlazados) . Moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia amino ácido del anticuerpo anti-CD20 se preparan por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de amino ácido de origen natural) o preparación por mutageneis derivada por oligonucleótido (o dirigida por sitio) , mutagenesi PCR y mutagenesis de cassette de una variante previamente preparada o una versión no variante del anticuerpo anti-CD20. Puede ser conveniente el modificar el anticuerpo de la invención respecto a la función efectora, por ejemplo para mejorar la citotoxicidad mediada por células dependientes de antígeno (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede lograrse al introducir una o más substituciones de amino ácido en una región Fc del anticuerpo. En forma alterna o adicional, puede introducirse uno o varios residuos cisteína en la región Fc, de esta manera permitiendo formación de enlace disulfuro intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o exterminio de célula mediada por complemento incrementado y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . Ver Carón et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol . 148:2918-2922 (1992). Anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumor mejorada también pueden prepararse utilizando entrelazadores heterobifuncionales como se describe en Wolff et al. Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). En forma alterna, un anticuerpo puede someterse a ingeniería que tenga regiones Fc duales y puede de esta manera tener lisis mediada por complemento mejorada y capacidades ADCC. Ver Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Para incrementar vida media en suero del anticuerpo, se puede incorporar un epítope de enlace receptor de recuperación en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en la patente de los E.U.A. número 5 ,739 ,277 , por ejemplo. Como se utiliza aquí, el término "epítope de enlace receptor de recuperación" se refiere a un epítope de la región Fc de una molécula IgG (por ejemplo, IgGl , IgG2, IgG3, o IgG4) , que es responsable por aumentar la vida media en suero in vivo de la molécula IgG. Otras modificaciones de anticuerpo Otras modificaciones del anticuerpo aquí se contemplan. Por ejemplo, el anticuerpo puede enlazarse con uno de una variedad de polímeros no proteínaceos, por ejemplo polietilen glicol, polipropilen glicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilen glicol y polipropilen glicol. El anticuerpo también puede estar atrapado en microcápsulas preparadas por ejemplo por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente) , en sistemas de suministro de droga coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, micro emulsiones, nano-partículas y nanocápsulas), o en macro emulsiones. Estas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980). Criba de anticuerpos con las propiedades deseadas Anticuerpos con ciertas características biológicas pueden seleccionarse como se describe en los Ejemplos Experimentales. Los efectos inhibitorios de crecimiento de un anticuerpo anti-CD20 de la invención pueden estimarse por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo utilizando células que expresan CD20 ya sea en forma endógena o siguiendo transfección con el gen CD20. Por ejemplo, líneas de células de tumor y células transfectadas CD20-pueden tratarse con un anticuerpo monoclonal anti-CD20 de la invención a diversas concentraciones por unos cuantos días (por ejemplo, 2-7) días y teñirse con violeta cristal o MTT o analizarse por algún otro ensayo colorimétrico. Otro método para medir proliferación seria al comparar la absorción de 3H-timidina por las células tratadas en la presencia o ausencia de un anticuerpo anti-CD20 de la invención. Después de tratamiento de anticuerpo, las células se cosechan y la cantidad de radioactividad incorporada en el DNA es cuantificada en un contador de destelleo. Controles positivos apropiados incluyen tratamiento de una línea celular selecta con un anticuerpo inhibitorio de crecimiento que se conoce inhibe el crecimiento de esa línea celular. Para seleccionar anticuerpos que inducen muerte celular, pérdida de integridad de membrana como se indica por, por ejemplo absorción de yoduro de propidio (Pl) azul triptano o 7AAD, puede estimarse respecto al control. Un ensayo de absorción Pl puede realizarse en la ausencia de células efectoras inmunes y complemento. Células de tumor que expresan CD20 se incuban con medio solo o medio que contiene el anticuerpo monoclonal apropiado por ejemplo aproximadamente 10 µ g/ml. Las células se incuban por un periodo de tiempo de 3 días. Después de cada tratamiento, las células se lavan y se toman alícuotas en tubos de 12 x 75 tapados con colador, de 35 mm (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para retirar los grumos celulares. Los tubos reciben entonces Pl (10 g/ml). Pueden analizarse muestras utilizando un citómetro de flujo FACSCAN™ y programa de CellQuest FACSCONVERT™ (Becton Dickinson) . Estos atributos que inducen niveles estadísticamente significantes de muerte celular como se determina por absorción Pl, pueden seleccionarse como anticuerpos que inducen muerte celular. Para cribar anticuerpos que liga a un epítope en CD20 ligado por un anticuerpo de interés, puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988) . Este ensayo puede emplearse para determinas si un anticuerpo de prueba liga al mismo sitio o epítope que un anticuerpo anti-CD20 de la invención. En forma alterna o adicionalmente, el mapeo de epítope puede realizarse por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la secuencia de anticuerpo puede mutagenizarse tal como por exploración de alanina para identificar residuos de contacto. El anticuerpo mutante se prueba inicialmente para ligar con anticuerpo policlonal para asegurar plegado adecuado. En un método diferente, péptidos que corresponden a diferentes regiones de CD20, pueden utilizarse en ensayos de competencia con los anticuerpos de prueba o con un anticuerpo de prueba y un anticuerpo con epítope caracterizado o conocido. Vectores, Células Anfitrionas y Métodos Recombinantes La invención también proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo variante 2H7 humanizado, vectores y células anfitrionas que comprenden el ácido nucleico, y técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo. Para producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico que lo codifica, se aisla e inserta en un vector replicable para mayor clonación (amplificación del DNA) o para expresión. DNA que codifica el anticuerpo monoclonal se aisla fácilmente y secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al utilizar sondas oligonucleótido que son capaces de ligar específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo) . Muchos vectores están disponibles. Los componentes de vector en general incluyen pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: Una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento mejorador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción. (i ) Componente de secuencia de señal El anticuerpo 2H7 humanizado de esta invención puede producirse en forma recombinante no solo directamente sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo que de preferencia es una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína madura o polipéptido. La secuencia de señal heteróloga seleccionada de preferencia es aquella que se reconoce y procesa (es decir, escinde por una señal peptidasa) por la célula anfitriona. Para células anfitrionas procarióticas que no reconocen y procesan la secuencia de señal de anticuerpo de enlace CD20 nativo, la secuencia de señal se substituye por una secuencia de señal procariótica selecta, por ejemplo, del grupo de fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp o líderes de enterotoxina II termo estables. Para secreción de levadura, la secuencia de señal nativa puede estar substituida por ejemplo por el líder de levadura invertasa, o líder -factor (incluyendo líderes de a -factor Saccharomyces y Kluyveromyces) , o líderes de fosfatasa acida, el líder de glucoamilasa de C. albicans o la señal descrita en WO 90/13646. En expresión de células de mamífero, las secuencias de señal de mamífero al igual que los líderes secretorios virales por ejemplo la señal gD de herpes simplex, están disponibles. El DNA para esta región precursora se liga en cuadro de lectura para DNA que codifica el anticuerpo 2H7 humanizado . (ii) Origen de replicación Tantos vectores de expresión como clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicar en una o más células anfitrionas selectas. En general, en vectores de clonación esta secuencia es aquella que permite al vector replicar independientemente del DNA cromosomal anfitrión, e incluyen orígenes de replicación o secuencia de replicación autónomas. Estas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias Gram-negativas, el origen de plásmido 2 µ es conveniente para levadura y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. En general, el origen del componente de replicación no se requiere para vectores de expresión de mamífero (el origen SV40 típicamente puede emplearse solo debido a que contiene el promotor precursor) . (iii ) Componente de gen de Selección Vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieran resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) aplican nutrientes críticos no disponibles de medio complejo, por ejemplo el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli . Un ejemplo de un esquema de selección utiliza una droga para frenar el crecimiento de una célula anfitriona. Esas células que se transforman exitosamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a droga y de esta manera sobreviven el régimen de selección. Ejemplos de esta selección dominante utilizan las drogas neomicina, ácido micofenólico e higromicina. Otro ejemplo de marcadores seleccionables convenientes para células de mamíferos son aquellos que permiten la identificación de células competentes para tomar el ácido nucleico que codifica el anticuerpo 2H7 humanizado, tal como DHFR, timidina cinasa, metalotioneina-I y -II, de preferencia genes de metalotioneina de primate, adenosina deaminasa, ornitina de descarboxilasa, etc. Por ejemplo, células transformadas con el gen de selección DHFR primero se identifican al cultivar todos los transformantes en un medios de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo de DHFR. Una célula anfitriona apropiada cuando DHFR de tipo silvestre se emplea es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad de DHFR (por ejemplo ATCC CRL- 9096) . En forma alterna, células anfitrionas (particularmente anfitriones de tipo silvestre que contienen DHFR endógeno) , transformados o cotransformados con secuencias de DNA que codifican el anticuerpo 2H7 humanizado, proteína de DHFR tipo silvestre y otro marcador seleccionables tal como aminoglicosido 3 ' -fosfotransferasa (APH) pueden seleccionarse por crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección por marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglicicídico, por ejemplo canamicina, neomicina, o G418. Ver la patente de los E.U.A. No. 4,965,199. Un gen de selección conveniente para utilizar en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la habilidad por crecer en triptofano, por ejemplo ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). La presencia de la lesión trpl en el genoma de célula anfitrión en levadura proporciona entonces un ambiente efectivo para detectar transformación por crecimiento en la ausencia de triptófano. Similarmente, cepas de levadura deficiente en Leu2 (ATCC 20,622 o 38,626) se complementan por plásmidos conocidos que contienen el gen Leu2. Además, vectores derivados del plásmido circular pKDl de 1.6//m puede utilizarse para transformación de las levaduras Kluyveromyces . En forma alterna, un sistema de expresión para producción a gran escala de quimocina de ternera recombinante se reportó para K. lacti s . Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990) . Vectores de expresión de múltiples copias estables para secreción de alb mina de suero humano recombinante madura por cepas industriales de Kluyveromyces también se han descrito. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991). (iv) Componente promotor Vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor que se reconoce por el organismo anfitrión y se enlaza operativamente con el ácido nucleico que codifica el anticuerpo 2H7 humanizado. Promotores adecuados para utilizar con anfitriones procarióticos incluyen el promotor p o4 , ?-lactamasa y sistemas promotores lactosa, promotor de fosfataza alcalina, un sistema promotor triptofano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, otros promotores bacterianos conocidos son convenientes. Promotores para utilizar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) enlazado operativamente en el DNA que codifica el anticuerpo de enlace CD20. Secuencias promotoras se conocen para eucariotas. Virtualmente todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente 25 a 30 bases corriente arriba del sitio en donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontró 70 a 80 bases corriente arriba del inicio de transcripción de muchos genes es una región CNCAAT en donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos ésta una secuencia AATAAA que puede ser la señal para admisión de la cola poli A al extremo 3 ' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias se insertan convenientemente en vectores de expresión eucarióticos . Ejemplos de secuencias promotoras convenientes para utilizar con anfitriones de levadura incluyen los promotores para 3 -fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glicoliticas, tales como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato de hidrogenasa, hexocinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucocinasa. Otros promotores de levadura que son promotores indusibles tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento son las regiones promotoras para alcohol de hidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa acida, enzimas negativas asociadas con metabolismo de nitrógeno, metalotioneina, gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa, y enzimas responsables por utilización de maltosa y galactosa. Vectores y promotores convenientes para utilizar en expresión de levadura además se describe en EP 73,657.

Mejoradores de levadura también se emplean ventajosamente con promotores de levadura. Transcripción de anticuerpo 2H7 humanizado de vectores en células anfitrionas de mamíferos se controla por ejemplo por promotores obtenidos en los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de viruela aviar, adenovirus (tales como Adenovirus 2) , virus de papiloma bovino, virus de sarcoma avian, citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis-B y más preferiblemente dichos Simio 40 (SV40) , de promotores de mamíferos heterologos, por ejemplo el promotor actina o un promotor de immunoglobulina, de promotores de choques térmico, siempre que estos promotores sean compatibles con los sistemas de células anfitrionas. Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción SV40 que también contiene el origen de replicación viral SV40. El promotor inmediatamente previo del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para expresar DNA en anfitriones de mamífero utilizando el virus de papiloma bovino como un vector se describe en la patente de los E.U.A. No. 4,419,446. Una modificación de este sistema se describe en la patente de los E.U.A No. 4,601,978. Ver también Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) en expresión de cDNA ß - interferona humana en células de ratón bajo el control de un promotor timidina cinasa de virus herpes simplex. En forma alterna, la repetición terminal larga del virus Rous Sarcoma puede utilizarse como el promotor. (v) Componente de elemento mejorador. La transcripción de un DNA que codifica el anticuerpo 2H7 humanizado de ésta invención por superiores eucariotas a menudo se incrementa al insertar una secuencia mejorada en el vector. Muchas secuencias mejorada más ahora se conocen de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a -fetoproteina, e insulina) . Típicamente sin embargo uno utilizará un mejorador para un virus de células eucariótica. Ejemplos incluyen el mejorador SV40 en el lado posterior tardío del origen de replicación (bp 100-270) , el mejorador de promotor temprano citomegalovirus, el mejorador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y mejoradoes de adenovirus. Ver también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) en elementos de mejora para activación de promotores eucarióticos. El mejorador puede aplicarse en el vector en una posición 5 ' o 3 ' a la secuencia de codificación de un anticuerpo de enlace CD20, pero de preferencia se ubica en el sitio 5' del promotor. (vi ) Componente de terminación de transcripción . Vectores de expresión utilizados en células anfitrionas eucarióticas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contienen secuencias necesarias para la determinación transcripción y para estabilizar el mRNA. Estas secuencias están comúnmente disponibles para las regiones 5' y ocasionalmente 3' de DNAs o cDNAs eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleótidos que se transcriben como fragmentos poliadenilados en la posición no traducida del mRNA que codifica anticuerpo enlace CD20. Un componente de terminación de transcripción útil es la región de poliadenilación de hormona de crecimiento bovina. Ver WO94/11026 y el vector de expresión ahí descrito. (vii ) Selección y transformación de células anfitrionas . Células anfitrionas convenientes para clonar o expresar el DNA en los vectores aquí son las células procarióticas, de levadura o eucarióticas superiores descritas anteriormente. Procariotas convenientes para éste propósito incluyen eubacterias tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia , por ejemplo, E. coli , Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella , por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella , así como Bacilli tales como B . subtilis y B . licheniformis (por ejemplo, B . licheniformis 41P descrito en DD 266,710 publicado el 12 de Abril 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un anfitrión de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31,446), aunque otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), y E. coli W3110 (ATCC 27,325) son convenientes. Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes . Además de procariotas, microbios eucarióticos tales como hongos filamentos o levadura son anfitriones adecuados de clonación o expresión para vectores que codifican anticuerpo de enlace CD20. Saccharomyces cerevisiae O levadura de repostero común es el más comúnmente empleado entre los microorganismos anfitriones eucarióticos inferiores. Sin embargo, una cantidad de otros géneros especies y cepas son comúnmente disponibles y útiles aquí, Schizosaccharomyces pombe; anfitriones de Kluyveromyces, tales como, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis ; y hongos filamentosos tales como por ejemplo Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y anfitrión Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger. Células anfitrionas convenientes para la expresión de anticuerpo 2H7 humanizado glicocilado se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos . Numerosas cepas de baculovirus y variantes y células anfitrionas de insecto permisivas correspondiente de anfitriones tales como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de fruta) , y Bo byx mori se han identificado. Una variedad de cepas virales para transcripción están públicamente disponibles, por ejemplo la variante L-l de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, estos virus pueden emplearse como el virus aquí de acuerdo con la presente invención, particularmente para transfección de las células de Spodoptera frugiperda . Propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se ha vuelto un procedimiento rutinario. Ejemplos de líneas celulares anfitrionas de mamíferos útiles son la línea de riñon de mono CVl transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ,- líneas de riñon embriónico humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) ); células de riñon de mono (CVl ATCC CCL 70) ; células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34) ; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ,- células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 ,- y una línea de hepatoma humano (Hep G2) . Las células anfitrionas se transforman con los vectores de clonación y expresión anteriormente descritos para producción de anticuerpo de enlace CD20 y cultivan en medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. (viii ) Cultivo de las células anfitrionas Las células anfitrionas empleadas para producir el anticuerpo de enlace CD20 de esta invención pueden ser cultivadas en una variedad de medios. Medios comercialmente disponibles tales como Ham's FIO (Sigma), medio esencial mínimo ( (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , y medio Eagle's modificado con Dulbecco's ((DMEM), Sigma) son convenientes para cultivar las células anfitrionas. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102 :255 (1980), patentes de los E.U.A. números. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o la patente Re. de los E.U.A. 30,985 pueden utilizarse como medio de cultivo para las células anfitrionas. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferina, o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato) , amortiguadores (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (tales como la droga GENTAMYCIAMR) elementos en trazas (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) , y glucosa o una fuente de energía equivalente.

Cualesquiera otros suplementos necesarios también pueden ser incluidos a concentraciones apropiadas que serán conocidas por aquellos con destreza en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, y semejantes son aquellas previamente empleadas con la célula anfitriona selecta para expresión y serán aparentes para la persona con destreza ordinaria en la especialidad. (ix) Purificación de anticuerpo Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o directamente secretada en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como una primera etapa, los desechos en partículas, ya sea células anfitrionas o fragmentos lisados se retiran, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describe un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados al espacio periplásmico de E. coli . Brevemente, pasta celular se descongela en la presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA, y fenilmetilsulfonilfloruro (PMSF) sobre aproximadamente 30 minutos. Los desechos celulares se retiran por centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta en el medio, en general los sobrenadantes de estos sistemas de expresión se concentran primero utilizando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede incluirse en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y pueden incluirse antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios. La composición de anticuerpo preparada de las células puede purificarse utilizando por ejemplo cromatografía de hidroxilapatita, electroforésis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, con la cromatografía de afinidad que es la técnica de purificación preferida. La conveniencia de proteína A como un ligando de afinidad depende de las especies e isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A puede utilizarse para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas /l, /2, o /4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol . Met. 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para / 3 humano (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz en la cual el ligando de afinidad se conecta, es más a menudo agarosa, pero están disponibles otras matrices. Matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli (estirendivinil) benceno permiten gastos de flujo más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABXMR (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para purificación. Otras técnicas para purificación de proteína tales como fraccionación en una columna de intercambio de iones, precipitación de etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSEMR, cromatografía en una resina en intercambio de aniones o cationes (tal como columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperar. Siguiendo cualesquiera etapas de purificación preliminares, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes puede someterse a cromatografía de interacción hidrofóbica de bajo pH utilizando un amortiguador de elusión a un pH de entre aproximadamente 2.5-4.5, de preferencia realizada a bajas concentraciones de sal (por ejemplo de aproximadamente 0-0.25M de sal) . Conjugados de Anticuerpo El anticuerpo puede conjugarse en un agente citotóxico tal como una toxina o isótopo radioactivo. En ciertas modalidades, la toxina es caliqueamicina, un maitansinoide, una dolastatina, auristatina E y sus análogos o derivados son preferidos. Drogas/toxinas preferidas incluyen agentes de daño de DNA inhibidores de polimerización de microtúbulos o despolimerización y antimetabolitos. Clases preferidas de agentes citotóxicos incluyen por ejemplo los inhibidores de enzima tales como inhibidores de hidrofolato reductasa e inhibidores de timidina sintasa, intercaladores de DNA, agentes de escisión de DNA, inhibidores de topoisomerasa, la familia de drogas antraciclina, las drogas vinca, las mitomicinas, las gleomicinas, los nucleósidos citotóxicos, la familia de drogas pteridina, diinenos, podofilotoxinas e inductores de diferenciación. Miembros particularmente útiles de esas clases incluyen por ejemplo metotrexato, metopterina, diclorometotrexato, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, citosina arabinosido, melfalan, leurosina, leurosideina, actinomicina, daunorubicina, doxorubicina, N- (5, 5-diacetoxipentil) doxorubicina, morfolino-doxorubicina, 1- (2-cloroetil) -1,2-dimetansulfonil hidrazida, N8-acetil espermidina, aminopterina, metopterina, esperamicina, mitomicina C, mitomicina A, actinomicina, bleomicina, carminomicina, aminopterina, talisomicina, podofilotoxina y derivados de podofilotoxina tales como etoposido o etoposido fosfato, vinblastina, vincristina, vindesina, taxol, taxotere, ácido retinoico, ácido butírico, N-acetil espermidina, camptotecina, caliqueamicina, briostatinas, cefalostatinas, ansamitocina, actosina, maitansinoides tales como DM-1, maitansina, maitansinol, N-desmetil-4 , 5-desepoximaitansinol , C-19-decloromaitansinol, C-20-hidroximaitansinol , C-20-demetoximaitansinol, C-9-SH maitansinol, C-14-alcoximetilmaitansinol , C-14-hidroxi o acetiloximetilmaitansinol , C-15-hidroxi/acetiloximaitansinol , C-15-metoximaitansinol , C-18-N-demetilmaitansinol y 4 , 5-deoximaitansinol , auristatinas tales como auristatina E, M, PHE y PE; dolostatinas tales como dolostatina A, dolostatina B, dolostatina C, dolostatina D, dolostatina E (20-epi y 11-epi) , dolostatina G, dolostatina H, dolostatina I, dolostatina 1, dolostatina 2, dolostatina 3, dolostatina 4, dolostatina 5, dolostatina 6, dolostatina 7, dolostatina 8, dolostatina 9, dolostatina 10, deo-dolostatina 10, dolostatina 11, dolostatina 12, dolostatina 13, dolostatina 14, dolostatina 15, dolostatina 16, dolostatina 17, y dolostatina 18; cefalostatinas tales como cefalostatina 1, cefalostatina 2, cefalostatina 3, cefalostatina 4, cefalostatina 5, cefalostatina 6, cefalostatina 7, 25 ' -epi-cefalostatina 7, 20-epi-cefalostatina 7, cefalostatina 8, cefalostatina 9, cefalostatina 10, cefalostatina 11 , cefalostatina 12 , cefalostatina 13 , cefalostatina 14, cefalostatina 15, cefalostatina 16 , cefalostatina 17, cefalostatina 18, y cefalostatina 19. Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan al inhibir la polimerización de tubulina. La maitansina primero se aisló del arbusto africano del este ?íaitepus serrata (Patente de los E.U.A. número 3,896,111). Subsecuentemente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y C-3 maitansinol esteres (Patente de los E.U.A. número 4,151,042). Maitansinol sintético y sus derivados y análogos se describen por ejemplo en las Patenetes de los E.U.A. números 4,137,230 4,248,870 4,256,746; 4,260,608 4,265,814 4,294,757 4,307,016 4,308,268 4,308,269 4,309,428 4,313,946 4,315,929 4,317,821 4,322,348 4,331,598 4,361,650 4,364,866 4,424,219 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533, las descripciones de las cuales aquí se incorporan expresamente por referencia. Maitansina y maitansinoides se han conjugado con anticuerpos que ligan específicamente a antígenos de célula de tumor. Inmunoconj gados que contienen maitansinoides y su uso terapéutico se describen por ejemplo en las Patentes de los E.U.A. números 5,208,020, 5,416,064 y la Patente Europea EP 0 425 235 Bl , las descripciones de las cuales aquí se incorporan expresamente por referencia. Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) describen inmunoconj ugados que comprenden un maitansinoide diseñado DM1 enlazado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra cáncer colorectal humano. El conjugado se encontró que es altamente citotóxico hacia células de cáncer de colon cultivado y muestra actividad antitumor en un ensayo de crecimiento de tumor in vivo. Chari et al. Cáncer Research 52:127-131 (1992) describe inmunoconjugados en los cuales se conjugó un maitansinoide mediante un enlazador disulfuro al anticuerpo murino A7 que liga a un antígeno en líneas de células de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.l que liga al encogen HER-2/neu. Hay muchos grupos de enlace conocidos en la técnica para producir conjugados an icuerpo-maitansinoide, incluyendo por ejemplo aquellos descritos en la Patente de los E.U.A. número 5,208,020 o la Patente EP 0 425 235 Bl , y Chari et al. Cáncer Research 52: 127-131 (1992) . Los grupos de enlace incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos de ácido lábil, grupos fotolábiles, grupos lábiles peptidasa o grupos lábiles esterasa como se describe en las patentes anteriormente identificadas, grupos disulfuro y tioéter que prefieren.

Conjugados del anticuerpo y maitansinoide pueden elaborarse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCL) , esteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos de bis-azida (tales como bis (p-azidobenzoil) hexandiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tal como toluen 2 , 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Agentes de acoplamiento preferidos particularmente incluyen N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737

[1978]) y N-succinimidil-4 - (2 -piridiltio) pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro. El enlazador puede conectarse a la molécula maitansinoide en diversas posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, puede formarse un enlace éster por reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción puede ocurrir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hirdoximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una modalidad preferida, el enlace se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo maitansinol. Caliqueamicina Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo de enlace CD20 conjugado con una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos caliqueamicina son capaces de producir estructuras de DNA de doble hebra en concentraciones sub-picomolar . Para la preparación de conjugados de la familia caliqueamicina, ver Patentes de los E.U.A. números 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (todas a American Cyanamid Company). Análogos estructurales de caliqueamicina que pueden utilizarse incluyen pero no están limitados a /i1, «21, c 31 , N-acetil-/!1, PSAG y ?\ (Hinman et al. Cáncer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode et al. Cáncer Research 58: 2925-2928 (1998) y las Patentes de los E.U.A. anteriormente mencionadas otorgadas a American Cyanamid) . Otra droga antitumor con la que puede conjugarse el anticuerpo es QFA que es un antifolato. Tanto caliqueamicina como QFA tienen sitios de acción intracelular y no cruzan fácilmente la membrana de plasma. Por lo tanto, la absorción celular de estos agentes a través de internalización mediada por anticuerpo mejora enormemente sus efectos citotóxicos. Isótopos radioactivos Para destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Una variedad de isótopos radioactivos están disponibles para la producción de anticuerpos anti-CD20 radioconjugados. Ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando el conjugado se utiliza para diagnóstico, puede comprender un átomo radioactivo para estudios escintigráficos, por ejemplo tc99m o I123, o una etiqueta de espín para formación de imagen por resonancia magnética nuclear (RMN) también conocida como formación por resonancia magnética, mri (mri = magnetic resonance imaging), tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbón-13, nitrógeno-15 , oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Las radio- u otras etiquetas pueden incorporarse en el conjugado en formas conocidas, por ejemplo, el péptido puede ser biosintetizado o puede sintetizarse por síntesis de aminoácidos químicos utilizando precursores de aminoácidos convenientes que involucran por ejemplo flúor- 19 en lugar de hidrógeno.

Etiquetas tales como tc99m o I123, Re186, Re188 y In111 puede conectarse mediante un residuo cisteína en el péptido. Itrio-90 puede conectarse mediante un residuo lisina. El método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophis. Res. Commun. 80: 49-57 puede utilizarse para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal,CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle . Conjugados del anticuerpo y agente citotóxico pueden elaborarse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil -4- (N-maleimidometil) ciciohexano- 1-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato AHL) , esteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como tolueno 2 , 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activo (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987) . Ácido l-isotiocianatobenzil-3-metildietilen triaminpentaacético etiquetado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para conjugar radionucleótido al anticuerpo. Ver WO94/11026. el enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación de la droga citotóxica en la célula, por ejemplo, un enlazador ácido lábil, enlazador sensible a peptidasa, enlazador fotolábil, enlazador dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al. Cáncer Research 52: 127-131 (1992); Patente de los E.U.A. número 5,208,020) puede emplearse. Usos Terapéuticos Los anticuerpos de enlace 2H7 CD20 humanizados de la invención son útiles para tratar una cantidad de enfermedades malignas y no malignas incluyendo cánceres CD20 positivos tales como linfomas de célula B y leucemia y enfermedades autoinmunes . Células madre (progenitoras célula B) en médula ósea carecen del antígeno CD20, permitiendo que células B sanas se regeneren después de tratamiento y regresen a niveles normales dentro de varios meses. hu2H7.v511 es el anticuerpo preferido a utilizarse en los métodos presentes de tratamiento. Cánceres CD20 positivos son aquellos que comprenden proliferación anormal de células que expresan CD20 en la superficie celular. Los neoplasmas de células B CD20 positivos incluyen enfermedad de Hodgkin positiva CD20 incluyendo enfermedad de Hodgkin predominante de linfocito (LPHD) ; linfoma no-Hodgkin (NHL) ; linfoma de célula de centro folicular (FCC) ,- leucemia linfocitica aguda (ALL) ; leucemia linfocitica crónica (CLL) ; leucemia de célula pilosa. El término "linfoma no-Hodgkin" o "NHL" como se emplea aquí, se refiere a un cáncer del sistema linfático diferente a linfoma de Hodgkin. Los linfomas de Hodgkin pueden en general distinguirse de linfomas no-Hodgkin por la presencia de células Reed-Sternberg en linfomas de Hodgkin y la ausencia de las células en linfomas no-Hodgkin. Ejemplos de linfomas no-Hodgkin abarcados por el término como se emplea aquí incluyen cualquiera que se identifique como tal por una persona con destreza en la técnica (por ejemplo un oncólogo o patólogo) de acuerdo con los esquemas de clasificación conocidos en la técnica, tales como el Esquema de Linfoma Europeo Americano Revisado (REAL = Revised European-American Lymphoma) como se describe en Color Atlas of Clinical Hematology (3ra edición), A. Víctor Hoffbrand and John E. Pettit (eds.) (Harcourt Publishers Ltd., 2000). Ver en particular las listas en las Figuras 11.57, 11.58 y 11.59. Ejemplos más específicos incluyen pero no están limitados a NHL de relapso o refractario, NHL de bajo grado línea frontal, NHL Etapa III/IV NHL, NHL resistente a la quimioterapia, leucemia linfoblástica B precursora y/o linfoma, linfoma linfocitico pequeño, leucemia linfática crónica de célula B y/o leucemia prolinfocitica y/o linfoma linfocitico pequeño, linfoma prolinfocitico de célula B, linfoma linfoplasmácitico y/o inmunocitoma, linfoma linfoplasmacitico, linfoma de célula B de zona marginal, linfoma de zona marginal esplénica, linfoma MALT-zona marginal extranodal, linfoma de zona marginal nodal, leucemia de célula pilosa, plasmacitoma y/o mieloma de células de plasma, linfoma folicular/grado bajo, NHL folicular/grado intermedio, linfoma de célula de manto con linfomas de centro del folículo (folicular) , NHL difuso grado intermedio, linfoma de célula B grande difuso, NHL agresivo (incluyendo NHL de línea frontal agresivo y NHL de relapso agresivo) , NHL de relapso después o refractario a transplante de células madre autologas, linfoma de células B grande mediastinal primario, linfoma de efusión primario, NHL inmunoblástico de alto grado, NHL linfoblástico de alto grado, NHL de células no escindidas pequeñas de alto grado, NHL de enfermedad de masas tumorales sólidas de gran tamaño, linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica glanular grande precursora (periférica) , micosis fungoides y/o síndrome de Sezary, linfomas de la piel (cutáneos) , linfomas de grandes células anaplásticas, linfoma angiocéntrico.

Linfoma indolente es una enfermedad incurable de lento crecimiento en donde el paciente promedio sobrevive entre 6 y 10 años después de numerosos periodos de remisión y relapso. En una modalidad, los anticuerpos de enlace CD20 humanizados o sus fragmentos funcionales se emplean para tratar NHL indolente. Los presentes anticuerpos 2H7 humanizados o sus fragmentos funcionales son útiles como tratamiento de un solo agente por ejemplo para NHL de célula B, positivo CD20, de relapso o bajo grado refractario o folicular, o pueden administrarse a pacientes en conjunto con otras drogas en un régimen de múltiples drogas. En modalidades específicas, los anticuerpos de enlace CD20 humanizados y sus fragmentos funcionales se utilizan para tratar linfoma no-Hodgkin (NHL) , enfermedad de Hodgkin predominante de linfocito (LPHD) , linfoma linfocitico pequeño (SLL) , leucemia linfocitica crónica (CLL) . Una "enfermedad autoinmune" aquí es una enfermedad o desorden que surge de y se dirige contra los propios tejidos de un individuo o un co-segregado o su manifestación o condición resultante de ello. Ejemplos de enfermedades o desórdenes autoinmunes incluyen, pero no están limitados a artritis (artritis reumátoide tal como artritis aguda, artritis reumatoide crónica, artritis gotosa, artritis gotosa aguda, artritis inflamatoria crónica, artritis degenerativa, artritis infecciosa, artritis de Lyme, artritis proliferativa, artritis soriásica, artritis vertebral y artritis reumatoide de inicio juvenil, osteoartritis, progrediente crónica de artritis, artritis deformans, poliartritis crónica primaria, artritis reactiva y espondilitis enquilosante) , enfermedades de la piel hiperproliferativas inflamatorias, ppsoriasis tales como psoriasis de placa, psoriasis manchada, psoriasis pustular y psoriasis de las uñas, enfermedades atópicas incluyendo atopía, tales como fiebre de heno y síndrome de Job's, dermatitis incluyendo dermatitis de contacto, dermatitis de contacto crónica, dermatitis alérgica, dermatitis de contacto alérgica, dermatitis herpetiforme y dermatitis atópica, síndrome hiper IgM x-enlazado, urticaria tal como urticaria alérgica crónica y urticaria idiopática crónica, incluyendo urticaria autoinmune crónica, poliomicitis/dermatomicitis, dermatomicitis juvenil, necrolisis epidémica tóxica, escleroderma (incluyendo escleroderma sistémica) , esclerosis tal como esclerosis sistémica, esclerosis múltiple (MS) tal como MS espino-óptica, MS progresiva primaria (PPMS) , y MS de remisión de relapso (RRMS) , esclerosis sistémica progresiva, arterioesclerosis, esclerosis disseminata y esclerosis atáxica, enfermedad de intestino inflamatoria (IBD) (por ejemplo enfermedad de Crohn, enfermedades gastrointestinales mediadas autoinmunes, colitis tal como colitis ulcerativa, colitis ulcerosa, colitis microscópica, colitis colágenosa, colitis poliposa, enterocolitis necrotizante y colitis transmural, y enfermedad intestinal inflamatoria auto inmune) , pioderma gangrenosa, eritema nodosa, colangitis esclerosante primaria, episcleritis) , síndrome de tensión respiratoria, incluyendo síndrome de tensión respiratoria del adulto o aguda (ARDS) , meningitis, inflamación de toda parte de la uvea, iritis, coroiditis y desorden hematológico autoinmune, espondiritis reumatoide, pérdida de audición súbita, enfermedades mediadas por IgE, tales como a anafilaxis y rinitis alérgica y atópica, encefalitis tal como encefalitis de Rasmussen y encefalitis limbica y/o cerebelo o tronco cerebral, uveitis tal como uveitis anterior aguda, uveitis granulomatosa, uveitis no granulomatosa, uveitis facoantigénica, uveitis posterior o uveitis autoinmune, gromerulonefritis (GN) con y sin síndrome nefrótico tal como gromerulonefritis crónica o aguda tal como GN primario, GN inmuno mediada, GN membranosa (nefropatía membranosa) , Gn membranosa y hepática o nefropatía membranosa y hepática, GN membrano-o membranosa proliferativa (MPGN) , incluyendo Tipo I y Tipo II, y GN rápidamente progresiva, condiciones y respuestas alérgicas, reacción alérgica, eczema incluyendo eczema alérgico o atópico, asma, tal como asma bronquial, y asma auto inmune, condiciones que involucran infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónica, reacciones inmunes contra antígenos extraños tales como grupos de sangre A-B-0 fetal durante embarazo, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, miocarditis auto inmune, deficiencia de adhesión de leucocitos, lupus sitémico eritematoso (SLE) o lupus sitémico eritematodos, tal como SLE cutáneo, lupus eritematoso cutáneo sub agudo, síndrome de lupus neonatal (NLE) , lupus eritematosus disseminatus, lupus (incluyendo nefritis, cerebritis, pediátrico, no renal, extra renal, discoide, alopesia) , diabetes mellitus de inicio juvenil (Tipo I) incluyendo diabetes mellitus dependiente de insulina pediátrica (IDDM) , diabetes mellitus de inició en adulto (diabetes Tipo II) diabetes auto inmune, diabetes insipidus idiopática, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retrasada mediada por citosinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis linfomatoide, granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitis, incluyendo vasculitis (incluyendo vasculitis de vasos grande (incluyendo polimialgia reumática y artritis de células gigante (Takayasu' s) ) , vasculitis de vasos medios (incluyendo enfermedad de Kawasaki y poliartritis nodosa/periartitis nodosa, poliartritis microscópica, vasculitis de CNS, necrotizante cutánea o vasculitis de hipersensibilidad, vasculitis sistémica necrotizante y vasculitis asociada con ANCA, tal como vasculitis o síndrome de Churg-Strauss (CSS)), arteritis temporal, anemia aplástica, anemia aplástica autoinmune, anemia positiva de Coombs, anemia Diamond Blackfan, anemia hemolítica o anemia hemolítica inmune incluyendo anemia hemolítica autoimune (AIHA) , anemia perniciosa, enfermedad de Addison, anemia de glóbulos rojos puros o aplasia (PRCA), eficiencia de Factor VIII, hemofilia A, neutropenía autoinmune, parasitopenía, leucopenia, enfermedades que involucran diapedesis de leucocitos, desórdenes inflamatorios de CNS, síndrome de lesión de múltiples órganos tales como aquellos secundarios a septicemia, trauma o hemorragia, enfermedades medianas por complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad de membrana de base antiglomerular, síndrome de anticuerpo antifosfolípido, neuritis alérgica, enfermedad de Bechet o Behcet 's, síndrome de Castlemán, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, pemfigoide tal como pemfigoide bulosa y pemfigoide de piel, pemfigus (incluyendo pemfigus vulgaris, pemfigus foliaceus, pemfigus pemfigoide membrana y pemfigus eritematosos) , polsiendocrinopatías autoinmunes, enfermedad o síndrome de Reiter, nefritis inmuno compleja, nefritis mediada por anticuerpo, neuromielitis óptica, polineuropatias, neuropatía crónica tal como polineuropatias IgM o neuropatía mediada por IgM, trombocitopenía (como se desarrolla por pacientes de infarto al miocardio, por ejemplo), incluyendo púrpura tromboctopenia trombótica (TTP) , púrpura post-transfusión (PTP) , trombocitopenía inducida por heparina y trombocitopenía autoimmune o immuno mediada tal como púrpura trombocitopenica y hepática (ITP) incluyendo ITP crónica o aguda, enfermedad autoinune de los testículos y ovarios incluyendo orquitis auto inmune y ooforitis, hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades endocrinas autoimunes incluyendo tiroiditis tales como tiroiditis autoimune, enfermedad de Hashimoto, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto) , o tiroiditis subaguda, enfermedades de tiroides autoimmune, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Grave, síndromes poliglandulares tales como síndrome poliglandulares autoimunes o síndromes de endocrinopatía poliglandular) , síndromes paraneoplásticos, incluyendo síndromes paraneoplásticos neurológicos tales como síndrome miasténico de Lambert-Eaton o síndrome de Eaton-Lambert, síndrome de rigidez muscular, encefalomielitis tal como encefalomielitis alérgica o encefalomielitis alérgica y encefalomielitis alérgica experimental (EAE) , miastenía gravis tal como miastenía gravis asociada con timoma, degeneración cerebelar, neuromiotonía, opsoclonus o síndrome opsoclonus mioclonus (OMS) y neuropatía sensorial, neuropatía motriz multifocal, síndrome de Sheehan's, hepatitis autoimune, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, hepatitis de células gigantes, hepatitis activa crónica o hepatitis activa crónica autoinmune, neumonitis intersticial linfoide (LIP) , bronquiolitiserans (no-transplante) vs NSIP, síndrome Guillain-Barré, enfermedad de Berger (nefropatía IgA) , nefropatía IgA idiopática, dermatosis IgA lineal, cirrosis biliar primaria, neumonocirrosis síndrome de enteropatía autoinmune, enfermedad Ciliaca, enfermedad Ciliaca (enteropatía de gluten) , esprúe refractario, esprúe idiopático, crioglobulinemía, esclerosis lateral amilotrófica (ALS; enfermedad de Lou Gehrig) , enfermedad de arteria coronaria, enfermedad de oído autoimune tal como enfermedad de oído interior autoimune (AIED) , pérdida auditiva autoimune, síndrome opsoclonus myoclonus (OMS) , policondritis tal como policondritis refractaría o de relapso, proteinosis alveolar pulmonar, amiloidosis, escleritis, linfocitosis no cancerosa, una linfocitosis primaria, que incluye linfocitosis de células B monoclonal (por ejemplo gamopatía monoclonal benigna y gamopatía monoclonal de significancia no determinada, (GUS) , neuropatía periférica, síndrome paraneoplástico, canelopatías tales como epilepsia, migraña, arritmia, desórdenes musculares, sordera, ceguera, parálisis periódica y canelopatías del CNS, autismo, miopatía inflamatoria, glomeruloesclerosis de segmento focal (FSGS) , oftalmopatía endocrina, uveoretinitis, corioretinitis, desorden hepatológico autoimune, fibromialgía, falla endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, adrenalitis, atrofia gástrica, demencia presenil, enfermedades desmielinantes tales como enfermedades desmielinantes autoimunes y polineuropatía desmielinante inflamatoria crónica, nefropatía diabética, síndrome de Dressler, alopecia areata, síndrome CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, dismovilidad esofágica, esclerodactilia y tlangectasia) , infertilidad autoinmune masculina y femenina, enfermedad de tejido conectivo mixto, enfermedad de Chagas, fiebre reumática, aborto recurrente, pulmón de granjero, eritema multiforme, síndrome post-cardiotomía, síndrome de Cushing, pulmón de creadores de las aves, angiitis granulomatosa alérgica, angiitis limfocitica benigna, síndrome de Alport, alveolitis tal como alveolitis alérgica y alveolitis fibrosante, enfermedad de pulmón intersticial, reacción de transfusión, lepra, malaria, leishmaniaeis, kipanosomiasis, esquistosomiasis, ascariasis, aspergilosis, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocarditis, fibrosis endomiocardio, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis cistica, endoftalmitis, eritema elevatum et diutinum, eritroblastosis fetalis, faciitis eosinofilica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flariasis, ciclitis tal como ciclitis crónica, ciclitis heterocrónica, iridociclitis (aguda o crónica) o ciclitis Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, infección de virus de inmunodeficiencia humana (HIV) , infección de ecovirus, cardiomiopatía, enfermedad de Alzheimer, infección de parvovirus, infección del virus rubéola, síndromes post-vacunación, infección de rubéola congénita, infección del virus Epstein-Barr, paperas, síndrome del Evan, falla gonadal autoinmune, corea de Sydenham, nefritis post-estreptococos, tromboangitis ubiterans, tirotoxicosis, tabes dorsalis, corioiditis, polimialgía de células gigantes, opftalmopatía endocrina, neumonitis de hipersensibilidad crónica, querato conjuntivitis seca, querato conjuntivitis epidémica, síndrome nefrítico idiopático, nefropatía de cambio mínimo, lesión de reperfusión- isquemia y familial benigna, auto inmunidad retinal, inflamación de articulación, bronquitis, enfermedad de vías respiratorias obstructivas crónicas, silicosis, aftas, estomatitis aftosa, desórdenes arterioescleroticos, aspermiogenesis, hemolisis autoinmune, enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, endoftalmía facoanafiláctica, enteritis alérgica, eritema nodosum leprosum, parálisis facial idiopática, síndrome de fatiga crónica, febris reumática, enfermedad de Hamman-Rich, pérdida de audición sensoneural , hemoglobinuria paroxismática, hipogonadismo, ileitis regionalis, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis tranversa, mixedema idiopática primaria, nefrosis, oftalmía simpática, orquitis granulomatosa, pancreatitis, poliradiculitis aguda, pioderma gangrenosa, tiroidismo de Quervain, atrofia espénica adquirida, infertilidad debido a anticuerpos antiespermatozoides, timoma no maligno, vitíligo, SCID y enfermedades asociadas con el virus Epstein-Barr, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) , enfermedades parasitarias tales como Lesihmania, síndrome de choque tóxico, envenenamiento de alimentos, condiciones que involucran infiltración de células T, deficiencia de adhesión de leucocitos, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retrasada mediada por citocinas y T-linfocitos, enfermedades que involucran leucocito diapedesis, síndrome de lesión de múltiples órganos, enfermedades mediadas por complejos antígeno-anticuerpo, enfermedad de membrana basal antiglomerular, neuritis alérgica, poliendocrinopatías autoinmunes, ooforitis, mixedema primario, gastritis atrófica autoinmune, oftalmía simpática, enfermedades reumáticas, enfermedad del tejido conectivo mixto, síndrome nefrótico, insulitis, falla poliendocrina, neuropatía periférica, síndrome poliglandular autoinmune tipo I, hipoparatiroidismo idiopático de inicio en adulto (AOIH) , alopecia totalis, cardiomiopatía dilatada, epidermolisis bullosa acquisita (EBA) , hemocromatosis, miocarditis, síndrome nefrótico, colangitis esclerosante primaria, sinusitis purulenta o no purulenta, sinusitis aguda o crónica, etoide, frontal, maxilar, o sinusitis esfenoide, un desorden relacionado a eosinofilos, tal como eosinofilis, eosinofilis de infiltración pulmonar, síndrome de eosinofilía-mialgía, síndromes de Loffler, neumonía eosinofílica crónica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilosis bronconeumónica, aspergiloma, o granulomas que contienen eosinofilos, anafilaxis, spondiloartritis ceronegativa, enfermedad autoinmune poliendocrina, colangitis esclerosante, esclera, episclera, candidiasis mucocutánea crónica, síndrome de Bruton, hipogamaglobulinemia transitoria de infancia, síndrome de Wiskott-Aldrich, ataxia telangiectasia, desórdenes autoimmunes asociados con enfermedad de colágeno, reumatismo, enfermedad neurológica, limfadenitis, desorden de repercusión isquémica, reducción en respuesta a presión sanguínea, disfunción vascular, antgiectasis, lesión de tejido, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquémica cerebral, y enfermedad que acompaña vascularización, desórdenes de hipersensibilidad alérgica, glomerulonefritis, lesión de reperfusión, lesión de reperfusión de miocardio u otros tejidos, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, meningitis purulenta aguda u otros desórdenes inflamatorios del sistema nervioso central, desórdenes inflamatorios orbitales y oculares, síndromes asociados con transfusión de granulocitos, toxicidad inducida por citocina, inflamación sería aguda, inflamación intratable crónica, pielitis, neumonocirrosis, retinopatía diabética, desorden de grandes arterias diabéticas, hiperplasia endarterial, úlcera péptica, valvulitis y endometriosis . En modalidades específicas, los anticuerpos 2H7 humanizados y sus fragmentos funcionales se emplean para tratar artritis reumatoide y artritis reumatoide juvenil, lupus sistémico eritematoso incluyendo lupus nefritis, enfermedad de Wegener, enfermedad de intestino inflamatorio, colitis ulcerativa, púrpura trombocitopénica (ITP) , púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) , trombocitopenia autoinmune, esclerosis múltiples, psoriasis, nefropatía IgA, polineuropatías IgM, miastenia gravis, vasculitis asociada con ANCA, diabetes mellitus, síndrome de Reynaud, síndrome se Sjorgen, Neuromielitis Óptica (NMO) y glomerulonefritis. "Tratar", "tratamiento" o "alivio" se refiere a tratamiento terapéutico en donde el objeto es frenar (reducir) si no se cura la condición patológica objetivo o desorden o evitar la recurrencia de la condición. El sujeto se "trata" exitosamente de una enfermedad autoinmune o una malignidad de células B positivas CD20, si, después de recibir una cantidad terapéutica de anticuerpo de enlace CD20 humanizado de la invención de acuerdo con los métodos de la presente invención, el sujeto muestra reducción observable y/o medible en o ausencia de uno o más signos y síntomas de la enfermedad particular. Por ejemplo, para cáncer, reducción significante en el número de células y cáncer o ausencia de las células de cáncer; reducción en el tamaño de tumor; inhibición (es decir frenado en cierta proporción y de preferencia detener o interrumpir) de metástasis de tumor; inhibición, en cierta medida de crecimiento de tumor; aumento en longitud de remisión y/o alivio en cierta medida de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer específico; reducida morbidez y mortalidad y mejora en aspectos de calidad de vida. Reducción de los signos o síntomas de una enfermedad también pueden sentirse por el paciente. El tratamiento puede lograr una respuesta completa, definida como desaparición de todos los signos de cáncer o una respuesta parcial, en donde el tamaño del tumor se disminuye, de preferencia en más de 50%, más preferiblemente en 75%. Un paciente también se considera tratados si el paciente experimenta una enfermedad estable. En modalidades preferidas, el tratamiento con anticuerpo de la invención es efectivo para resultar en pacientes con cáncer que están libres de progreso en el cáncer cuatro meses después de tratamiento, de preferencia seis meses, más preferiblemente un año o más preferiblemente dos o más años posteriores al tratamiento. Estos parámetros para estimar tratamiento exitoso y mejora en la enfermedad se miden fácilmente por procedimientos rutinarios familiares o un médico con destreza apropiada en la técnica. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un anticuerpo o una droga efectiva "tratar" una enfermedad o desorden en un sujeto. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva de la droga puede reducir el número de células de cáncer; reducir el tamaño de tumor; inhibir (es decir frenar en cierta medida y de preferencia detener) la infiltración de células de cáncer en órganos periféricos; inhibir (es decir frenar en cierta medida de preferencia para) la metástasis de tumor; inhibir, en cierta medida el crecimiento de tumor y/o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Ver definición procedente de "tratamiento" . En el caso de enfermedad autoinmune, la cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo hubo otra droga se efectúa para reducir los signos y síntomas de la enfermedad. Los parámetros para estimar eficacia o éxito de tratamiento del neoplasma serán conocidos para el médico con destreza en la enfermedad apropiada. En general, el médico con destreza buscará reducir sus hijos y síntomas de la enfermedad específica. Parámetros pueden incluir tiempo medio de avance de la enfermedad, tiempo para remisión, enfermedad estable. Las siguientes referencias describen linfomas y CLL, su diagnóstico, tratamiento y procedimientos médicos estándar para medir la eficacia de tratamiento. Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL : The Lymphomas . W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1998; van Besien K and Cabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin' s Lymphoma, Chap . 70, pp 1293-1338, in: Hematology , Basic Principies and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors) . Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000; and Rai, K and Patel, D: Chronic Lymphocytic Leukemia, Chap. 72, pp 1350-1362, en: Hematology , Basic Principies and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000. Los parámetros para estimar la eficacia o éxito de tratamiento de una enfermedad auto inmune o auto inmune relacionada serán conocidos para el médico con destreza en la enfermedad apropiada. En general, el médico con destreza buscará reducción en los signos y síntomas de la enfermedad específica. Los siguientes son a manera de ejemplos. En una modalidad, los anticuerpos 2H7 humanizados y específicamente hu2H7.v511 y fragmentos funcionales de los mismos se utilizan para tratar artritis reumatoide. RA es una enfermedad auto inmune debilitante que afecta más 2 millones de americanos e impide las actividades diarias de los enfermos. RA ocurre cuando el propio sistema inmune del cuerpo ataca en forma inapropiada el tejido de articulación, provoca inflamación crónica que destruye tejido sano y daño dentro de las articulaciones. Síntomas incluyen inflamación de las articulaciones, hinchado, rigidez y dolor. Adicionalmente, ya que RA es una enfermedad sistémica, puede tener efectos en otros tejidos tales como pulmones, ojos y médula ósea. No hay cura conocida. Tratamientos incluyen una variedad de drogas anti inflamatorias esteroidales y no esteroidales, agentes inmunosupresores, drogas anti reumáticas que modifican la enfermedad (DMARDs = disease-modifying anti -rheumatic drugs) y agentes biológicos. Sin embargo, muchos pacientes continúan teniendo una respuesta inadecuada al tratamiento. Los anticuerpos pueden emplearse como terapia de primera línea en pacientes con RA temprana (es decir sin tratamiento de metotrextato (MTX) ) y como monoterapia o en combinación con, por ejemplo MTX o ciclofosfamida. 0, los anticuerpos pueden utilizarse en tratamiento como terapia de segunda línea para pacientes que requieran DMARD y/o MTX refractarios y como monoterapia o en combinación por ejemplo con MTX. Los anticuerpos de enlace CD20 humanizados o útiles para evitar y controlar el daño a articulaciones, daño estructural retardado, disminuir el dolor asociado con inflamación RA, y en general reducir los signos y síntomas en RA moderada a severa. El paciente de RA puede tratarse con anticuerpo CD20 humanizado antes de, después o junto con el tratamiento con otras drogas utilizadas para tratar RA (ver terapia de combinación siguiente) . En una modalidad, pacientes que previamente han fallado drogas anti reumáticas que modifican enfermedad y/o han tenido una respuesta inadecuada a metotrexato solo se tratan con un anticuerpo de enlace CD20 humanizado de la invención. En una modalidad de este tratamiento, los pacientes están en un régimen de tratamientos de 17 días que reciben anticuerpo de enlace CD20 humanizado solo (infusiones de 1 g i.v. los días 1 y 15); actividad de enlace CD20 más ciclofosfamida (infusión de 750 mg i.v. los días 3 y 17); o anticuerpos de enlace CD20 más metotrexato. Un método para evaluar la eficacia de tratamiento en RA se basa en los criterios del Colegio Americano de Reumatología (ACR = American College of Rheumatology) , que mide el por ciento de mejora en articulaciones sensibles e hinchadas, entre otras cosas. El paciente de RA puede ser calificado por ejemplo como ACR 20 (20% de mejora) , en comparación a sin tratamiento de anticuerpo (por ejemplo línea base antes de tratamiento) o tratamiento con placebo. Otras formas de evaluar la eficacia del tratamiento de anticuerpo incluyen calificaciones de rayos X tal como la calificación de rayos X Sharp, utilizada para calificar daño estructural tal como erosión de huesos y estrechamiento del espacio de articulación. Los pacientes también pueden ser evaluados para prevención de o mejoras en la incapacidad con base en la calificación del Cuestionario de Evaluación de Salud [HAQ => Health Assessment Questionnaire] , calificación AIMS, SF 36 en períodos de tiempo durante y después de tratamiento. Los criterios ACR 20 pueden incluir 20% de mejora tanto en conteo de articulaciones sensibles (dolor) y el conteo de articulaciones inflamadas más una mejora de 20% en al menos tres de cinco medidas adicionales : 1. evaluación del dolor del paciente por escala análoga visual (VAS) , 2. evaluación global del paciente de actividades de enfermedad (VAS) , 3. evaluación global del médico de la actividad de enfermedad (VAS) , 4. incapacidad auto evaluada del paciente medida por the Health Assessment Questionnaire, y 5. reactivos de fase aguda CRP or ESR. ACR 50 y 70 se definen en forma análoga. De preferencia, al paciente se le administra una cantidad de anticuerpo de enlace CD20 de la invención efectivo para lograr al menos una calificación de ACR20, de preferencia al menos ACR 30, más preferiblemente al menos ACR50, aún más preferible al menos ACR70, más preferiblemente al menos ACR 75 y superior. Artritis psoriásica tiene características radiológicas únicas y distintas. Para artritis psoriasica, la erosión de articulación y el inchamento del espacio de articulación pueden evaluarse por la calificación Sharp por igual. Los anticuerpos de enlace CD20 humanizados de la invención pueden utilizarse para evitar el daño la articulación al igual que reducidos signos de enfermedad y los síntomas del desorden. Todavía otro aspecto de dimensión es un método para tratar SLE o lupus nefritis al administrar a un sujeto que sufre del desorden, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de enlace CD20 humanizado de la invención. Calificaciones SLEDAI proporcionan una cuantificación numérica de la actividad de la enfermedad. SLEDAI es un índice ponderado de 24 parámetros clínicos y de laboratorio que se conoce correlacionan con actividad del enfermedad, con un intervalo numérico de 0-103. Ver Bryan Gescuk & John Davis, "Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus" en: Current Opinión in Rheumatology 2002, 14:515-521. Anticuerpos a DNA de doble hebra se considera que provocan engrosamientos renales y otras manifestaciones de lupus. Pacientes que se someten al tratamiento de anticuerpo pueden ser supervisados por tiempo a engrosamiento renal, que se define como un incremento significante, reproducible en creatinina de suero, proteína de orina o sangre en la orina. De forma alterna o además, pueden supervisar los pacientes para niveles de anticuerpos antinucleares y anticuerpos a DNA de doble hebra. Tratamientos para SLE incluyen corticoesteroides de alta dosis y/o ciclofosfamida (HDCC) . Espondiloartropatías son un grupo de desórdenes de las articulaciones, incluyendo espondilitis anquilosante, artritis psoriásica y enfermedad de Crohn. El sitio de tratamiento puede determinarse por herramientas validadas para medición de evaluación global del médico y paciente. La eficacia de tratamiento para soriasis se estima al supervisar cambios y síntomas químicos de la enfermedad incluyendo cambios de evaluación global del médico (PGA) y calificaciones de Área de soriasis e índice de Estabilidad (PASI) , Evaluación de Síntoma de Soriasis (PSA) , en comparación con la condición de línea base. El paciente de soriasis tratado con un anticuerpo de enlace CD20 humanizado de la invención tal como hu2H7.v511 puede medirse periódicamente a través de tratamientos de la escala análoga Visual utilizada para indicar el grado de comezón experimentado en puntos en tiempo específicos. Los pacientes pueden experimentar una reacción de infusión o síntomas relacionados a infusión con su primera infusión de un anticuerpo terapéutico. Estos síntomas varían en severidad y en general son reversibles con la intervención médica. Estos síntomas incluyen pero no están limitados a fiebre tipo gripe, calosfríos/rigidez, náusea, urticaria, dolor de cabeza, bronco espasmo, angioedema. Sería conveniente para los métodos de tratamiento de enfermedad de la presente invención el reducir al mínimo reacciones de infusión. Para aliviar o minimizar estos eventos adversos, el paciente puede recibir un acondicionamiento inicial o dosis de tolerancia del anticuerpo seguido por una dosis terapéutica mente efectiva. La o las dosis de acondicionamiento serán menores que la dosis terapéuticamente efectiva para condicionar paciente a tolerar dosis superiores. Dosificación Dependiendo de la indicación a tratar y factores relevantes para la dosis con la que esté familiarizado un médico con destreza en el campo, los anticuerpos de la invención serán administrados a una dosis que es eficaz pretratamiento de esa indicación mientras que se reduce la toxicidad y efectos secundarios. La dosis deseada puede depender de la enfermedad y severidad del enfermedad, etapa de la enfermedad, nivel de modulación de célula B deseado, y otros factores familiares al médico con destreza en la técnica . Para tratamiento de una enfermedad autos Monde, puede ser conveniente el modular la extensión de agotamiento de células B dependiendo del enfermedad y/o la severidad de la condición en el paciente individual, ajustando la dosis del anticuerpo 2H7 humanizado. Agotamiento de células B puede pero no tiene que ser completo. O, agotamiento total de células B puede desearse en el tratamiento inicial personal totalmente subsecuentes, la dosis podrá ajustarse para lograr sólo agotamiento parcial. En una modalidad, el agotamiento de células B es al menos 20%, es decir 80% menos de las células B positivas CD20 que quedan en comparación con el nivel de línea base antes de tratamiento. Én otras modalidades, el agotamiento de células B es 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% o mayor. De preferencia, el agotamiento de células B es suficiente para detener el avance del enfermedad, más preferiblemente para aliviar los signos y síntomas de la enfermedad particular bajo tratamiento, aún más preferiblemente para curar la enfermedad. Las investigaciones de las clínicas Genentech y Biogen Idee han evaluado la efectividad terapéutica de tratamientos de enfermedades autoinmunes utilizando dosis de anti-CD20 (hu2H7.vl6 and Rituximab) en el intervalo tan bajo como 10 mg hasta una dosis de lg (ver bajo la sección antecedentes para estudios de Rituximab y WO 04/056312, Ejemplo 16). En general, los anticuerpos se administraron en estas investigaciones químicas en dos dosis, separadas aproximadamente dos semanas. Ejemplos de regímenes estudiados en las investigaciones clínicas incluyen para anticuerpo CD20 humanizado 2H7.vl6 en artritis reumatoide a 2 x 10 mg (significa 2 dosis de 10 mg por dosis; dosis total de -10.1 mg/m2 para un paciente de 70 kg, con altura de 1.70m (67 in) ) , 2 x 50 mg (dosis total de 55 mg/m2 para un paciente de 70 kg, con altura de 1.70 m (67 in) ) , 2 x 200 mg (dosis total de 220 mg/m2 para un paciente de 70 kg, con altura de 1.70 m (67 in) ) , 2 x 500 mg (dosis total de -550 mg/m2 para un paciente de 70 kg, con altura de 1.70 m (67 in) ) y 2 x 1000 mg (dosis total de -1100 mg/m2 para un paciente de 70 kg, con altura de 1.70 m (67 in) ) ; y para Rituxan, 2 x 500 mg (dosis total de -550 mg/m2 para un paciente de 70 kg, con altura de 1.70 m (67 in) ) , 2 x 1000 mg (dosis total de -1100 mg/m2 para un paciente de 70 kg, con altura de 1.70m (67 in) ) . En cada una de estas dosis, agotamiento sustancial de linfocitos B en circulación se observa después de la administración de la primer dosis del anticuerpo. En los presentes métodos para tratar enfermedades autoinmunes y agotar células B en un paciente que tiene una enfermedad autoinmune, en una modalidad, al paciente se le administra anticuerpo 2H7.v511 humanizado a una dosis plana en el intervalo de 0.1 mg a 1000 mg . Hemos encontrado que la dosis plana es menor a 300 mg, incluso a 10 mg, se logra substancial agotamiento de células B. De esta manera, en los presentes métodos de agotamiento y tratamiento de células B en diferentes modalidades, el anticuerpo hu2H7.v511 se administra a dosis de 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 15, 20 25, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 200, o 250 mg . Menores dosis, por ejemplo a 20 mg, 10 mg o menores pueden emplearse si el objetivo es agotamiento de células B parcial o a corto plazo. Para el tratamiento de un cáncer CD20 positivo, puede ser conveniente el llevar al máximo el agotamiento de las células B que son el objetivo de los anticuerpos anti-CD20 de la invención. De esta manera, para el tratamiento de un neoplasma de célula B CD20 positivo, es conveniente que el agotamiento de células B sea suficiente para cuando menos evitar el avance de la enfermedad, que puede estimarse por el médico con destreza en la técnica, por ejemplo al supervisar crecimiento de tumor (tamaño) , proliferación del tipo de células cancerosas, metástasis, otros signos y síntomas del cáncer particular. De preferencia, el agotamiento de células B es suficiente para evitar avance de la enfermedad por al menos 2 meses, más preferiblemente 3 meses, aún más preferiblemente 4 meses, más preferiblemente 5 meses, aún más preferiblemente 6 o más meses. En modalidades aún más preferidas, el agotamiento de células B es suficiente para incrementar el tiempo en remisión por al menos 6 meses, más preferible 9 meses, más preferiblemente un año, más preferiblemente 2 años, más preferiblemente 3 años, aún más preferiblemente 5 o más años. En una modalidad más preferida, el agotamiento de células B es suficiente para curar la enfermedad. En modalidades preferidas, el agotamiento de células B en un paciente de cáncer es al menos aproximadamente 75% y más preferible 80%, 85%, 90%, 95%, 99% e incluso 100% del nivel de línea base antes de tratamiento. Ejemplos de regímenes de dosificación y dosis de anticuerpos hu2H7 incluyendo vl6 y v511 para pruebas clínicas en el tratamiento de NHL se describen bajo los Ejemplos Experimentales 18-20 siguientes. Dosis a mg/dosis de 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350 mg/dosis también pueden utilizarse en terapia de mantenimiento para malignidades de células B tales como NHL. La frecuencia de dosis puede variar en varios factores. Al paciente se le administrará al menos 2 dosis del anticuerpo de enlace 2H7 CD20 humanizado, y en diferentes modalidades puede recibir 2-4, 2-8 dosis, 2-10 dosis. Típicamente, las 2 dosis se administran con una separación de un mes, generalmente 1, 2 o 3 semanas. Dependiendo del nivel de mejora en la enfermedad o recurrencia, adicionales dosis pueden administrarse sobre el curso de enfermedad o como terapia para mantenimiento de enfermedad. Pacientes que tienen una enfermedad autoinmune en una malignidad de células B para quienes una o más terapias actuales fueron ineficaces, eficientemente toleradas o contraindicadas, pueden tratarse utilizando cualquiera de los regímenes de dosis de la presente invención. Por ejemplo, la invención contempla los presentes métodos de tratamiento para pacientes RA quienes han tenido una respuesta inadecuada a terapias para inhibición de factor de necrosis de tumor (TNF) o a terapia de drogas anti -reumáticas que modifican la enfermedad (DMARD) . En otra modalidad, el tratamiento a bajas dosis 200 mg/dosis o menos es útil en terapia de mantenimiento. En una modalidad, las presentes dosis y régimen de dosificación se utilizan para tratar artritis reumatoide (RA) . Administración "crónica" se refiere a la administración de el o los agentes en un modo continuo en oposición a un modo agudo, para mantener el efecto (actividad) terapéutico inicial por un periodo prolognado de tiempo. Administración "intermitente" es tratamiento que no es realizado consecutivamente sin interrupción, sino más bien es cíclico en naturaleza. .Rutas de administración Los anticuerpos 2H7 humanizados se administran a un paciente humano de acuerdo con métodos conocidos, tal como por administración intravenosa, por ejemplo como un bolo o infusión continua sobre un periodo de tiempo, por rutas subcutáneas intramusculares, intraperitoneales, intracerobroespinales , intra-articulares , intrasinoviales, intratecales o de inhalación, en general por administración intravenosa o subcutánea. En una modalidad, el anticuerpo 2H7 humanizado se administra por infusión intravenosa con solución de cloruro de sodio al 0.9% como un vehículo de infusión. En otra modalidad, el anticuerpo 2H7 humanizado se administra por inyección subcutánea. Terapia de Combinación Para tratar los neoplasmas de células B descritos anteriormente, el paciente puede ser tratado con los anticuerpos 2H7 humanizados de la presente invención en conjunto con uno o más agentes terapéuticos tales como un agente quimioterapéutico en un régimen de múltiples drogas. El anticuerpo 2H7 humanizado puede ser administrado en forma concurrente, secuencial o alterna con el agente quimioterapéutico, o después de falta de respuesta con otra terapia. Quimioterapia estándar para tratamiento de linfoma puede incluir ciclofosfamida, citarabina, melfalan y mitoxantrona más melfalan. CHOP es una de los regíemens de quimioterapia más comunes para tratar linfoma No-Hodgkin. Los siguiente son drogas empleadas como el régimen CHOP: ciclofosfamida (nombres comerciales citoxan, neosar) ,- adriamicina (doxorubicina/ hidroxidoxorubicina) ,- vincristina (Oncovin) ; y prednisolona (en ocasiones denominada Deltasone o Orasone) . En modalidades particulares, el anticuerpo de enlace CD20 se administra a un paciente que lo requiere en combinación con uno o más de los siguientes agentes quimioterapéuticos de doxorubicina, ciclofosfamida, vincristina y prednisolona. En una modalidad específica, un paciente que sufre de un linfoma (tal como linfoma no-Hodgkin) se trata con un anticuerpo 2H7 humanizado de la presente invención en conjunto con terapia de CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisona) . En otra modalidad, el paciente de cáncer puede ser tratado con un anticuerpo que liga 2H7 CD20 humanizado de la invención en combinación con quimioterapia CVP (ciclofosfamida, vincristina y prednisona) . En una modalidad específica, el paciente que sufre de NHL CD20-positivo se trata con 2H7.v511 humanizado en conjunto con CVP. En una modalidad específica del tratamiento de CLL, el anticuerpo hu2H7.v511 se administra en conjunto con quimioterapia con uno o ambos de fludarabina y citoxan. Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida CYTOXAN®; alquil sulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; TLK 286 (TELCYTA™) ; acetogeninas (en especial bullatacina y bullatacinona) ,- delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®) ,- beta-lapacona; lapacol; colchicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®) , CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotecina, scopolectin, y 9-aminocamptotecina) ; briostatina; callistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina) ,- podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (en particular criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1) ,- eleuterobina,- pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina,- mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro óxido de mecloretamina, melfalan, novembichin, phenesterine, prednimustine, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina,- bisfosfonatos, tales como clodronato; antibióticos tales como los antibióticos enediina (es decir, calicheamicina, en especial calicheamicina gammall y calicheamicina omegall (ver, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)) y antraciclinas tales como annamicina, AD 32, alcarubicina, daunorubicina, dexrazoxana, DX-52-1, epirubicina, GPX-100, idarubicina, KRN5500, menogaril, dinemicina, incluyendo dinemicina A, una esperamicina, neocarzinostatina cromóforo y cromóforos antibióticos de cromoproteína enediina, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinis, dactinomicina, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina ADRIAMYCIN® (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, liposomal doxorubicina y deoxidoxorubicina) , esorubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicin, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidin, ubenimex, zinostatina, y zorubicina; análogos de ácido fólico tales como denopterina, pteropterina, y trimetrexato; análogos purina tales como fludarabina, 6 -mercaptopurina, tiamiprina y tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, y floxuridina; andrógenos tales como calusterona, dromostanolona propionato, tales como epitiostanol , mepitiostana y testolactona; anti-adrenaless tales como aminoglutetimida, mitotano y trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido folínico (leucovorin) ,-aceglatona; agentes anti-neoplásticos anti-folato tales como ALIMTA®, LY231514 pemetrexado, inhibidores de dihidrofolato reductasa tales como metotrexato, anti-metabolitos tales como 5-fluorouracil (5-FU) y sus prodrogas tales como UFT, S-l y capecitabina, e inhibidores de timidilato sintasa e inhibidores de glicinamida ribonucleótido formiltransferasa tales como raltitrexed (TOMUDEXRM, TDX) ; inhibidores de dihidropiri idina dehidrogenasa tales como eniluracil aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulínico amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio,- una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maytansinoides tales como maytansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol ,- nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida,- procarbazina; complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina; sizofiran,- ácido tenuazónico espirogermanio,- triaziquona; 2 , 2 ' , 2" -triclorotrietilamina; tricotecenos (en especial T-2 toxina, verracurin A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) ; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"),• ciclofosfamida; tiotepa; taxoides y taxanos, por ejemplo paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), formulación de nanopartículas de paclitaxel de ingeniería de albúmina libre de Cremofor ABRAXANEMR, (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) , y doxetaxel TAXOTERE® (Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ,- cloranbucilo; gemcitabina (GEMZAR®) ,- 6-tioguanina; mercaptopurina; platino; análogos de platino o análogos basados en platino tales como cisplatina, oxaliplatina y carboplatina; vinblastina (VELBAN®) ; etoposido (VP-16) ,- ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®) ; vinca alcaloide; vinorelbina (NAVELBINE®) novantrona,- edatrexato; daunomicina; aminopterina xeioda; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000 difluorometilornitina (DMFO) ,- retinoides tales como ácido retinoico; sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisolona, y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatin (ELOXATINTM) combinado con 5 -FU y leucovorina . También se incluye en esta definición agentes anti -hormonales que actúan para regular o inhibir acción de hormonas en tumores tales como anti -estrógenos y moduladores receptores de estrógenos selectivos (SERMs = selective estrogen receptor modulators) , incluyendo por ejemplo, tamoxifen (incluyen tamoxifen NOLVADEX®) , raloxifen, droloxifen, 4-hidroxitamoxifen, trioxifen, queoxifen, LY117018, onapristona y toremifene FARESTON®; inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regulan producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como por ejemplo, 4 (5) -imidazoles , aminoglutetimida, megestrol acetato MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestani, fadrozol, RIVISOR® vorozol , letrozol FEMARA®, y anastrozol ARIMIDEX®; y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; así como troxacitabina (un análogo de 1,3-dioxolan nucleósido citosina) ; oligonucleótidos anti sentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en proliferación de células aberrantes, tales como por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) ; vacunas tales como vacunas para terapia de genes, por ejemplo vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECA ®; ABARELIX® rmRH; y las sales, ácidos y derivados farmacéuticamente aceptables, de cualquiera de los anteriores . Para tratar las enfermedades autoinmunes o condiciones autoinmune relacionadas descritas anteriormente, el paciente puede ser tratado con uno o más anticuerpos hu2H7 tales como hu2H7.v511, en conjunto con un segundo agente terapéutico, tal como un agente inmunosupresor, tal como un régimen de múltiples drogas. El anticuerpo hu2H7 puede ser administrado en forma concurrente, secuencial o alterna con el agente inmunosupresor o ante no respuesta con otra terapia. El agente inmunosupresor puede administrarse a iguales o menores dosis que como se establece en la técnica. El agente inmunosupresor auxiliar preferido dependerá de muchos factores, incluyendo el tipo de desorden a tratar así como la historia del paciente. "Agente inmunosupresor" como se emplea aquí para terapia auxiliar se refiere a sustancias que actúan para suprimir o enmascarar el sistema inmune de un paciente. Estos agentes incluirán sustancias que suprimen producción de citocina, regulan a la baja o suprimen la expresión auto-antígeno, o enmascaran los antígenos MHC. Ejemplos de estos agentes incluyen esteroides tales como glucocorticosteroides, por ejemplo prednisona, metilprednisolona y dexametasona; pirimidinas 2-amino-6-aril-5-substituidas (ver patente de los E.U.A. No. 4,665,077), azatioprina (o ciclofosfamida, si hay una reacción adversa a azatioprina) ,- bromocriptina; glutaraldehido (que enmascara los antígenos MHC, como se describe en la patente de los E.U.A. No. 4,120,649); anticuerpos anti-idiotípicos para antígenos MHC y fragmentos MHC; ciclosporina A; citocina o antagonistas de receptor de citocina incluyendo anticuerpos de anti-interferona- / , ß , o a ; anticuerpos de factor a de necrosis anti-tumor; anticuerpos de factor ß de necrosis anti-tumor; anticuerpos anti-interleucina-2 y anticuerpos receptores anti-IL-2; anticuerpos anti-L3T4; globulina anti-linfocito heteróloga; anticuerpos pan-T, de preferencia anti-CD3 o anticuerpos anti-CD4/CD4a; péptitio soluble que contiene un dominio de enlace LFA-3 (WO 90/08187 publicada en 7/26/90); estreptocinasa; TGF-/?; estreptodornasa; RNA o DNA del anfitrión; FK506; RS-61443; deoxispergualina; rapamicina; receptor de célula T (patente de los E.U.A. No. 5,114,721); fragmentos receptores de célula T (Offner et al., Science 251:430-432 (1991); WO 90/11294; y WO 91/01133); y anticuerpos receptores de células T (EP 340,109) tal como T10B9. Para el tratamiento de artritis reumatoide, el paciente puede ser tratado con un anticuerpo hu2H7 en conjunto con cualquiera una o más de las siguientes drogas: drogas antirreumáticas que modifican la enfermedad (DMARDS= disease-modifying anti -rheumatic drugs (por ejemplo, metotrexato) , drogas antinflamatorias no esteroidales (NSAI o NSAID= non-steroidal anti-inflammatory drugs) , HUMIRAMR (adalimumab; Abbott Laboratories) , ARAVA® (leflunomida) , REMICADE® (infliximab; Centocor Inc., of Malvern, Pa) , ENBREL (etanercept; Immunex, WA) , inhibidores COX-2. DMARDs comúnmente empleados en RA son hidroxicloroquina, sulfasalazina, metotrexato, leflunomida, etanercept, infliximab, azatioprina, D-penicilamina, Oro (oral) , Oro (intramuscular) , minociclina, ciclosporina, inmunoadsorción proteína A de estafilococos. Adalimumab es un anticuerpo monoclonal humano que liga a TNFa . Infliximab es un anticuerpo monoclonal quimérico que liga a TNFa . Etanercept es una proteína de fusión "de immunoadhesina" que consiste de la porción de enlace de ligando extracelular del receptor de factor de necrosis de tumor (TNFR = tumor necrosis factor receptor) de 75 kD (p75) humano enlazado a la porción Fc de un IgGl humano. Para tratamiento convencional de RA, ver por ejemplo, "Guidelines for the management of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheumatism 46(2): 328-346 (Febrero, 2002). En una modalidad específica, el paciente RA se trata con un anticuerpo hu2H7 CD20 de la invención en conjunto con (MTX) . Una dosis ejemplar de MTX es aproximadamente 7.5-25 mg/kg/semana . MTX puede administrarse oral o subcutáneamente . Para el tratamiento de spondilitis ankilosante, artritis soriatica y enfermedad de Crohn, el paciente puede ser tratado con un anticuerpo de enlace CD20 de la invención en conjunto por ejemplo con, Remicade® (infliximab; de Centocor Inc., de Malvern, Pa.) , ENBREL (etanercept; Immunex, WA) . Tratamientos para SLE incluyen altas dosis de corticoesteroides y/o ciclosfosfamida (HDCC) . Para el tratamiento de psiorasis, pacientes pueden administrarse de un anticuerpo de enlace CD20 en conjunto con tratamientos tópicos, tales como esteroides tópicos, antralina, calcipotrieno, clobetasol, y tazaroteno, o con metotrexato, retinoides, ciclosporina, terapias PUVA y UVB. En una modalidad, el paciente de psiorasis se trata con un anticuerpo de enlace CD20 secuencialmente o en forma concurrente con ciclosporina. Para minimizar toxicidad, las terapias sistémicas tradicionales pueden ser administradas en regimenes de tratamiento rotacionales, secuenciales, combinatorios o intermitentes, o regimenes de combinación de menores dosis con las composiciones de anticuerpo de enlace hu2H7 CD20 en las actuales dosis.

Formulaciones Farmacéuticas Formulaciones terapéuticas de los anticuerpos de enlace hu2H7 CD20 empleados de acuerdo con la presente invención se preparan para almacenamiento al mezclar un anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con portadores excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol , A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Portadores excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para recipientes a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecilmetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de benzetonio; fenol, butil o benzil alcohol; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; and m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (con menos de aproximadamente 10 residuos) ,- proteínas, tales como albúmina, suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; amino ácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lysina; monosacáridos, disacaridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azucares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra- iones formadores de sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo complejos de proteína-Zn) ,- y/o surfactantes no-ionicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilen glicol (PEG) . Formulaciones de anticuerpo hu2H7 ejemplares se describen en W098/56418, expresamente incorporadas aquí por referencia. Otra formulación es una formulación de múltiples dosis líquida que comprende el anticuerpo hu2H7 a 40 mg/mL, acetato 25 mM, trehalosa 150 mM, benzil alcohol a 0.9% , polisorbato 20 a 0.02% a pH 5.0 que tiene una vida en estante mínima de dos años a 2-8 grados C. Otra formulación de anticuerpo anti-CD20 de interés comprende lOmg/mL, anticuerpo en 9.0 mg/mL, cloruro de sodio, 7.35 mg/mL dihidrato de citrato de sodio, 0.7mg/mL polisorbato 80, y Agua Estéril para Inyección pH 6.5. Todavía otra formulación farmacéutica acuosa comprende acetato de sodio 10-30 mM de aproximadamente pH 4.8 a aproximadamente pH 5.5, de preferencia pH5.5, polisorbato como surfactante en una cantidad de aproximadamente 0.01-0.1% p/v, trehalosa en una cantidad aproximadamente 2-10% p/v y benzil alcohol como un conservador (patente de los E.U.A. no. 6,171,586). Formulaciones liofilizadas adaptadas para administración subcutánea se describen en WO97/04801. Estas formulaciones liofilizadas pueden ser reconstituidas con un diluyente conveniente a una alta concentración de proteína y la formulación reconstituida puede ser administrada subcutáneamente al mamífero a tratar. Una formulación para la variante 2H7.v511 humanizada es del anticuerpo a 12-14 mg/mL en histidina 10 mM, sacarosa al 6%, polisorbato 20 al 0.02%, pH 5.8. En una modalidad específica, variantes 2H7 y en particular 2H7.v511 se formula a 20mg/mL anticuerpo en sulfato histidina lOmM, 60mg/ml sacarosa, 0.2 mg/ml de polisorbato 20 y Agua Estéril para Inyección a pH5.8. La presente formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular a tratar, de preferencia aquellos con actividad complementarias que no afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser conveniente el proporcionar en forma adicional un agente citotoxico, agente quimioterapeutico, citocina o agente inmunosupresor (por ejemplo uno que actúa en células T, tal como ciclosporina o un anticuerpo que liga a células T, por ejemplo uno que liga a LFA-1) . La cantidad efectiva de estos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de enfermedad, de desorden o tratamiento y otros factores discutidos anteriormente. Estos en general se emplean en las mismas dosis con rutas de administración como se describe aquí o aproximadamente de 1 a 99% de las dosis previamente empleadas . Los ingredientes activos también pueden ser atrapados en micro cápsulas preparadas por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo hidroximetilcelulosa o micro cápsulas de gelatina y micro cápsulas de poli- (metilmetacrilato) respectivamente en sistemas de suministro de droga coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas se discuten en Remington's Pharmaceutical Sciences 16ava edición, Osol , A. Ed. (1980). Pueden elaborarse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos convenientes de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semi -permeables de polímeros hidrfóbicos sólidos que contienen el antagonista, estas matrices están en la forma de artículos conformados, por ejemplo películas o micro cápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxyetil-metacrilato) , o poli (vinilalcohol) ) , o polilactidas (Patente de los E.U.A. No. 3,773,919), copolimeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, etilen-vinil acetato no degradable, copolimeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOTMR (microesferas inyectables compuestas por copolimero de ácido láctico-ácido glicólico y leuprolida acetato), y ácido poli-D- ( - ) -3-hidroxibutírico. Las formulaciones a utilizarse para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membrana de filtración estéril. Artículos de Manufactura y Equipos Otra modalidad de la invención es un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento de enfermedades autoinmunes y condiciones relacionadas y cánceres CD20 positivos tales como linfoma no-Hodgkin's. El artículo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de empaque en o asociado con el recipiente. Recipientes convenientes incluyen por ejemplo botellas, ampolletas, jeringas, etc. Los recipientes pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que sea efectiva para tratar la condición y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o ampolleta que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . Cuando menos un agente activo en la composición es un anticuerpo hu2H7, por ejemplo hu2H7.v511 de la invención. La etiqueta o inserto de paquete indica que la composición se utiliza para tratar la condición particular. La etiqueta o inserto de paquete además comprende la instrucción para administrar la composición de anticuerpo al paciente. El inserto de paquete se refiere a instrucciones usualmente incluidas en paquetes comerciales de productos terapéuticos que contienen información respecto a los ingredientes, uso, dosis, administración, contraindicaciones y/o advertencias referentes al uso de estos productos terapéuticos. En una modalidad, el inserto de paquete indica que la composición se utiliza para tratar linfoma no-Hodgkins. Adicionalmente, el artículo de manufactura además puede comprender un segundo recipiente que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable tal como agua para inyección bacteriostática (BWFI bacteriostatic water for injection) , salino amortiguado con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además puede incluir otros materiales convenientes desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas . También se proporcionan equipos que son útiles para diversos propósitos, por ejemplo, para los ensayos de destrucción de células B, como un control positivo para ensayos de apoptosis, para purificación o inmunoprecipitación de CD20 de células. Para aislamiento y purificación de CD20, el equipo puede contener un anticuerpo hu2H7.v511 acoplado con perlas (por ejemplo, perlas de sefarosa) . Pueden proporcionarse equipos que contienen los anticuerpos para detección y cuantificación de CD20 in vitro, por ejemplo en un ELISA o transferencia Western. Como con el artículo de manufactura, el equipo comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de paquete en o asociado con el recipiente. El recipiente, contiene una composición que comprende al menos un anticuerpo anti-CD20 de la invención. Recipientes adicionales pueden incluirse que contienen por ejemplo, diluyentes y amortiguadores, anticuerpos de control. La etiqueta o inserto de paquete puede proporcionar una descripción de la composición así como instrucciones para el uso pretendido in vi tro o de diagnóstico. Ejemplos Experimentales Ejemplo 1 Conversión de una línea celular existente a una línea celular menos fucosilada. Para lograr altos rendimientos de anticuerpos no- fucosilados en células CHO, el enfoque de RNAi se emplea para eliminar la expresión del gen FUT8. Plásmido pSilencer 3.1-Hl-Puro de Ambion, Inc. (Austin, TX) se utiliza para producir siRNA de horquilla corto que consiste de secuencia siRNA sentido 19nt (nucleótido) específica al gen de FUT8 , enlazado a su secuencia siRNA antisentido complementaria inversa por un espaciador corto (bucle de horquilla de 9nt) , seguido por 5-6 U' s en el extremo 3' (Fig. 3). El método empleado para designar sondas siRNA para ser blanco al gen CHO FUT8 se describió por Elbashir et al (2002) . Cinco diferentes sondas siRNA se diseñaron (sondas #1-5) para ser blanco a las diferentes regiones basado en la secuencia FUT8 D?A disponible (Fig. 4). La Sonda 1 (SEQ ID ?0.3 y ?0.4); Sonda 2 (SEQ ID ?0.5 y ?0.6); Sonda 3 (SEQ ID ?0.7 y ?0.37); Sonda 4 (SEQ ID ?0.38 y ?0.39); Sonda 5 (SEQ ID ?O.40 y ?0.41). La secuencia de codificación siR?A que consiste de la secuencia sentido 19nt enlazada por el espaciador a la secuencia antisentido y 5-6 U' s es SEQ ID ?O. 42 en la sonda #2 (posiciones 7 a 59 en SEQ ID 5) y SEQ ID ?O. 43 en la sonda #4. Las sondas 1-5 corresponden a R?Ai 1-5 en la Fig. 5B. La cinco sondas siR?A se construyeron utilizando oligonucleotidos sintéticos alineados o hibridizados, independientemente clonados en el plásmido pSilencer 3.1-Hl-Puro. Para probar la eficacia de estas sondas RNAi , una proteína de fusión FUT8 con etiqueta FLAG se contruye utilizando la secuencia DNA parcial CHO FUT8 de Genbank (número de acceso P_AAC63891) . Un fragmento 3' 0.98 kb de la secuencia de codificación FUT8 se clona por reacción de cadena polimerosa de transcripción inversa (RT-PCR) utilizando RNA total purificado de células CHO y cebadores FUT8 y el fragmento PCR resultante se fusiona con la secuencia de etiqueta 5' FLAG. Una etiqueta FLAG de 8 amino ácidos (metAspTyrLysAspAspAspAspLys - SEQ ID NO. _ ) se agrega al extremo 5' de la secuencia cDNA parcial aislada. El fragmento FUT8 etiquetado se clona en un vector de expresión. El plásmido sonda RNAi y el plásmido FUT8 etiquetado con FLAG se cotransectan en células CHO. Lisado celular se extrae 24 horas después de transfección y el nivel de proteína de fusión FUT8 se analiza por anticuerpo M2 anti -flag (Sigma, MO) por inmunotransferencia. En la presencia de sondas R?Ai, la expresión proteína de fusión se inhibe significativamente en cuatro de los cinco casos (Fig. 5) . La capacidad de estas sondas para escindir la transcripción FUT8 se probó por cotransfección transitoria de cada plásmido de expresión siRNA con el plásmido FUT8 etiquetado Flag-en células CHO. Las células se lisaron 24 horas después de tranfección y el lisado celular se analizó por transferencia western con anticuerpo FlagM2 (Sigma, Mo) . Células transfectadas RNAil (sonda 1) , como se espera, mostraron fuerte expresión del producto FUT8 etiquetado Flag, ya que la proteína de fusión FUT8 etiquetada Flag no contiene la secuencia objetivo por esa sonda (Fig. 5A, 5B) . En contraste, las sondas 2 (RNAÍ2 ) a 5 siR?A todas tienen los diversos grados de efectos inhibitorios de expresión de proteína de fusión FUT8 etiquetada Flag (Fig. 5B) . La sonda #2 y #4 muestran el mejor efecto inhibitorio y fueron seleccionadas para mayor evaluación. EJEMPLO 2 Contenido de fucosa de anti cuerpos expresados en forma estable manipulados por expresión siR?A transitoria : Plásmidos R?AÍ2 y R?AÍ4 se transfectaron en forma transitoria en una línea celular CHO estable, previamente establecida que expresa un anticuerpo anti-CD20 humanizado, 2H7.vl6 (clon #60). Las células transfectadas después se sembraron separadamente en vasos de centrifugador de 250 ml en medio libre de suero para producción de anticuerpo. El anticuerpo 2H7.vl6 expresado y secretado en el fluido de cultivo celular cosechado se purifica por una columna de proteína A y oligosacáridos N-enlazados se analizaron para contenido de fucosa por análisis espectral de tiempo-de-vuelo desde solución/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF = matrix-assisted láser desorption/ionization time-of-flight ) , como se describe en Papac et al., 1998. El anticuerpo también se ensayó en un ensayo de enlace Fc/R (descrito a continuación) . Hay tres grupos de receptores Fc/ humano: Fc/RI, Fc/RII, y Fc/RIII. Algunos de estos tienen un polimorfismo alélico funcional que genera alotipos con diferentes propiedades de receptor (Dij stelbloem et al., 1999; Lehrnbecher et al., 1999). Fc/ RUI (F158) tiene fenilalanina en la posición 158 y tiene una menor afinidad de enlace para la región Fc de IgGs que Fc/ RUI (V158) que tiene valina en la posición 158 (Shields et al., 2001 y 2002). Las células RNAi transitoriamente transfectadas producen aproximadamente 35 a 37 por ciento de anticuerpo 2H7 no-fucosilado como se muestra en la FIG.6. Comparado con la línea celular de control 2H7 (transfectada con plásmido RNAi irrelevante) que tiene aproximadamente 2 a 4 por ciento de anticuerpo no-fucosilado, un nivel típico de anticuerpos generados de células CHO regulares, el conjunto de anticuerpos 2H7 con 35 a 37 por ciento sin fucosilación mostró un incremento de 6 y 4 veces en afinidad de enlace hacia Fc/RIII (alelo F158) y Fc/RIII (alelo V158) , respectivamente (Fig. 7D, 7E ) . No se notó efecto con otros receptores Fc (por ejemplo Fc/Rl y Fc/RII - ver FIG. 7A, 7B, 7C) . Glicanos aislados de anticuerpos producidos a partir tanto de plásmído RNAi transfectado como células de tranfección simulada tuvieron similares distribuciones de contenidos de galactosa cuando se compararon estructuras sin galactosa (GO) , una galactosa (Gl) y dos galactosas (G2) . Estos datos muestran que el contenido de fucosa de anticuerpos secretados de una línea celular de producción estable pueden disminuirse por transfección de plásmido R?Ai transitoria y que el efecto no altera las otras composiciones principales de glicano incluyendo la distribución GO, Gl y G2. Para confirmar que las células transfectadas R?Ai tienen menos expresión FUT8 R?A, se realizó una transferencia Northern utilizando muestras de RNA extraídas de las células transfectadas, 24 horas después de tranfección. RNA total de células que contienen un plásmido de control (secuencia de DNA de ratón al azar, sin homología a ningunas proteínas de ratón conocidas) y 2 plásmidos RNAi se purificaron e hibridizaron con una sonda de 300 bp . Como se muestra en la FIG. 8, el nivel de mRNA fue eliminado en dos células transfectadas RNAi (pistas 2 y 3) . Esto concuerda con la inmunotransferencia en donde se detectó menor cantidad de proteína FUT8 en dos células transfectadas de plásmido R?Ai. El tamaño de mR?A CHO FUT8 es similar a aquél en células de ratas, que es de aproximadamente 3.5 kb. La eliminación de RNAa 1, 6-fucosiltransferasa endógena se confirma adicionalmente por PCR cuantitativo (no se muestran los datos) . Ya que ambas construcciones R?AÍ2 y RNAÍ4 pueden eliminar eficientemente el nivel de R?A gen FUT8 endógeno, sólo el plásmido R?AÍ4 se elige para utilizarse en adicional transfección estable. El clon de línea celular de anticuerpo 60 que está a una resistencia de metotrexato 600 nM (MTX) y produce más de 1.5 g/L en bioreactor se transfectó en forma estable con la construcción R?AÍ4 en donde el gen puromicina de el plásmido pSilencer se retiró y reemplazó por hidromicina bajo el control de promotor SV40 y seleccionó con /g/ml de hidromicina. Los ciónos positivos se recogieron en una placa de cultivo de tejido de 96 pozos y cribaron por Taqman para nivel de mRNA FUT8 endógeno. Los 4 ciónos que muestran diferentes niveles decreciente de mR?A FUT8 se aumentaron en escala para producir el anticuerpo en centrifugadores de 250 ml . Anticuerpos en HCCF fueron purificados con proteína A y sometieron para ensayo de contenido de fucosa y ensayo de enlace Fc/RIII. Los resultados de FIG. 7A-E mostraron que los receptores Fc/ prueban sólo enlace Fc/RIII fue afectado con anticuerpo que contiene menor fucosa. Por lo tanto, los productos de anticuerpo de la transfección estable se presentaron sólo para ensayos de enlace Fc/RIII. Análisis de contenido de fucosa mostró que las 4 líneas producen anticuerpo no-fucosilado en el intervalo de 45 a 70 por ciento o 80 por ciento. Anticuerpos que contienen 5 niveles diferentes de fucosilación se ensayaron por su enlace a Fc/RIII. Ensayo de enlace Fc/RIII mostró que una mejora incrementada con Fc/RIII (F158) de baja afinidad que Fc/RIII (V158) como se muestra en la Tabla 1. Cuando se trazó el incremento de pliegue contra el cuadrado del por ciento de material no-fucosilado en cada muestra de anticuerpo, se notó una relación lineal para ambas variantes Fc/RIII. IgGl humano intacto contiene dos cadenas pesadas, cada una con un sitio de N-glicosilación en Asn297 en el dominio CH2 de la región Fc . Por lo tanto, hay tres posibilidades para el Fc en términos de ocupación de fucosa de la estructura carbohidrato núcleo.

Una cadena pesada es fucosilada y una no. Ambas cadenas pesadas están fucosiladas,- o ninguna cadena pesada está fucosilada. La relación linear entre el incremento en pliegue en afinidad Fc/RIII y el cuadrado del por ciento de glicanos no-fucosilados indica que en este caso moléculas de anticuerpo con ninguna cadena pesada fucosilada pueden proporcionar la contribución mayor a la mejora de afinidad de enlace Fc/RIII incrementada. En un aumento en la escala adicional de producción de anticuerpo por dos de los ciónos de transfección estables a un bioreactor, el análisis de contenido de fucosa mostró que el nivel de fucosilación permaneció estable sobre el periodo estudiado de 79 días a aproximadamente 80 por ciento de no-fucosilación. Títulos de anticuerpo así como GO, Gl y G2 en glicanos de anticuerpo también estuvieron en el rango esperado al final de la corrida del bioreactor. Por lo tanto, transfección del plásmido RNAi en una línea celular de producción de proteína establecida, línea celular de producción de anticuerpo en este caso, es un enfoque que puede emplearse para generar células anfitrionas que producen cantidades comerciales de un anticuerpo terapéutico con cantidades controladas del carbohidrato no-fucosilado . Table 1. Afinidades de enlace de Fc/RIII con anticuerpos de diferentes contenidos de fucosa EJEMPLO 3 En este ejemplo, se construye una versión de plásmido RNAi que contiene dos unidades de transcripción RNAi, haciendo blanco a dos regiones diferentes de gen FUT8. Este plásmido fue más potente que la versión previa que hace blanco sólo en una región del gen. EJEMPLO 4 Generación de nueva línea celular estable con ingeniería metabólica simultánea de contenido de fucosa (eliminación de nivel de fucosilación) . Materiales y Métodos Cul tivo Celular y Transfección Células de Ovario de Hámster Chino (CHO) se desarrollaron en medio de crecimiento con FBS al 5 por ciento (suero bovino fetal) y IX GHT (glicina, hipoxantina, y timidina) a 37 grados C. Para transfección transitoria, se utilizó reactivo de transfección DMRIE-C y (Invitrogen) . Para transfección estable, se utilizó Lipofectamine 2000 (Invitrogen) . Selección Después de transfección, las células se centrifugaron para recolectar el precipitado. El precipitado después se resuspende en medio que contiene metotrexato 25 nM (MTX) . Medio se cambió cada 3 a 4 días. Aproximadamente 2 semanas después de tansfección, se recolectaron ciónos individuales y desarrollaron en placas de 96 pozos. Usualmente tarda 1 semana aproximada para que las células crezcan a confluecia en una placa de 96 pozos. Ensayo de Densidad de Siembra Igual 5X 104 células/pozos se sembraron en la placa de 96 pozos. Al día siguiente, el medio de crecimiento se retiró y reemplazó con medio de producción. El día después de agregar el medio de producción, la placa se incubó a 33 grados C por 5 a 6 días antes del ensayo ELISA. Ensayo ELISA Cuando las células son confluentes, el medio de crecimiento se retira y se agrega medio de producción en cada pozo. El día después de agregar el medio de producción, la placa se incuba a 33 grados C por 5 a 6 días antes del ensayo ELISA. Típicamente, se realiza un ELISA con diluciones en serie. Análi si s RNA RNA total se purifica con equipo de purificación RNA de Qiagen y cuantifica por Taqman con cebadores y sondas específicas de gen. Ensayo de Enlace Receptor Fc? -ELISA Placas de micropozos de 96 pozos MaxiSorp (Nunc, Roskilde, Dinamarca) se revistieron con 2 //g/ml de anti-GST (clon 8E2.1.1, Genentech), a 100 µ l /pozo en amortiguador carbonato 50mM, pH 9.6, a 4 grados C durante la noche. Las placas se lavaron con PBS que contiene polisorbato 0.05 por ciento, pH 7.4 (amortiguador de lavado) y bloquearon con PBS que contiene 0.5 por ciento BSA, pH 7.4, a 150 µ l /pozo. Después de incubación de una hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron con amortiguador de lavado. Fc/RIII humano se agrega a las placas a 0.25 g/ml, 100 /1/pozo, en PBS que contiene BSA al 0.5 por ciento, polisorbato 20 a 0.05 por ciento, pH 7.4. (amortiguador de ensayo). Las placas se incubaron por una hora y lavaron con un amortiguador de lavado. Anticuerpos se incubaron con anti-K" de cabra F(ab')2 (Cappel, ICN Pharmaceuticals, Inc., Aurora, Ohio) en una proporción 1:2 (p/p) por una hora para formar complejos de anticuerpo. Once dilusiones en serie dobles de anticuerpos IgG complejado (0.85-50000 ng/ml en dilución en serie triple) en amortiguador de ensayo se agregaron a las placas. Después de incubación por dos horas, las placas se lavaron con amortiguador de lavado. IgG ligado se detecta al agregar IgG F(ab')2 anti-humano cabra F(ab')2 etiquetada con peroxiadasa (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) a 100 1/pozo en amortiguadores de ensayo. Después de una incubación de una hora, las placas se lavaron con amortiguador de lavado y el sustrato 3 , 3 ' , 5 , 5 ' -tetrametil benzidina (TMB) (Kirkegaard & Perry Laboratories) se agrega a 100 µ l /pozo. La reacción se detiene al agregar ácido fosfórico 1 M a 100 µ l /pozo. La absorbancia se lee a 450 nM en un lector multiskan Ascent (Thermo Labsystems, Helsinki, Finlandia) . La absorbancia al punto medio de la curva estándar (mid-OD) se calcula. Las concentraciones correspondientes de estándar y muestras en este mid-OD se determina a partir de las curvas de titulación utilizando un programa de ajuste de curva de regresión no lineal de 4 parámetros (KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA) . La actividad relativa se calcula al dividir la concentración mid-OD del estándar con el de la muestra.

Ensayos de Ci totoxicidad Celular dependiente de anticuerpo (ADCC) Un formato de ensayo ADCC fue como sigue. Variantes 2H7 IgG se ensayaron por su habilidad para mediar lisis de célula destructora natural (células NK) de células WIL2-S, una línea de células B linfoblastoides que expresan CD20, esencialmente como se describe (Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)) utilizando una lectura lactato de dehidrogenasa (LDH) . Células NK se prepararon a partir de 100 mL de sangre heparinizada, diluyeron con 100 mL de PBS (salina amortiguado con fosfato) , obtenidas de donadores humanos normales que han obtenido isotipo para Fc/RIII, también conocidos como CD16 (Koene et al., Blood 90:1109-1114 (1997) ) . Las células NK pueden ser de donadores humanos heterocigotos para CD16 (F158/V158) de homocigotos para V158 o F158. La sangre diluida se formo en capas sobre 15 mL de medio de separación de linfocito (ICN Biochemical, Aurora, Ohio) y centrifugaron por 20 minutos a 2000 RPM. Glóbulos blancos en la interfase entre la capas se surtieron a 4 tubos limpios de 50-mL, que se llenaron con medio RPMl que contiene 15% de suero bovino fetal. Los tubos se centrifugaron por 5 minutos a 1400 RPM y el sobrenadante se descarto. Los precipitados se resuspendieron en amortiguador MACS (0.5% BSA, 2 mM EDTA) , y células NK se purificaron utilizando perlas (equipo de aislamiento celular NK, 130-046-502) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotech, ) . Células NK se diluyeron en amortiguador MACS a 2 x 106 células/mL. Diluciones en serie de anticuerpo (0.05 mL) en medio de ensayos (F12/DMEM 50:50 sin glicina, amortiguador HEPES 1 mM pH 7.2, Penicilina/Estreptomicina (100 unidad/mL; Gibco) , glutamina, y suero bovino fetal termo inactivado al 1%) se agregaron a un placa de cultivo de tejido de fondo redondo de 96 pozos. Células WIL2-S se diluyeron en amortiguador de ensayo a una concentración de 4 x 105/mL. Células WIL2-S (por pozo 0.05 mL) se mezclaron con anticuerpo diluido en la placa de 96 pozos e incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente para permitir enlace de anticuerpo a CD20 (opsonización) . La reacción ADCC se inicio al agregar ADCC 0.1 mL de células NK a cada pozo. En pozos de control, se agrega Tritón X-100 al 2%. La placa después de incuba por 4h a 37 grados C. Niveles de LDH liberados se midieron utilizando un equipo de detección de citotoxicidad (LDH) (Kit#1644793 , Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana.), siguiendo las instrucciones del fabricante. 0.1 mL de revelador de LDH de agregan a cada pozo, seguido por mezclado por lOs. La placa después se cubre con hoja delgada de aluminio e incuba en la oscuridad a temperatura ambiente por 15 minutos. Densidad óptica a 490 nm después se lee y utiliza para calcular % de lisis al dividir el LDH total medido en pozos de control. Lisis se traza como una función de concentración de anticuerpo, y un ajuste de 4 -parámetros (KaleidaGraph) se utiliza para determinar las concentraciones EC50. Análi sis Espectral de Masas de Tiempo-de-vuelo Deserción/ 'Ionización láser asistida por Matriz (MALDI-TOF) de Oligosacaridos enlazados por asparagina : Oligosacaridos N-enlazados se liberaron de glicoproteínas recombinantes utilizando el procedimiento de Papac et al., Glycobiology 8, 445-454 (1998). Brevemente, los pozos de una placa de microtitulación revestida con PVDF de 96 pozos (Millipore, Bedford, MA) se acondicionaron con 100 / l de metanol que se pasa a través de membranas PDVF al aplicar vació al múltiple de vació Millipore Multiscreen. Las membranas PVDF acondicionadas se lavan con 3 X 250 µ l de agua. Entre todas las etapas de lavado, los pozos se drenaron completamente al aplicar ligero vació al múltiple. Las membranas se lavaron con reducción y amortiguador de carboximetilación (RCM) que consiste de hidrocloruro de guanidina 6 M, Tris 360 mM, EDTA 2 mM, pH 8.6. Muestras de glicoproteína (50 µ g) se aplicaron a pozos individuales, de nuevo pasaron a través de las membranas PVDF por ligero vació y los pozos se lavan con 2 X 50 µ 1 de amortiguador RCM. Las muestras inmovilizadas se redujeron al agregar 50 µ l de una solución de ditiotreitol (DTT) 0.1 M a cada pozo e incubar la placa de micro titulación a 37 grados C por 1 hora. DTT se retira por vació y los pozos se lavan con 4 X 250 µ l de agua. Residuos de cisteína se carboxilmetilaron por la adición de 50 µ l de una solución de ácido yodo acético (IAA) a 0.1 M, que se preparo recientemente en NaOH 1 M y diluyo a 0.1 M con amortiguador RCM. La carboximetilación se logra al incubar por 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Se aplica vació a la placa para retirar la solución IAA y los pozos se lavan con 4 x 250 µ 1 de agua purificada. Las membranas PVDF se bloquearon por la adición de 100 µ 1 de PVP360 al 1% (polivinilpirrolidona 360,000 MW) en solución (Sigma) e incubación por 30 minutos a temperatura ambiente. La solución PVP-360 se retira por ligero vació y los pozos se lavaron 4 x 250 1 de agua. La PNGase F (New England Biolabs, Beverly, MA) solución de digestión, 25 µ l de una solución de 25 Unidades/ml en Tris acetato 10 mM, pH 8.3, se agrega a cada pozo y la digestión procede por 3 horas a 37 grados C. Después de digestión, las muestras se transfieren a tubos Eppendorf 500 µ l y 2.5 µ l de una solución de ácido acético 1.5 M se agrega a cada muestra. Las muestras acidificadas se incubaron por 2 horas a temperatura ambiente para convertir los oligosacaridos de la glicosilamina a la forma hidroxilo. Antes del análisis espectral de masas MALDI-TOF, los oligosacaridos liberados se desalificaron utilizando una cama de 0.7-ml de resina de intercambio de cationes (resina AG50W-X8 en la forma hidrógeno) (Bio-Rad, Hercules, CA) , empacados en fango en tubos de reacción compactos (US Biochemical, Cleveland, OH) . Para análisis espectral de masas MALDl-TOF de las muestras en el modo positivo, los oligosacaridos desalificados (alícuotas de 0.5 µ l ) se aplicaron al blanco de acero inoxidable con 0.5 µ l de la matriz de ácido 2 , 5-dihidroxibenzoico (sDHB) que se prepara al disolver 2 mg de ácido 2 , 5-dihidroxibenzoico con 0.1 mg de ácido 5-metoxisalicílico en 1 ml de NaCl 1 mM en etanol acuopso al 25%. La mezcla de muestra/matriz se seca al vació. La mezcla de muestra/matriz se seca al vació y después se deja que absorba humedad atmosférica antes de análisis. Los oligosacaridos liberados se analizan por MALDI-TOF en un espectrómetro de masas PerSeptive BioSystems Voyager-ELITE . El espectrómetro de masas se opera en el modo positivo a 20 kV con la configuración lineal y utilizando extracción retardada. Los datos se adquieren utilizando energía láser de aproximadamente 1100 y en el modo de suma de datos (240 exploraciones) para mejorar la señal a interferencia. El instrumento se calibra con una mezcla de oligosacáridos estándar y los datos se alisan utilizando un algoritmo Savitsky-Golay de 19 puntos antes de que se asignaran las masas. Integración de los datos espectrales de masas se logra utilizando el paquete de soporte lógico para análisis de datos Caesar 7.2 (SciBridge Software). Resultados y Discusión En los ejemplos previos, actividad de a - 1 , 6 -fucosiltransferasa (FUT8) se elimina en la línea celular 2H7. vl6 utilizando tecnología RNAi. RNAi hace blanco en un área dentro del marco de lectura abierto (ORF) del gen FUT8. Los anticuerpos menos fucosilados producidos por esta línea celular exhiben superoior afinidad de enlace hacia los receptores Fc/RIII, y superior actividad ADCC que los anticuerpos altamente fucosilados. La FIGURA 9A muestra el proceso que se utiliza para desarrollar una línea celular 2H7.vl6 menos fucosilada. El proceso anterior es un enfoque de dos etapas que requiere la existencia de una línea celular de producción de anticuerpo estable antes de transfección de plásmido RNAi. Para acortar el tiempo requerido para este proceso, un nuevo enfoque de una etapa se explora en donde la o las unidades siRNA se han incluido en el plásmido de expresión que expresa la proteína de interés (por ejemplo anticuerpo) , como se ilustra en la Figura 9B. Primero, los plásmidos de expresión que contienen el cassette de expresión de anticuerpo y la o las unidades RNAi se probaron para ver si el anticuerpo y RNAi pueden expresarse simultáneamente en transfección transitoria. La configuración de los cinco conjuntos de plásmidos transfectados transitoriamente se ilustra en la Figura 10. Las proteínas expresadas de aquellos cinco juegos de plásmidos se ensayaron para nivel de fucosilación. En la Tabla 2 siguiente, v511 y vll4 se refieren a las variantes de anticuerpo hu2H7 descritos en la Tabla 3. Como se ilustra en la Tabla 2, el anticuerpo de plásmidos de control que no contiene unidad RNAi tiene 9% de no-fucosilación. Los anticuerpos expresados de los plásmidos que contiene una unidad RNAi tienen no-fucosilación en el rango de 33% a 49%. Los anticuerpos espresados de los plasmidios que contiene dos unidades R?Ai tienen no-fucosilación en el intervalo de 62 a 65%. Estos resultados muestran que la adición de dos unidades de transcripción R?Ai en plásmidos de expresión lleva a la producción de anticuerpos con superior no-fucosilación de 62-65% en comparación con 33-49% con solo una unidad RNAi en los plasmados de expresión, indicando efectos aditivos de las dos transcripciones siRNAi. El anticuerpo expresado en este ejemplo es anticuerpo 2H7.v511 anti-CD20 humanizado (también referido aquí como hu2H7.v511) las secuencias del cual se proporcionaron anteriormente bajo los anticuerpos de enlace CD20. Tabla 2 Las células se transfectaron en forma estable con uno de los dos plásmidos CMV. PD.V511.RNAÍ4 o CMV.PD.v511.RNAi2.4 (Figura- 10C) y las células transfectadas seleccionadas con metotrexato 25 nM (MTX) . De cada transfeción, 72 ciónos se recolectaron y cribaron para expresión de anticuerpo. Títulos de expresión se ilustran en la Figura 11. Ciónos para de la transfección de plásmido CMV. PD. v511.RNAÍ2.4 parecen tener menores títulos en total en comparación con las otras dos transfecciones . Para ver si los ciónos que tienen buenos títulos de expresión también tienen menores niveles de fucosilación, aproximadamente 20% de los ciónos con superior expresión se analizaron para expresión mRNA FUT 8 por Taqman. Como se ilustra en la Figura 12, ciónos de la transfección de plásmido CMV. PD.v511.RNAÍ2.4 generalmente tienen menores niveles de mRNA FUT8 en comparación con ciónos de la trasfección de plásmido CMV.PD.V511.R?AÍ4. Seis ciónos con menores niveles de expresión mRNA FUT8, dos de la transfección de plasmado CMV. PD. v511R?Ai4 y cuatro de la transfección de plasmado CMV. PD.v511.R?AÍ2.4 se evaluaron adicionalmente para expresión de anticuerpo utilizando igual ensayo de densidad de siembra. Los resultados indican que los títulos de estos seis ciónos son comparables con ciónos de control 2H7 v511 (18 y 63 clono son comparables con ciónos de transfección de plásmido CMV.PD.v511) como se ilustra en Figura 13. Sin embargo, los ciónos CMV. PD. v511.R?AÍ2.4 parecen tener menor titulo que los ciónos CMV. PD.v511.R?AÍ4 y los ciónos de control. El contenido de fucosa de los anticuerpos producidos por los ciónos 2H7.v511 mostrados en la Figura 14 se realiza por análisis espectral de masas MALDI-TOF como se describió anteriormente. Se encontró que un clon, RNAi24-3d logro 94-95% de no-fucosilación. Un ensayo de enlace Fc/RIII se realizo con el anticuerpo 2H7 .v511 que contiene ya sea 65% no-fucosilación (de corrida transitoria) o 94-95% no-fucosilación (del clon más estable RNAi2.4-3d) . Los resultados se ilustra en la Figura 15A y Figura 15B. Comparado con los conjuntos de anticuerpo de control, que tienen aproximadamente 5% de no-fucosilación, el material no-fucosilado al 65% mostró un incremento de 4.8 y 6.2 veces moderado en afinidad hacia los receptores de alta afinidad (alelo V158-Figura 15B) y baja afinidad (alelo F158, Figura 15A) respectivamente, mientras que el material no-fucosilado al 95% mostró un incremento de 6.8 y 9.8 veces en afinidad hacia los dos isotipos de receptor. Ya que los anticuerpos no-fucosilados parecen ligar al Fc/RIII mejor, se probaron por sus actividades ADCC. Materiales recolectados del clon 2H7.vl6 7F (en el intervalo de 60-70% de no-fucosilación) y de transfección transitoria 2H7.v511 (65% no-fucosilación) se utilizaron para el ensayo de actividad ADCC. Como se ve en la Figura 16A y 16B, ambas versiones de 2H7 menos fucosilado exhibieron superior actividad ADCC en comparación con sus contrapartes altamente fucosilados correspondientes. Aquí describimos una forma moderna de someter a ingeniería metabólica células CHO para producir anticuerpos no fucosilados aun más en forma más elevada (tan alta como 95%) al incorporar las unidades de transcripción de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo junto con 1-2 unidades de transcripción siRNA en el mismo plásmido. Las dos transcripciones siRNa utilizadas en este enfoque hacen blanco a diferentes regiones de codificación en el gen FTU8 y se dirigen por promotores tipo Pol III separados Hl y U6. En resumen hemos demostrado que es factible incorporar tecnología R?Ai en el desarrollo de las líneas celulares 2H7 humanizadas para eliminar el nivel de fucosilación. Una línea celular que produce anticuerpo existente se convirtió exitosamente a una línea celular menos fucosilada. Adicionalmente, simultánea eliminación de fucosilación mientras que se genera una nueva línea celular productora de anticuerpo también se logró en forma exitosa. Referencias Referencias citadas dentro de esta solicitud, incluyen patentes, solicitudes publicadas y otras publicaciones aquí se incorporan por referencia de esta manera.

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Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para producir un anticuerpo que comprende un IgG Fc en una célula anfitriona de mamífero mientras que reduce el contenido de fucosa del anticuerpo, que comprende introducir simultáneamente en la célula anfitriona, cuando menos un ácido nucleico que codifica un anticuerpo y un segundo ácido nucleico que codifica al menos dos siRNAs que hacen blanco o diana en diferentes regiones de codificación de la secuencia de gen FUT8 de SEQ ID NO. 1, en donde los siRNAs inhiben la expresión de FUT8 y reducen el nivel de fucosilación del anticuerpo. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, codifica tanto una cadena ligera (L) como una cadena pesada (H) del anticuerpo. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica las cadenas H y L del anticuerpo y el ácido nucleico que codifica los siRNAs están en el mismo vector de expresión. . El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica la cadena H y el ácido nucleico que codifica la cadena L están en separados vectores de expresión, en donde cada uno de los vectores de expresión que codifican la cadena H y L también comprenden un ácido nucleico que codifica al menos dos siRNAs. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los dos siRNAs se expresan bajo el control de promotores separados. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque un siRNA se expresa bajo el promotor Pol III, Hl y el segundo siRNAi se expresa bajo el promotor Pol III, U6.. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer y segundo siRNAs hacen blanco en las posiciones nucleótido 733-751 y 1056-1074, respectivamente de la secuencia de gen FUT8 de SEQ ID NO. 1. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula anfitriona es una célula de ovario de hámster chino (CHO) o su derivado. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el nivel de fucosilación de anticuerpos se reduce en al menos 90%. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el nivel de fucosilación de anticuerpos se reduce en al menos 95%. 11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo terapéutico. 12. Un anticuerpo producido por el método de la reivindicación 1. 13. Un método para producir un anticuerpo IgG con mejorada ADCC, que comprende introducir simultáneamente en la célula anfitriona, al menos un ácido nucleico que codifica un anticuerpo y un segundo ácido nucleico que codifica al menos dos siRNAs que hacen blanco en diferentes regiones de codificación de la secuencia de gen FUT8 de SEQ ID NO. 1, en donde el anticuerpo y los siRNAs se expresan en la célula para producir un anticuerpo con reducida fucosilación e incrementada actividad ADCC en comparación con el anticuerpo producido en la célula en la ausencia de los siRNAs . 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el anticuerpo comprende al menos una alteración de aminoácido en la región Fc que mejora el enlace de anticuerpo a Fc?RIII y/o ADCC. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el anticuerpo comprende las sustituciones de aminoácidos Fc de S298A, E333A, K334A. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque además comprende en la sustitución de aminoácido Fc K326A. 17. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el anticuerpo liga CD20. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el anticuerpo liga CD20 de primate. 19. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el anticuerpo que liga CD20 es un anticuerpo humano. 20. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el anticuerpo que liga CD20 es un anticuerpo quimérico. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el anticuerpo quimérico es rituximab. 22. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el anticuerpo de enlace CD20 es un anticuerpo humanizado. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el anticuerpo de enlace CD20 humanizado comprende las regiones VL y VH seleccionadas del VL de SEQ ID NO .2 y VH de SEQ ID NO .8 ; VL de SEQ ID NO.25 y VH de SEQ ID NO.22; y VL de SEQ ID NO.25 y VH de SEQ ID NO.33. 24. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el anticuerpo de enlace CD20 humanizado comprende las cadenas L y H que tienen la secuencia de SEQ ID NO.13 y 14, respectivamente . 25. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el anticuerpo de enlace CD20 humanizado comprende las cadenas L y H que tienen la secuencia de SEQ ID NO. 26 y SEQ ID NO. 27, respectivamente . 26. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el anticuerpo de enlace CD20 humanizado comprende las cadenas L y H que tienen la secuencia de SEQ ID NO. 26 y SEQ ID NO. 34, respectivamente . 27. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el anticuerpo liga BR3. 28. Un anticuerpo producido por el método de la reivindicación 13. 29. Un ácido nucleico que comprende la secuencia de SEQ ID NO. 10 y SEQ ID NO. 11. 30. Una composición que comprende anticuerpos de enlace CD20 humanizados que tienen una región Fc, y un portador, en donde al menos 95 % de los anticuerpos en la composición carecen de fucosa. 31. Una célula anfitriona que comprende al menos un ácido nucleico que codifica un anticuerpo y un segundo ácido nucleico que codifica al menos dos siRNAs que hacen blanco o diana en diferentes regiones de codificación de la secuencia del gen FUT8 de SEQ ID NO. 1 , en donde la célula anfitriona expresa el anticuerpo y los siRNAs.