ES2535734T3 - Aislamiento y purificación de anticuerpos mediante cromatografía de afinidad con la proteína A - Google Patents

Abstract

Procedimiento para producir un anticuerpo, o porción del mismo de unión al antígeno, con un nivel reducido de proteína de célula huésped (HCP) a partir de una mezcla de muestra que comprende un anticuerpo, o parte del mismo de unión al antígeno, y al menos una HCP, y dicho procedimiento comprende: (a) sometimiento de dicha mezcla de muestra a una reducción del pH, con lo que se forma una muestra de recuperación primaria en la que el pH de dicha mezcla de muestra se reduce hasta un pH de 3 a 4 para formar dicha muestra de recuperación primaria; (b) ajuste de dicha muestra de recuperación primaria hasta un pH de 6,8 a 8, seguido de; (c) puesta en contacto de dicha muestra de recuperación primaria con una resina cromatográfica de afinidad de proteína A, lavado de dicha reina cromatográfica de afinidad con un tampón seleccionado entre el grupo formado por: 1) un tampón que comprende NaCl 0,5 M, acetato sódico 25 mM, a pH 5; 2) un tampón que comprende NaCl 0,5 M, acetato sódico 25 mM, a pH 5,5; y 3) un tampón que comprende NaCl 0,5 M, ácido cítrico/citrato sódico 20 mM, a pH 6, y recolección de una muestra de cromatografía de afinidad; (d) puesta en contacto de dicha muestra de cromatografía de afinidad con una resina de intercambio iónico y recolección de una muestra de intercambio iónico; (e) puesta en contacto de dicha muestra de intercambio iónico con una resina de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) y recolección de una muestra de HIC, en la que dicha muestra de HIC comprende dicha preparación de anticuerpo, o porción del mismo de unión al antígeno, con un nivel reducido de HCP.

Description

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vivo conocidos en la técnica.

[0036] El término «actividad» incluye actividades tales como la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo para un antígeno, p. ej., un anticuerpo anti-hIL-12 que se une a un antígeno IL-12 y/o la potencia neutralizante de un 5 anticuerpo, p. ej., un anticuerpo anti-hIL-12 cuya unión a la hIL-12 inhibe la actividad biológica de la hIL-12, p. ej., la inhibición de la proliferación de blastocitos PHA o la inhibición de la unión al receptor en un ensayo de unión al receptor de la IL-12 humana. El término «actividad» también incluye actividades tales como la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo aniti-IL-18 por su antígeno, p. ej., un anticuerpo anti-IL-18 que se une a un antígeno IL-18 y/o la potencia neutralizante de un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo anti-IL-18 cuya unión a la hIL-18 inhibe la

10 actividad biológica de la hIL-18. El término «actividad» también incluye actividades tales como la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo anti-TNFα por su antígeno, p. ej., un anticuerpo anti-TNFα que se une a un antígeno TNFα y/o la potencia neutralizante de un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo anti-TNFα cuya unión al hTNFα inhibe la actividad biológica de la hTNFα.

15 [0037] La expresión «resonancia de plasmones superficiales» incluye un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en concentraciones de proteínas dentro de una matriz de biosensores, p. ej., usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N. J.). Para conocer otras descripciones, consulte los siguientes documentos: Jonsson, U., y col. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., y col. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson,

20 B., y col. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; y Johnnson, B., y col. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

[0038] El término «Koff» se usa en el presente documento para hacer referencia a la constante de disociación (offrate) para la disociación de un anticuerpo a partir del complejo anticuerpo/antígeno.

25 [0039] El término «Kd» se usa en el presente documento para hacer referencia a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno concreta.

[0040] La expresión «molécula de ácido nucleico» incluye moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario, pero en un aspecto es ADN bicatenario.

30 [0041] La expresión «molécula de ácido nucleico aislada», tal como se usa en el presente documento, hace referencia a ácidos nucleicos que codifican, anticuerpos o porciones de anticuerpos (por ejemplo, VH, VL, CDR3), por ejemplo aquellos que se unen a la hIL-12, hTNFα o hIL-18, e incluye una molécula de ácido nucleico en la que las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo o la porción de anticuerpo están exentas de otras

35 secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos o porciones de anticuerpos que se unen a antígenos distintos de la hIL-12, hTNFα o hIL-18, y dichas otras secuencias pueden flanquear de manera natural el ácido nucleico en el ADN genómico humano. Por tanto, p. ej., un ácido nucleico aislado de la invención que codifica una región VH de un anticuerpo anti-IL-12, anti-TNFα o anti-IL-18 no contiene otras secuencias que codifiquen otras regiones VH que se unan a antígenos distintos a, por ejemplo, IL-12, hTNFα o hIL-18. La expresión «molécula de ácido nucleico aislada»

40 también se entenderá que incluye secuencias que codifican anticuerpos específicos bivalentes, tales como diacuerpos en los que las regiones VH y VL no contienen secuencias distintas a las secuencias del diacuerpo.

[0042] La expresión «célula huésped recombinante» (o simplemente «célula huésped») incluye una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que dichos términos no solo hacen

45 referencia a la célula concreta sometida a esta operación, sino también a la descendencia de dicha célula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas a causa de mutaciones o influencias del entorno, dicha descendencia, de hecho, puede no ser idéntica a la célula progenitora, pero aun así se engloba en la expresión «célula huésped», tal como se usa en el presente documento.

50 [0043] El término «modificador», tal como se usa en el presente documento, se entenderá que hace referencia al cambio de uno o más aminoácidos en el anticuerpo o en sus porciones de unión al antígeno. El cambio se puede producir añadiendo, sustituyendo o eliminando un aminoácido en una o más posiciones. El cambio se puede producir mediante el uso de técnicas conocidas, como la mutagénesis por PCR.

55 [0044] El término «aproximadamente», tal como se usa en el presente documento, se entenderá que hace referencia a intervalos aproximadamente un 10-20% más grande o más pequeño que el valor de referencia. En ciertas circunstancias, un experto en la materia reconocerá que, debido a las características intrínsecas del valor de referencia, el término «aproximadamente» puede significar un entorno mayor o menor que una desviación de dicho valor del 10-20%.

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chino/-DHFR (CHO, Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células renales de mono (CV1 ATCC CCL 70); células renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); hepatocitos de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares

5 humanas (W138, ATCC CCL 75); hepatocitos humanos (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

[0065] Se transforman células huésped con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la

10 producción de anticuerpos y se cultivan en medios nutritivos convencionales, con las modificaciones adecuadas para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias que se desean obtener.

[0066] Las células huésped usadas para producir un anticuerpo se pueden cultivar en diversos medios. Modelos

15 disponibles en el mercado, como Ham’s F10™ (Sigma), Minimal Essential Medium™ ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma)), y Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium™ ((DMEM), Sigma) resultan adecuados para cultivar las células huésped. Además, como medio de cultivo para las células huésped se puede usar cualquiera de los medios descritos por Ham y col., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes y col., Anal. Biochem. 102:255 (1980), y en las patentes de EE. UU. n. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; las patentes WO 90/03430; WO 87/00195; o

20 la patente de EE. UU. n.º Re. 30.985.

[0067] Cualquiera de estos medios se puede complementar, si fuera necesario, con hormonas y/u otros factores del crecimiento (como, por ejemplo, insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (como, por ejemplo, cloruro sódico, calcio, magnesio, y fosfato), tampones, (como HEPES), nucleótidos (como, por ejemplo, 25 adenosina y timidina), antibióticos (como, por ejemplo, gentamicina), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos que suelen estar presentes en concentraciones finales a escala micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se puede incluir cualquier otro suplemento necesario en concentraciones apropiadas, que ya conocerán los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, como por ejemplo la temperatura, el pH y similares son las mismas que se han usado anteriormente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y

30 son evidentes para los técnicos expertos en la materia.

[0068] También se pueden usar células huésped para producir porciones de anticuerpos, como por ejemplo fragmentos Fab o moléculas scFv. Se entiende que las variaciones sobre el anterior procedimiento caen dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, en ciertas formas de realización, puede ser conveniente transfectar 35 una célula huésped con ADN que codifica la cadena ligera o bien la cadena pesada (pero no ambas) de un anticuerpo de la presente invención. También se puede usar tecnología de ADN recombinante para eliminar todo o parte del ADN que codifica las cadenas ligera o pesada, o ambas, que no sea necesario para unirse a la IL-12, específicamente hIL-12, en el contexto de los anticuerpos anti-IL-12, o el ADN que no sea necesario para unirse a la IL-18, específicamente hIL-18, en el contexto de los anticuerpos anti-IL-18, o el ADN que no sea necesario para 40 unirse a la TNFα, específicamente hTNFα, en el contexto de los anticuerpos anti-TNFα. Las moléculas expresadas a partir de dichas moléculas de ADN truncadas también están englobadas en los anticuerpos de la invención. Además, se pueden producir anticuerpos bifuncionales en los que una cadena pesada y otra ligera constituyen un anticuerpo de la invención y las otras cadenas pesada y ligera son específicas para un antígeno distinto a la IL-12, TNFα, o IL18, dependiendo de la especificidad del anticuerpo de la invención, por medio del entrecruzamiento de un anticuerpo

45 de la invención con un segundo anticuerpo mediante procedimientos de entrecruzamiento químico.

[0069] En un sistema adecuado para la expresión recombinante de un anticuerpo, o una parte del mismo de unión al antígeno, de la invención, un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo se introduce en células dhfr-CHO mediante una transfección 50 mediada por fosfato cálcico. Dentro del vector de expresión recombinante, cada uno de los genes de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo está ligado operativamente a elementos reguladores potenciador CMV/promotor AdMLP para inducir altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también porta un gen DHFR, que permite seleccionar las células CHO que han sido transfectadas con el vector mediante una selección/amplificación con metotrexato. Las células huésped transformantes seleccionadas se cultivan para permitir

55 la expresión de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y se recupera el anticuerpo intacto del medio de cultivo. Se utilizan técnicas de biología molecular convencionales para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células huésped, seleccionar las transformantes, cultivar las células huésped y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo.

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resultar conveniente eliminar todos los agentes caotrópicos o sustancias muy hidrófobas, p. ej., haciendo pasar la mezcla a través de una precolumna.

[0098] Por ejemplo, en el contexto de la purificación por lotes, el material de HIC se prepara en o se equilibra para

5 el tampón de equilibrado deseado. Se obtiene una suspensión acuosa del material de HIC. La solución de anticuerpos se pone en contacto con la suspensión acuosa para adsorber en el material de HIC el anticuerpo que se va a separar. La solución que comprende las HCP que no se unen al material de HIC se separa de la suspensión acuosa, p. ej., permitiendo que la suspensión acuosa se asiente y retirando el sobrenadante. La suspensión acuosa se puede someter a una o más etapas de lavado. SI se desea, la suspensión acuosa se puede poner en contacto

10 con una solución de menor conductividad para desorber anticuerpos que se han unido al material de HIC. Para eluir anticuerpos unidos, se puede reducir la concentración de sal.

[0099] Mientras que la cromatografía de intercambio iónico se basa en las cargas de los anticuerpos para aislarlos, la cromatografía de interacción hidrófoba utiliza las propiedades hidrófobas de los anticuerpos. Grupos hidrófobos

15 del anticuerpo interactúan con grupos hidrófobos de la columna. Cuanto más hidrófoba sea una proteína, más fuerte será la interacción con la columna. De este modo, en la etapa HIC se eliminan impurezas derivadas de la célula huésped (p. ej., ADN y otras especies relacionadas con el producto, con pesos moleculares altos y bajos).

[0100] Las interacciones hidrófobas alcanzan la máxima intensidad cuando hay una fuerza iónica elevada; por lo

20 tanto, esta forma de separación se lleva a cabo convenientemente tras precipitaciones de sales o procedimientos de intercambio iónico. La adsorción del anticuerpo en una columna de HIC se ve favorecida por concentraciones de sal elevadas, pero las concentraciones reales pueden variar dentro de un amplio intervalo de valores, dependiendo de la naturaleza del anticuerpo y del ligando de HIC concreto escogido. Diversos iones se pueden disponer en una serie de solvofobia, tal como se denomina, dependiendo de si fomentan las interacciones hidrófobas (efectos de

25 precipitación salina o salting-out) o interfieren en la estructura del agua (efecto caotrópico) y provocan un debilitamiento.de la interacción hidrófoba. Los cationes se clasifican en orden creciente de efecto de precipitación salina: Ba++; Ca++; Mg++; Li+; Cs+; Na+; K+; Rb+; NH4+, mientras que los aniones se pueden clasificar en orden creciente de efecto caotrópico: P0---; S04--; CH3CO3-; Cl-; Br-; NO3-; ClO4-; I-; SCN-.

30 [0101] En general, los sulfatos de Na, K o NH4 fomentan eficazmente la interacción ligando-proteína en la HIC. Se pueden formular sales que influyan sobre la fuerza de la interacción, de acuerdo con la siguiente relación: (NH4)2SO4 > Na2SO4 > NaCl > NH4Cl > NaBr > NaSCN. En general, resultan útiles concentraciones salinas de sulfato de amonio entre 0,75 y 2 M, o de NaCl entre aproximadamente 1 y 4 M.

35 [0102] Las columnas de HIC comprenden normalmente una matriz base (p. ej., agarosa entrecruzada o un material copolimérico sintético) al que se acoplan ligandos hidrófobos (p. ej., grupos alquilo o arilo). Una columna de HIC adecuada comprende una resina de agarosa sustituida con grupos fenilo (p. ej., una columna de fenil-sefarosa (Phenyl Sepharose™)). Existen muchas columnas disponibles en el mercado. Los ejemplos incluyen, entre otros: una columna Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow con alto o bajo grado de sustitución (Pharmacia LKB Biotechnology,

40 AB, Suecia); una columna de alto rendimiento de Phenyl Sepharose™ (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Suecia); columna de alto rendimiento Octyl Sepharose™ (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Suecia); columnas de Fractogel™ EMD Propyl o Fractogel™ EMD Phenyl (E. Merck, Alemania); soportes de Macro-Prep™ Methyl o Macro-Prep™ t-Butyl (Bio-Rad, California); columna WP HI-Propyl (C3)™ (J. T. Baker, Nueva Jersey); y columnas Toyopearl™ de éter, fenilo o butilo (TosoHaas, PA).

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4.7 Estrategias de purificación ejemplares

[0103] En ciertas formas de realización, la recuperación primaria puede proseguir empleando una secuencia de etapas de reducción de pH, centrifugado, y filtración para eliminar células y residuos celulares (incluidas HPC) del 50 cultivo del biorreactor de producción. Como ejemplo no exclusivo, un cultivo que comprende anticuerpos, medios y células se puede someter a una reducción/inactivación de virus mediada por pH usando un pH ácido de 3,5 durante aproximadamente 1 hora. La reducción de pH se puede facilitar usando preparaciones de ácidos conocidos, como el ácido cítrico, p. ej., ácido cítrico 3M. La exposición a un pH ácido reduce, si no elimina por completo, los contaminantes víricos sensibles al pH y precipita algunos contaminantes procedentes de medios/células. Tras esta 55 etapa de reducción/inactivación vírica, el pH se ajusta a 4,9 o 5,0 mediante una base como el hidróxido sódico, p. ej., hidróxido sódico 3M, durante un tiempo aproximado de veinte a cuarenta minutos. Este ajuste puede producirse a 20º C aproximadamente. En ciertas formas de realización, el cultivo con pH ajustado se centrifugó después con una fuerza de aproximadamente 7000 xg a aproximadamente 11.000 xg. En ciertas formas de realización, el sobrenadante de muestra obtenido se hace pasar después a través de una serie de filtros que comprende múltiples

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luminiscente incluye luminol; y los ejemplos de material radioactivo adecuado incluyen: o 3H. La detección de la IL-18 en una muestra puede resultar útil en un contexto diagnóstico, por ejemplo en el diagnóstico de un trastorno relacionado con un aumento en la IL-18 y/o puede resultar útil para identificar a un sujeto para el que podría resultar beneficioso un tratamiento con un anticuerpo anti-IL-18.

5 [0167] Como alternativa al marcado del anticuerpo, se puede analizar la IL-18 de una muestra mediante un inmunoanálisis competitivo en el que se utilizan, p. ej., soluciones estándar de rhIL-18 marcadas con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-IL-18 no marcado, como por ejemplo un anticuerpo anti-hIL-18. En este análisis, la muestra, las soluciones estándar rhIL-18 marcadas y el anticuerpo anti-hIL-18 se combinan y se determina la

10 cantidad de estándar rhIL-18 marcado unido al anticuerpo no marcado. La cantidad de hIL-18 contenida en la muestra es inversamente proporcional a la cantidad de estándar rhIL-18 marcado unido al anticuerpo anti-IL-18.

[0168] Los anticuerpos y porciones de anticuerpos de la invención son capaces de neutralizar la actividad in vivo e in vitro de la IL-18, en un aspecto, una actividad de la hIL-18. Por consiguiente, los anticuerpos y porciones de 15 anticuerpos de la invención se pueden usar para inhibir la actividad de la IL-18, p. ej., en un cultivo celular que contiene IL-18, en sujetos humanos u otros mamíferos con IL-18 con la que un anticuerpo de la invención presenta actividad cruzada (p. ej., primates como el babuino, cynomolgus y rhesus). En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo humano aislado, o porción del mismo de unión a antígeno, que neutraliza la actividad de la IL-18 humana, y al menos otra IL-18 de primate seleccionada entre el grupo formado por: IL-18 de babuino, IL-18 de tití,

20 IL-18 de chimpancé, IL-18 de cynomolgus e IL-18 de rhesus, pero que no neutraliza la actividad de la IL-18 de ratón. En un aspecto, la IL-18 es IL-18 humana. Por ejemplo, en un cultivo celular que contiene, o del que se sospecha que contiene hIL-18, se puede añadir un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención al medio de cultivo para inhibir la actividad de la hIL-18 en el cultivo.

25 [0169] En el presente documento se desvela un procedimiento para inhibir la actividad de la IL-18 en un sujeto aquejado de un trastorno en el que la actividad de la IL-18 resulta perjudicial. La interleucina-18 desempeña un papel clave en la patología relacionada con diversas enfermedades en las que entran en juego elementos inmunitarios e inflamatorios.

30 [0170] Tal como se usa en la presente memoria, se entenderá que la frase «un trastorno en el que la actividad de la IL-18 resulta perjudicial» incluye enfermedades y otros trastornos en los que se ha demostrado que la presencia de IL-18 en un sujeto aquejado del trastorno es o se sospecha que es la responsable de la fisiopatología del trastorno, o bien un factor que contribuye al empeoramiento del trastorno. Por consiguiente, un trastorno en el que la actividad de la IL-18 resulta perjudicial es un trastorno en el que se espera que la inhibición de la actividad de la IL

35 18 alivie los síntomas y/o el avance del trastorno. Dichos trastornos se pueden manifestar, p. ej., a través de un aumento en la concentración de IL-18 en un fluido biológico de un sujeto aquejado del trastorno (p. ej., un aumento en la concentración de IL-18 en el suero, plasma, fluido sinovial, etc. del sujeto), que se puede detectar, p. ej., mediante un anticuerpo anti-IL-18, tal como se describe anteriormente. Existen numerosos ejemplos de trastornos en los que la actividad de la IL-18 resulta perjudicial. En un aspecto, los anticuerpos o sus porciones de unión al

40 antígeno se pueden usar en una terapia para tratar las enfermedades o trastornos descritos en la presente memoria. En otro aspecto, los anticuerpos o sus porciones de unión al antígeno, se pueden usar para la fabricación de un medicamento para tratar las enfermedades o trastornos descritos en la presente memoria. El uso de los anticuerpos y porciones de anticuerpos de la invención en el tratamiento de unos pocos trastornos específicos no exclusivos se explica más adelante.

45 [0171] En el presente documento se desvelan composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades

o trastornos que requieren la modulación de la actividad de la IL-18. Entre estas enfermedades o trastornos se incluyen enfermedades autoinmunitarias, diabetes de tipo 1, artritis reumatoide, rechazos a trasplantes, enfermedad intestinal inflamatoria, septicemia, esclerosis múltiple, cardiopatías isquémicas (incluidos infartos de miocardio),

50 lesiones cerebrales isquémicas, hepatitis crónica, psoriasis, pancreatitis crónica, pancreatitis aguda y similares.

[0172] Por consiguiente, los anticuerpos anti-IL-18 o sus porciones de unión al antígeno, o vectores que los expresan in vivo resultan indicados para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, diabetes de tipo 1, artritis reumatoide, rechazos a trasplantes, enfermedad intestinal inflamatoria, septicemia, esclerosis múltiple, cardiopatías

55 isquémicas (incluidos infartos de miocardio), lesiones cerebrales isquémicas, hepatitis crónica, psoriasis, pancreatitis crónica, pancreatitis aguda y enfermedades similares, en las que se da una expresión aberrante de la IL-18, que da lugar a un exceso de IL-18 o en ciertos casos de complicaciones debidas a IL-18 administrada de manera exógena.

8.8 Uso del anticuerpo anti-IL-18 en lesiones hepáticas

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µL de fosfatasa alcalina a los pocillos y la placa se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación a 180 rpm. Se tomaron lecturas de la placa a 405 y 492 nm. Si la absorbancia de la muestra de 16 ng/mL era < 1,2, la placa se incubaba 30 minutos más y se volvían a tomar lecturas. La intensidad del color es proporcional a la cantidad de proteína A presente en la muestra analizada.

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1.3 Resultados de la estrategia de purificación

[0205] Cromatografía de proteína A. Se usó la cromatografía de proteína A con MabSelect™ para capturar anticuerpos anti-IL-12 y reducir el nivel de impurezas debidas al producto y al proceso tales como fragmentos de

10 cadena ligera simple y doble, proteínas de célula huésped de CHO (HCP) y ADN, etc. Los datos contenidos tanto a escala de banco como a escala de biorreactor de 300 L mostraron una buena recuperación de proteína y depuración de HCP (tablas 1 y 2). En la figura 4 se proporciona un cromatograma representativo de la escala de biorreactor de 300 L.

15 Tabla 1: Sinopsis de la recuperación y pureza del nuevo procedimiento a escala de banco

Etapa

Recuperación (%) Pureza (% monóm.) HCP (ng/mg Ab)* Proteína A lixiviada (ng/mg Ab)

Clarificación

91 S. D.** 211195,7 0,14

MabSelect™

95 97,5 1121,9 9,36

Q Seph™ FF

96 96,9 34,5 8,21

Phenyl HP

90 99,2 11,1 0,65

Global

81 S. D.** S. D.** S. D.**

* Análisis ELISA de HCP de 1 día. SOP PD-122. * S. D.: sin determinar

Tabla 2: Sinopsis del nuevo procedimiento a escala de 300 litros

Etapa

Recuperación (%) Pureza (% monóm.) HCP (ng/mg Ab)* Proteína A lixiviada (ng/mg Ab)

Clarificación

91 S. D.** 141753 S. D.**

MabSelect™

95 94,44 < 2117,6 7,6

Filtración Delipid

97 95,97 58 3,4

Q Seph™ FF

93 96,21 8 3,7

Phenyl Seph™ HP

92 99,72 4 2,3

DV50™

95 99,64 S. D.** S. D.**

UF/DF

99 99,59 S. D.** S. D.**

Envasado

99 99,55 5 0,3

Global

67 N. A.*** N. A.*** N. A.***

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*

Análisis ELISA de HCP de 1 día. SOP PD-122.

*

S. D.: sin determinar *** N. A.: no aplicable

[0206] Los datos que se muestran en la tabla 3 demostraron que la capacidad de unión dinámica de la cromatografía con MabSelect™ se veía afectada por el caudal de carga, concretamente por el tiempo de residencia. Cuando la carga se llevó a cabo a una velocidad lineal constante de 300 cm/hora (3,4 minutos de tiempo de 5 residencia), la DBC fue de 44,3 mg de proteína/mL de resina. Cuando se usó la estrategia de carga de dos velocidades (300 cm/hora hasta 35 g/L), el cambio a 150 cm/hora dio lugar a un aumento de la DBC del 17% hasta 51,7 mg de proteína/mL de resina. Este aumento en la DBC se logró doblando el tiempo de residencia para la última porción de la carga. Teóricamente, en la etapa inicial de la carga de la columna, la unión se produce predominantemente en la superficie de la microesfera, en sitios de fácil acceso. Esto permite usar caudales más

10 rápidos sin que apenas afecte a la cinética de la unión. Una vez que se han ocupado todos los sitios de fácil acceso, las proteínas tienen que difundirse dentro de los poros para unirse los sitios menos accesibles. Desde el punto de vista cinético, este es un proceso lento y, por lo tanto, para maximizar la unión se deberían reducir los caudales atendiendo a este factor.

15 Tabla 3: Efecto del caudal sobre la DBC de la columna de MabSelect™

Velocidad lineal de carga

N. º de experimento DBC al 5% BT (mg Ab/mL resina)

Carga de velocidad constante

300 cm/hora Exp. 1 43,7

Exp. 2

44,9

Promedio

44,3

Velocidad lineal inicial de 300 cm/hora hasta carga de 35

Exp. 3 51,6

Carga de dos velocidades

mg Ab/mL de resina, 2ª velocidad lineal de 150 cm/hora hasta la aparición del anticuerpo en la fracción no retenida de la carga Exp. 4 51,7

Promedio

51,7

[0207] La cantidad de cadena ligera doble se redujo desde el 0,5% al 0,2% (según la SEC-HPLC) al incluir una etapa intermedia de lavado. Se evaluaron varios tampones de lavado, incluidos: NaCl 0,5 M, acetato sódico 25 mM,

20 NaCl 0,5 M, pH 5,0 o pH 5,5 y ácido cítrico/citrato de Na 20 mM, NaCl 0,5 M, pH 6. Los datos obtenidos tanto por HPLC-SEC como por SDS-PAGE (figura 5) mostraron una buena depuración de especies de bajo peso molecular (LMW) de todos los experimentos. Cuando se llevó a cabo el lavado a pH 6, se observó la misma depuración de LMW en comparación con los lavados a pH más bajo, mientras que la recuperación de proteína del 95% era comparable a las tandas realizadas sin la etapa intermedia de lavado.

25 [0208] Cromatografía con Q Sepharose™ Fast Flow. La columna de Q Sepharose™ FF para reducir el nivel de impurezas debidas al producto y al proceso cargadas negativamente, como el ADN y proteínas de células huésped. Esta etapa y las siguientes constituyen las etapas de purificación fina del proceso global.

30 [0209] Antes de la cromatografía, comenzó la preparación de la muestra de carga con el ajuste del pH y la conductividad del eluido de MabSelect™. Se ajustó el pH del eluido desde pH 5 a pH 8 con Tris 1 M, pH 10; y de inmediato se redujo la conductividad desde ~15 mS a 7 mS con agua. Una vez que la conductividad del eluido de MabSelect™ se aproximó a 7 mS/cm, comenzó a producirse la precipitación y se dejó que continuara durante una hora. El material precipitado se eliminó mediante un filtro de profundidad 30 ZA o Cuno™ Delipid y, a continuación,

35 una filtración de 0,45/0,2 µm. La recuperación de proteína de esta etapa de preparación de carga fue del 96,3%, según la absorbancia a 280 nm, lo que indicaba que la mayoría del material precipitado no contenía anticuerpos. Esto se confirmó mediante un análisis SDS-PAGE de los precipitados (figura 6).

[0210] La columna de Q Sepharose™ FF funcionó en modo de no retención. En la figura 7 se muestra un perfil 40 cromatográfico representativo. No se observó ninguna ruptura aparente de las HCP cuando la carga llegó a 80 g

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2.1. Estrategia de purificación

[0215] Clarificación de recolección de cultivo celular. En este ejemplo, se usó como material de partida caldo de

5 recolección de fermentación de 13 días de cultivo celular y un material de recolección de fermentación de 15 días clarificado. El caldo de cultivo celular se centrifugó a 3000 rpm durante 30 minutos con una centrifugadora Beckman Coulter Allegra™ 6R. El sobrenadante recogido se filtró a través de un filtro Delipid (CUNO ZeraPlus® BC0030A DELI -cápsula desechable BioCap™ 30) con un caudal de 20 mL/min. Después, la recolección clarificada se dividió en alícuotas y se almacenó a -80º C. La recolección congelada se descongeló y se filtró con un filtro de acetato de

10 celulosa Corning® de 0,22 µm antes de cargarlo en la columna. El caldo de recolección se centrifugó con una centrifugadora de discos y se continuó filtrando a través de un filtro de profundidad y un filtro Delipid. El filtrado se almacenó a 4º C antes de cargarlo en la columna. El proceso de clarificación se llevó a cabo a temperatura ambiente.

15 [0216] Cromatografía de afinidad con proteína A. Se cargó una columna de 10mL (1,6 x 5cm) y una columna de 40,2 mL (1,6 x 20cm) con resina MabSelect™ (GE Healthcare). Se usó un sistema cromatográfico AKTA Explorer™ para llevar a cabo las operaciones. Las columnas se rellenaron con NaCl 0,5 M. En la tabla 5 se muestran las condiciones cromatográficas. Las fracciones del pico de elución se combinaron y se mantuvieron durante 1 hora antes de neutralizarlas hasta pH 8,0 con trolamina 3M. El proceso se llevó a cabo a temperatura ambiente.

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Tabla 5. Condiciones de la cromatografía de afinidad con proteína A

Etapa

Solución Volumen Velocidad lineal*

(VC)

(cm/h)

Enjuague

Agua 5 400

Equilibrado

1 x PBS 5 400

Carga

Consulte la información de la muestra Variable 400

Lavado

1 x PBS 5 400

Elución

Tampón de ácido acético con pH 3,2 5 400

Regeneración

Ácido acético al 1,0%/NaCl 0,5M 5 400

Desinfección en cada ciclo

Guanidina 6,0M 5 400

Enjuague

Agua Milli-Q 5 400

Almacenamiento

Acetato de Na 50 mM, pH 5, etanol al 20% 3 100

* La velocidad lineal fue de 100 cm/h para una columna de 5 cm de altura y 400 cm/h para una columna de 20 cm de altura para mantener el mismo tiempo de residencia.

[0217] Preparación del material de carga Q. Los eluidos neutralizados obtenidos en las dos tandas de proteína A

25 se combinaron y se eluyeron con aproximadamente 0,5 ~ 1,0 time con agua Milli-Q para lograr una conductividad de 4,5 ~ 5,5 mS/cm (25º C). La muestra diluida se filtró a través de un filtro de profundidad (CUNO Zeta Plus BioCap® BC0030A30ZA) a un caudal de 20 mL/min; a continuación, con un filtro de acetato de celulosa de 0,45 µm (Corning, Inc.) y después con un filtro de acetato de celulosa de 0,22 µm (Corning, Inc.). Tras este paso, la muestra estaba lista para cargarla en la columna Q.

[0218] Cromatografía de intercambio aniónico con Q Sepharose™. Se rellenó una columna de 60,3 mL (1,6 x 30 m) y una columna 40,2 mL (1,6 x 20 cm) con resina Q Sepharose™ Fast Flow (GE Healthcare) y se empleó un sistema cromatográfico AKTA Explorer™. En la tabla 6 se muestran las condiciones cromatográficas. El proceso se

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[0221] Conductividad. Se midió la conductividad a 25º C, mediante un medidor de conductividad Radiometer Analytical CDM 210.

5 [0222] Espectroscopia UV A280. Se midió el espectro UV a A280 mediante un espectrofotómetro Agilent UV8453. El coeficiente de extinción usado para el adalimumab es 1,39 L/g·cm.

[0223] HPLC de Poros A. La concentración del anticuerpo se determinó mediante HPLC de Poros A (proteína A). Se aplicaron las diluciones de muestra para obtener lecturas comprendidas en el intervalo de calibrado. Se configuró

10 un sistema HPLC Shimadzu con un cartucho detector Poros A ImmunoDetection (Applied Biosystems, Foster City, CA). La columna se mantuvo a temperatura ambiente. El sistema trabajó con un caudal de 2 mL/minuto. La temperatura de la bandeja del automuestreador se ajustó a 4º C. Se detectó la absorbancia a 280 nm. El tampón A era 1 x PBS. El tampón B era ácido acético 0,1 M y cloruro sódico 150 mM. Se inyectó la muestra y se eluyó el adalimumab con tampón B al 100%.

15 [0224] HPLC WCX-10. Se llevó a cabo un análisis mediante HPLC WCX-10 (WCX: intercambio catiónico débil). Se configuró un sistema HPLC Shimadzu con una columna analítica Dionex ProPac WCX-10 y una precolumna (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA). Ambas columnas se mantuvieron a 30º C. El sistema trabajó con un caudal de 1 mL/minuto. La temperatura de la bandeja del automuestreador se ajustó a 4º C. Se detectó la absorbancia a 280 nm.

20 El tampón A era fosfato sódico dibásico 10 mM, pH 7,5. El tampón B era fosfato sódico dibásico 10 mM/ cloruro sódico 550 mM, pH 5,5. Se inyectó la muestra y se eluyó el adalimumab mediante el siguiente procedimiento en gradiente.

Tiempo (min.)

Tampón A (%) Tampón B (%)

0,0

94 6

20,0

84 16

22,0

0 100

26,0

0 100

28,0

94 6

34,0

94 6

25 [0225] Cromatografía de exclusión por tamaño HPLC (SEC). Se llevó a cabo un análisis por SEC. Se aplicaron las diluciones de muestra para obtener lecturas comprendidas en la curva estándar. Se configuró un sistema HPLC Shimadzu con una columna Superose™ 6 10/300 GL (GE Healthcare). La columna se mantuvo a temperatura ambiente. El sistema trabajó con un caudal de 0,5 mL/minuto. La temperatura de la bandeja del automuestreador se ajustó a 4º C. Se detectó la absorbancia a 214 nm. El tampón A era fosfato sódico dibásico 20 mM/ cloruro sódico

30 150 mM. Se inyectó la muestra y el adalimumab se separó isocráticamente con tampón A al 100%.

[0226] ELISA HCP. Se llevó a cabo un análisis ELISA de HCP tal como se explica anteriormente. Se aplicaron las diluciones de muestra para obtener lecturas comprendidas en el intervalo de calibrado.

35 [0227] Análisis ELISA de proteína A. Se llevó a cabo un análisis de la concentración de proteína A lixiviable tal como se explica anteriormente. Se adquirieron muestras de análisis inmunoenzimométrico para la medición de proteína A que contenían kits de análisis de inmunoglobulina humana previamente recubiertos (n. º de catálogo F050H) que incluyen el diluyente de muestras (n. º de catálogo 1028) de Cygnus Technologies, Inc. Se usó un bloque de calentamiento (Type 17600 Dri-Bath, Barnstead/Thermolyne) para desnaturalizar la muestra. Se usó un

40 incubador (máx. 4000, Barnstead/Lab-Line) para incubar las muestras. Se usó un lector de placas (Spectramax Plus, Molecular Devices) para tomar lecturas de la absorbancia a 405 nm y 495 nm.

[0228] SDS-PAGE. Las muestras se diluyeron con tampón PBS 1X hasta alcanzar una concentración predeterminada, después se añadió un volumen igual de tampón de carga 2X (Invitrogen™ Novex® Tris-Glycine 45 SDS Sample Buffer (2X), n. º de cat. LC2676) a cada muestra diluida. Para la reducción del SDS-PAGE, se añadió en cada muestra una décima parte de volumen de reductor (invitrogen™ NaPAGE® Sample Reducing Agent (10X),

n. º de cat. NP0004). Se aplicaron 20 µL de cada muestra preparada en cada pocillo sobre el gel (invitrogen™ 12%

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graduado de 4 L, mezclar 400 mL de PBS 10 X (etapa 5.2) con 3500 mL de agua Milli-Q. Comprobar el pH, y ajustar si fuera necesario hasta 7,40 ± 0,05 con HCl 1 N o NaOH 1 N. Enrasar con agua Milli-Q. Sellar bien el tubo con Parafilm y mezclar por inversión hasta lograr la homogeneidad. Transferir a un frasco de 4 L. Retirar 4 mL del PBS 1 X y desecharlos. Añadir 4 mL de Triton X-100 a los 3996 mL de PBS 1 X. Colocar en un agitador de placas y agitar

5 hasta lograr su total disolución. Filtrar la cantidad de tampón de lavado de placa necesaria para la preparación del tampón de dilución a través de una unidad de filtro estéril de 0,22 µm. Almacenar a temperatura ambiente durante un periodo de hasta 7 días.

[0243] Preparación de la mezcla de anticuerpos de recubrimiento: anti-CHO caprino 599/626/748 (n. º de lote

10 G11201 a 1,534 mg/mL), purificado por afinidad. NOTA: Las soluciones madre se almacenan a una temperatura nominal de -80º C en viales. Preparar alícuotas. Tomar una alícuota por placa en el momento de su uso. Justo antes de su uso: Diluir la mezcla de anticuerpos para lograr una concentración final de 4 µg/mL en bicarbonato sódico 50 mM frío, del siguiente modo. Por ejemplo: añadir 31 µLs de mezcla de anticuerpos de recubrimiento a 11969 µLs de tampón de recubrimiento frío. Mezclar cuidadosamente mediante inversión.

15 [0244] Preparación de la mezcla de anticuerpos caprinos biotinilados contra la proteína de célula huésped, 599/626/748 (n. º de lote G11202 a 0,822 mg/mL). NOTA: Las soluciones madre se almacenan a una temperatura nominal de -80º C en viales. Preparar alícuotas. Tomar una alícuota por placa en el momento de su uso. Justo antes de su uso: Diluir la mezcla de anticuerpos biotinilados para lograr una concentración final de 1 µg/mL en caseína a

20 37º C ± 2º C, del siguiente modo. Por ejemplo: añadir 14,6 µLs de mezcla de anticuerpos biotinilados a 11985 µLs de caseína a 37º C ± 2º C. Mezclar cuidadosamente mediante inversión.

[0245] Preparación de Neutravidina-HRP. Reconstituir los nuevos lotes (2 mg/vial) hasta 1 mg/mL, del siguiente modo: Añadir 400 µL de agua Milli-Q al vial y después añadir 1600 µL de PBS 1X para un total de 2 mL. Agitar 25 cuidadosamente en vórtex para mezclar. Almacenar a una temperatura nominal de -20º C. Preparar alícuotas con el volumen deseado, de manera que se use 1 alícuota por placa. Preparar en tubo de polipropileno. Cualificar nuevos lotes para determinar la concentración de trabajo. Asignar un periodo de validez de 6 meses tras la fecha de preparación. Por ejemplo, si se determina que la concentración de trabajo era de 0,2 µg/mL, entonces se prepara de siguiente modo: Justo antes de su uso: descongelar una alícuota de neutravidina-HRP a temperatura ambiente.

30 Diluir la disolución de 1 mg/mL neutravidina hasta 0,1 mg/mL (100 µg/mL) con caseína a 37º C ± 2º C. Por ejemplo: Diluir x10, añadir 50 µL de neutravidina a 450 µL de caseína. Agitar cuidadosamente en vórtex para mezclar. Diluir aún más la solución de 100 µg/mL hasta 0,2 µg/mL con caseína a 37º C ± 2º C. Por ejemplo: Diluir X500, añadir 24 µL de neutravidina (100 µg/mL) a 11976 µL de caseína. Agitar cuidadosamente en vórtex para mezclar.

35 [0246] Preparación de ácido fosfórico 2M de la etapa 5.7 (solución de interrupción). Preparar una solución de ácido fosfórico 2M a partir de ácido fosfórico concentrado, del siguiente modo. A partir del % del ácido fosfórico indicado en la etiqueta, densidad (1,685 g/mL) y peso de fórmula (98 g/mol), calcular el volumen de ácido fosfórico concentrado necesario para preparar 500 mL de ácido fosfórico 2M. Añadir al matraz el volumen de ácido fosfórico concentrado calculado. Enrasar con agua Milli-Q y mezclar mediante inversión hasta lograr la homogeneidad.

40 Almacenar a temperatura ambiente durante un periodo de hasta 6 meses desde la fecha de preparación.

[0247] Preparación del tampón de dilución (caseína diluida X100 en PBS 1X + Triton X100 al 0,1%, pH 7,4). Diluir caseína a 37º C ± 2º C X100 en 0,22 µm de 1X PBS + 0.1 % Triton X100, pH 7.4 (de la preparación anterior) esterilizado y filtrado. Por ejemplo: Añadir 1 mL de caseína a 37º C ± 2º C a 99 mL 0,22 µm, de PBS 1X + Triton

45 X100 al 0,1 %, pH 7,4. Mezclar bien. Elaborar una preparación nueva para cada uso.

[0248] Preparación de soluciones estándar. Soluciones estándar de proteína de célula huésped (soluciones estándar de antígeno) (n. º de lote G11203 a 1,218 mg/mL). NOTA: Las soluciones madre se almacenan a una temperatura nominal de -80º C en alícuotas de 70 µL. Descongelar una alícuota a temperatura ambiente. Llevar a

50 cabo diluciones seriadas en tubos de polipropileno con el tampón de dilución.

[0249] Preparación de muestras. Diluir en tubos de polipropileno muestras a granel finales hasta 24 mg/mL en el tampón de dilución. Registrar la concentración. NOTA: usar las siguientes soluciones para preparar muestras enriquecidas y para preparar las soluciones de 12 mg/mL a las que se hace referencia más adelante. Diluir aún más

55 en microtubos de polipropileno las soluciones de 24 mg/mL hasta 12 mg/mL en el tampón de dilución. Cargar en la placa los pocillos por triplicado por cada una de las soluciones de 12 mg/mL para un total de 6 pocillos.

[0250] Preparación del aditivo. En un microtubo de polipropileno, preparar un aditivo de proteína de célula huésped de 10 ng/mL a partir de la solución estándar de 20 mg/mL preparada anteriormente diluyéndola 2X con el

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estándar de 2,5 ng/mL.

[0258] Curva estándar. Se deberán introducir las concentraciones de las soluciones estándar en la plantilla del protocolo. Se emplea un ajuste de curva cuadrático. El coeficiente de determinación debe ser = 0,99 y el CV (%) 5 entre pocillos triplicados debe ser = 20%. Si no se cumplen estos criterios: Se puede omitir un estándar (1 nivel, 3 pocillos). Si se omite el de 1,25 ng/mL, solo resultarán aceptables las muestras y muestras enriquecidas con densidades ópticas entre las densidades ópticas del de 2,5 ng/mL y el de 100 ng/mL (el resto de puntos de la curva estándar). Además, para los triplicados de cada nivel de estándar, si un único pocillo está claramente contaminado o presenta un bajo nivel de unión, se puede omitir. Si se omite un pocillo de un nivel de estándar las réplicas restantes

10 deben tener una diferencia (%) = 20%. El CV (%) para el estándar más bajo, que presenta valores de OD próximos al fondo (blancos) de la placa, deberá ser = 30%. Si se omite un pocillo, la diferencia (%) para las restantes réplicas debe ser = 35%. Si se omite el estándar más bajo, solo resultarán aceptables las muestras y muestras enriquecidas con densidades ópticas entre las densidades ópticas del resto de la curva estándar.

15 [0259] Muestras. El CV (%) deberá ser = 20% entre los pocillos triplicados. Informar del CV (%) entre los pocillos triplicados. Se puede omitir un pocillo de cada dilución de la muestra. Las réplicas restantes deben tener una diferencia (%) = 20%. Nota: Si la OD de la muestra no enriquecida está por debajo de la OD del estándar de 2,5 ng/mL, no se aplica el criterio de diferencia (%) a los resultados de la muestra no enriquecida. Ver el cálculo anterior.

20 [0260] Calcular la concentración real de células huésped en ng/mg a partir del valor promedio (ng/mL) del siguiente modo: Proteína de célula huésped CHO (ng/mg) = Promedio de «resultado de muestra no enriquecida (ng/mL)»_concentración de muestra diluida (12 mg/mL).

[0261] Aditivos. El CV (%) deberá ser = 20% entre los pocillos triplicados. Registrar el CV (%) entre los pocillos

25 triplicados. Se puede omitir un pocillo del aditivo. Los puntos restantes deben tener una diferencia (%) = 20%. Ver el cálculo anterior. Indicar la concentración de células huésped en ng/mL. Este resultado se usará en los cálculos de recuperación de aditivo. La concentración resultante para el aditivo (ng/mL) debe ser ± 20% de la concentración teórica de aditivo. Registrar el resultado e indicar si se ha aceptado o rechazado. Si el resultado del aditivo se diferencia del teórico más del 20%, el ensayo debe repetirse. Concentración promedio de aditivo (ng/mL) x 100 debe

30 ser = 100% ± 20% de 10 ng/mL.

[0262] Muestras enriquecidas. El CV (%) deberá ser = 20% entre los pocillos triplicados. Registrar el CV (%) entre los pocillos triplicados. Se puede omitir un pocillo de cada dilución de la muestra enriquecida. Las réplicas restantes deben tener una diferencia (%) = 20%. Ver el cálculo anterior. Informar del «resultado de la muestra enriquecida»

35 para cada dilución en ng/mL. Registrar la diferencia (%) entre las diluciones duplicadas. La diferencia (%) entre las diluciones deberá ser = 25%. Estos resultados se utilizarán en los cálculos de recuperación de aditivo.

[0263] Calcular % de recuperación de aditivo para conjunto de diluciones mediante la siguiente fórmula: % de recuperación de aditivo = valor de muestra enriquecida – valor de muestra no enriquecida X 100 valor de aditivo.

40 NOTA: (1) Si el valor de OD de la muestra no enriquecida no supera al del estándar de 2,5 ng/mL, considerar el valor como cero en el cálculo del % de recuperación de aditivo. La recuperación de aditivo % debe ser 100% 50% (50% a 150%) para cada dilución de cada muestra. Registrar los resultados y si se ha aceptado o rechazado.

[0264] Control. El CV (%) deberá ser = 20% entre los pocillos triplicados. Registrar el resultado del CV (%). Se

45 puede omitir un pocillo del control. Las réplicas restantes deben tener una diferencia (%) = 20%. Ver el cálculo anterior. Indicar la concentración de células huésped en el control en ng/mL. Calcular la concentración de células huésped en ng/mg del siguiente modo: proteína de célula huésped (ng/mg) = resultado en ng/mL de la proteína de célula huésped de control.

50 4. Determinación de la concentración de proteína A en composiciones de anticuerpo anti-IL-12

[0265] En este ELISA, las placas se recubren con anticuerpo de pollo anti-proteína A y se incuban. Se bloquean los sitios no específicos con caseína en PBS. Las placas se lavan en PBS 1X + Triton X-100 al 0,1% para eliminar el material no unido. Las soluciones estándar de la proteína A-cis y las muestras se diluyen en PBS 1X + Triton X-100

55 al 4,1% + caseína al 10%. Las soluciones se desnaturalizan calentándolas a 95º C ± 2º C, separando la proteína A de la ABT-874. Después se añaden las soluciones a la palca y se incuban. El material no unido se arrastra lavando con PBS 1X + Triton X-100 al 0,1%. Se añade anticuerpo de pollo biotinilado anti-proteína A a la placa de microtitulación y se incuba. Se lava la placa para eliminar el material no unido y se añade un conjugado de neutravidina-peroxidasa.

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equilibre a 95º C ± 2º C durante al menos 30 minutos.

[0283] Procedimiento de análisis. Se puede usar una lista de comprobación como guía, tachando las etapas a medida que se van llevando a cabo. Además, registrar todo el equipo utilizado durante el análisis. La cantidad de 5 alícuotas de caseína que se van a usar para cada día del proceso de análisis se deben poner a 37º C ± 2º C. El tampón de recubrimiento y el sustrato se usan fríos. Preparar soluciones de control, muestra, control, aditivo y muestras enriquecidas antes y durante la incubación de bloqueo. Puede llevar más tiempo que la 1 hora de incubación de bloqueo para preparar las diluciones, transferir a tubos Eppendorf, desnaturalizar durante 15 minutos, enfriar durante 15 minutos, centrifugar durante 15 minutos y transferir a microtubos. Dejar al menos 40 minutos antes

10 de bloquear las placas. Las muestras, muestras enriquecidas, soluciones estándar, control, aditivo de análisis, y blancos se cargan en la placa horizontalmente desde las filas B a la G mediante una pipeta de 12 canales. Las soluciones estándar se cargan desde una concentración alta a una baja. El recubrimiento de la placa, la adición de biotina, la adición de neutravidina, la adición de sustrato y la adición de solución de interrupción se llevan a cabo verticalmente desde la columna 2 a la 11.

15 [0284] Recubrir las placas con 100 µL/pocillo de anticuerpo de recubrimiento en bicarbonato sódico 50 mM frío. Golpear suavemente un lado de la placa hasta que la solución de recubrimiento cubra la parte inferior de los pocillos de manera uniforme, cubrir con cinta selladora e incubar a una temperatura nominal de 4º C con agitación en un agitador de placas (o equivalente) a velocidad 3.

20 [0285] Tras incubar toda la noche, retirar la placa del refrigerador y dejar que se equilibre hasta alcanzar la temperatura ambiente. Sacudir para retirar el recubrimiento. Transferir la placa sobre toallas de papel. Bloquear con 300 µL/pocillo de caseína a 37º C ± 2º C, cubrir con cinta selladora e incubar a 37º C ± 2º C con agitación en un agitador de placas Lab-Line Environ (o equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm durante 1 hora ± 10 minutos.

25 [0286] Preparar la solución estándar, la muestra, el control, el aditivo y las muestras enriquecidas antes y durante la incubación de bloqueo. Lavar la placa 4 veces con el tampón de lavado. Transferir la placa sobre toallas de papel. Con una pipeta de 8 canales, pipetear 100 µL/pocillo de soluciones estándar, muestras, aditivos, muestras enriquecidas y el control desnaturalizados por triplicado en pocillos de la placa. Los pocillos exteriores de la placa no

30 se usan, añadir a estos pocillos tampón de dilución no tratado. Cubrir con cinta selladora e incubar a 37º C ± 2º C con agitación sobre un agitador de placas Lab-Line Environ (o equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm durante 2 horas. Rellenar una plantilla para utilizarla como guía al cargar la placa.

[0287] Configuración del lector de placas. Lavar la placa 4 veces con el tampón de lavado. Transferir la placa 35 sobre toallas de papel. Añadir 100 µL/pocillo de anticuerpo biotinilado. Cubrir con cinta selladora e incubar a 37º C ± 2º C con agitación en un agitador de placas Lab-Line Environ (o equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm durante 1 hora.

[0288] Lavar la placa 4 veces con el tampón de lavado. Transferir la placa sobre toallas de papel. Añadir 100 µL/pocillo de solución de conjugado de neutravidina-HRP. Cubrir con cinta selladora e incubar a 37º C ± 2º C con 40 agitación en un agitador de placas Lab-Line Environ (o equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm durante 30 minutos. Lavar la placa 4 veces con el tampón de lavado. Transferir la placa sobre toallas de papel. Añadir 100 µL/pocillo de sustrato K-Blue frío, cubrir con cinta selladora e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos (poner en marcha el temporizador en cuanto se añada el sustrato a la primera fila), con agitación a velocidad 3 sobre un agitador de placas de titulación Lab-Line Environ (o equivalente). Interrumpir la reacción añadiendo 100 µL/pocillo de ácido

45 fosfórico 1N. Colocar la placa sobre un agitador de placas a velocidad 3 durante 3 minutos. Tomar una lectura de la placa a 450 nm.

[0289] Análisis de datos y cálculo. NOTA: Solo se aceptan muestras, aditivos, muestras enriquecidas y control con densidades ópticas dentro del límite de cuantificación práctica de la curva estándar y que cumplan los criterios de 50 CV% o de diferencia (%) que se indican más adelante. Si la OD de la muestra se encuentra por debajo de la curva estándar, en el informe de los resultados se deberá indicar: menos de 0,18 ng/mL (límite de cuantificación (LOQ) del análisis). Después, este valor se deberá dividir por la concentración de la muestra diluida (10 mg/mL) para indicar su valor en ng/mg. Si la muestra presenta una elevada concentración de proteína A que lleva a la muestra no enriquecida y/o la muestra enriquecida a superar la curva estándar (2 ng/mL), entonces diluir aún más para que

55 quede dentro de la curva estándar. Este valor se deberá dividir después por la concentración de la muestra diluida para indicar su valor en ng/mg. Para los cálculos de recuperación de aditivo, restar el valor de la muestra no enriquecida (ng/mL) del valor de la muestra enriquecida (ng/mL) incluso si el valor de la muestra no enriquecida (ng/mL) está por debajo de la curva. Si el valor es negativo o se obtiene un «intervalo», entonces considerar la muestra no enriquecida como cero para cálculos de recuperación de aditivo.

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