ES2565077T3

ES2565077T3 - Método para producción en gran escala de un polipéptido en células eucariotas

Info

Publication number: ES2565077T3
Application number: ES04762893.8T
Authority: ES
Inventors: Ida Mölgaard KNUDSEN
Original assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Current assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Priority date: 2003-10-10
Filing date: 2004-10-06
Publication date: 2016-03-31
Anticipated expiration: 2024-10-06
Also published as: JP2007508003A; WO2005035748A1; EP1673452B1; JP4740138B2; US20060216790A1; US7521210B2; EP1673452A1

Abstract

Un método para producción en gran escala de un polipéptido en células eucariotas contenidas en un líquido de cultivo a una densidad de células de 1-12 x 106 células/mL, comprendiendo dicho método: monitorizar la concentración de CO2 disuelto en el líquido de cultivo, y borbotear aire constante o intermitentemente a través del líquido de cultivo, en donde la velocidad de borboteo del aire se controla en relación con la concentración monitorizada de CO2 disuelto en el líquido de cultivo; y en donde el aire se borbotea a una velocidad suficiente para mantener la concentración de CO2 disuelto en el líquido de cultivo dentro de un intervalo predeterminado que comprende un punto de regulación para dicha concentración y en donde no se añade al líquido de cultivo cantidad alguna de base con un valor de pH superior a 8,5.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para produccion en gran escala de un polipeptido en celulas eucariotas CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a metodos para produccion de polipeptidos interesantes de celulas eucariotas y a una vasija de reactor util para estos metodos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Metodos para produccion en gran escala de polipeptidos, tales como polipeptidos Factor VII en celulas eucariotas se conocen en la tecnica, vease, v.g., WO 02/29083, WO 02/29084 y WO 03/29442. Aunque muchos de los problemas asociados con la produccion en gran escala de polipeptidos, tales como polipeptidos Factor VII, han sido resueltos, quedan todavfa por resolver algunos problemas.

El mantenimiento del valor de pH del lfquido de cultivo dentro de una "ventana" optima de produccion bastante estrecha, v.g. dentro de 0,5 unidades de pH o menos como ocurre actualmente para muchos cultivos de celulas, es un problema particular. La generacion de CO2 y lactato en el lfquido de cultivo causa una disminucion de pH, y para la mayona de los propositos practicos, la adicion de bases fuerte, v.g. NaOH 1M o Na2CO3 1 M, es necesaria a fin de estabilizar el pH o mantener el pH dentro de un intervalo predeterminado. Sin embargo, la adicion de bases fuertes causa problemas con respecto a un aumento de pH espectacular localizado que puede conducir a metabolismo celular anomalo (tasa elevada de consumo de glucosa, tasa elevada de formacion de lactato), si no a apoptosis celular, comparese Nienow et al., Cytotechnology 22: 87-94, 1996; Langheinrich y Nienow, Biotechnology and Bioengineering, 66 (3): 171-179, 1999; Osman et al., Biotechnology and Bioengineering, 75 (1): 63-73, 2001; y Osman et al., Biotechnology and Bioengineering, 79 (4): 398-407, 2002.

Asf pues, existe necesidad de metodos mejorados para produccion en gran escala de polipeptidos a partir de celulas eucariotas, en particular metodos en los que la necesidad de adicion de bases fuertes se reduzca o se elimine.

Mostafa y Gu, Biotechnol. Prog., 2003, 19, 45-51, dan a conocer diversas estrategias para eliminacion de CO2 disuelto de cultivos de alimentacion por lotes en gran escala, v.g. utilizando borboteo con aire.

Pattison et al., Biotechnol. Prog., 2000, 16, 768-774, dan a conocer la medida y el control de CO2 disuelto en procesos de cultivo de celulas de mamffero utilizando un sensor qrnmico de fibra optica in situ. El CO2 disuelto se elimina por borboteo del cultivo con nitrogeno.

Telling & Stone, Biotech. Bioeng. Vol. VI, paginas 147-158 (1964) describe un metodo de control automatico del pH de un sistema tampon bicarbonato-CO2 para el cultivo sumergido de celulas BHK.

Aunque estas referencias mencionan estrategias para controlar el nivel de CO2 disuelto en vasijas de cultivo de celulas por medio de borboteo de gas, ninguna de ellas menciona que la necesidad de adicion de base puede reducirse o eliminarse totalmente de este modo.

SUMARIO DE LA INVENCION

En un aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para produccion en gran escala de un polipeptido en celulas eucariotas contenidas en un lfquido de cultivo a una densidad de celulas de 1-12x106 celulas/mL, comprendiendo dicho metodo: monitorizar la concentracion de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo, y borbotear aire constante o intermitentemente a traves del lfquido de cultivo, en donde la velocidad de borboteo del aire se controla en relacion con la concentracion monitorizada de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo; y en donde el aire se borbotea a una velocidad suficiente para mantener la concentracion de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo dentro de un intervalo predeterminado que comprende un punto de regulacion para dicha concentracion y en el que no se anade al lfquido de cultivo base alguna con un valor de pH superior a 8,5.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para produccion en gran escala de un polipeptido en celulas eucariotas contenidas en un lfquido de cultivo a una densidad de celulas de 1-12x106 celulas/mL, comprendiendo dicho metodo borbotear aire constante o intermitentemente a traves del lfquido de cultivo a una velocidad suficiente para mantener la concentracion de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo dentro de un intervalo predeterminado que comprende un punto de regulacion para dicha concentracion, en el que la velocidad de borboteo de aire esta dentro del intervalo de 0,000-0,070 L/min por L de lfquido de cultivo y cualesquiera sustancias solidas o lfquidas anadidas al lfquido de cultivo no dan lugar a un valor localizado de pH superior a 7,5 en dicho lfquido de cultivo.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 ilustra una realizacion de la vasija del reactor de la invencion.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

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Metodos

Un aspecto de la presente invencion se refiere a metodos para produccion en gran escala de un polipeptido en celulas eucariotas contenidas en un Kquido de cultivo. Una caractenstica de los metodos es que se borbotea aire constante o intermitentemente a traves del lfquido de cultivo para control de CO2 y pH a fin de reducir o eliminar la necesidad de adicion de bases.

As^ en una realizacion principal, la presente invencion proporciona un metodo para produccion en gran escala de un polipeptido en celulas eucariotas contenidas en un lfquido de cultivo a una densidad de 1-12x106 celulas/mL, comprendiendo dicho metodo: monitorizar la concentracion de CO2 disuelto en el Uquido de cultivo, y borbotear aire constante o intermitentemente a traves del lfquido de cultivo, en el que la velocidad de borboteo del aire se controla en relacion con la concentracion monitorizada de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo; y en el que el aire se borbotea a una velocidad suficiente para mantener la concentracion de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo dentro de un intervalo predeterminado que comprende un punto de regulacion para dicha concentracion y en el que no se anade al lfquido de cultivo cantidad alguna de base con un valor de pH superior a 8,5.

Por el termino "produccion en gran escala" se entiende produccion que implica una vasija de cultivo de al menos 100 L. En realizaciones preferidas, sin embargo, la escala es tfpicamente al menos 250 L, tal como al menos 500 L, v.g. al menos 1000 L o incluso 5000 L o mas. El termino "gran escala" puede utilizarse intercambiablemente con los terminos "escala industrial" y "escala de produccion".

El metodo para produccion en gran escala del polipeptido se realiza tfpicamente a lo largo de un periodo de al menos 120 horas, v.g. 1-26 semanas.

La presente invencion no se limita actualmente a la produccion de polipeptido particular alguno o al uso de cualquier celula eucariota particular. Sin embargo, ejemplos ilustrativos de los polipeptidos relevantes y celulas eucariotas utiles se proporcionan mas adelante en esta memoria. No obstante, en algunas de las realizaciones de la invencion actualmente mas interesantes y preferidas, el polipeptido es un polipeptido Factor VII.

El termino "lfquido de cultivo" debe entenderse que significa un lfquido que comprende un cultivo de las celulas eucariotas en un medio adecuado. En una realizacion importante, las celulas estan inmovilizadas por fijacion a la superficie de microportadores compactos o por fijacion a o atrapamiento ffsico en el interior de la estructura interna de microportadores macroporosos. Esta realizacion se explicara con mas detalles mas adelante en esta memoria.

El metodo de la invencion implica monitorizar la concentracion de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo y borbotear aire, constante o intermitentemente, a traves del lfquido de cultivo. La velocidad de borboteo del aire esta controlada en relacion con la concentracion monitorizada de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo.

La monitorizacion de gases, con inclusion de CO2, en lfquidos se conoce en la tecnica, y estan disponibles comercialmente varios sensores (vease "Culture Vessel"). Tales sensores de CO2 proporcionan tfpicamente una senal electrica que transporta datos correspondientes al valor de concentracion real. Algunos sensores proporcionan ademas una lectura del valor real correspondiente a la concentracion de CO2 disuelto. La lectura o senal electrica puede utilizarse para controlar la velocidad de borboteo de aire en el lfquido de cultivo. Aunque dicho control puede efectuarse manualmente, la realizacion preferida incluye el empleo de control automatico. El control automatico se realiza tfpicamente por un medio de control e implica tfpicamente un algoritmo predeterminado. Una vasija de cultivo util para el metodo anterior se describe adicionalmente mas adelante (vease "Culture Vessels").

La velocidad de borboteo se controla en relacion con la concentracion monitorizada de CO2 de tal manera que un aumento significativo en la concentracion real (monitorizada) de CO2 disuelto (con relacion a un punto de regulacion predefinido) sea contrarrestado por un aumento en la velocidad de borboteo del aire, y de tal manera que una disminucion significativa en la concentracion real (monitorizada) de CO2 disuelto (con relacion a un punto de regulacion predefinido) sea contrarrestado por una disminucion en la velocidad de borboteo del aire. De este modo, el metodo hace posible preferiblemente mantener la concentracion de CO2 disuelto dentro de un intervalo predeterminado que comprende un punto de regulacion para dicha concentracion.

El punto de regulacion se define tfpicamente por el operador antes de monitorizar la concentracion de CO2 disuelto y es la concentracion a la cual el operador considera que la produccion del polipeptido en las celulas eucariotas es optima. En ciertos casos, el punto de regulacion puede ajustarse ligeramente en el curso de la fase de produccion a fin de tener en cuenta cualesquiera alteraciones en el lfquido de cultivo.

Ejemplos de algoritmos para controlar la velocidad de borboteo en relacion con la concentracion de CO2 disuelto incluyen el control "todo-nada", control proporcional (P), control proporcional-derivado (PD), control proporcional- integral (PI) y control proporcional-integral-derivado (PID), de los cuales se prefieren a menudo el control PI y PID. Para mas detalles vease, v.g., Michael Barr, "Closed-Loop Control", Embedded Systems Programming, agosto 2002, pp. 55-56. y
www.neutrino.com/Publications/Glossary/PID.html.

El intervalo de la concentracion de CO2 disuelto para el cual es factible la produccion del polipeptido, y el punto de regulacion para el cual se considera optima la produccion, dependen en cierto grado del polipeptido en cuestion, la

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celula eucariota seleccionada, y el medio; por tanto, la persona experta podra determinar este intervalo y esta valor por experimentacion estandar.

Sin embargo, en muchas realizaciones importantes, el intervalo predeterminado para la concentracion de CO2 disuelto es tipicamente 80-200 mmHg, en particular 100-180 mmHg. La concentracion del punto de regulacion de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo es tfpicamente un valor comprendido dentro del intervalo de 100-180 mmHg, tal como 120-160 mmHg, v.g., un valor de alrededor de 140 mmHg.

El termino "velocidad de borboteo de aire" se expresa en L/min por L de lfquido de cultivo (volumen por volumen por minuto (vvm)), y se define como la velocidad a la cual se alimenta aire, normalizado a una temperatura de 25 °C y una presion de 1 atm (101,3 kPa), al lfquido de cultivo.

El termino "constante o intermitentemente" debe entenderse que significa que el borboteo de aire puede conducirse de cualquier manera, v.g., por un flujo sustancialmente ininterrumpido (es decir constante) de aire o un flujo de aire intermitente, etc. La velocidad de borboteo para un flujo intermitente de aire se calcula como la velocidad de flujo media (L/min) a lo largo de un periodo de 3 minutos, es decir el flujo en litros durante los 3 minutos precedentes dividido por 3. Preferiblemente, el borboteo de aire se realiza de modo sustancialmente ininterrumpido. Esto es ventajoso, dado que el borboteo de aire facilita tambien la mezcladura dentro de la vasija de cultivo.

El termino "aire" se entiende que abarca gases que comprenden 60-90%, tal como 65-85% (v.g. 75-82%), de nitrogeno, 10-40%, tal como 15-35% (v.g. 18-24%), de oxfgeno, y menos de 0,5% (v.g. menos de 0,2%) de CO2. El "aire" puede obtenerse por mezcladura de aire atmosferico con nitrogeno u oxfgeno en una ratio adecuada. Un ejemplo preferido de esto es el aire atmosferico, que comprende aproximadamente 78% nitrogeno, aproximadamente 21% oxfgeno, y menos de 0,1% CO2. El uso de aire proporciona la ventaja de suministrar oxfgeno al lfquido de cultivo eliminando al mismo tiempo CO2 del lfquido de cultivo.

En vista de los resultados obtenidos hasta ahora, la velocidad de borboteo de aire esta comprendida preferiblemente dentro del intervalo de 0,000-0,100, tal como 0,000-0,070 L/min por L de lfquido de cultivo. En particular, la velocidad de borboteo de aire esta comprendida tfpicamente dentro del intervalo de 0,005-0,020 L/min por L de lfquido de cultivo cuando la concentracion monitorizada de CO2 disuelto es igual a la concentracion del punto de regulacion.

En realizaciones preferidas, la velocidad de borboteo de aire es: dentro del intervalo de 0,000-0,005, tal como alrededor de 0,0 L/min por L de litro de cultivo cuando la concentracion monitorizada de CO2 disuelto es igual a la concentracion del punto de regulacion - 5 mmHg; y dentro del intervalo de 0,010-0,100, tal como 0,030-0,070, v.g. alrededor de 0,040-0,060, L/min por L de lfquido de cultivo cuando la concentracion monitorizada de CO2 disuelto es igual a la concentracion del punto de regulacion + 5 mmHg.

La presente invencion proporciona una manera util de controlar la concentracion de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo y controlar tambien por tanto indirectamente el pH en el lfquido de cultivo. La presente invencion proporciona por tanto una medida para reducir o eliminar la necesidad de adicion de bases.

Asf, en la presente invencion, cualesquiera sustancias solidas o lfquidas anadidas al lfquido de cultivo no dan lugar a un valor localizado de pH superior a 7,5 en dicho lfquido de cultivo. Preferiblemente, no se anade al lfquido de cultivo base alguna con un valor de pH superior a 8,5.

El termino "valor localizado de pH" se refiere al fenomeno que ocurre cuando la adicion de, v.g., incluso una cantidad pequena de una base fuerte (v.g. pH 10) a un lfquido de cultivo (v.g. pH aproximadamente 7,0) hace que el valor de pH aumente localmente a, v.g., 9,0 antes de mezclar completamente la base fuerte con el medio de cultivo. En algunos casos, la mezcladura puede causar adicionalmente un aumento local de temperatura si el proceso de mezcladura es exotermico. El termino "cualesquiera sustancias solidas o lfquidas anadidas al lfquido de cultivo" se refiere a e incluye todos los agentes, medios, soluciones, suspensiones, etc. anadidos al lfquido de cultivo durante la produccion del polipeptido.

En una variante particular de la invencion, se contempla que la monitorizacion real en lmea de la concentracion de CO2 disuelto puede no ser estrictamente obligada. Asf, la presente invencion proporciona tambien un metodo para produccion en gran escala de un polipeptido en celulas eucariotas contenidas en un lfquido de cultivo a una densidad de celulas de 1-12x106 celulas/mL, comprendiendo dicho metodo borbotear aire constante o intermitentemente a traves del lfquido de cultivo a una velocidad suficiente para mantener la concentracion de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo dentro de un intervalo predeterminado que comprende un punto de regulacion para dicha concentracion, en donde la velocidad de borboteo de aire esta dentro del intervalo de 0,000-0,070 L/min por L de lfquido de cultivo y cualesquiera sustancias solidas o lfquidas anadidas al lfquido de cultivo no dan lugar a un valor localizado de pH superior a 7,5 en dicho lfquido de cultivo. La concentracion de CO2 disuelto puede monitorizarse fuera de lmea por analisis de muestras del lfquido de cultivo con un equipo convencional de analisis de gases, v.g. un analizador comercial de gases en sangre.

En la presente invencion, la velocidad de borboteo del aire esta comprendida tfpicamente dentro del intervalo de 0,001-0,070, tal como 0,005-0,020 L/min por L de lfquido de cultivo. Adicionalmente, la concentracion de CO2

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disuelto en el Ifquido de cultivo se monitoriza preferiblemente a fin de asegurar que la concentracion de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo se mantiene dentro del intervalo predeterminado. Alternativamente, se monitoriza el pH.

En esta realizacion, la velocidad de borboteo de aire se controla preferiblemente en relacion con la concentracion monitorizada de CO2. Alternativamente, la velocidad de borboteo de aire puede controlarse en relacion con el pH monitorizado. En particular, la velocidad de borboteo puede controlarse en relacion con el pH monitorizado y la concentracion monitorizada de lactato.

En particular, la velocidad de borboteo de aire esta dentro del intervalo de 0,005-0,020 L/min por L de lfquido de cultivo cuando la concentracion monitorizada de CO2 disuelto es igual a la concentracion del punto de regulacion. Adicionalmente, la velocidad de borboteo de aire esta tfpicamente:

dentro del intervalo de 0,000-0,005, tal como alrededor de 0,0 L/min por L de lfquido de cultivo cuando la concentracion monitorizada de CO2 disuelto es igual a la concentracion del punto de regulacion - 5 mmHg; y

dentro del intervalo de 0,010-0,100, tal como 0,030-0,070, v.g. alrededor de 0,040-0,060, L/min por L de lfquido de cultivo cuando la concentracion monitorizada de CO2 disuelto es igual a la concentracion del punto de regulacion + 5 mmHg.

Vasija de Cultivo

Se describe tambien en esta memoria una vasija de cultivo particularmente util para los metodos de la invencion.

La vasija de cultivo (1) comprende un lfquido de cultivo (2), estando adaptada dicha vasija para produccion en escala industrial de un polipeptido en una celula eucariota comprendida en el lfquido de cultivo (2), comprendiendo adicionalmente dicha vasija primeros medios sensores (3) para monitorizacion de la concentracion de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo (2), medios de borboteo de gas (4) para borboteo de un gas (tal como aire) a traves del lfquido de cultivo (2), y medios de control (5), estando dichos medios de control (5) en comunicacion con dichos primeros medios sensores (3), y estando dichos medios de control (5) en comunicacion con dichos medios de borboteo de gas (4), en donde los medios de control (5) controlan la velocidad de borboteo del gas por la via de los medios de borboteo de gas (4) en respuesta al valor de CO2 disuelto monitorizado por los primeros medios sensores (3).

Una realizacion de la vasija de cultivo de la invencion se ilustra en la Figura 1.

Los primeros medios sensores (3) estan adaptados particularmente para monitorizar constante o intermitentemente la concentracion de CO2 disuelto en el medio de cultivo (2). Tales medios sensores estan disponibles comercialmente de diversos suministradores comerciales, v.g. el sensor de fibra optica dCO2 YSI 8500, de YSI, Inc.

Los medios de borboteo de gas (4) pueden, v.g., seleccionarse de valvulas controlables, bombas controlables, etc. y combinaciones de valvulas y bombas. Tales valvulas y/o bombas proporcionan aire, v.g. aire comprimido, al lfquido de cultivo a una velocidad controlada por los medios de control (5) basandose en el valor de concentracion para CO2 disuelto en el lfquido de cultivo. Tales medios de borboteo de gas estan disponibles comercialmente de diversos suministradores comerciales, v.g. Burkert, HI-TEC, Samson, Emerson.

En una realizacion, la velocidad de borboteo del gas puede controlarse a fin de mantener la concentracion de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo dentro de un intervalo predeterminado que comprende un punto de regulacion para dicha concentracion. En particular, el medio de borboteo de gas esta adaptado para proporcionar velocidades de borboteo de 0,000-0,100, tales como 0,000-0,050, L/min por L de lfquido de cultivo.

El medio de control (5) es tfpicamente un dispositivo que contiene un microprocesador que es capaz de recibir senales o datos del primer medio sensor (3) y proporcionar senales o datos al medio de borboteo de gas (4). Medios de control estan disponibles comercialmente de diversos suministradores comerciales, v.g. Philips, Yokogawa, Honeywell.

Algoritmos adecuados para implementacion en los medios de control se han descrito adicionalmente con anterioridad.

El termino "en comunicacion con" significa que senales y datos digitales y/o analogicos pueden intercambiarse entre los respectivos "medios" o de un "medio a otro". La comunicacion puede establecerse directamente por conductores electricos o, en caso aplicable, por transmisores y transductores de radiacion electromagnetica, radiacion infrarroja, etc.

El medio de control (5) comprende tfpicamente medios de pre-regulacion tales que un operador de la vasija de cultivo puede introducir los puntos extremos para el intervalo predeterminado y el punto de regulacion predeterminado para la concentracion de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo. Los puntos extremos para el intervalo y el punto de regulacion pueden modificase opcionalmente en el curso de la operacion de la vasija de cultivo, si es necesario o deseable.

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Modificaciones del primer medio sensor (3), el medio de borboteo de gas (4), el medio de control (5) y la manera de poner en comunicacion unos con otros dichos medios seran evidentes para la persona experta en la tecnica.

Las vasijas de cultivo aplicables en la presente invencion pueden estar basadas v.g., en reactores convencionales de tanque agitado (CSTR) en los que la agitacion se obtiene por medio de tipos de rotor convencionales o reactores "airlift" en los que la agitacion se obtiene por introduccion de aire desde el fondo de la vasija. Entre los parametros adicionales que se controlan tfpicamente dentro de lfmites especificados se encuentran el pH, la tension de oxfgeno disuelto (DOT), y la temperatura. La tension de oxfgeno disuelto puede mantenerse por, v.g., borboteo de oxfgeno puro. El medio de control de temperatura es tfpicamente agua, calentado o enfriada en caso necesario. El agua puede hacerse pasar por una camisa que rodea la vasija o por un serpentm de tubos sumergido en el cultivo.

El termino "vasija de cultivo" puede utilizarse intercambiablemente con "tanque", "reactor", "fermentador" y "biorreactor".

Polipeptidos para Produccion en Gran Escala

La presente invencion se refiere a metodos pertinentes para el cultivo mejorado en gran escala de celulas eucariotas que expresan una o mas protemas de interes, sea de genes endogenos o subsiguientemente a la introduccion en tales celulas de genes recombinantes que codifican la protema. Tales protemas incluyen, sin limitacion, polipeptidos Factor VII; Factor VIII; Factor IX; Factor X, Protema C; Factor tisular; renina; hormona del crecimiento, con inclusion de la hormona de crecimiento humano, hormona de crecimiento bovino; factor liberador de hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoprotemas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina, hormona estimulante del folmulo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factor natriuretico atrial; surfactante pulmonar; un activador del plasminogeno, tal como uroquinasa o activador del plasminogeno de orina humana o de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyetico; factor alfa y beta de necrosis tumoral; encefalinasa; protema inflamatoria de macrofagos humanos (MIP-1-alfa); una seroalbumina tal como seroalbumina humana; sustancia inhibidora mulleriana, cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; peptido asociado a gonadotropina de raton; una protema microbiana, tal como beta- lactamasa; DNasa; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; integrina; protema A o D; factores reumatoides; un factor neurotrofico tal como factor neurotrofico derivado de hueso (bDnF), neurotrofina-3, -4, -5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6), o un factor de crecimiento de los nervios tal como factor de crecimiento NGF-p derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tal como a-FGF y p-FGF; factor de crecimiento epidermico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, factor de crecimiento I y II semejante a insulina (IGF-I e IGF-II); protemas CD tales como CD-3, CD-4, CD-8, y CD-19; eritropoyetina; factores osteoinductivos; inmunotoxinas; protema morfogenetica osea (BMP); un interferon tal como interferon-alfa, -beta, y -gamma; factores estimulantes de colonias (CSFs), v.g. M-CsF, GM-CSF, y G-CSF; interleucinas (ILs), v.g., IL-1 a IL-10; superoxido-dismutasa; receptores de celulas T; protemas de la membrana superficial; factor acelerador de la degradacion; antfgenos virales tales como, por ejemplo, una porcion de la envoltura del SIDA; protemas de transporte; receptores de retorno; adresina; protemas reguladoras; anticuerpos; y variantes y fragmentos de secuencia de cualquiera de los polipeptidos anteriores.

En realizaciones preferidas de la invencion, el polipeptido es un polipeptido Factor VII.

En algunas realizaciones de esta memoria, las celulas utilizadas en la practica de la invencion son celulas humanas que expresan un gen del Factor VII endogeno. En estas celulas, el gen endogeno puede estar intacto o puede haber sido modificado in situ, o una secuencia exterior del gen del Factor VII puede haber sido modificada in situ para alterar la expresion del gen del Factor VII endogeno.

En otras realizaciones de esta memoria, celulas procedentes de cualquier fuente eucariota se modifican por ingeniena genetica para expresar Factor VII humano a partir de un gen recombinante.

El "polipeptido Factor VII" abarca Factor VII de tipo salvaje (es decir, un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos descrita en la Patente U.S. N.° 4.784.950), asf como variantes Factor VII que exhiben sustancialmente la misma o mejor actividad biologica con relacion al Factor VII de tipo salvaje, y variantes Factor VII que tienen actividad biologica sustancialmente modificada o reducida con relacion al Factor VII de tipo salvaje. El termino "Factor VII" debe entenderse que abarca polipeptidos Factor VII en su forma no escindida (zimogeno), asf como aquellos que han sido procesados proteolfticamente para producir sus formas bioactivas respectivas, que pueden designarse Factor VIIa. Tfpicamente, el Factor VII se escinde entre los residuos 152 y 153 para producir el Factor VIIa. El termino "polipeptido Factor VII" abarca tambien polipeptidos, con inclusion de variantes, en los cuales la actividad biologica del Factor VIIa ha sido sustancialmente modificada o algo reducida con relacion a la actividad del Factor VIIa de tipo salvaje. Estos polipeptidos incluyen, sin limitacion, Factor VII o Factor VIIa en los cuales se han introducido alteraciones espedficas en la secuencia de aminoacidos que modifican o perturban la bioactividad del polipeptido.

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La actividad biologica del Factor Vila en la coagulacion de la sangre deriva de su capacidad para (i) fijarse al Factor Tisular (TF) y (ii) catalizar la escision proteolftica de Factor IX o Factor X para producir Factor IX o X activado (Factor IXa o Xa, respectivamente).

La actividad biologica de los polipeptidos Factor VII ("actividad biologica del Factor VII") puede cuantificarse por medida de la capacidad de una preparacion para promover la coagulacion de la sangre utilizando plasma deficiente en Factor VII y tromboplastina, como se describe, v.g., en la Patente U.S. N.° 5.997.864 o WO 92/15686. De este modo, la actividad biologica se expresa como la reduccion en el tiempo de coagulacion con relacion a una muestra de control y se convierte en "unidades Factor VII" por comparacion con un estandar de suero humano agrupado que contiene 1 unidad/mL de actividad del Factor VII. Alternativamente, la actividad biologica del Factor VIIa puede cuantificarse por (i) medida de la capacidad Factor VIIa (o el polipeptido Factor VII) para producir Factor X activado (Factor Xa) en un sistema que comprende TF embebido en una membrana lipfdica y Factor X. (Persson et al., J. Biol. Chem. 272: 19919-19924, 1997); (ii) medida de la hidrolisis de Factor X en un sistema acuoso ("In Vitro Proteolysis Assay", Ensayo 2 - vease mas adelante); (iii) medida de la fijacion ffsica Factor VIIa (o el polipeptido Factor VII) a TF utilizando un instrumento basado en resonancia de plasmones de superficie (Persson, FEBS Letts, 413:359-363, 1997); (iv) medida de la hidrolisis de un sustrato sintetico por Factor VIIa (o un polipeptido Factor VII) ("In Vitro Hydrolysis Assay", Ensayo 1 - vease mas adelante); o (v) medida de la generacion de trombina en un sistema in vitro independiente de TF.

Las variantes Factor VII que tienen sustancialmente la misma o mayor actividad biologica con relacion al Factor VIIa de tipo salvaje abarcan aquellas que exhiben al menos aproximadamente 25%, con preferencia al menos aproximadamente 50%, con mas preferencia al menos aproximadamente 75% y de modo muy preferible al menos aproximadamente 90% de la actividad espedfica Factor VIIa que se ha producido en el mismo tipo de celula, cuando se testa en uno o mas de un ensayo de coagulacion, ensayo de proteolisis, o ensayo de fijacion de TF arriba descritos. Variantes Factor VII que tienen actividad biologica sustancialmente reducida con relacion al Factor VIIa de tipo salvaje son aquellas que exhiben menos de aproximadamente 25%, con preferencia menos de aproximadamente 10%, de modo mas preferible menos de aproximadamente 5% y de modo muy preferible menos de aproximadamente 1% de la actividad espedfica Factor VIIa de tipo salvaje que se ha producido en el mismo tipo de celula cuando se testa en uno o mas de un ensayo de coagulacion, ensayo de proteolisis, o ensayo de fijacion de TF arriba descrito. Variantes Factor VII que tienen una actividad biologica sustancialmente modificada con relacion al Factor VII de tipo salvaje incluyen, sin limitacion, variantes Factor VII que exhiben actividad proteolftica de Factor X independiente de TF y aquellas que fijan TF pero no escinden el Factor X.

Variantes Factor VII, tanto si exhiben sustancialmente la misma bioactividad o mayor que el Factor VII de tipo salvaje o, alternativamente, si exhiben bioactividad sustancialmente modificada o reducida con relacion al Factor VII de tipo salvaje, incluyen, sin limitacion, polipeptidos que tienen una secuencia de aminoacidos que difiere de la secuencia Factor VII de tipo salvaje por insercion, delecion, o sustitucion de uno o mas aminoacidos.

Ejemplos no limitantes de variantes Factor VII que tienen sustancialmente la misma actividad biologica que el Factor VII de tipo salvaje incluyen S52a-FVIIa, S60a-FVIIa (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352:182-192, 1998); variantes Factor VIIa que exhiben estabilidad proteolftica aumentada como se describe en la Patente U.S. No. 5.580.560; Factor VIIa que ha sido escindido proteolfticamente entre los residuos 290 y 291 o entre los residuos 315 y 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); formas oxidadas Factor VIIa (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); variantes Factor VII como se describe en PCT/DK02/00189; y variantes Factor VII que exhiben estabilidad proteolftica aumentada como se describe en WO 02/38162 (Scripps Research Institute); variantes Factor VII que tienen un dominio Gla modificado y que exhiben una fijacion de membrana mejorada como se describe en WO 99/20767 (Universidad de Minnesota); y variantes Factor VII como se describen en WO 01/58935 (Maxygen ApS).

Ejemplos no limitantes de variantes Factor VII que tienen actividad biologica aumentada comparados con el Factor VIIa de tipo salvaje incluyen variantes Factor VII como se describen en WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, WO 03/27147, WO 03/37932; WO 02/38162 (Scripps Research Institute); y variantes Factor VIIa con actividad mejorada como se describen en JP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.).

Ejemplos no limitantes de variantes Factor VII que tienen actividad biologica sustancialmente reducida o modificada con relacion al Factor VII de tipo salvaje incluyen R152E-FVIIa (Wildgoose et al., Biochem 29:3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995), FFR-FVIIa (Holst et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998), y Factor VIIa que carece del dominio Gla, (Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317:245-249, 1993).

Ejemplos expftcitos de polipeptidos Factor VII incluyen, sin limitacion, Factor VII de tipo salvaje, L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII,

V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII,

E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, y S336G-FVII, L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII,

L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-

5

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20

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40

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60

65

FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII

L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII

L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII

S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII

K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII

K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII

S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/V158T-FVII

S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII

S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII

S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII

S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/- K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/-

L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A- FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII

K316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII

K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII

K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/- M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII

K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII

K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/-K337A-FVII, K316Q/L305V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D-FVII

K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII

K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII

K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII

K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII

K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII

K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII

K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII, F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII

F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII,

F374Y/L305V/V158D-FVII,

F374Y/L305V/S314E-FVII,

F374Y/K337A/E296V-FVII,

F374Y/V158D/E296V-FVII,

F374Y/E296V/S314E-FVII,

F374Y/L305V/E296V-FVII,

F374Y/K337A/S314E-FVII,

F374Y/K337A/V158D-FVII,

F374Y/V158T/S314E-FVII,

F374Y/S314E/M298Q-FVII,

F374Y/L305V/M298Q-FVII

F374Y/K337A/VI58T-FVII,

F374Y/V158D/S314E-FVII,

F374Y/V158T/M298Q-FVII

F374Y/E296V/M298Q-FVII,

F374Y/L305V/K337A-FVII

F374Y/L305V/V158T-FVII

F374Y/K337A/M298Q-FVII

F374Y/V158D/M298Q-FVII

F374Y/V158T/E296V-FVII

F374Y/L305V/K337A/V158D

FVII, F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII

F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII

F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII,

F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII F374Y/L305V/E296V/-M298Q/S314E-FVII F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII

S52A-Factor VII, S60A-Factor VII; R152E-Factor VII, S344A-Factor VII, Factor VIIa que carece del dominio Gla; y P11Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315N/V317T-

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FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII; y Factor VII que tiene sustituciones, adiciones o deleciones en la secuencia de aminoacidos desde 233Thr a 240Asn, Factor VII que tiene sustituciones, adiciones o deleciones en la secuencia de aminoacidos desde 304Arg a 329Cys.

En algunas realizaciones, el polipeptido Factor VII es Factor VIIa humano (hFVIIa), con preferencia Factor VIIa que se ha hecho humano recombinantemente (rhFVIIa).

En otras realizaciones, el polipeptido Factor VII es una variante de secuencia Factor VII.

En algunas realizaciones, v.g. aquellas en las que el polipeptido Factor VII es una variante de la secuencia Factor VII, la ratio entre la actividad del polipeptido Factor VII y la actividad del Factor VIIa humano nativo (FVIIa tipo salvaje) es al menos aproximadamente 1,25, con preferencia al menos aproximadamente 2,0, o al menos aproximadamente 4,0, cuando se testa conforme al "In Vitro Proteolysis Assay" (Ensayo 2) como se describe en la presente memoria descriptiva.

En algunas realizaciones, v.g. aquellas en las cuales el polipeptido Factor VII es una variante de la secuencia Factor VII, la ratio entre la actividad de dicho polipeptido Factor VII y la actividad del Factor VIIa humano nativo (FVIIa tipo salvaje) es al menos aproximadamente 1,25, con preferencia al menos aproximadamente 2,0, o al menos aproximadamente 4,0, cuando se testa conforme al "In Vitro Hydrolysis Assay" (Ensayo 1) como se describe en la presente memoria descriptiva.

En algunas realizaciones, el polipeptido Factor VII tiene una glicosilacion diferente Factor VII humano de tipo salvaje. Celulas

En la practica de la presente invencion, las celulas son celulas eucariotas, mas preferiblemente un linaje de celulas eucariotas establecido, que incluye, sin limitacion, linajes de celulas CHO (v.g., ATCC CCL 61), COS-1 (v.g., ATCC CRL 1650), de rinon de cna de hamster (BHK), y HEK293 (v.g., ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Un linaje de celulas BHK preferido es el linaje de celulas BHK tk" ts13 (Waechter y Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1106-1110, 1982), al que se hace referencia en lo sucesivo como celulas BHK 570. El linaje de celulas BHK 570 esta disponible de la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, bajo el numero de acceso ATCC CRL 10314. Un linaje de celulas BHK tk- ts13 esta disponible tambien de la ATCC bajo el numero de acceso CRL 1632. Un linaje de celulas CHO preferido es el linaje de celulas CHO K1, disponible de ATCC bajo el numero de acceso CCI61.

Otros linajes de celulas adecuados incluyen, sin limitacion, Rat Hep I (hepatoma de rata; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (hepatoma de rata; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), Pulmon humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1); celulas DUKX (linaje de celulas CHO) (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980) (celulas DUKX a las que se hace referencia tambien como celulas DXB11), y DG44 (linaje de celulas CHO) ('Cell, 33: 405, 1983, y Somatic Cell and Molecular Genetics 12: 555, 1986). Son utiles tambien celulas 3T3, celulas Namalwa, mielomas y fusiones de mielomas con otras celulas. En algunas realizaciones, las celulas pueden ser celulas mutantes o recombinantes, tales como, v.g., celulas que expresan un espectro cualitativa o cuantitativamente distinto de enzimas que catalizan la modificacion de protemas posterior a la traduccion (v.g., enzimas de glicosilacion tales como glicosil-transferasas y/o glicosidasas, o enzimas de procesamiento tales como propeptidos) que el tipo de celula del que se han derivado las mismas. Linajes adecuados de celulas de insecto incluyen tambien, sin limitacion, linajes de celulas de Lepidopteros, tales como celulas de Spodoptera frugiperda o celulas de Trichoplusia ni (vease, v.g., US 5.077.214).

En algunas realizaciones, las celulas utilizadas en la practica de la invencion son capaces de crecer en cultivos de suspension. Como se utiliza en esta memoria, celulas competentes en suspension son aquellas que pueden crecer en suspension sin producir agregados compactos grandes, es decir, celulas que estan monodispersas o crecen en agregados sueltos con solo unas pocas celulas por agregado. Celulas competentes en suspension incluyen, sin limitacion, celulas que crecen en suspension sin adaptacion o manipulacion (tales como, v.g., celulas hematopoyeticas o celulas linfoides) y celulas que se han hecho competentes en suspension por adaptacion gradual de celulas dependientes de fijacion (tales como, v.g., celulas epiteliales o fibroblastos) al crecimiento en suspension.

Las celulas utilizadas en la practica de la invencion pueden ser celulas de adhesion (conocidas tambien como celulas dependientes de anclaje o dependientes de fijacion). Como se utiliza en esta memoria, las celulas de adhesion son aquellas que precisan adherirse o anclarse a una superficie adecuada para propagacion y crecimiento. En una realizacion de la invencion, las celulas utilizadas son celulas de adhesion. En estas realizaciones, tanto las fases de propagacion como la fase de produccion incluyen el uso de microportadores. Las celulas de adhesion utilizadas debenan ser capaces de migrar sobre los portadores (y a la estructura interior de los portadores si se utiliza un portador macroporoso) durante la o las fases de propagacion y migrar a nuevos portadores cuando se transfieren al biorreactor de produccion. Si las celulas de adhesion no son suficientemente capaces de migrar a nuevos portadores por sf mismas, las mismas pueden librarse de los portadores por contacto de los microportadores que contienen las celulas con enzimas proteolfticas o EDTA. El medio utilizado (particularmente cuando esta exento de componentes derivados de animales) debena contener ademas componentes adecuados para soportar las

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celulas de adhesion; medios adecuados para cultivo de celulas de adhesion estan disponibles de suministradores comerciales, tales como, v.g., Sigma.

Las celulas pueden ser tambien celulas adaptadas a suspension o competentes en suspension. Si se utilizan tales celulas, la propagacion de las celulas puede hacerse en suspension, por lo que los microportadores se utilizan solo en la fase de propagacion final en la vasija de cultivo de produccion propiamente dicha y en la fase de produccion. En el caso de celulas adaptadas en suspension, los microportadores utilizados son tipicamente portadores macroporosos en los cuales las celulas estan fijadas por atrapamiento ffsico en el interior de la estructura interna de los portadores.

Procedimientos de Cultivo de Celulas

Los metodos de la invencion se realizan tipicamente en una vasija de cultivo agitada, empleandose preferiblemente un tipo de proceso basado en microportadores. En el proceso basado en microportadores, las celulas han migrado a la estructura interna de los portadores (portadores macroporosos) o se han fijado ellas mismas a la superficie de los portadores (portadores compactos), o ambas cosas. En un proceso basado en microportadores, las celulas eucariotas, los microportadores y el medio de cultivo se suministran inicialmente a una vasija de cultivo. En los dfas siguientes, puede alimentarse medio de cultivo adicional si el volumen de cultivo no habfa llegado al volumen de trabajo final de la vasija desde el principio. Durante el periodo siguiente, se realiza periodicamente la recoleccion de sobrenadante de cultivo que contiene el producto y el reemplazamiento con medio nuevo, hasta que finalmente se termina el cultivo. Cuando se cosecha el sobrenadante que contiene el producto, la agitacion, v.g., el removido del cultivo se detiene y los portadores que contienen las celulas se dejan sedimentar, despues de lo cual se retira parte del medio de cultivo que contiene el producto.

Para mejorar el resultado global del procedimiento, puede aplicarse preferiblemente un paso de enfriamiento antes de recoger el sobrenadante que contiene el producto, vease, v.g., WO 03/029442. En algunas realizaciones, el lfquido de cultivo se enfna a una temperatura comprendida entre aproximadamente 18 °C y aproximadamente 32 °C antes de dejar que se sedimenten los portadores, o entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 30 °C, o entre aproximadamente 22 °C y aproximadamente 28 °C.

Otras variantes aplicables del procedimiento de cultivo de celulas se describen en WO 02/29084.

Pasos de Propagacion

Antes de alcanzar la fase de produccion en la que se realiza la recogida regular del sobrenadante de cultivo que contiene el producto para procesamiento ulterior aguas abajo, las celulas se propagan segun cualquier esquema de rutina que pueda ser adecuado para la celula particular en cuestion. La fase de propagacion puede ser un procedimiento de un solo paso o un procedimiento de pasos multiples. En un procedimiento de propagacion de un solo paso, las celulas se retiran del almacenamiento y se inoculan directamente en la vasija de cultivo que contiene los microportadores en los que va a tener lugar la produccion. En un procedimiento de propagacion de pasos multiples, las celulas se retiran del almacenamiento y se propagan en varias vasijas de cultivo de tamano gradualmente creciente hasta que alcanzan la vasija de cultivo final que contiene microportadores en los que va a tener lugar la produccion. Durante los pasos de propagacion, las celulas se dejan crecer en condiciones que estan optimizadas para crecimiento. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, tension de oxfgeno disuelto y analogas, son las que se conocen como optimas para la celula particular y seran evidentes para la persona experta o profesional en este campo (vease, v.g., Animal Cell Culture: A Practical Approach 2.a edicion, Rickwood, D. y Hames, B.D., editores., Oxford University Press, Nueva York (1992)).

En un enfoque, el proceso de cultivo de celulas se realiza en una sola vasija de cultivo: Las celulas se inoculan directamente en la vasija de cultivo que contiene microportadores en los que va a tener lugar la produccion; las celulas se propagan hasta que se alcanza una densidad de celulas adecuada y se inicia la fase de produccion.

En otro enfoque, el proceso de cultivo de celulas se lleva a cabo en al menos dos vasijas de cultivo distintas: Una o mas vasijas de cultivo de celulas (primer o primeros pasos de propagacion) seguidas por la vasija de cultivo de produccion (ultimo paso de propagacion seguido por la fase de produccion). En el primer paso de propagacion, las celulas que expresan el polipeptido deseado se inoculan en una vasija de cultivo de siembra que contiene medio de cultivo y se propagan hasta que las celulas alcanzan una densidad minima de siembra cruzada. Subsiguientemente, el cultivo de siembra propagado se transfiere a la vasija de cultivo de produccion que contiene (a) medio de cultivo y (b) microportadores. En esta vasija de cultivo se cultivan las celulas en condiciones en las que las celulas migran a la superficie de los portadores compactos o las superficies exteriores e interiores de los portadores macroporosos, y aquellas continuan creciendo en este ultimo paso de propagacion hasta que los portadores estan totalmente colonizados por las celulas. Durante este ultimo paso de propagacion se realiza el cambio de medio dejando que los microportadores se sedimenten en el fondo de la vasija de cultivo, despues de lo cual se retira un porcentaje predeterminado del volumen del tanque y se anade a la vasija un volumen porcentual de tanque correspondiente de medio nuevo. Los microportadores se resuspenden luego en el medio y este proceso de retirada y reemplazamiento del medio se repite a intervalos predeterminados, por ejemplo cada 24 horas. La cantidad de medio reemplazado

depende de la densidad de celulas y puede ser tfpicamente de 10% a 95%, preferiblemente de 25% a 80%, del volumen del tanque como se muestra en la Tabla 1 siguiente.

Se comprendera que en un proceso en el que la fase de propagacion es un procedimiento de pasos multiples, la propagacion puede tener lugar en vasijas de cultivo de tamano progresivamente creciente hasta que se obtiene un 5 numero de celulas suficiente para entrar en la vasija de cultivo final. Por ejemplo, puede(n) utilizarse secuencialmente una o mas vasijas de cultivo de siembra de 5 L, 50 L, 100 L o 500 L. Una vasija de cultivo de siembra tiene una capacidad comprendida entre 5 L y 1000 L. Tfpicamente, las celulas se inoculan en una vasija de cultivo de siembra a una densidad inicial de aproximadamente 0,2 a 0,4 x 106 celulas/mL y se propagan hasta que el cultivo alcanza una densidad de celulas de aproximadamente 1,0 x 106 celulas/mL. Tfpicamente, una densidad 10 minima de siembra cruzada esta comprendida entre aproximadamente 0,8 y aproximadamente 1,5 x 106 celulas/mL.

Algunos de los productos de regulacion que son adecuados para la produccion de un polipeptido deseado, v.g. Factor VII, no son necesariamente adecuados para el crecimiento inicial de las celulas, sea en cultivo de siembra o sobre los microportadores. Por ejemplo, la temperatura, la tension de oxfgeno disuelto, y/o el pH pueden ser diferentes para las dos fases. Los intercambios de medio durante la propagacion se realizan para mantener las 15 celulas vivas y en crecimiento, no para cosechar el sobrenadante de cultivo para procesamiento aguas abajo.

Condiciones de cultivo posibles para el ultimo paso de propagacion en la vasija de cultivo final (que contiene los microportadores) se resenan en la Tabla 1 a continuacion.

Tabla 1

Punto de regulacion: Intervalo Intervalo preferido Valor mas preferido

CO2 disuelto: 80-200 mmHg 100-180 mmHg 120-160 mmHg

Ph: 6-8 6,6-7,6 7,0

Temperatura: 28-40 °C 34-38 °C 36-37 °C

Tension de oxfgeno disuelto: 10-90% de la saturacion 20-80% de la saturacion 50% de la saturacion

Cambio diario de medio:

- % de medio cambiado a: 10-35% de medio cambiado a 0,4-1,0x106 celulas/mL 25 % de medio cambiado a 0,4-1,0x106 celulas/mL 25% de medio cambiado a 0,5x106 celulas/mL

- % de medio cambiado a: 30-70% de medio cambiado a 0,7-3,0x106 celulas/mL 50% de medio cambiado a 0,7-3,0x106 celulas/mL 50% de medio cambiado a 1,0x106 celulas/mL

- % de medio cambiado a: 60-90% de medio cambiado a 1,0-12,0x106 celulas/mL 80% de medio cambiado a 1,0-12,0x106 celulas/mL 80% de medio cambiado a 2,0-10x106 celulas/mL

20 Fase de Produccion

Los metodos de la presente invencion son interesantes fundamentalmente para la fase de produccion, aunque los mismos pueden utilizarse para la fase de propagacion en caso deseable (vease Tabla 1).

Ademas de las caractensticas y medidas definidas por los metodos de la presente invencion, precisan ser tomadas varias otras medidas para la produccion a fin de lograr un resultado satisfactorio como se describira en lo que sigue.

25 Cuando la densidad de celulas alcanza el valor adecuado para comienzo de la fase de produccion, es decir para tener un sobrenadante de cultivo que contiene producto procesado agua abajo, se recoge 60-95% del sobrenadante de cultivo cada 24 horas, preferiblemente 80%. Este valor de densidad de celulas es tfpicamente 1-12 x 106 celulas/mL. Los productos de regulacion pueden modificarse en este momento y ajustarse a valores adecuados para produccion del polipeptido deseado.

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El intercambio de medio se realiza dejando que los microportadores se sedimenten en el fondo del tanque, despues de lo cual se retira el porcentaje seleccionado del volumen del tanque y se anade a la vasija un volumen porcentual de tanque correspondiente de medio nuevo. Tfpicamente se reemplaza entre 25 y 90% del volumen de tanque; preferiblemente, se reemplaza con medio nuevo 80% del volumen del tanque. Los microportadores se resuspenden luego en el medio y este proceso de retirada y reemplazamiento del medio se repite tipicamente cada 10 a 48 horas, preferiblemente cada 24 horas.

Un resumen de este aspecto del proceso se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2

Punto de regulacion: Intervalo Intervalo preferido Valor mas preferido

CO2 disuelto: 80-200 mmHg 100-180 mmHg 120-160 mmHg

pH: 6-8 6,6-7,6 7,0 para CHO y 6,7-6,9 para BHK

Temperatura: 26-40 °C 30-37 °C 0 0 CD CO

Tension de oxfgeno disuelto: 10-90% de la saturacion 20-80% de la saturacion 50%

- % de medio cambiado: 25-90% de medio cambiado cada 10-48 horas 80% de medio cambiado cada 10-48 horas 80% de medio cambiado cada 24 horas

Opcionalmente, puede emplearse una cafda en el punto de regulacion de temperatura del cultivo cuando se entra en la fase de produccion, y durante la misma.

Cuando se inicia la fase de produccion, la temperatura, el pH de operacion y la frecuencia de intercambio de medio se cambian tfpicamente a valores que son optimos para la produccion. Ejemplos de intervalos y valores de temperatura en las fases de crecimiento y produccion, respectivamente, pueden verse en las Tablas 1 y 2. Se prefiere una temperatura de aproximadamente 36 °C para un linaje de celulas CHO durante la fase de produccion.

Microportadores

Como se utiliza en esta memoria, los microportadores son partfculas que son suficientemente pequenas para permitir que las mismas se utilicen en cultivos de suspension (con una velocidad de agitacion que no causa un deterioro significativo a las celulas por cizalladura). Los microportadores son compactos, porosos, o tienen un nucleo compacto con un recubrimiento poroso en la superficie. Por ejemplo, los microportadores pueden estar basados, sin limitacion, en celulosa o dextrano, y sus superficies (superficie exterior e interior en el caso de portadores porosos) pueden estar cargadas positivamente. Detalles adicionales pueden encontrarse en WO 02/29083.

En una serie de realizaciones, los microportadores tienen un diametro de partfcula global comprendido entre aproximadamente 150 y 350 pm; y tienen una densidad de carga positiva comprendida entre aproximadamente 0,8 y 2,0 meq/g. En una serie de realizaciones, el microportador es un microportador compacto. Microportadores compactos utiles incluyen, sin limitacion, Cytodex 1TM y Cytodex 2TM (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway NJ). Los portadores compactos son particularmente adecuados para celulas de adhesion (celulas dependientes de anclaje).

En otra serie de realizaciones, el microportador es un portador macroporoso. Como se utiliza en esta memoria, los portadores macroporosos son partfculas, v.g. basadas en celulosa, que tienen las propiedades siguientes: (a) son suficientemente pequenas para permitir su utilizacion en cultivos de suspension (con una velocidad de agitacion que no causa deterioro significativo por cizalladura a las celulas); y (b) tienen poros y espacios interiores de tamano suficiente para permitir que las celulas migren a los espacios interiores de la partfcula. En una realizacion sus superficies (exterior e interior) pueden estar cargadas positivamente. En una serie de realizaciones, los portadores: (a) tienen un diametro global de partfcula entre aproximadamente 150 y 350 pm; (b) tienen poros que poseen un diametro medio de abertura de poro comprendido entre aproximadamente 15 y aproximadamente 40 pm; y (c) tienen una densidad de carga positiva comprendida entre aproximadamente 0,8 y 2,0 meq/g. En algunas realizaciones, la carga positiva esta proporcionada por grupos DEAE (N,N-dietilaminoetilo). Portadores macroporosos utiles incluyen, sin limitacion, Cytopore 1TM y Cytopore 2TM (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway NJ). Son particularmente preferidos los portadores Cytopore 1TM, que tienen un diametro medio de partfcula de 230 pm, un diametro medio de poro de 30 pm, y una densidad de carga positiva de 1,1 meq/g.

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Condiciones de Cultivo en Gran Escala

Como se utiliza en esta memoria, una vasija de cultivo en gran escala tiene una capacidad de al menos aproximadamente 100 L, con preferencia al menos aproximadamente 500 L, de modo mas preferible al menos aproximadamente 1000 L, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 5000 L. En el caso de que el proceso de cultivo de celulas se realice en al menos dos vasijas de cultivo distintas, tales como una o mas vasija(s) de cultivo de siembra (primer(os) paso(s) de propagacion) seguidas por la vasija de cultivo de produccion (ultimo paso de propagacion seguido por la fase de produccion), entonces el proceso implica por lo general transferir aproximadamente 50 L del cultivo de siembra propagado (que tiene aproximadamente 1,0 x 106 celulas/mL) a una vasija de cultivo de 500 L que contiene 150 L de medio de cultivo. El cultivo en gran escala se mantiene en condiciones apropiadas de v.g. temperatura, pH, tension de oxfgeno disuelto (DOT), y velocidad de agitacion, y el volumen se aumenta gradualmente por adicion de medio a la vasija de cultivo. En el caso de un proceso con microportadores, la vasija de cultivo comprende tambien una cantidad de microportadores correspondiente a una concentracion final de microportadores dentro del intervalo de 1 a 10 g/L. Despues de la transferencia, las celulas migran tfpicamente a la superficie de los portadores o al interior de los portadores dentro de las primeras 24 horas.

Medio

Los terminos "medio de cultivo de celulas" y "medio de cultivo" (o simplemente "medio") se refieren a una solucion de nutrientes utilizada para crecimiento de celulas eucariotas que proporcionan tipicamente al menos un componente de una o mas de las categonas siguientes: (1) sales de v.g. sodio, potasio, magnesio, y calcio que contribuyen a la osmolalidad del medio; (2) una fuente de energfa, usualmente en la forma de un carbohidrato tal como glucosa; (3) la totalidad de los aminoacidos esenciales, y usualmente el conjunto basico de veinte aminoacidos; (4) vitaminas y/u otros compuestos organicos requeridos a bajas concentraciones; y (5) elementos traza, donde los elementos traza se definen como compuestos inorganicos que se requieren tipicamente a concentraciones muy bajas, usualmente en el rango micromolar. La solucion de nutrientes puede complementarse opcionalmente con uno o mas de los componentes de cualquiera de las categonas siguientes: (a) suero animal; (b) hormonas y otros factores de crecimiento tales como, por ejemplo, insulina, transferrina, y factor de crecimiento epidermico; y (c) hidrolizados de protema y tejidos.

La presente invencion abarca el cultivo de celulas eucariotas en un medio que comprende componentes derivados de animales, v.g. suero o componentes de suero, asf como medio que carece de componentes derivados de animales. El medio de cultivo de celulas que comprende componentes derivados de animales (tales como, v.g., suero bovino fetal (FBS)) puede comprender mas de 5% de suero o entre 0% y 5% de suero, tal como, por ejemplo, entre 0% y 1% de suero o entre 0% y 0,1% de suero.

Se prefieren medios que carecen de componentes derivados de animales. Como se utiliza en esta memoria, componentes "derivados de animales" son cualesquiera componentes que se producen en un animal intacto (tal como, v.g., protemas aisladas y purificadas de suero), o producidos por utilizacion de componentes producidos en un animal intacto (tal como, v.g., un aminoacido producido por utilizacion de una enzima aislada y purificada a partir de un animal para hidrolizar un material de procedencia vegetal). En contraste, una protema que tiene la secuencia de una protema animal (es decir, que tiene origen genomico en un animal) pero que se produce in vitro en cultivo de celulas (tal como, v.g., en una levadura o celula bacteriana recombinante o en un linaje establecido continuo de celulas eucariotas, recombinante o no), en medios que carecen de componentes que se producen en, y se afslan y purifican a partir de un animal intacto no es un componente "derivado de animal" (tal como, v.g., insulina producida en una levadura o celula bacteriana, o insulina producida en un linaje establecido de celulas de mairnfero, tal como, v.g., celulas CHO, BHK o HEK, o interferon producido en celulas Namalwa). Por ejemplo, una protema que tiene una secuencia de una protema animal (v.g., tiene un origen genomico en un animal) pero que se produce en una celula recombinante en medios que carecen de componentes derivados de animales (tal como, v.g., insulina producida en una levadura o celula bacteriana) no es un "componente derivado de animal". De acuerdo con ello, un medio de cultivo de celulas que carece de componentes derivados de animales es uno que puede contener protemas animales que se producen recombinantemente; dicho medio, sin embargo, no contiene, v.g., suero animal o protemas u otros productos purificados a partir de suero animal. Dicho medio puede contener, por ejemplo, uno o mas componentes derivados de plantas. Puede utilizarse cualquier medio de cultivo de celulas, en particular uno que carezca de componentes derivados de animales, que soporte el crecimiento y mantenimiento de celulas en las condiciones de la invencion. Tfpicamente, el medio contiene agua, un regulador de osmolalidad, un tampon, una fuente de energfa, aminoacidos, una fuente de hierro inorganica o recombinante, uno o mas factores de crecimiento sinteticos o recombinantes, vitaminas, y cofactores. En una realizacion, el medio carece de componentes derivados de animales y carece de protemas ("exento de protemas"). Medios que carecen de componentes y/o protemas derivados de animales estan disponibles de suministradores comerciales, tales como, por ejemplo, Sigma, JRH Biosciences, Gibco y Gemini.

Ademas de componentes convencionales, un medio adecuado para produccion de polipeptidos Factor VII o afines a Factor VII contiene Vitamina K, que se requiere para Y-carboxilacion de residuos de acido glutamico en el Factor VII, a una concentracion comprendida entre aproximadamente 0,1 y 50 mg/L, con preferencia entre aproximadamente 0,5 y 25 mg/L, de modo mas preferible entre aproximadamente 1 y 10 mg/L y de modo muy preferible aproximadamente 5 mg/L.

Medios adecuados para uso en la presente invencion estan disponibles de suministradores comerciales tales como, por ejemplo, Gibco, y JRH Biosciences.

En una realizacion, el medio esta compuesto como se muestra en la Tabla 3, complementado opcionalmente con uno o mas de los componentes que se muestran en la Tabla 4.

5 La tabla siguiente (Tabla 3) es una composicion de un medio adecuado para uso en la presente invencion. Opcionalmente, se anade(n) al medio de cultivo uno o mas de los componentes enumerados en la Tabla 4. Los intervalos preferidos se enumeran en la Tabla 4. En una realizacion, el medio utilizado es Medio 318-X; en otra realizacion, se trata del medio CHO-K.

Tabla 3

COMPONENTE: Intervalo (mg/L) Concentracion en CHO-K (mg/L) Concentracion en 318-X (mg/L)

Cloruro de sodio: 0-70 000 6122 6996

Cloruro de potasio: 0-3118 311,8 311,8

Dihidrogeno-fosfato de sodio monohidratado: 0-625 62,5 62,5

Hidrogenocarbonato de sodio: 0-27 - 2,7

Hidrogenofosfato disodico anhidro: 0-710 71,02 -

Hidrogenofosfato disodico heptahidratado: 0-1340 134

Cloruro de magnesio anhidro: 0-287 28,64 -

Cloruro de magnesio hexahidratado: 0-610 - 61

Sulfato de magnesio anhidro: 0-488 48,84 -

Sulfato de magnesio heptahidratado: 0-1000 - 100

Cloruro de calcio anhidro: 0-1166 116,6 116,6

Sulfato de cobre pentahidratado: 0-0,014 0,0013 0,0013

Sulfato ferroso heptahidratado: 0-4,17 0,147 0,417

Nitrato ferrico nonahidratado: 0-0,5 0,05 0,05

Citrato ferrico: 0-123 0,4 12,24

Sulfato de cinc heptahidratado: 0-0,44 0,432 0,432

Dextrosa anhidra: 0-45 000 4501 4500

Acido linoleico: 0-12 1,189 0,336

Insulina: 0-50 5 5

Acido DL 68 tioctico: 0-9 0,473 0,84

L-alanina: 0-50 4,45 4,45

Cloruro de L-arginina: 0-5500 547,8 447,5

L-asparagina monohidratada: 0-6010 407,5 607,5

Acido L-aspartico: 0-1100 6,65 106,65

Hidrocloruro de L-cistema monohidratado: 0-1200 117,65 77,56

Acido L-glutamico: 0-2500 251,35 107,35

Glicina: 0-190 18,75 18,75

Hidrocloruro de L-histidina monohidratado: 0-2200 211,48 101,48

L-isoleucina: 0-750 54,47 74,47

L-leucina: 0-1800 179,05 159,05

Hidrocloruro de L-lisina: 0-2400 231,25 131,25

L-metionina: 0-1380 137,24 97,24

L-fenilalanina: 0-1600 155,48 85,48

L-prolina: 0-1150 17,25 117,25

L-serina: 0-4300 266,25 426,25

L-treonina: 0-1800 173,45 73,45

L-triptofano: 0-2100 39,02 209,02

L-tirosina-disodica dihidratada: 0-900 55,79 85,79

L-valina: 0-1800 177,85 125,85

Dihidrocloruro de L-cistina: 0-320 31,29 31,29

Hipoxantina de sodio: 0-25 2,39 2,39

Dihidrocloruro de putrescina: 0-1 0,081 0,081

Piruvato de sodio: 0-2300 220 55

D-biotina: 0-3 0,1313 0,259

D-pantotenato de calcio: 0-60 4,08 6

Acido folico: 0-70 4,65 6,65

I-inositol: 0-700 39,1 65,6

Nicotinamida: 0-50 3,085 4,2

Cloruro de colina: 0-450 29,32 42

Hidrocloruro de piridoxina: 0-25 0,117 2,2

Riboflavina: 0-3 0,219 0,219

Hidrocloruro de tiamina: 0-35 2,67 3,17

Timidina: 0-4 0,365 0,365

Vitamina B12: 0-50 2,68 4,68

Hidrocloruro de piridoxal: 0-60 6 2

Glutation: 0-50 2,5 5

Selenito de sodio: 0-0,5 0,02175 0,0232

Acido L-ascorbico: 0-50 27,5 5

Pluronic F68: 0-10 000 1000 1000

Vitamina K: 0-50 5 5

Dextrano T70: 0-1000 - 100

Hidrolizado de soja (v.g., HY-SOY®): 0-5000 500 -

Componentes opcionales:

Tabla 4

Componente: Intervalo (mg/L)

Hidrolizados vegetales HyPep 4601,4602, 4605, 5603, 7401: 0-5000

Lfpidos, acido oleico: 0-15

Factores de crecimiento HGR, IGF, EGF: 0-50

5 En otra realizacion, el medio utilizado tiene la composicion siguiente (medio 318-U):

Tabla 5

COMPONENTE: (mg/L)

Cloruro de sodio: 6122

Cloruro de potasio: 311,8

Dihidrogenofosfato de sodio monohidratado: 62,5

Hidrogenofosfato disodico anhidro: 71,02

Cloruro de magnesio anhidro: 28,64

Sulfato de magnesio anhidro: 48,84

Cloruro de calcio anhidro: 116,6

Sulfato de cobre pentahidratado: 0,0013

Sulfato ferroso heptahidratado: 0,417

Nitrato ferrico nonahidratado: 0,05

Sulfato de cinc heptahidratado: 0,432

Dextrosa anhidra: 4501

Acido linoleico: 1,189

Acido DL-68-tioctico: 0,473

L-alanina: 4,45

Hidrocloruro de L-arginina: 547,5

Monohidrato de L-asparagina: 407,5

Acido L-aspartico: 6,65

Monohidrato de hidrocloruro de L-cistema: 117,65

Acido L-glutamico: 251,35

L-glutamina: 365

Glicina: 18,75

Monohidrato de hidrocloruro de L-histidina: 211,48

L-isoleucina: 54,47

L-leucina: 179,05

Hidrocloruro de L-lisina: 231,25

L-metionina: 137,24

L-fenilalanina: 155,48

L-prolina: 17,25

L-serina: 266,25

L-treonina: 173,45

L-triptofano: 39,02

L-tirosina disodica dihidratada: 55,79

L-valina: 177,85

Dihidrocloruro de L-cistina: 31,29

Hipoxantina sodica: 2,39

Dihidrocloruro de putrescina: 0,081

Piruvato de sodio: 220

D-biotina: 0,1313

D-pantotenato de calcio: 4,08

Acido folico: 4,65

I-inositol: 39,1

Nicotinamida: 3,085

Cloruro de colina: 29,32

Hidrocloruro de piridoxina: 0,117

Riboflavina: 0,219

Hidrocloruro de tiamina: 2,67

Timidina: 0,365

Vitamina B12: 2,68

Hidrocloruro de piridoxal: 3

Glutation: 2,5

Selenito de sodio: 0,02175

Acido L-ascorbico, acido libre: 27,5

Hidrogenocarbonato de sodio: 2440

HySoy (hidrolizado de protemas de soja): 500

Etanolamina: 1,22

5

10

15

20

25

30

35

40

Insulina: 5

Dextrano T70: 100

Pluronic F68: 1000

Vitamina K1: 5

COMPONENTE: mL/L

Complejo Fe/citrato (50 mM/1 M): 0,4

Mercaptoetanol: 0,0035

El medio es preferiblemente un medio que carece de componentes derivados de animales, o un medio que carece de componentes derivados de animales y que carece de protemas ("exento de protemas").

En una realizacion, el medio es un medio CHO disponible comercialmente y exento de protemas que carece de componentes derivados de animales (JRH Biosciences) y el linaje de celulas es una celula CHO. En una realizacion, el medio es Medio 318-X y el linaje de celulas es un linaje de celulas BHK; en otra realizacion, el Medio es medio 318-U y el linaje de celulas es un linaje de celulas BHK. En otra realizacion, el medio es Medio CHO-K y el linaje de celulas es un linaje de celulas CHO.

En algunas realizaciones, las celulas utilizadas en la practica de la presente invencion estan adaptadas para crecimiento en suspension en un medio que carece de componentes derivados de animales, tal como, v.g., medio que carece de suero. Tales procedimientos de adaptacion se describen, v.g., en Scharfenberg, et al., Animal Cell Technology Developments towards the 21st Century, E. C. Beuvery et al. (Eds.), Kluwer Academic Publishers, pp. 619-623, 1995 (celulas BHK y CHO); Cruz, Biotechnol. Tech. 11:117-120, 1997 (celulas de insecto); Keen, Cytotechnol. 17: 203-211, 1995 (celulas de mieloma); Berg et al., Biotechniques 14: 972-978, 1993 (celulas 293 de rinon humano). En una realizacion particularmente preferida, las celulas hospedadoras son celulas BHK 21 o celulas CHO que han sido modificadas por ingenieffa genetica para expresar Factor VII humano y que se han adaptado para crecimiento en ausencia de suero o componentes derivados de animales.

Procesamiento Aguas Abajo

Una vez que el medio ha sido retirado de la vasija de cultivo, el mismo puede someterse a uno o mas pasos de procesamiento para obtener la protema deseada, que incluyen, sin limitacion, centrifugacion o filtracion para eliminar las celulas que no estaban inmovilizadas en los portadores; cromatograffa de afinidad, cromatograffa de interaccion hidrofoba; cromatograffa de intercambio ionico; cromatograffa de exclusion de tamanos; procedimientos electroforeticos (v.g., enfoque isoelectrico preparativo (IEF), solubilidad diferencial (v.g., precipitacion con sulfato de amonio), o extraccion y analogos. Vease, generalmente, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, Nueva York, 1982; y Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989.

La purificacion de polipeptidos Factor VII o afines a Factor VII puede implicar, v.g., cromatograffa de afinidad en una columna de anticuerpos anti-Factor VII (vease, v.g., Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261: 11097, 1986; y Thim et al., Biochem. 27: 7785, 1988) y activacion por escision proteolffica, utilizando Factor XIIa u otras proteasas que tienen especificidad de tipo tripsina tales como, v.g., Factor IXa, calicrema, Factor Xa, y trombina. Vease, v.g., Osterud et al., Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, Patente U.S. N.° 4.456.591; y Hedner et al., J. Clin. Invest. 71:1836 (1983). Alternativamente, el Factor VII puede activarse por paso del mismo a traves de una columna de cromatograffa de intercambio ionico, tal como Mono Q® (Pharmacia) o analogas.

Los ejemplos que siguen se presentan como ilustraciones no limitantes de la presente invencion.

PARTE EXPERIMENTAL

Metodos Generales

Ensayos adecuados para determinacion de la actividad biologica de polipeptidos Factor VII

Los polipeptidos Factor VII utiles segun la presente invencion pueden seleccionarse por ensayos adecuados que se pueden realizar como tests in vitro simples preliminares. Asf, la presente memoria descriptiva da a conocer un test simple (titulado "Ensayo de Hidrolisis in Vitro") para la actividad de polipeptidos Factor VII.

Ensayo de Hidrolisis In Vitro (Ensayo 1)

Los polipeptidos Factor VIIa nativo (tipo salvaje) y Factor VII (a los dos cuales se hace referencia en lo sucesivo como "del Factor VIIa") pueden ensayarse respecto a actividades espedficas. Los mismos pueden ensayarse

tambien en paralelo para comparar directamente sus actividades espedficas. El ensayo se lleva a cabo en una placa de microtitulacion (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca). El sustrato cromogeno D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilida (S-2288, Chromogenix, Suecia), concentracion final 1 mM, se anade a Factor Vila (concentracion final 100 nM) en HEPES 50 mM, pH 7,4, que contiene NaCl 0,1 M, CaCl2 5 mM, y 1 mg/mL de seroalbumina bovina. La absorbancia a 405 nm 5 se mide continuamente en un lector de placas SpectraMax™ 340 (Molecular Devices, EE. UU.). La absorbancia desarrollada durante una incubacion de 20 minutos, despues de sustraccion de la absorbancia en un pocillo de muestra en blanco que no contiene enzima alguna, se utiliza para calcular la ratio entre las actividades de polipeptido Factor VII y Factor Vila tipo salvaje:

Ratio = (A405 nm polipeptido Factor VII)/(A405 nm Factor Vila tipo salvaje).

10 Basandose en ello, pueden identificarse polipeptidos Factor VII con una actividad menor que, comparable a, o mayor que Factor VIIa nativo, tales como, por ejemplo, polipeptidos Factor VII en los cuales la ratio entre la actividad del polipeptido Factor VII y la actividad del Factor VII nativo (FVII tipo salvaje) es aproximadamente 1,0 frente a mas de 1,0.

La actividad de los polipeptidos Factor VII puede medirse tambien utilizando un sustrato fisiologico tal como Factor X 15 ("Ensayo de Proteolisis In Vitro"), convenientemente a una concentracion de 100-1000 nM, donde el Factor Xa generado se mide despues de la adicion de un sustrato cromogeno adecuado (v.g., S-2765). Adicionalmente, el ensayo de actividad puede realizarse a temperatura fisiologica.

Ensayo de Proteolisis In Vitro (Ensayo 2)

Se ensayan polipeptido Factor VIIa y Factor VII nativo (tipo salvaje) (a los dos cuales se hace referencia en lo 20 sucesivo en esta memoria como "del Factor VIIa") en paralelo para comparar directamente sus actividades espedficas. El ensayo se lleva a cabo en una placa de microtitulacion (MaxiSorp, Nunc. Dinamarca). Factor VIIa (10 nM) y Factor X (0,8 microM) en 100 pL de HEPES 50 mM, pH 7,4, que contiene NaCl 0,1 M, CaCl2 5 mM, y 1 mg/mL de seroalbumina bovina, se incuban durante 15 min. La escision Factor X se interrumpe luego por adicion de 50 pL de HEPES 50 mM, pH 7,4, que contiene NaCl 0,1 M, EDTA 20 mM y 1 mg/mL de seroalbumina bovina. La cantidad 25 de Factor Xa generada se mide por adicion del sustrato cromogeno Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilida (S-2765, Chromogenix, Suecia), concentracion final 0,5 mM. La absorbancia a 405 nm se mide continuamente en un lector de placas SpectraMax™ 340 (Molecular Devices, EE. UU.). La absorbancia desarrollada durante 10 minutos, despues de sustraccion de la absorbancia en un pocillo de muestra en blanco que no contiene cantidad alguna de FVIIa, se utiliza para calcular la ratio entre las actividades proteoltticas del polipeptido Factor VII y Factor VIIa de tipo salvaje:

30 Ratio = (A405 nm polipeptido Factor VII)/(A405 nm Factor VIIa de tipo salvaje).

Basandose en ello, puede identificarse el polipeptido Factor VII con una actividad menor que, comparable a, o mayor que el Factor VIIa nativo, tal como, por ejemplo, polipeptidos Factor VII en los cuales la ratio entre la actividad del polipeptido Factor VII y la actividad del Factor VII nativo (FVII de tipo salvaje) es aproximadamente 1,0 frente a mas de 1,0.

35 EJEMPLOS

Ejemplo 1: Produccion Exenta de Suero Factor VII

Se realizo el experimento siguiente para producir Factor VII en cultivo de escala piloto grande.

Un linaje de celulas CHO K1 transformado con un plasmido codificante Factor VII se adapto a crecimiento en cultivo de suspension en un medio exento de componentes derivados de animales. Se congelo un conjunto de las celulas 40 adaptadas. Las celulas del conjunto se propagaron en botellas "spinner" en cultivo de suspension en medio exento de componentes derivados de animales. A medida que aumentaba el numero de celulas, el volumen se incrementaba gradualmente por adicion de medio nuevo. Cuando el volumen hubo alcanzado 4 L, y el numero de celulas habfa alcanzado “ 0,8 * 106/mL, los contenidos de las botellas "spinner" se transfirieron a un reactor de tanque agitado de 50 L (reactor de siembra). A medida que aumentaba el numero de celulas en el reactor de 50 L, el 45 volumen se incrementaba gradualmente por adicion de medio nuevo. Cuando el volumen hubo alcanzado 50 L, y el numero de celulas hubo alcanzado “ 1 x 106/mL, los contenidos del reactor 50 L se transfirieron a un reactor de tanque agitado de 500 L (reactor de produccion). El reactor de 500 L contema portadores macroporosos Cytopore 1 (Amersham Biosciences) dentro de los cuales las celulas llegaron a inmovilizarse en el transcurso de 24 horas despues de la inoculacion. El volumen en el reactor de 500 L se incremento gradualmente por adicion de medio 50 nuevo a medida que aumentaba el numero de celulas. Cuando el volumen hubo alcanzado 450 L, y el numero de celulas hubo alcanzado “2 x 106/mL, se inicio la fase de produccion y se realizo un cambio de medio cada 24 horas: Se paro la agitacion para permitir la sedimentacion de los portadores que conteman celulas, y se recogio luego el 80% del sobrenadante de cultivo, que se reemplazo con medio nuevo. El sobrenadante de cultivo recogido se filtro para separar las celulas no atrapadas y los residuos de celulas, y se transfirio luego para procesamiento ulterior. El 55 reactor de 50 L, asf como el biorreactor de 500 L estaban provistos de instrumentos para control de temperatura, oxfgeno disuelto (borboteo de oxfgeno mediante microborboteador), velocidad de agitacion, velocidad de aireacion del espacio de cabezas y pH (control descendente por adicion de CO2 gaseoso al espacio de cabezas, sin control

ascendente alguno por adicion de base). Adicionalmente, el biorreactor de 500 L estaba provisto de instrumentos para control de CO2 disuelto. La medida de CO2 en lmea se realizo por medio de un instrumento de CO2 YSI 8500. El nivel de CO2 se controlo por borboteo de aire atmosferico en el interior del lfquido mediante un tubo segun la senal de CO2. La velocidad de borboteo se ajusto a 0 L/min por L de lfquido de cultivo cuando la concentracion de 5 CO2 era igual o menor que el punto de regulacion, y a 0,01-0,05 L/min por L de lfquido de cultivo cuando la concentracion de CO2 era superior al punto de regulacion. El punto de regulacion para CO2 disuelto era 160 mmHg. Como se ha mencionado, no se anadio base alguna al biorreactor para controlar el pH hacia arriba. Durante la fase de produccion, la densidad de celulas alcanzo 1-2 x 107 celulas/mL, y la concentracion de FVII en la cosecha diaria era 10-20 mg/L. La pCO2 se mantuvo dentro del intervalo de 150-170 mmHg. El pH se mantuvo por encima de 6,70, 10 aunque no se anadio base alguna.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para produccion en gran escala de un polipeptido en celulas eucariotas contenidas en un Kquido de cultivo a una densidad de celulas de 1-12 x 106 celulas/mL, comprendiendo dicho metodo: monitorizar la concentracion de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo, y borbotear aire constante o intermitentemente a traves del lfquido de cultivo, en donde la velocidad de borboteo del aire se controla en relacion con la concentracion monitorizada de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo; y en donde el aire se borbotea a una velocidad suficiente para mantener la concentracion de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo dentro de un intervalo predeterminado que comprende un punto de regulacion para dicha concentracion y

en donde no se anade al lfquido de cultivo cantidad alguna de base con un valor de pH superior a 8,5.
2. El metodo segun la reivindicacion 1, en donde el intervalo predeterminado para la concentracion de CO2 disuelto es 80-200 mmHg, tal como 100-180 mmHg.
3. El metodo segun la reivindicacion 2, en donde la concentracion en el punto de regulacion de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo es un valor comprendido dentro del intervalo de 100-180 mmHg, tal como 120-160 mmHg.
4. El metodo segun la reivindicacion 3, en el que la concentracion del punto de regulacion de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo corresponde a un valor de 140 mmHg.
5. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la velocidad de borboteo de aire esta dentro del intervalo de 0,000-0,100 L/min por L de lfquido de cultivo.
6. El metodo segun la reivindicacion 5, en el que la velocidad de borboteo de aire esta dentro del intervalo de 0,005-0,020 L/min por L de lfquido de cultivo cuando la concentracion monitorizada de CO2 disuelto es igual a la concentracion del punto de regulacion.
7. El metodo segun la reivindicacion 6, en el que la velocidad de borboteo de aire esta:

dentro del intervalo de 0,000-0,005, tal como alrededor de 0,0 L/min por L de lfquido de cultivo cuando la concentracion monitorizada de CO2 disuelto es igual a la concentracion del punto de regulacion - 5 mmHg; y

dentro del intervalo de 0,010-0,100, tal como 0,030-0,070, v.g. alrededor de 0,040-0,060, L/min por L de lfquido de cultivo cuando la concentracion monitorizada de CO2 disuelto es igual a la concentracion del punto de regulacion + 5 mmHg.
8. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cualesquiera sustancias solidas o lfquidas anadidas al lfquido de cultivo no dan lugar a un valor localizado de pH superior a 7,5 en dicho lfquido de cultivo.
9. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipeptido es un polipeptido Factor VII.
10. Un metodo para produccion en gran escala de un polipeptido en celulas eucariotas contenidas en un lfquido de cultivo a una densidad de celulas de 1-12 x 106 celulas/mL, comprendiendo dicho metodo borbotear aire constante o intermitentemente a traves del lfquido de cultivo a una velocidad suficiente para mantener la concentracion de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo dentro de un intervalo predeterminado que comprende un punto de regulacion para dicha concentracion, en donde la velocidad de borboteo de aire esta dentro del intervalo de 0,000-0,070 L/min por L de lfquido de cultivo y cualesquiera sustancias solidas o lfquidas anadidas al lfquido de cultivo no dan lugar a un valor localizado de pH superior a 7,5 en dicho lfquido de cultivo.
11. El metodo segun la reivindicacion 10, en el que la concentracion de CO2 disuelto en el lfquido de cultivo esta monitorizada.
12. El metodo segun la reivindicacion 11, en el que la velocidad de borboteo de aire esta dentro del intervalo de 0,005-0,020 L/min por L de lfquido de cultivo cuando la concentracion monitorizada de CO2 disuelto es igual a la concentracion del punto de regulacion.
13. El metodo segun la reivindicacion 12, en el que la velocidad de borboteo de aire esta:

dentro del intervalo de 0,000-0,005, tal como alrededor de 0,0 L/min por L de lfquido de cultivo cuando la concentracion monitorizada de CO2 disuelto es igual a la concentracion del punto de regulacion - 5 mmHg; y

dentro del intervalo de 0,010-0,100, tal como 0,030-0,070, v.g. alrededor de 0,040-0,060, L/min por L de lfquido de cultivo cuando la concentracion monitorizada de CO2 disuelto es igual a la concentracion del punto de regulacion + 5 mmHg.

LU >

l metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en el que el polipeptido es un polipeptido Factor II.