KR20230061462A - 단백질 정제 공정에서의 숙주 세포 단백질 함량의 감소 방법 - Google Patents
단백질 정제 공정에서의 숙주 세포 단백질 함량의 감소 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 개시내용은 환자에 대한 투여를 위한 단백질의 제조 공정에서 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 재조합 단백질 제조 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 치료용 또는 진단용 단백질과 같이 환자에 대한 투여를 위한 단백질의 제조 공정에서 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다.
숙주 세포 단백질 (HCP)은 세포 유지 및 성장, 그리고 단백질 합성 및 프로세싱과 연관되어 있는 숙주 세포의 단백질들이다. 그러나, 치료용 또는 진단용 단백질의 범주에서, HCP의 존재는 응집, 촉매활성에 의한 생성물 단편화 및/또는 면역원성과 같은 우려를 낳음으로써, 생성물 품질 및 환자 안전성을 위협한다. 이에 따라, HCP는 단백질 제제의 중요 품질 속성 (CQA)으로 취급되고 있다. 원치않는 응집물의 형성 및 생성물 단편화는 HCP를 감소/제거하기 위한 추가적인 정제 단계를 요구하며, 이러한 추가적인 정제 단계는 종종 원하는 단백질의 수율 감소 및 전체적인 제조 비용의 증가를 초래한다.
제조 공정에서 HCP를 제거한다는 과제 및 HCP의 감소 과정을 개선하기 위한 시도에 대해서는 예를 들면 문헌 [Gilgunn et al.]; [Goey et al., Biotechnology Advances 36 (2018) 1223-1237]; 및 [Current Opinion in Chemical Engineering 2018, 22:98-106]에 제시되어 있는 바와 같이 개시되어 있다. 그러나, HCP를 제거하기 위한 이러한 과정들은 한계를 가지고 있다. 예를 들어 일부 경우에서, 이들 개시내용은 HCP의 불완전한 제거, 응집물로 이어지는 HCP 제거 과정에서의 모순, 원하는 단백질과 HCP의 공동-정제, 생성물 기능의 손상, 환자에서의 면역원성 우려, 및/또는 반감기와 같은 약동학적 특성의 감소 중 1종 이상을 나타내고 있다. 또한, HCP를 제거하기 위하여 개발된 과정들은 종종 예를 들면 증가된 부피 및 추가적인 정제 단계를 사용하여 작업할 필요성을 요구함으로써, 종종 제조 비용의 증가 및 수율 감소를 초래한다. 일부 경우에서는, 특정 분자 및/또는 포맷으로 방법의 적용성이 제한된다. 이에 따라, 치료용 또는 진단용 단백질의 정제 공정에서 HCP를 감소시키는 대안적인 방법에 대한 필요성이 남아 있다. 그와 같은 대안적인 방법은 바람직하게는 생성물 안정성, 수율 또는 비용에 영향을 주지 않으면서 HCP를 감소시킴으로써, 궁극적으로 생성물 품질을 유지하며, 대규모 제조에 적합하고, 환자의 안전성을 보장한다.
이에 따라, 본 발명은 치료용 또는 진단용 단백질의 제조에서 HCP를 감소시키는 대안적인 방법을 제공하는 것에 의해 상기 문제점들 중 1종 이상을 해소한다. 본 발명의 방법은 단백질 안정성을 보존하고 응집을 감소시키며 생성물 수율을 유지하면서 HCP를 제거하는 데에 있어서 고도로 효과적이고, 면역원성의 위험성을 낮추는 잠재력을 가지고 있는 재현가능한 방법을 제공한다. 그와 같은 방법은 증가된 단백질 조제물 부피를 필요로 하지 않으면서도 HCP를 효과적으로 제거할 수 있다. 놀랍게도, 본 발명의 방법은 < 100 ppm인 산업상 허용가능한 표준 훨씬 아래의 HCP 계수를 달성하였다. 놀랍게도, 실시양태에서, 본 발명의 방법은 단백질 안정성을 보존하고 응집을 감소시키며 생성물 수율을 유지하면서도 < 50 ppm의 HCP 계수를 달성하였다. 더욱 놀랍게도, 본 발명의 다른 실시양태는 단백질 안정성을 보존하고 응집을 감소시키며 생성물 수율을 유지하면서도 < 20 ppm의 HCP 계수를 달성하였다. 또한, 본 발명의 실시양태는 광범위한 분자에 적용가능한 HCP 제거 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태는 추가적인 정제 단계의 배제를 가능하게 함으로써, 배치 처리 시간의 감소 및 제조 비용의 감소를 초래한다.
이에 따라, 특정 실시양태는 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 관심 단백질을 용리시킴으로써 관심 단백질을 포함하는 용리액을 수득하는 단계, 용리액의 pH를 약 pH 6.0 초과로 상승시키는 단계, 용리액을 심층 필터(depth filter)에 적용하는 단계, 및 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 약 pH 6.0 초과로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다. 일부 실시양태에서, 상기 약산은 1개 이하의 pKa 값이 7.0 미만이고, 상기 강산은 1개 이하의 pKa 값이 7.0 미만이다. 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 50 ppm 미만 또는 약 20 ppm 미만으로 감소된다.
이에 따라, 특정 실시양태에서, 제공되는 것은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 관심 단백질을 용리시킴으로써 관심 단백질을 포함하는 용리액을 수득하는 단계, 용리액에서 바이러스 불활성화를 수행하는 단계, 용리액의 pH를 약 pH 6.0 초과로 상승시키는 단계, 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법이다. 일부 실시양태에서, 약 pH 6.0 초과로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다. 일부 실시양태에서, 상기 약산은 1개 이하의 pKa 값이 7.0 미만이고, 상기 강산은 1개 이하의 pKa 값이 7.0 미만이다. 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 50 ppm 미만 또는 약 20 ppm 미만으로 감소된다.
이에 따라, 특정 실시양태에서, 제공되는 것은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 관심 단백질을 용리시킴으로써 관심 단백질을 포함하는 용리액을 수득하는 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 단백질을 용리시키는 상기 단계로부터의 용리액의 pH를 약 pH 4.0 미만으로 조정하는 것을 포함하며 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되는 것인 바이러스 불활성화를 수행하는 단계, 용리액의 pH를 약 pH 6.0 초과로 상승시키는 단계, 단백질을 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법이다. 일부 실시양태에서, 약 pH 6.0 초과로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다. 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 50 ppm 미만 또는 약 20 ppm 미만으로 감소된다.
이에 따라, 특정 실시양태에서, 제공되는 것은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 관심 단백질을 용리시킴으로써 관심 단백질을 포함하는 용리액을 수득하는 단계이며, 여기서 상기 약산은 아세트산이고, 상기 강산은 인산 또는 락트산인 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 단백질을 용리시키는 상기 단계로부터의 단백질을 포함하는 용리액의 pH를 약 pH 4.0 미만으로 조정하는 단계이며, 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되는 것인 단계, 용리액의 pH를 약 pH 6.0 초과로 상승시키는 단계, 단백질을 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법이다. 일부 실시양태에서, 약 pH 6.0 초과로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다. 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 50 ppm 미만 또는 약 20 ppm 미만으로 감소된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 관심 단백질을 용리시킴으로써 관심 단백질을 포함하는 용리액을 수득하는 단계이며, 여기서 상기 약산은 아세트산이고, 상기 강산은 인산이고, 아세트산의 농도는 약 20 mM이고, 인산의 농도는 약 5 mM 내지 약 10 mM인 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 단백질을 용리시키는 상기 단계로부터의 단백질을 포함하는 용리액의 pH를 약 pH 4.0 미만으로 조정하는 단계이며, 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되는 것인 단계, 용리액의 pH를 약 pH 6.0 초과로 상승시키는 단계, 단백질을 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 약 pH 6.0 초과로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다. 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 50 ppm 미만 또는 약 20 ppm 미만으로 감소된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 관심 단백질을 용리시킴으로써 관심 단백질을 포함하는 용리액을 수득하는 단계이며, 여기서 상기 약산은 아세트산이고, 상기 강산은 락트산이고, 아세트산의 농도는 약 20 mM이고, 락트산의 농도는 약 5 mM인 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 단백질을 용리시키는 상기 단계로부터의 단백질을 포함하는 용리액의 pH를 약 pH 4.0 미만으로 조정하는 단계이며, 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되는 것인 단계, 용리액의 pH를 약 pH 6.0 초과로 상승시키는 단계, 단백질을 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 약 pH 6.0 초과로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다. 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 50 ppm 미만 또는 약 20 ppm 미만으로 감소된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 관심 단백질을 용리시킴으로써 관심 단백질을 포함하는 용리액을 수득하는 단계이며, 여기서 상기 약산은 아세트산이고, 상기 강산은 인산 또는 락트산인 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 단백질을 용리시키는 상기 단계로부터의 단백질을 포함하는 용리액의 pH를 조정하는 단계이며, 용리액의 pH를 조정하는 상기 단계가 약 20 mM HCl을 용리액에 첨가하는 것을 포함하고, 여기서 용리액의 pH는 약 pH 3.3 내지 약 pH 3.7로 조정되고, 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 3.3 내지 약 pH 3.7으로 유지되는 것인 단계, 용리액의 pH를 약 pH 6.0 초과로 상승시키는 단계, 단백질을 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 약 pH 6.0 초과로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다. 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 50 ppm 미만 또는 약 20 ppm 미만으로 감소된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 관심 단백질을 용리시킴으로써 관심 단백질을 포함하는 용리액을 수득하는 단계이며, 여기서 상기 약산은 아세트산이고, 상기 강산은 인산 또는 락트산인 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 단백질을 용리시키는 상기 단계로부터의 단백질을 포함하는 용리액의 pH를 조정하는 단계이며, 용리액의 pH를 조정하는 상기 단계가 약 20 mM HCl을 용리액에 첨가하는 것을 포함하고, 여기서 용리액의 pH는 약 pH 3.5로 조정되고, 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 3.5로 유지되는 것인 단계, 용리액의 pH를 약 pH 6.0 초과로 상승시키는 단계, 단백질을 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 약 pH 6.0 초과로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다. 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 50 ppm 미만 또는 약 20 ppm 미만으로 감소된다.
일부 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 관심 단백질을 용리시킴으로써 관심 단백질을 포함하는 용리액을 수득하는 단계이며, 여기서 상기 약산은 아세트산이고, 상기 강산은 인산 또는 락트산인 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 단백질을 용리시키는 상기 단계로부터의 단백질을 포함하는 용리액의 pH를 약 pH 4.0 미만으로 조정하는 단계이며, 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되는 것인 단계, 약 250 mM의 트리스(Tris) 완충제를 용리액에 첨가하는 것을 포함하며, 여기서 용리액의 pH는 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5로 상승되는 것인 단계, 및 단백질을 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 용리액의 pH를 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5로 상승시키는 단계는 약 100 mM 내지 약 1000 mM의 트리스 완충제를 용리액에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약 pH 6.5 초과 내지 약 pH 7.5로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다. 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 50 ppm 미만 또는 약 20 ppm 미만으로 감소된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 관심 단백질을 용리시킴으로써 관심 단백질을 포함하는 용리액을 수득하는 단계이며, 여기서 상기 약산은 아세트산이고, 상기 강산은 인산 또는 락트산인 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 단백질을 용리시키는 상기 단계로부터의 단백질을 포함하는 용리액의 pH를 약 pH 4.0 미만으로 조정하는 단계이며, 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되는 것인 단계, 약 250 mM의 트리스 완충제를 용리액에 첨가하는 것을 포함하며, 여기서 용리액의 pH는 약 pH 7.0으로 상승되는 것인 단계, 단백질을 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 용리액의 pH를 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5로 상승시키는 단계는 약 100 mM 내지 약 1000 mM의 트리스 완충제를 용리액에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약 pH 7.0으로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다. 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 50 ppm 미만 또는 약 20 ppm 미만으로 감소된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 관심 단백질을 용리시킴으로써 관심 단백질을 포함하는 용리액을 수득하는 단계이며, 여기서 상기 약산은 아세트산이고, 상기 강산은 인산 또는 락트산인 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 단백질을 용리시키는 상기 단계로부터의 단백질을 포함하는 용리액의 pH를 약 pH 4.0 미만으로 조정하는 단계이며, 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되는 것인 단계, 용리액의 pH를 pH 약 6.0 초과로 상승시키는 단계, 단백질을 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하며, 여기서 심층 필터에 적용되는 용리액은 약 10 mM 내지 약 45 mM의 이온 강도를 가지는 것인, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 50 ppm 미만 또는 약 20 ppm 미만으로 감소된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 관심 단백질을 용리시킴으로써 관심 단백질을 포함하는 용리액을 수득하는 단계이며, 여기서 상기 약산은 아세트산이고, 상기 강산은 인산 또는 락트산인 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 단백질을 용리시키는 상기 단계로부터의 단백질을 포함하는 용리액의 pH를 약 pH 4.0 미만으로 조정하는 것을 포함하며 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되는 것인 바이러스 불활성화를 달성하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 관심 단백질을 용리시킴으로써 관심 단백질을 포함하는 용리액을 수득하는 단계이며, 여기서 상기 약산은 약 20 mM의 농도로 아세트산을 포함하고, 상기 강산은 인산, 포름산 또는 락트산 중 임의의 1종으로 구성되고, 여기서 강산의 농도는 약 5 mM 내지 약 10 mM인 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 단백질을 용리시키는 상기 단계로부터의 단백질을 포함하는 용리액의 pH를 조정하는 단계이며, 용리액의 pH를 조정하는 상기 단계는 HCl, 인산, 시트르산, 또는 아세트산 더하기 인산의 조합 중 임의의 1종을 용리액에 첨가하는 것을 포함하고, 여기서 pH는 약 pH 4.0 미만으로 조정되고, 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되는 것인 단계, 용리액의 pH를 약 pH 6.0 초과 내지 약 pH 7.5로 상승시키는 단계, 단백질을 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 약 pH 6.0 초과 내지 약 7.5로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다. 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 상기 용리 단계는 아세트산과 인산, 아세트산과 락트산, 또는 아세트산과 포름산으로 구성되는 산 조합을 포함하고, 약 pH 4.0 미만으로 pH를 조정하는 단계는 HCl, 인산, 시트르산, 또는 아세트산과 인산의 조합 중 임의의 1종을 첨가하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 용리 단계는 약 20 mM의 아세트산과 약 10 mM의 인산, 약 20 mM의 아세트산과 약 5 mM의 인산, 또는 약 20 mM의 아세트산과 약 5 mM의 포름산 중 임의의 1종의 조합으로 구성되며, 약 pH 4.0 미만으로 pH를 조정하는 단계는 약 20 mM의 HCl, 약 15 mM 내지 약 200 mM의 인산, 약 1000 mM의 시트르산, 또는 약 20 mM 아세트산과 약 10 mM 인산의 조합 중 임의의 1종을 첨가하는 것을 포함한다. 그와 같은 실시양태들에서, 약 6.0의 pH 초과로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다.
본 발명의 일 측면에서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다:
숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계;
약산과 강산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 관심 단백질을 용리시킴으로써 관심 단백질을 포함하는 용리액을 수득하는 단계이며, 여기서 상기 약산은 아세트산이고, 상기 강산은 인산 또는 락트산인 단계;
크로마토그래피 컬럼으로부터 단백질을 용리시키는 상기 단계로부터의 단백질을 포함하는 용리액의 pH를 약 pH 4.0 미만으로 조정하는 단계이며, 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되는 것인 단계;
용리액의 pH를 약 pH 6.0 초과로 상승시키는 단계;
단백질을 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계; 및
여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계.
바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 50 ppm 미만 또는 약 20 ppm 미만으로 감소된다.
일부 실시양태에서, 상기 단백질은 치료용 또는 진단용 단백질, 예컨대 항체, Fc 융합 단백질, 펩티드, 이뮤노어드헤신(immunoadhesin), 효소, 성장 인자, 수용체, 호르몬, 조절 인자, 시토카인, 항원, 펩티드 또는 결합제이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 항체, 예컨대 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 이중특이적 항체 또는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 IgG1 항체이거나, 또는 IgG1 항체의 Fc 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질은 항-SARS-COV-2 항체이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하며, 여기서 심층 여과 후 여과된 항-SARS-COV-2 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 0 ppm 내지 약 100 ppm으로 감소되고, 항-SARS-COV-2 항체는 IgG1 항체인, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-SARS-COV-2 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다:
숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-SARS-COV-2 항체 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼, 예컨대 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계;
아세트산과 인산으로 구성되는 산 조합 또는 아세트산과 락트산의 조합을 사용하여 항-SARS-COV-2 항체를 용리시킴으로써 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액을 수득하는 단계;
약 20 mM HCl의 첨가에 의해 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액의 pH를 조정하는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 3.3 내지 약 pH 3.7로 조정되고, 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 3.3 내지 약 pH 3.7로 유지되는 것인 단계;
약 250 mM 트리스 완충제의 첨가에 의해 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액의 pH를 상승시키는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5로 상승되는 것인 단계; 및
항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하고, 여과된 항-SARS-COV-2 항체 조제물을 수득하는 단계.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-SARS-COV-2 항체 조제물을 단백질 A 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약 20 mM의 아세트산과 약 5 mM의 인산으로 구성되는 산 조합, 또는 약 20 mM의 아세트산과 약 10 mM의 인산으로 구성되는 산 조합, 또는 약 20 mM의 아세트산과 약 5 mM의 락트산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-SARS-COV-2 항체를 용리시킴으로써 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액을 수득하는 단계, 약 20 mM HCl의 첨가에 의해 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액의 pH를 조정하는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 3.3 내지 약 pH 3.7로 저하되고, 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 3.3 내지 약 pH 3.7로 유지되는 것인 단계, 약 250 mM 트리스 완충제의 첨가에 의해 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액의 pH를 상승시키는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5로 상승되는 것인 단계, 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 여과된 항-SARS-COV-2 항체 조제물을 수득하는 단계를 포함하며, 여기서 여과된 항-SARS-COV-2 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 0 ppm 내지 약 100 ppm이고, 항-SARS-COV-2 항체는 IgG1 항체인, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-SARS-COV-2 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 용리액의 pH를 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5로 상승시키는 단계는 약 100 mM 내지 약 1000 mM의 트리스 완충제를 용리액에 첨가하는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-SARS-COV-2 항체 조제물을 단백질 A 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약 20 mM의 아세트산과 약 5 mM의 인산으로 구성되는 산 조합, 또는 약 20 mM의 아세트산과 약 10 mM의 인산으로 구성되는 산 조합, 또는 약 20 mM의 아세트산과 약 5 mM의 락트산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-SARS-COV-2 항체를 용리시킴으로써 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액을 수득하는 단계, 약 20 mM의 HCl을 사용하여 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액의 pH를 조정하는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 3.5로 조정되고, 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 3.5로 유지되는 것인 단계, 약 250 mM의 트리스 완충제를 사용하여 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액의 pH를 상승시키는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5로 상승되는 것인 단계, 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 여과된 항-SARS-COV-2 항체 조제물을 수득하는 단계를 포함하며, 여기서 여과된 항-SARS-COV-2 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 0 ppm 내지 약 100 ppm이고, 항-SARS-COV-2 항체는 IgG1 항체인, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-SARS-COV-2 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 용리액의 pH를 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5로 상승시키는 단계는 약 100 mM 내지 약 1000 mM의 트리스 완충제를 용리액에 첨가하는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-SARS-COV-2 항체 조제물을 단백질 A 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약 20 mM의 아세트산과 약 5 mM의 인산으로 구성되는 산 조합, 또는 약 20 mM의 아세트산과 약 10 mM의 인산으로 구성되는 산 조합, 또는 약 20 mM의 아세트산과 약 5 mM의 락트산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-SARS-COV-2 항체를 용리시킴으로써 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액을 수득하는 단계, 약 20 mM HCl의 첨가에 의해 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액의 pH를 조정하는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 3.5로 저하되고, 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 3.5로 유지되는 것인, 바이러스 불활성화를 달성하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-SARS-COV-2 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-SARS-COV-2 항체 조제물을 단백질 A 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약 20 mM의 아세트산과 약 5 mM의 인산으로 구성되는 산 조합, 또는 약 20 mM의 아세트산과 약 10 mM의 인산으로 구성되는 산 조합, 또는 약 20 mM의 아세트산과 약 5 mM의 락트산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-SARS-COV-2 항체를 용리시킴으로써 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액을 수득하는 단계, 약 20 mM HCl의 첨가에 의해 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액의 pH를 조정하는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 3.3 내지 약 pH 3.7로 저하되고, 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 3.3 내지 약 pH 3.7로 유지되는 것인 단계, 약 250 mM의 트리스 완충제를 사용하여 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액의 pH를 상승시키는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 7.25로 상승되는 것인 단계, 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 여과된 항-SARS-COV-2 항체 조제물을 수득하는 단계를 포함하며, 여기서 여과된 항-SARS-COV-2 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 0 ppm 내지 약 100 ppm이고, 항-SARS-COV-2 항체는 IgG1 항체인, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-SARS-COV-2 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 용리액의 pH를 약 pH 7.25로 상승시키는 단계는 약 100 mM 내지 약 1000 mM의 트리스 완충제를 용리액에 첨가하는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-SARS-COV-2 항체 조제물을 단백질 A 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약 20 mM의 아세트산과 약 5 mM의 인산으로 구성되는 산 조합, 또는 약 20 mM의 아세트산과 약 5 mM의 인산으로 구성되는 산 조합, 또는 약 20 mM의 아세트산과 약 5 mM의 락트산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-SARS-COV-2 항체를 용리시킴으로써 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액을 수득하는 단계, 약 20 mM HCl의 첨가에 의해 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액의 pH를 조정하는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 3.5로 저하되고, 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 3.5로 유지되는 것인 단계, 약 250 mM 트리스 완충제의 첨가에 의해 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액의 pH를 상승시키는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 7.25로 상승되는 것인 단계, 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 여과된 항-SARS-COV-2 항체 조제물을 수득하는 단계를 포함하며, 여기서 여과된 항-SARS-COV-2 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 0 ppm 내지 약 100 ppm이고, 항-SARS-COV-2 항체는 IgG1 항체인, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-SARS-COV-2 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 용리액의 pH를 약 pH 7.25로 상승시키는 단계는 약 100 mM 내지 약 1000 mM의 트리스 완충제를 용리액에 첨가하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-SARS-COV-2 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 항-SARS-COV-2 항체는 밤라니비맙(bamlanivimab)이다. 일부 실시양태에서, 항-SARS-COV-2 항체는 서열식별번호(SEQ ID NO): 1의 아미노산 서열로 구성되는 가변 중쇄 및 서열식별번호: 2의 아미노산 서열로 구성되는 가변 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-SARS-COV-2 항체는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 및 서열식별번호: 4의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄를 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-SARS-COV-2 항체는 에테세비맙(etesevimab)이다. 또 다른 실시양태에서, 항-SARS-COV-2 항체는 서열식별번호: 5의 아미노산 서열로 구성되는 가변 중쇄 및 서열식별번호: 6의 아미노산 서열로 구성되는 가변 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-SARS-COV-2 항체는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 및 서열식별번호: 8의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-SARS-COV-2 항체는 벱텔로비맙(bebtelovimab)이다. 또 다른 실시양태에서, 항-SARS-COV-2 항체는 서열식별번호: 9의 아미노산 서열로 구성되는 가변 중쇄 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열로 구성되는 가변 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-SARS-COV-2 항체는 서열식별번호: 11의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질, 예컨대 치료용 또는 진단용 단백질은 포유동물 세포에서 생성된다. 일부 실시양태에서, 상기 포유동물 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 햄스터 새끼 신장 (BHK) 세포, 뮤린 하이브리도마 세포, 또는 뮤린 골수종 세포이다. 일부 실시양태에서, 치료용 또는 진단용 단백질은 세균 세포에서 생성된다. 다른 실시양태에서, 치료용 또는 진단용 단백질은 효모 세포에서 생성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량의 상기 감소 방법이 심층 필터에의 적용 후 추가로 이온 교환 크로마토그래피에 적용되는 방법을 제공하다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는 것인, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 10 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 내용물이 PLBL2를 포함하고, PLBL2가 약 100 ppm 미만으로 감소되는 것인, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, PLBL2는 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, PLBL2는 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, PLBL2는 약 10 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, PLBL2는 약 0 ppm으로 감소된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 심층 여과 후 단백질 포획 용리액으로부터 약 97 %만큼 감소되는 것인, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 99 %만큼 감소된다. 다른 실시양태에서, 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 99.9 %만큼 감소된다. 다른 실시양태에서, 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 99.99 %만큼 감소된다. 다른 실시양태에서, 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 %만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 내용물이 PLBL2를 포함하고, PLBL2가 약 100 ppm 미만으로 감소되는 것인, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, PLBL2는 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, PLBL2는 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, PLBL2는 약 10 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, PLBL2는 약 0 ppm으로 감소된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 단백질 조제물이 심층 여과에 적용되는 것인, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 심층 필터는 X0SP, C0SP, X0HC, 엠파즈(Emphaze)™ AEX 하이브리드 정제기, 제타 플러스(Zeta Plus) (ZB 미디어(Media) 사) 예컨대, 제타 플러스 (60ZB05A), 제타 플러스 (90ZB05A) 또는 제타 플러스 (90ZB08A) 중 1종 이상이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 약 6.0 초과의 pH로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도가 약 10 mM 내지 약 45 mM인, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 이온 강도는 약 30 mM 미만이다. 일부 실시양태에서, 이온 강도는 약 20 mM 미만이다. 다른 실시양태에서, 이온 강도는 약 15 mM 미만이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물이 크로마토그래피 컬럼에 적용되는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 크로마토그래피 컬럼은 친화성 컬럼, 이온 교환 컬럼, 소수성 상호작용 컬럼, 히드록시아파타이트 컬럼 또는 혼합 양식 컬럼 중 1종 이상이다. 일부 실시양태에서, 상기 친화성 크로마토그래피 컬럼은 단백질 A 컬럼, 단백질 G 컬럼 또는 단백질 L 컬럼이다. 다른 실시양태에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 음이온 교환 컬럼 또는 양이온 교환 컬럼이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 최종 생성물로부터 HCP가 충분히 제거되는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 단백질이 치료용 또는 진단용 단백질인, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 상기 치료용 또는 진단용 단백질은 항체, Fc 융합 단백질, 이뮤노어드헤신, 효소, 성장 인자, 수용체, 호르몬, 조절 인자, 시토카인, 항원 또는 결합제이다. 다른 실시양태에서, 상기 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 이중특이적 항체 또는 항체 단편이다.
또 다른 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 본원에서 기술되는 단백질 조제물, 핵산 또는 벡터를 포함하는 제약 조성물이다. 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에서 기술되는 바와 같은 방법에 의해 제조되는 조성물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 조성물 중 숙주 세포 단백질 함량이 약 100 ppm 미만인, 본원에서 기술되는 바와 같은 방법에 의해 제조되는 조성물을 제공한다.
"숙주 세포 단백질" (HCP)이라는 용어는 세포 유지 및 성장, 그리고 단백질 합성 및 프로세싱과 연관되어 있는 숙주 세포의 단백질들이다. 그와 같은 HCP에는 예를 들면 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포로부터의 것들, 예컨대 포스포리파제 B-유사 2 (PLBL2), vLPL (지질단백질 리파제), vLAL (라이소좀 산 리파제, 라이소좀 리파제, LIPA), vPLA2 (포스포리파제 A2), vPPT1 (팔미토일-단백질 티오에스테라제 1), PLBD2 및 퍼옥시레독신이 포함된다.
"약산"이라는 용어는 > ~4의 최저 pKa를 가지는 산을 지칭한다. 약산의 예에는 아세트산, 숙신산 및 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
"강산"이라는 용어는 < ~4의 최저 pKa를 가지는 산을 지칭한다. 강산의 예에는 인산, 락트산, 포름산, 말산, 말론산, 글리콜산, 시트르산, 타르타르산 및 염산이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
"심층 필터"라는 용어는 단순히 매체 표면상이라기보다는 매체 전체에 걸쳐 (매체 내 및 매체상에) 입자를 보유하는 다공성 여과 매체를 사용하는 필터 요소를 지칭한다. 심층 필터는 또한 그것이 구성되는 재료의 화학적 특성에 기인하는 흡착 능력을 가질 수 있다. 시중에서 구입가능한 심층 필터의 예에는 X0SP, C0SP, X0HC, 엠파즈™ AEX 하이브리드 정제기, 제타 플러스 (60ZB05A), 제타 플러스 (90ZB05A) 및 제타 플러스 (90ZB08A)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. "심층 여과"라는 용어는 비균질하거나 균질할 수 있는 액체 재료를 심층 필터로 통과시키는 작업을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 액체 재료는 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물을 포함한다.
용액을 언급할 때의 "이온 강도"라는 용어는 그 용액 중 이온 농도의 척도이다. 이온 강도 (I)는 모든 이온 종에 있어서의 이온 농도 c i 및 순 전하 z i 의 함수이다. 이온 강도를 측정하는 데에는, 수학식 1이 사용된다.
"단백질 조제물"은 치료용 또는 진단용 관심 단백질을 함유하며 다양한 불순물들을 함유할 수도 있는, 정제 공정 또는 방법용으로 제공되는 재료 또는 용액이다. 비-제한적인 예로는 예를 들면 수확된 세포 배양액 (HCCF), 수확된 세포 배양 재료, 정화된 세포 배양액, 정화된 세포 배양 재료, 포획 풀, 회수된 풀, 및/또는 1회 이상의 원심분리 단계 및/또는 여과 단계 후 치료용 또는 진단용 관심 단백질을 함유하는 수집된 풀, 포획 풀, 회수된 단백질 풀, 및/또는 1회 이상의 정제 단계 후 치료용 또는 진단용 관심 단백질을 함유하는 수집된 풀이 포함될 수 있다.
"불순물"이라는 용어는 원하는 단백질 생성물과 다른 재료를 지칭한다. 불순물에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 숙주 세포 재료, 예컨대 숙주 세포 단백질, CHOP; 침출된 단백질 A; 핵산; 원하는 단백질의 변이체, 크기 변이체, 단편, 응집물 또는 유도체; 기타 단백질; 내독소; 바이러스 오염물; 세포 배양 배지 성분 등.
"단백질" 및 "폴리펩티드"라는 용어들은 본원에서 임의 길이의 아미노산 중합체를 지칭하는 데에 호환가능하게 사용된다. 상기 중합체는 선형이거나 분지형일 수 있으며, 그것이 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산이 거기에 개재될 수 있다. 상기 용어는 자연적으로, 또는 개재; 예를 들면 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체도 포괄한다. 역시 정의 내에 포함되는 것은 예를 들면 1종 이상의 아미노산 유사체 (예를 들면 비자연 아미노산 등 포함)는 물론 관련 기술분야에 공지되어 있는 기타 변형들을 포함하는 단백질이다. 단백질의 예로는 항체, 펩티드, 효소, 수용체, 호르몬, 조절 인자, 항원, 결합제, 시토카인, Fc 융합 단백질, 이뮤노어드헤신 분자 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용될 때, "항체"라는 용어는 항원에 결합하는 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 항체의 구현예에는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 항체 또는 접합 항체가 포함된다. 항체는 임의 클래스 (예컨대 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA) 및 임의 하위클래스 (예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)의 것일 수 있다.
본 개시내용의 대표적인 항체는 하기 4개의 폴리펩티드 쇄로 구성되는 이뮤노글로불린 G (IgG) 유형 항체이다: 쇄간 디술피드 결합을 통하여 가교-결합되어 있는 2개의 중쇄 (HC) 및 2개의 경쇄 (LC). 상기 4개 폴리펩티드 쇄 각각의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100-125개 이상 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 4개 폴리펩티드 쇄 각각의 카르복실-말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. IgG 동형은 또한 하위클래스 (예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)로 나누어질 수 있다.
VH 및 VL 영역은 또한 프레임워크 영역 (FR)로 지칭되는 더 보존되어 있는 영역이 산재하는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 지칭되는 초-가변성의 영역들로 하위분할될 수 있다. CDR은 단백질의 표면상에 노출되며, 항원 결합 특이성을 위한 항체의 중요한 영역이다. 각 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복실-말단으로 하기 순서로 배열되는 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 여기에서, 중쇄의 3개 CDR은 "HCDR1, HCDR2 및 HCDR3"으로 지칭되며, 경쇄의 3개 CDR은 "LCDR1, LCDR2 및 LCDR3"으로 지칭된다. CDR은 항원과 특이적인 상호작용을 형성하는 대부분의 잔기들을 포함한다. CDR에의 아미노산 잔기들의 할당은 문헌 [Kabat (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))], [Chothia (Chothia et al., "Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987)]; [Al-Lazikani et al., "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997))], [North (North et al., "A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations", Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011))], 또는 IMGT (www.imgt.org에서 입수가능한 국제 면역유전학(ImMunoGeneTics) 데이터베이스; 문헌 [Lefranc et al., Nucleic Acids Res. 1999; 27:209-212)] 참조)에 기술되어 있는 것들을 포함하여, 널리 공지되어 있는 체계에 따라 수행될 수 있다.
본 개시내용의 실시양태들은 본원에서 사용될 때 항원 또는 항원의 항원결정인자와 특이적으로 상호작용하는 능력을 보유하는 항체의 적어도 일부를 포함하는 항체 단편 또는 항원-결합 단편, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv 항체 단편, scFab, 디술피드-연결 Fvs (sdFv), Fd 단편도 포함한다.
본원에서 사용될 때의 "항-SARS-CoV2 항체"라는 용어는 SARS-CoV-2의 스파이크 (S) 단백질에 결합하는 항체를 지칭한다. SARS-CoV-2 스파이크 (S) 단백질의 아미노산 서열은 예를 들면 진뱅크(GenBank) 등재 번호: YP_009724390.1로 이미 기술되어 있다.
"한외여과" 또는 "여과"라는 용어는 정수 압력이 반투과성 멤브레인에 대하여 액체를 가압하는 형태의 멤브레인 여과이다. 높은 분자량을 가지는 현탁된 고체 및 용질은 보유되는 반면, 물 및 저분자량 용질은 멤브레인을 통과한다. 일부 예에서, 한외여과 멤브레인은 1 μm 내지 100 μm 범위의 세공 크기를 가진다. "한외여과 멤브레인", "한외여과 필터", "여과 멤브레인" 및 "여과 필터"라는 용어들은 호환가능하게 사용될 수 있다. 여과 멤브레인의 예에는 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 멤브레인, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 니트레이트, 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE, 테플론(Teflon)), 폴리비닐 클로라이드, 폴리에테르술폰, 유리 섬유, 또는 cGMP 제조 환경에서 사용하기에 적합한 기타 필터 재료들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용될 때, 숫자 범위는 그 범위를 한정하는 숫자들을 포괄하는 것이다.
관련 기술분야에 공지되어 있는 "EU 번호지정"이라는 용어는 이뮤노글로불린 분자의 아미노산 잔기들을 번호지정하는 시스템을 지칭한다. EU 번호지정에 대해서는 예를 들면 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]; [Edelman, G.M, et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969)]; 및 http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#refs에 기술되어 있다. "카바트(Kabat) 번호지정"이라는 용어는 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기들에 비해 더 가변적인 (즉 초가변성인) 아미노산 잔기들을 번호지정하는 시스템을 지칭하는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들면 문헌 [Kabat, et al., Ann. NY Acad . Sci . 190:382-93 (1971)]; [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)] 참조). "노스(North) 번호지정"이라는 용어는 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기들에 비해 더 가변적인 (즉 초가변성인) 아미노산 잔기들을 번호지정하는 시스템을 지칭하며, 적어도 부분적으로 문헌 [North et al., A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations, Journal of Molecular Biology, 406:228-256 (2011)]에 기술되어 있는 바와 같이 많은 수의 결정 구조와의 친화성 전파 클러스터화(affinity propagation clustering)를 바탕으로 한다.
본원에서 사용될 때, "친화성 크로마토그래피"라는 용어는 생체분자들 사이의 특이적인 가역적 상호작용을 바탕으로 생화학적 혼합물 (예컨대 단백질과 원치않는 생체분자 종들)을 분리하기 위한 크로마토그래피법을 지칭한다. 친화성 크로마토그래피의 대표적인 구현예에는 단백질 A 친화성, 단백질 G 친화성, 단백질 L 친화성, 카파 친화성 리간드 크로마토그래피 (예컨대 캡쳐셀렉트(CaptureSelect)™, 카파(Kappa)XL™, 카파셀렉트(KappaSelect)™, 카파XP™) 또는 람다 친화성 리간드 크로마토그래피가 포함된다.
본 개시내용의 단백질은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있으며 본 개시내용의 단백질 및 1종 이상의 제약상 허용되는 캐리어(들) 및/또는 희석제(들)를 포함하는 제약 조성물에 도입될 수 있다 (예컨대 개업의에게 일반적으로 공지되어 있는 바와 같은 제제화 기술들의 개요를 제공하는 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Loyd V., Ed., Pharmaceutical Press, 2012]). 제약 조성물용으로 적합한 캐리어에는 단백질과 조합되었을 때 분자의 활성을 유지하며 환자의 면역 시스템과 비-반응성인 임의의 재료가 포함된다.
그것이 작용가능하게 연결되어 있는 유전자의 발현을 유도할 수 있는 발현 벡터에 대해서는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 폴리펩티드(들)의 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 신호 펩티드는 이뮤노글로불린 신호 펩티드 또는 이종유래 신호 펩티드일 수 있다. 발현되는 폴리펩티드 각각은 하나의 벡터에서 그것이 작용가능하게 연결되어 있는 상이한 프로모터들로부터 독립적으로 발현될 수 있거나, 또는 대안적으로 다수의 벡터에서 그것이 작용가능하게 연결되어 있는 상이한 프로모터들로부터 독립적으로 발현될 수 있다. 발현 벡터는 통상적으로 에피솜 또는 숙주 염색체 DNA의 통합된 일부 중 어느 하나로서 숙주 생물체에서 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 원하는 DNA 서열에 의해 형질전환된 세포의 검출을 가능하게 하는 선택 마커, 예컨대 테트라사이클린, 네오마이신 및 디히드로폴레이트 리덕타제를 포함하게 된다.
숙주 세포는 1종 이상의 본 개시내용의 단백질을 발현하는 1종 이상의 발현 벡터에 의해 안정하거나 일시적으로 형질감염, 형질전환, 형질도입 또는 감염된 세포를 지칭한다. 본 개시내용의 단백질을 생성시키는 숙주 세포주의 생성 및 단리는 관련 기술분야에 공지되어 있는 표준 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 본 개시내용의 단백질의 발현에 있어서, 포유동물 세포는 바람직한 숙주 세포이다. 구체적인 포유동물 세포에는 HEK 293, NS0, DG-44 및 CHO가 포함된다. 바람직하게는, 단백질은 숙주 세포가 배양되는 배지로 분비되며, 그로부터 예를 들면 통상적인 기술을 사용하여 단백질이 회수되거나 정제될 수 있다. 예를 들면, 배지는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼 및/또는 카파 친화성 리간드 또는 람다 친화성 리간드 크로마토그래피 컬럼에 적용되고, 그로부터 용리될 수 있다. 가용성 응집물 및 다량체들을 포함한 원치않는 생체분자 종들은 크기 배제, 소수성 상호작용, 이온 교환 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 포함한 통상적인 기술에 의해 효과적으로 제거될 수 있다. 생성물은 즉시 예를 들면 -70 ℃에서 냉동되거나, 냉장되거나, 또는 동결건조될 수 있다. 다양한 단백질 정제 방법들이 사용될 수 있으며, 그와 같은 방법들에 대해서는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들면 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990)] 및 [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Edition, Springer, NY (1994)]에 기술되어 있다.
[
실시예
]
LCMS에 의한 숙주 세포 단백질 ( HCP ) 측정: 하기하는 실시예에서는, 숙주 세포 단백질 (HCP) 농도에 대한 정제 영향을 평가하기 위하여, 예컨대 써모 사이언티픽(Thermo Scientific) 질량 분광계와 연계된 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC)를 통한 펩티드 맵핑(mapping)/LC-MS/MS HCP 프로파일링에 의해 샘플을 분석한다. 이와 같은 분석에서는, 샘플을 트립신에 의한 분해에 적용하고, 디티오트레이톨 (DTT)을 사용하여 환원/침전시킨 후, 이어서 LC-MS/MS 분석용 HPLC 바이알로 상청액을 옮기고 산성화한다. LC-MS/MS 데이터는 첨가 항체, 첨입 및 대조 단백질 서열을 동반하는 CHO-K1 단백질 데이터베이스에 대비하여 프로테옴 디스커버러(Proteome Discoverer)에 의해 분석한다. HCP 함량은 총 HCP 함량에 대하여 샘플 당 HCP 백만 당 총 부 (ppm) (예컨대 생성물 mg 당 HCP의 ng)로 기록한다. 또한, 포스포리파제 B-유사 2 (PLBL2) 함량도 제공한다.
ELISA에 의한 HCP 측정: 하기하는 실시예에서는, 지로랩(Gyrolab)® CHO-HCP 키트 1 (시그너스 테크놀로지스(Cygnus Technologies) 사, 제조자의 지침에 따라 수행)을 사용한 ELISA 검정에 의해서도 샘플 중 HCP 함량을 평가한다. 총 HCP 함량에 대하여 샘플 당 HCP 백만 당 총 부 (ppm)로 HCP 함량을 기록한다.
실시예
1 -
mAb1
(
에테세비맙
) 정제 공정에서의
HCP
감소
단백질 포획 단계: 살균된 단백질 A 컬럼 (맵셀렉트 수레(MabSelect SuRe) 단백질 A 매체)을 평형화하고, mAb1 (에테세비맙) 무-세포 생물반응기 수확물을 단백질 A 컬럼상에 적재한 후, 최종 세척으로서 20 mM 트리스(Tris) (pH 7.0)를 사용하여 단백질 A 컬럼의 3회 세척을 수행한다. 5 컬럼 부피 (CV)의 20 mM 아세트산 + 5 mM 인산을 사용하여, mAb1을 컬럼으로부터 용리한다. 전면 및 후면에서의 흡광도-기반 피크 절단을 사용하여, 주 생성물 분획을 단일 포괄 분획으로 수집한다.
저 pH 바이러스 불활성화 단계 및 중화 단계: 20 mM HCl의 첨가에 의해 3.30 내지 3.60 사이의 pH로 mAb1을 함유하는 수집된 주 생성물 분획 (단백질 포획 용리액 포괄 분획)의 pH를 조정함으로써, 바이러스 불활성화를 수행한다. 혼합물을 18 ℃ 내지 25 ℃에서 약 180분 동안 인큐베이션한다. 다음에, 250 mM 트리스 염기 pH 비조정 완충제를 사용하여, 7.0의 pH로 혼합물을 중화한다.
심층 여과 단계: 주사용수 (WFI)를 사용하여 심층 필터 (X0SP, 밀리포어(Millipore) 사)를 플러싱한다. 저 pH 바이러스 불활성화 단계 및 중화 단계로부터 수득된 mAb1 혼합물을 1200 g/m2 (심층 필터 멤브레인 면적 m2 당 mAb 그램)의 적재량으로 심층 필터에 적용한다. WFI를 사용하여 적재된 심층 필터를 플러싱한다. 250 mM 트리스 염기 pH 비조정 완충제를 사용하여, 임의적으로 적재-후 WFI 플러싱물을 포함하는 심층 필터로부터의 여과액을 pH 8.0으로 중화한다.
음이온 교환 ( AEX ) 크로마토그래피 단계: 2 CV의 20 mM 트리스 (pH 8.0)를 사용하여, 살균된 컬럼 (Q 세파로스 고유량(Sepharose Fast Flow) 음이온 교환 크로마토그래피 매체, 또는 QFF)을 평형화한다. 심층 여과 단계로부터 수득된 mAb1 용액을 수지 리터 당 25 g 내지 100 g의 적재량으로 컬럼상에 적재하고, 평형화 완충제를 사용하여 추가적인 세척을 수행한다. 비결합 분획에 의해 형성되는 피크 영역의 전면 및 후면에서의 흡광도-기반 피크 절단 더하기 추가적인 세척에 의해 mAb1을 수집한다.
결과: 기술한 정제 공정을 사용할 경우, LC-MS에 의해 측정하였을 때의 총 HCP 농도는 하기이다:
mAb1에 대한 심층 필터 세트 1 평가: 본질적으로 상기한 바와 같이 단백질 A, 저 pH 바이러스 불활성화, 중화 및 심층 여과 단계를 통하여 mAb1을 처리한다. 표 1에 나타낸 바와 같이 2000 g/m2의 적재량에서 하기 4종의 상이한 심층 필터들을 시험한다: 엠파즈™ AEX 하이브리드 정제기, 제타 플러스 BC25 - 60ZB05A, 제타 플러스 BC25 - 90ZB05A 및 제타 플러스 BC25 - 90ZB08A (3M). 표 1의 결과는 LCMS (28901 ppm) 및 Elisa (527 ppm)에 의해 단백질 A 용리 후 관찰되는 총 HCP 함량과 비교하였을 때의 시험된 4종 심층 필터에 있어서의 LCMS (24 내지 31 ppm 범위) 및/또는 ELISA (6 내지 16 ppm 범위)에 의한 심층 여과 후 총 HCP 함량의 상당한 감소를 보여준다.
실시예
2 -
mAb2
(
밤라니비맙
) 정제 공정에서의
HCP
감소
단백질 A 용리 완충제 비교: 하기의 예외를 동반하여, 본질적으로 실시예 1에서 mAb1에 대하여 기술된 바와 같이 mAb2 (밤라니비맙)를 제조한다: 1) 표 2에 열거되어 있는 바와 같은 완충제 조합들을 사용하여 단백질 A 포획 컬럼으로부터 mAb2를 용리함, 2) 저 pH 바이러스 불활성화 단계 후 및 심층 여과 단계 전에, 250 mM 트리스 염기 pH 비조정 완충제를 사용하여 7.0 대신 7.25의 pH로 mAb2 용액을 중화함, 및 3) 포로스(Poros) XQ 수지를 사용하여 AEX 크로마토그래피를 수행함. 표 2 및 3에 열거되어 있는 바와 같은 정제 장치 가동 후 LCMS를 통하여 HCP 함량 (총 HCP 함량 및 PLBL2 함량 둘 다)을 평가한다.
표 2 및 3의 결과는 심층 여과 단계 후의 총 HCP 및 PLBL2 함량이 시험된 3종 산 조합 모두에서 감소되었음을 보여준다. 구체적으로, 20 mM 아세트산 + 5 mM 인산 및 20 mM 아세트산 + 5 mM L-락트산의 조합이 20 mM 아세트산 + 5 mM 시트르산 조합과 비교하였을 때 심층 여과 후 20 ppm 미만까지의 더 큰 총 HCP 함량 감소를 나타내었다. 또한, 20 mM 아세트산 + 5 mM 인산 및 20 mM 아세트산 + 5 mM L-락트산 조합을 사용한 심층 여과 단계 후의 PLBL2 함량은 정량 한계 미만까지 감소되었다.
심층 필터 세트 2 평가: 하기의 예외를 동반하여, 본질적으로 mAb1에 대하여 기술된 바와 같이 mAb2를 제조한다: 1) 저 pH 바이러스 불활성화 단계 후 및 심층 여과 단계 전에, 250 mM 트리스 염기 pH 비조정 완충제를 사용하여 7.0 대신 7.25의 pH로 mAb2 용액을 중화함, 및 2) 표 4에 나타낸 심층 필터들을 사용하여 심층 여과 단계를 수행함.
표 4의 결과는 1500 g/m2가 적재된 3종의 세트 2 심층 필터 모두 (X0SP, C0SP, X0HC (밀리포어 사))를 사용한 심층 여과 후의 총 HCP 및 PLBL2 함량이 심층 여과 단계 후 20 ppm 미만으로 감소되었음을 보여준다.
실시예
3 -
mAb3
(
벱텔로비맙
) 정제 공정에서의
HCP
감소
900 g/m2의 적재량으로 X0SP 심층 필터를 사용하는 것 이외에는 본질적으로 실시예 1에서 mAb1에 대하여 기술된 바와 같이 단백질 포획, 저 pH 바이러스 불활성화, 중화 및 심층 여과 단계를 사용하여 mAb3 (벱텔로비맙)을 제조한다. 기술한 정제 공정을 사용할 경우, LCMS에 의해 측정하였을 때의 총 HCP 농도는 하기이다:
실시예
4 - 이중특이적 항체 (
mAb4
) 정제 공정에서의
HCP
감소
단백질 L 친화성 포획 컬럼 (시티바(Cytiva) 사)을 사용하는 것 및 표 5에 나타낸 완충제 시스템을 사용하여 용리하는 것 이외에는 본질적으로 실시예 1에서 mAb1에 대하여 기술된 바와 같이 단백질 포획 단계를 사용하여 이중특이적 항체 mAb4를 제조한다. 약 1300 내지 약 2500 ppm의 범위를 제공하는 ELISA에 의해 총 HCP 함량을 측정한다. 단백질 포획 후, 표 5에 열거되어 있는 정적액을 사용하는 것 이외에는 본질적으로 실시예 1에서 mAb1에 대하여 기술된 바와 같이 저 pH 바이러스 불활성화를 수행한 후, 이어서 500 mM 트리스 염기 pH 비조정 완충제를 사용하여 pH 7.0까지 중화한다. 1200 g/m2의 적재량으로 X0SP 심층 필터를 사용하여 본질적으로 실시예 1에서 mAb1에 대하여 기술된 바와 같이 심층 여과 단계를 수행한다. 심층 여과 후 ELISA에 의해 HCP 함량을 측정한다.
표 5의 결과는 심층 여과 후 참가물 1 내지 7에 있어서의 ≤ 50 ppm 미만까지의 상당한 총 HCP 함량 감소를 보여주는데, 여기서 심층 필터에 적용된 혼합물의 이온 강도는 약 45 mM 미만이었다. 또한, 심층 필터에 적용된 혼합물의 이온 강도와 심층 여과 후 총 HCP 함량 사이의 상관관계가 관찰되었다. 또한, 참가물 2는 완충제를 희석하여 심층 여과 후 낮은 HCP 함량을 제공함으로써 이온 강도가 감소될 수 있기는 하지만, 희석으로부터의 부피 증가는 제조 공정에 불리할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예
5 -
mAb5
정제 공정에서의
HCP
감소
용리 단계가 표 6에 나타낸 완충제 시스템을 사용하여 수행된다는 것 이외에는 본질적으로 실시예 1에서 mAb1에 대하여 기술된 바와 같이 단백질 포획 단계를 사용하여 mAb5를 제조한다. 약 2800 내지 약 3200 ppm의 범위를 제공하는 ELISA에 의해 총 HCP 함량을 측정한다. 단백질 포획 후, 본질적으로 실시예 1에서 mAb1에 대하여 기술된 바와 같이 저 pH 바이러스 불활성화 단계를 수행하고, 이어서 500 mM 트리스 염기 pH 비조정 완충제를 사용하여 pH 5.0 또는 pH 7.0 중 어느 하나로 중화 단계를 수행한다. 1000 g/m2의 적재량으로 X0SP 심층 필터를 사용하여 본질적으로 실시예 1에서 mAb1에 대하여 기술된 바와 같이 심층 여과 단계를 수행한다. 심층 여과 단계 후 HCP 함량은 ELISA에 의해 측정한다.
표 6의 결과는 심층 필터에 적용된 혼합물의 pH가 pH 7.0인 경우 심층 여과 후 mAb5에 있어서의 ≤ 50 ppm 미만까지의 상당한 총 HCP 함량 감소를 보여준다. 심층 필터에 적용된 혼합물의 pH가 pH 5.0인 경우, 총 HCP 함량은 더 적은 정도로 감소된다.
실시예
6. 생체분자 정제 공정 동안의 이온 강도의 측정 방법
여기에서는, 생체분자 정제 장치 공정 동안 완충제 조성에 대해 공지되어 있는 것을 바탕으로 하는 이온 강도의 추산 방법을 기술한다. 용액의 이온 강도 (I)는 그 용액 중 이온들의 농도의 척도로서, 모든 이온 종에 있어서의 종 농도 c i 및 순 전하 z i 의 함수이다. 이온 강도를 측정하는 데에는, 수학식 1이 사용된다.
강 전해질: 낮은 농도 (예컨대 50 mM 미만)의 강 전해질의 경우, 완전 해리를 가정한다. 완전 해리에서는, 조성이 용이하게 계산됨으로써, 이온 강도 계산이 간단해진다. 예를 들어, 50 mM NaCl의 용액은 해리되어 0.5 × [50 mM × 12 + 50 mM × (-1)2] = 50 mM의 이온 강도를 동반하는 각각 50 mM의 Na+ 및 Cl-를 산출한다. 또 다른 예로서, 50 mM의 Na2SO4는 해리되어 100 mM의 Na+ 및 50 mM의 SO4 2-를 산출함으로써, 0.5 × [100 mM × 12 + 50 mM × (-2)2] = 150 mM의 이온 강도를 산출한다. 완충 종이 없는 경우, 이러한 계산에서는 거의-중성인 pH가 예상됨으로써, 물의 해리로부터의 이온 농도가 이온 강도에 대하여 의미있게 기여하지 않는다. 물의 해리 상수는 [H+] = 10- pH인 K w = [H+][OH-] = 10-14인 것으로 이해되며, 여기서 중괄호(square bracket)는 농도를 표시한다. 본원에서의 계산 목적상, H+ 이온의 물리적 해석 (예컨대 하이드로늄 이온과 대비하는 것)은 필요하지 않으며, H+ 농도와 활성 사이를 구별하는 것 역시 필요하지 않다.
완충된 시스템: 완충된 시스템의 경우, 완전 해리를 가정할 수 없다. 산 및 염기 형태에서의 완충제의 비율을 측정하는 데에는 완충제의 산 해리 상수가 사용되어야 한다. H+ 및 A-로 해리되는 일반적인 산 HA의 경우, 수학식 2가 산 해리 상수 K a 및 종 농도와 관련된다:
산 해리 상수는 종종 pK a = -log10(K a )의 대수 형태로 사용된다. pK a,0 로 표시되는 열역학적 pK a 는 많은 중요한 완충제들에 대한 문헌에서 찾아볼 수 있다. 그러나, 완충제의 유효 pK a 는 활성 계수의 일관성으로부터의 이탈로 인하여 매우 묽은 용액에서 이외에는 열역학적 값에서 벗어난다. 본 개시내용에서 고려되는 중간정도로 희석된 용액의 경우, 연장된 데비 휴켈(Debye Huckel) 방정식 또는 데이비스(Davies) 방정식이 비-일관성 활성 계수를 설명하는 데에 사용되었다. 문헌에서 발견되는 상수들 중 일부의 값은 약간 상이할 수 있으나, 본 개시내용의 대상 이온 강도 값 범위 내에서 유사한 결과를 산출한다. 연장된 데비 휴켈 방정식은 수학식 (3)으로 제공된다:
데이비스 방정식은 수학식 (4)로 제공된다:
(식 중, n = 2z - 1이고, z는 n을 계산하기 위한 산성 완충제 형태의 순 전하임 (문헌 [Scopes, Protein Purification: Principles and Practices, 2013])).
pK a 가 이온 강도의 함수이기 때문에, 조성 및 이온 강도가 독립적으로 측정될 수는 없지만, 방정식 시스템의 일부가 된다. 상기 방정식 시스템은 상기언급된 이온 강도 방정식, 각 완충제의 산 해리 상수 및 각 완충제의 pK a 방정식을 포함하며, 또한 각 완충제의 전기중성 조건 및 총 종 균형을 포함한다. 이와 같은 방정식 시스템을 사용하면, 몇 가지 값들이 추산될 수 있다. 예를 들면, 공지의 용액 pH를 사용하여 완충제 제제의 산-기반 비를 추산할 수 있거나, 또는 역으로 산-기반 비를 사용하여 용액 pH 및 상응하는 적정 부피를 추산할 수 있다. 이들 적용분야 중 어느 것에서도, 용리액 및 적정액 선택사항의 합리적인 선택을 안내하는 것을 돕기 위하여 이온 강도가 추산될 수 있다.
심층 여과용 공급 재료의 것과 같은 본 개시내용의 완충된 시스템에 적격인 이온 강도를 계산하기 위해서는, 용액의 완충제 조성이 필요하다. 이와 같은 조성은 공정에 사용되는 완충제 및 적정액의 부피 및 조성에 기반하여 합리적으로 추산될 수 있다. 관련 기술분야에 공지되어 있는 이온 측정 기술들을 사용하여 조성을 추산할 수도 있다.
용액 조성을 추산하기 위한 개시점으로 한 가지 가능한 방법론은 친화성 컬럼 용리액 풀이 측정된 용리액 풀의 pH에서 완충된다는 것을 예외로 하여 용리액의 것과 동일한 완충제 조성을 가진다고 가정하는 것이다. 예를 들어, 관심 단백질이 20 mM 아세트산을 사용하여 단백질 A 컬럼으로부터 용리되는 경우, 5 mM 락트산 및 용리액 풀은 4.2의 측정 pH를 가지며, 용리액 풀의 완충제 조성은 20 mM 아세테이트, 5 mM 락테이트, 및 pH가 4.2가 되게 하기에 충분한 NaOH라는 가정이 이루어지는데; 이는 약 ~8.2 mM의 NaOH와 일치하게 된다. 계산에는 총 소듐 양이온 Na+ 함량만이 중요하기 때문에, 용리액 소듐 함량이 소듐 아세테이트, 소듐 포스페이트, 소듐 히드록시드 또는 이들의 임의 조합으로부터 기원한다고 가정하는지 여부는 문제가 되지 않으며, 그에 따라 편리성을 위하여 소듐을 NaOH로 전환하는 관습이 사용된다.
용리액 조성 및 용리액 pH를 사용하여 용리액의 완충제 조성을 추산하였으므로, 다음에는 용액 적정이 고려된다. 예를 들어, pH 4.2에서 20 mM 아세테이트, 5 mM 락테이트, ~8.2 mM NaOH의 추산된 용리액 조성에서, 바이러스 불활성화를 위하여 3.45의 목표 값으로 pH를 낮추는 데에 필요한 20 mM HCl의 부피가 개시 부피의 0.305배에 상당하는 경우라면, 희석률로부터 pH 3.45에서의 그 공정 중간물의 조성이 알려지게 된다. 아세테이트, 락테이트 및 NaOH는 그의 각 개시 값의 1/1.305배로 존재하고 (즉 ~15.3 mM 아세테이트, ~3.8 mM 락테이트 및 ~6.2 mM NaOH), HCl은 적정액 중 그의 값의 0.305/1.305로 존재하게 된다 (~4.7 mM HCl). 유사하게, 250 mM 트리스 염기를 사용한 중화에 있어서, pH 7.0의 목표로 pH를 상승시키는 비가 pH 3.45 용액 부피의 0.0743배인 경우, 중화된 용액에서의 최종 농도를 찾기 위해서는 1/1.0743 및 0.0743/1.0743의 비가 적용된다 (~14.3 mM 아세테이트, ~3.6 mM 락테이트, ~5.8 mM NaOH, ~4.4 mM HCl 및 ~17.3 mM 트리스). 모든 기지의 값들을 방정식 시스템 (수학식 5 내지 15)에 투입하여 이온 강도를 계산한다:
(식 중, 트리스, 아세테이트 및 락테이트의 각 pK a,o 값은 22 ℃에서 8.15, 4.76, 및 3.86인 것으로 하였음). 심층 여과 공급 재료 이온 강도의 최종 추산치는 22.1 mM이다.
본원에서 기술될 때, 단백질 생성물의 완충 용량은 직접적으로 모델링되지 않는다. 따라서, 강 산 또는 염기를 적정에 사용하는 경우, 계산치와 경험적 적정 결과 사이에 약간의 편차가 발생할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 불활성화를 위하여 낮은 pH로 단백질 A 용리액을 적정하는 경우, 완충제 계산치는 통상적으로 필요한 20 mM HCl의 경험량을 하향추산하는데; 필요한 경험량은 계산된 추산치에 비해 50 % 정도 더 클 수 있다. 이와 같은 차이를 고려하는 한 가지 방식은 친화성 컬럼 용리액 재료를 더 높은 pH에서 모델링함으로써, 추산된 적정 부피가 실험 값과 일치할 때까지 값을 경험적으로 조정하는 것이다. 예를 들어, 상기 실시예에서, 20 mM HCl의 양이 처음에 추산된 것에 비해 0.305 비보다 50 % 더 높았던 경우, 단백질 A 용리액은 pH 4.2 대신 약 pH 4.45인 것으로 모델링된다. 모델링에 대하여 이와 같은 경험적 변화를 줌으로써, 실시예의 추산 이온 강도는 직접적으로 감소되나, 소량만큼 만이다: 최초 22.1 mM 추산치로부터 아래로 21.9 mM. 이에 따라, 양 접근법이 본 개시내용의 바람직한 실시양태를 추론하기 위하여 이온 강도를 추산하는 데에 충분하다는 결론이 내려진다.
대안적인 방법 : 이온 함량 측정법은 심층 여과 공급물 재료의 완충제 조성을 측정하여 이온 강도를 계산하는 데에 사용될 수 있다. 이는 측정치가 첨가되는 적정액의 양과 같은 임의의 기지의 양과 자체-일치하는 결과를 산출한다는 확신을 필요로 한다. 친화성 컬럼 용리액의 완충제 조성은 용리액의 것과 일치하나 pH가 상이한 것으로 가정되기 때문에, 진정한 조성에 있어서의 차이는 이온 함량 측정에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 용리액 중 완충제 성분들의 이온 강도를 계산하는 데에는 용리액 조성 또는 측정된 값을 기반으로 하는 양 중 어느 하나가 사용될 수 있다.
서열
하기의 핵산 및/또는 아미노산 서열들이 본 개시내용에서 언급되며, 참조용으로 하기에 제공한다.
서열식별번호: 1 -
밤라니비맙
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(
VH
)
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밤라니비맙
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VL
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서열식별번호: 3 -
밤라니비맙
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서열식별번호: 4 -
밤라니비맙
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(LC)
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에테세비맙
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VH
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에테세비맙
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VL
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에테세비맙
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(HC)
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에테세비맙
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(LC)
서열식별번호: 9 -
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벱텔로비맙
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VL
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벱텔로비맙
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(LC)
SEQUENCE LISTING
<110> Eli Lilly and Company
<120> METHODS FOR REDUCING HOST CELL PROTEIN CONTENT IN PROTEIN
PURIFICATION PROCESSES
<130> X22634
<150> US 63/086,915
<151> 2020-10-02
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Tyr Glu Ala Arg His Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Tyr Glu Ala Arg His Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 4
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 5
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Met Asn Thr Leu Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Leu Pro Met Tyr Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 6
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Glu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
<210> 7
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Met Asn Thr Leu Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Leu Pro Met Tyr Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 8
<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Glu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
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Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ile Ser
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Gly Val Gly Val Gly Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
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Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Met Thr Asn Ile Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala His His Ser Ile Ser Thr Ile Phe Asp His Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 10
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Ala Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Phe Glu Val Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Ser
85 90 95
Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 11
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 11
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ile Ser
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Met Thr Asn Ile Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala His His Ser Ile Ser Thr Ile Phe Asp His Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
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Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
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Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
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Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Lys
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<400> 12
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
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Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Ala Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Tyr
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35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Ser
85 90 95
Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
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Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
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Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
Claims (54)
- 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 관심 단백질을 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법으로서,
a. 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계;
b. 약산과 강산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 관심 단백질을 용리시킴으로써 관심 단백질을 포함하는 용리액을 수득하는 단계;
c. 용리액의 pH를 약 pH 6.0 초과로 상승시키는 단계; 및
d. 용리액을 심층 필터에 적용하고, 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 크로마토그래피 컬럼이 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L 친화성 크로마토그래피 컬럼을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 약산이 1개 이하의 pKa 값이 7.0 미만이고, 강산이 1개 이하의 pKa 값이 7.0 미만인 방법.
- 제1항에 있어서, 약산이 아세트산이고, 강산이 인산 또는 락트산인 방법.
- 제4항에 있어서, 아세트산의 농도가 약 20 mM이고, 강산이 인산이고, 인산의 농도가 약 5 mM 내지 약 10 mM인 방법.
- 제4항에 있어서, 아세트산의 농도가 약 20 mM이고, 강산이 락트산이고, 락트산의 농도가 약 5 mM인 방법.
- 제1항에 있어서, 바이러스 불활성화를 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 크로마토그래피 컬럼으로부터 단백질을 용리시키는 상기 단계로부터의 용리액의 pH를 약 pH 4.0 미만으로 조정하는 것을 포함하며 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되는 것인 바이러스 불활성화를 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제8항에 있어서, 용리액의 pH를 조정하는 상기 단계가 용리액의 pH를 약 pH 3.3 내지 약 pH 3.7로 조정하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 용리액의 pH가 약 pH 3.5로 조정되는 것인 방법.
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 용리액의 pH를 조정하는 단계가 HCl, 인산, 또는 아세트산과 인산의 조합 중 임의의 1종을 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 용리액의 pH를 상승시키는 상기 단계가 pH를 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5로 상승시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 용리액의 pH가 약 pH 7.0으로 상승되는 것인 방법.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 용리액의 pH를 상승시키는 단계가 트리스를 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 약 6.0 초과로 pH를 상승시키는 상기 단계에서의 용리액이 약 10 mM 내지 약 45 mM의 이온 강도를 가지는 것인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 심층 여과된 단백질 조제물을 이온 교환 크로마토그래피에 적용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 100 ppm 미만으로 감소되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 내용물이 PLBL2를 포함하고, 여기서 PLBL2는 100 ppm 미만으로 감소되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 조제물이 수확된 세포 배양액, 포획 풀 또는 회수된 단백질 풀을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 치료용 또는 진단용 단백질인 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 항체, Fc 융합 단백질, 펩티드, 이뮤노어드헤신, 효소, 성장 인자, 수용체, 호르몬, 조절 인자, 시토카인, 항원, 펩티드 또는 결합제인 방법.
- 제21항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 이중특이적 항체 또는 항체 단편인 방법.
- 제22항에 있어서, 항체가 IgG1 항체인 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 항-SARS-COV-2 항체인 방법.
- 제24항에 있어서, 항-SARS-COV-2 항체가 밤라니비맙인 방법.
- 제24항에 있어서, 항-SARS-COV-2 항체가 서열식별번호: 1의 VH 및 서열식별번호: 2의 VL을 포함하는 것인 방법.
- 제24항에 있어서, 항-SARS-COV-2 항체가 서열식별번호: 3의 HC 및 서열식별번호: 4의 LC를 포함하는 것인 방법.
- 제24항에 있어서, 항-SARS-COV-2 항체가 에테세비맙인 방법.
- 제24항에 있어서, 항-SARS-COV-2 항체가 서열식별번호: 5의 VH 및 서열식별번호: 6의 VL을 포함하는 것인 방법.
- 제24항에 있어서, 항-SARS-COV-2 항체가 서열식별번호: 7의 HC 및 서열식별번호: 8의 LC를 포함하는 것인 방법.
- 제24항에 있어서, 항-SARS-COV-2 항체가 벱텔로비맙인 방법.
- 제24항에 있어서, 항-SARS-COV-2 항체가 서열식별번호: 9의 VH 및 서열식별번호: 10의 VL을 포함하는 것인 방법.
- 제24항에 있어서, 항-SARS-COV-2 항체가 서열식별번호: 11의 HC 및 서열식별번호: 12의 LC를 포함하는 것인 방법.
- 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-SARS-COV-2 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법으로서,
a. 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-SARS-COV-2 항체 조제물을 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계;
b. 아세트산과 인산으로 구성되는 산 조합 또는 아세트산과 락트산의 조합을 사용하여 항-SARS-COV-2 항체를 용리시킴으로써 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액을 수득하는 단계;
c. 약 20 mM HCl의 첨가에 의해 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액의 pH를 조정하는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 3.3 내지 약 pH 3.7로 저하되고, 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 3.3 내지 약 pH 3.7로 유지되는 것인 단계;
d. 약 250 mM 트리스 완충제의 첨가에 의해 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액의 pH를 상승시키는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5로 상승되는 것인 단계; 및
e. 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하고, 여과된 항-SARS-COV-2 항체 조제물을 수득하는 단계
를 포함하며, 여기서 여과된 항-SARS-COV-2 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 0 ppm 내지 약 20 ppm으로 감소되고, 항-SARS-COV-2 항체는 IgG1 항체인 방법. - 제34항에 있어서, 단계 b의 산 조합이 20 mM 아세트산과 5 mM 인산, 또는 20 mM 아세트산과 5 mM 인산, 또는 20 mM 아세트산과 5 mM 락트산을 포함하는 것인 방법.
- 제34항에 있어서, 용리액의 pH를 조정하는 단계 c가 용리액의 pH를 약 3.5로 조정하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 약 20 mM HCl의 첨가에 의해 항-SARS-COV-2 항체를 포함하는 용리액의 pH를 조정하는 상기 단계가 바이러스 불활성화를 달성하는 것인 방법.
- 제34항에 있어서, 용리액의 pH를 상승시키는 상기 단계가 상기 pH를 약 pH 7.25로 상승시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제34항 또는 제38항에 있어서, pH를 상승시키는 상기 단계 후의 용리액이 약 10 mM 내지 약 45 mM의 이온 강도를 가지는 것인 방법.
- 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 심층 여과된 항-SARS-COV-2 항체 조제물을 이온 교환 크로마토그래피에 적용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항-SARS-COV-2 항체가 밤라니비맙인 방법.
- 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항-SARS-COV-2 항체가 아미노산 서열식별번호: 1의 VH 및 아미노산 서열식별번호: 2의 VL을 포함하는 것인 방법.
- 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항-SARS-COV-2 항체가 아미노산 서열식별번호: 3의 HC 및 아미노산 서열식별번호: 4의 LC를 포함하는 것인 방법.
- 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항-SARS-COV-2 항체가 에테세비맙인 방법.
- 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항-SARS-COV-2 항체가 서열식별번호: 5의 VH 및 서열식별번호: 6의 VL을 포함하는 것인 방법.
- 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항-SARS-COV-2 항체가 서열식별번호: 7의 HC 및 서열식별번호: 8의 LC를 포함하는 것인 방법.
- 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항-SARS-COV-2 항체가 벱텔로비맙인 방법.
- 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항-SARS-COV-2 항체가 아미노산 서열식별번호: 9의 VH 및 아미노산 서열식별번호: 10의 VL을 포함하는 것인 방법.
- 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항-SARS-COV-2 항체가 아미노산 서열식별번호: 11의 HC 및 아미노산 서열식별번호: 12의 LC를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 심층 필터가 C0SP, X0SP, X0HC, 엠파즈 AEX 하이브리드 정제기 또는 제타 플러스 (ZB 미디어)를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 세포인 방법.
- 제51항에 있어서, 포유동물 세포가 CHO 세포인 방법.
- 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 조성물.
- 제53항에 있어서, 조성물 중 숙주 세포 단백질 함량이 약 100 ppm 미만인 조성물.
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