CN107849087B - 在亲和层析中减少宿主细胞蛋白的方法 - Google Patents

在亲和层析中减少宿主细胞蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明报道了通过减少宿主细胞蛋白含量来纯化抗体的方法。该方法采用了在亲和层析中使用低电导率水溶液的洗涤步骤。

Description

在亲和层析中减少宿主细胞蛋白的方法
本发明涉及多肽纯化领域。本发明具体涉及在含有抗体的溶液中减少宿主细胞蛋白如磷脂酶B样2(PLBL2)或簇蛋白(Clusterin)。
背景技术
蛋白质，特别是免疫球蛋白在当今的医疗序列产品中起着重要的作用。对于人类应用，每种治疗蛋白质必须满足不同的标准。为了确保生物制药剂对人体的安全性，在生产过程中积累的副产物必须被特别去除。为了满足监管规范，制造过程后必须进行一个或多个纯化步骤。除此之外，纯度，生产能力和产量在确定合适的纯化过程中起着重要的作用。
不同的方法已被良好建立并广泛用于蛋白质纯化，例如亲和层析(例如蛋白A或蛋白G亲和层析，单链Fv配体亲和层析)，离子交换层析(例如阳离子交换(磺丙基或羧甲基树脂)，阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式离子交换)，亲硫吸附(例如，用β-巯基乙醇和其它SH配体)，疏水相互作用或芳香族吸附层析(例如，用苯基-琼脂糖，氮杂arenophilic树脂或间氨基苯基硼酸)，金属螯合亲和层析(例如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)，大小排阻层析和电泳方法(如凝胶电泳，毛细管电泳)。
为了纯化重组产生的免疫球蛋白，通常使用不同柱层析步骤的组合。在纯化期间，非免疫球蛋白污染物如宿主细胞蛋白和宿主细胞DNA以及内毒素和病毒被耗尽。因此，通常亲和层析步骤如蛋白A亲和层析之后是一个或多个额外的分离步骤。通常，高电导率缓冲液被描述为用于亲和层析法的洗涤步骤。
在US 6,127,526中描述了一种通过蛋白A层析纯化蛋白质的方法，其包括以下步骤：(a)将蛋白质吸附到固定在包含二氧化硅或玻璃的固相上的蛋白A；(b)通过用疏水电解质溶剂洗涤固相来去除结合到固相上的污染物；和(c)从固相中回收蛋白质。
在WO2011/038894中报道了在从蛋白A层析材料中回收免疫球蛋白之前，通过特定洗涤步骤明显消耗宿主细胞蛋白和DNA的蛋白A层析法。
在WO2013/177118中报道了从样品基质中分离和纯化抗体的组合物和方法。
在WO2013/033517中报道了从病毒中分离目的多肽(如抗体)的方法。
在EP2583973中报道了一种纯化蛋白质的方法，包括一种或多种层析过程，其中在至少一个层析过程(平衡缓冲液，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液)中使用的缓冲液中包含氨基酸；或者二肽，寡肽或其多聚氨基酸，由此纯化具有非常少量杂质的高纯度蛋白质(例如聚合物或宿主细胞蛋白)。
发明概述
本文报道了通过用亲和层析步骤纯化抗体来生产具有降低的宿主细胞蛋白含量的抗体的方法。
更详细地说，已经发现，在从层析材料回收抗体之前，在亲和层析的洗涤步骤中使用低电导率水溶液的本发明的方法中，在包含抗体的溶液中某些宿主细胞蛋白可以被减少。因此，已经发现可以减少磷脂酶(特别是磷脂酶B样2(PLBL2))的含量。已经发现，如果抗体是IgG4同种型抗体，则PLBL2含量可减少100倍或更多。
本文报道的一个方面是低电导率水溶液在蛋白A层析的洗涤步骤中降低宿主细胞蛋白的含量的用途，其中蛋白A层析用于纯化人IgG1或人IgG4同种型抗体。
在该方面的一个实施方案中，人IgG4同种型抗体是针对P-选择蛋白的抗体或针对因子IXa和因子X的双特异性抗体或针对IL-13的抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体。在该方面的一个实施方案中，人IgG1同种型抗体是针对乙型流感的抗体或针对VEGF-A的抗体或针对CD22的抗体，针对HER3和EGFR的双特异性抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体，或针对Her2的抗体或针对Ang2和VEGF-A的双特异性抗体或针对癌胚抗原(CEA)和CD3的双特异性抗体。
在该方面的一个实施方案中，低电导率水溶液具有约0.5mS/cm或更小的电导率值。
在这个方面的一个实施方案中，宿主细胞蛋白是磷脂酶B样2(PLBL2)或簇蛋白。
在该方面的一个实施方案中，低电导率水溶液包含约0.1mM至约8mM Tris。
在该方面的一个实施方案中，低电导率水溶液包含约0.05mM至约2mM磷酸钾。
在该方面的一个实施方案中，低电导率水溶液具有约7或更高的pH。
在该方面的一个实施方案中，低电导率水溶液洗涤步骤之前或之后是高电导率水溶液洗涤步骤。
在该方面的一个实施方案中，高电导率水溶液具有约20mS/cm或更高的电导率值。
在该方面的一个实施方案中，用低电导率水溶液洗涤步骤和高电导率水溶液洗涤步骤之间用中等电导率水溶液进行中间洗涤步骤。
在该方面的一个实施方案中，中等电导率水溶液具有大于0.5mS/cm至小于20mS/cm的电导率值。
在该方面的一个实施方案中，高(或中等)电导率水溶液包含组氨酸。
本文报道的一个方面是生产人IgG4或IgG1同种型抗体的方法，其包括以下步骤：
a)培养包含编码人IgG4或IgG1同种型抗体的核酸的细胞，
b)从细胞或培养基中回收人IgG4或IgG1同种型抗体，
c)使人IgG4或IgG1同种型抗体与蛋白A层析材料接触，
d)用低电导率水溶液洗涤蛋白A层析材料，
e)从蛋白A层析材料中回收人IgG4或IgG1同种型抗体,
从而产生人IgG4或IgG1同种型抗体。
本文报道的一个方面是从样品中纯化人IgG4或IgG1同种型抗体的方法，包括以下步骤：
a)提供包含人IgG4或IgG1同种型抗体的样品，
b)用蛋白A层析法/步骤纯化人IgG4或IgG1同种型抗体，包括用低电导率水溶液洗涤蛋白A层析材料。
在所有方面的一个实施方案中，人IgG4同种型抗体是针对P-选择蛋白的抗体或针对因子IXa和因子X的双特异性抗体或针对IL-13的抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体。在所有方面的一个实施方案中，人IgG1同种型抗体是针对乙型流感的抗体或针对VEGF-A的抗体或针对CD22的抗体或针对HER3和EGFR的双特异性抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体或针对Her2的抗体或针对Ang2和VEGF-A的双特异性抗体或针对癌胚抗原(CEA)和CD3的双特异性抗体。
在所有方面的一个实施方案中，低电导率水溶液具有约0.5mS/cm或更小的电导率值。
在所有方面的一个实施方案中，宿主细胞蛋白的含量降低并且(特异性)宿主细胞蛋白是磷脂酶B样2(PLBL2)或簇蛋白。
在所有方面的一个实施方案中，低电导率水溶液包含约0.1mM至约8mM Tris。
在所有方面的一个实施方案中，低电导率水溶液包含约0.05mM至约2mM磷酸钾。
在所有方面的一个实施方案中，低电导率水溶液具有约7或更高的pH。
在所有方法方面的一个实施方案中，所述方法还包括在用低电导率水溶液洗涤蛋白A层析材料之前或之后，用高电导率水溶液和/或用中等电导率水溶液洗涤亲和层析材料。
在所有方面的一个实施方案中，高电导率水溶液具有约20mS/cm或更高的电导率值。
在所有方面的一个实施方案中，中等电导率水溶液具有从大于0.5mS/cm到小于20mS/cm的电导率值。
在所有方面的一个实施方案中，高或中等电导率水溶液包含组氨酸。
发明详述
本文报道了一种改进的亲和层析方法和用途，包括用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料。
已经发现，当这种洗涤步骤用于亲和层析步骤，例如，蛋白A层析步骤时，可以用低电导率水溶液进行洗涤步骤来减少特定的宿主细胞蛋白。亲和层析步骤用于抗体的纯化或生产方法中。低电导率水溶液洗涤步骤对降低磷脂酶B样2(PLBL2)的含量特别有效。
本文报道的一个方面是低电导率水溶液在亲和层析的洗涤步骤中用于降低(特异性)宿主细胞蛋白的含量的用途。
如本文所报道的一个方面是用于产生人IgG同种型抗体的方法，包括
a)培养包含编码人IgG同种型抗体的核酸的细胞，
b)从细胞或培养基中回收人IgG同种型抗体，
c)使人IgG同种型抗体(包含该抗体的溶液)与亲和层析材料接触，
d)用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料，而至少90％的双特异性抗体保持与亲和层析材料结合，
e)从亲和层析材料中回收人IgG同种型抗体，
从而产生人IgG同种型抗体。
如本文报道的一个方面是从样品中纯化人IgG同种型抗体的方法，其包括以下步骤：
a)提供包含人IgG同种型抗体的(缓冲水性)样品，
b)用亲和层析法/步骤纯化人IgG同种型抗体，包括用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料。
在CHO细胞中产生的重组多肽可根据本文所述的方法纯化以去除宿主细胞蛋白或降低宿主细胞蛋白的水平。
示例性的重组多肽包括治疗性抗体和免疫粘附素，包括但不限于针对一种或多种以下抗原的抗体，包括抗体片段：HER1(EGFR)，HER2(例如曲妥珠单抗，帕妥珠单抗)，HER3，HER4，VEGF(例如，贝伐单抗,雷珠单抗),MET(例如，onartuzumab)，CD20(例如利妥昔单抗，obinutuzumab，奥瑞珠单抗)，CD22，CD11a，CD11b，CD11c，CD18，ICAM，VLA-4，VCAM，IL-17A和/或F，IgE(例如奥马珠单抗)，DRS，CD40，Apo2L/TRAIL，EGFL7(例如帕沙珠单抗)，NRP1，整联蛋白β7(例如etrolizumab)，IL-13(例如lebrikizumab)，Abeta(例如，crenezumab，gantenerumab)，P-选择蛋白(例如，inclacumab)，IL-6R(例如tociluzumab)，IFNα(例如，rontalizumab)，M1prime(例如quilizumab)，促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，OX40L，TSLP，因子D(例如lampalizumab)和受体如：IL-9受体，IL-5受体，IL-4受体α，IL-13受体α1和IL-13受体α2，OX40，TSLP-R，IL-7Rα(TSLP的共同受体)，IL17RB(IL-25的受体)，ST2(IL-33的受体)，CCR3，CCR4，CRTH2，FcepsilonRI和FcepsilonRII/CD23(IgE的受体)。其他示例性的抗体包括选自但不限于以下的抗体：抗雌激素受体抗体，抗孕酮受体抗体，抗p53抗体，抗组织蛋白酶D抗体，抗Bcl-2抗体，抗E-钙粘蛋白抗体，抗CA125抗体，抗CA15-3抗体，抗CA19-9抗体，抗c-erbB-2抗体，抗-P-糖蛋白抗体，抗CEA抗体，Ki-67抗体，抗PCNA抗体，抗CD3抗体，抗CD4抗体，抗CD5抗体，抗CD7抗体，抗CD8抗体，抗CD9/p24抗体，抗CD10抗体，抗CD11c抗体，抗CD13抗体，抗CD14抗体，抗CD15抗体，CD19抗体，抗CD23抗体，抗CD30抗体，抗CD31抗体，抗CD33抗体，抗CD34抗体，抗CD35抗体，抗CD38抗体，抗CD41抗体，抗LCA/CD45抗体，CD45RO抗体，抗CD45RA抗体，抗CD39抗体，抗CD100抗体，抗CD95/Fas抗体，抗CD99抗体，抗CD106抗体，抗遍在蛋白抗体，抗-CD71抗体，抗c-myc抗体，抗细胞角蛋白抗体，抗波形蛋白抗体，抗HPV蛋白抗体，抗κ轻链抗体，抗λ轻链抗体，抗黑素体抗体，抗前列腺特异性抗原抗体，抗S-100抗体，抗tau抗原抗体，抗纤维蛋白抗体，抗角蛋白抗体和抗Tn-抗原抗体。
在一些实施方案中，示例性抗体包括针对Abeta的抗体，针对IL17A/F的抗体和针对CMV的抗体。例如在WO2008011348，WO2007068429，WO2001062801和WO2004071408中已经描述了示例性的抗Aβ抗体和生产这类抗体的方法。例如，在WO 2009136286和美国专利号8,715,669中已经描述了示例性的抗IL17A/F抗体和生产这类抗体的方法。先前，例如在WO2012047732中已经描述了示例性的抗CMV抗体，包括抗CMV-MSL，以及生产此类抗体的方法。
在一些实施方案中，亲和层析用于纯化人IgG同种型抗体。在一些实施方案中，亲和层析用于纯化IgG4抗体。在一个实施方案中，IgG4同种型抗体是针对P-选择蛋白的抗体或针对因子IXa和因子X的(双特异性)抗体或针对IL-13的抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体。在一些实施方案中，亲和层析用于纯化IgG1同种型抗体。在一个实施方案中，IgG1同种型抗体是针对乙型流感的抗体或针对VEGF-A的抗体或针对CD22的抗体或针对HER3和EGFR的(双特异性)抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体或针对Her2的抗体或针对Ang2和VEGF-A的双特异性抗体或针对癌胚抗原(CEA)和CD3的双特异性抗体。
如本文所报道的一个方面是生产人IgG4同种型抗体(含有该抗体的溶液)的方法，其包括
a)培养包含编码人IgG4同种型抗体的核酸的细胞，
b)从细胞或培养基中回收人IgG4同种型抗体，
c)将人IgG4同种型抗体与亲和层析材料接触，
d)用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料，
e)从亲和层析材料中回收人IgG4同种型抗体
从而产生人IgG4同种型抗体。
如本文所报道的一个方面是生产IgG4同种型抗体(含有该抗体的溶液)的方法，其包含
a)培养包含编码IgG4同种型抗体的核酸的细胞，
b)从细胞或培养基中回收IgG4同种型抗体，
c)使IgG4同种型抗体与亲和层析材料接触，
d)用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料，
e)从亲和层析材料中回收IgG4同种型抗体
从而产生IgG4同种型抗体。
本文报道的一个方面是从样品纯化人IgG4同种型抗体的方法，其包括以下步骤：
a)提供包含人IgG4同种型抗体的样品，
b)用亲和层析方法/步骤纯化人IgG4同种型抗体，所述亲和层析方法/步骤包括用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料。
如本文报道的一个方面是从样品中纯化IgG4同种型抗体的方法，其包括以下步骤：
a)提供包含IgG4同种型抗体的样品，
b)用亲和层析法/步骤纯化IgG4同种型抗体，所述亲和层析法/步骤包括用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料。
已经发现，如果洗涤步骤中使用的水溶液的电导率低，即,使用低电导率水溶液进行洗涤，则可以降低宿主细胞蛋白的含量。在所有方面的一个实施方案中，低电导率水溶液具有约1mS/cm或更小的电导率值。在所有方面的一个优选实施方案中，低电导率水溶液具有约0.5mS/cm或更小的电导率值。在一个实施方案中，低电导率水溶液具有从约0.03μS/cm至约0.5mS/cm的电导率值。在一个实施方案中，低电导率水溶液具有从约0.05μS/cm至约0.35mS/cm的电导率值。在所有方面的一个实施方案中，低电导率水溶液是去离子水。对于某些应用，去离子水不适合用于洗涤步骤。在一些实施方案中，低电导率水溶液不是去离子水。
已经发现蛋白A亲和层析可用于本文所报道的目的。在所有方面的一个优选实施方案中，亲和层析是蛋白A亲和层析。在一个实施方案中，蛋白A亲和层析选自MabSelectSure亲和层析，ProSep vA亲和层析，Poros Mab Capture A亲和层析，ProSepUltra Plus亲和层析，MabSelect SuRe LX,MabSelect,Eshmuno A,Toyopearl AF-rProtein A-650F；Toyopearl AF-rProtein A HC-650HF)。在一个实施方案中，亲和层析是蛋白G亲和层析。在一个实施方案中，亲和层析是使用重组蛋白作为配体的亲和层析，这意味着亲和层析是重组蛋白配体亲和层析。在一个实施方案中，亲和层析是使用单链Fv作为配体的亲和层析，这意味着亲和层析是单链Fv配体亲和层析。在一个实施方案中，亲和层析包含偶联至层析基质的突变蛋白A或偶联至层析基质的蛋白A的片段。
已经发现可以降低(特异性)宿主细胞蛋白的含量。已经发现特别是磷脂酶B样2(PLBL2)的含量可以降低。在一个实施方案中，(特定)宿主细胞蛋白是中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞蛋白。在所有方面的一个优选实施方案中，(特异性)宿主细胞蛋白是磷脂酶B样2(PLBL2)或簇蛋白。在一个实施方案中，(特定)宿主细胞蛋白是磷脂酶B样2(PLBL2)。
已经发现，低电导率水溶液可以包含少量的某些缓冲物质，例如，Tris或磷酸钾。在一个实施方案中，低电导率水溶液含有三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)。在一个实施方案中，低电导率水溶液包含约0.1mM至约10mM Tris。在一个实施方案中，低电导率水溶液包含约0.5mM至约6.5mM Tris。在一个实施方案中，低电导率水溶液包含约2mM Tris。在一个实施方案中，低电导率水溶液含有磷酸钾。在一个实施方案中，低电导率水溶液包含约0.05mM至约5mM磷酸钾。在一个实施方案中，低电导率水溶液包含约0.05mM至约2mM磷酸钾。在一个实施方案中，低电导率水溶液包含约0.5mM磷酸钾。
已经发现，如果低电导率水溶液具有一定的pH，则降低宿主细胞蛋白含量的效果是显著的。在一个实施方案中，低电导率水溶液具有约7或更高的pH。在一个实施方案中，低电导率水溶液具有约7.5或更高的pH。在一个实施方案中，低电导率水溶液具有约7至约9.5的pH。在一个实施方案中，低电导率水溶液具有约7.5至约8.5的pH。在一个实施方案中，低电导率水溶液具有约8的pH。在一个实施方案中，低电导率水溶液具有约9的pH。
已经发现，如果低电导率水溶液的pH为约8.5或更高，并且低电导率水溶液具有约1.2mS/cm或更低的电导率值，则还可以实现降低宿主细胞蛋白含量的效果。在一个实施方案中，低电导率水溶液具有约8.5或更高的pH，并且低电导率水溶液具有约1.2mS/cm或更低的电导率值。在一个实施方案中，低电导率水溶液具有约8.5或更高的pH，并且低电导率水溶液具有约1mS/cm或更低的电导率值。在一个实施方案中，低电导率水溶液具有约8.5或更高的pH，并且低电导率水溶液包含约55mM或更低的Tris。在一个实施方案中，低电导率水溶液具有约8.5或更高的pH，并且低电导率水溶液包含约30mM或更低的Tris。
在一个实施方案中，低电导率水溶液处于从pH7至低于pH8.5的pH范围内，并且具有约0.5mS/cm或更低的电导率值，在pH值为8.5或更高时，电导率值为约1.2mS/cm或更低。
已经发现，通过本文报道的用途和方法，可以将宿主细胞蛋白如PLBL2的含量降低到一定水平，例如，当与纯化步骤如亲和层析步骤之前的PLBL2的加载量进行比较时。在一个实施方案中，PLBL2的含量降低至少20倍。在一个实施方案中，PLBL2的含量降低至少40倍。在一个实施方案中，PLBL2的含量降低至少50倍。在一个实施方案中，PLBL2的含量降低至少90倍。在一个实施方案中，PLBL2的含量降低至少100倍。在某些情况下，降低水平甚至更高。在一些实施方案中，PLBL2的含量降低至少200倍。在一些实施方案中，PLBL2的含量降低至少250倍。在一些实施方案中，PLBL2的含量降低至少300倍。在一些实施方案中，PLBL2的含量降低至少400倍。在一些实施方案中，PLBL2的含量降低至少1000倍。在一个实施方案中，PLBL2的含量降低至少50％。在一个实施方案中，PLBL2的含量降低至少66％。在一个实施方案中，PLBL2的含量降低至少80％。在一个实施方案中，PLBL2的含量降低至少90％。在一个实施方案中，PLBL2的含量降低至少95％。在一些实施方案中，PLBL2的含量降低至低于10ng/mg抗体。在一些实施方案中，PLBL2的含量降低至低于5ng/mg抗体。在一些实施方案中，PLBL2的含量降低至低于2ng/mg抗体。
在本文报道的方法和用途中，另外的洗涤步骤可以使用中等和/或高电导率水溶液。在一个实施方案中，低电导率水溶液洗涤步骤之前或之后是高电导率水溶液洗涤步骤。在一个实施方案中，高电导率水溶液具有约20mS/cm或更高的电导率值。在一个实施方案中，高电导率水溶液具有从约20mS/cm至约100mS/cm的电导率值。在一个实施方案中，低电导率水溶液洗涤步骤和高电导率水溶液洗涤步骤之间用中等电导率水溶液进行中间洗涤步骤。在一个实施方案中，中等电导率水溶液具有大于0.5mS/cm至小于20mS/cm的电导率值。
已经发现，当高或中等电导率水溶液进一步包含氨基酸时，可以改善宿主细胞蛋白降低效果。在一个实施方案中，高或中等电导率水溶液包含氨基酸。在一个实施方案中，高或中等电导率水溶液包含组氨酸或精氨酸。在一个实施方案中，高或中等电导率水溶液包含组氨酸。在一个实施方案中，高或中等电导率水溶液包含组氨酸和Tris。
如本文所报道的方法和用途可以包括一个或多个进一步的层析步骤。在一个实施方案中，进行至少一个另外的层析方法/步骤。在一个实施方案中，进行另外的离子交换层析法/步骤。在一个实施方案中，进行另外的阴离子交换层析法/步骤。在一个实施方案中，进行另外的阴离子交换层析法/步骤和另外的阳离子交换层析法/步骤。
已经发现可以省略疏水作用层析步骤的使用。在一个实施方案中，所述用途或方法不具有疏水性相互作用层析法/步骤。
本文报道的一个方面是低电导率水溶液在蛋白A层析的洗涤步骤中降低PLBL2或簇蛋白的含量的用途，其中蛋白A层析用于纯化IgG4或IgG1同种型，例如人IgG4或IgG1抗体，并且其中低电导率水溶液具有约0.5mS/cm或更小的电导率值和约7或更高的pH值。
一个方面是低电导率水溶液在蛋白A层析的洗涤步骤中降低PLBL2或簇蛋白的含量的用途，其中蛋白A层析用于纯化人IgG4或IgG1同种型抗体，并且其中低电导率水溶液具有约0.5mS/cm或更小的电导率值和约7或更高的pH值。在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型抗体，例如针对P-选择蛋白的抗体或针对因子IXa和因子X的双特异性抗体，针对IL-13的抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型抗体，例如针对乙型流感的抗体或针对VEGF-A的抗体或针对CD22的抗体或针对HER3和EGFR的双特异性抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体，或针对Her2的抗体或针对Ang2和VEGF-A的双特异性抗体，或针对癌胚抗原(CEA)和CD3的双特异性抗体。
一方面，本公开提供了用于产生人IgG4或IgG1同种型抗体的方法，包括
a)培养包含编码人IgG4或IgG1同种型抗体的核酸的细胞，
b)从细胞或培养基中回收人IgG4或IgG1同种型抗体，
c)使人IgG4或IgG1同种型抗体与蛋白A亲和层析材料接触，
d)用低电导率水溶液洗涤蛋白A亲和层析材料，
e)从亲和层析材料中回收人IgG4或IgG1同种型抗体
从而产生人IgG4或IgG1同种型抗体，
其中所述低电导率水溶液具有约0.5mS/cm或更小的电导率值和约7或更高的pH值。
一方面，本公开提供了用于产生人IgG4或IgG1同种型抗体的方法，包括
a)培养包含编码人IgG4或IgG1同种型抗体的核酸的细胞，
b)从细胞或培养基中回收人IgG4或IgG1同种型抗体，
c)使人IgG4或IgG1同种型抗体与蛋白A亲和层析材料接触，
d)用低电导率水溶液洗涤蛋白A亲和层析材料，
e)从亲和层析材料中回收人IgG4或IgG1同种型抗体，
从而产生人IgG4或IgG1同种型抗体，
其中所述低电导率水溶液具有约0.5mS/cm或更小的电导率值和约7或更高的pH值，
并且其中所述人IgG4同种型抗体是针对P-选择蛋白的抗体或针对IXa因子和因子X的双特异性抗体或针对IL-13的抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体，并且其中所述人IgG1同种型抗体是针对乙型流感的抗体或针对VEGF-A抗体或针对CD22的抗体或针对HER3和EGFR的双特异性抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体或针对Her2的抗体或针对Ang2和VEGF-A的双特异性抗体或针对癌胚抗原(CEA)和CD3的双特异性抗体。
一方面，本公开提供了从样品中纯化人IgG4或IgG1同种型抗体的方法，其包括以下步骤：
a)提供包含人IgG4或IgG1同种型抗体的样品，
b)用蛋白A亲和层析法/步骤纯化人IgG4或IgG1同种型抗体，所述蛋白A亲和层析法/步骤包括用低电导率水溶液洗涤蛋白A亲和层析材料，
其中所述低电导率水溶液具有约0.5mS/cm或更小的电导率值和约7或更高的pH值。
一方面，本公开提供了从样品中纯化人IgG4或IgG1同种型抗体的方法，其包括以下步骤：
a)提供包含人IgG4或IgG1同种型抗体的样品，
b)用蛋白A亲和层析法/步骤纯化人IgG4或IgG1同种型抗体，所述蛋白A亲和层析法/步骤包括用低电导率水溶液洗涤蛋白A亲和层析材料，
其中所述低电导率水溶液具有约0.5mS/cm或更小的电导率值和约7或更高的pH值，
并且其中所述人IgG4同种型抗体是针对P-选择蛋白的抗体或针对因子IXa和因子X的抗体或针对IL-13的抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体，并且其中所述人IgG1同种型抗体是针对乙型流感的抗体或针对VEGF-A的抗体或针对CD22的抗体或针对HER3和EGFR的抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体或针对Her2的抗体或针对Ang2和VEGF-A的双特异性抗体，或针对癌胚抗原(CEA)和CD3的双特异性抗体。
一方面，本公开内容提供了产生人IgG4同种型抗体的方法，包括
a)培养包含编码人IgG4同种型抗体的核酸的细胞，
b)从细胞或培养基中回收人IgG4同种型抗体，
c)使人IgG4同种型抗体与蛋白A亲和层析材料接触，
d)用低电导率水溶液洗涤蛋白A亲和层析材料，
e)从亲和层析材料中回收人IgG4同种型抗体，
从而产生人IgG4同种型抗体，
其中所述低电导率水溶液具有约0.5mS/cm或更小的电导率值和约7或更高的pH值，
并且其中人IgG4同种型抗体是针对因子IXa和因子X的抗体。
一方面，本公开提供了一种从样品中纯化人IgG4同种型抗体的方法，包括以下步骤：
a)提供包含人IgG4同种型抗体的样品，
b)用蛋白A亲和层析法/步骤纯化人IgG4同种型抗体，所述蛋白A亲和层析法/步骤包括用低电导率水溶液洗涤蛋白A亲和层析材料，
其中所述低电导率水溶液具有约0.5mS/cm或更小的电导率值和约7或更高的pH值，
并且其中所述人IgG4同种型抗体是针对因子IXa和因子X的抗体。
术语“抗-P选择蛋白抗体”和“与P-选择蛋白结合的抗体”或“针对P-选择蛋白的抗体”是指能够以足够的亲和力结合P-选择蛋白的抗体，使得该抗体可用作靶向P-选择蛋白的诊断和/或治疗剂。在一个实施方案中，如通过ELISA或表面等离振子共振所测量的，抗-P选择蛋白抗体与无关的非P-选择蛋白蛋白的结合程度小于抗体与P-选择蛋白的结合的约10％。在某些实施方案中，抗P-选择蛋白抗体结合来自不同物种的P-选择蛋白中保守的P-选择蛋白的表位。上述也适用于术语“针对因子IXa和因子X的抗体”或“针对IL-13的抗体”或“针对β淀粉状蛋白的抗体”等。
在一些实施方案中，针对P-选择蛋白的抗体是如WO 2005/100402或SEQ ID NO：07-12中所述的inclacumab(IgG4同种型)。在一些实施方案中，抗体是针对因子IXa和因子X的双特异性抗体，例如，如WO2012/067176中所述的抗FIXa/X抗体(IgG4同种型)。在一些实施方案中，抗体是针对Her2的抗体，例如如WO 1992/022653中所述的曲妥珠单抗(IgG1同种型)。在一些实施方案中，抗体是针对血管生成素2(Ang2)和血管内皮生长因子A(VEGF-A)的双特异性抗体，例如WO2011/117329或SEQ ID NO：01至04中描述的vanucizumab(IgG1同种型)。在一些实施方案中，抗体是如WO 2003/070760或SEQ ID NO：05至06中所述的针对β淀粉状蛋白的抗体，例如，gantenerumab(IgG1同种型)或crenezumab(IgG4同种型)。在一些实施方案中，抗体是针对CD22的抗体，针对IL13的抗体(例如，lebrikizumab)，针对Her3和EGFR的双特异性抗体(例如，duligotuzumab)，针对VEGF-A的抗体(例如贝伐单抗)和针对乙型流感的抗体。术语VEGF或VEGF-A可以在本文中互换使用。
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”是指在体外测定，优选在表面等离振子共振测定(SPR，BIAcore，GE-Healthcare Uppsala，瑞典)中抗体与抗原表位的结合。结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体结合的速率常数)，kd(解离常数)和KD(kd/ka)定义。结合或特异性结合是指10-7mol/L或更小的结合亲和力(KD)。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原-结合活性。
“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含与完整抗体结合的抗原结合的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv,Fab,Fab',Fab’-SH,F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。Fab片段是通过木瓜蛋白酶消化(全长/完整)抗体获得的抗体片段。
“双特异性抗体”是具有两种不同的抗原结合特异性的抗体。如本文所用的术语“双特异性”抗体表示具有至少两个结合位点的抗体，每个结合位点结合不同的表位。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来自不同来源或物种。
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类别。有五种主要类别的抗体：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中这些的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α,δ,ε,γ,和μ。
术语“人IgG同种型抗体”是指包含源自人类野生型IgG同种型的恒定区的抗体，即例如其可以包含源自具有突变例如P329G突变(根据Kabat编号)的人类IgG同种型的恒定区。
术语“人IgG4同种型抗体”表示包含源自人类野生型IgG4同种型的恒定区的抗体，即例如其可以包含衍生自具有突变例如P329G突变和/或S228P，L235E突变(根据Kabat编号)的人类IgG4同种型的恒定区。
本文的术语“Fc-区”用于定义含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C末端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)或C-末端甘氨酰-赖氨酸二肽(Gly446Lys447)可能存在或可能不存在。除非本文另外指明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据EU编号系统(也称为EU索引)，如Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242所述。
“构架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以以下顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，指的是已经导入了外源核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的后代，而不考虑传代次数。子代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括具有与最初转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变子代。术语“细胞”包括用于表达核酸的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是CHO细胞(例如CHO K1，CHO DG44)或BHK细胞或NS0细胞或SP2/0细胞或HEK 293细胞或HEK 293EBNA细胞或
Figure BDA0001550276460000171
细胞或COS细胞。在另一个实施方案中，细胞是CHO细胞或BHK细胞或
Figure BDA0001550276460000172
细胞。如本文所用，表述“细胞”包括受试者细胞及其后代。
术语“洗涤”表示将溶液应用于亲和层析材料以从层析材料中除去非特异性结合的多肽和非多肽化合物，尤其是除去宿主细胞蛋白和宿主细胞DNA。术语“洗涤”不包括从亲和层析材料洗脱结合的材料。
用于蛋白质回收和纯化的不同方法已经被很好地确立和广泛使用，例如使用微生物蛋白质的亲和层析(例如蛋白A或蛋白G亲和层析)，使用重组蛋白质作为配体(例如单链Fv作为配体，例如Kappa选择)的亲和层析，离子交换层析(例如阳离子交换(羧甲基树脂)，阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换)，亲硫吸附(例如用β-巯基乙醇和其他SH配体)，疏水相互作用或芳香吸附层析(例如用苯基-琼脂糖，氮杂-arenophilic树脂或间氨基苯基硼酸)，金属螯合物亲和层析(例如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)，大小排阻层析和电泳方法(如凝胶电泳，毛细管电泳)。这些方法可以在本文中报道的不同实施方案中独立地组合。
术语“蛋白A”表示从天然来源获得或合成产生的蛋白A多肽。
术语“蛋白A层析材料”表示蛋白A共价连接的惰性固相。
在一个实施方案中，蛋白A层析材料选自MabSelectSure,ProSep vA,Mab CaptureA,ProSep Ultra Plus,Mab Select,Mab Select Xtra,Poros A,或ProSep A。
术语“高电导率水溶液”是指具有高电导率值的水溶液。电导率值可以是约20mS/cm或更高。
术语“中等电导率水溶液”是指具有中等电导率值的水溶液。电导率值可以大于0.5mS/cm至小于20mS/cm。
术语“低电导率水溶液”是指具有低电导率值的水溶液。电导率值可以是大约0.5mS/cm或更小。如果pH约为8.5或更高，则电导率值可以是约1.2mS/cm或更小。电导率值可以通过本领域技术人员已知的标准方法确定。
提供以下实施例和序列以帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求中阐述。可以理解的是，在不背离本发明的精神的情况下，可以对所述步骤进行修改。
本发明的具体实施方案
1.低电导率水溶液在亲和层析的洗涤步骤中降低宿主细胞蛋白的含量的用途。
2.根据实施方案1的用途，其中所述亲和层析用于纯化人IgG同种型抗体。
3.根据实施方案2的用途，其中所述亲和层析用于纯化人IgG4同种型抗体或人IgG1同种型抗体。
4.根据实施方案3所述的用途，其中所述亲和层析用于纯化人IgG4同种型抗体或人IgG1同种型抗体，所述抗体在其Fab片段中没有糖基化的糖基化位点/具有恰好一个糖基化位点(根据Kabat编号在位置Asn297)。
5.根据实施方案4所述的用途，其中所述低电导率水溶液具有约0.5mS/cm或更小的电导率值。
6.根据实施方案5所述的用途，其中所述低电导率水溶液具有从约0.03μS/cm至约0.5mS/cm的电导率值。
7.根据实施方案5所述的用途，其中所述低电导率水溶液具有从约0.05μS/cm至约0.35mS/cm的电导率值。
8.根据实施方案5至7中任一项所述的用途，其中所述低电导率水溶液不是去离子水。
9.根据前述实施方案中任一项的用途，其中所述亲和层析是蛋白A亲和层析或蛋白G亲和层析或单链Fv配体(KappaSelect)亲和层析。
10.根据实施方案9的用途，其中亲和层析是蛋白A亲和层析。
11.根据实施方案10的用途，其中蛋白A亲和层析选自MabSelectSure亲和层析，ProSep vA亲和层析，Poros Mab Capture A亲和层析，ProSep Ultra Plus亲和层析，MabSelect SuRe LX，MabSelect，Eshmuno A，Toyopearl AF-rProtein A-650F；ToyopearlAF-rProtein A HC-650HF)。
12.根据前述实施方案中任一项的用途，其中所述宿主细胞蛋白是中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞蛋白。
13.根据实施方案12的用途，其中所述宿主细胞蛋白是磷脂酶。
14.根据实施方案13所述的用途，其中所述宿主细胞蛋白是磷脂酶A，磷脂酶B，磷脂酶C或磷脂酶D。
15.根据实施方案12,13或14的用途，其中所述宿主细胞蛋白是磷脂酶B样2(PLBL2)。
16.根据实施方案12的用途，其中所述宿主细胞蛋白是磷脂酶B样2(PLBL2)或簇蛋白。
17.根据前述实施方案中任一项的用途，其中所述低电导率水溶液含有三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)。
18.根据实施方案17所述的用途，其中所述低电导率水溶液包含约0.1mM至约10mMTris。
19.根据实施方案18所述的用途，其中所述低电导率水溶液包含约0.1mM至约8mMTris。
20.根据实施方案19所述的用途，其中所述低电导率水溶液包含约0.5mM至约6.5mM Tris。
21.根据实施方案20的用途，其中所述低电导率水溶液包含约2mM Tris。
22.根据实施方案17至21中任一项所述的用途，其中所述低电导率水溶液含有磷酸钾。
23.根据实施方案22所述的用途，其中所述低电导率水溶液包含约0.05mM至约5mM磷酸钾。
24.根据实施方案23所述的用途，其中所述低电导率水溶液包含约0.05mM至约2mM磷酸钾。
25.根据实施方案24的用途，其中所述低电导率水溶液包含约0.5mM磷酸钾。
26.根据前述实施方案中任一项的用途，其中所述低电导率水溶液具有约7或更高的pH。
27.根据实施方案26的用途，其中所述低电导率水溶液具有约7.5或更高的pH。
28.根据实施方案27的用途，其中所述低电导率水溶液具有约7至约9.5的pH。
29.根据实施方案28所述的用途，其中所述低电导率水溶液具有约7.5至约8.5的pH。
30.根据实施方案29所述的用途，其中所述低电导率水溶液具有约8的pH。
31.根据前述实施方案中任一项的用途，其中所述低电导率水溶液洗涤步骤之前或之后是高电导率水溶液洗涤步骤。
32.根据实施方案31所述的用途，其中所述低电导率水溶液洗涤步骤之前是高电导率水溶液洗涤步骤。
33.根据实施方案31所述的用途，其中所述高电导率水溶液具有约20mS/cm或更高的电导率值。
34.根据实施方案33所述的用途，其中所述高电导率水溶液具有从约20mS/cm至约100mS/cm的电导率值。
35.根据实施方案31的用途，其中在低电导率水溶液洗涤步骤和高电导率水溶液洗涤步骤之间用中等电导率水溶液进行中间洗涤步骤。
36.根据实施方案35所述的用途，其中所述中等电导率水溶液具有大于0.5mS/cm至小于20mS/cm的电导率值。
37.根据实施方案33至36中任一项所述的用途，其中所述高或中等电导率水溶液包含氨基酸。
38.根据实施方案37所述的用途，其中所述高或中等电导率水溶液包含组氨酸。
39.根据实施方案37的用途，其中所述高或中等电导率水溶液包含组氨酸和Tris。
40.根据前述实施方案中任一项的用途，其中进行至少一种另外的层析方法/步骤。
41.根据实施方案40的用途，其中进行另外的离子交换层析法/步骤。
42.根据实施方案41的用途，其中进行另外的阴离子交换层析法/步骤。
43.根据实施方案40的用途，其中进行另外的阳离子交换层析法/步骤。
44.根据实施方案40的用途，其中进行另外的阴离子交换层析法/步骤和另外的阳离子交换层析法/步骤。
45.根据实施方案40的用途，其中所述用途没有疏水性相互作用层析方法/步骤。
46.根据前述实施方案中任一项的用途，其中所述人IgG4同种型抗体是针对P-选择蛋白的抗体或针对因子IXa和因子X的抗体或针对IL-13的抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体。
47.根据实施方案1-45的用途，其中人IgG1同种型抗体是针对乙型流感的抗体或针对VEGF-A的抗体或针对CD22的抗体或针对HER3和EGFR的抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体或针对Her2的抗体或针对Ang2和VEGF-A的抗体或针对癌胚抗原(CEA)和CD3的抗体。
48.生产人IgG同种型抗体的方法，包括
a)培养包含编码人IgG同种型抗体的核酸的细胞，
b)从细胞或培养基中回收人IgG同种型抗体，
c)将人IgG同种型抗体与亲和层析材料接触，
d)用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料，
e)从亲和层析材料中回收人IgG同种型抗体，
从而产生人IgG同种型抗体。
49.生产人IgG4同种型抗体的方法，包括
a)培养包含编码人IgG4同种型抗体的核酸的细胞，
b)从细胞或培养基中回收人IgG4同种型抗体，
c)将人IgG4同种型抗体与亲和层析材料接触，
d)用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料，
e)从亲和层析材料中回收人IgG4同种型抗体，
从而产生人IgG4同种型抗体。
50.根据实施方案48所述的方法，其中所述人IgG同种型抗体是人IgG4同种型抗体或人IgG1同种型抗体。
51.根据实施方案48所述的方法，其中所述人IgG同种型抗体是人IgG4同种型抗体或人IgG1同种型抗体，所述抗体在其Fab片段中没有糖基化的糖基化位点/具有恰好一个糖基化位点(根据Kabat编号在位置Asn297)。
52.根据实施方案48所述的方法，其中所述低电导率水溶液具有约0.5mS/cm或更小的电导率值。
53.根据实施方案52所述的方法，其中所述低电导率水溶液具有从约0.03μS/cm至约0.5mS/cm的电导率值。
54.根据实施方案53所述的方法，其中所述低电导率水溶液具有从约0.05μS/cm至约0.35mS/cm的电导率值。
55.根据实施方案54所述的方法，其中所述低电导率水溶液不是去离子水。
56.根据实施方案48至55中任一项的方法，其中所述亲和层析是蛋白A亲和层析或蛋白G亲和层析或单链Fv配体(KappaSelect)亲和层析。
57.根据实施方案56的方法，其中所述亲和层析是蛋白A亲和层析。
58.根据实施方案56的方法，其中蛋白A亲和层析选自MabSelectSure亲和层析，ProSep vA亲和层析，Poros Mab Capture A亲和层析，ProSep Ultra Plus亲和层析，MabSelect SuRe LX，MabSelect，Eshmuno A，Toyopearl AF-rProtein A-650F；ToyopearlAF-rProtein A HC-650HF)。
59.根据实施方案48或49的方法，其中宿主细胞蛋白的含量降低。
60.根据实施方案59中任一项的方法，其中所述宿主细胞蛋白是中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞蛋白。
61.根据实施方案60所述的方法，其中所述宿主细胞蛋白是磷脂酶。
62.根据实施方案61所述的方法，其中所述宿主细胞蛋白是磷脂酶A，磷脂酶B，磷脂酶C或磷脂酶D。
63.根据实施方案62中任一个所述的方法，其中所述宿主细胞蛋白是磷脂酶B样2(PLBL2)。
64.根据实施方案60所述的方法，其中所述宿主细胞蛋白是磷脂酶B样2(PLBL2)或簇蛋白。
65.根据实施方案48至64中任一项所述的方法，其中所述低电导率水溶液含有三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)。
66.根据实施方案65所述的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.1mM至约10mMTris。
67.根据实施方案66所述的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.1mM至约8mMTris。
68.根据实施方案67所述的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.5mM至约6.5mM Tris。
69.根据实施方案68所述的方法，其中所述低电导率水溶液包含约2mM Tris。
70.根据实施方案65-69的方法，其中低电导率水溶液含有磷酸钾。
71.根据实施方案70的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.2mM至约5mM磷酸钾。
72.根据实施方案71的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.05mM至约2mM磷酸钾。
73.根据实施方案72所述的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.5mM磷酸钾。
74.根据实施方案48至73中任一项所述的方法，其中所述低电导率水溶液具有约7或更高的pH。
75.根据实施方案74所述的方法，其中所述低电导率水溶液具有约7.5或更高的pH。
76.根据实施方案75所述的方法，其中所述低电导率水溶液具有约7至约9.5的pH。
77.根据实施方案76所述的方法，其中所述低电导率水溶液具有约7.5至约8.5的pH。
78.根据实施方案77所述的方法，其中所述电导率水溶液具有约8的pH。
79.根据实施方案48或49的方法，其中所述方法另外包括在用低电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料之前或之后，用高电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料。
80.根据实施方案79所述的方法，其中所述方法另外包括在用低电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料之前用高电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料。
81.根据实施方案79的方法，其中所述方法另外包括在用低电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料之前或之后，用高电导率水溶液和/或用中等电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料。
82.根据实施方案79的方法，其中所述方法另外包括在用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料之前，用高电导率水溶液和/或用中等电导率水溶液洗涤亲和层析材料。
83.根据实施方案79至82中任一项所述的方法，其中所述高电导率水溶液具有约20mS/cm或更高的电导率值。
84.根据实施方案83所述的方法，其中所述高电导率水溶液具有从约20mS/cm至约100mS/cm的电导率值。
85.根据实施方案81至82中任一项所述的方法，其中所述中等电导率水溶液具有大于0.5mS/cm至小于20mS/cm的电导率值。
86.根据实施方案79至85中任一项所述的方法，其中所述高或中等电导率水溶液包含氨基酸。
87.根据实施方案86所述的方法，其中所述高或中等电导率水溶液包含组氨酸。
88.根据实施方案86或87所述的方法，其中所述高或中等电导率水溶液包含组氨酸和Tris。
89.根据实施方案48或49的方法，其中在步骤e)之后进行至少一个另外的层析方法/步骤。
90.根据实施方案89的方法，其中在步骤e)之后进行另外的离子交换层析法/步骤。
91.根据实施方案90的方法，其中在步骤e)之后进行另外的阴离子交换层析法/步骤。
92.根据实施方案90的方法，其中在步骤e)之后进行另外的阳离子交换层析法/步骤。
93.根据实施方案90的方法，其中在步骤e)之后进行另外的阴离子交换层析法/步骤和另外的阳离子交换层析法/步骤。
94.根据实施方案48或49的方法，其中所述方法没有疏水性相互作用层析方法/步骤。
95.根据实施方案49-94中任一项的方法，其中所述人IgG4同种型抗体是针对P-选择蛋白的抗体或针对因子IXa和因子X的抗体或针对IL-13的抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体。
96.根据实施方案48或50-94中任一项的方法，其中所述人IgG1同种型抗体是针对乙型流感的抗体或针对VEGF-A的抗体或针对CD22的抗体或针对HER3和EGFR的双特异性抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体或针对Her2的抗体或针对Ang2和VEGF-A的双特异性抗体或针对癌胚抗原(CEA)和CD3的抗体。
97.从样品中纯化人IgG同种型抗体的方法，包括以下步骤：
a)提供包含人IgG同种型抗体的样品，
b)用亲和层析法/步骤纯化人IgG同种型抗体，包括用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料。
98.根据实施方案97的方法，其中所述人IgG同种型抗体是人IgG4同种型抗体或人IgG1同种型抗体。
99.根据实施方案98的方法，其中所述人IgG同种型抗体是人IgG4同种型抗体或人IgG1同种型抗体，所述抗体在其Fab片段中没有糖基化的糖基化位点/具有恰好一个糖基化位点(根据Kabat编号在位置Asn 297处)。
100.根据实施方案97至99中任一项所述的方法，其中所述低电导率水溶液具有约0.5mS/cm或更小的电导率值。
101.根据实施方案100所述的方法，其中所述低电导率水溶液具有从约0.03μS/cm至约0.5mS/cm的电导率值。
102.根据实施方案101所述的方法，其中所述低电导率水溶液具有从约0.05μS/cm至约0.35mS/cm的电导率值。
103.根据实施方案102所述的方法，其中所述低电导率水溶液不是去离子水。
104.根据实施方案97至104中任一项所述的方法，其中亲和层析是蛋白A亲和层析或蛋白G亲和层析或单链Fv配体(KappaSelect)亲和层析。
105.根据实施方案104所述的方法，其中亲和层析是蛋白A亲和层析。
106.根据实施方案105的方法，其中蛋白A亲和层析选自MabSelectSure亲和层析，ProSep vA亲和层析，Poros Mab Capture A亲和层析，ProSep Ultra Plus亲和层析，MabSelect SuRe LX，MabSelect，Eshmuno A，Toyopearl AF-rProtein A-650F；ToyopearlAF-rProtein A HC-650HF)。
107.根据实施方案97-106中任一项的方法，其中宿主细胞蛋白的含量降低。
108.根据实施方案107的方法，其中所述宿主细胞蛋白是中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞蛋白。
109.根据实施方案108所述的方法，其中所述宿主细胞蛋白是磷脂酶。
110.根据实施方案109所述的方法，其中所述宿主细胞蛋白是磷脂酶A，磷脂酶B，磷脂酶C或磷脂酶D.
111.根据实施方案110中任一个所述的方法，其中所述宿主细胞蛋白是磷脂酶B样2(PLBL2)。
112.根据实施方案107的方法，其中所述宿主细胞蛋白是磷脂酶B样2(PLBL2)或簇蛋白。
113.根据实施方案97至112中任一项所述的方法，其中所述低电导率水溶液含有三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)。
114.根据实施方案113所述的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.1mM至约10mM Tris。
115.根据实施方案114所述的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.1mM至约8mM Tris。
116.根据实施方案115所述的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.5mM至约6.5mM Tris。
117.根据实施方案116所述的方法，其中所述低电导率水溶液包含约2mM Tris。
118.根据实施方案113至117中任一项所述的方法，其中所述低电导率水溶液含有磷酸钾。
119.根据实施方案118所述的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.2mM至约5mM磷酸钾。
120.根据实施方案119所述的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.2mM至约2mM磷酸钾。
121.根据实施方案120所述的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.5mM磷酸钾。
122.根据实施方案97至121中任一项所述的方法，其中所述低电导率水溶液具有约7或更高的pH。
123.根据实施方案122所述的方法，其中所述低电导率水溶液具有约7.5或更高的pH。
124.根据实施方案123所述的方法，其中所述低电导率水溶液具有约7至约9.5的pH。
125.根据实施方案124所述的方法，其中所述低电导率水溶液具有约7.5至约8.5的pH。
126.根据实施方案125所述的方法，其中所述电导率水溶液具有约8的pH。
127.根据实施方案97到126任一项所述的方法，其中所述方法另外包括在用低电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料之前或之后，用高电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料。
128.根据实施方案127所述的方法，其中所述方法另外包括在用低电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料之前用高电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料。
129.根据实施方案127的方法，其中所述方法另外包括在用低电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料之前或之后，用高电导率水溶液和/或用中等电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料。
130.根据实施方案127的方法，其中所述方法另外包括在用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料之前，用高电导率水溶液和/或用中等电导率水溶液洗涤亲和层析材料。
131.根据实施方案127至130中任一项所述的方法，其中所述高电导率水溶液具有约20mS/cm或更高的电导率值。
132.根据实施方案131所述的方法，其中所述高电导率水溶液具有从约20mS/cm至约100mS/cm的电导率值。
133.根据实施方案129或130所述的方法，其中所述中等电导率水溶液具有大于0.5mS/cm至小于20mS/cm的电导率值。
134.根据实施方案127至133中任一项所述的方法，其中所述高或中等电导率水溶液包含氨基酸。
135.根据实施方案134所述的方法，其中所述高或中等电导率水溶液包含组氨酸。
136.根据实施方案134所述的方法，其中所述高或中等电导率水溶液包含组氨酸和Tris。
137.根据实施方案97或98的方法，其中在步骤b)之后进行至少一个另外的层析方法/步骤。
138.根据实施方案137的方法，其中在步骤b)之后进行另外的离子交换层析法/步骤。
139.根据实施方案138的方法，其中在步骤b)之后进行另外的阴离子交换层析法/步骤。
140.根据实施方案138的方法，其中在步骤b)之后进行另外的阳离子交换层析法/步骤。
141.根据实施方案138的方法，其中在步骤b)之后进行另外的阴离子交换层析法/步骤和另外的阳离子交换层析法/步骤。
142.根据实施方案97-141任一项的方法，其中所述方法没有疏水性相互作用层析方法/步骤。
143.根据实施方案97或98的方法，其中所述人IgG4同种型抗体是针对P-选择蛋白的抗体或针对因子IXa和因子X的抗体或针对IL-13的抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体。
144.根据实施方案97或98的方法，其中所述人IgG1同种型抗体是针对乙型流感的抗体或针对VEGF-A的抗体或针对CD22的抗体或针对HER3和EGFR的(双特异性)抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体或针对Her2的抗体或针对Ang2和VEGF-A的双特异性抗体或针对癌胚抗原(CEA)和CD3的双特异性抗体。
145.低电导率水溶液在蛋白A层析的洗涤步骤中降低宿主细胞蛋白的含量的用途，其中蛋白A层析用于纯化人IgG4或IgG1同种型抗体，其中低电导率水溶液具有约0.5mS/cm或更小的电导率值。
146.产生人IgG4或IgG1同种型抗体的方法，包括以下步骤：
a)培养包含编码人IgG4或IgG1同种型抗体的核酸的细胞，
b)从细胞或培养基中回收人IgG4或IgG1同种型抗体，
c)使人IgG4或IgG1同种型抗体与蛋白A层析材料接触，
d)用低电导率水溶液洗涤蛋白A层析材料，其中低电导率水溶液具有约0.5mS/cm或更小的电导率值，
e)从蛋白A层析材料中回收人IgG4或IgG1同种型抗体
从而产生人IgG4或IgG1同种型抗体。
147.从样品中纯化人IgG4或IgG1同种型抗体的方法，包括以下步骤：
a)提供包含人IgG4或IgG1同种型抗体的样品，
b)用蛋白A层析法/步骤纯化人IgG4或IgG1同种型抗体，包括用低电导率水溶液洗涤蛋白A层析材料，其中低电导率水溶液具有约0.5mS/cm或更小的电导率值。
148.根据实施方案5至7中任一项所述的用途，其中所述低电导率水溶液是去离子水。
149.根据实施方案54所述的方法，其中所述低电导率水溶液是去离子水。
序列表描述
SEQ ID NO：01 <VEGF>的可变重链结构域VH
SEQ ID NO：02 <VEGF>的可变轻链结构域VL
SEQ ID NO：03 <ANG-2>的可变重链结构域VH
SEQ ID NO：04 <ANG-2>的可变轻链结构域VL
SEQ ID NO：05 抗β淀粉状蛋白抗体(IgG1同种型)的可变重链结构域VH，
SEQ ID NO：06 抗β淀粉状蛋白抗体(IgG1同种型)的可变轻链结构域VL
SEQ ID NO：07 抗P-选择蛋白抗体的可变重链结构域VH1
SEQ ID NO：08 抗P-选择蛋白抗体的可变重链结构域VH2
SEQ ID NO：09 抗P-选择蛋白抗体的可变重链结构域VH3
SEQ ID NO：10 抗P-选择蛋白抗体的可变轻链结构域VL1
SEQ ID NO：11 抗P-选择蛋白抗体的可变轻链结构域VL2
SEQ ID NO：12 抗P-选择蛋白抗体的可变轻链结构域VL3
实施例1
材料与方法
抗体
本发明使用许多示例性抗体来举例说明，所述抗体包括：以如WO 2005/100402或SEQ ID NO：07-12中所述的针对P-选择蛋白的抗体(抗P-选择蛋白抗体；inclacumab；IgG4同种型)；如WO2012/067176中所述的针对因子IXa和因子X的双特异性抗体(抗FIXa/X抗体；IgG4同种型)；针对Her2的抗体；如WO2011/117329或SEQ ID NO：01-SEQ ID NO：04中所述的针对Ang2和VEGF-A的双特异性抗体(抗-Ang2/VEGF-A抗体；vanucizumab；IgG1同种型)；如WO 2003/070760或SEQ ID NO：05至SEQ ID NO：06中所述的针对β淀粉状蛋白的抗体(抗β淀粉状蛋白抗体；gantenerumab；IgG1同种型)。本文还包括许多IgG1抗体和IgG4抗体，如以下实施例中所述。
总体宿主细胞蛋白(HCP)，磷脂酶B样蛋白2(PLBL2)和簇蛋白的检测方法
a)CHO HCP测定
方法样品中残余的CHO HCP含量通过在cobas e 411免疫测定分析仪(RocheDiagnostics)上的电化学发光免疫测定法(ECLIA)测定。
该测定基于夹心原理，使用来自绵羊的多克隆抗CHO HCP抗体。
第一次温育：来自15μL样品(纯净的和/或稀释的)的中国仓鼠卵巢宿主细胞蛋白(CHO HCP)和生物素缀合的多克隆CHO HCP特异性抗体形成夹心复合物，其通过生物素与链霉抗生物素蛋白的相互作用变得结合到链霉抗生物素蛋白包被的微粒。
第二次温育：加入用钌络合物(三(2,2’-联吡啶)钌(II)络合物)标记的多克隆CHOHCP特异性抗体后，在微粒上形成三元夹心复合物。
将反应混合物吸入测量室中，在其中将微粒通过磁力捕获到电极表面上。然后在洗涤步骤中除去未结合的物质。然后施加电压到电极，诱导化学发光发射，其由光电倍增管测量。
最终从已知浓度的CHO HCP标准曲线计算出测试样品中CHO HCP的浓度。
b)CHO PLBL2测定
方法样品中残余的中国仓鼠卵巢(CHO)磷脂酶B样2蛋白(PLBL2)含量通过cobas e411免疫测定分析仪(Roche Diagnostics)上的电化学发光免疫测定法(ECLIA)测定。
该测定基于夹心原理，使用来自小鼠的单克隆抗CHO PLBL2抗体。
在第一个温育步骤中，来自30μL样品(纯的和/或稀释的)的CHO PLBL2，生物素标记的单克隆CHO PLBL2特异性抗体和钌络合物(三(2,2’-联吡啶)钌(II)-络合物)标记的单克隆CHO PLBL2特异性抗体形成夹心复合物。
在加入链霉抗生物素蛋白包被的微粒后的第二步中，三元复合物通过生物素和链霉抗生物素蛋白的相互作用而结合到固相上。
将反应混合物吸入测量室中，在其中将微粒通过磁力捕获到电极表面上。然后在洗涤步骤中除去未结合的物质。向电极施加电压然后诱导化学发光，其由光电倍增管测量。
最终从已知浓度的CHO PLBL2标准曲线计算测试样品中CHO PLBL2的浓度。
c)簇蛋白测定
方法样品中残留的簇蛋白含量是根据制造商的说明书通过Merck Millipore(GyroMark HT Kit GYRCLU-37K)的商业测定法来确定的。
简言之，该测定法是基于夹心ELISA的，依次为：
1)将大鼠簇蛋白生物素化捕获抗体结合到Bioaffy 1000nL CD的链霉抗生物素蛋白包被的亲和柱上，
2)从样品捕获大鼠簇蛋白分子到抗簇蛋白抗体，
3)第二种染料标记的抗簇蛋白检测抗体与捕获的分子的结合，
4)使用Gyrolab Evaluator对大鼠簇蛋白进行定量。
实施例2
用蛋白A层析纯化抗-P选择蛋白抗体(IgG4同种型)
抗体：抗P-选择蛋白
通用层析条件
柱树脂：蛋白A材料“Mab Select SuRe”(GE-Healthcare)
Figure BDA0001550276460000331
高度：20.1cm，CV：15.79ml
装备：
Figure BDA0001550276460000332
Avant 150
流速：所有步骤中均为300厘米/小时
柱平衡(步骤1)后，将含有抗P-选择蛋白抗体的溶液施加于蛋白A亲和柱。在含有抗P-选择蛋白抗体的溶液中确定PLBL2的初始加载量：335ng PLBL2/mg抗体。在含有抗P-选择蛋白抗体的溶液中确定的簇蛋白的初始加载量：2874.8ng簇蛋白/mg抗体。在含有抗P-选择蛋白抗体的溶液中确定的CHOP的初始加载量：100971ng CHOP/mg抗体。
层析步骤按照以下一般方案进行：
步骤1：平衡：
步骤2：加载含有抗体的溶液
步骤3：洗涤I
步骤4：洗涤II
步骤5：洗涤III
步骤6：洗涤IV(额外洗涤)
步骤7：洗脱
从蛋白A亲和柱洗脱后，通过大小排阻层析法(SEC)和分光光度法(OD)分析测定蛋白质。
SEC:
树脂：TSK 3000(Tosoh)
柱：300×7,8毫米
流速：0.5毫升/分钟
缓冲液： 含有250mM氯化钾的200mM磷酸钾，调节至pH7.0
波长：280nm
OD：
比系数：1,54
波长：280nm减去320nm
蛋白A层析的特定缓冲液条件(抗P-选择蛋白抗体)
a)对照(只用平衡缓冲液洗涤)
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤5:洗涤III:---
步骤6:洗涤IV:---
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
b)低电导率洗涤(只用Tris缓冲液)
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤5:洗涤III:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤6:洗涤IV:2mM Tris,pH 8.0
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
c)低电导率洗涤(仅用磷酸钾(KP))
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤5:洗涤III:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤6:洗涤IV:0.5mM磷酸钾,pH 8.0
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
d)高电导率洗涤(只用Tris缓冲液)
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:700mM Tris,pH 7,2
步骤5:洗涤III:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤6:洗涤IV:---
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
e)低电导率洗涤(只用Tris缓冲液；pH 6.0)
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤5:洗涤III:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤6:洗涤IV:2mM Tris,pH 6.0
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
f)高电导率洗涤(只用组氨酸(His)/Tris缓冲液)
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:200mM His/1000mM Tris,pH 7,0
步骤5:洗涤III:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤6:洗涤IV:---
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
g)低电导率Tris+高电导率组氨酸(His)/Tris
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:200mM His/1000mM Tris,pH 7,0
步骤5:洗涤III:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤6:洗涤IV:2mM Tris,pH 8.0
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
h)低电导率磷酸钾(KP)+高电导率组氨酸(His)/Tris
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:200mM His/1000mM Tris,pH 7,0
步骤5:洗涤III:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤6:洗涤IV:0.5mM磷酸钾,pH 8.0
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
i)低电导率Tris+高电导率Tris
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:700mM Tris,pH 7,2
步骤5:洗涤III:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤6:洗涤IV:2mM Tris,pH 8.0
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
j)低电导率Tris；pH 6.0+高电导率Tris
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:700mM Tris,pH 7,2
步骤5:洗涤III:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤6:洗涤IV:2mM Tris,pH 6.0
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
结果:
Figure BDA0001550276460000371
实施例3
在蛋白A层析中纯化抗β淀粉状蛋白抗体(IgG1同种型)
一般条件是根据实施例2中描述的条件。
抗体：抗β淀粉状蛋白。
在含有抗β淀粉状蛋白抗体的溶液中测定的PLBL2的初始上样量：2019.7ngPLBL2/mg抗体。在含有抗β淀粉状蛋白抗体的溶液中确定CHOP的初始上样量：578908ngCHOP/mg抗体。
蛋白A层析的特定缓冲条件
a)对照(仅用平衡缓冲液洗涤)
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤5:洗涤III:---
步骤6:洗涤IV:---
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
b)低电导率洗涤(只用Tris缓冲液)
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤5:洗涤III:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤6:洗涤IV:2mM Tris,pH 8.0
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
c)高电导率洗涤(只用Tris缓冲液)
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:700mM Tris,pH 7,2
步骤5:洗涤III:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤6:洗涤IV:---
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
d)低电导率Tris+高电导率组氨酸(His)/Tris
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:200mM His/1000mM Tris,pH 7,0
步骤5:洗涤III:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤6:洗涤IV:2mM Tris,pH 8.0
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
Figure BDA0001550276460000391
实施例4
在蛋白A层析中纯化抗Her2抗体(IgG1同种型)
一般条件是根据实施例2中描述的条件。
抗体：抗Her2
在含有抗Her2抗体的溶液中测定的PLBL2的初始上样量：1662.5ng PLBL2/mg抗体。在含有抗Her2抗体的溶液中确定的CHOP的初始上样量：727070ng CHOP/mg抗体。
蛋白A层析的特定缓冲条件
a)对照(仅用平衡缓冲液洗涤)
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤5:洗涤III:---
步骤6:洗涤IV:---
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
b)低电导率洗涤(只用Tris缓冲液)
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤5:洗涤III:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤6:洗涤IV:2mM Tris,pH 8.0
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
c)高电导率洗涤(只用Tris缓冲液)
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:700mM Tris,pH 7,2
步骤5:洗涤III:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤6:洗涤IV:---
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
d)低电导率Tris+高电导率组氨酸(His)/Tris
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:200mM His/1000mM Tris,pH 7,0
步骤5:洗涤III:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤6:洗涤IV:2mM Tris,pH 8.0
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
Figure BDA0001550276460000411
实施例5
在蛋白A层析中纯化双特异性抗-Ang2/VEGF-A抗体(IgG1同种型)
一般条件是根据实施例2中描述的条件。
抗体：抗Ang2/VEGF-A
在含有双特异性抗Ang2/VEGF-A抗体的溶液中测定的PLBL2的初始上样量：919.7ng PLBL2/mg抗体。在含有抗-Ang2/VEGF-A的溶液中确定CHOP的初始上样量：682304ng CHOP/mg抗体。
蛋白A层析的特定缓冲条件
a)对照(仅用平衡缓冲液洗涤)
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤5:洗涤III:---
步骤6:洗涤IV:---
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
b)低电导率洗涤(只用Tris缓冲液)
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤5:洗涤III:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤6:洗涤IV:2mM Tris,pH 8.0
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
c)高电导率洗涤(只用Tris缓冲液)
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:700mM Tris,pH 7,2
步骤5:洗涤III:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤6:洗涤IV:---
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
d)低电导率Tris+高电导率组氨酸(His)/Tris
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:200mM His/1000mM Tris,pH 7,0
步骤5:洗涤III:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤6:洗涤IV:2mM Tris,pH 8.0
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
Figure BDA0001550276460000421
实施例6
在蛋白A层析中纯化双特异性抗FIXa/X抗体(IgG4同种型)
在两种不同的层析设置中测试抗FIXa/X抗体的纯化：
设置1
一般条件是根据实施例2中描述的条件。
抗体：抗FIXa/X
在含有抗FIXa/X抗体的溶液中确定的PLBL2的初始上样量：557ng PLBL2/mg抗体。在含有抗FIXa/X的溶液中测定CHOP的初始上样量：387377ng CHOP/mg抗体。
蛋白A层析的特定缓冲条件
a)高电导率洗涤(只用Tris缓冲液)
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:700mM Tris,pH 7,2
步骤5:洗涤III:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤6:洗涤IV:---
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
b)低电导率Tris+高电导率组氨酸(His)/Tris
步骤1:平衡:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤4:洗涤II:200mM His/1000mM Tris,pH 7,0
步骤5:洗涤III:25mM Tris,25mM NaCl,pH 7,0
步骤6:洗涤IV:2mM Tris,pH 8.0
步骤7:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
Figure BDA0001550276460000441
设置2
通用层析条件
柱树脂：蛋白A材料“Mab Select SuRe”(GE-Healthcare)
Figure BDA0001550276460000442
高度：20.1cm，CV：15.79ml
设备：
Figure BDA0001550276460000443
Avant 150
流速：所有步骤中均为300cm/h
柱的平衡(步骤1)后，将含有抗FIXa/X抗体的溶液施加到蛋白A亲和柱上。
在含有抗FIXa/X抗体的溶液中确定的PLBL2的初始上样：557ng PLBL2/mg抗体。
层析步骤按照以下一般方案进行：
步骤1:平衡:
步骤2:含有抗体的溶液的上样
步骤3:洗涤I
步骤4:洗涤II
步骤5:洗涤III(额外洗涤)
步骤6:洗脱
蛋白A层析的特定缓冲条件
a)高电导率洗涤(仅使用NaSO4缓冲液)
步骤1:平衡:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:450mM NaSO4,20mM NaAc,pH 4,8
步骤4:洗涤II:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤5:洗涤III:---
步骤6:洗脱:35mM乙酸,pH 4,0
b)低电导率洗涤(Tris 1mM)+高电导率洗涤(用NaSO4)
步骤1:平衡:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:450mM NaSO4,20mM NaAc,pH 4,8
步骤4:洗涤II:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤5:洗涤III:1mM Tris,pH 8.0
步骤6:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
c)低电导率洗涤(Tris 2mM)+高电导率洗涤(用NaSO4)
步骤1:平衡:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:450mM NaSO4,20mM NaAc,pH 4,8
步骤4:洗涤II:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤5:洗涤III:2mM Tris,pH 8.0
步骤6:洗脱:35mM乙酸,pH 4,0
d)低电导率洗涤(Tris 4mM)+高电导率洗涤(用NaSO4)
步骤1:平衡:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:450mM NaSO4,20mM NaAc,pH 4,8
步骤4:洗涤II:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤5:洗涤III:4mM Tris,pH 8.0
步骤6:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
e)低电导率洗涤(Tris 6mM)+高电导率洗涤(用NaSO4)
步骤1:平衡:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:450mM NaSO4,20mM NaAc,pH 4,8
步骤4:洗涤II:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤5:洗涤III:6mM Tris,pH 8.0
步骤6:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
f)低电导率洗涤(Tris 4mM,pH 7.8)+高电导率洗涤(用NaSO4)
步骤1:平衡:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:450mM NaSO4,20mM NaAc,pH 4,8
步骤4:洗涤II:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤5:洗涤III:4mM Tris,pH 7.8
步骤6:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
g)低电导率洗涤(Tris 4mM,pH 8.2)+高电导率洗涤(用NaSO4)
步骤1:平衡:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:450mM NaSO4,20mM NaAc,pH 4,8
步骤4:洗涤II:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤5:洗涤III:4mM Tris,pH 8.2
步骤6:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
h)低电导率洗涤(Tris 2mM)+高电导率洗涤(用组氨酸(His)/Tris 1M)
步骤1:平衡:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:200mM His/1000mM Tris,pH 7,0
步骤4:洗涤II:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤5:洗涤III:2mM Tris,pH 8.0
步骤6:洗脱:35mM乙酸,pH 4,0
i)低电导率洗涤(Tris 2mM)+高电导率洗涤(组氨酸(His)/Tris 0.85M)
步骤1:平衡:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:200mM His/850mM Tris,pH 7,0
步骤4:洗涤II:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤5:洗涤III:2mM Tris,pH 8.0
步骤6:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
j)低电导率洗涤(Tris 2mM)+高电导率洗涤(组氨酸(His)/Tris 0.7M)
步骤1:平衡:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:200mM His/700mM Tris,pH 7,0
步骤4:洗涤II:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤5:洗涤III:2mM Tris,pH 8.0
步骤6:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
k)低电导率洗涤(Tris 2mM)+高电导率洗涤(组氨酸(His)/Tris 0.55M)
步骤1:平衡:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤2:上样
步骤3:洗涤I:200mM His/550mM Tris,pH 7,0
步骤4:洗涤II:20mM NaPO4,pH 7,5
步骤5:洗涤III:2mM Tris,pH 8.0
步骤6:洗脱:50mM乙酸,pH 4,0
Figure BDA0001550276460000471
Figure BDA0001550276460000481
实施例7
一般程序/条件：
模拟细胞培养液
使用在无血清培养基中培养的未转染的CHO-DP12细胞产生空白收获的细胞培养液。使用代表性细胞培养方法以2L规模进行发酵。在发酵14天结束时，通过离心和无菌过滤收获细胞培养液。然后将收获的细胞培养液(HCCF)储存在-70℃直到实验。
纯化的PLBL2
具有C-末端六组氨酸标签的重组CHO PLBL2以35L规模的瞬时转染表达，并如前所述从收获的细胞培养液中纯化(Vanderlaan等，2015)。然后将纯化的PLBL2配制在PBS溶液中并储存在-70℃直到实验。
纯化的抗体
重组人源化抗体在CHO细胞中表达并使用柱层析纯化以确保PLBL2浓度低于20ng/mg。在开始每个研究之前，使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)将每种抗体缓冲液交换到PBS中。
蛋白A层析的上样材料的制备
为了在抗体间归一化蛋白A负荷中宿主细胞蛋白的群体和丰度，使用PBS将纯化的抗体稀释至相同浓度，并掺入来自非生产细胞系的HCCF以得到5g/L的最终抗体滴度。还制备了对照，其中加入PBS代替纯化的抗体以评估在不存在抗体的情况下与蛋白A树脂结合的非特异性宿主细胞蛋白。
填充床柱层析
所有填充床柱层析实验使用0.66cm内径×20cm床高MabSelect SuRe(GEHealthcare)蛋白A树脂柱进行。对于每次纯化，首先将柱用25mM tris，25mM NaCl，pH7.7(平衡缓冲液)平衡3个柱体积(CV)。然后将蛋白A负载施加至30g抗体/L树脂的目标负载密度，之后用平衡缓冲液洗涤柱3个CV，3个CV不同类型洗涤缓冲液，并且再次用3个CV的平衡缓冲液洗涤柱。随后，用0.1至0.15M乙酸在低pH下洗脱抗体，并从洗脱峰开始时的0.5OD开始收集洗脱液合并物；在2.8个CV之后终止合并。对于用PBS掺杂的无效HCCF进行的对照运行，在洗脱阶段开始之后，从1CV到3.8CV开始产生2.8CV模拟洗脱合并物。在每次运行结束时，使用1.5M tris碱将每种蛋白A洗脱液滴定至pH 5.0。然后用0.1M氢氧化钠溶液清洗柱子。除了负载，第一次平衡洗涤和洗脱阶段(流速为15CV/h)之外，所有阶段的体积流速为20CV/h。
A)在蛋白A层析中纯化示例性抗体(IgG4同种型)抗体A
使用实施例7(如上所概述)的一般程序纯化抗体A(IgG4同种型)的具体洗涤缓冲液条件：
a)0.4M磷酸钾，pH7.0
b)25mM Tris，25mM NaCl，pH7.7
c)0.75M Arg-HCl，pH7.0
d)0.6M NaCl，pH7.0
e)去离子水
结果:
Figure BDA0001550276460000491
Figure BDA0001550276460000501
B)在蛋白A层析中纯化示例性抗体(IgG1同种型)抗体B
使用实施例7的一般程序纯化抗体B(IgG1同种型)的具体洗涤缓冲液条件：
a)去离子水
结果：
Figure BDA0001550276460000502
C)在蛋白A层析中纯化示例性抗体(IgG4同种型)抗体C
使用实施例7的一般程序纯化抗体C(IgG4同种型)的具体洗涤缓冲液条件：
0.4M磷酸钾,pH 7.0
25mM Tris,25mM NaCl,pH 7.7
0.75M Arg-HCl,pH 7.0
0.6M NaCl,pH 7.0
去离子水
结果:
Figure BDA0001550276460000503
Figure BDA0001550276460000511
D)在蛋白A层析中纯化示例性抗体(IgG1同种型)抗体D
使用实施例7的一般程序纯化抗体D(IgG1同种型)的具体洗涤缓冲液条件：
a)去离子水
Figure BDA0001550276460000512
E)在蛋白A层析中纯化示例性抗体(IgG1同种型)，抗体E
使用实施例7的一般程序纯化抗体E(IgG1同种型)的具体洗涤缓冲液条件：
a)0.4M磷酸钾，pH7.0
b)31mM Tris，pH8.5
c)55mM Tris，pH9.0
d)去离子水
结果：
Figure BDA0001550276460000513
Figure BDA0001550276460000521
F)在蛋白A层析中纯化示例性抗体(IgG1同种型)，抗体F使用实施例7的一般程序纯化抗体F的具体洗涤缓冲液条件：
a)25mM Tris，pH9.0
结果:
Figure BDA0001550276460000522
Figure IDA0001550276490000011
Figure IDA0001550276490000021
Figure IDA0001550276490000031
Figure IDA0001550276490000041
Figure IDA0001550276490000051
Figure IDA0001550276490000061
Figure IDA0001550276490000071

Claims (10)

1.低电导率水溶液在蛋白A层析的洗涤步骤中降低宿主细胞蛋白的含量的用途，其中蛋白A层析用于纯化人IgG4或IgG1同种型抗体，其中低电导率水溶液具有0.5mS/cm或更小的电导率值，其中所述宿主细胞蛋白是磷脂酶B样2(PLBL2)或簇蛋白，其中所述低电导率水溶液包含0.1mM至8mM Tris或0.05mM至2mM磷酸钾，其中所述低电导率水溶液具有7或更高的pH，其中所述人IgG4同种型抗体是针对P-选择蛋白的抗体或针对因子IXa和因子X的抗体或针对IL-13的抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体，并且其中所述人IgG1同种型抗体是针对乙型流感的抗体或针对VEGF-A的抗体或针对CD22的抗体或针对HER3和EGFR的双特异性抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体或针对Her2的抗体或针对Ang2和VEGF-A的双特异性抗体或针对癌胚抗原(CEA)和CD3的双特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述低电导率水溶液洗涤步骤之前或之后是高电导率水溶液洗涤步骤。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述高电导率水溶液具有20mS/cm或更高的电导率值。
4.根据权利要求2所述的用途，其中所述高电导率水溶液包含组氨酸。
5.产生人IgG4或IgG1同种型抗体的方法，包括以下步骤：
a)培养包含编码人IgG4或IgG1同种型抗体的核酸的细胞，
b)从细胞或培养基中回收人IgG4或IgG1同种型抗体，
c)使人IgG4或IgG1同种型抗体与蛋白A层析材料接触，
d)用低电导率水溶液洗涤蛋白A层析材料，其中所述低电导率水溶液具有0.5mS/cm或更小的电导率值，其中所述宿主细胞蛋白的量减少，并且其中所述宿主细胞蛋白是磷脂酶B样2(PLBL2)或簇蛋白，
e)从蛋白A层析材料中回收人IgG4或IgG1同种型抗体，
从而产生人IgG4或IgG1同种型抗体，
其中所述低电导率水溶液包含0.1mM至8mM Tris或0.05mM至2mM磷酸钾，其中所述低电导率水溶液具有7或更高的pH，其中所述人IgG4同种型抗体是针对P-选择蛋白的抗体或针对因子IXa和因子X的抗体或针对IL-13的抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体，并且其中所述人IgG1同种型抗体是针对乙型流感的抗体或针对VEGF-A的抗体或针对CD22的抗体或针对HER3和EGFR的双特异性抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体或针对Her2的抗体或针对Ang2和VEGF-A的双特异性抗体或针对癌胚抗原(CEA)和CD3的双特异性抗体。
6.从样品中纯化人IgG4或IgG1同种型抗体的方法，包括以下步骤：
a)提供包含人IgG4或IgG1同种型抗体的样品，
b)用蛋白A层析法/步骤纯化人IgG4或IgG1同种型抗体，包括用低电导率水溶液洗涤蛋白A层析材料，其中所述低电导率水溶液具有0.5mS/cm或更小的电导率值，其中所述宿主细胞蛋白的量减少，并且其中所述宿主细胞蛋白是磷脂酶B样2(PLBL2)或簇蛋白，
其中所述低电导率水溶液包含0.1mM至8mM Tris或0.05mM至2mM磷酸钾，其中所述低电导率水溶液具有7或更高的pH，其中所述人IgG4同种型抗体是针对P-选择蛋白的抗体或针对因子IXa和因子X的抗体或针对IL-13的抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体，并且其中所述人IgG1同种型抗体是针对乙型流感的抗体或针对VEGF-A的抗体或针对CD22的抗体或针对HER3和EGFR的双特异性抗体或针对β淀粉状蛋白的抗体或针对Her2的抗体或针对Ang2和VEGF-A的双特异性抗体或针对癌胚抗原(CEA)和CD3的双特异性抗体。
7.根据权利要求5至6中任一项所述的方法，其中所述方法另外包括用低电导率水溶液洗涤所述蛋白A层析材料之前或之后，用高电导率水溶液和/或用中等电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述高电导率水溶液具有20mS/cm或更高的电导率值。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述中等电导率水溶液具有从大于0.5mS/cm到小于20mS/cm的电导率值。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述高或中等电导率水溶液包含组氨酸。
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