KR20160044023A - 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용하는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항체 생산 부산물의 분리 - Google Patents

히드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용하는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항체 생산 부산물의 분리 Download PDF

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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 이중특이적 항체 생산에 특이적인 하나 이상의 부산물을 또한 포함하는 용액으로부터 이중특이적 항체를 분리하기 위한 히드록시아파타이트 크로마토그래피의 사용을 포함하는 방법에 관한 것이다. 이중특이적 항체의 생산에 특이적인 부산물 (이중특이적 항체 특이적 부산물, "BASB") 은 이중특이적 항체의 분절 및 항체의 더 무거운 분자량 변이체를 포함하며, 여기에서 분절 및/또는 변이체는 Fc 도메인을 포함하지만 원하는 이중특이적 항체에 의해 나타나는 2 가지 상이한 에피토프 및/또는 항원에 대한 친화도를 나타내지 않는다. 따라서, 본 공개의 방법은 이중특이적 항체를 그것의 BASB 중 하나 이상으로부터 분리하는 것을 포함한다. 본 공개의 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법은 단독으로 사용되거나 기술분야에 알려진 표준 정제 과정 및 단위 조작과 추가로 조합되어, 예를 들어, 치료적 및/또는 진단적 응용에 필수적인 이중특이적 항체의 순도 수준을 달성할 수 있다.

Description

히드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용하는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항체 생산 부산물의 분리 {SEPARATION OF BISPECIFIC ANTIBODIES AND BISPECIFIC ANTIBODY PRODUCTION SIDE PRODUCTS USING HYDROXYAPATITE CHROMATOGRAPHY}
본 발명은 이중특이적 항체 생산에 특이적인 하나 이상의 부산물을 또한 포함하는 용액으로부터 이중특이적 항체를 분리하기 위한 히드록시아파타이트 크로마토그래피의 사용을 포함하는 방법에 관한 것이다. 이중특이적 항체의 생산에 특이적인 부산물 (이중특이적 항체 특이적 부산물 (Bispecific Antibody Specific Byproducts), "BASB") 은 이중특이적 항체의 분절 및 항체의 더 무거운 분자량 변이체를 포함하며, 여기에서 분절 및/또는 변이체는 Fc 도메인을 포함하지만 원하는 이중특이적 항체에 의해 나타나는 2 가지 상이한 에피토프 및/또는 항원에 대한 친화성을 나타내지 않는다. 따라서, 본 발명의 방법은 이중특이적 항체를 그것의 BASB 중 하나 이상으로부터 분리하는 것을 포함한다. 발명의 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법은 단독으로 사용되거나, 예를 들어, 치료적 및/또는 진단적 응용에 필수적인 이중특이적 항체의 순도 수준을 달성하도록 기술분야에 알려진 표준 정제 과정 및 단위 조작과 추가로 조합될 수 있다.
이중특이적 항체의 치료 잠재성은 오래 전부터 인지되었다. 이중특이적 항체는 2 가지 항원 또는 2 가지 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 IgG 유사 플랫폼을 제공한다. 따라서, 이중특이적 항체는 적어도 2 가지 분자의 상호작용 및/또는 분자를 포함하는 적어도 2 가지 시스템의 상호작용을 조정하는 잠재적 도구를 제공한다. 그러한 조정은, 예를 들어, 인지된 항원, 항원들 및/또는 에피토프들이 세포의 표면에 발현되는 2 가지 세포의 상호작용의 조정일 수 있다. 이중특이적 항체의 치료적 용도의 예는, 예를 들어, 세포 신호전달의 조정 (예를 들어, 원하는 표면 수용체 또는 리간드의 상호작용을 촉진 또는 간섭하는 것에 의함) 및 암 요법 (예를 들어, 면역 세포를 암 세포에게 표적화하는 것을 보조함) 을 포함한다.
이중특이적 항체의 치료적 용도에 대한 관심에도 불구하고, 그것의 상업적 생산은 문제가 많은 것으로 증명되었다. 초기 시도들은 단일특이적, 2 가 항체를 각각 발현하는 2 가지 하이브리도마 세포주의 융합에 초점을 맞췄다 ("쿼드로마 기술 (quadroma technology)", 예를 들어, Milstein and Cuello, Nature 305(1983), 537-540 참조). 하지만 쿼드로마 발현된 항체 분자의 경우에, 발현된 분자가 2 가지 부모 중쇄 및 2 가지 부모 경쇄의 다양한 조합을 함유하는 것이 매우 명백했다. 모든 4 가지 부모 사슬의 동시 발현은 거의 동일한 분자의 10 가지 상이한 변이체의 혼합물을 초래하며, 이 때 10 가지 중 오직 1 가지 (즉, 발현된 모든 분자 중 오직 부수적 분획) 만이 원하는 이중특이적 활성을 나타내는데 필수적인 적절히 짝을 이룬 중쇄 및 경쇄를 함유했다 (예를 들어, Suresh et al., Methods Enzymol. 121(1986), 210-228 참조). 따라서, 생산 문제를 없애려는 시도에서 대안적인 이중특이적 항체-기반 구축물, 예를 들어, 항체 가변 도메인의 단일-사슬 융합물이 주목되었다. 그러나, 이들 포맷 중 다수는 원형적 항체 구조와 상당히 상이하고 치료적 난점 예컨대 불량한 약동학 특성 및/또는 효과기 활성의 상실 (예를 들어, Fc 도메인의 부재로 인한 것임) 을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 게다가, 많은 구축물이 또한 비-인간 또는 인공 도메인 예컨대 링커 영역의 존재로 인해 응집 경향 및 증가된 면역원성을 나타냈다.
대안 이중특이적 포맷의 제약에 비추어, 생산 곤란성에도 불구하고, 원형적 항체 구조 (특히, IgG 유사 구조) 를 갖는 이중특이적 항체에 대한 관심은 여전하다. IgG 유사 구조를 갖는 원하는 이중특이적 항체의 생산 동안 주로 2 가지 문제가 발생한다. 그러한 분자는 2 가지 상이한 중쇄 및 2 가지 상이한 경쇄의 적절한 연합을 요구하기 때문에, (1) 2 가지 상이한 중쇄의 이종이합체화를 동종이합체화보다 선호되는 반응으로서 유도하고, (2) 가능한 경쇄/중쇄 조합 상호작용 사이의 구별을 최적화하여 발현된 분자가 오직 원하는 경쇄/중쇄 상호작용을 함유하도록 하는 것이 필수적이다. 이들 2 가지 문제는 효과적으로 해결되었다.
첫째로, 2 가지 상이한 중쇄의 이종이합체화는 "놉 인투 홀 (Knobs into Holes)" 또는 "KiH" 방법을 이용하여 동종이합체화 상호작용보다 촉진되는 것으로 밝혀졌다. KiH 방법에서, 큰 아미노산 측쇄가 중쇄 중 하나의 CH3 도메인에 도입되며, 상기 측쇄는 다른 중쇄의 CH3 도메인에 있는 적절히 디자인된 공동에 꼭 들어맞는다 (예를 들어, Ridgeway et al., Protein Eng. 9(1996), 617-621 및 Atwell et al., J. Mol. Biol. 270(1997), 677-681 참조). 따라서, 중쇄의 이종이합체는 동종이합체보다 더 안정적인 경향이 있고, 발현된 폴리펩티드 중 더 큰 비율을 차지한다.
둘째로, 원하는 경쇄/중쇄 쌍의 연합은 경쇄와 중쇄 사이에 불변 또는 불변 및 가변 영역을 "교환 (swap)" 하는 이중특이적 항체 (Fab 영역) 의 하나의 Fab 의 수식에 의해 유도될 수 있다. 따라서, 수식된 Fab 도메인에서, 예를 들어, 중쇄는 CL-VH 또는 CL-VL 도메인을 포함할 것이고 경쇄는 CH1-VL 또는 CH1-VH 도메인을 각각 포함할 것이다. 이는 수식된 사슬 (즉, 수식된 경쇄 또는 중쇄) 의 중쇄/경쇄 Fab 부분과 표준/수식되지 않은 팔 (arm) 의 중쇄/경쇄 Fab 부분의 상호작용을 방지한다. 설명으로서, CL 도메인을 포함하는 수식된 팔의 Fab 도메인의 중쇄는 CL 도메인을 또한 포함하는 수식되지 않은 팔/Fab 도메인의 경쇄와 우선적으로 상호작용하지 않는다 (중쇄/경쇄의 "부적절한" 또는 원하지 않는 쌍형성을 방지함). "부적절한" 경쇄/중쇄의 연합을 방지하기 위한 이러한 기술은 "CrossMab" 기술로 명명되고, KiT 기술과 조합되었을 때, 원하는 이중특이적 분자의 현저히 향상된 발현을 초래한다 (예를 들어, Schaefer et al., PNAS 108(2011), 11187-11192 참고). 대안적으로 또는 부가적으로, 항체의 하나의 팔이 Fab 도메인이 scFab 또는 scFv 이도록 수식되어, 오직 하나의 "자유" 경쇄가 시스템에 남을 수 있다.
이중특이적 항체의 발현에서의 최근의 이점에도 불구하고, 그 분자의 사용은 그것의 생산과 특이적으로 연관되는 부산물 (이중특이적-항체 특이적 부산물, "BASB") 의 형성 및 원하는 분자로부터의 BASB 분리와 연관되는 문제로 인해 여전히 제한된다. 표준 항체의 정제와 비교할 때, 생산 매질로부터의 이중특이적 항체의 경제적 정제는 특별한 도전에 해당한다. 표준 항체의 생산은 동일한 중쇄/경쇄 서브유닛의 이합체화에 의존한다. 그와 대조적으로, 이중특이적 항체의 생산은 상이한 중쇄 뿐만 아니라 상이한 경쇄를 각각 포함하는 2 가지 상이한 중쇄/경쇄 서브유닛의 이합체화를 요구한다. 따라서, 이중특이적 항체 생산은 총 4 개의 펩티드 사슬의 적절한 상호작용을 요구한다. 따라서, 사슬 쌍형성오류 (예를 들어, 동일한 중쇄 펩티드의 동종이합체화 또는 부적절한 중쇄/경쇄 연합) 가 종종 관찰되며, 이는 상이한 항체 사슬의 불균형 발현으로 인한 불완전한 단백질 조립이다. 흔히 관찰되는 BASB 는 1/2 항체 (단일 중쇄/경쇄 쌍을 포함함) 및 3/4 항체 (단일 경쇄를 결여하는 완전한 항체를 포함함) 를 포함한다. 사용되는 이중특이적 형태에 따라 부가적 BASB 가 관찰될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체의 하나의 가변 도메인이 단일-사슬 Fab (scFab) 로서 구축되는 경우에, 5/4 항체 부산물 (부가적 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 포함함) 이 관찰될 수 있다. 해당 부산물은 보통 표준 항체 생산에서는 보이지 않는다.
더욱이, BASB 가 최종 정제 산물에 남는 경우에 BASB 는 특히 불리한 활성을 나타낼 수 있다. 표준 항체, 즉, 단일특이적 항체에 관하여, 상기 부산물은 적어도 하나의 기능적 항원 결합 자리를 함유한고 볼 수 있다. 그러므로, 단일특이적 항체 제형 중의 그러한 부산물은 아마도 전적이 아닌 경우 부분적으로 치료 기능적일 것이고, 따라서, 임의의 정제 계획 (scheme) 에서 거의 관심의 대상이 아니다. 그와 대조적으로, BASB 는, 이중특이적 포맷에 따라, 원하는 이중특이적 제형의 활성에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는 불순물에 해당한다. 따라서, 정제 동안 원하는 분자로부터의 그들의 분리는 매우 중요하게 된다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 기능은 2 가지 상이한 항원에 대해 결합 활성을 나타내는 단일 분자에 의존할 수 있다. 분자가 오직 하나의 표적 항원에 대해 결합 활성을 나타내는 경우 (예를 들어, 상기와 같은 1/2 또는 3/4 항체의 경우), 이러한 표적 항원에 대한 그것의 결합은 완전히 기능적인 이중특이적 항체의 결합을 차단하여, 잠재적으로 이중특이적 분자의 원하는 활성에 길항작용 (antagonizing) 할 것이다. 적어도, 이중특이적 항체 생산의 단일특이적 부산물은 분리되지 않으면 아마도 최종 이중특이적 제형의 효능을 감소시킬 것이다. 부가적으로, 본원에 기재된 바와 같은 BASB 중 다수는 펩티드-펩티드 상호작용을 정상적으로 촉진하는 노출된 영역을 가져서, 면역원성 및 응집 경향을 나타낸다.
불행하게도, 대부분의 상업적 항체 생산 및 정제 계획은 상기 특이적 부산물로부터 이중특이적 항체를 분리하는데 부적합하거나 그런 능력이 없다. 표준 항체 정제 계획은 보통 적어도 2 개의 구별되는 모드의 크로마토그래피를 수반하며, 즉, 보통 적어도 2 개의 크로마토그래피 메카니즘을 이용하여 부산물/불순물로부터 원하는 면역글로불린(들)을 분리한다. 첫번째 모드는 보통 정제될 단백질 (즉, 관심의 단백질) 과 부동화된 포획 시약 사이의 특이적 상호작용을 이용하는 친화도-기반 크로마토그래피이다. 친화도 시약은 정제 계획 중 가장 비싼 부분에 해당할 수 있기 때문에, 친화도 리간드의 사용을 감소시키고/거나 특별한 계획 (및 친화도 시약) 의 적용가능성을 다수의 산물에 걸쳐 최대화하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 정제에서 가장 흔히 사용되는 (그리고 광범위한 면역글로불린-기반 산물에 적용가능한) 친화도 리간드는 Fc-결합 또는 불변 도메인-결합제 예컨대 Protein A, Protein G, Protein L, KappaSelect™ 및 LamdaFabSelect™ 이다. 그러나, 이들 Fc- 또는 불변 도메인- 결합제의 분리 활성은, 중요하게, 이중특이적 항체 및 그것의 특이적 부산물 (즉, BASB) 에 의해 공유되는 Fc-, κ-, 및/또는 λ- 도메인의 존재에 기초한다. 따라서, Fc- 또는 불변 도메인- 친화도 리간드 단독으로는 이중특이적 항체를 BASB 로부터 정제하기에 불충분하고, 부가적인 친화도 기반 정제 및/또는 분자 특이적 (즉, 항원-특이적) 정제의 실시는 아마도 경제적으로 엄두를 못 낼 정도로 비싼 계획을 초래할 것이다.
추가로, 본 발명에 선행하는 기술에서의 이해에 기초하여, 상업적 항체 가공 계획에서 사용되는 기타 흔한 정제 과정의 부가는 또한 이중특이적 항체를 BASB 로부터 만족스럽게 분리하기에 충분하다고 여겨지지 않을 것이다. 상업적 항체 정제에서 친화도 크로마토그래피와 함께 사용되는 가장 흔한 정제 과정은 관심의 단백질을 원하지 않는 부산물/불순물로부터 크기, 전하 (예를 들어, 등전점 또는 "IEP"), 용해도, 및/또는 소수성 정도의 차이에 기초하여 분리하는 표준 크로마토그래피 방법이다. 그러한 방법은 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 부동화된 금속 친화도 크로마토그래피, 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 포함한다. 그러나, 표준 프로토콜을 사용하는 이들 흔한 크로마토그래피 과정은 이중특이적 항체를 BASB 로부터 분리하는데 부적합하다: 크기 배제 크로마토그래피는 경제적으로 대규모 정제에서 실현가능하지 않고 이중특이적 항체와 BASB 사이의 IEP 의 차이는 대개 이온-교환 크로마토그래피로 그들을 분리하기에 너무 작다고 여겨졌다.
그러므로, 항체 생산에 특이적인 부산물 (예를 들어, Fc 함유 항체 분절) 을 포함하는 용액으로부터 항체를 분리하기 위한 알려진 방법은 이중특이적 항체의 정제에 비효과적이고/거나 경제적인 이유로 바람직하지 않을 수 있다 (예를 들어, 부가적 친화도 크로마토그래피 단계의 사용). 따라서, 생산 용액으로부터 (특히 그안에 함유된 BASB 로부터) 이중특이적 항체를 정제하기 위한 신규한 및/또는 개선된 계획으로서, 진단 및 치료 제품의 생산을 위한 바이오기술 산업의 요구조건 (예를 들어, 효과적인 비용, 산출률 및 산물 순도를 나타냄) 을 만족시킬 수 있는 계획에 대한 필요가 존재한다.
본 발명은 이중특이적 항체 및 이중특이적 항체의 생산 (예를 들어, 재조합 생산) 에 특이적인 하나 이상의 부산물을 함유하는 용액으로부터 이중특이적 항체를 분리하기 위한 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용하는 방법에 관한 것이다. 이중특이적 항체의 생산 (예를 들어, 재조합 생산) 에 특이적인 부산물 (또한 본원에서 이중특이적 항체 특이적 부산물, "BASB" 로서 언급됨) 은 원하는 이중특이적 활성을 결여하는 이중특이적 항체의 더 높은 또는 더 낮은 분자량 폴리펩티드 변이체이다. 예를 들어, BASB 는 이중특이적 항체에 의해 인지되는 2 가지 에피토프 또는 항원 중 오직 하나에 대해 특이성을 나타내고/거나 이중특이적 항체에 의해 인지되는 에피토프 또는 항원 중 하나 또는 둘 모두에 대해 크게 감소된 친화도를 나타낼 수 있다. 전형적인 BASB 는 (i) 1/2 항체 (단일 중쇄/경쇄 쌍을 가짐) 및 3/4 항체 (항체 중쇄들의 이종- 또는 동종-이합체 및 단일 항체 경쇄를 가짐) 를 포함하나 그에 제한되지 않는, 이중특이적 항체의 분절 (즉, 더 낮은 분자량 펩티드 또는 폴리펩티드 변이체); 및 (ii) 5/4 항체 (항체 중쇄들 (그 중 하나는 항체 scFab 또는 scFv 분절을 포함함) 의 이종이합체 및 2 개의 항체 경쇄들을 가짐) 를 포함하나 그에 제한되지 않는, 더 높은 분자량 폴리펩티드 변이체를 포함한다 (예를 들어, 도 1 참조). 특히, 발명의 방법은 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를, 또한 Fc 도메인을 포함하는 하나 이상의 BASB 로부터 분리하기 위한 것이다.
본 발명자들은 놀랍게도 본원에 기재된 바와 같은 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법이 산물 피드 스트림에서 Fc 도메인을 포함하는 원하는 이중특이적 항체를, 또한 Fc 도메인을 포함하는 하나 이상의 BASB 로부터 분리할 수 있다는 것을 발견했다. 그러므로 발명의 방법은 그렇지 않은 경우 이중특이적 항체를 BASB 로부터 분리하는데 불충분한 단위 조작을 포함하는 표준 항체 정제 계획과의 조합으로 특히 유용할 수 있다. 본원에 기재된 방법은 또한 표준 항체 정제 과정과의 조합으로 최종 산물 스트림 (이중특이적 항체를 함유함) 을 최종 제형 및/또는 순도로 만드는데 특히 유용할 수 있다.
본 발명은 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 그 이중특이적 항체를 함유하는 용액으로부터 분리하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (a) 용액을 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계, (b) 이중특이적 항체를 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질에 흡착시키는 단계, 및 (c) 이중특이적 항체를 클로라이드 이온의 존재 하에 히드록시아파타이트 매질로부터 용출시키는 단계를 포함하며, 여기에서 이중특이적 항체를 함유하는 용액은 (i) 이중특이적 항체의 하나 이상의 분절 (이러한 분절도 또한 Fc 도메인을 포함함) 및/또는 (ii) 이중특이적 항체의 분자량보다 큰 분자량을 갖고 상기 이중특이적 항체의 2 개의 중쇄 중 적어도 하나를 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 (이러한 하나 이상의 폴리펩티드도 또한 Fc 도메인을 포함함) 를 추가로 함유 또는 포함한다. 그와 같이, 본 발명은 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 그 이중특이적 항체를 함유하는 용액으로부터 분리하기 위한 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질의 용도를 또한 망라하며, 상기 용도는 (a) 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질을 용액과 접촉시키는 단계, (b) 이중특이적 항체를 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질에 흡착시키는 단계, 및 (c) 클로라이드 이온의 존재 하에 히드록시아파타이트 매질로부터 이중특이적 항체를 용출시키는 단계를 포함하며, 여기에서 이중특이적 항체를 함유하는 용액은 (i) 이중특이적 항체의 하나 이상의 분절 (이러한 분절도 또한 Fc 도메인을 포함함) 및/또는 (ii) 상기 이중특이적 항체의 분자량보다 큰 분자량을 갖고 상기 이중특이적 항체의 2 개의 중쇄 중 적어도 하나를 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 (이러한 하나 이상의 폴리펩티드도 또한 Fc 도메인을 포함함) 를 추가로 함유한다.
이중특이적 항체 및 하나 이상의 BASB 를 함유하는 용액은 크로마토그래피 매질에 대한 이중특이적 항체 및/또는 이중특이적 항체 및 하나 이상의 BASB 의 결합을 허용하는 조건 하에 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 바람직하게는, 이중특이적 항체 및 하나 이상의 BASB 의 결합에 적합한 조건은 용액이 낮은 전도성 값을 갖는 조건이다. 본원에 공개된 방법에 적합한 낮은 전도성 값을 갖는 용액은 전형적으로 약 13 mS/cm 또는 그 이하의 값을 갖는다. 본원에 공개된 방법에 적합한 낮은 전도성 값을 갖는 용액은 또한 약 10.6 mS/cm 또는 그 이하, 또는 약 8.5 mS/cm 또는 그 이하의 전도성 값을 가질 수 있다. 낮은 전도성 값을 갖는 용액의 비제한적 예는 약 1 mM 내지 약 20 mM 범위, 바람직하게는 약 10 mM 농도의 포스페이트 이온; 약 0.001 mM 내지 약 0.5 mM 범위, 바람직하게는 약 0.1 mM 농도의 칼슘 이온; 및 약 10 mM 내지 약 200 mM 범위, 바람직하게는 약 50 mM 농도의 클로라이드 이온을 포함하는 pH 약 6.5 내지 8.0 의 완충 용액을 포함한다. 발명의 방법에서 사용하기 위한 낮은 전도성 값을 갖는 용액은 pH 값 약 6.5 내지 7.5, 포스페이트 이온 농도 적어도 10 mM, 칼슘 이온 농도 적어도 0.1 mM 및 클로라이드 이온 농도 약 50 mM 내지 약 500 mM 을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 발명의 방법에서 사용하기 위한 낮은 전도성 값을 갖는 용액은 pH 값 약 6.5 내지 7.5, 포스페이트 이온 농도 약 10 mM, 칼슘 이온 농도 약 0.1 mM 및 클로라이드 이온 농도 약 50 mM 내지 약 500 mM 을 가질 수 있다. 용액 중 포스페이트 이온은 기술분야에 알려지고/거나 본원에 기재된 임의의 적합한 포스페이트 염, 또는 그들의 조합에 의해 제공될 수 있다. 본원의 방법에 따른 용액에서 사용하기에 적합한 포스페이트 염의 비제한적 예는 NaH2PO4, Na2HPO4, KH2PO4 및 K2HPO4 를 포함한다. 용액 중 칼슘 이온은 기술분야에 알려지고/거나 본원에 기재된 임의의 적합한 칼슘 염, 또는 그들의 조합에 의해 제공될 수 있다. 본원의 방법에 따른 용액에서 사용하기에 적합한 칼슘 염의 비제한적 예는 CaCl2 를 포함한다. 용액 중 클로라이드 이온은 기술분야에 알려지고/거나 본원에 기재된 임의의 적합한 클로라이드 염, 또는 그들의 조합에 의해 제공될 수 있으며, 그 예는 칼슘 이온 농도가 본원에 명시된 범위에서 유지된다면 칼슘 이온을 제공하는데 사용되는 염을 포함한다. 발명의 방법에 따른 용액에서 사용하기에 적합한 클로라이드 염의 비제한적 예는 NaCl, 및 KCl 을 포함한다. 이들 구현예에서 사용하기 위한 클로라이드 이온 제공 염의 예시적 조합은 NaCl, CaCl2, 및 KCl 을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질에 대한 그들의 초기 결합을 허용하기에 적합한 조건의 이중특이적 항체 및 하나 이상의 BASB 를 함유하는 용액은 (이중특이적 항체 및 하나 이상의 BASB 에 더하여) pH 약 6.5 내지 7.5 에서 약 10 mM NaH2PO4, 약 50 mM NaCl, 20 mM MES, 및 약 0.1 mM CaCl2 를 포함하는 용액이다. 기술분야에 알려진 바와 같이, 이 단락에서 구체적으로 언급된 구현예를 포함하여, 결합 완충액은 단독으로 (이중특이적 항체 및 하나 이상의 BASB 없음) 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질을 위한 평형 완충액으로서 및/또는 크로마토그래피 과정의 하나 이상의 단계에서의 세정 완충액으로서 사용될 수 있다.
이중특이적 항체의 용출은 오로지 클로라이드 이온의 농도를 증가시킴으로써 달성된다. 용출은 낮은 출발 전도성을 갖는 용출 완충액으로 실행되며, 여기에서 클로라이드 이온의 농도는 후속적으로 꾸준히 증가된다. 바로 위에 기재된 낮은 전도성을 갖는 결합 용액 (즉, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질에 대한 그들의 결합을 허용하는 조건의 이중특이적 항체 및 하나 이상의 BASB 를 함유하는 용액) 의 선별 조건은 발명의 용출 완충액 (즉, 또한 낮은 출발 전도성을 가짐) 에 관한 출발 조성의 선별에 동일하게 적용된다. 따라서, 용출 완충액의 출발 조성은 바로 위에 또는 본원의 다른 곳에 기재된 결합 용액/결합 완충액의 조성과 동일 또는 상이할 수 있다. 특정 구현예에서, 용출 완충액의 출발 조성은 결합 용액/결합 완충액의 조성과 동일하다. 기타 구현예에서, 용출 완충액의 출발 조성은 결합 용액/결합 완충액의 조성과 상이하다. 용출 완충액은 바람직하게는 포스페이트 및 클로라이드 이온 둘 모두를 함유한다. 특정 구현예에서, 용출 완충액은 pH 약 6.5 내지 7.5 에서 약 10 mM NaH2PO4, 약 50 mM NaCl, 약 20 mM MES, 및 약 0.1 mM CaCl2 의 출발 조성을 갖는다.
본 발명은 이중특이적 항체를 크로마토그래피 매질로부터 용출시키기 위해 용출 완충액 중 클로라이드 이온의 농도를 증가시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 클로라이드 이온 농도는 선형 기울기 (linear gradient), 실행된 단계 기울기 (implemented step gradient) (예를 들어, 도 6 에 나타난 증가하는 클로라이드 이온의 실행된 단계 기울기 참조), 또는 이들 2 개의 기울기의 조합에 따라 증가될 수 있다. 이중특이적 항체를 크로마토그래피 매질로부터 용출시키기 위한 및/또는 이중특이적 항체를 BASB 로부터 분리하기 위한 (즉, 하나를 용출시키는 한편 다른 하나를 매질에 결합된 채 유지하기 위한) 기울기의 최적화는 본원에 함유된 교시에 비추어 통상의 기술자의 능력 범위 내이다. 용출 완충액 중 클로라이드 이온의 농도는 하나 이상의 클로라이드 염의 농도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 클로라이드 이온의 농도를 증가시키기 위해 용출 완충액에 첨가될 수 있는 클로라이드 염의 비제한적 예는 NaCl 및 KCl 을 포함한다. 단백질 크로마토그래피 분야에서 이해되는 바와 같이, 발명의 과정 동안 하나 이상의 용액으로부터 칼슘 및 포스페이트의 침전을 방지하기 위해 칼슘 및 포스페이트 이온의 상대 농도가 모니터링 또는 평가되어야 한다. 특정 구현예에서, 용출 완충액 중 클로라이드 이온의 농도는 NaCl 의 농도를 증가시킴으로써 증가된다. 바람직한 구현예에서, 용출 완충액의 출발 클로라이드 이온 농도는 약 50 mM (이는 하나 이상의 클로라이드 염에 의해 제공될 수 있음) 이고 후속적으로 용출 동안 이중특이적 항체를 용출시키는데 필수적인 농도로 증가된다. 통상의 기술자는 기술분야에 알려진 일상적 방법을 사용하여 본원에 기재된 교시 및 방법에 따라 흡착된 이중특이적 항체를 용출시키는데 필수적인 클로라이드 이온의 최대 농도를 쉽게 확인할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 BASB 로부터 이중특이적 항체를 용출 및/또는 이중특이적 항체를 분리하기 위한 클로라이드 이온의 최대 농도는 약 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM 또는 500 mM 이다. 발명의 방법에 따른 예시적 용출 완충액은 pH 약 6.5 내지 7.5 에서 약 10 mM NaH2PO4, 약 50 mM NaCl, 약 20 mM MES, 및 약 0.1 mM CaCl2 의 출발 조성을 가지며, 여기에서 클로라이드 이온의 농도는 후속적으로 용출 단계 동안 NaCl 의 농도를 선형, 단계형 또는 선형-단계형 기울기에 따라 약 500 mM 로 증가시킴으로써 증가된다.
이중특이적 항체의 용출은 바람직하게는 이중특이적 항체를 포함하나 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질에 흡착된 BASB 중 적어도 하나를 포함하지 않는 용출물 분획에서 달성된다. 발명의 방법은, 특히, 이중특이적 항체를 그것의 적어도 하나의 BASB 로부터 분리하는 것을 허용하며, 이중특이적 항체의 적어도 하나의 BASB 는 1/2 항체, 3/4 항체 또는 5/4 항체이다. 다시 말하면, 발명의 방법은 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 상기 이중특이적 항체 및 하나 이상의 BASB 를 포함하는 용액으로부터 분리하는 것을 허용하며, (a) 용액을 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계, (b) 이중특이적 항체를 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질에 흡착시키는 단계, 및 (c) 클로라이드 이온의 존재 하에 히드록시아파타이트 매질로부터 이중특이적 항체를 용출시키는 단계를 포함하며, 여기에서 이중특이적 항체를 포함하는 단계 (c) 의 용출물 분획은 하나 이상의 BASB 중 적어도 하나를 함유하지 않거나 포함하지 않고, 여기에서 상기 하나 이상의 BASB 는 1/2 항체, 3/4 항체 또는 5/4 항체이다. 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질 성능은 선행 기술에서 인지되는 바와 같이 생물 분자 (예를 들어, 이중특이적 항체 및 BASB) 와 관련하여 다를 수 있기 때문에, 하나 이상의 BASB 로부터의 이중특이적 항체의 분리 및/또는 정제에 관하여 이 공개 전체에서 사용되는 용어 "분리하다" 및 유사한 용어 및 구절은 반드시 절대적 표현으로서 해석되면 안된다고 이해된다. 오히려, 본원에서 사용되는 바와 같이 그리고 기술분야의 이해에 따라, 상기 용어는 용출된 이중특이적 항체는 분리 및/또는 정제된 것으로 여겨질 수 있으나 하나 이상의 BASB 중 적어도 하나 (이는 또한 원래 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질에 흡착되어 있었음) 로부터의 약간의 최소 오염을 포함할 수 있다는 인식으로 사용된다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 발명의 방법으로부터/에 의해 수득된 이중특이적 항체의 용액에 관하여 사용되는 용어 "분리된", "정제된", "함유하지 않는다" 및 유사한 용어 및 구절은 이중특이적 항체를 포함하는 용출물 또는 용출물 분획(들) 중 하나 이상의 BASB 의 총량이 이중특이적 항체의 총량의 10% 이하이라는 것을 의미하는데 사용된다. 바람직한 구현예에서, 발명의 방법으로부터/에 의해 수득된 이중특이적 항체의 용액에 관하여 사용되는 용어 "분리하다"/"분리된", "정제된", "함유하지 않는다" 및 유사한 용어 및 구절은 이중특이적 항체를 포함하는 용출물 또는 용출물 분획(들) 중 하나 이상의 BASB 의 총량이 이중특이적 항체의 총량의 5% 이하라는 것을 의미하는데 사용된다. 기타 구현예에서, 용출된 이중특이적 항체는 하나 이상의 BASB 중 적어도 하나로부터의 오염을 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만으로 포함하거나 오염을 포함하지 않는다. 유사하게, 하나 이상의 BASB 및 용출물 및/또는 용출물 분획(들)에 관하여 구절 "포함하지 않는다" 및 유사한 구절은 절대적 표현으로서 이해되어서는 안된다. 오히려, 기술 분야에서 이해되는 바와 같이, 상기 구절은 용출물 분획(들)이 특정 하나 이상의 BASB 로부터 본질적으로 자유로우며, 즉, 최소량의 BASB 를 함유할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 이중특이적 항체를 포함하고 하나 이상의 BASB 를 포함하지 않는 용출물 또는 용출물 분획(들)은 하나 이상의 BASB 를 이중특이적 항체의 총량의 5 % 이하인 양으로 포함할 수 있다. 이 단락에서 및 명세서 전체에서 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 이중특이적 항체-함유 분획 중 이중특이적 항체의 총량과 비교되는 하나 이상의 BASB 의 총량의 상대 백분율은 기술분야에 알려진 또는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 확인될 수 있다. 비제한적 예에서, 그것은 SDS-Page 분석, MS 분석으로부터, 또는 BIAcore, Octet 또는 ELISA 프로토콜에 기초하는 결합 분석으로부터 확인 또는 추정된 양의 비교에 기초하여 계산될 수 있다.
발명의 방법은 기술분야에 알려지고/거나 본원에 기재된 임의의 이중특이적 항체 포맷에 적용가능하다. 따라서, 이중특이적 항체는 동물 공급원에서 유래하는 항체 (예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니아 피그, 토끼, 염소, 양, 개, 말, 소, 원숭이, 유인원 및/또는 닭 항체) 뿐만 아니라 키메라, 인간 및 인간화된 항체를 포함하나 그에 제한되지 않는, 임의의 적합한 공급원 항체로부터의 항체 펩티드 사슬 (예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄), 또는 그의 항원 결합 분절을 포함할 수 있고/거나; 본원에서 정의된 바와 같은 적합한 동물 공급원 및 인간 항체를 포함하나 그에 제한되지 않는, 임의의 적합한 공급원 항체로부터의 불변 도메인 (예를 들어, CL, CH1, CH2 및 CH3 도메인) 을 갖는 펩티드 사슬 (예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄) 을 포함할 수 있고/거나; scFv, scFab, Fd, dAb, 단일-중쇄-가변 도메인 및 단일-경쇄-가변 도메인을 포함하나 그에 제한되지 않는, 그것의 항원 결합 기능을 보유하는 항체 분절에 재조합적 융합 또는 화학적 접합된 임의의 적합한 공급원 항체로부터의 하나 이상의 불변 도메인 (예를 들어, 하나 이상의 CL, CH1, CH2 및 CH3 도메인) 을 갖는 펩티드 사슬 (예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄) 을 포함할 수 있고/거나; 인간 또는 인간화된 골격 도메인을 갖는 펩티드 사슬 (예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄) 을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 발명에 따른 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항체는 "놉-인-홀 (knobs-in-holes)" ("KiH") 이중특이적 항체이다 (즉, 기술분야에 알려진 바와 같고/거나 본원에 기재된 바와 같은 KiH 방법에 따라 디자인된 2 개의 중쇄를 포함한다). KiH 방법은 기타 이중특이적 항체 디자인 방법과 조합되거나 조합되지 않을 수 있다. 그러한 기타 이중특이적 항체 디자인 방법의 비제한적 예는 이중특이적 항체의 가변 도메인 중 하나 이상에 적용되는 방법 예컨대 CrossMab 방법 및/또는 하나 이상의 중쇄 불변 도메인에 대한 항원 결합 분절 (예를 들어, scFab) 의 융합을 포함한다. 발명은 또한 KiH 방법에 독립적인 CrossMab 및 항원 결합 분절 (예를 들어, scFab) 중쇄 융합 방법의 사용을 망라한다. 따라서, 발명의 이중특이적 항체는 KiH 방법, CrossMab 방법 및 항원-결합 분절-중쇄 융합 방법 중 오직 하나의 사용을 포함할 수 있거나, 이들 방법 중 하나 초과의 사용을 포함할 수 있다. 편의상, 이 공개 전체에서 사용되는 바와 같은, KiH, CrossMab 및/또는 항원-결합 분절-중쇄 융합 방법에 따라 디자인된 항체는 각각 "KiH 이중특이적 항체", "CrossMab 이중특이적 항체" 및/또는 "결합 분절-중쇄 융합 항체" 로서 언급된다. 발명의 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 결합 분절-중쇄 융합 항체이며, 여기에서 이중특이적 항체의 하나의 중쇄는 항체 중쇄의 힌지-CH2-CH3 영역에 재조합적 융합 또는 화학적 접합되어 있는 scFab 를 포함한다 (즉, "scFab 이중특이적 항체"). 특정 구현예에서, 발명의 방법에 따른 이중특이적 항체는 KiH 이중특이적 항체, CrossMab 이중특이적 항체, scFab 이중특이적 항체, KiH-CrossMab 이중특이적 항체 또는 KiH-scFab 이중특이적 항체이다. 특정 구현예에서, 발명의 방법에 따른 이중특이적 항체는 KiH 이중특이적 항체, CrossMab 이중특이적 항체, scFab 이중특이적 항체, KiH-CrossMab 이중특이적 항체 또는 KiH-scFab 이중특이적 항체이고, 발명의 방법은 이중특이적 항체를 그의 하나 이상의 BASB 로부터 분리한다.
본 발명은 임의의 특별한 에피토프 또는 항원에 대해 특이성을 갖는 이중특이적 항체에 제한되지 않고, 이중특이적 항체에 일반적으로 적용가능하고, 특히, Fc 도메인을 갖는 이중특이적 항체에 적용가능하다. 따라서, 발명의 항체는 둘 이상의 에피토프 (이러한 에피토프는 동일 또는 상이한 항원 상에 있음) 에 대해 특이성을 갖고/거나 둘 이상의 항원에 대해 특이성을 가질 수 있다. 이중특이적 항체가 특이성을 나타낼 수 있는 항원의 비제한적 예는 단백질 및 폴리펩티드 (선천 구조의 단리된 단백질 및 폴리펩티드; 단리된, 변성된 단백질 및 폴리펩티드; 세포의 표면에 발현된 단백질 및 폴리펩티드 (기술분야에 알려지거나 본원에 기재된 바와 같은 세포 수용체 및/또는 세포 마커를 포함함) 및 생물 유체에서 발견될 수 있는 바와 같은 가용성 단백질 및 폴리펩티드 (예를 들어, 혈액, 혈청, 소변, 및 그의 분획) 예컨대 분비된 단백질, 박리된 (shed) 세포 수용체 및 박리된 세포 마커를 포함하나, 그에 제한되지 않음) 를 포함한다. 특정 구현예에서, 발명의 방법에 따른 이중특이적 항체는 EGFR, IGFR, Ang2, VEGF, TWEAK, IL17, CD3, TNF (TNF-알파), 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP), 사멸 수용체 5 (DR5), CEA, 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (MCSP), 폴레이트 수용체 1 (FolR1), 잠복 (latent) 막 단백질 1/2 (LMP 1/2), 또는 상세한 설명에 기재된 바와 같은 기타 항원 중 하나 이상에 대해 특이성을 갖는다. 대안적 또는 부가적 구현예에서, 발명의 방법에 따른 이중특이적 항체는 EGFR, IGFR, Ang2, VEGF, TWEAK, IL17, CD3, TNF (TNF-알파), 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP), 사멸 수용체 5 (DR5), CEA, 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (MCSP), 폴레이트 수용체 1 (FolR1), 잠복 막 단백질 1/2 (LMP 1/2), 또는 상세한 설명에 기재된 바와 같은 기타 항원 중 임의의 2 가지에 대해 특이성을 갖는다. 추가의 대안적 또는 부가적 구현예에서, 발명의 방법에 따른 이중특이적 항체는 EGFR 및 IGFR, Ang2 및 VEGF, 또는 TWEAK 및 IL17 에 대해 특이성을 갖는다.
특정 구현예에서, 발명의 방법에 따른 이중특이적 항체는 EGFR 및 IGFR 에 대해 특이성을 갖는 KiH-CrossMab 이중특이적 항체이며, 여기에서 발명의 방법은 이중특이적 항체를 그것 및 적어도 하나의 BASB 를 포함하는 용액으로부터 분리하고, 여기에서 적어도 하나의 BASB 는 1/2 항체이고, 여기에서 분리는 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질로부터 용출물 분획을 수득하며, 상기 용출물 분획은 EGFR-IGFR 이중특이적 항체를 포함하나 1/2 항체를 포함하지 않는다. 이러한 구현예의 특정 양상에서, 이중특이적 항체는 EGFR 및 IGFR 에 대해 특이성을 갖는 KiH-CrossMab 이중특이적 항체이며, 여기에서 IGFR 에 특이적인 가변 도메인은 CrossMab 가변 도메인이다. 이러한 구현예의 바람직한 양상에서, 이중특이적 항체는 EGFR 및 IGFR 에 대해 특이성을 갖는 KiH-CrossMab 이중특이적 항체이며, 여기에서 IGFR 에 특이적인 가변 도메인은 CrossMab 가변 도메인이고, 여기에서 하나 이상의 BASB 는 1/2 항체이고, 여기에서 발명의 방법은 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질로부터 용출물 분획을 수득하는 것을 포함하며, 상기 용출물 분획은 EGFR-IGFR 이중특이적 항체를 포함하나 1/2 항체를 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 발명의 방법에 따른 이중특이적 항체는 Ang2 및 VEGF 에 대해 특이성을 갖는 KiH-scFab 이중특이적 항체이며, 여기에서 발명의 방법은 이중특이적 항체를 그것 및 적어도 하나의 BASB 를 포함하는 용액으로부터 분리하고, 여기에서 적어도 하나의 BASB 는 1/2 항체이고, 여기에서 분리는 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질로부터 용출물 분획을 수득하고, 상기 용출물 분획은 Ang2-VEGF 이중특이적 항체를 포함하나 1/2 항체를 포함하지 않는다. 이러한 구현예의 특정 양상에서, 이중특이적 항체는 Ang2 및 VEGF 에 대해 특이성을 갖는 KiH-scFab 이중특이적 항체이며, 여기에서 Ang2 에 특이적인 가변 도메인은 scFab 가변 도메인이다. 이러한 구현예의 바람직한 양상에서, 이중특이적 항체는 Ang2 및 VEGF 에 대해 특이성을 갖는 KiH-scFab 이중특이적 항체이며, 여기에서 Ang2 에 특이적인 가변 도메인은 scFab 가변 도메인이고, 여기에서 하나 이상의 BASB 는 1/2 항체이고, 여기에서 발명의 방법은 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질로부터 용출물 분획을 수득하는 것을 포함하며, 상기 용출물 분획은 Ang2-VEGF 이중특이적 항체를 포함하나 1/2 항체를 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 발명의 방법에 따른 이중특이적 항체는 EGFR 및 IGFR 에 대해 특이성을 갖는 KiH-scFab 이중특이적 항체이며, 여기에서 발명의 방법은 이중특이적 항체를 그것 및 적어도 하나의 BASB 를 포함하는 용액으로부터 분리하고, 여기에서 적어도 하나의 BASB 는 1/2 항체이고, 여기에서 분리는 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질로부터 용출물 분획을 수득하며, 상기 용출물 분획은 EGFR-IGFR 이중특이적 항체를 포함하나 1/2 항체를 포함하지 않는다. 이러한 구현예의 특정 양상에서, 이중특이적 항체는 EGFR 및 IGFR 에 대해 특이성을 갖는 KiH-scFab 이중특이적 항체이며, 여기에서 IGFR 에 특이적인 가변 도메인은 scFab 가변 도메인이다. 이러한 구현예의 바람직한 양상에서, 이중특이적 항체는 EGFR 및 IGFR 에 대해 특이성을 갖는 KiH-scFab 이중특이적 항체이며, 여기에서 IGFR 에 특이적인 가변 도메인은 scFab 가변 도메인이고, 여기에서 하나 이상의 BASB 는 1/2 항체이고, 여기에서 발명의 방법은 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질로부터 용출물 분획을 수득하는 것을 포함하며, 상기 용출물 분획은 EGFR-IGFR 이중특이적 항체를 포함하나 1/2 항체를 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 발명의 방법에 따른 이중특이적 항체는 TWEAK 및 IL17 에 대해 특이성을 갖는 KiH-scFab 이중특이적 항체이며, 여기에서 발명의 방법은 이중특이적 항체를 그것 및 적어도 하나의 BASB 를 포함하는 용액으로부터 분리하며, 여기에서 적어도 하나의 BASB 는 5/4 항체이고, 여기에서 분리는 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질로부터 용출물 분획을 수득하고, 상기 용출물 분획은 TWEAK-IL17 이중특이적 항체를 포함하나 5/4 항체를 포함하지 않는다. 이러한 구현예의 특정 양상에서, 이중특이적 항체는 TWEAK 및 IL17 에 대해 특이성을 갖는 KiH-scFab 이중특이적 항체이며, 여기에서 TWEAK 에 특이적인 가변 도메인은 scFab 가변 도메인이다. 이러한 구현예의 바람직한 양상에서, 이중특이적 항체는 TWEAK 및 IL17 에 대해 특이성을 갖는 KiH-scFab 이중특이적 항체이며, 여기에서 TWEAK 에 특이적인 가변 도메인은 scFab 가변 도메인이고, 여기에서 하나 이상의 BASB 는 5/4 항체이고, 여기에서 발명의 방법은 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질로부터 용출물 분획을 수득하는 것을 포함하며, 상기 용출물 분획은 TWEAK-IL17 이중특이적 항체를 포함하나 5/4 항체를 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 발명의 방법에 따른 이중특이적 항체는 Ang2 및 VEGF 에 대해 특이성을 갖는 KiH-CrossMab 이중특이적 항체이며, 여기에서 발명의 방법은 이중특이적 항체를 그것 및 적어도 하나의 BASB 를 포함하는 용액으로부터 분리하며, 여기에서 적어도 하나의 BASB 는 3/4 항체이고, 여기에서 분리는 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질로부터 용출물 분획을 수득하고, 상기 용출물 분획은 Ang2-VEGF 이중특이적 항체를 포함하나 3/4 항체를 포함하지 않는다. 이러한 구현예의 특정 양상에서, 이중특이적 항체는 Ang2 및 VEGF 에 대해 특이성을 갖는 KiH-CrossMab 이중특이적 항체이며, 여기에서 Ang2 에 특이적인 가변 도메인은 CrossMab 가변 도메인이다. 이러한 구현예의 바람직한 양상에서, 이중특이적 항체는 Ang2 및 VEGF 에 대해 특이성을 갖는 KiH-CrossMab 이중특이적 항체이며, 여기에서 Ang2 에 특이적인 가변 도메인은 CrossMab 가변 도메인이고, 여기에서 하나 이상의 BASB 는 3/4 항체이고, 여기에서 발명의 방법은 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질로부터 용출물 분획을 수득하는 것을 포함하며, 상기 용출물 분획은 Ang2-VEGF 이중특이적 항체를 포함하나 3/4 항체를 포함하지 않는다.
본원에 공개된 임의의 히드록시아파타이트 방법은, 발명의 양상 및/또는 구현예로서 기재되든, 바람직하다고 또는 바람직하지 않다고 기재되든, 본원에 기재되고/거나 그렇지 않으면 기술분야에 알려진 상류 (upstream) 또는 하류 (downstream) 정제 과정과 조합될 수 있다. 본원에 공개된 히드록시아파타이트 방법과 상류 또는 하류에서 조합될 수 있는 그러한 정제 과정의 예는 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 (음이온 및 양이온 교환 크로마토그래피를 포함함), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 기타 형태의 혼합 모드 크로마토그래피 및 기술분야에 알려진 다양한 여과 방법을 포함하나 그에 제한되지 않는다. 공개된 방법과의 통합에 적당한 조건을 개발하여 이중특이적 항체의 특별한 정제를 달성하는 것은 통상의 기술자의 능력 범위 내이다. 비제한적 예에서, 본원에 공개된 임의의 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법은 상류 친화도 크로마토그래피 방법과 조합될 수 있으며, 여기에서 친화도 리간드는 항체 도메인 예컨대 Fc 도메인, 카파 도메인 또는 람다 도메인 (예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, Protein A, Protein G, Protein A/G, Protein L, KappaSelect™ 및 LambdaFabSelect™ (GE Healthcare Life Sciences, Upsala, SE)) 에 대해 특이성을 갖는다. 특정 구현예에서, 발명의 방법에 따라 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉되는 이중특이적 항체 및 하나 이상의 BASB 를 함유하는 용액은, 항체 Fc 도메인, 또는 항체 경쇄 카파 또는 람다 도메인에 대해 특이성을 갖는 친화도 크로마토그래피 매질로부터의 용출물의 모아진 (pooled) 항체 함유 분획을 포함한다. 추가의 비제한적 예에서, 발명에 따른 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법은, 음이온 크로마토그래피 및 양이온 크로마토그래피를 포함하나 그에 제한되지 않는, 상류 또는 하류 정제 과정과 조합될 수 있다. 비제한적 예로서, 본원에 공개된 발명에 따른 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법의 임의의 방법, 양상, 구현예 또는 기타 예는 상류 또는 하류 음이온 또는 양이온 크로마토그래피와 조합될 수 있다. 본원에 공개된, 임의의 방법, 양상 구현예 또는 기타 예와 조합될 수 있는 구체적 예에서, 발명에 따른 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법은 상류 또는 하류 양이온 크로마토그래피와 조합될 수 있으며, 상기 양이온 크로마토그래피는 이중특이적 항체를 하나 이상의 오염물, 불순물 및/또는 제 2 BASB 로부터 분리할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "오염물", "불순물" 및 유사한 용어는 기술분야에 알려진 그들의 표준 의미를 갖고, 특히, 이중특이적 항체를 함유하는 용액 중 원하지 않는 성분을 나타낸다. 그러한 원하지 않는 성분의 비제한적 예는 원하지 않는 단백질 (예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 이중특이적 항체의 중쇄의 동종이합체), 원하지 않는 작은 분자, 본원에 기재된 바와 같은 BASB 이외의 이중특이적 항체의 하나 이상의 분절, 이중특이적 항체의 응집물, 및 세포 (내생적이든 이종유래이든) 에 의해 생산된 원하지 않는 단백질/분자를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "제 2 BASB" 및 유사한 용어는 본원에 공개된 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법에 의해 이중특이적 항체로부터 분리되는 적어도 하나의 BASB 가 아닌 BASB 를 지칭한다. 따라서, 특정 구현예에서, 본원에 공개된 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법은 이중특이적 항체를 이중특이적 항체 및 적어도 하나의 BASB 를 함유하는 용액으로부터 분리하며, 여기에서 분리는 이중특이적 항체를 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질로부터 이중특이적 항체를 함유하나 적어도 하나의 BASB 를 함유하지 않는 용출 분획으로 용출시키고, 여기에서 방법은 이중특이적 항체를 적어도 하나 오염물, 불순물 및/또는 제 2 BASB 로부터 분리하는 적어도 하나 상류 또는 하류 양이온 크로마토그래피 방법과 조합된다. 본원에 공개된 임의의 방법, 양상 구현예 또는 기타 예와 조합될 수 있는 구체적 예에서, 발명에 따른 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법은 (1) 상류 친화도 크로마토그래피 방법 (여기에서 친화도 리간드는 항체 도메인 예컨대 Fc 도메인, 카파 도메인 또는 람다 도메인에 대해 특이성을 가짐); 및 (2) 상류 또는 하류 양이온 크로마토그래피 방법 (이러한 양이온 크로마토그래피는 이중특이적 항체를 하나 이상의 오염물, 불순물 및/또는 제 2 BASB 로부터 분리함) 과 조합될 수 있다.
정의
일반적으로, 하기 단어 및 구절은 요약, 명세서, 실시예, 및 청구항에서 사용될 때 명시된 정의를 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 수치와 관련하여 용어 "약" 은 수치의 ± 5% 를 나타낸다. 장치에 의해 수행되는 (예를 들어, pH 미터에 의해 확인되는 pH) 또는 기술분야에 알려진 표준 방법에 따라 수행되는 (예를 들어, HPLC, UV 흡착, ELISA, 표준 키트 (예를 들어, 비색 검정법) 에 의해 확인되는 용액의 단백질 농도) 측정과 관련하여 사용될 때, "약" 은 그러한 장치에 대해 알려진 표준 오차 내 또는 그러한 방법에 대해 확인된 값의 단일 표준 편차 내의 값을 나타낸다.
용어 "항체" 는 가장 넓은 의미로 사용되고 구체적으로, 예를 들어, 단일 모노클로날 항체 (아고니스트, 안타고니스트, 및 중화 항체; 뿐만 아니라 탈-면역화된 (de-immunized), 키메라, 인간화된 및 인간 항체 및/또는 임의의 적합한 동물 공급원에서 (예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니아 피그, 토끼, 염소, 양, 개, 말, 소, 원숭이, 유인원 및/또는 닭에서) 유래하는 항체를 포함함), 면역-접합체, 합성 항체, 낙타화된 항체, 단일-사슬 Fvs (scFv), 단일 사슬 항체, Fab 분절, F(ab') 분절, F(ab')2 분절, 다이설파이드-연결된 Fvs (sdFv), 인트라바디 (intrabodies), 및 임의의 상기의 에피토프-결합 분절을 포괄한다. 특히, 본 발명은, 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 그리고 특정 구현예에서, 적어도 둘 이상의 상이한 항체로부터의 도메인으로 구성되는 것으로 여겨지는 이중특이적 항체와 관련된다. 따라서, 발명의 이중특이적 항체는 2 가지 상이한 중쇄 (각각 상이한 항체에서 유래함) 및 2 가지 상이한 경쇄 (각각 상이한 항체에서 유래함) 를 포함할 수 있고/거나, 둘 이상의 상이한 항체로부터의 분절을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있다. 따라서, 발명의 이중특이적 항체는 탈-면역화된, 쥐, 키메라, 인간화된 및 인간 항체로부터의 중쇄 및/또는 경쇄, 뿐만 아니라 탈-면역화된, 쥐, 키메라, 인간화된, 인간 항체 및 그의 분절로부터의 조합 중쇄 및/또는 경쇄 (예를 들어, 그의 가변 및/또는 불변 도메인) 를 포함할 수 있다. 발명의 이중특이적 항체는 항체의 에피토프 결합 분절 (예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나 단일-사슬 Fvs (scFv), 단일 사슬 항체, Fab 분절, F(ab') 분절, F(ab')2 분절, 및 다이설파이드-연결된 Fvs (sdFv)), 특히, 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인에 연결된 것, 예를 들어, 중쇄 CH1/CH2/CH3 도메인에 연결된 scFv 를 또한 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 발명의 이중특이적 항체는 Fc 도메인을 포함한다. 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, Fc 도메인의 존재는 이중특이적 항체를 Fc-결합 모이어티 예컨대, 이에 제한되는 것은 아니나, Protein A, Protein G, 및/또는 Protein A/G 를 사용하는 정제에 적용가능하게 만든다. 기술 분야에서 잘 인지되는 바와 같이, 중쇄의 CH1-힌지-CH2-CH3 도메인의 특별한 구조 및 아미노산 서열은 면역글로불린 유형 및 서브클래스를 결정한다. 발명의 이중특이적 항체는 어떤 식으로든 특정 중쇄 구조 또는 아미노산 서열에 제한되지 않는다; 따라서, 발명의 이중특이적 항체는 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스에 속할 수 있다.
본원에서 특별히 크로마토그래피 과정에 관하여 사용되는 바와 같은 "친화도 리간드" 는 모이어티 (예를 들어, 리간드) 및/또는 성분 상의 결합 자리와의 특이적 상호작용를 통해 과정의 피드 또는 로드 스트림 내의 성분에 선택적으로 또는 우선적으로 결합하는 모이어티를 지칭한다. 본 발명에 따른 면역글로불린-친화도 리간드는 면역글로불린의 Fc- 또는 기타 불변 도메인에 (예를 들어, 항체 경쇄의 κ- 또는 λ-도메인에) 선택적으로 또는 우선적으로 결합한다. 그러므로, 본원에서 사용되는 바와 같이 "면역글로불린-친화도 리간드" 는 Fc-, κ- 및/또는 λ-도메인(들)을 갖는 피드 또는 로드 스트림 내의 성분에 선택적으로 또는 우선적으로 결합한다. 면역글로불린-친화도 리간드는 전형적으로 고체 상 예컨대 수지 지지체에 부동화된다. 본 발명에 따른 수지 지지체에 결합될 수 있는 면역글로불린-친화도 리간드의 예는 Fc-친화도 리간드 예컨대, 이에 제한되는 것은 아니나, Protein A, Protein G 및 Protein A/G, 및 그들의 유사체; 뿐만 아니라 면역글로불린의 기타 불변 도메인에 (예컨대 κ- 및/또는 λ-도메인에) 결합하는 친화도 리간드 예컨대, 이에 제한되는 것은 아니나, KappaSelect™ 및 LambdaFabSelect™ (GE Healthcare Life Sciences, Upsala, SE), 및 그들의 유사체를 포함하나, 그에 제한되지 않는다. 결합 친화도 리간드를 고체 지지체 재료에 결합하는 방법은 정제 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, Affinity Separations: A Practical Approach (Practical Approach Series), Paul Matejtschuk (Ed.), (Irl Pr: 1997); 및 Affinity Chromatography, Herbert Schott (Marcel Dekker, New York: 1997) 를 참조한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 범위 내의 파라미터의 정의에 관하여 용어 "사이에서" 는 그 범위의 종점을 명백히 포함한다. 따라서, 파라미터가 본원에서 "X 와 Y 사이" 로 정의되는 경우에, 그 값이 Y 미만 또는 그와 동일한, 즉, Y 이하인 한 X 와 동일한 또는 X 초과의 값을 가질 수 있다는 것이 명백히 의도된다. 다시 말하면, 구절 "X 와 Y 사이" 및 유사한 구성에 의해 정의되는 값은 값 X 및 Y 를 명백히 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 표현 "세포", "세포주", 및 "세포 배양물" 은 호환되게 사용되고, 모든 그러한 명칭은 자손을 포함한다. 특히, 본 발명은 세포, 세포주 및 세포 배양물의 산물로부터의 관심의 분자, 즉, 이중특이적 항체의 분리 및/또는 정제를 망라한다. 그러한 산물은 전형적으로 조건화된 세포 배지 및/또는 용해된 및 균질화된 세포 및 세포 배양물 (예를 들어, 조건화된 세포 배지 내의 균질화된 세포 및 세포 성분) 을 포함한다. 발명의 방법은 트랜스제닉 세포, 세포주 및 세포 배양물로부터의 산물의 가공에 특히 적합하며, 여기에서 트랜스제닉 세포, 세포주 및 세포 배양물은 관심의 분자를 발현한다.
발명의 방법은 분자를 함유하는 용액으로부터의 관심의 분자, 예를 들어, 이중특이적 항체의 분리, 정제 및/또는 가공에 관련된다고 이해된다. 본 발명의 방법에 따른 관심의 분자를 함유하는 용액은 크로마토그래피 과정의 피드 스트림 또는 로드 스트림, 예를 들어, 하나 이상의 크로마토그래피 단위 조작에 (예를 들어, 정제 계획의 일부로서) 적용되는 피드 또는 로드 스트림을 포함한다. 그와 같이, 관심의 분자를 함유하는 용액이 세포 배양물 배지 또는 세포 배양물 배지의 분별된 또는 정화된 일부인 경우에, 그러한 배지는 필수적으로 조건화된 세포 배양물 배지 (따라서 관심의 분자를 포함함) 라고 이해된다. 그러므로, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 배양물 용액" 및 유사한 용어는, 예를 들어, 조건화된 세포 배양물 상청액; 정화된 조건화된 세포 배양물 상청액; 정화된, 균질화된/용해된 세포 배양물 등을 포함하나 그에 제한되지 않는, 관심의 분자를 함유할 것으로 예상되는 생물학적 과정 또는 시스템의 임의의 용액을 지칭한다.
특정 구현예에서 세포 배양물 배지는 본원에 공개된 방법의 실행에 앞서 정화 및/또는 멸균된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "정화된" 및 "정화" 는, 여과, 멸균 및/또는 원심분리를 포함하여, 용액으로부터의 미립자 물질의 제거를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "멸균된" 은 단백질을 함유하는 용액에 관하여 사용되는 것으로 이해된다; 따라서, 그러한 용액의 "멸균" 은 바람직하게는 여과 및/또는 원심분리에 의해 실행되며, 단백질 변성 및/또는 단백질 응집을 회피하기 위해 열해 의해서는 실행되지 않는 것으로 이해된다. 전형적으로, 임의의 세포 배양물 배지에 관하여 "정화된"/"멸균된" 용액은 약 0.45 ㎛ 공극 크기 이하, 바람직하게는, 약 0.22 ㎛ 공극 크기 이하의 막을 통하여 여과된 용액이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "크로마토그래피 매질" 은 기술분야에 잘 알려진 바와 같은 적용된 로드 유체 중 하나 이상의 성분에 선택적으로 결합할 수 있는 고체 상 재료를 지칭한다. 본 발명은, 특히, 관심의 분자, 구체적으로, 이중특이적 항체의 가공을 위한 기술분야에 알려진 및/또는 본원에 정의된 임의의 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질의 용도를 망라한다. 발명의 방법은 또한 이중특이적 항체의 제조에 특이적인 하나 이상의 부산물, 즉, 이중특이적 항체 특이적 부산물 ("BASB") 로부터 관심의 분자, 즉, 이중특이적 항체를 분리하기 위한 히드록시아파타이트 크로마토그래피와 정제 계획의 일부로서의 하나 이상의 추가의 크로마토그래피 과정 (예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피) 의 조합을 망라한다. 발명의 방법에 따라 히드록시아파타이트 크로마토그래피와 조합될 수 있는 크로마토그래피 단위 조작의 예는 양이온 교환, 음이온 교환, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 수소 결합, pi-pi 결합, 금속 친화도 및/또는 생물분자 (예를 들어, 면역글로불린, 면역글로불린 분절, 및 효소를 포함하는 친화도 수지) 를 통한 특이적 결합을 통해 로드 유체의 하나 이상의 성분에 선택적으로 결합하는 고체 상 (예를 들어, 수지) 의 사용을 포함하는 크로마토그래피 단위 조작을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니나. 고체 상은 다공성 입자, 비(非)다공성 입자, 막, 또는 모놀리스 (monolith) 일 수 있다. 이들 부가적 크로마토그래피 단위 조작에 적당한 조건을 개발하고 그들을 본원에 공개된 발명과 통합하여 특별한 이중특이적 항체의 정제를 달성하는 것은 통상의 기술자의 능력 범위 내이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "Fc 도메인", "Fc 영역" 및 유사한 용어는 IgG 항체의 C-말단 영역, 특히, IgG 중쇄의 CH2/CH3 도메인을 함유하는 IgG 항체의 중쇄(들)의 C-말단 영역을 지칭한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계는 약간 다를 수 있지만, Fc 도메인은 전형적으로 대략 아미노산 잔기 Cys226 에서부터 IgG 중쇄(들)의 카르복실-말단까지 걸쳐 있는 것으로서 정의된다. 기술분야에 알려진 바와 같이, Fc 영역은 나머지 항체 구조에 독립적으로 사용될 수 있으며, 예를 들어, 제 2 단백질에 연결되어 단백질 태그로서 기능하거나 Fc 영역과 전형적으로 연관되는 기능 (예를 들어, 보체 결합 활성, FcRn 결합 등) 을 제 2 단백질에 부여할 수 있다. Fc 도메인에 연결 (예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 화학적 접합 및 재조합 융합) 된 그러한 제 2 단백질은 면역글로불린 분절을 포함한다. 기술 분야에서 인지되는 바와 같이, 그러한 Fc 접합 또는 융합을 포함하는 단백질에서, Fc-영역이 반드시 단백질 사슬 또는 발현된 아미노산 서열의 C-말단 영역일 필요는 없다.
용어 "부산물" 및 유사한 용어는 관심의 분자, 즉, 이중특이적 항체의 생산으로부터 특이적으로 초래되고 그로부터 크로마토그래피/정제 과정 동안 분리되어야 하는 로드 또는 피드 스트림에 존재하는 임의의 원치 않는 분자를 지칭한다. 구절 이중특이적 항체 특이적 부산물, "BASB" 에 관하여, 이 용어는 이중특이적 항체의 재조합 생산에 특이적인 Fc-도메인을 함유하는 부산물을 지칭한다. 따라서, BASB 는 이중특이적 항체의 분절로서, Fc 도메인을 포함하는 분절일 수 있거나, 이중특이적 항체의 분자량보다 큰 분자량을 갖는 폴리펩티드로서, 이중특이적 항체의 2 개의 중쇄 중 적어도 하나를 포함하고 Fc 도메인을 추가로 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 발현될 원하는 이중특이적 항체 포맷에 따라, 발명의 방법에 따라 이중특이적 항체로부터 분리될 수 있는 전형적인 BASB 는 1/2 항체 (하나의 항체 경쇄/중쇄 쌍을 함유함), 3/4 항체 (항체 중쇄의 이종이합체 또는 동종이합체 및 단일 항체 경쇄를 함유함) 및 5/4 항체 (항체 중쇄의 이종이합체 또는 동종이합체 (중쇄 중 하나는 본원에서 정의된 바와 같은 scFab-중쇄 융합물이거나 아닐 수 있음), 단일 항체 경쇄 및 Fab 또는 scFab 분절을 함유함) (도 1 참조) 를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니나.
발명의 방법은 또한 이중특이적 항체를 함유하는 용액으로부터의 BASB 이외의 불순물 및/또는 오염물의 분리를 망라한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "불순물", "오염물" 및 유사한 용어는 관심의 분자를 함유하는 로드/로드 유체에 또한 존재하는 관심의 분자 이외의 생물 거대분자 예컨대 DNA, RNA, 또는 단백질을 포함하는 임의의 외래 또는 원치 않는 분자를 지칭한다. 불순물은, 예를 들어, 단백질 변이체 (본원에서 구체적으로 개요서술된 BASB, 응집된 단백질, 높은 분자량 종, 낮은 분자량 종 및 분절, 및 탈아미드화된 종을 포함하나 그에 제한되지 않음); 정제되고 있는 관심의 분자를 분비하는 숙주 세포로부터의 기타 단백질 (숙주 세포 단백질); 정제 단계에 앞서 샘플 내로 침출할 수 있는 친화도 크로마토그래피에 사용되는 흡수제의 일부인 단백질 (예를 들어, Protein A); 엔도톡신; 및 바이러스를 포함한다.
도 1 Protein A 크로마토그래피에 후속하는, KiH-CrossMab 항-EGFR/항-IGFR 이중특이적 항체의 생산 배양물 상청액의 비-환원 CE-SDS 분석.
도 2 도 1 에서 분석된 이중특이적 항체 조성물의 히드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용출 프로파일 (280 ㎚ 에서의 UV 흡수에 의해 모니터링됨). 용출은 경사진 선으로 나타나는 용출 완충액 중 NaCl 의 증가하는 기울기 (선형 기울기) 로 달성되었다.
도 3 도 2 로부터의 첫번째 용출 피크 (왼쪽 회색 박스) 의 비-환원 CE-SDS 분석.
도 4 도 2 로부터의 두번째 용출 피크 (오른쪽 회색 박스) 의 비-환원 CE-SDS 분석.
도 5 Protein A 크로마토그래피에 후속하는, KiH/scFab 이중특이적 항체, 항-VEGF/항-Ang2 의 생산 배양물 상청액의 비-환원 CE-SDS 분석.
도 6 도 5 에서 분석된 이중특이적 항체 조성물의 히드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용출 프로파일 (280 ㎚ 에서의 UV 흡수에 의해 모니터링됨). 용출은 경사진 및 단계형 선으로 나타나는 용출 완충액 중 NaCl 의 증가하는 기울기 (실행된 단계를 갖는 선형 기울기) 로 달성되었다.
도 7 도 6 에서 검은색 수직선의 왼쪽으로부터의 첫번째 용출 피크 및 모아진 분획의 비-환원 CE-SDS 분석.
도 8 도 6 으로부터의 두번째 용출 피크 (도 6 에서 검은색 수직선의 오른쪽에 있는 첫번째 용출 피크) 의 비-환원 CE-SDS 분석.
도 9 히드록시아파타이트 컬럼에 로딩하기에 앞서 Protein A 크로마토그래피에 적용된 KiH/CrossMab 이중특이적 항체, 항-VEGF/항-Ang2 의 생산 배양물 상청액의 히드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용출 프로파일 (280 ㎚ 에서의 UV 흡수에 의해 모니터링됨). 용출은 경사진 선으로 나타나는 용출 완충액 중 NaCl 의 증가하는 기울기 (선형 기울기) 로 달성되었다.
도 10 Protein A 크로마토그래피에 후속하는, KiH/scFab 이중특이적 항체, 항-EGFR/항-IGFR 의 생산 배양물 상청액의 비-환원 CE-SDS 분석.
도 11 도 10 에서 분석된 이중특이적 항체 조성물의 히드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용출 프로파일 (280 ㎚ 에서의 UV 흡수에 의해 모니터링됨). 용출은 경사진 및 단계형 선으로 나타나는 용출 완충액 중 NaCl 의 증가하는 기울기 (실행된 단계를 갖는 선형 기울기) 로 달성되었다.
도 12 도 11 로부터의 두번째 용출 피크의 비-환원 CE-SDS 분석.
도 13 Protein A 크로마토그래피에 후속하는, KiH/scFab 이중특이적 항체, 항-IL17/항-TWEAK 의 생산 배양물 상청액의 비-환원 CE-SDS 분석.
도 14 도 13 에서 분석된 이중특이적 항체 조성물의 히드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용출 프로파일 (280 ㎚ 에서의 UV 흡수에 의해 모니터링됨). 용출은 경사진 및 단계형 선으로 나타나는 용출 완충액 중 NaCl 의 증가하는 기울기 (실행된 단계를 갖는 선형 기울기) 로 달성되었다. 첫번째, 두번째 및 세번째 용출 피크 내의 검은색 화살표는 후속적으로 CE-SDS 에 의해 분석된 분획을 나타낸다 (도 15 및 16 에 제시됨; 세번째 화살표에 의해 표시된 분획의 분석은 보여지지 않음).
도 15 도 14 로부터의 첫번째 용출 피크 (첫번째/제일 왼쪽 검은색 화살표) 의 비-환원 CE-SDS 분석.
도 16 도 14 로부터의 두번째 용출 피크 (두번째/중간 검은색 화살표) 의 비-환원 CE-SDS 분석.
도 17 도 13 에서 분석된 이중특이적 항체 조성물의 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 (280 ㎚ 에서의 UV 흡수에 의해 모니터링됨) 으로부터의 용출 프로파일. 용출은 경사진 선으로 나타나는 용출 완충액 중 NaCl 의 증가하는 기울기 (선형 기울기) 로 달성되었다.
도 18 도 17 로부터의 첫번째 용출 피크의 비-환원 CE-SDS 분석.
도 19 도 17 로부터의 두번째 용출 피크의 환원 CE-SDS 분석.
상세한 설명
놀랍게도 히드록시아파타이트 크로마토그래피가 이중특이적 항체를 이중특이적 항체 생산에 특이적인 적어도 하나 부산물로부터 (즉, 적어도 하나 이중특이적 항체 특이적 부산물, "BASB" 로부터) 분리하는데 사용될 수 있다는 것이 발견되었다. 히드록시아파타이트 크로마토그래피는 단백질 정제 과정에서 불순물 예컨대 응집물, DNA 및 엔도톡신으로부터 높은 정도의 정제를 달성하는 것으로 밝혀졌지만, 오직 미미하게 다른 IEP 를 갖는 분자를 분리하는 것이 입증되지는 않았다 (예를 들어, Gagnon et al., Hydroxyapatite as a Capture Method for Purification of Monoclonal Antibodies, IBC World Conference and Exposition, San Francisco (2006) 참고). 전형적으로, 이중특이적 항체 및 BASB 는 그들의 IEP 값에서 0.5 pH 이하 만큼 상이할 것이며, 이는, 본 발명 및 교시 전에, 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분리하기에 너무 가까운 것으로 여겨졌다. 따라서, 이중특이적 항체를 정제하려는 시도는 전형적으로 이중특이적 활성을 갖는 분자의 정제를 보장하는 복수의 많은 비용이 드는 친화도 단계의 사용에 의존한다. 그와 대조적으로, 본 발명의 방법은 이중특이적 항체 및 적어도 하나의 BASB 의 분리를 위한 단순화되고/거나 그렇지 않으면 개선된 정제 프로토콜을 제공한다.
본원에서 정의된 바와 같이 BASB 는 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항체의 분절, 및/또는 이중특이적 항체보다 큰 분자량을 갖는 이중특이적 항체의 폴리펩티드 변이체로서, 이중특이적 항체의 2 개의 중쇄 중 적어도 하나를 포함하고 Fc 도메인을 추가로 포함하는 폴리펩티드 변이체이다. BASB 의 비제한적 예는 1/2 항체, 3/4 항체 및 5/4 항체를 포함한다. 그와 같이 공개된 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법은 일반적으로 이중특이적 항체를 하나 이상의 BASB 로부터 분리하기에 부적합 또는 불충분한 기존 항체 정제 계획을 보완할 수 있다. 본원에 공개된 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법은 용액, 특히, 하나 이상의 BASB 를 포함하는 용액으로부터 이중특이적 항체를 분리/정제/단리하는 임의의 과정에서 사용될 수 있다. 발명의 방법은 이중특이적 항체를 그것 및 하나 이상의 (즉, 적어도 하나의) BASB 를 함유하는 용액으로부터 분리하는데 사용될 수 있으며, 여기에서, 히드록시아파타이트 매질에 대한 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항체 및 하나 이상의 BASB 의 흡착에 후속하여, 분리는 이중특이적 항체를 함유하나 하나 이상의 BASB 를 함유하지 않는 용출물 분획을 수득하는 것을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 발명의 방법은 이중특이적 항체를 그것 및 하나 이상의 (즉, 적어도 하나의) BASB 를 함유하는 용액으로부터 분리하는데 사용될 수 있으며, 여기에서, 히드록시아파타이트 매질에 대한 이중특이적 항체의 흡착에 후속하여 또는 이중특이적 항체 및 하나 이상의 BASB 의 흡착에 후속하여, 분리는 이중특이적 항체를 함유하나 하나 이상의 BASB 를 함유하지 않는 용출물 분획을 수득하는 것을 포함하며, 여기에서 하나 이상의 BASB 는 1/2 항체, 3/4 항체 또는 5/4 항체이다. 특정 구현예에서, 발명의 방법은 이중특이적 항체를 그것 및 하나 이상의 (즉, 적어도 하나의) BASB 를 포함하는 용액으로부터 분리하는데 사용될 수 있으며, 여기에서 하나 이상의 BASB 는 1/2 항체이고, 히드록시아파타이트 매질에 대한 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항체 및 1/2 항체의 흡착에 후속하여, 분리는 이중특이적 항체를 함유하나 1/2 항체를 함유하지 않는 용출물 분획을 수득하는 것을 포함한다. 관련된 또는 대안적 구현예에서, 발명의 방법은 이중특이적 항체를 그것 및 하나 이상의 (즉, 적어도 하나의) BASB 를 포함하는 용액으로부터 분리하는데 사용될 수 있으며, 여기에서 하나 이상의 BASB 는 3/4 항체이고, 히드록시아파타이트 매질에 대한 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항체 및 3/4 항체의 흡착에 후속하여, 분리는 이중특이적 항체를 함유하나 3/4 항체를 함유하지 않는 용출물 분획을 수득하는 것을 포함한다. 추가의 관련된 또는 대안적 구현예에서, 발명의 방법은 이중특이적 항체를 그것 및 하나 이상의 (즉, 적어도 하나의) BASB 를 포함하는 용액으로부터 분리하는데 사용될 수 있으며, 여기에서 하나 이상의 BASB 는 5/4 항체이고, 히드록시아파타이트 매질에 대한 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항체 및 5/4 항체의 흡착에 후속하여, 분리는 이중특이적 항체를 함유하나 5/4 항체를 함유하지 않는 용출물 분획을 수득하는 것을 포함한다. 추가의 관련된 또는 대안적 구현예에서, 발명의 방법은 이중특이적 항체를 그것 및 하나 이상의 (즉, 적어도 하나의) BASB 를 포함하는 용액으로부터 분리하는데 사용될 수 있으며, 여기에서 하나 이상의 BASB 는 1/2 항체 및 3/4 항체이고, 히드록시아파타이트 매질에 대한 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항체, 1/2 항체 및 3/4 항체의 흡착에 후속하여, 분리는 이중특이적 항체를 함유하나 1/2 항체 및 3/4 항체 중 하나 또는 둘 모두를 함유하지 않는 용출물 분획을 수득하는 것을 포함한다. 추가의 관련된 또는 대안적 구현예에서, 발명의 방법은 이중특이적 항체를 그것 및 하나 이상의 (즉, 적어도 하나의) BASB 를 포함하는 용액으로부터 분리하는데 사용될 수 있으며, 여기에서 하나 이상의 BASB 는 1/2 항체 및 5/4 항체이고, 히드록시아파타이트 매질에 대한 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항체, 1/2 항체 및 5/4 항체의 흡착에 후속하여, 분리는 이중특이적 항체를 함유하나 1/2 항체 및 5/4 항체 중 하나 또는 둘 모두를 함유하지 않는 용출물 분획을 수득하는 것을 포함한다. 추가의 관련된 또는 대안적 구현예에서, 발명의 방법은 이중특이적 항체를 그것 및 하나 이상의 (즉, 적어도 하나의) BASB 를 포함하는 용액으로부터 분리하는데 사용될 수 있으며, 여기에서 하나 이상의 BASB 는 3/4 항체 및 5/4 항체이고, 히드록시아파타이트 매질에 대한 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항체, 3/4 항체 및 5/4 항체의 흡착에 후속하여, 분리는 이중특이적 항체를 함유하나 3/4 항체 및 5/4 항체 중 하나 또는 둘 모두를 함유하지 않는 용출물 분획을 수득하는 것을 포함한다. 추가의 관련된 또는 대안적 구현예에서, 발명의 방법은 이중특이적 항체를 그것 및 하나 이상의 (즉, 적어도 하나의) BASB 를 포함하는 용액으로부터 분리하는데 사용될 수 있으며, 여기에서 하나 이상의 BASB 는 1/2 항체, 3/4 항체 및 5/4 항체이고, 히드록시아파타이트 매질에 대한 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항체, 1/2 항체, 3/4 항체 및 5/4 항체의 흡착에 후속하여, 분리는 이중특이적 항체를 함유하나 1/2 항체, 3/4 항체 및 5/4 항체 중 하나, 둘 또는 모두를 함유하지 않는 용출물 분획을 수득하는 것을 포함한다.
히드록시아파타이트 [HA] 는 구조식 Ca10(PO4)6(OH)2 를 갖는 칼슘 포스페이트의 결정질 광물이다. HA 상의 단백질-반응성 자리는 양전하 칼슘 이온의 쌍 (C-자리) 및 음전하 포스페이트 기의 트리플렛 (triplet) (P-자리) 을 포함한다. C-자리는 단백질 카르복실 클러스터에 의한 HA 칼슘 킬레이트화를 통해 단백질 (예컨대 이중특이적 항체 및 BASB) 과 상호작용한다. 칼슘 킬레이트화 및 배위는 때때로 칼슘 친화도로서 언급된다. P-자리는 양전하 단백질 아미노산 잔기와의 포스포릴 양이온 교환을 통해 단백질과 상호작용한다 (예를 들어, US 2012/0077961 참고). 산업 및 상업 상황에서, HA 는 포스페이트 기울기, 또는, 어떤 상황에서는, 클로라이드 기울기를 사용하여 단백질 생산 부산물 예컨대 단백질 응집물, 숙주-세포 단백질 및 숙주-세포 DNA 로부터 원하는 단백질을 분리하는데 가장 흔히 사용된다. 그러나, HA 는 전장 항체 (예를 들어, Fc 도메인을 포함함) 를 Fc 함유 부산물로부터 정제하는 경우에는 고려되지 않았으며, 이는 이들 부산물이 원하는 산물 (즉, 전체 항체) 과 함께 용출하는 것으로 여겨졌기 때문일 것이다. 예를 들어, 이전에 포스페이트의 존재 하의 소듐 클로라이드의 사용은 IgG 가 HA 에 덜 강하게 결합하게 하여, 항체 뿐만 아니라 Fc 함유 오염물의 용출을 초래하는 것으로 여겨졌다. 그와 대조적으로, 본 발명자들은 포스페이트의 존재 하의 증가하는 농도의 소듐 클로라이드가 놀랍게도 이중특이적 항체를 하나 이상의 BASB 로부터 분리할 수 있다는 것을 발견했다.
다양한 히드록시아파타이트 크로마토그래피 지지체가 상업적으로 입수가능하고 기술분야에서 일상적으로 사용되고, 이들 중 임의의 것이 이 발명의 실시에서 사용될 수 있다. 이들은 세라믹 히드록시아파타이트, 히드록시아파타이트 겔, 히드록시아파타이트 수지 및 히드록시아파타이트 분말을 포함하나 그에 제한되지 않는다. 세라믹 히드록시아파타이트는 나노결정이 입자로 응집되고 높은 온도에서 융합되어 크로마토그래피 응용물에 적합한 안정적인 세라믹 미소구체를 창출하는 히드록시아파타이트의 형태를 지칭한다. 세라믹 히드록시아파타이트의 상업적 예는 CHT 유형 I 및 CHT 유형 II (BIORad, USA) 를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니나. 히드록시아파타이트 미소구체는 전형적으로 10, 20, 40, 및 80 micron 을 포함하나, 그에 제한되지 않는 입자 크기로 입수가능하다. 히드록시아파타이트 겔은 겔 지지체에 포매된 비-세라믹 히드록시아파타이트 함유 제품을 지칭한다. 히드록시아파타이트 겔의 비제한적 예는 다공성 아가로스 미소구체에 포매된 비-세라믹 히드록시아파타이트의 미세분절을 포함하는 ULTROGEL™ (Pall Corp., USA) 이다. 발명의 방법에 적합한, 평균 입자 크기를 포함하는, 히드록시아파타이트의 형태 및/또는 유형의 선별은 통상의 기술자의 능력 범위 내이고/거나, 보통의 지식을 사용하여 달성되고/거나, 일상적 실험에 의해 결정된다.
크로마토그래피 방법은 기술분야에 알려지고/거나 본원에 기재된 임의의 설정에 따라 실행될 수 있다. 크로마토그래피 방법의 비제한적 예는 충전층 컬럼, 유동/팽창층 컬럼 및/또는 뱃치 작업의 사용을 포함하며, 여기에서 크로마토그래피 매질이 이중특이적 항체를 포함하는 용액과 혼합된다. 바람직한 구현예에서, 발명의 방법은 히드록시아파타이트의 충전층 컬럼을 사용하여 실행되며, 컬럼은 결합-용출 모드/조건으로 작업된다.
발명의 방법은 이중특이적 항체를 그 이중특이적 항체 및 적어도 하나의 BASB 를 포함하는 용액 (즉, "이중특이적 항체 용액") 으로부터 분리한다. 발명의 방법은 정제되지 않거나 부분적으로 정제되고/거나, 여과되거나 여과되지 않은 이중특이적 항체 용액에 적용가능하다. 이중특이적 항체 용액은 천연, 합성, 또는 재조합 공급원에서 유래할 수 있다. 정제되지 않은 이중특이적 항체 용액은 혈장, 혈청, 복수 유체, 젖, 식물 추출물, 세균 용해물, 효모 용해물, 세포 용해물, 재조합 세포 용해물 및 조건화된 세포 배양물 배지를 포함하나, 그에 제한되지 않는, 기술분야에 알려지고/거나 본원에 기재된 임의의 공급원으로부터 유래할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "부분적으로 정제된 용액" 은 적어도 하나의 크로마토그래피 과정, 여과 과정, 분별 과정, 침전 과정, 또는 기술분야에 알려진 기타 표준 정제 과정, 또는 임의의 그들의 조합에 의해 가공된 이중특이적 항체 용액을 포함하나, 그에 제한되지 않는 용액을 언급할 수 있다. 본 발명은 본원에 기재된 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법 및 크기 배제, 친화도, 음이온 교환, 양이온 교환, 소수성 상호작용, 부동화된 금속 친화도 크로마토그래피, 및 혼합-모드 크로마토그래피, 및 그들의 조합을 포함하나, 그에 제한되지 않는 기술분야에 알려지고/거나 본원에 기재된 임의의 기타 크로마토그래피 과정 또는 과정들의 조합을 포괄한다.
본원에 기재된 바와 같은 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법은, 특히, 예를 들어, 항체 Fc 도메인 및/또는 항체 경쇄 κ- 또는 λ-도메인을 포함하나 그에 제한되지 않는 항체 불변 도메인에 대해 특이성을 갖는 친화도 매질을 사용하는 (즉, 각각 Fc-결합제, κ-결합제 및/또는 λ-결합제의 사용을 포함함), 하나 이상의 친화도 크로마토그래피 방법과 조합될 수 있다. 불변 도메인-결합제 (예를 들어, Fc-결합제) 에 기초하는 다양한 용액으로부터 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 를 정제하는 친화도 크로마토그래피가 기술분야에서 잘 알려져 있고 일상적으로 실시된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Fc-결합제" 및 유사한 용어는 항체 (예를 들어, IgG 항체) 의 Fc 영역에 결합하는 능력이 있는 분자를 언급한다. 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 통상적 Fc-결합제의 비제한적 예는 보체 단백질, Fc-수용체, 세균-유래 단백질 (예컨대 Protein A 및/또는 Protein G) 및 그들의 조합을 포함한다. 전형적으로, Fc-결합제는 항체, 예를 들어, IgG 에, 중쇄의 CH2/CH3 영역 내에 결합한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 Fc 도메인/영역을 함유하는 이중특이적 항체를 그 이중특이적 항체를 포함하는 용액으로부터 분리하는 것에 관한 것이다. 더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명은 Fc 도메인/영역을 함유하는 이중특이적 항체를 그 이중특이적 항체 및 적어도 하나의 BASB (이는 필수적으로 Fc 도메인을 또한 포함함) 를 포함하는 용액으로부터 분리하는 것에 관한 것이다. 그러므로, 특정 구현예에서, 발명의 방법에 따라 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉되는 용액은 Fc-결합제를 함유하는 친화도 컬럼으로부터 용출된 모아진 이중특이적 항체 및 BASB 함유 분획을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 경쇄 불변 도메인 결합제" 및 유사한 용어는 항체 (예를 들어, IgG 항체) 의 경쇄에, 특히, 항체 경쇄의 불변 영역에, 예를 들어, 경쇄 κ-불변 도메인/영역 또는 경쇄 λ-불변 도메인/영역에 결합하는 능력이 있는 분자를 언급한다. 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 통상적 항체 경쇄 불변 도메인-결합제의 비제한적 예는 세균-유래 단백질 (예컨대 Protein L), 및 경쇄에 대해 특이성을 갖는 단일 사슬 항체 분절 (예를 들어, 상업적으로 입수가능한 제품 예컨대 KappaSelect™ 및 LambdaFabSelect™ (GE Healthcare, USA)), 및 그러한 작용제의 조합을 포함한다. 전형적으로, Protein L, κ-결합제 및 λ-결합제는 항체, 예를 들어, IgG 에, 경쇄의 불변 영역 내에 결합한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 항체 경쇄 불변 도메인/영역을 함유하는 이중특이적 항체를 그 이중특이적 항체를 포함하는 용액으로부터 분리하는 것에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 발명의 방법에 따라 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉되는 용액은 경쇄 불변 도메인-결합제를 함유하는 친화도 컬럼으로부터 용출된 모아진 이중특이적 항체 함유 분획 항체를 포함한다.
가장 상업적인 정제 응용의 경우에 Fc-결합제 및/또는 항체 경쇄 불변 도메인 결합제 (예를 들어, κ-결합제 및/또는 λ-결합제) 는 고체 상에 부동화되어 컬럼 충진 (packing) 및/또는 적용된 용액으로부터의 친화도 리간드-표적 분자 (예를 들어, 이중특이적 항체 및 적어도 하나의 BASB) 의 쉬운 분리를 허용한다. 고체 상은, 예를 들어, 비드, 아가로스 기재, 실리카, 및 그들의 혼합물을 포함할 수 있으나 그에 제한되는 것은 아니다.
발명에 따른 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법은 단백질, 펩티드 및/또는 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 및 이중특이적 항체) 의 정제에 관한 기술분야에 알려지고/거나 본원에 기재된 기타 알려진 과정과 조합될 수 있다. 단백질/펩티드/폴리펩티드 정제 과정, 특히, 상업적 정제 과정은, 통상적으로 하나 이상의 구별되는 과정/단계/방법 예컨대 여과, 침전 및/또는 크로마토그래피를 포함하는 정제 계획을 이용한다. 구별되는 과정/단계/방법은 또한 기술분야에 알려진 바와 같은 "단위 조작" 으로 언급될 수 있다; 따라서, 용어 "과정", "단계", "방법" 및 "단위 조작" 은 본원에서 정제 단계, 예를 들어, 크로마토그래피 방법 및 크로마토그래피 단위 조작과 함께 사용될 때, 호환가능하다. 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법은 미생물-유래 단백질을 사용하는 친화도 크로마토그래피 (예를 들어 언급된 바와 같은 Protein A, Protein G, Protein A/G 및/또는 Protein L 친화도 크로마토그래피) , 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어 양이온 교환, 음이온 교환 및 혼합-모드 교환 크로마토그래피), 티오필릭 (thiophilic) 흡착 (예를 들어 베타-메르캅토에탄올 및 기타 SH 리간드를 이용), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피 (예를 들어 부틸-세파로스, 페닐-세파로스, 아자-아레노필릭 (aza-arenophilic) 수지, 또는 m-아미노페닐보론산을 이용), 금속 킬레이트 친화도 크로마토그래피 (예를 들어 Ni(II)-, Zn(II) 및 Cu(II)-친화도 재료를 이용), 크기 배제 크로마토그래피, 및 제조용 전기영동 방법 (예컨대 겔 전기영동, 모세관 전기영동) (Vijayalakshmi, M. A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102) 을 포함하나, 그에 제한되지 않는, 기술분야에 알려진 또는 본원에 기재된 임의의 정제 방법/단위 조작과 조합될 수 있다. 기술분야에 잘 알려진 정제 단계 또는 단위 조작의 부가적 비제한적 예는 투석, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 소수성 전하 상호작용 크로마토그래피 (HCIC), 암모늄 설페이트 침전, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 에탄올 침전; 역 상 HPLC; 실리카 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱 및 겔 여과를 포함한다. 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법 및/또는 기술분야에 알려지거나 본원에 기재된 바와 같은 기타 정제 방법/단위 조작과의 조합은 숙주 세포 핵산, 엔도톡신, 바이러스, 및 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 BASB 에 의해 명백히 포괄되지 않는 기타 이중특이적 항체 변이체를 포함하나 그에 제한되지 않는 오염물 및/또는 불순물로부터 이중특이적 항체를 분리하는데 잘 적응된다. 이중특이적 항체의 생산으로부터의 오염물로 여겨질 것이나, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 BASB 에 의해 포괄되지 않을 수 있는 이중특이적 항체 변이체의 예는 한 쌍의 중쇄/경쇄 폴리펩티드를 포함하는 동종이합체이다. 그러한 동종이합체는 이중특이적 항체와 유사한 분자량 및 구성 (즉, "표준" IgG 와 유사한 구성) 을 갖지만 각각의 가변 도메인이 동일할 것이다. 그러한 동종이합체는 본원에서 1/2 항체 동종이합체로서 언급된다. 따라서, 발명에 따른 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법은, 단독으로든 또는 기술분야에 알려진 바와 같은 하나 이상의 정제 단위 조작과의 조합으로든, 이중특이적 항체를 그 이중특이적 항체 및 1/2 항체 동종이합체를 함유하는 용액으로부터 분리할 수 있으며, 여기에서, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질에 대한 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항체 및 1/2 항체 동종이합체의 흡착에 후속하여, 분리는 이중특이적 항체를 포함하나 1/2 항체 동종이합체를 포함하지 않는 용출물 분획을 수득하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 발명의 방법은 이중특이적 항체를 그것 및 1/2 항체 동종이합체를 포함하는 용액으로부터 분리하는 것을 포함하며, 여기에서 상기 방법은 양이온 교환 크로마토그래피 방법 (이는 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법의 상류 또는 하류에 있을 수 있음) 과의 조합으로 본원에 기재된 바와 같은 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법을 포함하며, 여기에서, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법 및 양이온 교환 크로마토그래피 방법에 후속하여, 분리는 이중특이적 항체를 포함하나 1/2 항체 동종이합체를 포함하지 않는 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법 또는 양이온 교환 크로마토그래피 방법 (그들의 수행되는 순서에 따라) 으로부터의 용출물 분획을 수득하는 것을 포함한다.
본원에 공개된 크로마토그래피 방법은 상업적 규모의 사용에 잘 적응된다. 본원의 방법은, 예를 들어, 뱃치 또는 연속 작업으로, 또는 반연속 방식으로, 예를 들어, 전체 큰 뱃치가 여과될 때까지, 크로마토그래피 단위 조작을 통하는, 원하는 종을 함유하는 용액의 연속-흐름에 기초하여 (예를 들어, 여과 단계 사이에 하나 이상의 임의적 세정 단계가 개입됨) 실시될 수 있다. 이러한 방식으로, 연속 주기 과정이 수행되어 상대적으로 짧은 기간에 걸쳐, 허용가능하게 순수한 형태의, 원하는 산물의 큰 수율을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체는 바람직하게는 재조합 수단에 의해 생산된다. 항체의 일상적인 재조합 생산 방법이 이중특이적 항체의 생산에 일반적으로 적응가능하다. 그러한 일상적 방법은 최신 기술에서 잘 알려져 있고, 원핵 또는 진핵 세포에서의 단백질 발현을 포함한다 (예를 들어 하기 리뷰 참조: Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17, 183-202 (1999); Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., MoI. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880). 이중특이적 항체의 재조합 생산은 표준 항체의 생산에 비해, 특히, 2 가지 상이한 중쇄의 이종이합체화의 촉진 및 적절한 중쇄 가변 도메인-경쇄 가변 도메인 쌍형성의 촉진에 관하여, 다루어져야 하는 부가적 문제를 포함한다. 그러나, 이중특이적 항체의 성공적 생산, 예를 들어, 적절한 폴리펩티드 형성의 촉진은 최신 기술이 되었다. 예를 들어, 2 가지 상이한 중쇄의 이종이합체화는 "놉 인투 홀" 또는 "KiH" 방법을 이용하여 촉진되는 것으로 밝혀졌다. KiH 방법에서, 큰 아미노산 측쇄가 하나의 중쇄의 CH3 도메인에 도입되며, 상기 측쇄는 다른 중쇄의 CH3 도메인에 있는 적절히 디자인된 공동에 꼭 들어맞는다 (예를 들어, Ridgeway et al., Protein Eng. 9(1996), 617-621 및 Atwell et al., J. Mol. Biol. 270(1997), 677-681 참조). 따라서, 중쇄의 이종이합체는 동종이합체보다 더 안정적인 경향이 있고, 발현된 폴리펩티드 중 더 큰 비율을 차지한다. 추가로, 원하는 Fab 도메인을 형성하는 원하는 경쇄/중쇄 쌍의 연합은 경쇄와 중쇄 사이에 불변 또는 불변 및 가변 영역을 "교환 (swap)" 하는 이중특이적 항체 (Fab 영역) 의 하나의 가변 도메인 (또는 Fab 도메인 내의 가변 도메인-불변 영역) 의 수식에 의해 유도될 수 있다. 따라서, 수식된 Fab 도메인에서, 예를 들어, 중쇄는 CL-VH 또는 CL-VL 도메인을 포함할 것이고, 경쇄는 CH1-VL 또는 CH1-VH 도메인을 각각 포함할 것이다. 이는 수식된 팔의 경쇄/중쇄와 표준/수식되지 않은 팔의 경쇄/중쇄의 상호작용을 방지한다. 설명으로서, CL 도메인을 포함하는 수식된 팔의 Fab 도메인의 중쇄는 표준 팔의 경쇄의 CL 도메인과 상호작용하지 않을 것이다 (중쇄/경쇄의 "부적절한" 쌍형성을 방지함). 부적절한 경쇄/중쇄의 연합을 방지하기 위한 이러한 기술은 "CrossMab" 기술로 명명되고, KiT 기술과 조합되었을 때, 원하는 이중특이적 분자의 현저히 향상된 발현을 초래한다 (예를 들어, Schaefer et al., PNAS 108(2011), 11187-11192 참고). 대안적으로 또는 부가적으로, 항체의 하나의 팔이 Fab 도메인이 scFab 또는 scFv 이도록 수식되어, 오직 하나의 "자유" 경쇄가 시스템에 남을 수 있다. 따라서 본 발명은 기술분야에 알려진 또는 본원에 기재된 임의의 수단에 의해 생산된 이중특이적 항체를 포함한다.
본 발명의 방법은 임의의 이중특이적 항체를 그것 및 적어도 하나의 BASB 를 포함하는 용액으로부터 분리하는데 적합하다. 공개된 방법에 따른 이중특이적 항체는 재조합 면역글로불린일 수 있다. 추가로, 발명에 따른 이중특이적 항체는 인간화된 면역글로불린, 키메라 면역글로불린, 인간 면역글로불린의 분절, 및/또는 면역글로불린 접합체를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 분리 및/또는 정제된 이중특이적 항체는 치료적 또는 진단적 이중특이적 항체일 수 있다. 하나의 구현예에서 이중특이적 항체는 치료적 이중특이적 항체이다. 치료적 이중특이적 항체의 비제한적 예는 EGFR, HER3, HER4, IGFR, Ep-CAM, CEA, TRAIL, TRAIL-수용체 1, TRAIL-수용체 2, 림포톡신-베타 수용체, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD22, CD28, CD33, CD40, CD80, CSF-1R, CTLA-4, 사멸 수용체 5 (DR5), IL-17, 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP), 폴레이트 수용체 1 (FolR1), 헵신, 잠복 막 단백질 1/2 (LMP 1/2), 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (MCSP), 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, IGFl-R, TSLP-R, PDGF-R, TIE-I, TIE-2, TNF (TNF-알파), 세포자멸사의 TNF 유사 약한 유도인자 (TWEAK), IL-IR, VEGF, EGF, PDGF, HGF, 안지오포이에틴 1 및/또는 2 (Ang1 및/또는 Ang2), 및 본원에 기재된 또는 기술분야에 알려진 바와 같은 종양 항원 (예를 들어 성장 인자 수용체 및 성장 인자) 중 적어도 하나 또는 둘에 대해 특이성을 갖는 이중특이적 항체를 포함한다.
이중특이적 항체 및 적어도 하나의 BASB 를 포함하는 용액을 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉시키기 위한 준비에서, 통상적으로 매질의 화학적 환경을 평형시키는 것이 필수적이다. 이는 매질을 평형 완충액과 접촉시켜 매질에 대한 이중특이적 항체의 결합을 허용하는 적절한 pH, 전도성, 및 염 농도를 확립함으로써 달성된다. 본 발명에 따른 평형 완충액은 농도 약 1 mM 내지 20 mM 의 포스페이트 염, 농도 약 10 mM 내지 200 mM 의 클로라이드 염, 및 농도 약 0.01 mM 내지 0.5 mM 의 칼슘 염을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 발명의 방법에 따른 평형 완충액은 포스페이트 염, 칼슘 염 및 클로라이드 염을 포함한다. 발명의 방법에 따른 평형 완충액은 농도 약 10 mM 의 포스페이트 염, 농도 약 0.1 mM 의 칼슘 염, 및 농도 약 50 mM 의 클로라이드 염을 포함할 수 있다. 발명의 방법에 따른 평형 완충액은 농도 약 10 mM 의 NaH2PO4, 농도 약 0.1 mM 의 CaCl2, 및 농도 약 50 mM 의 NaCl 을 포함할 수 있다.
평형 완충액은 또한 임의로 완충 화합물을 포함하여 적절한 pH 조절을 제공할 수 있다. 완충 화합물은 MES, HEPES, BICINE, 이미다졸, 및 Tris 를 포함할 수 있으나 그에 제한되지 않는다. 비제한적 구현예에서, 발명의 방법에 따른 평형 완충액은 pH 약 6.5 내지 7.5 및 농도 약 20 mM 의 MES 의 존재 하에 농도 약 10 mM 의 포스페이트 염, 농도 약 0.1 mM 의 칼슘 염, 및 농도 약 50 mM 의 클로라이드 염을 포함할 수 있다. 관련된 또는 대안적 비제한적 구현예에서, 발명의 방법에 따른 평형 완충액은 pH 약 6.5 내지 7.5 및 농도 약 20 mM 의 MES 의 존재 하에 농도 약 10 mM 의 NaH2PO4, 농도 약 0.1 mM 의 CaCl2, 및 농도 약 50 mM 의 NaCl 을 포함할 수 있다.
히드록시아파타이트 매질의 평형 후에, 그것은 이중특이적 항체 및 적어도 하나의 BASB 를 포함하는 용액과 접촉될 수 있다. 이중특이적 항체 및 적어도 하나의 BASB 는 전형적으로 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질에 대한 그들의 결합을 허용하는 조건의 용액 중에 있다. 기술분야에 알려진 바와 같이, 그러한 용액은 결합 완충액으로 호칭될 수 있다. 결합 완충액은 본원에서 정의된 바와 같은 평형 완충액과 동일 또는 상이한 조성을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 결합 완충액은 본원에 개요서술된 평형 완충액에 관해 개요서술된 기준에 따라 선별된다. 따라서, 비제한적 구현예에서, 발명의 방법에 따른 결합 완충액은 평형 완충액과 동일하다. 비제한적 구현예에서, 결합-완충액은 pH 약 6.5 내지 7.5 및 농도 약 20 mM 의 MES 의 존재 하에 농도 약 10 mM 의 포스페이트 염, 농도 약 0.1 mM 의 칼슘 염 및 농도 약 50 mM 의 클로라이드 염을 포함할 수 있다. 관련된 또는 대안적인 비제한적 구현예에서, 발명의 방법에 따른 결합 완충액은 pH 약 6.5 내지 7.5 및 농도 약 20 mM 의 MES 의 존재 하에 농도 약 10 mM 의 NaH2PO4, 농도 약 0.1 mM 의 CaCl2 및 농도 약 50 mM 의 NaCl 을 포함할 수 있다. 결합 및 용출 크로마토그래피 방법을 포함하는 하나의 구현예에서, 이중특이적 항체 및 하나 이상의 BASB 를 포함하는 용액은 히드록시아파타이트 매질을 함유하는 컬럼을 통하여 흐르고, 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항체 및 하나 이상의 BASB 는 컬럼에 (즉, 히드록시아파타이트 매질에) 결합한다. 이중특이적 항체 함유 용액에 후에, 통상적으로 평형 완충액 및/또는 결합 완충액과 동일한 조성의, 세정 완충액이 뒤따르거나 그렇지 않을 수 있다. 세정 완충액은, 사용되는 경우에, 하나 이상의 오염물을 컬럼으로부터 제거할 수 있다.
적어도 이중특이적 항체의 결합 및 임의적 세정에 후속하여, 하나 이상의 BASB 를 매질에 결합된 상태로 남기는 조건 하에 및/또는 이중특이적 항체 및 하나 이상의 BASB 가 매질로부터 별도로 용출하는 조건 하에, 이중특이적 항체가 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질로부터 용출된다. 용출 완충액은 전도성 값이 낮게 되는 출발 조성을 갖도록 선택된다. 본원에 공개된 방법에 적합한 낮은 전도성 값을 갖는 용액은 전형적으로 약 13 mS/cm 이하의 값을 갖는다. 본원에 공개된 방법에 적합한 낮은 전도성 값을 갖는 용액은 또한 약 10.6 mS/cm 이하, 또는 약 8.5 mS/cm 이하의 전도성 값을 가질 수 있다. 낮은 전도성 값을 갖는 용출 완충액의 출발 조성의 비제한적 예는 pH 6.5 내지 8.0 의 완충 화합물 (본원에서 결합 및/또는 평형 완충액에 관해 정의된 바와 같음) 의 존재 하에 포스페이트 이온 농도 범위 약 1 mM 내지 약 20 mM, 칼슘 농도 범위 약 0.01 mM 내지 약 0.5 mM, 및 클로라이드 농도 범위 약 10 mM 내지 약 200 mM 를 갖는 용액을 포함한다. 발명의 방법에 따른 용출 완충액은 pH 약 6.5 내지 7.5 의 완충 화합물 (본원에서 결합 및/또는 평형 완충액에 관해 정의된 바와 같음) 의 존재 하에 포스페이트 이온 농도 약 10 mM, 칼슘 농도 약 0.1 mM, 및 클로라이드 농도 약 50 mM 의 출발 조성을 가질 수 있다. 구체적 구현예에서 발명의 방법에 따른 용출 완충액은 pH 6.5 내지 7.5 의 20 mM MES 의 존재 하에 10 mM NaH2PO4, 0.1 mM CaCl2, 및 50 mM NaCl 의 출발 조성을 갖는다. 발명의 방법은 오로지 용출 완충액 중 클로라이드 이온의 농도를 증가시킴으로써 이중특이적 항체를 히드록시아파타이트 매질로부터 용출시킨다. 클로라이드 이온 농도는 선형 기울기, 실행된 단계 기울기 (예를 들어, 도 6 에 나타난 증가하는 클로라이드 이온의 실행된 단계 기울기 참조), 또는 이들 2 개의 기울기의 조합에 따라 증가될 수 있다. 이중특이적 항체를 크로마토그래피 매질로부터 용출시키기 위한 및/또는 이중특이적 항체를 하나 이상의 BASB 로부터 분리하기 위한 (즉, 하나를 용출시키는 한편 다른 하나를 매질에 결합된 상태로 유지하기 위한) 기울기의 최적화는 본원에 함유된 교시에 비추어 통상의 기술자의 능력 범위 내이다. 용출 완충액 중 클로라이드 이온의 농도는 하나 이상의 클로라이드 염의 농도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 클로라이드 이온의 농도를 증가시키기 위해 용출 완충액에 첨가될 수 있는 클로라이드 염의 예는 NaCl 및 KCl 을 포함한다. 특정 구현예에서, 용출 완충액 중 클로라이드 이온의 농도는 NaCl 의 농도를 증가시킴으로써 증가된다. 바람직한 구현예에서, 용출 완충액의 출발 클로라이드 이온 농도는 약 50 mM (이는 하나 이상의 클로라이드 염에 의해 제공될 수 있음) 이고 후속적으로 용출 동안 이중특이적 항체를 용출시키는데 필수적인 농도로 증가된다. 통상의 기술자는 기술분야에 알려지고 본원에 기재된 교시 및 방법에 따른 일상적 방법을 사용하여 흡착된 이중특이적 항체를 용출시키는데 필수적인 클로라이드 이온의 최대 농도를 쉽게 확인할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 BASB 로부터 이중특이적 항체를 용출 및/또는 이중특이적 항체를 분리하기 위한 클로라이드 이온의 최대 농도는 약 200 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM 또는 약 500 mM 이다. 발명의 방법에 따른 예시적 용출 완충액은 pH 약 6.5 내지 7.5 에서 약 10 mM NaH2PO4, 약 50 mM NaCl, 약 20 mM MES, 및 약 0.1 mM CaCl2 의 출발 조성을 가지며, 여기에서 클로라이드 이온의 농도는 후속적으로 용출 단계 동안 NaCl 의 농도를 약 500 mM 까지 선형, 단계형 또는 선형-단계형 기울기에 따라 증가시킴으로써 증가된다.
이 명세서에서 언급된 모든 특허 및 문헌은 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자의 수준을 나타낸다. 특정 형태의 발명이 설명되어 있지만, 그들은 본원에 기재 및 제시된 부분들의 특정 형태 또는 배열에 제한되지 않는다고 이해될 것이다. 발명의 주제에서 벗어나지 않으면서 다양한 변화가 일어날 수 있다는 것이 명백할 것이고, 발명이 명세서에 제시 및 기재된 것에 제한되는 것으로 여겨져서는 안된다. 본원에 기재된 발명이 완전히 이해될 수 있기 위해서, 하기 비제한적 예가 제시된다.
실시예
일반적 방법
항체 발현
항체를 HEK293 세포 (Invitrogen) 에서 일시적으로 발현시켰다. 세포 트랜스펙션을 세포 공급사의 지침에 따라 항체 벡터의 Maxiprep (Qiagen) 제제, Opti-MEM I 매질 (Invitrogen), 293fectin (Invitrogen), 및 무혈청 FreeStyle 293 발현 매질 (Invitrogen) 중 초기 세포 밀도 1-2 x 106 생세포/mL 를 사용하여 수행했다. 셰이크 플라스크 또는 교반되는 발효기에서 7 일 배양 후에, 항체 함유 세포 배양물 상청액을 원심분리에 의해 수확하고 멸균 필터 (0.22 ㎛) 를 통하여 여과했다. 상청액을 수확 직후에 가공하거나 정제 전까지 -80 ℃ 에서 저장했다.
Protein A 친화도 크로마토그래피
멸균 여과된 배양물 상청액으로부터 Protein A - Sepharose 컬럼 (MabSelectSure-Sepharose™ (GE Healthcare, Sweden)) 을 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 Fc 영역/도메인을 함유하는 분자를 정제했다. 간략히, 배양물 상청액을 첫째로 PBS 완충액 (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4) 으로 평형되는 Protein A 컬럼에 적용했다. 컬럼을 후속적으로 평형 완충액으로 세정하고, 항체를 25 mM 소듐 시트레이트, pH 3.0 으로 용출시켰다. 항체 분획을 모으고, 탈염 컬럼을 사용하여 10 mM NaH2PO4, 50 mM NaCl, 20 mM MES, 0.1 mM CaCl2, pH 6.5-7.5 로 완충액 교환하여 또는 확장적 투석 (extensive dialysis) 에 의해 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 준비했다.
히드록시아파타이트 크로마토그래피
히드록시아파타이트 크로마토그래피를 MacroPrep CHT 유형 II 히드록시아파타이트 수지 (BioRad, USA) 를 사용하여 수행했다. 10 mM NaH2PO4, 50 mM NaCl, 20 mM MES, 0,1 mM CaCl2, pH 6.5 - 7.5 로 히드록시아파타이트 수지를 평형시킨 후에, 상기와 같이 준비된 항체 로드 유체를 컬럼에 적용했다. 그 후 컬럼을 평형 완충액으로 세정하고, 결합된 물질을 10 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, 20 mM MES, 0,1 mM CaCl2, pH 6.5 - 7.5 로의 선형 기울기 또는 실행된 단계를 갖는 선형 기울기에 따라 용출시켰다. 용출물 (용출된 분획) 중 단백질 농도를 280 ㎚ 에서의 흡광도에 의해 모니터링했다 (본원에 명시된 크로마토그램으로서 제시됨).
CE-SDS 분석
히드록시아파타이트 크로마토그래피 전 및 후에 둘다, 이중특이적 항체, 이중특이적 항체 분절 및/또는 이중특이적 항체 특이적 부산물의 백분율 (추정된 분자량을 포함함) 의 확인을 포함하여, 로드 및/또는 분획 조성물을 소듐 도데실 설페이트 모세관 전기영동 (CE-SDS) 에 의해 분석했다. CE-SDS 를 제조사의 지침에 따라 미세유체 Labchip 기술 (PerkinElmer, USA) 을 사용하여 수행했다. 간략히, 5 ㎕ 의 로드 유체 (프리-히드록시아파타이트 크로마토그래피; 이는 Protein A 친화도 컬럼으로부터 용출된 용출물 (즉, 항체) 임) 및 히드록시아파타이트 컬럼으로부터의 용출물을 제조사의 지침에 따라 HT Protein Express Reagent Kit 를 사용하는 CE-SDS 분석을 위해 준비하고, LabChip GXII 시스템에서 HT Protein Express Chip 을 사용하여 분석했다. 데이타를 LabChip GX Software 를 사용하여 분석했다.
실시예 1: 1/2 항체 분절 및 이중특이적 CrossMab EGFR-IGFR 의 분리
방법
항-EGFR/항-IGFR 이중특이적 항체를, 예를 들어, Schaefer et al., PNAS USA 108(2011), 11187-11192 에 기재된 CrossMab 및 놉 인 홀 (KiH) 방법에 따라 디자인했다. 위의 일반적 방법에 기재된 바와 같이 이중특이적 항체를 발현시키고, Protein A 친화도 크로마토그래피를 사용하여 배양물 상청액으로부터 정제하고, CE-SDS 로 분석했다.
Protein A 친화도 정제에 후속하여, 항체 함유 용액을 히드록시아파타이트 컬럼에 로딩하고, 상기와 같은 선형 염 기울기로 용출시켰다.
결과
Protein A 컬럼으로부터 용출된 항체 함유 분획을 모아서 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 위한 로드 유체를 형성하고 단백질 조성에 대해 분석했다. CE-SDS 분석은 로드 유체가 2 가지 우세한 단백질 종을 함유했음을 밝혔다. 총 단백질의 약 43% 가 대략적 분자량 94 kD 를 갖는 단백질이었고 약 33% 가 대략적 분자량 160 kD 를 갖는 단백질이었다; 2 가지 단백질 종은 각각 1/2 항체 분절 (즉, 단일 중쇄 및 단일 경쇄를 함유하는 이중특이적 항체의 분절) 및 "완전한" 이중특이적 항체로서 확인되었다 (도 1).
로드 유체를 히드록시아파타이트 컬럼에 적용하고 상기와 같은 그리고 도 2 에 경사진 선으로 나타난 바와 같은 선형 염 기울기로 용출시켰다. 도 2 는 또한 280 ㎚ 에서의 UV 흡수에 의해 모니터링된 히드록시아파타이트 컬럼으로부터의 용출 프로파일을 보여준다. 1/2 항체 종은 히드록시아파타이트 컬럼으로부터 더 낮은 염 농도에서 용출되었고 원하는 이중특이적 항체의 동시용출은 거의 없었다: 도 2 의 왼쪽 회색 박스에 의해 표시되는 모아진 분획 중 총 단백질의 약 92% 는 1/2 항체 부산물/오염물이고, 4% 미만이 이중특이적 항체인 것으로 밝혀졌다 (CE-SDS 에 의해 확인됨, 도 3). 이중특이적 항체는 두번째 피크로서 용출되었다: 도 2 의 오른쪽 회색 박스에 의해 표시되는 모아진 분획 중 단백질의 약 80% 는 이중특이적 항체인 것으로 밝혀졌다 (CE-SDS 에 의해 확인됨, 도 4).
결과는 발명의 방법이 적어도 1/2 항체 부산물/오염물로부터의 이중특이적 항체의 쉬운 분리를 가능하게 한다는 것을 입증한다.
실시예 2: 1/2 항체 분절 및 이중특이적 scFab Ang2-VEGF 의 분리
방법
실시예 2 는 실시예 1 의 방법을 따르지만 다음과 같이 다르게 했다: 이중특이적 항체는 KiH 방법을 사용하여, 그러나 CrossMab 방법을 사용하지 않고 디자인된 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체였다. 대신, Ang2 특이적 가변 도메인을 scFab 로서 디자인했으며, 이는 본원에, 예를 들어, 배경기술 부분에 기재된 바와 같이 다양한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 부적절한 쌍형성을 방지했다. 추가로, Protein A 포획에 후속하여, 항체 함유 용액을 실행된 단계를 갖는 선형 염 기울기를 사용하여 히드록시아파타이트 컬럼으로부터 용출시켰다.
결과
Protein A 친화도 크로마토그래피로부터의 모아진 항체 함유 분획의 CE-SDS 분석은 히드록시아파타이트 크로마토그래피 전의 로드 유체가 3 가지 우세한 단백질 종을 함유했음을 밝혔다: 약 16% 는 1/2 항체 분절이고, 약 77% 는 원하는 이중특이적 항체이고, 약 6% 는 더 높은 분자량 응집물이었다 (도 5).
로드 유체를 히드록시아파타이트 컬럼에 적용하고, 도 6 에서 단계형 및 경사진 선에 의해 나타나는 실행된 단계를 갖는 선형 염 기울기로 용출시켰다. 도 6 은 또한 280 ㎚ 에서의 UV 흡광도에 의해 모니터링된 히드록시아파타이트 컬럼으로부터의 용출 프로파일을 보여준다. 1/2 항체 종은 이중특이적 항체보다 상당히 더 낮은 염 농도에서 용출되었고, "완전한" 이중특이적 종 및 더 큰 응집물로부터 전부 분리될 수 있었다. 낮은 염 농도에서 용출하는 단백질 종의 100% 는 1/2 항체 분절인 것으로 밝혀졌다 (도 7: 도 6 의 굵은 수직 선의 왼쪽에 있는 모아진 분획의 분석). 그 후 염 농도가 증가함에 따라 이중특이적 항체 및 항체 응집물이 별도로 용출되었다. 이중특이적 항체를 함유하는 모아진 분획 (도 6 에서 검은색 실선의 오른쪽에 있는 첫번째 피크에 해당함) 은 약 97% 순수한 이중특이적 항체인 것으로 밝혀졌다 (도 8).
결과는 발명의 방법이 적어도 1/2 항체 부산물/오염물 뿐만 아니라 5/4 항체 부산물/오염물을 포함하는 항체 응집물로부터의 이중특이적 항체의 쉬운 분리를 가능하게 한다는 것을 입증한다.
실시예 3: 3/4 항체 분절 및 이중특이적 CrossMab Ang2-VEGF 의 분리
방법
실시예 2 를 반복했으나, CrossMab 방법에 따라 디자인된 이중특이적 Ang2-VEGF 항체를 사용했다. 다시, Protein A 포획에 후속하여, 항체 함유 용액을 선형 염 기울기를 사용하여 히드록시아파타이트 컬럼으로부터 용출시켰다.
결과
Protein A 친화도 크로마토그래피로부터의 모아진 항체 함유 분획의 CE-SDS 분석은 히드록시아파타이트 크로마토그래피 전의 로드 유체가 약 7.8% 의 3/4 항체 분절 (즉, 하나의 경쇄를 결여하는 이중특이적 항체) 및 85% 이중특이적 항체 (데이타가 제시되지 않음) 를 함유했음을 밝혔다.
로드 유체를 히드록시아파타이트 컬럼에 적용하고, 도 9 에 경사진 선으로 나타나는 선형 염 기울기로 용출시켰다. 3/4 항체는 도 9 에서 피크의 측면 분획이 풍부했다. 예를 들어, 분획 C4 (도 9) 는 95% 이중특이적 항체 및 1.8% 3/4 항체를 함유했다; 분획 D8 은 78% 이중특이적 항체 및 9.1% 3/4 항체를 함유했다. 따라서, 결과는 발명의 방법이 적어도 3/4 항체 부산물/오염물로부터의 이중특이적 항체의 실질적 분리를 가능하게 한다는 것을 입증한다.
실시예 4: 1/2 항체 분절 및 이중특이적 scFab EGFR-IGFR 의 분리
방법
실시예 4 는 실시예 2 의 방법을 따르지만 다음과 같이 다르게 했다: 이중특이적 항체는 항-EGFR/항-IGFR 이중특이적 항체였다. 실시예 2 에서와 같이, 이중특이적 항체를 KiH 을 사용하여, 그러나 CrossMab 방법을 사용하지 않고 디자인했으며, IGFR 항원 결합 도메인은 scFab 였다. 항체 함유 분획을 실행된 단계를 갖는 선형 염 기울기를 사용하여 히드록시아파타이트 컬럼으로부터 용출시켰다.
결과
Protein A 친화도 크로마토그래피로부터의 모아진 항체 함유 분획의 CE-SDS 분석은 히드록시아파타이트 크로마토그래피 전의 로드 유체가 3 가지 우세한 단백질 종을 함유했음을 밝혔으며, 이는 실시예 2 에서 관찰된 것과 일치한다: 약 25% 는 1/2 항체 분절이고, 약 57% 는 원하는 이중특이적 항체이고, 약 14% 는 더 높은 분자량 응집물이었다 (도 10).
로드 유체를 히드록시아파타이트 컬럼에 적용하고, 도 11 에서 단계형 및 경사진 선에 의해 나타나는 실행된 단계를 갖는 선형 염 기울기로 용출시켰다. 1/2 항체 종은 낮은 염 농도에서 용출되었으며, 이중특이적 항체 및 항체 응집물은 계속해서 더 높은 농도에서 별도로 용출되었다 (도 11). 이중특이적 항체의 용출 피크로부터 모아진 분획은 약 97% 이중특이적 항체를 함유했으며, 1/2 항체 분절/부산물 또는 응집물로부터의 오염이 적은 것으로 확인되었다 (도 12). 따라서, 선형 및 단계형 염 기울기는 1/2 항체 분절/부산물 및 항체 응집물 둘 모두로부터의 이중특이적 항체의 쉬운 분리 및 정제를 가능하게 했다.
실시예 5: 5/4 항체 및 이중특이적 scFab TWEAK-IL17 의 분리
방법
실시예 5 는 실시예 2 및 3 의 방법을 따르지만 다음과 같이 다르게 했다: 이중특이적 항체는 항-TWEAK/항-IL17 이중특이적 항체였다. 실시예 2 및 3 에서와 같이, 이중특이적 항체는 KiH 을 사용하여, 그러나 CrossMab 방법을 사용하지 않고 디자인했으며, TWEAK 항원 결합 도메인은 scFab 였다. 항체 함유 분획을 실행된 단계를 갖는 선형 염 기울기를 사용하여 히드록시아파타이트 컬럼으로부터 용출시켰다.
결과
Protein A 친화도 크로마토그래피로부터의 모아진 항체 함유 분획의 CE-SDS 분석은 히드록시아파타이트 크로마토그래피 전의 로드 유체가 2 개의 우세한 단백질 분획을 함유했음을 밝혔다: 약 17% 는 5/4 항체 종 (아마도 추가의 IL17 경쇄를 함유함) 이었으며, 한편 약 68% 는 원하는 이중특이적 항체의 겉보기 분자량을 갖는 분획이었다 (도 13). 후속 분석은 이중특이적 단백질의 겉보기 분자량을 갖는 단백질을 함유하는 분획이 이중특이적 단백질 및 항-IL17 중쇄/경쇄 쌍의 동종이합체, 즉, 단일특이적 또는 "표준" 항-IL17 항체 등가물의 혼합물이었음을 밝혔다 (데이타가 제시되지 않음; 환원 조건 하에 수행되는 CE-SDS 에 의해 확인됨).
로드 유체를 히드록시아파타이트 컬럼에 적용하고, 도 14 에서 경사진 및 단계형 선으로 나타나는 실행된 단계를 갖는 선형 염 기울기로 용출시켰다. 이중특이적 항체 및 동종이합체는 더 낮은 염 농도에서 단일 피크로 동시용출되었다 (첫번째 피크, 도 14 및 도 15 참조). 5/4 항체는 더 높은 염 농도에서 별도로 용출되었다 (도 14 에서, 세번째 피크 참조; 네번째 피크는 단백질 응집물임). 첫번째 용출 피크로부터의 모아진 분획은 오직 이중특이적 항체 및 동종이합체를 함유하는 것으로 확인되었으며, 더 높은 분자량 종, 예를 들어, 5/4 항체로부터의 오염은 관찰가능하지 않았다 (도 15). 유사하게, 5/4 항체와 관련된 용출 피크의 모아진 분획은 그것이 용출될 때 이중특이적 항체 또는 동종이합체로부터의 오염이 탐지가능하지 않았음이 밝혀졌다 (도 16). 따라서, 선형 및 단계형 염 기울기는 관심의 분자보다 오직 미미하게 더 큰 분자량을 갖는 적어도 5/4 항체 및/또는 부산물로부터의 이중특이적 항체의 쉬운 분리 및 정제를 가능하게 했다.
실시예 6: 동종이합체 및 이중특이적 scFab TWEAK-IL17 의 분리
방법
실시예 5 는 발명의 방법에 따른 히드록시아파타이트 크로마토그래피가 이중특이적 항체를 5/4 항체 오염물로부터 분리할 수 있음을 입증했다; 그러나, 이중특이적 항체는 쌍을 이룬 항-IL17 중쇄/경쇄의 동종이합체 (즉, "표준" 또는 단일특이적 항-IL17 항체 등가물) 와 동시용출되었다. 동종이합체 및 이중특이적 항체의 분리를 PorosHS50 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 선형 염 기울기를 사용하여 조사했다.
결과
실시예 5 에서 보고되는 바와 같이, Protein A 친화도 크로마토그래피에 후속하여 이중특이적 scFab TWEAK-IL17 의 생산으로부터의 로드 유체는 3 가지 단백질 종을 함유했다: 이중특이적 항체, 항-IL17 동종이합체 및 5/4 항체. 로드 유체를 양이온 교환 크로마토그래피에 적용하고, 도 17 에 나타난 바와 같이 선형 염 기울기를 사용하여 용출시켰다. 로드 유체로부터의 단백질은 2 개의 피크로 용출되었다 (도 17). 첫번째 피크의 모아진 분획의 CE-SDS 분석은 그들이 이중특이적 항체 및 5/4 항체 종을 함유했음을 밝혔다 (실시예 5 및 도 18 (비-환원 조건 하의 CE-SDS) 참조). 두번째 피크의 모아진 분획의 CE-SDS 분석은 그들이 오로지 IL-17 동종이합체를 함유했음을 밝혔다 (도 19, 환원 조건 하의 CE-SDS). 따라서, 양이온 교환 컬럼의 사용은 동종이합체 분자로부터의 이중특이적 항체 및/또는 5/4 항체 오염물 종의 쉬운 분리를 가능하게 했다. 실시예 5 는 동시용출된 이중특이적 항체 및 5/4 항체 오염물이 그 후 본원에 기재된 바와 같은 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용하여 쉽게 분리될 수 있음을 입증한다. 실시예 5 및 6 의 결과의 차이는 본원에 기재된 바와 같은 히드록시아파타이트 크로마토그래피 방법이 기술분야에 알려진 이전의 방법, 예를 들어, 이온-교환 크로마토그래피와 구별되는 독특한 크로마토그래피 도구를 제공한다는 추가의 증거를 제공한다. 따라서, 기타 크로마토그래피 방법과 임의로 조합된, 본원에 기재된 바와 같은 히드록시아파타이트 크로마토그래피의 사용은 이중특이적 항체 생산에 특이적인 부산물로부터의 이중특이적 항체의 분리를 가능하게 한다.

Claims (13)

  1. Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 상기 이중특이적 항체를 포함하는 용액으로부터 분리하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 상기 용액을 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계,
    (b) 상기 이중특이적 항체를 상기 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질에 흡착시키는 단계, 및
    (c) 상기 이중특이적 항체를 클로라이드 이온의 존재 하에 상기 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질로부터 용출시키는 단계를 포함하며,
    여기에서
    상기 용액은 상기 이중특이적 항체의 하나 이상의 분절 (이러한 하나 이상의 분절은 Fc 도메인을 포함함) 을 추가로 포함하고/거나;
    상기 용액은 상기 이중특이적 항체의 분자량보다 큰 분자량을 갖고 상기 이중특이적 항체의 2 개의 중쇄 중 적어도 하나를 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 (이러한 하나 이상의 폴리펩티드는 또한 Fc 도메인을 포함함) 를 추가로 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 단계 (c) 가 상기 이중특이적 항체를 함유하지만 상기 하나 이상의 분절 중 적어도 하나를 함유하지 않고/거나 상기 하나 이상의 폴리펩티드 중 적어도 하나를 함유하지 않는 용출물 분획을 수득하는 것을 포함하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 분절 중 적어도 하나는 1/2 항체 또는 3/4 항체이고/거나;
    상기 하나 이상의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 5/4 항체인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용출이 pH 6.5 내지 7.5, 포스페이트 이온 농도 약 1 mM 내지 약 20 mM, 칼슘 이온 농도 약 0.001 mM 내지 약 0.5 mM 및 클로라이드 이온 농도 약 10 mM 내지 약 200 mM 을 갖는 용출 완충액의 존재 하에 실시되는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 용출이 pH 6.5 내지 7.5, 포스페이트 이온 농도 약 10 mM, 칼슘 이온 농도 약 0.1 mM 을 갖는 용출 완충액의 존재 하에 실시되고, 클로라이드 이온의 농도가 약 50 mM 로부터 약 500 mM 까지의 기울기로 증가되는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 기울기가 선형 기울기, 단계형 기울기, 또는 그들의 조합인 선형-단계형 기울기인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액이 항체 Fc 도메인, 항체 경쇄의 카파 도메인, 및/또는 항체 경쇄의 람다 도메인에 대해 특이성을 갖는 친화도 크로마토그래피 매질의 용출물로부터의 이중특이적 항체-함유 분획 또는 모아진 (pooled) 이중특이적 항체-함유 분획을 포함하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체를 상기 분절, 상기 폴리펩티드 및/또는 1/2 항체 동종이합체 중 적어도 하나로부터 분리하는 상류 또는 하류 이온 교환 크로마토그래피 과정을 추가로 포함하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 이온 교환 단위 조작이 양이온 교환 단위 조작인 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체가 CrossMab 이중특이적 항체이거나 상기 이중특이적 항체의 중쇄 중 하나가 scFab 를 포함하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체가 놉-인-홀 (Knob-in-Hole) (KiH) 이중특이적 항체인 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체가 CrossMab 및 KiH 이중특이적 항체이고, 상기 이중특이적 항체가 EGFR 및 IGFR 에 대해 특이성을 갖거나, Ang2 및 VEGF 에 대해 특이성을 갖는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체의 중쇄 중 하나가 scFab 를 포함하고, 상기 이중특이적 항체가 KiH 이중특이적 항체이고, 상기 이중특이적 항체가 Ang2 및 VEGF 에 대해 특이성을 갖거나, EGFR 및 IGFR 에 대해 특이성을 갖거나, TWEAK 및 IL17 에 대해 특이성을 갖는 방법.
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