JP6560673B2 - ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた二重特異性抗体および二重特異性抗体生産副産物の分離法 - Google Patents
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた二重特異性抗体および二重特異性抗体生産副産物の分離法 Download PDFInfo
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本発明は、二重特異性抗体生産に特有の1種または複数種の副産物も含む溶液から二重特異性抗体を分離するためのハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの使用を含む方法に指向している。二重特異性抗体の生産に特有の副産物(二重特異性抗体特有副産物(bispecific antibody specific byproduct)、「BASB」)は、二重特異性抗体の断片と、該抗体のより重い分子量の変異体とを含み、該断片および/または該変異体はFcドメインを含むが、所望の二重特異性抗体によって示される2つの異なるエピトープおよび/または抗原に対する親和性を示さない。したがって、本発明の方法は、二重特異性抗体の、そのBASBのうちの1種または複数種からの分離を含む。本発明のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法は、単独で使用してもよいか、あるいは、治療用途および/または診断用途などに必要な二重特異性抗体の任意のレベルの純度を達成するために、当技術分野で公知の標準的な精製工程および単位操作とさらに組み合わせてもよい。
二重特異性抗体の治療可能性は、長い間認識されてきた。二重特異性抗体は、2つの抗原または2つのエピトープに同時に結合することができるIgG様プラットフォームを提供する。したがって、二重特異性抗体は、少なくとも2つの分子の相互作用および/または該分子を含む少なくとも2つのシステムの相互作用を調節するための有望なツールを提供する。このような調節は、例えば、認識される抗原および/またはエピトープが細胞の表面に発現される場合の、これら2つの細胞の相互作用の調節であってよい。二重特異性抗体の治療的使用の例としては、例えば、細胞シグナル伝達の調節(例えば、所望の表面受容体またはリガンドの相互作用を促進または妨害することによる)および癌治療(例えば、癌細胞に免疫細胞を標的化するのを助ける)が挙げられる。
一般的に、下記の用語または語句は、要約、説明、実施例、および特許請求の範囲で使用される場合、示された定義を有する。
[本発明1001]
Fcドメインを含む二重特異性抗体を、該二重特異性抗体を含む溶液から分離する方法であって、
(a) 該溶液をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体と接触させる段階、
(b) 該二重特異性抗体を該ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体に吸着させる段階、および
(c) 塩化物イオンの存在下で該ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体から該二重特異性抗体を溶出する段階
を含み、
該溶液が、該二重特異性抗体の1種もしくは複数種の断片をさらに含み、該1種もしくは複数種の断片がFcドメインを含み、かつ/または
該溶液が、1種もしくは複数種のポリペプチドをさらに含み、該1種もしくは複数種のポリペプチドが、該二重特異性抗体の分子量よりも大きい分子量を有し、かつ該二重特異性抗体の2本の重鎖のうちの少なくとも一方を含み、該1種もしくは複数種のポリペプチドがFcドメインをさらに含む、方法。
[本発明1002]
段階(c)が、溶出画分を得ることを含み、該画分が、前記二重特異性抗体を含有するが、前記1種もしくは複数種の断片のうちの少なくとも1種を含有せず、かつ/または前記1種もしくは複数種のポリペプチドのうちの少なくとも1種を含有しない、本発明1001に記載の方法。
[本発明1003]
前記1種もしくは複数種の断片のうちの少なくとも1種が 1 / 2 抗体もしくは 3 / 4 抗体であり、かつ/または
前記1種もしくは複数種のポリペプチドのうちの少なくとも1種が5/4抗体である、
本発明1002に記載の方法。
[本発明1004 ]
前記溶出が、6.5〜7.5のpH、約1mM〜約20mMのリン酸イオン濃度、約0.001mM〜約0.5mMのカルシウムイオン濃度、および約10mM〜約200mMの塩化物イオン濃度を有する溶出緩衝液の存在下である、本発明1001〜1003のいずれか一項に記載の方法。
[本発明1005]
前記溶出が、6.5〜7.5のpH、約10mMのリン酸イオン濃度、約0.1mMのカルシウムイオン濃度を有する溶出緩衝液の存在下であり、かつ塩化物イオンの濃度が、約50mMから約500mMまでの勾配で増加する、本発明1004に記載の方法。
[本発明1006]
前記勾配が、直線勾配、段階的勾配、または、直線-段階的勾配でのそれらの組み合わせである、本発明1005に記載の方法。
[本発明1007]
前記溶液が、抗体Fcドメインに対する特異性、抗体軽鎖のκドメインに対する特異性、および/または抗体軽鎖のλドメインに対する特異性を有するアフィニティクロマトグラフィー媒体の溶出液由来の二重特異性抗体含有画分またはプールされた二重特異性抗体含有画分を含む、本発明1001〜1006のいずれか一項に記載の方法。
[本発明1008]
上流または下流のイオン交換クロマトグラフィー工程をさらに含み、該工程が、前記断片、前記ポリペプチド、および/または 1 / 2 抗体ホモ二量体のうちの少なくとも1種から前記二重特異性抗体を分離する、本発明1001〜1007のいずれか一項に記載の方法。
[本発明1009]
前記イオン交換単位操作がカチオン交換単位操作である、本発明1008に記載の方法。
[本発明1010]
前記二重特異性抗体がCrossMab二重特異性抗体であるか、または該二重特異性抗体の重鎖のうちの一方がscFabを含む、本発明1001〜1009のいずれか一項に記載の方法。
[本発明1011]
前記二重特異性抗体がknob-in-hole(KiH)二重特異性抗体である、本発明1001〜1010のいずれか一項に記載の方法。
[本発明1012]
前記二重特異性抗体がCrossMabおよびKiH二重特異性抗体であり、かつ該二重特異性抗体が、EGFRおよびIGFRに対する特異性を有するか、またはAng2およびVEGFに対する特異性を有する、本発明1001〜1011のいずれか一項に記載の方法。
[本発明1013]
前記二重特異性抗体の重鎖のうちの一方がscFabを含み、該二重特異性抗体がKiH二重特異性抗体であり、かつ該二重特異性抗体が、Ang2およびVEGFに対する特異性を有するか、EGFRおよびIGFRに対する特異性を有するか、またはTWEAKおよびIL17に対する特異性を有する、本発明1001〜1011のいずれか一項に記載の方法。
驚くべきことに、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、二重特異性抗体生産に特有の少なくとも1種の副産物(すなわち、少なくとも1種の二重特異性抗体特有副産物、「BASB」)から二重特異性抗体を分離するために使用できることが判明した。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、タンパク質精製工程において、凝集物、DNA、および内毒素などの不純物から高度の精製をもたらすことが示されているが、ごくわずかに異なるIEPを有する分子を分離することは実証されていない(例えば、Gagnon et al., Hydroxyapatite as a Capture Method for Purification of Monoclonal Antibodies, IBC World Conference and Exposition, San Francisco (2006)を参照されたい)。一般的に、二重特異性抗体およびBASBは、それらのIEP値がせいぜい0.5のpHしか異なっておらず、このことは、本発明および本教示以前には、イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離するにはあまりにも接近しすぎると考えられた。その結果、二重特異性抗体を精製する試みは、一般的に、二重特異的活性を有する分子の精製を確実にするために複数の高価なアフィニティ段階を使用することに依拠している。対照的に、本発明の方法は、二重特異性抗体および少なくとも1種のBASBを分離するための簡略化および/または改良された精製プロトコールを提供する。
抗体発現
抗体はHEK293細胞(Invitrogen社)において一過的に発現させた。細胞のトランスフェクションは、細胞供給業者の指示に従って、抗体ベクターのMaxiprep(Qiagen社)製品、Opti-MEM I培地(Invitrogen社)、293fectin(Invitrogen社)、および無血清FreeStyle 293発現培地(Invitrogen社)中の1〜2×106個 生細胞/mLの初期細胞密度を使用して行った。振盪フラスコ内または撹拌型発酵槽内で7日間培養した後、抗体含有細胞培養上清を遠心分離により回収し、滅菌フィルター(0.22μm)を通して濾過した。上清は回収後直ちに処理するか、精製まで-80℃で保存した。
Fc領域/ドメインを含む分子は、プロテインA-セファロースカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって、滅菌濾過した培養上清から精製した(MabSelectSure-Sepharose(商標)(GE Healthcare社, スウェーデン))。簡単に説明すると、培養上清をPBS緩衝液(10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および2.7mM KCl、pH7.4)で平衡化したプロテインAカラムに最初にアプライした。続いて、このカラムを平衡化緩衝液で洗浄し、抗体を25mMクエン酸ナトリウムpH3.0で溶出した。抗体画分をプールし、脱塩カラムを用いた10mM NaH2PO4、50mM NaCl、20mM MES、0.1mM CaCl2、pH6.5〜7.5への緩衝液交換によって、または透析によって、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー用に調製した。
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、MacroPrep CHTタイプIIハイドロキシアパタイト樹脂(BioRad社, USA)を用いて行った。そのハイドロキシアパタイト樹脂を10mM NaH2PO4、50mM NaCl、20mM MES、0.1mM CaCl2、pH6.5〜7.5で平衡化した後、上記のように調製した抗体負荷流体をカラムにアプライした。次いで、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、結合された物質を10mM NaH2PO4、500mM NaCl、20mM MES、0.1mM CaCl2、pH6.5〜7.5への直線勾配または組み込まれた段を有する直線勾配で溶出した。溶出液(溶出画分)中のタンパク質濃度は、280nmでの吸光度によりモニターした(本明細書に示されるように、クロマトグラムとして提示される)。
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの前後に、二重特異性抗体、二重特異性抗体断片、および/または二重特異性抗体特有副産物の割合の測定を含めて、負荷および/または画分組成(推定分子量を含む)をドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動(CE-SDS)によって分析した。CE-SDSは、マイクロ流体Labchip技術(PerkinElmer社, USA)を用いて、製造業者の説明書に従って行った。簡単に説明すると、5μlの負荷流体(プレ-ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー;すなわち、プロテインAアフィニティカラムから溶出された溶出液(つまり抗体))およびハイドロキシアパタイトカラムからの溶出液を、HT Protein Express試薬キットを製造業者の説明書に従って用いてCE-SDS分析用に調製し、HT Protein Expressチップを用いてLabChip GXIIシステムで分析した。データは、LabChip GXソフトウェアを用いて解析した。
方法
抗EGFR/抗IGFR二重特異性抗体は、例えば、Schaefer et al., PNAS USA 108(2011), 11187-11192に記載された、CrossMabおよびknob in hole(KiH)の方法に従って設計した。その二重特異性抗体を発現させ、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーを用いて培養上清から精製し、一般的方法で上述したようにCE-SDSにより分析した。
プロテインAカラムから溶出された抗体含有画分をプールして、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー用の負荷流体を形成させ、タンパク質組成について分析した。CE-SDS分析により、負荷流体が2つの主要なタンパク質種を含むことが明らかになった。総タンパク質の約43%は約94kDの分子量を有するタンパク質であり、約33%は約160kDの分子量を有するタンパク質であった。これら2つのタンパク質種は、それぞれ1/2抗体断片(すなわち、単一重鎖と単一軽鎖を含む二重特異性抗体の断片)および「完全な」二重特異性抗体として同定された(図1)。
方法
実施例2は、以下を除いては実施例1の手法に従う:二重特異性抗体が、CrossMab法ではなくKiH法を用いて設計された抗Ang2/抗VEGF二重特異性抗体であったこと。その代わりに、Ang2特異的可変ドメインはscFabとして設計され、これは、本明細書に、例えば背景技術の項に、記載されるように、種々の軽鎖および重鎖可変ドメインの不適切な対合を防止した。さらに、プロテインA捕捉に続いて、抗体含有溶液は、組み込まれた段を有する直線塩勾配を用いてハイドロキシアパタイトカラムから溶出させた。
プロテインAアフィニティクロマトグラフィーからプールされた抗体含有画分のCE-SDS分析により、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー前の負荷流体が3つの主要なタンパク質種を含有することが明らかになった。すなわち、約16%は1/2抗体断片であり、約77%は所望の二重特異性抗体であり、かつ約6%は高分子量の凝集物であった(図5)。
方法
実施例2を繰り返したが、CrossMab手法に従って設計した二重特異性Ang2-VEGF抗体を用いた。この場合も、プロテインA捕捉に続いて、抗体含有溶液は、直線塩勾配を用いてハイドロキシアパタイトカラムから溶出させた。
プロテインAアフィニティクロマトグラフィーからプールされた抗体含有画分のCE-SDS分析により、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー前の負荷流体が、約7.8%の3/4抗体断片(すなわち、1本の軽鎖を欠く二重特異性抗体)および85%の二重特異性抗体を含むことが明らかになった(データは示さず)。
方法
実施例4は、以下を除いては実施例2の手法に従う:二重特異性抗体を抗EGFR/抗IGFR二重特異性抗体としたこと。実施例2と同様に、二重特異性抗体は、CrossMab手法ではなくKiHを用いて設計され、IGFR抗原結合ドメインがscFabであった。抗体含有画分は、組み込まれた段を有する直線塩勾配を用いてハイドロキシアパタイトカラムから溶出させた。
プロテインAアフィニティクロマトグラフィーからプールされた抗体含有画分のCE-SDS分析により、実施例2について観察されたものと同様に、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー前の負荷流体が3つの主要なタンパク質種を含むことが明らかになった。すなわち、約25%は1/2抗体断片であり、約57%は所望の二重特異性抗体であり、かつ約14%は高分子量の凝集物であった(図10)。
方法
実施例5は、以下を除いては実施例2および3の手法に従う:二重特異性抗体を抗TWEAK/抗IL17二重特異性抗体としたこと。実施例2および3と同様に、二重特異性抗体は、CrossMab手法ではなくKiHを用いて設計され、TWEAK抗原結合ドメインがscFabであった。抗体含有画分は、組み込まれた段を有する直線塩勾配を用いてハイドロキシアパタイトカラムから溶出させた。
プロテインAアフィニティクロマトグラフィーからプールされた抗体含有画分のCE-SDS分析により、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー前の負荷流体が2つの主要なタンパク質画分を含むことが明らかになった。すなわち、約17%は5/4抗体種(おそらく余分なIL17軽鎖を含む)であったが、約68%は所望の二重特異性抗体の見かけの分子量を有する画分であった(図13)。その後の分析は、二重特異性タンパク質の見かけの分子量を有するタンパク質を含む画分が二重特異性タンパク質と、抗IL17重鎖/軽鎖対のホモ二量体との、すなわち、単一特異性または「標準」抗IL17抗体の等価物との混合物であることを明らかにした(データは示さず;還元条件下で行ったCE-SDSにより確認)。
方法
実施例5は、本発明の方法によるハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーが5/4抗体汚染物質から二重特異性抗体を分離することができることを実証したが;二重特異性抗体は、抗IL17重鎖/軽鎖対のホモ二量体(すなわち、「標準」または単一特異性抗IL17抗体に等しい)と共溶出した。ホモ二量体と二重特異性抗体の分離は、直線塩勾配を用いたPorosHS50カチオン交換クロマトグラフィーを使用して調べた。
実施例5について報告したように、プロテインAアフィニティクロマトグラフィー後の二重特異性scFab TWEAK-IL17の生産からの負荷流体は、3つのタンパク質種:二重特異性抗体、抗IL17ホモ二量体、および5/4抗体を含んでいた。負荷流体をカチオン交換クロマトグラフィーに供して、図17に示すように直線塩勾配を用いて溶出した。負荷流体由来のタンパク質は2つのピークで溶出した(図17)。最初のピークのプール画分のCE-SDS分析により、それらが二重特異性抗体と5/4抗体種とを含むことが明らかになった(実施例5および図18(非還元条件下でのCE-SDS)参照)。2番目のピークのプール画分のCE-SDS分析により、それらがもっぱらIL-17ホモ二量体を含むことが明らかになった(図19参照、還元条件下でのCE-SDS)。したがって、カチオン交換カラムの使用は、ホモ二量体分子からの二重特異性抗体および/または5/4抗体汚染物質種の容易な分離を可能にした。実施例5は、共溶出した二重特異性抗体および5/4抗体汚染物質がその後、本明細書に記載するようなハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて容易に分離できることを示している。実施例5および6の結果の差は、本明細書に記載のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法が、当技術分野で公知の従来の方法、例えばイオン交換クロマトグラフィーとは異なる、独特のクロマトグラフィーツールをもたらすというさらなる証拠を提供する。したがって、本明細書に記載のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを、任意で他のクロマトグラフィー法と組み合わせて、使用することは、二重特異性抗体生産に特有の副産物からの二重特異性抗体の分離を可能にする。
Claims (10)
- Fcドメインを含む二重特異性抗体を、該二重特異性抗体を含む溶液から分離する方法であって、
(a) 該溶液をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体と接触させる段階であって、該溶液が
(i)該二重特異性抗体の1種もしくは複数種の断片、ここで、1種もしくは複数種の断片はFcドメインを含み;かつ/または
(ii)抗体重鎖のヘテロ二量体またはホモ二量体、単一の抗体軽鎖およびFabまたはscFab断片を有する1種もしくは複数種の二重特異性抗体特有副産物(BASB)、ここで1種もしくは複数種のBASBはFcドメインを含む;
をさらに含み、
(b)該二重特異性抗体を該ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体に吸着させる段階、および
(c)塩化物イオンの存在下で該ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体から該二重特異性抗体を溶出する段階であって、該溶出が
(i)6.5〜8.0のpH、1mM〜20mMのリン酸イオン濃度、0.01mM〜0.5mMのカルシウムイオン濃度、および10mM〜200mMの塩化物イオン濃度を有する溶出緩衝液の出発組成;
(ii)勾配による該出発組成の塩化物イオン濃度の増加;および
(iii) 溶出画分を得ること、ここで、画分は、該二重特異性抗体を含有するが、該1種もしくは複数種の断片のうちの少なくとも1種を含有せず、かつ/または該1種もしくは複数種のBASBのうちの少なくとも1種を含有しない、
を含む、段階
を含む、方法。 - 前記溶出緩衝液の出発組成が、6.5〜7.5のpH、10mMのリン酸イオン濃度、0.1mMのカルシウムイオン濃度および50mMの塩化物イオン濃度を有し、かつ、塩化物イオンの濃度の増加が、50mMから500mMまでの勾配における増加である、請求項1に記載の方法。
- 前記勾配が、直線勾配、段階的勾配、または、直線-段階的勾配でのそれらの組み合わせである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記溶液が、抗体Fcドメインに対する特異性、抗体軽鎖のκドメインに対する特異性、および/または抗体軽鎖のλドメインに対する特異性を有するアフィニティクロマトグラフィー媒体の溶出液由来の二重特異性抗体含有画分またはプールされた二重特異性抗体含有画分を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 上流または下流のイオン交換クロマトグラフィー工程をさらに含み、該工程が、前記断片、前記BASB、および/または重鎖/軽鎖ポリペプチドの対を含むホモ二量体のうちの少なくとも1種から前記二重特異性抗体を分離する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記イオン交換単位操作がカチオン交換単位操作である、請求項5に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体がCrossMab二重特異性抗体であるか、または該二重特異性抗体の重鎖のうちの一方がscFabを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体がknob-in-hole(KiH)二重特異性抗体である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体がCrossMabおよびKiH二重特異性抗体であり、かつ該二重特異性抗体が、EGFRおよびIGFRに対する特異性を有するか、またはAng2およびVEGFに対する特異性を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体の重鎖のうちの一方がscFabを含み、該二重特異性抗体がKiH二重特異性抗体であり、かつ該二重特異性抗体が、Ang2およびVEGFに対する特異性を有するか、EGFRおよびIGFRに対する特異性を有するか、またはTWEAKおよびIL17に対する特異性を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
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