CN105473612A - 用羟基磷灰石层析分离双特异性抗体和双特异性抗体生产副产物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包括用羟基磷灰石层析,来从还包含一种或多种双特异性抗体生产特异的副产物的溶液分离双特异性抗体的方法。双特异性抗体生产特异的副产物(双特异性抗体特异性副产物,“BASA”)包括双特异性抗体的片段和抗体的更重分子量变体,其中该片段和/或变体包含Fc结构域,但不显示如希望的双特异性抗体所显示的对两种不同表位和/或抗原的亲和力。因此,本发明的方法包括从一种或多种其BASA分离双特异性抗体。本发明的羟基磷灰石层析方法可以单独使用,或者可以与本领域已知的标准纯化方法和单元操作进一步组合,以达到例如治疗和/或诊断应用所必需双特异性抗体的任意纯度水平。
Description
技术领域
本发明涉及包括用羟基磷灰石层析来从还包含一种或多种双特异性抗体生产特异的副产物的溶液分离双特异性抗体的方法。双特异性抗体生产特异的副产物(双特异性抗体特异性副产物,“BASA”)包括双特异性抗体的片段和抗体的更重分子量变体,其中该片段和/或变体包含Fc结构域,但不显示如希望的双特异性抗体所显示的对两种不同表位和/或抗原的亲和力。因此,本发明的方法包括从一种或多种其BASA分离双特异性抗体。本发明的羟基磷灰石层析方法可以单独使用,或者可以与本领域已知的标准纯化方法和单元操作进一步组合,以达到例如治疗和/或诊断应用所必需双特异性抗体的任意纯度水平。
背景技术
双特异性抗体的治疗潜力早已得到认可。双特异性抗体提供能够同时结合两种抗原或两种表位的IgG样平台。因此,双特异性抗体提供调节至少两个分子的相互作用和/或包含该分子的至少两个系统的相互作用的有潜力的工具。这种调节可以是例如调节两个细胞的相互作用,其中所识别的一种或多种抗原和/或表位表达在该细胞的表面。双特异性抗体的治疗用途的实例包括例如调节细胞信号发放(例如通过促进或干扰希望的表面受体或配体的相互作用)和癌症治疗(例如辅助将免疫细胞靶向至癌细胞)。
尽管双特异性抗体的治疗用途中存在利益,但它们的商业化生产已经证明存在问题。早期尝试集中在融合各表达单特异性二价抗体的两个杂交瘤细胞系(“四源杂交瘤(quadroma)技术”,参见例如Milstein和Cuello,Nature305(1983),537-540)。虽然四源杂交瘤表达抗体分子,但显然所表达的分子包含两种亲本重链和两种亲本轻链的可变组合。全部四种亲本链的同时表达产生几乎相同的分子的10种不同变体的混合物,其中只有1/10(即所表达的所有分子中只有少部分)包含显示希望的双特异性活性所必需的正确配对的重链和轻链(参见例如Suresh等,MethodsEnzymol.121(1986),210-228)。因此,在消除生产问题的尝试中将注意力转至基于其他双特异性抗体的构建体,例如抗体可变结构域的单链融合。但是,许多这些型式显著不同于典型抗体结构,且发现其显示治疗劣势,如药物代谢动力学特性差和/或效应子活性丧失(例如由于缺乏Fc结构域)。此外,许多构建体还显示聚集倾向,及由于存在非人或人工结构域如接头区而提高的免疫原性可能性。
鉴于交替双特异性型式的局限性,尽管存在生产问题,但对具有典型抗体结构(尤其是IgG样结构)的双特异性抗体的兴趣仍存在。主要地,在生产希望的具有IgG样结构的双特异性抗体的过程中出现两个问题。因为这种分子需要2种不同重链和2种不同轻链的正确结合,有必要(1)诱导两种不同重链的异二聚化成为优先于同二聚化的反应和(2)优化可能的轻链/重链组合相互作用间的分辨,使得所表达的分子仅包含希望的轻链/重链相互作用。这两个问题已得到有效解决。
首先,已显示通过使用“杵入臼”或“KiH”方法促进两种不同重链的异二聚化超过同二聚化相互作用。在KiH方法中,将大的氨基酸侧链引入重链之一的CH3结构域,该侧链嵌入另一重链的CH3结构域中适当设计的凹陷(参见例如Ridgeway等,ProteinEng.9(1996),617-621和Atwell等,J.Mol.Biol.270(1997),677-681)。因此,重链的异二聚体倾向于比任一种同二聚体更稳定,形成更大比例的所表达的多肽。
其次,通过修饰双特异性抗体的一个Fab(Fab区)来在轻链和重链之间“对换(swap)”恒定区,或恒定区和可变区,可以诱导希望的轻链/重链配对的结合。因此,在经修饰的Fab结构域中,重链可包含例如CL-VH或CL-VL结构域,而轻链可包含CH1-VL或CH1-VH结构域。这阻止了修饰链(即经修饰的轻链或重链)的重/轻链Fab部分与标准/未修饰臂的重/轻链Fab部分的相互作用。作为说明,修饰臂Fab结构域中包含CL结构域的重链不优先与未修饰臂/Fab结构域的也包含CL结构域的轻链相互作用(阻止“不正确”或不希望的重/轻链配对)。这种用于阻止“不正确”轻/重链结合的技术称为“CrossMab”技术,在与KiT技术组合时,导致希望的双特异性分子的表达显著增强(参见例如Schaefer等,PNAS108(2011),11187-11192)。备选地或此外,可以修饰抗体的一条臂,使得Fab结构域是scFab或scFv,仅在系统中留下一条“自由”轻链。
尽管最近在双特异性抗体的表达中取得了进步,但由于与其生产特异性相关的副产物(双特异性抗体特异性副产物,“BASB”)的形成及与从希望的分子分离BASB相关的问题,这类分子的用途仍受限。与标准抗体的纯化相比,从生产培养基经济地纯化双特异性抗体是独特的挑战。标准抗体的生产依赖于相同重链/轻链亚基的二聚化。相反,双特异性抗体的生产需要各包含不同重链以及不同轻链的两种不同重链/轻链亚基的二聚化。因此,双特异性抗体生产需要至多4条多肽链的正确相互作用。因此,常观察到链错配(例如相同重链肽的同二聚化或不正确的重链/轻链结合),以及由不同抗体链的不平衡表达引起的不完整蛋白质组装。通常观察到的BASB包括1/2抗体(包含单个重链/轻链对)和3/4抗体(包含缺乏单条轻链的完整抗体)。取决于所使用的双特异性型式,可以观察到其他BASB。例如,在将双特异性抗体的一个可变结构域构建为单链Fab(scFab)时,可以观察到5/4抗体副产物(包含附加的重链或轻链可变结构域)。标准抗体生产中正常情况下观察不到这类相应的副产物。
此外,在它们保留在最终纯化的产品中时,BASB可以显示极其不利的活性。对于标准抗体,即单特异性抗体,可以观察到,上述副产物包含至少一个功能性抗原结合部位。因此,单特异性抗体制剂中的这种副产物将可能具有部分(若非全部)治疗功能,并因此在任何纯化方案中具有很少的顾虑。相反,取决于双特异性型式,BASB是可负面影响希望的双特异性制剂的活性的杂质。因此,在纯化过程中从希望的分子分离它们变得至关重要。例如,双特异性分子的功能性可以依赖于对两种不同抗原显示结合活性的单个分子。在分子仅对一种靶抗原显示结合活性时(例如,如在上述1/2或3/4抗体中),其与此靶抗原的结合可阻断全功能双特异性抗体的结合,可能拮抗希望的该双特异性分子的活性。至少,如果不进行分离,双特异性抗体生产的单特异性副产物将可能降低最终的双特异性制剂的功效。此外,本文所述的许多具有正常情况下促进肽-肽相互作用的暴露区的BASB显示免疫原性和聚集的倾向。
不幸的是,大多数商业化抗体生产和纯化方案不适于或不能从上述特异性副产物分离双特异性抗体。标准抗体纯化方案通常涉及至少两种不同模式的层析,也就是说,通常利用两种不同层析机制来从副产物/杂质分离希望的抗体。第一种模式通常是基于亲和力的层析,其利用待纯化蛋白质(即目的蛋白质)和固定化捕获试剂之间的特异性相互作用。由于亲和试剂可以是纯化方案最昂贵的部分,所以希望减少亲和配体的使用和/或最大化具体方案(和亲和试剂)在许多产品中的适用性。免疫球蛋白纯化中最常用的亲和配体(且适用于多种基于免疫球蛋白的产品)是Fc结合剂或恒定结构域结合剂,如A蛋白、G蛋白、L蛋白、KappaSelectTM和LambdaFabSelectTM。但是,这些Fc或恒定结构域结合剂的分离活性基于Fc-、κ-和/或λ-的存在,重要的是,这些结构域为双特异性抗体及其特异性副产物(即BASB)所共有。因此,Fc-或恒定结构域亲和配体单独不足以从BASB纯化双特异性抗体,实施附加的基于亲和力的纯化和/或分子特异性(即抗原特异性)纯化将可能产生经济上禁止的方案。
此外,基于现有技术中的理解,也不认为加入商业化抗体处理方案中所用的其他常用纯化方法足以令人满意地从BASA分离双特异性抗体。与亲和层析结合用于商业化抗体纯化的最常用的纯化方法是标准层析方法,该标准层析方法基于大小、电荷(即等电点或“IEP”)、溶解度和/或疏水程度的差异从不希望的副产物/杂质分离目的蛋白质。这类方法包括离子交换层析、大小排阻层析、固定化金属亲和层析和羟基磷灰石层析。但是,这些使用标准方案的常用层析方法不适于从BASA分离双特异性抗体:大小排阻层析不能经济上可行地用于大规模纯化,在很大程度上认为双特异性抗体和BASB之间的IEP差异对其离子交换层析分离而言太小。
因此,用于从包含其生产特异性副产物(例如含Fc的抗体片段)的溶液分离抗体的已知方法对双特异性抗体的纯化而言是无效的,和/或由于经济原因而是不希望使用的(例如附加的亲和层析步骤的使用)。因此,存在对用于从生产溶液(尤其是从其中所含的BASB)纯化双特异性抗体的新的和/或改进的方案的需要,该方案能够符合生物技术产业对生产诊断和治疗产品的要求(例如证明实际成本、通量和产品纯度)。
发明概述
本发明涉及用羟基磷灰石层析从包含双特异性抗体和双特异性抗体生产(例如重组产生)特异的一种或多种副产物的溶液分离双特异性抗体的方法。双特异性抗体生产(例如重组产生)特异的副产物(本文中也称为双特异性抗体特异性副产物,“BASB”)是双特异性抗体的高分子量或低分子量多肽变体,其缺乏希望的双特异性活性。例如,BASB可以仅对双特异性抗体所识别的两种表位或抗原之一显示特异性,和/或可以对双特异性抗体所识别的表位或抗原中的一个或两个显示大幅降低的亲和力。典型的BASB包括:(i)双特异性抗体的片段(即低分子量肽或多肽变体),其包括但不限于1/2抗体(具有单个重链/轻链对)和3/4抗体(具有抗体重链的异二聚体或同二聚体和单条抗体轻链);和(ii)高分子量多肽变体,其包括但不限于5/4抗体(具有抗体重链的异二聚体(其中之一包含抗体scFab或scFv片段)和两条抗体轻链)(参见例如图1)。具体而言,本发明的方法涉及从一种或多种BASB分离包含Fc结构域的双特异性抗体,该一种或多种BASB也包含Fc结构域。
本发明人惊奇地发现,本文所述的羟基磷灰石层析可以从产品原料流中也包含Fc结构域的一种或多种BASB中分离希望的包含Fc结构域的双特异性抗体。本发明的方法因此尤其可与标准抗体纯化方案组合使用,该标准抗体纯化方案否则包含不足以从BASB分离双特异性抗体的单元操作。本文所述的方法尤其还可与标准抗体纯化方法组合使用来使终产品流(包含双特异性抗体)达到最终制剂和/或纯度。
本发明涉及从包含双特异性抗体的溶液分离包含Fc结构域的双特异性抗体的方法,该方法包括:(a)使该溶液与羟基磷灰石层析介质接触;(b)使该双特异性抗体吸附至该羟基磷灰石层析介质;和(c)在氯离子的存在下从该羟基磷灰石介质洗脱该双特异性抗体,其中该包含双特异性抗体的溶液进一步包含或含有:(i)该双特异性抗体的一种或多种片段(该片段也包含Fc结构域);和/或(ii)具有比该双特异性抗体的分子量更大的分子量且包含该双特异性抗体的两条重链中的至少一条的一种或多种多肽(该一种或多种多肽也包含Fc结构域)。因此,本发明还涵盖羟基磷灰石层析介质在从包含双特异性抗体的溶液分离包含Fc结构域的双特异性抗体中的用途,该用途包括:(a)使该羟基磷灰石层析介质与该溶液接触;(b)使该双特异性抗体吸附至该羟基磷灰石层析介质;和(c)在氯离子的存在下从该羟基磷灰石介质洗脱该双特异性抗体,其中该包含双特异性抗体的溶液进一步包含:(i)该双特异性抗体的一种或多种片段(该片段也包含Fc结构域);和/或(ii)具有比该双特异性抗体的分子量更大的分子量且包含该双特异性抗体的两条重链中的至少一条的一种或多种多肽(该一种或多种多肽也包含Fc结构域)。
在允许该双特异性抗体和/或该双特异性抗体和该一种或多种BASB与该层析介质结合的条件下,使包含该双特异性抗体和该一种或多种BASB的溶液与该羟基磷灰石层析介质接触。优选地,适于该双特异性抗体和该一种或多种BASB结合的条件是其中该溶液具有低电导率值的条件。适合用于本文公开的方法的具有低电导率值的溶液通常具有约或不大于约13mS/cm的值。适合用于本文公开的方法的具有低电导率值的溶液还可以具有约或不超过约10.6mS/cm、或约或不超过约8.5mS/cm的电导率值。具有低电导率值的溶液的非限制性实例包括pH为约6.5至8.0的缓冲液,该缓冲液包含浓度在约1mM至约20mM之间、优选约10mM的磷酸根离子,浓度在约0.001mM至约0.5mM之间、优选约0.1mM的钙离子,及浓度在约10mM至约200mM之间、优选约50mM的氯离子。用于本发明方法的具有低电导率值的溶液可以具有约6.5至7.5的pH值,至少10mM的磷酸根离子浓度,至少0.1mM的钙离子浓度,及从约50mM至约500mM的氯离子浓度。备选地或此外,用于本发明方法的具有低电导率值的溶液可以具有约6.5至7.5的pH值,约10mM的磷酸根离子浓度,约0.1mM的钙离子浓度,及从约50mM至约500mM的氯离子浓度。该溶液中的磷酸根离子可以由本领域已知和/或本文所述的任意适宜的磷酸盐或其组合来提供。适合用于本文方法的溶液中的磷酸盐的非限制性实例包括NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4和K2HPO4。该溶液中的钙离子可以由本领域已知和/或本文所述的任意适宜的钙盐或其组合来提供。适合用于本文方法的溶液中的钙盐的非限制性实例包括CaCl2。该溶液中的氯离子可以由本领域已知和/或本文所述的任意适宜的氯化物盐(chloridesalt)(包括用来提供钙离子的盐)或其组合来提供,前提是钙离子浓度维持在本文规定的范围内。适合用于本发明方法的溶液中的氯化物盐的非限制性实例包括NaCl和KCl。用于这些实施方案的提供氯离子的盐的示例性组合包括NaCl、CaCl2和KCl。在优选实施方案中,包含该双特异性抗体和该一种或多种BASB的溶液是包含约10mMNaH2PO4、约50mMNaCl、20mMMES和约0.1mMCaCl2的pH为约6.5至7.5的溶液,该溶液处于适于允许它们与该羟基磷灰石层析介质的初始结合的条件下。如本领域已知,结合缓冲液(不含该双特异性抗体和该一种或多种BASB)(包括本段落中明确列出的实施方案)可以单独用作羟基磷灰石层析介质的平衡缓冲液和/或在层析过程的一个或多个阶段用作洗涤缓冲液。
通过提高氯离子的浓度来专一性达到双特异性抗体的洗脱。用具有低起始电导率的洗脱缓冲液实现洗脱,其中氯离子浓度随后稳步提高。上文所述的用于选择低电导率结合溶液的条件(即包含该双特异性抗体和该一种或多种BASB的溶液处于允许它们与羟基磷灰石层析介质结合的条件)同等地适用于选择本发明的洗脱缓冲液起始组成(即也具有低起始电导率)。因此,洗脱缓冲液的起始组成可以与上文或本文其他地方所述的结合溶液/结合缓冲液的组成相同或可以不同。在某些实施方案中,洗脱缓冲液的起始组成与结合溶液/结合缓冲液的组成相同。在其他实施方案中,洗脱缓冲液的起始组成与结合溶液/结合缓冲液的组成相同。洗脱缓冲液优选包含磷酸根离子和氯离子二者。在某些实施方案中,洗脱缓冲液具有约10mMNaH2PO4、约50mMNaCl、约20mMMES和约0.1mMCaCl2、pH约6.5至7.5的起始组成。
本发明涉及包括提高洗脱缓冲液中氯离子的浓度来从层析介质洗脱双特异性抗体的方法。氯离子浓度可以按照线性梯度、执行分级梯度(implementedstepgradient)(参见例如图6中所示的增加氯离子的执行分级梯度)或这两种梯度的组合提高。鉴于本文中所包含的教导,从层析介质洗脱双特异性抗体和/或从BASB分离双特异性抗体(即洗脱一种而其他保持结合于介质)的梯度的优化在本领域技术人员的能力范围之内。可以通过提高一种或多种氯化物盐的浓度来提高洗脱缓冲液中氯离子的浓度。可以加至洗脱缓冲液来提高氯离子浓度的氯化物盐的非限制性实例包括NaCl和KCl。如蛋白质层析领域所理解,必须监测或评价钙离子和磷酸根离子的相对浓度,以防止钙和磷酸在本发明的方法期间从一种或多种溶液沉淀。在某些实施方案中,通过提高NaCl的浓度来提高洗脱缓冲液中氯离子的浓度。在优选实施方案中,洗脱缓冲液的起始氯离子浓度为约50mM(其可以由一种或多种氯化物盐提供),随后在洗脱期间增加至洗脱双特异性抗体所必需的浓度。本领域技术人员可以使用本领域已知的常规方法及按照本文所述的教导和方法,容易地确定洗脱所吸附的双特异性抗体所必需的最大氯离子浓度。在某些实施方案中,用于洗脱双特异性抗体和/或从一种或多种BASB分离双特异性抗体的最大氯离子浓度为约200mM、250mM、300mM、350mM、400mM或500mM。本发明方法的示例性洗脱缓冲液具有约10mMNaH2PO4、约50mMNaCl、约20mMMES和约0.1mMCaCl2、pH约6.5至7.5的起始组成,其中随后在洗脱步骤期间通过按照线性、分级或线性-分级梯度提高NaCl浓度至约500mM来提高氯离子的浓度。
优选在洗脱级分中达到双特异性抗体的洗脱,该级分包含双特异性抗体但不包含至少一种吸附至羟基磷灰石层析介质的BASB。具体而言,本发明的方法允许从其至少一种BASB分离双特异性抗体,该其至少一种BASB是1/2抗体、3/4抗体或5/4抗体。换言之,本发明的方法允许从包含双特异性抗体和一种或多种BASB的溶液分离包含Fc结构域的双特异性抗体,其包括(a)使该溶液与羟基磷灰石层析介质接触,(b)使该双特异性抗体吸附至该羟基磷灰石层析介质,和(c)在氯离子的存在下从该羟基磷灰石介质洗脱该双特异性抗体,其中步骤(c)的洗脱级分(其包含该双特异性抗体)不包含或不含有该一种或多种BASB中的至少一种,且其中该一种或多种BASB是1/2抗体、3/4抗体或5/4抗体。由于本领域公认羟基磷灰石层析介质性能可以随生物分子(例如双特异性抗体和BASB)而变,应理解,本公开通篇关于从一种或多种BASB分离和/或纯化双特异性抗体所用的术语“分离”及类似的术语和短语并非必然解释为绝对表述。相反,如本文所使用及按照本领域的理解,该术语是在理解所洗脱的双特异性抗体可以认为是分离的和/或纯化的,但可以包含来自该一种或多种BASB中的至少一种(其最初也吸附至该羟基磷灰石层析介质)的某种最少限度污染物的前提下使用。因此,本文关于从/通过本发明的方法获得的双特异性抗体的溶液所用的术语“分离的”、“纯化的”、“不包含”及类似的术语和短语用来指包含该双特异性抗体的洗脱物或洗脱级分中,该一种或多种BASB的总量不超过该双特异性抗体总量的10%。在优选实施方案中,本文关于从/通过本发明的方法获得的双特异性抗体的溶液所用的术语“分离”/“分离的”、“纯化的”、“不包含”及类似的术语和短语用来指包含该双特异性抗体的洗脱物或洗脱级分中该一种或多种BASB的总量不超过该双特异性抗体总量的5%。在其他实施方案中,所洗脱的双特异性抗体包含不到4%、不到3%、不到2%、不到1%或不含来自该一种或多种BASB中的至少一种的污染物。类似地,关于该一种或多种BASB和洗脱物和/或洗脱级分的短语“不含有”和类似的短语不理解为绝对表述。相反,如本领域所理解,该短语表示该洗脱级分基本不含该具体的一种或多种BASB,即可以包含最小量的BASB。因此,如本文所使用,包含该双特异性抗体且不包含该一种或多种BASB的洗脱物或洗脱级分可以包含量不超过该双特异性抗体总量的5%的该一种或多种BASB。如本段落和说明书通篇中所使用,含有一种或多种双特异性抗体的级分中,该一种或多种BASB的总量与该双特异性抗体的总量相比的相对百分比可以通过本领域已知或本文所述的任意方法来测定。在非限制性实例中,它可以根据从SDS-Page分析、MS分析或从基于BIAcore的结合分析、Octet或ELISA流程测定或估计的量的比较来计算。
本发明的方法可应用于本领域已知和/或本文所述的任意双特异性抗体形式(format)。因此,该双特异性抗体可以包含来自任意适宜的源抗体的抗体肽链(例如重链和/或轻链)或其抗原结合片段,该源抗体包括但不限于源自动物来源的抗体(例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、山羊、绵羊、狗、马、牛、猴、猿和/或鸡抗体),以及嵌合抗体、人抗体和人源化抗体;可以包含具有来自任意适宜的源抗体的恒定结构域(例如CL、CH1、CH2和CH3结构域)的肽链,该源抗体包括但不限于本文所定义的适宜的动物来源和人抗体;可以包含具有来自任意适宜的源抗体的一个或多个恒定结构域(例如一个或多个CL、CH1、CH2和CH3结构域)的肽链(例如重链和/或轻链),该一个或多个恒定结构域重组融合或化学缀合至保持其抗原结合功能的抗体片段,包括但不限于scFv、scFab、Fd、dAb、单重链可变结构域和单轻链可变结构域;和/或可以包含具有人或人源化构架结构域的肽链(例如重链和/或轻链)。在某些实施方案中,本发明的包含Fc结构域的双特异性抗体是“杵入臼”(KiH)双特异性抗体(即包含按照本领域已知和/或本文所述的KiH方法设计的两条重链)。KiH方法可以与其他双特异性抗体设计方法组合或不组合。这类其他双特异性抗体设计方法的非限制性实例包括应用于双特异性抗体的一个或多个可变结构域的方法,如CrossMab方法,和/或抗原结合片段(例如scFab)与一个或多个重链恒定结构域的融合。本发明还涵盖独立于KiH方法的CrossMab和抗原结合片段(例如scFab)重链融合方法的使用。因此,本发明的双特异性抗体可以包括仅使用KiH方法、CrossMab方法和抗原结合片段-重链融合方法中的一种,或可以包括使用一种以上这些方法。为了方便,如本公开通篇中所使用,按照KiH、CrossMab和/或抗原结合片段-重链融合方法设计的抗体分别称为“KiH双特异性抗体”、“CrossMab双特异性抗体”和/或“结合片段-重链融合抗体”。在本发明的某些实施方案中,该双特异性抗体是结合片段-重链融合抗体,其中该双特异性抗体的一条重链包含重组融合或化学缀合至抗体重链的铰合部-CH2-CH3区的scFab(即“scFab双特异性抗体”)。在某些实施方案中,本发明方法的双特异性抗体是KiH双特异性抗体、CrossMab双特异性抗体、scFab双特异性抗体、KiH-CrossMab双特异性抗体或KiH-scFab双特异性抗体。在某些实施方案中,本发明方法的双特异性抗体是KiH双特异性抗体、CrossMab双特异性抗体、scFab双特异性抗体、KiH-CrossMab双特异性抗体或KiH-scFab双特异性抗体,且本发明的方法从其一种或多种BASB分离该双特异性抗体。
本发明不限于对任意具体表位或抗原具有特异性的双特异性抗体,而是可广泛适用于双特异性抗体,尤其是可应用于具有Fc结构域的双特异性抗体。因此,本发明的抗体可以对两个或多个表位(该表位在相同或不同的抗原上)具有特异性和/或对两种或多种抗原具有特异性。该双特异性抗体可以对其显示特异性的抗原的非限制性实例包括蛋白质和多肽(包括但不限于处于天然构象的分离的蛋白质和多肽;分离的、变性的蛋白质和多肽;表达在细胞表面上的蛋白质和多肽(包括本领域已知或本文所述的细胞受体和/或细胞标志);及可见于生物流体(例如血液、血清、尿及这些的级分)中的可溶性蛋白质和多肽,如分泌性蛋白质、脱落的细胞受体和脱落的细胞标志)。在某些实施方案中,本发明方法的双特异性抗体对EGFR、IGFR、Ang2、VEGF、TWEAK、IL17、CD3、TNF(TNF-α)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、死亡受体5(DR5)、CEA、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、叶酸受体1(FolR1)、潜伏膜蛋白1/2(LMP1/2)或发明详述中所述的其他抗原中的一种或多种具有特异性。在备选的或附加的实施方案中,本发明方法的双特异性抗体对EGFR、IGFR、Ang2、VEGF、TWEAK、IL17、CD3、TNF(TNF-α)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、死亡受体5(DR5)、CEA、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、叶酸受体1(FolR1)、潜伏膜蛋白1/2(LMP1/2)或发明详述中所述的其他抗原中的任意两种具有特异性。在其他备选的或附加的实施方案中,本发明方法的双特异性抗体对EGFR和IGFR、Ang2和VEGF或TWEAK和IL17具有特异性。
在某些实施方案中,本发明方法的双特异性抗体是对EGFR和IGFR具有特异性的KiH-CrossMab双特异性抗体,其中本发明的方法从包含双特异性抗体和至少一种BASB的溶液分离该双特异性抗体,其中该至少一种BASB是1/2抗体,且其中该分离是从羟基磷灰石层析介质获得洗脱级分,该洗脱级分包含该EGFR-IGFR双特异性抗体但不包含该1/2抗体。在此实施方案的某个方面,该双特异性抗体是对EGFR和IGFR具有特异性的KiH-CrossMab双特异性抗体,其中对IGFR特异的可变结构域是CrossMab可变结构域。在此实施方案的优选方面,该双特异性抗体是对EGFR和IGFR具有特异性的KiH-CrossMab双特异性抗体,其中对IGFR特异的可变结构域是CrossMab可变结构域,其中该一种或多种BASB是1/2抗体,且其中本发明的方法包括从羟基磷灰石层析介质获得洗脱级分,该洗脱级分包含该EGFR-IGFR双特异性抗体但不包含该1/2抗体。
在某些实施方案中,本发明方法的双特异性抗体是对Ang2和VEGF具有特异性的KiH-scFab双特异性抗体,其中本发明的方法从包含双特异性抗体和至少一种BASB的溶液分离该双特异性抗体,其中该至少一种BASB是1/2抗体,且其中该分离是从羟基磷灰石层析介质获得洗脱级分,该洗脱级分包含该Ang2-VEGF双特异性抗体但不包含该1/2抗体。在此实施方案的某个方面,该双特异性抗体是对Ang2和VEGF具有特异性的KiH-scFab双特异性抗体,其中对Ang2特异的可变结构域是scFab可变结构域。在此实施方案的优选方面,该双特异性抗体是对Ang2和VEGF具有特异性的KiH-scFab双特异性抗体,其中对Ang2特异的可变结构域是scFab可变结构域,其中该一种或多种BASB是1/2抗体,且其中本发明的方法包括从羟基磷灰石层析介质获得洗脱级分,该洗脱级分包含该Ang2-VEGF双特异性抗体但不包含该1/2抗体。
在某些实施方案中,本发明方法的双特异性抗体是对EGFR和IGFR具有特异性的KiH-scFab双特异性抗体,其中本发明的方法从包含双特异性抗体和至少一种BASB的溶液分离该双特异性抗体,其中该至少一种BASB是1/2抗体,且其中该分离是从羟基磷灰石层析介质获得洗脱级分,该洗脱级分包含该EGFR-IGFR双特异性抗体但不包含该1/2抗体。在此实施方案的某个方面,该双特异性抗体是对EGFR和IGFR具有特异性的KiH-scFab双特异性抗体,其中对IGFR特异的可变结构域是scFab可变结构域。在此实施方案的优选方面,该双特异性抗体是对EGFR和IGFR具有特异性的KiH-scFab双特异性抗体,其中对IGFR特异的可变结构域是scFab可变结构域,其中该一种或多种BASB是1/2抗体,且其中本发明的方法包括从羟基磷灰石层析介质获得洗脱级分,该洗脱级分包含该EGFR-IGFR双特异性抗体但不包含该1/2抗体。
在某些实施方案中,本发明方法的双特异性抗体是对TWEAK和IL17具有特异性的KiH-scFab双特异性抗体,其中本发明的方法从包含双特异性抗体和至少一种BASB的溶液分离该双特异性抗体,其中该至少一种BASB是5/4抗体,且其中该分离是从羟基磷灰石层析介质获得洗脱级分,该洗脱级分包含该TWEAK-IL17双特异性抗体但不包含该5/4抗体。在此实施方案的某个方面,该双特异性抗体是对TWEAK和IL17具有特异性的KiH-scFab双特异性抗体,其中对TWEAK特异的可变结构域是scFab可变结构域。在此实施方案的优选方面,该双特异性抗体是对TWEAK和IL17具有特异性的KiH-scFab双特异性抗体,其中对TWEAK特异的可变结构域是scFab可变结构域,其中该一种或多种BASB是5/4抗体,且其中本发明的方法包括从羟基磷灰石层析介质获得洗脱级分,该洗脱级分包含该TWEAK-IL17双特异性抗体但不包含该5/4抗体。
在某些实施方案中,本发明方法的双特异性抗体是对Ang2和VEGF具有特异性的KiH-CrossMab双特异性抗体,其中本发明的方法从包含双特异性抗体和至少一种BASB的溶液分离该双特异性抗体,其中该至少一种BASB是3/4抗体,且其中该分离是从羟基磷灰石层析介质获得洗脱级分,该洗脱级分包含该Ang2-VEGF双特异性抗体但不包含该3/4抗体。在此实施方案的某个方面,该双特异性抗体是对Ang2和VEGF具有特异性的KiH-CrossMab双特异性抗体,其中对Ang2特异的可变结构域是CrossMab可变结构域。在此实施方案的优选方面,该双特异性抗体是对Ang2和VEGF具有特异性的KiH-scFab双特异性抗体,其中对Ang2特异的可变结构域是CrossMab可变结构域,其中该一种或多种BASB是3/4抗体,且其中本发明的方法包括从羟基磷灰石层析介质获得洗脱级分,该洗脱级分包含该Ang2-VEGF双特异性抗体但不包含该3/4抗体。
无论是否描述为本发明的方面和/或实施方案,且无论是否描述为优选的,本文公开的任意羟基磷灰石方法都可以与本文所述和/或本领域已知的上游或下游纯化方法组合。可以在上游或下游与本文公开的羟基磷灰石方法组合的这类纯化方法的实例包括但不限于亲和层析、大小排阻层析、离子交换层析(包括阴离子和阳离子交换层析)、疏水相互作用层析、其他形式的混合模式层析和本领域已知的多种过滤方法。开发适合用于与所公开的方法整合以达到双特异性抗体的具体纯化的条件在本领域技术人员的能力范围之内。在非限制性实例中,本文公开的任意羟基磷灰石层析方法可以与上游亲和层析方法组合,其中亲和配体对抗体结构域如Fc结构域、κ结构域或λ结构域具有特异性(例如但不限于A蛋白、G蛋白、A/G蛋白、L蛋白、KappaSelectTM和LambdaFabSelectTM(GEHealthcareLifeSciences,Upsala,SE))。在某些实施方案中,包含双特异性抗体和一种或多种BASB且按照本发明的方法与羟基磷灰石层析介质接触的溶液包含含有来自对抗体Fc结构域、或抗体轻链κ或λ结构域具有特异性的亲和层析介质的洗脱物的合并的含抗体级分。在其他非限制性实例中,本发明的羟基磷灰石层析方法可以与包括但不限于阴离子交换层析和阳离子交换层析的上游或下游纯化方法组合。作为非限制性实例,本文公开的本发明的羟基磷灰石层析方法的任意方法、方面、实施方案或其他实例可以与上游或下游阴离子或阳离子层析组合。在可以与本文公开的任意方法、方面、实施方案或其他实例组合的具体实例中,本发明的羟基磷灰石层析方法可以与上游或下游阳离子交换层析组合,该阳离子交换层析可以从一种或多种污染物、杂质和/或第二BASB分离该双特异性抗体。本文所用的术语“污染物”、“杂质”和类似的术语具有其本领域已知的标准含义,且尤其指包含双特异性抗体的溶液中所不希望的成分。这类不希望的成分的非限制性实例包括不希望的蛋白质(例如但不限于双特异性抗体重链的同二聚体)、不希望的小分子、本文所述BASB之外的双特异性抗体的一种或多种片段、双特异性抗体的聚集体、及细胞产生的不希望的蛋白质/分子(无论内源的还是异源的)。本文所用的术语“第二BASB”和类似的术语指不是通过本文所公开的羟基磷灰石层析方法从双特异性抗体分离的该至少一种BASB的BASB。因此,在某些实施方案中,本文所公开的羟基磷灰石层析方法从包含双特异性抗体和至少一种BASB的溶液分离双特异性抗体,其中该分离是将该双特异性抗体从羟基磷灰石层析介质洗脱在包含该双特异性抗体但不包含该至少一种BASB的洗脱级分中,且其中该方法与从至少一种污染物、杂质和/或第二BASB分离该双特异性抗体的至少一种上游或下游阳离子交换层析方法组合。在可以与本文公开的任意方法、方面、实施方案或其他实例组合的具体实例中,本发明的羟基磷灰石层析方法可以与以下组合:(1)上游亲和层析方法,其中亲和配体对抗体结构域如Fc结构域、κ结构域或λ结构域具有特异性;和(2)上游或下游阳离子交换层析方法,该阳离子交换层析从一种或多种污染物、杂质和/或第二BASB分离双特异性抗体。
定义
一般而言,在用于发明概述、发明详述、实施例和权利要求中时,以下词语或短语具有所示定义。
本文所用的与数字有关的术语“约”表示该数字的±5%。在与通过设备进行(例如通过pH计测定的pH)或按照本领域已知的标准方法进行(例如通过HPLC、UV吸光度、ELISA、标准试剂盒(例如比色测定))的测量关联使用时,“约”表示这种设备已知的标准误之内或这种方法的测定值的一个标准差之内的值。
术语“抗体”以最广泛的含义使用,且明确涵盖例如单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体;以及脱免疫(de-immunized)、嵌合、人源化和人抗体和/或源自任意适宜的动物来源(例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、山羊、绵羊、狗、马、牛、猴、猿和/或鸡)的抗体)、免疫缀合物、合成抗体、骆驼抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体和以上任意一种的表位结合片段。尤其是,本发明涉及双特异性抗体,如本领域技术人员所理解和在某些实施方案中,认为该双特异性抗体包含来自至少两种或多种不同抗体的结构域。因此,本发明的双特异性抗体可以包含两种不同重链(各源自不同抗体)和两种不同轻链(各源自不同抗体),和/或可以包含各含有来自两种或多种不同抗体的片段的重链和轻链。因此,本发明的双特异性抗体可以包含来自脱免疫抗体、鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体的重链和/或轻链,以及来自脱免疫抗体、鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体的重链和/或轻链及其片段(例如其可变和/或恒定结构域)的组合。本发明的双特异性抗体还可以包含抗体的表位结合片段(例如但不限于单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、F(ab')2片段和二硫键连接的Fv(sdFv)),尤其是连接至一个或多个重链或轻链恒定区,例如scFv连接至重链CH1/CH2/CH3结构域。在优选实施方案中,本发明的双特异性抗体包含Fc结构域。如本领域技术人员所理解,Fc结构域的存在使得双特异性抗体可用Fc结合部分(如但不限于A蛋白、G蛋白和/或A/G蛋白)纯化。如本领域公知,重链CH1-铰合部-CH2-CH3结构域的具体结构和氨基酸序列决定免疫球蛋白类型和亚类。本发明的双特异性抗体不以任何方式限于具体重链结构或氨基酸序列;因此,本发明的双特异性抗体可以属于任意类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
尤其是对层析方法而言,本文所用的“亲和配体”指通过部分(例如配体)和/或成分上的结合部位的特异性相互作用与方法的原料流或上样流内的成分选择性或优先结合的部分。本发明的免疫球蛋白亲和配体选择性或优先结合免疫球蛋白的Fc-或其他恒定区(例如结合抗体轻链的κ-或λ-结构域)。因此,本文所用的“免疫球蛋白亲和配体”选择性或优先结合原料流或上样流内具有Fc-、κ-和/或λ-结构域的成分。免疫球蛋白亲和配体通常固定在固相如树脂支持物上。本发明的可以结合于树脂支持物的免疫球蛋白亲和配体的实例包括但不限于:Fc亲和配体,如但不限于A蛋白、G蛋白和A/G蛋白及其类似物;以及结合免疫球蛋白的其他恒定结构域(如结合κ-和/或λ-结构域)的亲和配体,包括但不限于KappaSelectTM和LambdaFabSelectTM(GEHealthcareLifeSciences,Upsala,SE)及其类似物。将亲和配体结合至固体支持材料的方法为纯化领域公知。参见例如AffinitySeparations:APracticalApproach(PracticalApproachSeries),PaulMatejtschuk(编辑),(IrlPr:1997);和AffinityChromatography,HerbertSchott(MarcelDekker,NewYork:1997)。
本文所用的与一个范围内的参数的定义有关的术语“之间”明确包括该范围的终点。因此,如果本文将参数定义为“在X和Y之间”,则明确旨在该参数可以具有等于X或大于X的值,只要该值小于或等于Y,即不超过Y。换言之,通过短语“X和Y之间”和类似的结构定义的值明确包括值X和Y。
本文所用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用,且所有这类命名都包括后代。尤其是,本发明涵盖从细胞、细胞系和细胞培养物的产物分离和/或纯化目的分子(即双特异性抗体)。这种产物通常包括条件细胞培养基和/或裂解和匀浆的细胞和细胞培养物(例如匀浆的细胞和条件细胞培养基内的细胞成分)。本发明的方法尤其适于处理来自转基因细胞、细胞系和细胞培养物的产物,其中该转基因细胞、细胞系和细胞培养物表达目的分子。
应理解,本发明的方法涉及从包含目的分子(例如双特异性抗体)的溶液分离、纯化和/或处理该分子。包含本发明方法的目的分子的溶液包括层析方法的原料流或上样流,例如应用于例如作为纯化方案的部分的一个或多个层析单元操作的原料流或上样流。因此,在包含目的分子的溶液是细胞培养基或细胞培养基的分级分离部分或澄清部分时,应理解,这种培养基必然是条件细胞培养基(以包含目的分子)。因此,本文所用的术语“细胞培养物溶液”和类似的术语指生物过程或系统的预期包含目的分子的任意溶液,包括但不限于例如条件细胞培养物上清;澄清的条件细胞培养物上清;澄清、匀浆/裂解的细胞培养物等。
在某些实施方案中,在实施本文公开的方法之前澄清和/或灭菌细胞培养基。本文所用的术语“澄清”指从溶液去除颗粒物质,包括过滤除菌和/或离心。本文所用的术语“灭菌”理解为与包含蛋白质的溶液关联使用;因此,这类溶液的“灭菌”理解为优选通过过滤和/或离心而不是通过加热来实现,以避免蛋白质变性和/或蛋白质聚集。通常,关于任意细胞培养基的“澄清”/“灭菌”溶液是已过滤通过不超过约0.45μm孔径、优选不超过约0.22μm孔径的膜的溶液。
本文所用的术语“层析介质”指本领域已知的能够选择性结合所应用的上样流体的一种或多种成分的固相材料。本发明尤其涵盖本领域已知和/或本文所定义的任意羟基磷灰石层析介质在处理目的分子(具体而言双特异性抗体)中的用途。本发明的方法进一步涵盖羟基磷灰石层析与一种或多种其他层析方法(例如离子交换层析)的组合,作为用于从双特异性抗体的制备特异的一种或多种副产物(即双特异性抗体特异性副产物“BASB”)分离目的分子(即双特异性抗体)的纯化方案的部分。本发明方法的羟基磷灰石层析可与之组合的层析单元操作的实例包括但不限于这样的层析单元操作,该层析单元操作包括通过阳离子交换、阴离子交换、疏水相互作用、亲水相互作用、氢键键合、π-π键键合、金属亲和力和/或通过生物分子的特异性结合(例如包含免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和酶的亲和树脂)选择性结合上样流体的一种或多种成分的固相(例如树脂)的使用。固相可以是多孔颗粒、无孔颗粒、膜或monolith。开发适合用于这些附加层析单元操作的条件并将它们与本文所公开的发明整合来达到具体双特异性抗体的纯化在本领域技术人员的能力范围之内。
本文所用的术语“Fc结构域”、“Fc区”和类似的术语指IgG抗体的C端区域,尤其是IgG抗体的重链的C端区域,包含IgG重链的CH2/CH3结构域。虽然IgG重链Fc区的边界可略为变动,但Fc结构域通常定义为从IgG重链的约氨基酸残基Cys226跨越至羧基端。如本领域已知,Fc区可独立于其余抗体结构使用,例如连接至第二蛋白质来作为蛋白质标记发挥作用或赋予第二蛋白质通常与Fc区相关的功能性(例如补体结合活性、FcRn结合等)。这类与Fc结构域连接(例如但不限于化学缀合和重组融合)的第二蛋白质包括免疫球蛋白片段。如本领域公知,在包含这类Fc缀合或融合的蛋白质中,Fc区无需必然是蛋白质链或所表达的氨基酸序列的C端区域。
术语“副产物”和类似的术语指存在于上样流或原料流中的任何不希望的分子,其特异性源自目的分子(即双特异性抗体)的生产,且将在层析/纯化过程期间从目的分子分离。对于短语双特异性抗体特异性副产物,“BASB”,该术语指双特异性抗体的重组生产特异的包含Fc区的副产物。因此,BASB可以是双特异性抗体的片段,该片段包含Fc结构域,或可以是具有大于双特异性抗体的分子量的分子量的多肽,该多肽包含该双特异性抗体的两条重链中的至少一条,且进一步包含Fc结构域。取决于所要表达的希望的双特异性抗体形式,可以按照本发明的方法从双特异性抗体分离的典型BASB,该典型BASB包括但不限于1/2抗体(包含一个抗体轻链/重链对)、3/4抗体(包含抗体重链的异二聚体或同二聚体和单条抗体轻链)和5/4抗体(包含抗体重链的异二聚体或同二聚体(该重链之一可以是或不是本文所定义的scFab-重链融合)、单条抗体轻链和Fab或scFab片段)(见图1)。
本发明的方法还涵盖从包含双特异性抗体的溶液分离BASB以外的杂质和/或污染物。本文所用的术语“杂质”、“污染物”和类似的术语指也存在于包含目的分子的上样/上样流体中的除目的分子外的任意外来的或不希望的分子,包括生物大分子,如DNA、RNA或蛋白质。杂质包括例如蛋白质变体(包括但不限于本文具体列出的BASB、聚集的蛋白质、高分子量种类、低分子量种类和片段,及脱酰胺种类);来自分泌待纯化的目的分子的宿主细胞的其他蛋白质(宿主细胞蛋白质);可以在前一纯化步骤期间渗漏入样品的作为用于亲和层析的吸附剂的部分的蛋白质(例如A蛋白);内毒素;及病毒。
附图简述
图1.A蛋白层析之后的KiH-CrossMab抗-EGFR/抗-IGFR双特异性抗体的生产培养物上清的非还原CE-SDS分析。
图2.图1中分析的双特异性抗体组合物的来自羟基磷灰石层析柱的洗脱图谱(通过280nmUV吸光度监测)。用斜线所示的洗脱缓冲液中的递增NaCl梯度(线性梯度)达到洗脱。
图3.来自图2的第一洗脱峰(左侧灰框)的非还原CE-SDS分析。
图4.来自图2的第二洗脱峰(右侧灰框)的非还原CE-SDS分析。
图5.A蛋白层析之后的KiH/scFab双特异性抗体抗-VEGF/抗-Ang2的生产培养物上清的非还原CE-SDS分析。
图6.图5中分析的双特异性抗体组合物的来自羟基磷灰石层析柱的洗脱图谱(通过280nmUV吸光度监测)。用倾斜和分级线(steppedline)所示的洗脱缓冲液中的递增NaCl梯度(具有执行分级的线性梯度)达到洗脱。
图7.来自图6中垂直黑线左侧的第一洗脱峰和合并级分的非还原CE-SDS分析。
图8.来自图6的第二洗脱峰(第一洗脱峰在图6中垂直黑线的右侧)的非还原CE-SDS分析。
图9.在上样在羟基磷灰石柱上之前进行了A蛋白层析的KiH/CrossMab双特异性抗体抗-VEGF/抗-Ang2的生产培养物上清的来自羟基磷灰石层析柱的洗脱图谱(通过280nmUV吸光度监测)。用斜线所示的洗脱缓冲液中的递增NaCl梯度(线性梯度)达到洗脱。
图10.A蛋白层析之后的KiH/scFab双特异性抗体抗-EGFR/抗-IGFR的生产培养物上清的非还原CE-SDS分析。
图11.图10中分析的双特异性抗体组合物的来自羟基磷灰石层析柱的洗脱图谱(通过280nmUV吸光度监测)。用倾斜和分级线所示的洗脱缓冲液中的递增NaCl梯度(具有执行分级的线性梯度)达到洗脱。
图12.来自图11的第二洗脱峰的非还原CE-SDS分析。
图13.A蛋白层析之后的KiH/scFab双特异性抗体抗-IL17/抗-TWEAK的生产培养物上清的非还原CE-SDS分析。
图14.图13中分析的双特异性抗体组合物的来自羟基磷灰石层析柱的洗脱图谱(通过280nmUV吸光度监测)。用倾斜和分级线所示的洗脱缓冲液中的递增NaCl梯度(具有执行分级的线性梯度)达到洗脱。第一、第二和第三洗脱峰内的黑色尖头指示随后通过CD-SDS分析(显示在图15和16中;未显示第三箭头指示的级分的分析)的级分。
图15.来自图14的第一洗脱峰(第一/最左侧黑色箭头)的非还原CE-SDS分析。
图16.来自图14的第二洗脱峰(第二/中间黑色箭头)的非还原CE-SDS分析。
图17.图13中分析的双特异性抗体组合物的来自阳离子交换层析柱的洗脱图谱(通过280nmUV吸光度监测)。用斜线所示的洗脱缓冲液中的递增NaCl梯度(线性梯度)达到洗脱。
图18.来自图17的第一洗脱峰的非还原CE-SDS分析。
图19.来自图17的第二洗脱峰的还原CE-SDS分析。
发明详述
已令人惊奇地发现,可以用羟基磷灰石层析来从至少一种双特异性抗体生产特异的副产物(即从至少一种双特异性抗体特异性副产物“BASB”)分离双特异性抗体。虽然羟基磷灰石层析已显示在蛋白质纯化方法中从诸如聚集体、DNA和内毒素的杂质产生高纯度,但尚未证明可分离仅具有略微IEP差异的分子(参见例如Gagnon等,HydroxyapatiteasaCaptureMethodforPurificationofMonoclonalAntibodies,IBCWorldConferenceandExposition,SanFrancisco(2006))。通常,双特异性抗体和BASB的IEP值差异不超过0.5pH,在本发明和教导之前,认为IPE值过于接近而不能用离子交换层析分离。因此,纯化双特异性抗体的尝试通常依赖于用多个昂贵的亲和步骤,来确保具有双特异性活性的分子的纯度。相反,本方法提供了用于分离双特异性抗体和至少一种BASB的简化和/或以其他方式改进的纯化方案。
本文定义的BASB是双特异性抗体的包含Fc结构域的片段,和/或双特异性抗体的具有比该双特异性抗体大的分子量的多肽变体,该多肽变体包含双特异性抗体的两条重链中的至少一条,且进一步包含Fc结构域。BASB的非限制性实例包括1/2抗体、3/4抗体和5/4抗体。因此,所公开的羟基磷灰石层析方法可以补充现有的抗体纯化方案,现有的抗体纯化方案通常不适于或不足以从一种或多种BASB分离双特异性抗体。本文公开的羟基磷灰石层析方法可以用于从溶液分离/纯化/分开双特异性抗体的任意方法,尤其是其中该溶液包含一种或多种BASB。本发明的方法可以用于从包含双特异性抗体和一种或多种(即至少一种)BASB的溶液分离双特异性抗体,其中,在双特异性抗体或双特异性抗体和一种或多种BASB吸附在羟基磷灰石介质上之后,该分离包括获得包含双特异性抗体但不包含该一种或多种BASB的洗脱级分。如本文所述,本发明的方法可以用于从包含双特异性抗体和一种或多种(即至少一种)BASB的溶液分离双特异性抗体,其中,在双特异性抗体吸附在羟基磷灰石介质上之后,或在双特异性抗体和一种或多种BASB吸附在羟基磷灰石介质上之后,该分离包括获得包含双特异性抗体但不包含该一种或多种BASB的洗脱级分,其中该一种或多种BASB是1/2抗体、3/4抗体或5/4抗体。在某些实施方案中,本发明的方法可以用于从包含双特异性抗体和一种或多种(即至少一种)BASB的溶液分离双特异性抗体,其中该一种或多种BASB是1/2抗体,且在双特异性抗体或双特异性抗体和1/2抗体吸附在羟基磷灰石介质上之后,该分离包括获得包含双特异性抗体但不包含1/2抗体的洗脱级分。在相关或备选实施方案中,本发明的方法可以用于从包含双特异性抗体和一种或多种(即至少一种)BASB的溶液分离双特异性抗体,其中该一种或多种BASB是3/4抗体,且在双特异性抗体或双特异性抗体和3/4抗体吸附在羟基磷灰石介质上之后,该分离包括获得包含双特异性抗体但不包含3/4抗体的洗脱级分。在其他相关或备选实施方案中,本发明的方法可以用于从包含双特异性抗体和一种或多种(即至少一种)BASB的溶液分离双特异性抗体,其中该一种或多种BASB是5/4抗体,且在双特异性抗体或双特异性抗体和5/4抗体吸附在羟基磷灰石介质上之后,该分离包括获得包含双特异性抗体但不包含5/4抗体的洗脱级分。在其他相关或备选实施方案中,本发明的方法可以用于从包含双特异性抗体和一种或多种(即至少一种)BASB的溶液分离双特异性抗体,其中该一种或多种BASB是1/2抗体和3/4抗体,且在双特异性抗体或双特异性抗体、1/2抗体和3/4抗体吸附在羟基磷灰石介质上之后,该分离包括获得包含双特异性抗体但不包含1/2抗体和3/4抗体中的一种或两种的洗脱级分。在其他相关或备选实施方案中,本发明的方法可以用于从包含双特异性抗体和一种或多种(即至少一种)BASB的溶液分离双特异性抗体,其中该一种或多种BASB是1/2抗体和5/4抗体,且在双特异性抗体或双特异性抗体、1/2抗体和5/4抗体吸附在羟基磷灰石介质上之后,该分离包括获得包含双特异性抗体但不包含1/2抗体和5/4抗体中的一种或两种的洗脱级分。在其他相关或备选实施方案中,本发明的方法可以用于从包含双特异性抗体和一种或多种(即至少一种)BASB的溶液分离双特异性抗体,其中该一种或多种BASB是3/4抗体和5/4抗体,且在双特异性抗体或双特异性抗体、3/4抗体和5/4抗体吸附在羟基磷灰石介质上之后,该分离包括获得包含双特异性抗体但不包含3/4抗体和5/4抗体中的一种或两种的洗脱级分。在其他相关或备选实施方案中,本发明的方法可以用于从包含双特异性抗体和一种或多种(即至少一种)BASB的溶液分离双特异性抗体,其中该一种或多种BASB是1/2抗体、3/4抗体和5/4抗体,且在双特异性抗体或双特异性抗体、1/2抗体、3/4抗体和5/4抗体吸附在羟基磷灰石介质上之后,该分离包括获得包含双特异性抗体但不包含1/2抗体、3/4抗体和5/4抗体中的一种、两种或全部的洗脱级分。
羟基磷灰石[HA]是具有结构式Ca10(PO4)6(OH)2的磷酸钙的结晶矿物。HA上的蛋白质反应性位点包括带正电荷的钙离子(C-位点)和三个(triplet)带负电荷的磷酸基团(P-位点)对。C位点通过蛋白质羧基簇经HA钙螯合与蛋白质(如双特异性抗体和BASB)相互作用。钙螯合和配位有时称为钙亲和。P位点通过与带正电荷的蛋白质氨基酸残基的磷酰基阳离子交换与蛋白质相互作用(参见例如US2012/0077961)。在工业和商业背景中,HA最常用于用磷酸盐梯度或在一些情况下用氯化物梯度从诸如蛋白质聚集体、宿主细胞蛋白质和宿主细胞DNA的蛋白质生产副产物分离希望的蛋白质。但是,尚未考虑用HA来从含有Fc的副产物纯化全长抗体(例如包含Fc结构域),因为认为这些副产物与希望的产物(即全抗体)一起洗脱。例如,之前认为在磷酸盐存在下使用氯化钠导致IgG较弱地结合HA,导致不仅洗脱抗体,也洗脱含有Fc的污染物。相反,本发明人已发现,在磷酸盐的存在下提高氯化钠的浓度令人惊奇地能够从一种或多种BASB分离双特异性抗体。
多种羟基磷灰石层析支持物可购得,并常用于本领域,它们中的任何一种都可以用于实施本发明。这些包括但不限于陶瓷羟基磷灰石、羟基磷灰石凝胶、羟基磷灰石树脂和氰基磷灰石粉末。陶瓷羟基磷灰石指其中纳米晶体聚集为颗粒并在高温下烧结产生适于层析应用的稳定陶瓷微球的羟基磷灰石形式。市售陶瓷羟基磷灰石的实例包括但不限于CHTI型和CHTII型(BIORad,USA)。通常可获得颗粒大小包括但不限于10、20、40和80微米的羟基磷灰石微球。羟基磷灰石凝胶指包含包埋在凝胶支持物中的非陶瓷羟基磷灰石的产品。羟基磷灰石凝胶的非限制性实例是ULTROGELTM(PallCorp.,USA),其包含包埋在多孔琼脂糖微球中的非陶瓷羟基磷灰石的微片段。适合用于本发明的方法的羟基磷灰石形式和/或类型(包括平均颗粒大小)的选择在本领域普通技术人员的能力范围之内,用常识达到和/或通过常规实验来确定。
层析方法可以按照本领域已知和/或本文所述的任意组合实施。层析方法的非限制性实例包括填充床柱、流化/膨胀床柱和/或分批操作,其中将层析介质与包含双特异性抗体的溶液混合。在优选实施方案中,以结合-洗脱模式/条件操作柱,用羟基磷灰石的填充床柱实施本发明的方法。
本发明的方法从包含双特异性抗体和至少一种BASB的溶液(即“双特异性抗体溶液”)分离双特异性抗体。本发明的方法可应用于未纯化或部分纯化和/或过滤或未过滤的双特异性抗体溶液。双特异性抗体溶液可以来自天然来源、合成来源或重组来源。未纯化的双特异性抗体溶液可以来自本领域已知和/或本文所述的任意来源,包括但不限于血浆、血清、腹水、乳、植物提取物、细菌裂解物、酵母裂解物、细胞裂解物、重组细胞裂解物和条件细胞培养基。本文所用的“部分纯化的溶液”可以指这样的溶液,其包括但不限于已通过至少一种层析方法、过滤方法、分级分离方法、沉淀方法或本领域已知的其他标准纯化方法或其任意组合处理的双特异性抗体溶液。本发明涵盖本文所述的羟基磷灰石层析方法和本领域已知和/或本文所述的任意其他一种或多种层析方法的组合,该一种或多种层析方法包括但不限于大小排阻、亲和、阴离子交换、阳离子交换、疏水相互作用、固定化金属亲和层析和混合模式层析及其组合。
本文所述的羟基磷灰石层析方法可以与一种或多种亲和层析方法组合,该一种或多种亲和层析方法尤其是使用对抗体恒定结构域(例如,包括但不限于抗体Fc结构域和/或抗体轻链κ-或λ-结构域)具有特异性的亲和介质(即分别包括使用Fc结合剂、κ结合剂和/或λ结合剂)。基于恒定结构域结合剂(例如Fc结合剂)的用于从多种溶液纯化抗体(例如双特异性抗体)的亲和层析众所周知,并在本领域中常规实施。
本文所用的术语“Fc结合剂”和类似的术语指能够结合抗体(例如IgG抗体)的Fc区的分子。可以用于本发明方法的常用Fc结合剂的非限制性实例包括补体蛋白质、Fc受体、细菌来源的蛋白质(如A蛋白和/或G蛋白)及其组合。通常,Fc结合剂在重链的CH2/CH3区域内结合抗体,例如IgG。在优选实施方案中,本发明涉及从包含双特异性抗体的溶液分离包含Fc结构域/区的双特异性抗体。在更优选的实施方案中,本发明涉及从包含双特异性抗体和至少一种BASB(其必然也包含Fc结构域)的溶液分离包含Fc结构域/区的双特异性抗体。因此,在某些实施方案中,按照本发明的方法与羟基磷灰石介质接触的溶液包含合并的从含有Fc结合剂的亲和柱洗脱的含有双特异性抗体和BASB的级分。
本文所用的术语“抗体轻链恒定结构域结合剂”和类似的术语指能够结合抗体(例如IgG抗体)轻链,尤其是结合抗体轻链的恒定区,例如结合轻链κ恒定结构域/区或轻链λ恒定结构域/区的分子。可以用于本发明方法的常用抗体轻链恒定结构域结合剂的非限制性实例包括细菌来源的蛋白质(如L蛋白),及对轻链具有特异性的单链抗体片段(例如市售产品,如KappaSelectTM和LambdaFabSelectTM(GEHealthcare,USA)),及这些物质的组合。通常,L蛋白、κ结合剂和λ结合剂在轻链的恒定区内结合抗体,例如IgG。在某些实施方案中,本发明涉及从包含双特异性抗体的溶液分离包含抗体轻链恒定结构域/区的双特异性抗体。在某些实施方案中,按照本发明的方法与羟基磷灰石介质接触的溶液包含合并的从含有抗体轻链恒定结构域结合剂的亲和柱洗脱的含有双特异性抗体的级分。
对于大多数商业纯化应用,将Fc结合剂和/或抗体轻链恒定结构域结合剂(例如κ结合剂和/或λ结合剂)固定在固相上,以允许装柱和/或从所加入的溶液容易地分离亲和配体-靶分子(例如双特异性抗体和至少一种BASB)。固相可以包含例如但不限于小球、琼脂糖基质、二氧化硅及其混合物。
本发明的羟基磷灰石层析方法可以与本领域已知和/或本文所述的其他用于纯化蛋白质、肽和/或多肽(例如抗体和双特异性抗体)的已知方法组合。蛋白质/肽/多肽纯化方法尤其是商业纯化方法常利用包括一个或多个不同过程/步骤/方法(如过滤、沉淀和/或层析)的纯化方案。不同过程/步骤/方法也可以称为本领域已知的“单元操作”;因此,在本文中与与纯化步骤(例如层析方法和层析单元操作)关联使用时,术语“过程”、“步骤”、“方法”和“单元操作”可互换。羟基磷灰石层析方法可以与本领域已知或本文所述的任意纯化方法/单元操作组合,包括但不限于使用微生物来源的蛋白质的亲和层析(例如所述A蛋白、ptoreinG、A/G蛋白和/或L蛋白亲和层析)、离子交换层析(例如阳离子交换、阴离子交换和混合模式交换层析)、亲硫吸附(例如具有β-巯基乙醇和其他SH配体)、疏水相互作用或芳族吸附层析(例如具有丁基-琼脂糖、苯基-琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂或间-氨基苯基硼酸)、金属螯合亲和层析(例如具有Ni(II)-、Zn(II)和Cu(II)亲和物质)、大小排阻层析和制备型电泳方法(如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。本领域公知的纯化步骤或单元操作的其他非限制性实例包括透析、疏水相互作用层析(HIC)、疏水电荷相互作用层析(HCIC)、硫酸铵沉淀、阴离子或阳离子交换层析、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的层析、层析聚焦和凝胶过滤。羟基磷灰石层析方法和/或与本领域已知或本文所述的其他纯化方法/单元操作的组合良好地适于从污染物和/或杂质分离双特异性抗体,该其污染物和/或杂质包括但不限于宿主细胞核酸、内毒素、病毒及本文所用的术语BASB未明确涵盖的其他双特异性抗体变体。可以认为是来自双特异性抗体生产的污染物但可以不为本文所用的术语BASB所涵盖的双特异性抗体变体的实例是包含一对重链/轻链多肽的同二聚体。这种同二聚体可具有类似于双特异性抗体的分子量和结构(即类似于“标准”IgG的结构),但各可变结构域将是相同的。这种同二聚体在本文中称为1/2抗体同二聚体。因此,无论单独还是与本领域已知的一种或多种纯化单元操作组合,本发明的羟基磷灰石层析方法都可以从包含双特异性抗体和1/2抗体同二聚体的溶液分离双特异性抗体,其中,在双特异性抗体或双特异性抗体和1/2抗体同二聚体吸附至羟基磷灰石介质之后,该分离包括获得包含双特异性抗体但不包含1/2抗体同二聚体的洗脱级分。在某些实施方案中,本发明的方法涵盖从包含它和1/2抗体同二聚体的溶液分离双特异性抗体,其中该方法包括本文所述的羟基磷灰石层析方法与阳离子交换层析方法(其可以在羟基磷灰石层析方法的上游或下游)组合,其中,在羟基磷灰石层析方法和阳离子交换层析方法之后,该分离包括获得包含双特异性抗体但不包含1/2抗体同二聚体的来自羟基磷灰石层析方法或阳离子交换层析方法(取决于它们的进行顺序)的洗脱级分。
本文公开的层析方法良好地适用于商业规模。该方法可以以分批或连续操作、或以半连续方式运行,例如在包含希望的种类的溶液的连续流基础上,通过层析单元操作,直至整个大批次这样经过过滤(例如,在过滤阶段之间插入一个或多个可选的洗涤步骤)。以这种方式,可以进行连续循环方法来在相对短的时期内以可接受的纯度形式得到大产率的希望的产品。
本发明的双特异性抗体优选通过重组手段产生。用于重组产生抗体的常规方法通常可适用于产生双特异性抗体。这种常规方法在现有技术中众所周知,且包括原核或真核细胞中的蛋白质表达(参见例如以下综述:Makrides,S.C.,ProteinExpr.Purif.17,183-202(1999);Geisse,S.等,ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R.J.,MoI.Biotechnol.16(2000)151-160;Werner,R.G.,DrugRes.48(1998)870-880)。相对于产生标准抗体,重组产生双特异性抗体涵盖必须考虑的其他问题,尤其是与促进两条不同重链的异二聚化和促进正确的重链可变结构域-轻链可变结构域配对相关的问题。但是,成功产生双特异性抗体,例如促进正确的多肽形成已成为现有技术。例如,已显示通过使用“杵入臼”或“KiH”方法来促进两条不同重链的异二聚化。在KiH方法中,将大的氨基酸侧链引入一条重链的CH3结构域中,该侧链嵌入另一重链的CH3结构域中适当设计的凹陷(参见例如Ridgeway等,ProteinEng.9(1996),617-621和Atwell等,J.Mol.Biol.270(1997),677-681)。因此,重链的异二聚体倾向于比任一种同二聚体更稳定,形成更大比例的所表达的多肽。另外,通过修饰双特异性抗体(Fab区)的一个可变结构域(或Fab结构域内的可变结构域-恒定区)来在轻链和重链之间“对换”恒定区,或恒定区和可变区,可以诱导希望的轻链/重链对的结合来形成希望的Fab结构域。因此,在经修饰的Fab结构域中,重链可包含例如CL-VH或CL-VL结构域,而轻链可包含CH1-VL或CH1-VH结构域。这阻止了修饰臂的轻链/重链与标准/未修饰臂的轻链/重链的相互作用。作为说明,修饰臂Fab结构域中包含CL结构域的重链将不与标准臂轻链中的CL结构域相互作用(阻止重链/轻链的“不正确”配对)。这种用于阻止不正确的轻链/重链结合的技术称为“CrossMab”技术,在与KiT技术组合时,导致希望的双特异性分子的表达显著增强(参见例如Schaefer等,PNAS108(2011),11187-11192)。备选地或此外,可以修饰抗体的一条臂,使得Fab结构域是scFab或scFv,仅在系统中留下一条“自由”轻链。本发明因此涵盖通过本领域已知或本文所述的任意手段产生的双特异性抗体。
本发明的方法适合用于从包含任意双特异性抗体和至少一种BASB的溶液分离该双特异性抗体。本所公开的方法的双特异性抗体可以是重组免疫球蛋白。另外,本发明的双特异性抗体可以包含人源化免疫球蛋白、嵌合免疫球蛋白、人免疫球蛋白和/或免疫球蛋白缀合物的片段。通过本发明的方法分离和/或纯化的双特异性抗体可以是治疗性或诊断性双特异性抗体。在一个实施方案中,双特异性抗体是治疗性双特异性抗体。治疗性双特异性抗体的非限制性实例包括对以下至少一种或两种具有特异性的双特异性抗体:EGFR、HER3、HER4、IGFR、Ep-CAM、CEA、TRAIL、TRAIL-受体1、TRAIL-受体2、淋巴毒素-β受体、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD22、CD28、CD33、CD40、CD80、CSF-1R、CTLA-4、死亡受体5(DR5)、IL-17、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、叶酸受体1(FolR1)、hepsin、潜伏膜蛋白1/2(LMP1/2)、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、VEGF受体1、VEGF受体2、IGFl-R、TSLP-R、PDGF-R、TIE-I、TIE-2、TNF(TNF-α)、TNF样弱凋亡诱导物(TWEAK)、IL-IR、VEGF、EGF、PDGF、HGF、血管生成素1和/或2(Ang1和/或Ang2)及本文所述或本领域已知的肿瘤抗原(例如生长因子受体和生长因子)。
在准备使包含双特异性抗体和至少一种BASB的溶液与羟基磷灰石层析介质接触时,通常有必要平衡介质的化学环境。这通过使介质与平衡缓冲液接触来达到,以建立允许双特异性抗体与介质结合的适当pH、电导率和盐浓度。本发明的平衡缓冲液包含浓度为约1mM至20mM的磷酸盐、浓度为约10mM至200mM的氯化物盐和浓度为约0.01mM至0.5mM的钙盐。在某些实施方案中,本发明方法的平衡缓冲液包含磷酸盐、钙盐和氯化物盐。本发明方法的平衡缓冲液可以包含浓度为约10mM的磷酸盐、浓度为约0.1mM的钙盐和浓度为约50mM的氯化物盐。本发明方法的平衡缓冲液可以包含浓度为约10mM的NaH2PO4、浓度为约0.1mM的CaCl2和浓度为约50mM的NaCl。
平衡缓冲液还可以可选地包含缓冲化合物来赋予充分的pH控制。缓冲化合物可以包括但不限于MES、HEPES、BICINE、咪唑和Tris。在非限制性实施方案中,本发明方法的平衡缓冲液可以在浓度为约20mM的MES存在下包含浓度为约10mM的磷酸盐、浓度为约0.1mM的钙盐和浓度为约50mM的氯化物盐,且pH为约6.5至7.5。在相关或备选的非限制性实施方案中,本发明方法的平衡缓冲液可以在浓度为约20mM的MES存在下包含浓度为约10mM的NaH2PO4、浓度为约0.1mM的CaCl2和浓度为约50mM的NaCl,且pH为约6.5至7.5。
平衡羟基磷灰石介质后,可以使它与包含双特异性抗体和至少一种BASB的溶液接触。双特异性抗体和至少一种BASB通常处于允许它们与羟基磷灰石介质结合的条件的溶液中。如本领域已知,这种溶液可以称为结合缓冲液。结合缓冲液可以具有与本文定义的平衡缓冲液相同或不同的组成。在某些实施方案中,按照本文所列的针对平衡缓冲液列出的标准选择结合缓冲液。因此,在非限制性实施方案中,本发明方法的结合缓冲液与平衡缓冲液相同。在非限制性实施方案中,结合缓冲液可以在浓度为约20mM的MES存在下包含浓度为约10mM的磷酸盐、浓度为约0.1mM的钙盐和浓度为约50mM的氯化物盐,且pH为约6.5至7.5。在相关或备选的非限制性实施方案中,本发明方法的结合缓冲液可以在浓度为约20mM的MES存在下包含浓度为约10mM的NaH2PO4、浓度为约0.1mM的CaCl2和浓度为约50mM的NaCl,且pH为约6.5至7.5。在一个包括结合和洗脱层析方法的实施方案中,包含双特异性抗体和一种或多种BASB的溶液流过包含羟基磷灰石介质的柱子,且双特异性抗体或双特异性抗体和一种或多种BASB结合至柱(即结合至羟基磷灰石介质)。包含双特异性抗体的溶液之后可以跟随通常具有与平衡缓冲液和/或结合缓冲液相同的组成的洗涤缓冲液。如果使用,洗涤缓冲液可以从柱去除一种或多种污染物。
至少双特异性抗体结合和可选的洗涤之后,在保持一种或多种BASB结合于介质的条件下和/或在其中双特异性抗体和一种或多种BASB从介质分离洗脱的条件下从羟基磷灰石层析介质洗脱双特异性抗体。选择具有这样的起始组成的洗脱缓冲液,使得电导率值低。适合用于本文公开的方法的具有低电导率值的溶液通常具有约或不大于约13mS/cm的值。适合用于本文公开的方法的具有低电导率值的溶液还可以具有约或不超过约10.6mS/cm、或约或不超过约8.5mS/cm的电导率值。具有低电导率值的洗脱缓冲液的起始组成的非限制性实例包括这样的溶液,该溶液在缓冲化合物(如本文关于结合和/或平衡缓冲液所定义)的存下具有约1mM至约20mM范围内的磷酸根离子浓度、约0.01mM至约0.5mM范围内的钙浓度和约10mM至约200mM范围内的氯化物浓度,pH为约6.5至8.0。本发明方法的洗脱缓冲液可以具有这样的起始组成:在缓冲化合物(如本文关于结合和/或平衡缓冲液所定义)的存下,具有约10mM的磷酸根离子浓度、约0.1mM的钙浓度和约50mM的氯化物浓度,pH为约6.5至7.5。在具体实施方案中,本发明方法的洗脱缓冲液可以具有这样的起始组成:在20mMMES存在下,含10mMNaH2PO4、0.1mMCaCl2和50mMNaCl,pH为6.5至7.5。本发明的方法通过提高洗脱缓冲液中氯离子的浓度来专一性地从羟基磷灰石介质洗脱双特异性抗体。氯离子浓度可以按照线性梯度、执行分级梯度(参见例如图6中所示的增加氯离子的执行分级梯度)或这两种梯度的组合提高。鉴于本文中所包含的教导,从层析介质洗脱双特异性抗体和/或从一种或多种BASB分离双特异性抗体(即洗脱一种而其他保持结合于介质)的梯度的优化在本领域技术人员能力范围之内。可以通过提高一种或多种氯化物盐的浓度来提高洗脱缓冲液中氯离子的浓度。可以加至洗脱缓冲液来提高氯离子浓度的氯化物盐的实例包括NaCl和KCl。在某些实施方案中,通过提高NaCl的浓度来提高洗脱缓冲液中氯离子的浓度。在优选实施方案中,洗脱缓冲液的起始氯离子浓度为约50mM(其可以由一种或多种氯化物盐提供),随后在洗脱期间增加至洗脱双特异性抗体所必需的浓度。本领域技术人员可以使用本领域已知的常规方法及按照本文所述的教导和方法容易地确定洗脱所吸附的双特异性抗体所必需的最大氯离子浓度。在某些实施方案中,用于洗脱双特异性抗体和/或从一种或多种BASB分离双特异性抗体的最大氯离子浓度为约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mM或约500mM。本发明方法的示例性洗脱缓冲液具有约10mMNaH2PO4、约50mMNaCl、约20mMMES和约0.1mMCaCl2、pH约6.5至7.5的起始组成,其中随后在洗脱步骤期间通过按照线性、分级或线性-分级梯度提高NaCl浓度至约500mM来提高氯离子的浓度。
本说明书中提到的所有专利和出版物指示本发明所属领域技术人员的水平。应理解,虽然阐述了本发明的某些形式,但它们不限于本文所描述和显示的部分的具体形式或排列。对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以进行多种改变而不背离本发明的范围,不认为本发明限于本所明书中所显示和描述的内容。为了可以更全面地理解本文所描述的发明,提供以下非限制性实施例。
实施例
一般方法
抗体表达
在HEK293细胞(Invitrogen)中瞬时表达抗体。按细胞供应商的说明书用抗体载体的Maxiprep(Qiagen)制备物、Opti-MEMI培养基(Invitrogen)、293fectin(Invitrogen)和1–2x106活细胞/mL的起始细胞密度在无血清FreeStyle293表达培养基(Invitrogen)中进行细胞转染。在摇瓶或搅拌式发酵罐中培养7天后,通过离心收集包含抗体的细胞培养物上清,并过滤通过无菌滤器(0.22μm)。收集后立即处理上清或在-80℃保存直至纯化。
A蛋白亲和层析
用A蛋白–Sepharose柱(MabSelectSure-SepharoseTM(GEHealthcare,瑞典)),通过亲和层析,从无菌过滤的培养物上清纯化包含Fc区/结构域的分子。简言之,首先将培养物上清加至用PBS缓冲液(10mMNa2HPO4、1mMKH2PO4、137mMNaCl和2.7mMKCl,pH7.4)平衡的A蛋白柱。随后用平衡缓冲液洗涤柱,并用25mM柠檬酸钠pH3.0洗脱抗体。合并抗体级分,并用脱盐柱或通过充分透析来将缓冲液更换为10mMNaH2PO4、50mMNaCl、20mMMES、0.1mMCaCl2、pH6.5-7.5,准备进行羟基磷灰石层析。
羟基磷灰石层析
用MacroPrepCHTII型羟基磷灰石树脂(BioRad,USA)进行羟基磷灰石层析。用10mMNaH2PO4、50mMNaCl、20mMMES、0.1mMCaCl2、pH6.5-7.5平衡羟基磷灰石树脂后,将按上文制备的抗体上样流体加至柱。然后用平衡缓冲液洗涤柱,以直至10mMNaH2PO4、500mMNaCl、20mMMES、0.1mMCaCl2、pH6.5-7.5的线性梯度或具有执行分级的线性梯度洗脱所结合的物质。通过280nm吸光度(显示在本文所示的层析图中)监测洗脱物(洗脱级分)中的蛋白质浓度。
CE-SDS分析
在羟基磷灰石层析之前和之后,通过十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)分析上样和/或积分组成,包括测定双特异性抗体、双特异性抗体片段和/或双特异性抗体特异性副产物的百分比(包括估计的分子量)。用微流体Labchip技术(PerkinElmer,USA)按照厂家的说明书进行CE-SDS。简言之,按照厂家的说明书用HT蛋白质表达试剂盒制备5μl上样流体(羟基磷灰石层析之前;即从A蛋白亲和柱洗脱的洗脱物(即抗体))和来自羟基磷灰石柱的洗脱物用于CE-SDS分析,并用HT蛋白质表达芯片在LabChipGXII系统上分析。用LabChipGX软件分析数据。
实施例1:1/2抗体片段和双特异性CrossMabEGFR-IGFR的分离
方法
按照例如Schaefer等,PNASUSA108(2011),11187-11192中所述的CrossMab和杵入臼(KiH)方法设计抗-EGFR/抗-IGFR双特异性抗体。按上文一般方法中所述表达双特异性抗体、用A蛋白亲和层析从培养物上清纯化、并用CE-SDS分析。
A蛋白亲和纯化之后,将包含抗体的溶液上样至羟基磷灰石柱上,并以上文所述的线性盐梯度洗脱。
结果
合并从A蛋白柱洗脱的包含抗体的级分形成羟基磷灰石层析的上样流体,并分析蛋白质组成。CE-SDS分析显示,上样流体包含两种主要的蛋白质种类。约43%的总蛋白质是具有约94kD分子量的蛋白质,约33%是具有约160kD分子量的蛋白质;分别将这两种蛋白质种类鉴定为1/2抗体片段(即包含单条重链和单条轻链的双特异性抗体片段)和“完整的”双特异性抗体(图1)。
将上样流体加至羟基磷灰石柱,并用上文所述和图2中斜线所示的线性盐梯度洗脱。图2还显示通过280nmUV吸光度监测的来自羟基磷灰石柱的洗脱图谱。1/2抗体种类在较低盐浓度下从羟基磷灰石柱洗脱,几乎没有所希望的双特异性抗体的共洗脱:发现图2的左侧灰框所示的合并级分中总蛋白质的约92%是1/2抗体副产物/污染物,不到4%是双特异性抗体(通过CE-SDS测定,图3)。双特异性抗体作为第二个峰洗脱:发现图2的右侧灰框所示的合并级分中的蛋白质的约80%是双特异性抗体(通过CE-SDS测定,图4)。
结果证明本发明的方法允许容易地至少从1/2抗体副产物/污染物分离双特异性抗体。
实施例2:1/2抗体片段和双特异性scFabAng2-VEGF的分离
方法
除以下例外,实施例2遵循实施例1的方法:双特异性抗体是用KiH方法而不是CrossMab方法设计的抗-Ang2/抗-VEGF双特异性抗体。相反,将Ang2特异性可变结构域设计为scFab,这阻止了本文中例如背景章节中所述的多种轻链和重链可变结构域的不正确配对。此外,在A蛋白捕获之后,用具有执行分级的线性盐梯度从羟基磷灰石柱洗脱包含抗体的溶液。
结果
合并的来自A蛋白亲和层析的含抗体级分的CE-SDS分析显示,羟基磷灰石层析之前的上样流体包含三种主要的蛋白质种类:约16%是1/2抗体片段、约77%是希望的双特异性抗体、约6%是高分子量聚集体(图5)。
将上样流体加至羟基磷灰石柱,并用图6中分级和倾斜线所示的具有执行分级的线性盐梯度洗脱。图6还显示通过280nmUV吸光度监测的来自羟基磷灰石柱的洗脱图谱。1/2抗体种类在显著低于双特异性抗体的盐浓度下洗脱,可以从“完整的”双特异性种类和更大的聚集体完全分离。显示在低盐浓度下洗脱的蛋白质种类100%是1/2抗体片段(图7:图6的黑体垂直线左侧的合并级分的分析)。然后双特异性抗体和抗体聚集体分别随着盐浓度提高而洗脱。显示合并的包含双特异性抗体的级分(代表图6中黑实线右侧的第一个峰)是约97%纯的双特异性抗体(图8)。
结果证明本发明的方法允许容易地至少从1/2抗体副产物/污染物以及抗体聚集体(包括5/4抗体副产物/污染物)分离双特异性抗体。
实施例3:3/4抗体片段和双特异性CrossMabAng2-VEGF的分离
方法
重复实施例2,但按照CrossMab方法设计双特异性Ang2-VEGF抗体。同样,在A蛋白捕获之后,用线性盐梯度从羟基磷灰石柱洗脱包含抗体的溶液。
结果
合并的来自A蛋白亲和层析的含抗体级分的CE-SDS分析显示,羟基磷灰石层析之前的上样流体包含约7.8%的3/4抗体片段(即缺乏一条轻链的双特异性抗体)和85%双特异性抗体(数据未显示)。
将上样流体加至羟基磷灰石柱,并用图9中斜线所示的线性盐梯度洗脱。3/4抗体富集在图9中峰的侧面级分中。例如,级分C4(图9)包含95%双特异性抗体和1.8%3/4抗体;级分D8包含78%双特异性抗体和9.1%3/4抗体。因此,结果证明本发明的方法允许实质性地至少从3/4抗体副产物/污染物分离双特异性抗体。
实施例4:1/2抗体片段和双特异性scFabEGFR-IGFR的分离
方法
除以下例外,实施例4遵循实施例2的方法:双特异性抗体是抗-EGFR/抗-IGFR双特异性抗体。与实施例2一样,用KiH而不是CrossMab方法设计双特异性抗体,IGFR抗原结合结构域是scFab。用具有执行分级的线性盐梯度从羟基磷灰石柱洗脱包含抗体的级分。
结果
合并的来自A蛋白亲和层析的含抗体级分的CE-SDS分析显示,羟基磷灰石层析之前的上样流体包含与实施例2所观察到的平行的三种主要的蛋白质种类:约25%是1/2抗体片段、约57%是希望的双特异性抗体、约14%是高分子量聚集体(图10)。
将上样流体加至羟基磷灰石柱,并用图11中分级和倾斜线所示的具有执行分级的线性盐梯度洗脱。1/2抗体种类在低盐浓度下洗脱,双特异性抗体和抗体聚集体分别在逐渐提高的盐浓度下洗脱(图11)。测定合并的来自双特异性抗体洗脱峰的级分包含约97%双特异性抗体,其具有很少来自1/2抗体片段/副产物或聚集体的污染物(图12)。因此,线性和分级盐梯度允许容易地从1/2抗体片段/副产物和抗体聚集体分离和纯化双特异性抗体。
实施例5:5/4抗体和双特异性scFabTWEAK-IL17的分离
方法
除以下例外,实施例5遵循实施例2和3的方法:双特异性抗体是抗-TWEAK/抗-IL17双特异性抗体。与实施例2和3一样,用KiH而不是CrossMab方法设计双特异性抗体,TWEAK抗原结合结构域是scFab。用具有执行分级的线性盐梯度从羟基磷灰石柱洗脱包含抗体的级分。
结果
合并的来自A蛋白亲和层析的含抗体级分的CE-SDS分析显示,羟基磷灰石层析之前的上样流体包含两种主要的蛋白质级分:约17%是5/4抗体种类(可能包含额外的IL17轻链),而约68%是具有希望的双特异性抗体的表观分子量的级分(图13)。随后的分析显示,包含具有双特异性蛋白质的表观分子量的蛋白质的级分是双特异性蛋白质和抗-IL17重链/轻链对的同二聚体(即等同于单特异性或“标准”抗IL17抗体)的混合物(数据未显示;通过在还原条件下进行的CE-SDS确认)。
将上样流体加至羟基磷灰石柱,并用图14中倾斜和分级线所示的具有执行分级的线性盐梯度洗脱。双特异性抗体和同二聚体在较低盐浓度下共洗脱在单个峰中(参见图14和15的第一个峰)。5/4抗体在较高盐浓度下分离洗脱(参见图14中的第三个峰;第四个峰是蛋白质聚集体)。测定合并的来自第一个洗脱峰的级分仅包含双特异性抗体和同二聚体,未观察到来自高分子量种类的污染物,例如5/4抗体(图15)。类似地,合并的与5/4抗体相关的洗脱峰的级分显示,此洗脱种类无可检测到的来自双特异性抗体或同二聚体的污染物(图16)。因此,线性和分级盐梯度允许容易地至少从5/4抗体和/或具有仅最小程度地大于目的分子的分子量的副产物分离和纯化双特异性抗体。
实施例6:同二聚体和双特异性scFabTWEAK-IL17的分离
方法
实施例5证明本发明方法的羟基磷灰石层析能够从5/4抗体污染物分离双特异性抗体;但是,双特异性抗体与配对的抗-IL17重链/轻链的同二聚体(即等同于“标准”或单特异性抗-IL-17抗体)共洗脱。使用线性盐梯度,用PorosHS50阳离子交换层析研究了同二聚体和双特异性抗体的分离。
结果
如实施例5中所报道,来自A蛋白亲和层析之后的双特异性scFabTWEAK-IL17生产的上样流体包含三种蛋白质种类:双特异性抗体、抗IL-17同二聚体和5/4抗体。对上样流体进行进行阳离子交换层析,并用图17中所示的线性盐梯度洗脱。来自上样流体的蛋白质洗脱在两个峰中(图17)。合并的第一个峰的级分的CE-SDS分析显示,它们包含双特异性抗体和5/4抗体种类(参见实施例5和图18(非还原条件下的CE-SDS))。合并的第二个峰的级分的CE-SDS分析显示,它们专一性包含IL-17同二聚体(参见图19,还原条件下的CE-SDS)。因此,阳离子交换柱的使用允许容易地从同二聚体分离双特异性抗体和/或5/4抗体污染物种类。实施例5证明,然后可以用本文所述的羟基磷灰石层析容易地分离共洗脱的双特异性抗体和5/4抗体污染物。实施例5和6的结果的差异提供了进一步的证据证明,本文所述的羟基磷灰石层析方法提供了不同于本领域之前已知的方法(例如离子交换层析)的独特的层析工具。因此,可选地与其他层析方法组合使用本文所述的羟基磷灰石层析允许从双特异性抗体生产特异的副产物分离双特异性抗体。
Claims (13)
1.从包含双特异性抗体的溶液分离所述双特异性抗体的方法,所述双特异性抗体含有Fc结构域,所述方法包括:
(a)使所述溶液与羟基磷灰石层析介质接触;
(b)使所述双特异性抗体吸附至所述羟基磷灰石层析介质;和
(c)在氯离子的存在下,从所述羟基磷灰石层析介质洗脱所述双特异性抗体;
其中
所述溶液进一步包含所述双特异性抗体的一种或多种片段,所述一种或多种片段包含Fc结构域;
和/或其中
所述溶液进一步包含一种或多种多肽,所述一种或多种多肽具有比所述双特异性抗体的分子量大的分子量且包含所述双特异性抗体的两条重链中的至少一条,所述一种或多种多肽进一步包含Fc结构域。
2.权利要求1的方法,其中步骤(c)包括获得洗脱级分,所述级分包含所述双特异性抗体,但不包含所述一种或多种片段中的至少一种,和/或不包含所述一种或多种多肽中的至少一种。
3.权利要求2的方法,
其中所述一种或多种片段中的所述至少一种是1/2抗体或3/4抗体;和/或
其中所述一种或多种多肽中的所述至少一种是5/4抗体。
4.权利要求1至3中任一项的方法,其中所述洗脱是在具有6.5至7.5的pH、约1mM和约20mM之间的磷酸根离子浓度、约0.001mM和约0.5mM之间的钙离子浓度及约10mM和约200mM之间的氯离子浓度的洗脱缓冲液的存在下进行。
5.权利要求4的方法,其中所述洗脱是在洗脱缓冲液的存在下进行,所述洗脱缓冲液具有6.5至7.5的pH、约10mM的磷酸根离子浓度、约0.1mM的钙离子浓度,且其中氯离子的浓度在梯度中从约50mM提高至约500mM。
6.权利要求5的方法,其中所述梯度是线性梯度、分级梯度,或是线性-分级梯度的组合。
7.权利要求1至6中任一项的方法,其中所述溶液包含含有双特异性抗体的级分或合并的含有双特异性抗体的级分,所述双特异性抗体的级分或合并的含有双特异性抗体的级分来自对抗体Fc结构域、对抗体轻链κ结构域和/或对抗体轻链λ结构域具有特异性的亲和层析介质的洗脱物。
8.权利要求1至7中任一项的方法,其中所述方法进一步包括上游或下游离子交换层析方法,所述方法从所述片段、所述多肽和/或1/2抗体同二聚体分离所述双特异性抗体。
9.权利要求8的方法,其中所述离子交换单元操作是阳离子交换单元操作。
10.权利要求1至9中任一项的方法,其中所述双特异性抗体是CrossMab双特异性抗体,或其中所述双特异性抗体的重链之一包含scFab。
11.权利要求1至10中任一项的方法,其中所述双特异性抗体是杵入臼(KiH)双特异性抗体。
12.权利要求1至11中任一项的方法,其中所述双特异性抗体是CrossMab和KiH双特异性抗体,且其中双特异性抗体对EGFR和IGFR具有特异性,或对Ang2和VEGF具有特异性。
13.权利要求1至11中任一项的方法,其中所述双特异性抗体的重链之一包含scFab,其中所述双特异性抗体是KiH双特异性抗体,且其中所述双特异性抗体对Ang2和VEGF具有特异性、对EGFR和IGFR具有特异性、或对TWEAK和IL17具有特异性。
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106800599A (zh) * | 2016-12-05 | 2017-06-06 | 中国人民解放军第二军医大学 | 抗人EGFR和Notch多特异性抗体、其制备方法及用途 |
CN109517043A (zh) * | 2018-11-23 | 2019-03-26 | 艾美汉信疫苗(大连)有限公司 | 一种原核表达重组轮状病毒抗原p2-vp8的纯化方法 |
CN109563124A (zh) * | 2016-06-17 | 2019-04-02 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 多特异性抗体的纯化 |
CN111788222A (zh) * | 2018-02-27 | 2020-10-16 | 辉瑞大药厂 | 抗体纯化 |
CN113281430A (zh) * | 2021-05-11 | 2021-08-20 | 苏州君盟生物医药科技有限公司 | 一种双特异性抗体的分离鉴定方法 |
CN114409798A (zh) * | 2019-02-14 | 2022-04-29 | 美勒斯公司 | 制备包含两种或更多种抗体的组合物 |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107922476A (zh) * | 2015-03-13 | 2018-04-17 | 诺夫免疫股份有限公司 | 纯化双特异性抗体的方法 |
BR112018003127A2 (pt) * | 2015-08-20 | 2018-09-25 | Genentech Inc | purificação de fkpa e usos do mesmo para produzir polipeptídeos recombinantes |
WO2017032610A1 (en) * | 2015-08-21 | 2017-03-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Affinity chromatography purification with low conductivity wash buffer |
WO2017032686A1 (en) * | 2015-08-21 | 2017-03-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for the reduction of host cell proteins in affinity chromatography |
US11186858B1 (en) | 2016-03-15 | 2021-11-30 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Methods for increasing biosimilarity |
WO2018038469A1 (ko) * | 2016-08-20 | 2018-03-01 | (주)아이벤트러스 | 목적하는 이중특이성 항체의 선택적 생산 확인 방법 |
WO2019016411A1 (en) | 2017-07-21 | 2019-01-24 | Novimmune Sa | GENERATION OF MULTISPECIFIC ANTIBODY MIXTURES AND METHODS OF USE |
US11945839B2 (en) | 2017-12-22 | 2024-04-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | Depletion of light chain mispaired antibody variants by hydrophobic interaction chromatography |
GB201805142D0 (en) * | 2018-03-29 | 2018-05-16 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Separation method |
US20220127375A1 (en) * | 2019-02-14 | 2022-04-28 | Merus N.V. | Producing compositions comprising two or more antibodies |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120202975A1 (en) * | 2010-08-18 | 2012-08-09 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Elution of proteins from hydroxyapatite resins without resin deterioration |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2242762B1 (en) | 2008-01-18 | 2015-12-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Enhanced purification of antibodies and antibody fragments by apatite chromatography |
TWI541021B (zh) | 2009-03-05 | 2016-07-11 | 艾伯維有限公司 | Il-17結合蛋白 |
TWI426920B (zh) * | 2010-03-26 | 2014-02-21 | Hoffmann La Roche | 雙專一性、雙價抗-vegf/抗-ang-2抗體 |
TW201138821A (en) | 2010-03-26 | 2011-11-16 | Roche Glycart Ag | Bispecific antibodies |
JP5984854B2 (ja) * | 2011-03-16 | 2016-09-06 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 移動相の調整によって、ポリペプチド単量体、凝集物およびフラグメントを分離するための選択性を向上させた、イオン交換クロマトグラフィー |
US10047144B2 (en) * | 2011-10-19 | 2018-08-14 | Novimmune Sa | Methods of purifying antibodies |
-
2014
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-
2016
- 2016-02-19 US US15/048,308 patent/US10316059B2/en active Active
- 2016-09-27 HK HK16111307.7A patent/HK1223108A1/zh unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120202975A1 (en) * | 2010-08-18 | 2012-08-09 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Elution of proteins from hydroxyapatite resins without resin deterioration |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
GAGNON等: "Monoclonal antibody purification with hydroxyapatite", 《NEW BIOTECHNOLOGY》 * |
LAURA TARDITI等: "Selective high-performance liquid chromatographic purification of bispecific monoclonal antibodies", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY》 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109563124A (zh) * | 2016-06-17 | 2019-04-02 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 多特异性抗体的纯化 |
CN106800599A (zh) * | 2016-12-05 | 2017-06-06 | 中国人民解放军第二军医大学 | 抗人EGFR和Notch多特异性抗体、其制备方法及用途 |
CN111788222A (zh) * | 2018-02-27 | 2020-10-16 | 辉瑞大药厂 | 抗体纯化 |
CN109517043A (zh) * | 2018-11-23 | 2019-03-26 | 艾美汉信疫苗(大连)有限公司 | 一种原核表达重组轮状病毒抗原p2-vp8的纯化方法 |
CN109517043B (zh) * | 2018-11-23 | 2022-06-14 | 艾美诚信生物制药有限公司 | 一种原核表达重组轮状病毒抗原p2-vp8的纯化方法 |
CN114409798A (zh) * | 2019-02-14 | 2022-04-29 | 美勒斯公司 | 制备包含两种或更多种抗体的组合物 |
CN113281430A (zh) * | 2021-05-11 | 2021-08-20 | 苏州君盟生物医药科技有限公司 | 一种双特异性抗体的分离鉴定方法 |
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