CN109517043A - 一种原核表达重组轮状病毒抗原p2-vp8的纯化方法 - Google Patents

一种原核表达重组轮状病毒抗原p2-vp8的纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种原核表达重组轮状病毒抗原P2‑VP8的纯化方法，属于蛋白质纯化技术领域。本发明所述纯化方法包括菌体预处理的步骤、柱层析的步骤；其中，所述柱层析的步骤为：①先将预处理后的菌体采用强阴离子填料柱层析，获得洗脱峰；②再将步骤①所得洗脱峰采用羟基磷灰石填料柱层析，获得穿透峰。本发明所述纯化方法中羟基磷灰石填料柱层析对纯度的提升也很明显，传统的疏水层析后电泳可见明显杂带，纯度在90％，羟基磷灰石填料去除杂蛋白的能力较强，电泳条带单一，无其他杂带，纯度可到99％。

Description

一种原核表达重组轮状病毒抗原P2-VP8的纯化方法
技术领域
本发明涉及一种原核表达重组轮状病毒抗原P2-VP8的纯化方法，属于蛋白质纯化技术领域。
背景技术
轮状病毒是引起5岁以下儿童急性重症腹泻的主要原因，VP8是轮状病毒表面棘突蛋白最前端的一部分，具有良好的免疫原性，能够刺激机体产生抗体，有效的中和轮状病毒，具有很高的研究价值。近几年对于VP8蛋白纯化方法的研究不尽相同，有的是通过融合His标签后进行亲和层析，纯化方法相对简单，但是后期标签的去除及检测比较复杂；有的是通过阴离子交换柱和疏水柱进行逐级纯化，但是该方法中上样条件及流动相的选择较为苛刻，尤其是疏水柱。
发明内容
本发明经初纯、QFF层析、CHT I型层析纯化原核表达重组轮状病毒抗原P2-VP8，解决了现有原核表达重组轮状病毒抗原P2-VP8纯化方法工艺复杂、纯度低的问题。
本发明提供了一种原核表达重组轮状病毒抗原P2-VP8的纯化方法，所述纯化方法包括菌体预处理的步骤、柱层析的步骤；其中，所述柱层析的步骤为：①先将预处理后的菌体采用强阴离子填料柱层析，获得洗脱峰；②再将步骤①所得洗脱峰采用羟基磷灰石填料柱层析，获得穿透峰。
本发明优选为所述羟基磷灰石填料柱层析的条件为：将步骤①所得洗脱峰的pH值调节至7.0，上样量为400mg蛋白质/100mL填料，采用20mM Tris-HCl+0.1M NaCl，pH7.0，冲洗，线性流速为100cm/h。
本发明优选为所述羟基磷灰石填料柱的预处理方法为：先用0.5M NaOH清洗，再用纯化水间隔后，然后用300mM PBS，pH7.0缓冲液再生，最后用20mM Tris-HCl+0.1M NaCl，pH7.0，平衡。
本发明优选为所述强阴离子填料柱层析的条件为：上样量为500mg蛋白质/100mL填料，采用20mM Tris-HCl+0.1M NaCl，pH7.5，洗脱，线性流速为100cm/h。
本发明优选为所述柱层析步骤中强阴离子填料柱的预处理方法为：先用0.5MNaOH清洗，再用20mM Tris-HCl，pH7.5，平衡。
本发明优选为所述菌体预处理的步骤包括发酵获得菌体、重悬和破碎、超滤；其中，所述超滤为：将重悬和破碎后获得的胞浆上清通过100K中空纤维柱澄清。
本发明优选为所述发酵获得菌体为：利用大肠杆菌Rosetta(DE3)发酵诱导表达获得P2-VP8的发酵液，离心，获得菌体。
本发明优选为所述重悬和破碎为：先用20mM Tris-HCl，pH7.5平衡液重悬菌体，再利用高压匀浆器在50Hz，800-900psi下破碎菌体，12000r/min离心，获得胞浆上清液。
本发明有益效果为：
①本发明所述纯化方法中破碎液在初纯阶段，离心后进行100K中空纤维柱澄清，有效的去除了大量的杂蛋白，为纯化提升了很高的效果；
②本发明所述纯化方法中既有收集洗脱峰的方法，也有收集穿透峰的方法，并且首次采用羟基磷灰石填料纯化重组轮状病毒抗原，能够有效的确保目的蛋白在纯化过程中不被大量的稀释；
③传统的疏水层析方法回收率较低，而本发明所述纯化方法采用羟基磷灰石填料柱层析的回收率高达90％，大幅度提高了收率；
④本发明所述纯化方法中羟基磷灰石填料柱层析对纯度的提升也很明显，传统的疏水层析后电泳可见明显杂带，纯度在90％，羟基磷灰石填料去除杂蛋白的能力较强，电泳条带单一，无其他杂带，纯度可到99％。
附图说明
本发明附图5幅，
图1为实施例1所述菌体预处理步骤的电泳图；
其中，1、超滤前的产品，2、蛋白标准品，3、超滤后的产品。
图2为对比例1所述弱阴离子填料柱层析方法的电泳图；
其中，1、上样前的产品，2、弱阴离子填料柱层析的穿透峰，3、弱阴离子填料柱层析的洗脱峰。
图3为实施例1所述柱层析步骤的电泳图；
其中，1、蛋白标准品，2、强阴离子填料柱层析的洗脱峰，3、羟基磷灰石填料柱层析的穿透峰。
图4为对比例2所述传统疏水柱(HIC柱)层析方法的电泳图；
其中，1、蛋白标准品，2、强阴离子填料柱层析的洗脱峰，3、传统疏水柱(HIC柱)层析的穿透峰，4、传统疏水柱(HIC柱)层析的洗脱峰。
图5为实施例1所述纯化方法制备的产品的HPLC图。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
一种原核表达重组轮状病毒抗原P2-VP8的纯化方法，所述纯化方法包括菌体预处理的步骤、柱层析的步骤；
所述菌体预处理的步骤为：
发酵获得菌体
利用大肠杆菌Rosetta(DE3)发酵诱导表达获得P2-VP8的发酵液，离心，获得菌体；
重悬和破碎
先用20mM Tris-HCl，pH7.5平衡液重悬菌体，再利用高压匀浆器在50Hz，800psi下破碎菌体，12000r/min离心，获得胞浆上清液；
超滤
先用0.5M NaOH清洗100K中空纤维柱，再用20mM Tris-HCl，pH7.5平衡，将胞浆上清通过100K中空纤维柱澄清；
所述柱层析的步骤为：
先用0.5M NaOH清洗强阴离子填料柱，再用20mM Tris-HCl，pH7.5，平衡，将预处理后的菌体采用强阴离子填料柱层析，上样量为500mg蛋白质/100mL填料，采用20mM Tris-HCl+0.1M NaCl，pH7.5，洗脱，线性流速为100cm/h，获得洗脱峰；
先用0.5M NaOH清洗羟基磷灰石填料柱，再用纯化水间隔后，然后用300mM PBS，pH7.0缓冲液再生，最后用20mM Tris-HCl+0.1M NaCl，pH7.0，平衡，将上述洗脱峰pH值调节至7.0后采用羟基磷灰石填料柱层析，上样量为400mg蛋白质/100mL填料，采用20mM Tris-HCl+0.1M NaCl，pH7.0，冲洗，线性流速为100cm/h，获得穿透峰。
对比例1
一种弱阴离子填料柱层析方法：
先用0.5M NaOH清洗弱阴离子填料柱，再用20mM Tris-HCl，pH7.5，平衡；
将实施例1制备的预处理后菌体采用弱阴离子填料柱层析，上样量为500mg蛋白质/100mL填料，先采用20mM Tris-HCl，pH7.5，洗脱，线性流速为100cm/h，获得穿透峰，再采用20mM Tris-HCl+0.1M NaCl，pH7.5，洗脱，线性流速为100cm/h，获得洗脱峰。
对比例2
一种传统的疏水柱(HIC柱)层析方法：
先用0.5M NaOH清洗传统的疏水柱(HIC柱)，再用20mM Tris-HCl+1.0M(NH4)2SO4，pH7.0平衡；
将实施例1得到的洗脱峰等体积加入到20mM Tris-HCl+2.0M(NH4)2SO4，pH7.0中，调节pH至7.0，采用传统的疏水柱(HIC柱)层析，上样量为400mg蛋白质/100mL填料，先采用20mM Tris-HCl+1.0M(NH4)2SO4，pH7.0，洗脱，线性流速为100cm/h，获得穿透峰，再采用20mMTris-HCl+0.5M(NH4)2SO4，pH7.0，洗脱，线性流速为100cm/h，获得洗脱峰。

Claims (8)

1.一种原核表达重组轮状病毒抗原P2-VP8的纯化方法，其特征在于：所述纯化方法包括菌体预处理的步骤、柱层析的步骤；
其中，所述柱层析的步骤为：
①先将预处理后的菌体采用强阴离子填料柱层析，获得洗脱峰；
②再将步骤①所得洗脱峰采用羟基磷灰石填料柱层析，获得穿透峰。
2.根据权利要求1所述原核表达重组轮状病毒抗原P2-VP8的纯化方法，其特征在于：所述羟基磷灰石填料柱层析的条件为：将步骤①所得洗脱峰的pH值调节至7.0，上样量为400mg蛋白质/100mL填料，采用20mM Tris-HCl+0.1M NaCl，pH7.0，冲洗，线性流速为100cm/h。
3.根据权利要求2所述原核表达重组轮状病毒抗原P2-VP8的纯化方法，其特征在于：所述羟基磷灰石填料柱的预处理方法为：先用0.5M NaOH清洗，再用纯化水间隔后，然后用300mM PBS，pH7.0缓冲液再生，最后用20mM Tris-HCl+0.1M NaCl，pH7.0，平衡。
4.根据权利要求3所述原核表达重组轮状病毒抗原P2-VP8的纯化方法，其特征在于：所述强阴离子填料柱层析的条件为：上样量为500mg蛋白质/100mL填料，采用20mM Tris-HCl+0.1M NaCl，pH7.5，洗脱，线性流速为100cm/h。
5.根据权利要求4所述原核表达重组轮状病毒抗原P2-VP8的纯化方法，其特征在于：所述柱层析步骤中强阴离子填料柱的预处理方法为：先用0.5M NaOH清洗，再用20mM Tris-HCl，pH7.5，平衡。
6.根据权利要求5所述原核表达重组轮状病毒抗原P2-VP8的纯化方法，其特征在于：所述菌体预处理的步骤包括发酵获得菌体、重悬和破碎、超滤；
其中，所述超滤为：将重悬和破碎后获得的胞浆上清通过100K中空纤维柱澄清。
7.根据权利要求6所述原核表达重组轮状病毒抗原P2-VP8的纯化方法，其特征在于：所述发酵获得菌体为：利用大肠杆菌Rosetta(DE3)发酵诱导表达获得P2-VP8的发酵液，离心，获得菌体。
8.根据权利要求7所述原核表达重组轮状病毒抗原P2-VP8的纯化方法，其特征在于：所述重悬和破碎为：先用20mM Tris-HCl，pH7.5平衡液重悬菌体，再利用高压匀浆器在50Hz，800-900psi下破碎菌体，12000r/min离心，获得胞浆上清液。
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