CN107459572B - 一种浓缩发酵液中水蛭素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种浓缩发酵液中水蛭素的方法，属于生物医药技术领域。所述方法包括在水蛭素发酵液中加入反相色谱填料进行吸附，洗脱吸附沉淀，收集流出液，即为水蛭素浓缩液；所述反相色谱填料由硅胶基质表面健合疏水基团形成。整个吸附洗脱过程操作简单，浓缩的同时还具有纯化作用，水蛭素蛋白回收率可达70％以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种浓缩发酵液中水蛭素的方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
1884年，人们在医用水蛭(hirudo meduimalis)中发现有很强的抗凝物质，命名为水蛭素(hirudin Hir)。到1950年以后，从医用水蛭唾液腺中分离得到具有生物活性的水蛭素。七十年代初确定，水蛭素是凝血酶的特异性抑制剂。八十年代，确定了水蛭素的氨基酸序列，并对其构数关系及其生物学作用机理进行了一系列研究，水蛭素是一个由多种异构体所组成的家族，常见有三种分别为HV-1、HV-2和HV-3，异构体间有高度的同源性，都是由65个氨基酸所组成的单链多肽，分子量约为7000Da，氨基酸组成分析表明，水蛭素分子中不含精氨酸和色氨酸，而富含谷氨酸、天门冬氨酸以及谷氨酰胺和天门冬酰胺，比活性约为10000IU/mg蛋白。
由于水蛭素具有重要的医药价值，而天然水蛭素来源限制，故国内外医药界均着重研究通过基因工程获得重组水蛭素。基于已知的水蛭素氨基酸序列，在体外合成相应序列DNA片段，插入重组表达载体，在大肠杆菌和酵母细胞中表达。毕赤酵母(pichiapastoris)表达系统是具有分泌优势的高表达真核系统。其分泌表达量高，酵母工程菌稳定性好，高密度发酵条件下，能大大提高产物的表达水平等。
重组水蛭素的成功构建表达后，需要对酵母发酵中的水蛭素进行浓缩，浓缩的同时也要去除发酵液中培养基的成份、菌体残留部分，利于下步纯化。传统浓缩水蛭素多采用陶瓷膜、纤维素膜等超滤膜浓缩的方法，此种浓缩技术具有以下难点:1、超滤浓缩后水蛭素活性蛋白回收率在40％左右，蛋白回收率较低；2、因发酵过程中会产生蛋白降解酶，而该降解酶会水解水蛭素活性，因此超滤浓缩时间过长，不利于水蛭素活性的稳定，且超滤膜的消耗较大，浓缩成本高。
“反相色谱”早在20世纪40年代初就有人提出。但它真正被广泛应用，却是在微粒型多孔硅胶键合相出现之后。特别是硅胶基质键合C18、C8烷基以及苯基填料的出现，使该技术得到发展，被极其广泛的用于各个领域。这类填料的特点是颗粒刚性好，并有良好的选择性，pH值适应性在2-8之间。本发明将反相色谱填料应用于发酵液中水蛭素的浓缩，解决传统浓缩手段带来的问题。
发明内容
本发明的目的是针对目前浓缩技术出现的问题，提供一种使用反相色谱游离吸附浓缩发酵液中水蛭素的方法，快速浓缩的同时提高水蛭素蛋白回收率。
为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种浓缩发酵液中水蛭素的方法，所述方法包括在水蛭素发酵液中加入反相色谱填料进行吸附，洗脱吸附沉淀，收集流出液，即为水蛭素浓缩液；所述反相色谱填料由硅胶基质表面健合疏水基团形成。
反相色谱填料其表面键合疏水基团，具有弱疏水特性，而水蛭素蛋白表面存在一些疏水区域，蛋白质分子中的疏水区域可以与填料表面产生疏水性相互作用，这种疏水作用可以通过利用盐浓度来调节，使水蛭素蛋白吸附在反相色谱填料表面，然后通过增加洗脱液中有机溶剂(如乙腈、乙醇)的浓度来实现水蛭素蛋白洗脱。这种吸附洗脱过程即完成了发酵液中水蛭素的浓缩。
作为优选，所述疏水基团为C8烷基。反相色谱填料疏水表面烷基链长度对蛋白质的反相保留和蛋白质的活性回收有很大影响，烷基链越长，固定相疏水性越强，为使蛋白质洗脱，流动相有机溶剂的含量较高，因此疏水性过强，会导致蛋白质分子不可逆吸附和生物活性损失，因此选用C8烷基作为键合相，实现了水蛭素蛋白完全吸附和活性的最大保留。
作为优选，所述反相色谱填料颗粒度为15-25μm，孔径为
选用合适颗粒度和孔径的疏水色谱填料，不仅在吸附过程能吸附更多的蛋白，在后续洗脱过程中，能够提高蛋白和色素的分离率。疏水色谱填料颗粒度太小，需较长时间才能自然沉降，太大，则吸附效果较差。水蛭素蛋白的分子量约为7000Da，选用填料孔径为
不会因为孔径太小蛋白分子被截留而难以洗脱，也不会因孔径太大，降低蛋白和色素的分离效果。
作为优选，所述反相色谱填料在使用前经过预处理，所述预处理包括在反相色谱填料中加入乙醇，超声振荡后，抽滤除去乙醇，抽滤沉淀物依次经蒸馏水、pH 2.8-3.2的蒸馏水淋洗，抽干保存备用。反相色谱填料只有经过预处理，才能有效吸附蛋白质。
所述的乙醇浓度为92-96％，使用的乙醇质量最好为反相色谱填料的3倍以上，使反相色谱填料完全被乙醇浸润。
作为优选，所述吸附过程包括：按15-20mg水蛭素蛋白/g反相色谱填料的量取反相色谱填料，置水蛭素发酵液中，搅拌静置，待反相色谱填料完全沉降，取沉淀待用。水蛭素发酵液在临用前调pH至2.8-3.2。
我们的实验表明，反相色谱填料的量按20mg水蛭素蛋白/g反相色谱填料量取，在静置10-20分钟后，上清液基本显示无活性，表明蛋白吸附完全，也可以量取更多量的反相色谱填料，使水蛭素蛋白的吸附更完全和稳固。该吸附过程获得沉淀的方法非常简单，只需吸附液静置1-2h，待反相色谱填料完全沉降，利用虹吸法去除上清液，就可获得吸附沉淀。
作为优选，所述洗脱过程包括：将吸附沉淀用大于5倍沉淀体积的平衡液1淋洗，再用1-3倍沉淀体积的洗脱液洗脱，收集流出液，即为水蛭素浓缩液。
所述平衡液1为pH 2.8-3.2，100-300mmol/L氯化钠；所述洗脱液为pH 2.8-3.2的20-30％乙醇。具有一定离子强度的平衡液1，在对吸附沉淀淋洗过程中，加强水蛭素蛋白与反相色谱填料的疏水作用，同时将沉淀中极性较强的杂质淋洗出去；然后在洗脱液中加入乙醇以调剂洗脱液极性，将水蛭素蛋白洗脱出来。
作为优选，所述方法还包括洗脱后反相色谱填料再生，再生步骤包括：经洗脱后的沉淀，依次用75％-90％的乙醇和平衡液2淋洗，抽干即得再生反相色谱填料。经过再生处理，实现反相色谱填料的循环利用。所述平衡液2为pH 2.8-3.2的蒸馏水。
本发明与现有技术相比，有益效果是：
1、整个吸附洗脱过程操作简单。且水蛭素发酵液中的培养基成分、蛋白降解酶、有机溶剂、菌体蛋白残留部分等不会被反相色谱填料吸附，而是留在上清液中被分离出去，具有一定的纯化作用。
2、浓缩发酵液不受体积的限制，相同的分泌量表达，如体积增大只需增加反相色谱填料的重量即可，适合大规模发酵液分离使用，且浓缩时间短，都可在5小时左右完成浓缩操作。
3、反相色谱填料可反复使用几百次不需更换，高于超滤浓缩过程中膜的使用寿命，降低成本。
4、本发明的水蛭素蛋白回收率高于传统超滤浓缩法蛋白回收率，水蛭素蛋白回收率可达70％以上。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述说明。如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
实施例1
100L罐高密度发酵，离心得水蛭素发酵液体积35L，分泌水蛭素表达量:1.2mg/ml，蛋白活性:16800IU/ml。
对反相色谱填料进行预处理：取反相色谱填料2500g，颗粒度20μm，孔径
置15000m1容器中，加95％乙醇7500ml摇匀，置超声波清洗器中振荡15min，加入布氏漏斗中抽滤除去乙醇，依次用10000ml蒸馏水、10000ml pH 2.8蒸馏水淋洗抽干4℃保存备用。
取2100g预处理过的反相色谱填料(干重)，置离心过的水蛭素发酵液中，磁力搅拌20min。静置1.5小时，反相色谱填料完全沉降，虹吸去除上清液，沉淀待用。
将吸附沉淀置布氏漏斗中抽滤，先用12L pH 2.8 100mmol/L氯化钠平衡液1淋洗，再用4200m1pH 2.8 25％乙醇洗脱，收集流出液，即为水蛭素浓缩液。
将上述洗脱过后的吸附沉淀用10L pH 2.8 78％乙醇淋洗，然后用20L pH 2.8蒸馏水淋洗，抽干即得再生反相色谱填料。
收集的水蛭素蛋白活性部分蛋白浓度为7.05mg/ml，活性：9.86万IU/ml，水蛭素蛋白质回收率为70.5％，体积浓缩倍数为8.3倍。
实施例2
100L罐高密度发酵，离心得水蛭素发酵液体积38L，分泌水蛭素表达量：1.18mg/ml，活性：16100IU/ml。
对反相色谱填料进行预处理：取反相色谱填料2500g，颗粒度20μm，孔径
置15000m1容器中，加93％乙醇7500ml摇匀，置超声波清洗器中振荡20min，加入布氏漏斗中抽滤除去乙醇，依次用10000ml蒸馏水、10000ml pH 3.2蒸馏水淋洗抽干5℃保存备用。
取2300g预处理过的反相色谱填料(干重)，置离心过的水蛭素发酵液中，磁力搅拌15min。静置2小时，反相色谱填料完全沉降，虹吸去除上清液，沉淀待用。
将吸附沉淀置布氏漏斗中抽滤，先用13L pH 3.2 250mmol/L氯化钠平衡液1淋洗，再用4400m1pH 3.2 28％乙醇洗脱，收集流出液，即为水蛭素浓缩液。
将上述洗脱过后的吸附沉淀用12L pH 3.2 85％乙醇淋洗，然后用25L pH 3.2蒸馏水淋洗，抽干即得再生反相色谱填料。
收集的水蛭素蛋白活性部分蛋白浓度为7.24mg/ml，活性：9.85万IU/ml，水蛭素蛋白质回收率为71.0％，体积浓缩倍数为8.6倍。
实施例3
100L罐高密度发酵，离心得水蛭素发酵液体积40L，分泌水蛭素表达量:1.08mg/ml，蛋白活性:15800IU/ml。
对反相色谱填料进行预处理：取反相色谱填料2500g，颗粒度20μm，孔径
置15000m1容器中，加96％乙醇7500ml摇匀，置超声波清洗器中振荡20min，加入布氏漏斗中抽滤除去乙醇，依次用10000ml蒸馏水、10000ml pH 3.0蒸馏水淋洗抽干6℃保存备用。
取2400g预处理过的反相色谱填料(干重)，置离心过的水蛭素发酵液中，磁力搅拌20min。静置2小时，反相色谱填料完全沉降，虹吸去除上清液，沉淀待用。
将吸附沉淀置布氏漏斗中抽滤，先用15L pH 3.0 150mmol/L氯化钠平衡液1淋洗，再用4700m1pH 3.0 20％乙醇洗脱，收集流出液，即为水蛭素浓缩液。
将上述洗脱过后的吸附沉淀用12L pH 3.0 80％乙醇淋洗，然后用25L pH 3.0蒸馏水淋洗，抽干即得再生反相色谱填料。
收集的水蛭素蛋白活性部分蛋白浓度为6.70mg/ml，活性：9.79万IU/ml，水蛭素蛋白质回收率为72.9％，体积浓缩倍数为8.5倍。
对比例1
对比例1与实施例3的区别为反相色谱填料由硅胶基质以及表面键合C18烷基形成，其它与实施例3一样，在此不赘述。
收集的水蛭素蛋白活性部分蛋白浓度为4.72mg/ml，活性：万6.89IU/ml，水蛭素蛋白质回收率为51.4％，体积浓缩倍数为8.5倍。
对比例2
对比例2与实施例3的区别为反相色谱填料由硅胶基质以及表面键合苯甲基形成，其它与实施例3一样，在此不赘述。
收集的水蛭素蛋白活性部分蛋白浓度为4.89mg/ml，活性：7.14万IU/ml，水蛭素蛋白质回收率为53.2％，体积浓缩倍数为8.5倍。
对比例3
对比例3与实施例3的区别为反相色谱填料没有进行预处理，其它与实施例3一样，在此不赘述。
收集的水蛭素蛋白活性部分蛋白浓度为2.33mg/ml，活性：万3.39IU/ml，水蛭素蛋白质回收率为25.3％，体积浓缩倍数为8.5倍。
对比例4
对比例4与实施例3的区别为水蛭素发酵液在临用没有调pH，其它与实施例3一样，在此不赘述。
收集的水蛭素蛋白活性部分蛋白浓度为4.58mg/ml，活性：6.68万IU/ml，水蛭素蛋白质回收率为49.8％，体积浓缩倍数为8.5倍。
对比例5
对比例5与实施例3的区别为，在洗脱过程中，对比例1使用15L pH 3.5 500mmol/L氯化钠作为平衡液1淋洗吸附沉淀，再用5000m1pH 3.5 35％乙醇洗脱。
收集的水蛭素蛋白活性部分蛋白浓度为4.70mg/ml，活性：6.86万IU/ml，水蛭素蛋白质回收率为51.1％，体积浓缩倍数为8.5倍。
另外，本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
Claims (6)
1.一种浓缩发酵液中水蛭素的方法，其特征在于，所述方法包括在水蛭素发酵液中加入反相色谱填料进行吸附，洗脱吸附沉淀，收集流出液，即为水蛭素浓缩液；所述反相色谱填料由硅胶基质以及表面键合疏水基团形成；
所述反相色谱填料在使用前经过预处理，所述预处理包括在反相色谱填料中加入乙醇，超声振荡后，抽滤除去乙醇，抽滤沉淀物依次经蒸馏水、pH 2.8-3.2的蒸馏水淋洗，抽干保存备用；
所述洗脱过程包括：将吸附沉淀用大于5倍沉淀体积的平衡液1淋洗，再用1-3倍沉淀体积的洗脱液洗脱，收集流出液，即为水蛭素浓缩液；
所述平衡液1为pH 2.8-3.2，100-300mmol/L氯化钠；所述洗脱液为pH 2.8-3.2的20-30％乙醇。
2.根据权利要求1所述的一种浓缩发酵液中水蛭素的方法，其特征在于，所述疏水基团为C8烷基。
3.根据权利要求1所述的一种浓缩发酵液中水蛭素的方法，其特征在于，所述反相色谱填料颗粒度为15-25μm，孔径为200-400Å。
4.根据权利要求1所述的一种浓缩发酵液中水蛭素的方法，其特征在于，所述吸附过程包括：按15-20mg水蛭素蛋白/g反相色谱填料的量取反相色谱填料，置水蛭素发酵液中，搅拌静置，待反相色谱填料完全沉降，取沉淀待用。
5.根据权利要求1所述的一种浓缩发酵液中水蛭素的方法，其特征在于，所述方法在洗脱后还包括反相色谱填料再生，再生步骤包括：经洗脱后的沉淀，依次用75％-90％的乙醇和平衡液2淋洗，抽干即得再生反相色谱填料。
6.根据权利要求5所述的一种浓缩发酵液中水蛭素的方法，其特征在于，所述平衡液2为pH 2.8-3.2的蒸馏水。
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