JP2756279B2 - ヒルジンの単離および精製法 - Google Patents
ヒルジンの単離および精製法Info
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- JP2756279B2 JP2756279B2 JP63284093A JP28409388A JP2756279B2 JP 2756279 B2 JP2756279 B2 JP 2756279B2 JP 63284093 A JP63284093 A JP 63284093A JP 28409388 A JP28409388 A JP 28409388A JP 2756279 B2 JP2756279 B2 JP 2756279B2
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- Japan
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- hirudin
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- acetic acid
- salt
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は複合体培養液および塩含有溶液からのヒル
ジンの単離および精製の方法に関する。
ジンの単離および精製の方法に関する。
ヒルである薬用ヒルから最初に単離されたポリペプチ
ドヒルジンは、広い治療可能性を有する非常に特異的な
トロンビン阻害剤である（F.Markwardt氏著「Biomed.Bi
ochim.Acta」44（1985）1007〜1013参照）。しかしなが
ら、必要量は形質転換された微生物による遺伝子操作に
よってのみ製造されうる。この遺伝子操作から、正しく
折りたたまれかつ十分に活性なヒルジンを製造するため
の宿主微生物としては酵母菌のサツカロミセスセレビシ
エ（Saccharomycescerevisiae）が適当であるというこ
とが分かった（ヨーロツパ特許A1第168342号および同特
許A1第200655号の各明細書参照）。この蛋白質の分泌に
よって培養液１当たりヒルジンが数百ミリグラムま
での濃度で得られる。しかしながら、該蛋白質の高収量
はその酵母発酵に用いる栄養培地が酵母エキス、コーン
ステイープ、ペプトンまたはミートペーストの加えられ
た複合体である場合のみに得られるので、該蛋白質の精
製において生ずる問題点は同時に生ずる蛋白質様物質の
混合物中における高希釈物からヒルジンを単離すること
にある。ヒル抽出物からのヒルジンの単離について記載
されているように（P.Walsmann氏等著「Thromb.Res.」4
0（1985）563〜570参照）、イオン交換クロマトグラフ
イーは使用する栄養溶液の塩含有量が高いために第１段
階として不適当である。蛋白質溶液から塩を除去しそし
て該溶液を濃縮するのに普通用いられている限外過の
方法もまた相当に不利である。すなわち高価な装置を取
り付ける必要があり、長期にわたる操作のために大量生
産は限定されそして同時に生ずる付随物の蓄積のために
栄養培地の各成分は沈殿し易くなって技術上の困難をも
たらす。
ドヒルジンは、広い治療可能性を有する非常に特異的な
トロンビン阻害剤である（F.Markwardt氏著「Biomed.Bi
ochim.Acta」44（1985）1007〜1013参照）。しかしなが
ら、必要量は形質転換された微生物による遺伝子操作に
よってのみ製造されうる。この遺伝子操作から、正しく
折りたたまれかつ十分に活性なヒルジンを製造するため
の宿主微生物としては酵母菌のサツカロミセスセレビシ
エ（Saccharomycescerevisiae）が適当であるというこ
とが分かった（ヨーロツパ特許A1第168342号および同特
許A1第200655号の各明細書参照）。この蛋白質の分泌に
よって培養液１当たりヒルジンが数百ミリグラムま
での濃度で得られる。しかしながら、該蛋白質の高収量
はその酵母発酵に用いる栄養培地が酵母エキス、コーン
ステイープ、ペプトンまたはミートペーストの加えられ
た複合体である場合のみに得られるので、該蛋白質の精
製において生ずる問題点は同時に生ずる蛋白質様物質の
混合物中における高希釈物からヒルジンを単離すること
にある。ヒル抽出物からのヒルジンの単離について記載
されているように（P.Walsmann氏等著「Thromb.Res.」4
0（1985）563〜570参照）、イオン交換クロマトグラフ
イーは使用する栄養溶液の塩含有量が高いために第１段
階として不適当である。蛋白質溶液から塩を除去しそし
て該溶液を濃縮するのに普通用いられている限外過の
方法もまた相当に不利である。すなわち高価な装置を取
り付ける必要があり、長期にわたる操作のために大量生
産は限定されそして同時に生ずる付随物の蓄積のために
栄養培地の各成分は沈殿し易くなって技術上の困難をも
たらす。
ヨーロツパ特許A2第049847号明細書には、吸着樹脂を
用いることによってストレプトミセステンデ（Streptom
yces tendae）の培養液からα−アミラーゼ阻害剤を
精製する方法が開示されている。ヨーロッパ特許A2第19
7764号明細書には、10〜30％のアセトンまたはアセトニ
トリルを含有する水性溶離剤を用いて、アンバーライト
（ Amberlite）XAD樹脂によりプロインシユリンを精製
する方法が記載されている。
用いることによってストレプトミセステンデ（Streptom
yces tendae）の培養液からα−アミラーゼ阻害剤を
精製する方法が開示されている。ヨーロッパ特許A2第19
7764号明細書には、10〜30％のアセトンまたはアセトニ
トリルを含有する水性溶離剤を用いて、アンバーライト
（ Amberlite）XAD樹脂によりプロインシユリンを精製
する方法が記載されている。
本発明の複合体の酵母培養液から直接的手法および
良好な収率でヒルジンを単離することができる方法の開
発を目的とする。
良好な収率でヒルジンを単離することができる方法の開
発を目的とする。
この目的は疎水クロマトグラフイーによって複合体お
よび塩含有溶液からヒルジンを単離しそして精製する方
法による本発明に従って達成される。該方法は溶離剤と
して水と混和しうる１種以上の有機溶媒の10〜40％濃度
溶液を用いて、細孔直径が50〜5000Åでありそして比表
面積が少なくとも50m2/gである多孔質の吸着樹脂上で疎
水クロマトグラフイーを行うことからなる。
よび塩含有溶液からヒルジンを単離しそして精製する方
法による本発明に従って達成される。該方法は溶離剤と
して水と混和しうる１種以上の有機溶媒の10〜40％濃度
溶液を用いて、細孔直径が50〜5000Åでありそして比表
面積が少なくとも50m2/gである多孔質の吸着樹脂上で疎
水クロマトグラフイーを行うことからなる。
使用するのに好ましい多孔質の吸着樹脂はスチレンと
ジビニルベンゼンとの共重合体例えばジアイオン（ Di
aion）HP10、20、30、40もしくは50、またはアクリレー
トエステルとジビニルベンゼンとの共重合体例えばアン
バーライト（ Amberlite）XAD−７および８（Rohm and
Haas社製）、特に ジアイオンHP20および アンバー
ライトXAD−７である。水と混和しうる適当な有機溶媒
の例としてメタノール、エタノール、ｎ−プロパノー
ル、イソプロパノールおよびアセトンがある。水と混和
しうる有機溶媒１種の溶液を用いるのが好ましい。
ジビニルベンゼンとの共重合体例えばジアイオン（ Di
aion）HP10、20、30、40もしくは50、またはアクリレー
トエステルとジビニルベンゼンとの共重合体例えばアン
バーライト（ Amberlite）XAD−７および８（Rohm and
Haas社製）、特に ジアイオンHP20および アンバー
ライトXAD−７である。水と混和しうる適当な有機溶媒
の例としてメタノール、エタノール、ｎ−プロパノー
ル、イソプロパノールおよびアセトンがある。水と混和
しうる有機溶媒１種の溶液を用いるのが好ましい。
本発明方法はバツチクロマトグラフイーとカラムクロ
マトグラフイーの両形態で実施されうる。前記樹脂は緩
衝水溶液または有機酸例えば０〜0.2M酢酸の溶液であら
かじめ平衡化させておく。使用するヒルジン含有溶液特
にサツカロミセスセレビシエの培養液をpH2〜８好ま
しくは３〜５に調整しそして樹脂と接触させる。ヒルジ
ンが完全に結合した後に樹脂を緩衝水溶液（pH2〜９）
例えばトリスまたはエチレンジアミンおよび／または有
機酸例えば０〜0.2M酢酸の溶液で洗浄する。次いで水と
混和しうる有機溶媒の10〜40％強度溶液で溶離させる。
溶離剤の水性部分は緩衝水溶液、有機酸例えば酢酸の溶
液または水からなることができる。しかしながら、塩を
含まない溶離物を得るには20〜30％のイソプロパノール
を含有する０〜0.1M酢酸の溶液を用いるのが好ましい。
マトグラフイーの両形態で実施されうる。前記樹脂は緩
衝水溶液または有機酸例えば０〜0.2M酢酸の溶液であら
かじめ平衡化させておく。使用するヒルジン含有溶液特
にサツカロミセスセレビシエの培養液をpH2〜８好ま
しくは３〜５に調整しそして樹脂と接触させる。ヒルジ
ンが完全に結合した後に樹脂を緩衝水溶液（pH2〜９）
例えばトリスまたはエチレンジアミンおよび／または有
機酸例えば０〜0.2M酢酸の溶液で洗浄する。次いで水と
混和しうる有機溶媒の10〜40％強度溶液で溶離させる。
溶離剤の水性部分は緩衝水溶液、有機酸例えば酢酸の溶
液または水からなることができる。しかしながら、塩を
含まない溶離物を得るには20〜30％のイソプロパノール
を含有する０〜0.1M酢酸の溶液を用いるのが好ましい。
該方法は塩含有溶液例えばイオン交換体からの溶離物
から塩を含有しないヒルジンを得るのに類似方法として
適当である。
から塩を含有しないヒルジンを得るのに類似方法として
適当である。
本発明は組換えヒルジン類特にその形質発現がサツカ
ロミセスセレビシエにおいてもたらされたヒルジン類を
精製するのに使用される。ヒルジン類は、少なくとも1
0,000AT−U/mgの比活性を有し、薬用ヒル種から既知の
イソヒルジン類より誘導されそしてその本質的構造特徴
特に３個のジスルフイド橋の特徴的結合を有するペプチ
ド様トロンビン阻害剤であると理解されるべきである
（J.Dodt氏等著「Biol.Chem.」Hoppe−Seyler366（198
5）379−385、例えばヨーロツパ特許A1第158564号、同
特許A1第168342号、ドイツ特許A1第3445517号、ヨーロ
ツパ特許A2第193175号、同特許A1第200655号、同特許A1
第158986号、同特許A1第209061号、ドイツ特許第334213
9号およびヨーロツパ特許A1第171024号の各明細書参
照）。
ロミセスセレビシエにおいてもたらされたヒルジン類を
精製するのに使用される。ヒルジン類は、少なくとも1
0,000AT−U/mgの比活性を有し、薬用ヒル種から既知の
イソヒルジン類より誘導されそしてその本質的構造特徴
特に３個のジスルフイド橋の特徴的結合を有するペプチ
ド様トロンビン阻害剤であると理解されるべきである
（J.Dodt氏等著「Biol.Chem.」Hoppe−Seyler366（198
5）379−385、例えばヨーロツパ特許A1第158564号、同
特許A1第168342号、ドイツ特許A1第3445517号、ヨーロ
ツパ特許A2第193175号、同特許A1第200655号、同特許A1
第158986号、同特許A1第209061号、ドイツ特許第334213
9号およびヨーロツパ特許A1第171024号の各明細書参
照）。
それらは得にヨーロツパ特許A1第171024号、同特許A1
第158986号および同特許A1第209061号の各明細書に記載
のヒルジン類を包含することを理解すべきである。
第158986号および同特許A1第209061号の各明細書に記載
のヒルジン類を包含することを理解すべきである。
本発明方法は３次構造および活性を損わずに、複合体
および塩含有溶液例えば複合体の酵母培養液からヒル
ジンを定量的に吸着樹脂上に結合させることができる点
に特徴を有する。塩および濁りを生ずる物質を含まずし
かもさらに例えばイオン交換クロマトグラフイーによっ
て直接処理することができる溶液中に富化されたヒルジ
ンを得ることは、水と混和しうる有機溶媒を加えた水溶
液での溶離によって可能である。
および塩含有溶液例えば複合体の酵母培養液からヒル
ジンを定量的に吸着樹脂上に結合させることができる点
に特徴を有する。塩および濁りを生ずる物質を含まずし
かもさらに例えばイオン交換クロマトグラフイーによっ
て直接処理することができる溶液中に富化されたヒルジ
ンを得ることは、水と混和しうる有機溶媒を加えた水溶
液での溶離によって可能である。
以下に本発明を詳細に説明するために実施例を記載す
るが、それらは本発明を限定するものではない。
るが、それらは本発明を限定するものではない。
実施例１ マツト（Mat）α交配型に相当し、そしてBrake氏等著
「PNAS」第81巻（1984年）第4632〜4646頁に記載の方法
と類似の方法で酵母のヒルジン発現プラスミドを用いて
形質転換された種サツカロミセスセレビシエの酵母菌株
の発酵から培地を採取する。
「PNAS」第81巻（1984年）第4632〜4646頁に記載の方法
と類似の方法で酵母のヒルジン発現プラスミドを用いて
形質転換された種サツカロミセスセレビシエの酵母菌株
の発酵から培地を採取する。
酵母エキス20g/lおよびヒルジン12mg/lを含有するサ
ツカロミセスセレビシエの培養液950lを、20mM酢酸で
平衡化させた100lのジアイオン（ Diaion）HP20のカラ
ムに入れた。続いて1000lの50mMトリス/HCl（pH8.5）、
次に300lの20mM酢酸で洗浄した。次いで20％イソプロパ
ノールを含有する20mM酢酸300l続いて30％イソプロパノ
ールを含有する20mM酢酸500lで溶離させた。溶離物の各
フラクシヨンをそられのヒルジン含量について分析し
た。３個のフラクシヨン（150l）は一緒にしたところ、
84％の収率に相当する9.5gのヒルジンを含有していた。
次に酢酸溶液を1MピペラジンでpH6.0に調整し、20mMピ
ペラジン（pH6.0）で平衡化したマトレツクス（Matre
x）のセルフイン（ Cellufine）AM10kgとともに攪拌し
た。これよりイオン交換体上で定量的に結合したヒルジ
ンが得られた。この物質を20mMピペラジン（pH6.0）で
洗浄し次いでカラム中に詰めた。同一緩衝液中における
０〜0.3mM NaClの塩で勾配溶離させて、溶液6l中に非常
に富化されかつ濃縮された状態でヒルジン6.7gを得た。
ツカロミセスセレビシエの培養液950lを、20mM酢酸で
平衡化させた100lのジアイオン（ Diaion）HP20のカラ
ムに入れた。続いて1000lの50mMトリス/HCl（pH8.5）、
次に300lの20mM酢酸で洗浄した。次いで20％イソプロパ
ノールを含有する20mM酢酸300l続いて30％イソプロパノ
ールを含有する20mM酢酸500lで溶離させた。溶離物の各
フラクシヨンをそられのヒルジン含量について分析し
た。３個のフラクシヨン（150l）は一緒にしたところ、
84％の収率に相当する9.5gのヒルジンを含有していた。
次に酢酸溶液を1MピペラジンでpH6.0に調整し、20mMピ
ペラジン（pH6.0）で平衡化したマトレツクス（Matre
x）のセルフイン（ Cellufine）AM10kgとともに攪拌し
た。これよりイオン交換体上で定量的に結合したヒルジ
ンが得られた。この物質を20mMピペラジン（pH6.0）で
洗浄し次いでカラム中に詰めた。同一緩衝液中における
０〜0.3mM NaClの塩で勾配溶離させて、溶液6l中に非常
に富化されかつ濃縮された状態でヒルジン6.7gを得た。
実施例２ 2.0gのヒルジン、20mMのピペラジン（pH6.0）および2
00mMのNaClを含有するイオン交換体からの溶離物1.2lを
酸性化して0.1M酢酸にし次いで0.1M酢酸中における100m
lのダイアイオン（ Diaion）HP20のカラム上に毎時400
mlの流速で入れた。この試料を入れた後に、塩の除去さ
れた樹脂を10mM酢酸で洗浄した。次いで10mM酢酸中にお
ける30％イソプロパノールを用いて毎時200mlの流速で
溶離させた。ヒルジンを全容量20ml中に集めた。この溶
液を凍結乾燥して塩を含まないヒルジン1.7gを得た。
00mMのNaClを含有するイオン交換体からの溶離物1.2lを
酸性化して0.1M酢酸にし次いで0.1M酢酸中における100m
lのダイアイオン（ Diaion）HP20のカラム上に毎時400
mlの流速で入れた。この試料を入れた後に、塩の除去さ
れた樹脂を10mM酢酸で洗浄した。次いで10mM酢酸中にお
ける30％イソプロパノールを用いて毎時200mlの流速で
溶離させた。ヒルジンを全容量20ml中に集めた。この溶
液を凍結乾燥して塩を含まないヒルジン1.7gを得た。
実施例３ ヒルジン27.2gを含有するサツカロミセスセレビシエ
の培養液754lを酢酸4.9lでpH4に調整し、そして75lの
30％強度イソプロパノール中に懸濁した75kgのダイアイ
オン（ Diaion）HP20の懸濁液とともに攪拌した。30分
後培養液を圧力漏斗による過で取り出し、捨てた。
漏斗中に残留する吸着樹脂を700lの20mMトリス/HCl（pH
8.5）および250lの0.1M酢酸で洗浄した。次に毎回20mM
酢酸中における30％イソプロパノール50lを用いる10回
の連続洗浄によりヒルジンを溶離させた。溶離物をそれ
らのヒルジン含量について分析した。４個のフラクシヨ
ン（195l）は一緒にしたところ、83％の収率に相当する
22.6gのヒルジンを含有していた。
の培養液754lを酢酸4.9lでpH4に調整し、そして75lの
30％強度イソプロパノール中に懸濁した75kgのダイアイ
オン（ Diaion）HP20の懸濁液とともに攪拌した。30分
後培養液を圧力漏斗による過で取り出し、捨てた。
漏斗中に残留する吸着樹脂を700lの20mMトリス/HCl（pH
8.5）および250lの0.1M酢酸で洗浄した。次に毎回20mM
酢酸中における30％イソプロパノール50lを用いる10回
の連続洗浄によりヒルジンを溶離させた。溶離物をそれ
らのヒルジン含量について分析した。４個のフラクシヨ
ン（195l）は一緒にしたところ、83％の収率に相当する
22.6gのヒルジンを含有していた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 パウル・ハーバーマン ドイツ連邦共和国デー‐6239エプシユタ イン／タウヌス．ロセルトシユトラーセ 35 (72)発明者 ドミニク・トリピーア ドイツ連邦共和国デー‐6239エプシユタ イン／タウヌス．イム．キルシユガルテ ン16
Claims (3)
- 【請求項１】溶離剤として水と混和しうる１種以上の有
機溶媒の10〜40％濃度溶液を用いて、細孔直径が50〜50
00Åでありそして比表面積が少なくとも50m2/gである多
孔質の吸着樹脂上で疎水クロマトグラフイーを行うこと
からなる、該クロマトグラフイーによる複合体および塩
含有溶液からのヒルジンの単離および精製法。 - 【請求項２】多孔質の吸着樹脂としてスチレンとジビニ
ルベンゼンとの共重合体またはアクリレートエステルと
ジビニルベンゼンとの共重合体を用いる請求項１記載の
方法。 - 【請求項３】水と混和しうる有機溶媒としてメタノー
ル、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール
およびアセトンを用いる請求項１または２に記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3738541.0 | 1987-11-13 | ||
| DE19873738541 DE3738541A1 (de) | 1987-11-13 | 1987-11-13 | Verfahren zur isolierung und reinigung von hirudin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01165599A JPH01165599A (ja) | 1989-06-29 |
| JP2756279B2 true JP2756279B2 (ja) | 1998-05-25 |
Family
ID=6340409
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63284093A Expired - Lifetime JP2756279B2 (ja) | 1987-11-13 | 1988-11-11 | ヒルジンの単離および精製法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5095092A (ja) |
| EP (1) | EP0316650B1 (ja) |
| JP (1) | JP2756279B2 (ja) |
| AT (1) | ATE100109T1 (ja) |
| DE (2) | DE3738541A1 (ja) |
| DK (1) | DK173366B1 (ja) |
| ES (1) | ES2049238T3 (ja) |
| IE (1) | IE62538B1 (ja) |
| PT (1) | PT88975B (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5268296A (en) * | 1988-06-11 | 1993-12-07 | Ciba-Geigy Corporation | DNA vector and recombinant host cell for production of hirullin P6 and P18 |
| DE3835815A1 (de) * | 1988-10-21 | 1990-04-26 | Hoechst Ag | Neue isohirudine |
| DE4140381A1 (de) * | 1991-12-07 | 1993-06-09 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De | Neue synthetische isohirudine mit verbesserter stabilitaet |
| DE4404168A1 (de) * | 1994-02-10 | 1995-08-17 | Hoechst Ag | Hirudinderivate und Verfahren zu deren Herstellung |
| KR0141651B1 (ko) * | 1994-09-07 | 1998-06-15 | 강재헌 | 금속이온 친화성 크로마토그라피를 이용한 히루딘의 정제방법 |
| DE10108211A1 (de) * | 2001-02-20 | 2002-08-22 | Aventis Pharma Gmbh | Verwendung von Fusionsproteinen, deren N-terminaler Anteil aus einem Hirudinderivat besteht, zur Herstellung rekombinanter Proteine über Sekretion durch Hefen |
| US7638618B2 (en) | 2001-02-20 | 2009-12-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest |
| DE60231651D1 (de) * | 2001-12-21 | 2009-04-30 | Immunex Corp | Proteinreinigungsverfahren |
| US7795205B2 (en) | 2004-04-12 | 2010-09-14 | Canyon Pharmaceuticals, Inc. | Methods for effecting regression of tumor mass and size in a metastasized pancreatic tumor |
| WO2006011161A2 (en) * | 2004-06-29 | 2006-02-02 | Reliance Life Sciences Pvt Ltd | Process for the preparation of virus-safe biological fluids |
| US10617975B2 (en) * | 2014-12-15 | 2020-04-14 | Merck Patent Gmbh | Target molecule capture from crude solutions |
| CN107353338B (zh) * | 2017-07-27 | 2020-11-17 | 宁波博睿修存生物科技有限公司 | 一种分离水蛭素发酵液中色素分子的方法 |
| CN113984936A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-01-28 | 车延柠 | 一种水蛭酶解多肽的lc-ms特征图谱、检测方法及其应用 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES8207217A1 (es) * | 1980-10-09 | 1982-09-01 | Hoechst Ag | Procedimiento para la preparacion de un inactivador de alfa-amilasa |
| DE3342139A1 (de) * | 1983-11-22 | 1985-05-30 | Ciba-Geigy Ag, Basel | Desulfatohirudine, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel |
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| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
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