CN113984936A - 一种水蛭酶解多肽的lc-ms特征图谱、检测方法及其应用 - Google Patents

一种水蛭酶解多肽的lc-ms特征图谱、检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水蛭酶解多肽的LC‑MS特征图谱，包括52个多肽成分色谱峰。本发明还公开了一种水蛭酶解多肽的LC‑MS特征图谱的检测方法及其在水蛭药材及含水蛭制剂质量控制中的应用和在水蛭、蚂蟥鉴别中的应用。本发明通过水蛭酶解多肽成分的整体表征进行药材质量控制，具有较高的准确性和专属性；本发明建立表征水蛭酶解多肽成分的特征图谱，能够具有更好的专属性和药效相关性，能够保障水蛭药材的临床疗效，本发明通过与水蛭其它基原动物蚂蟥比较，本发明的特征图谱能够有效区别两种水蛭基原，从而有效解决水蛭药材的基原鉴别及真伪鉴别的问题，为水蛭药材的鉴别提供了准确评价方法。

Description

一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱、检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱、检测方法及其应用，属于中药质量控制技术领域。
背景技术
传统中药水蛭始载于《神农本草经》，2020年版《中国药典》规定水蛭为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman或柳叶蚂蟥Whitmaniaacranulata Whitman的干燥全体。唐代《新修本草》记载：“大者长尺，名马蛭，一名马蜞，并能咂牛、马、人血；今俗多取水中小者用之，大效，不必要须食人血满腹者”。宋代《本草图经》记载：“水蛭有长尺者，用之当以小者为佳。”本草古籍记载的优质水蛭药材与《中国药典》中规定的水蛭科动物水蛭Hirudo nipponica Whitman相一致（张卫,等.中药水蛭品种考证及资源可持续利用发展探讨[J].中国中药杂志,2013,38(6):914-918.）。本发明以此水蛭为对象，建立了一种水蛭药材的质量控制方法。
中药水蛭具有破血、逐瘀、通经的功效，用于治疗蓄血、症瘕积聚、妇女经闭、干血成痨、跌打损伤等。水蛭作为动物药，其含有的活性蛋白或多肽成分被认为是其主要有效成分，早在1955年就从水蛭唾液中分离得到一种由65个氨基酸残基组成的多肽-水蛭素（Hirudin），是迄今发现的最强的凝血酶抑制剂。然而，传统中药水蛭为其干燥体，至今未见从水蛭药材中发现水蛭素的报道，推断水蛭药材中另有其它未知的活性蛋白或多肽成分。传统中药水蛭为口服给药，口服后在胃肠道经消化酶酶解后被吸收进入体内，发挥其功能。已有研究报道，水蛭胃蛋白酶酶解物具有比水提物、醇提物及其它蛋白酶酶解物更优的纤溶作用（李濯冰，等。水蛭不同工艺提取物抗凝与纤溶活性比较及酶解物组成分析[J]。中成药，2011,33（1）：42-45.），因此，认为水蛭胃蛋白酶酶解物可能是水蛭口服给药后在体内发挥药理作用的真正有效成分。
由于水蛭药材抗凝血有效成分仍未明确，故《中国药典》采用抗凝血酶生物活性测定的方法对水蛭药材进行质量控制，然而这种方法不具有专属性。已有文献报道，通过测定次黄嘌呤、尿囊素、琥珀酸等小子化合物含量或指纹图谱的方法对水蛭药材及其制剂进行质量控制（徐佳，等。水蛭的高效液相指纹图谱研究。环球中医药，2013，6（8）：596-599。/徐长根，等。水蛭冻干粉针剂指纹图谱评价。第四军医大学学报，2009，30（22）：2667-2669./袁晓环，等。复方水蛭注射液HPLC指纹图谱研究。中国中药杂志，2008，33（15）：1852-1854./中国专利CN103558329B.），然而这些成分在动物药中普遍存在，也不具有专属性。中国专利CN103558329B测定次黄嘌呤及水蛭胺等蝶啶类成分，增强了其指纹图谱的专属性。这些水蛭指纹图谱分析方法为从物质基础角度评价水蛭药材及其制剂的质量提供了方法，然而均未涉及蛋白多肽类成分，使水蛭药材的质量控制大打折扣，难以保障水蛭的临床疗效。
鉴于以上不足，本发明针对水蛭蛋白多肽类成分，利用液质联用技术，对水蛭经胃蛋白酶酶解后的次生多肽成分进行了系统分析，筛选和表征水蛭酶解多肽成分，建立水蛭酶解多肽成分的特征图谱，为水蛭药材的质量控制提供新的评价方法。
发明内容
针对目前水蛭药材质量控制方法不能有效表征其多肽成分，难以保障水蛭药材的质量和基原，尤其是对于一些包含有水蛭药材的制剂，难以保证制剂中的水蛭药材的质量和基原，故本发明建立一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱，并应用于水蛭药材或水蛭制剂的质量控制。
同时，本发明提供一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱的检测方法，该法具有通过水蛭酶解多肽成分的整体表征进行药材质量控制，具有较高的准确性和专属性。
同时，本发明提供一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱的检测方法在水蛭药材质量控制中的应用。
同时，本发明提供一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱的检测方法在水蛭、蚂蟥鉴别中的应用，本发明通过与水蛭其它基原动物蚂蟥比较，本发明的特征图谱能够有效区别两种水蛭基原，从而有效解决水蛭药材的基原鉴别及真伪鉴别的问题，为水蛭药材/水蛭制剂的鉴别提供了准确评价方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱，包括52个多肽成分色谱峰，其特征离子信息如下：
峰号 特征离子质荷比（m/z） 离子模式 分子量（Da）
1 404.20 [M+2H]<sup>2+</sup> 806.39
2 406.70 [M+2H]<sup>2+</sup> 811.40
3 473.73 [M+2H]<sup>2+</sup> 945.47
4 278.18 [M+2H]<sup>2+</sup> 554.35
5 576.25 [M+2H]<sup>2+</sup> 1150.51
6 394.23 [M+2H]<sup>2+</sup> 786.45
7 466.25 [M+2H]<sup>2+</sup> 930.50
8 444.73 [M+2H]<sup>2+</sup> 887.46
9 515.28 [M+2H]<sup>2+</sup> 1028.55
10 665.38 [M+2H]<sup>2+</sup> 1328.76
11 510.76 [M+2H]<sup>2+</sup> 1019.52
12 416.25 [M+2H]<sup>2+</sup> 830.51
13 442.28 [M+2H]<sup>2+</sup> 882.56
14 336.22 [M+2H]<sup>2+</sup> 670.44
15 547.30 [M+2H]<sup>2+</sup> 1092.61
16 583.55 [M+4H]<sup>4+</sup> 2330.20
17 491.80 [M+2H]<sup>2+</sup> 981.59
18 458.26 [M+2H]<sup>2+</sup> 914.51
19 478.60 [M+3H]<sup>3+</sup> 1432.80
20 648.01 [M+3H]<sup>3+</sup> 1941.04
21 474.27 [M+2H]<sup>2+</sup> 946.54
22 530.63 [M+3H]<sup>3+</sup> 1588.89
23 573.82 [M+2H]<sup>2+</sup> 1145.64
24 460.60 [M+3H]<sup>3+</sup> 1378.79
25 585.82 [M+4H]<sup>4+</sup> 2339.20
26 560.54 [M+4H]<sup>4+</sup> 2238.15
27 622.84 [M+2H]<sup>2+</sup> 1243.67
28 509.75 [M+2H]<sup>2+</sup> 1017.51
29 458.03 [M+4H]<sup>4+</sup> 1828.11
30 773.86 [M+2H]<sup>2+</sup> 1545.71
31 633.81 [M+2H]<sup>2+</sup> 1265.62
32 549.82 [M+2H]<sup>2+</sup> 1097.64
33 569.32 [M+2H]<sup>2+</sup> 1136.63
34 696.83 [M+2H]<sup>2+</sup> 1391.66
35 778.41 [M+3H]<sup>3+</sup> 2332.23
36 665.35 [M+2H]<sup>2+</sup> 1328.71
37 936.48 [M+2H]<sup>2+</sup> 1870.95
38 506.26 [M+2H]<sup>2+</sup> 1010.52
39 664.90 [M+2H]<sup>2+</sup> 1327.80
40 501.25 [M+2H]<sup>2+</sup> 1000.50
41 449.26 [M+2H]<sup>2+</sup> 896.53
42 792.40 [M+2H]<sup>2+</sup> 1582.79
43 760.91 [M+2H]<sup>2+</sup> 1519.82
44 569.10 [M+5H]<sup>5+</sup> 2840.49
45 612.83 [M+2H]<sup>2+</sup> 1223.66
46 1001.19 [M+3H]<sup>3+</sup> 3000.58
47 608.82 [M+2H]<sup>2+</sup> 1215.65
48 1012.54 [M+3H]<sup>3+</sup> 3034.61
49 973.39 [M+3H]<sup>3+</sup> 2917.17
50 638.35 [M+2H]<sup>2+</sup> 1274.71
51 957.00 [M+2H]<sup>2+</sup> 1912.01
52 697.34 [M+2H]<sup>2+</sup> 1392.68
一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱的检测方法，包括以下步骤：取水蛭细粉或含水蛭制剂粉末适量，精密称定，加人工胃液，水蛭细粉与人工胃液的质量体积g/mL比为1：20，水蛭制剂粉末与人工胃液的质量体积g/mL比为1：（5~20），于37~40℃恒温水浴中振荡提取至少30min，加1~2%胃蛋白酶，摇匀，继续在30~50℃恒温水浴中振荡至少1h，立即置于80~90℃恒温水浴中振荡10~20min，然后以流水冷却至室温，离心，上清液加等体积甲醇，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液；
供试品溶液利用液相色谱法进行分离，检测上述特征图谱的液相色谱流动相为：以十八烷基键合硅胶为色谱柱固定相，流动相为乙腈-0.1%甲酸水；色谱条件为：乙腈A-0.1%甲酸水B，0-5min，1%-10% A；5-10min，10-30%A；10-15min，30-60%A；流速0.3~0.5mL/min；
供试品溶液经液相色谱分离后，利用质谱法进行检测，正离子电喷雾电离，靶向采集所述特征离子，获得水蛭药材酶解多肽的LC-MS特征图谱。
所述人工胃液的制备方法为：取浓盐酸9mL加蒸馏水稀释至1000mL，密闭，4℃冷藏备用。
所述水蛭为水蛭科动物水蛭Hirudo nipponica Whitman的干燥全体。
所述质谱条件为：离子源：（+）ESI；离子源毛细管电压：2.8KV；采样锥孔电压：40V；离子源温度：110℃；脱溶剂温度：400℃；锥孔气体流速：50 L/h；脱溶剂气体流速：800 L/h；采集质荷比范围：50Da-1200Da；数据采集分析软件：MassLynx 4.1。
所述水蛭细粉或含水蛭制剂粉末的目数均为50-200目。
一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱的检测方法在水蛭药材质量控制中的应用。
一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱的检测方法在水蛭、蚂蟥鉴别中的应用。
所述水蛭、蚂蟥包括药材粉或制剂。
所述蚂蟥为水蛭科动物蚂蝗Whitmania pigra Whitman的干燥全体。
本发明具有以下有益效果：
（1）由于水蛭药材有效成分仍未明确，现行《中国药典》采用薄层鉴别和抗凝血酶生物活性测定的方法对水蛭药材进行质量控制，准确性和专属性均较差。本发明通过水蛭酶解多肽成分的整体表征进行药材质量控制，具有较高的准确性和专属性。
（2）文献报道了通过测定次黄嘌呤等小分子化合物而对水蛭药材进行质量控制，与之相比，本发明建立表征水蛭酶解多肽成分的特征图谱，能够具有更好的专属性和药效相关性，能够保障水蛭药材的临床疗效。
（3）通过与水蛭其它基原动物蚂蟥比较，本发明的特征图谱能够有效区别两种水蛭基原，从而有效解决水蛭药材的基原鉴别及真伪鉴别的问题，为水蛭药材的鉴别提供了准确评价方法。
附图说明
图1是52个水蛭酶解多肽成分的特征离子质谱图；
图2是水蛭酶解多肽的UPLC-MS特征图谱；
图3是水蛭酶解多肽特征图谱分析方法的精密度考察图谱；
图4是水蛭酶解多肽特征图谱分析方法的重复性考察图谱；
图5是水蛭酶解多肽特征图谱分析方法的稳定性考察图谱，其中，自上到下依次为0h、2h、4h、8h、12h；
图6是10批水蛭药材酶解多肽成分的UPLC-MS特征图谱；
图7是8批蚂蝗药材酶解多肽成分的UPLC-MS特征图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱、检测方法及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面通过具体的实施例对本发明进行详细地说明。
实施例1：
1实验材料
1.1实验试剂
乙腈，质谱级，美国Fisher公司；甲酸，色谱级，中国科密欧化学试剂公司；甲醇，色谱级，美国Fisher公司；浓盐酸，分析级，中国科密欧化学试剂公司；胃蛋白酶，分析级，Solarbio Life Sciences公司。
水蛭，哈尔滨中药四厂有限公司提供，为水蛭科动物水蛭Hirudo nippocicaWhitman的干燥全体。蚂蝗，购自药材市场，为水蛭科动物蚂蝗Whitmania pigra Whitman的干燥全体。
1.2实验器材
超高效液相色谱仪（AcquityTM UPLC，Waters，美国）；质谱仪（SynaptTMG2-SiHDMS，Waters，美国）；电热恒温调速振荡器（SYC-A，上海新苗医疗器械制造有限公司，中国）；多管涡旋振荡器（VX-Ⅱ，北京踏锦科技公司，中国）；电子分析天平（BPI1510-N，梅特勒-托利多仪器有限公司，瑞士）；数控超声波清洗器（KQ-250DB，昆山市超声仪器有限公司，中国）。
2实验方法
2.1人工胃液制备：取浓盐酸9mL加蒸馏水稀释至1000mL，密闭，4℃冷藏备用。
2.2水蛭酶解多肽供试品溶液制备：取水蛭细粉1.0g，精密称定，加人工胃液20ml，于40℃恒温水浴中振荡提取30min，加2%胃蛋白酶，摇匀，继续在40℃恒温水浴中振荡1h，立即置于85℃恒温水浴中振荡15min，然后以流水冷却至室温，离心，上清液加等体积甲醇，摇匀，离心，取上清液，即得。
2.3色谱条件：Waters ACQUITYUPLCBHE C18色谱柱（1.7μm，100×2.1mm），流动相A： 0.1%甲酸乙腈，流动相B： 0.1%甲酸水，流速0.3mL/min，进样量2μL，柱温40℃，样品仓温度4℃。流动相洗脱梯度如下：
时间（min） 流速（ml/min） 流动相A（%） 流动相B（%）
0 0.3 1 99
5 0.3 10 90
10 0.3 30 70
15 0.3 60 40
2.4质谱条件：离子源：（+）ESI；离子源毛细管电压：2.8KV；采样锥孔电压：40V；离子源温度：110℃；脱溶剂温度：400℃；锥孔气体流速：50（L/h）；脱溶剂气体流速：800（L/h）；采集质荷比范围：50Da-1200Da；数据采集分析软件：MassLynx 4.1。
3实验结果
3.1特征离子的筛选与表征
制备水蛭供试品溶液，采集LC-MS总离子流色谱图。多肽是由多个氨基酸脱水缩合而成，在正离子模式下容易带上多个电荷，因此在多肽离子质谱图上同位素峰之间差值为1/N（N为≥2的正整数）。基于此特征，对UPLC-TOF/MS总离子流色谱图中各峰的离子进行分析，共筛选52个酶解多肽成分的特征离子，其质谱图如图1所示，多肽离子相关信息如表1所示。根据筛选的52个水蛭酶解多肽离子质谱信息，提取水蛭酶解多肽特征离子色谱峰，得到水蛭酶解多肽成分的UPLC-MS提取离子色谱图如图2。
表1水蛭酶解多肽成分离子的特征信息
峰号 保留时间（min） 多肽离子质荷比（m/z） 带电荷数（+H） 分子量（Da）
1 2.25 404.1969 2 806.3938
2 2.56 406.7003 2 811.4006
3 2.8 473.7337 2 945.4674
4 3.13 278.1747 2 554.3494
5 3.44 576.2531 2 1150.5062
6 3.61 394.2250 2 786.45
7 3.76 466.2522 2 930.5044
8 4.11 444.7308 2 887.4616
9 4.24 515.2772 2 1028.5544
10 4.53 665.3792 2 1328.7584
11 4.67 510.7604 2 1019.5208
12 4.85 416.2534 2 830.5068
13 5.13 442.2780 2 882.556
14 5.4 336.2205 2 670.441
15 5.75 547.3037 2 1092.6074
16 5.86 583.5499 4 2330.1996
17 6.08 491.7945 2 981.589
18 6.24 458.2546 2 914.5092
19 6.32 478.5994 3 1432.7982
20 6.53 648.0126 3 1941.0378
21 6.66 474.2714 2 946.5428
22 6.76 530.6284 3 1588.8852
23 7.09 573.8177 2 1145.6354
24 7.29 460.5959 3 1378.7877
25 7.38 585.7993 4 2339.1972
26 7.56 560.5369 4 2238.1476
27 7.76 622.8339 2 1243.6678
28 7.91 509.7523 2 1017.5046
29 8.07 458.0277 4 1828.1108
30 8.13 773.8557 2 1545.7114
31 8.24 633.8120 2 1265.624
32 8.38 549.8179 2 1097.6358
33 8.52 569.3165 2 1136.633
34 8.61 696.8274 2 1391.6548
35 8.81 778.4111 3 2332.2333
36 8.94 665.3530 2 1328.706
37 9.07 936.4749 2 1870.9498
38 9.15 506.2617 2 1010.5234
39 9.28 664.9012 2 1327.8024
40 9.38 501.2516 2 1000.5032
41 9.48 449.2640 2 896.528
42 9.56 792.3947 2 1582.7894
43 9.76 760.9087 2 1519.8174
44 9.87 569.0981 5 2840.4905
45 10.27 612.8278 2 1223.6556
46 10.32 1001.1926 3 3000.5778
47 10.47 608.8223 2 1215.6446
48 10.6 1012.5358 3 3034.6074
49 10.68 973.3898 3 2917.1694
50 10.87 638.3541 2 1274.7082
51 11.06 957.0037 2 1912.0074
52 11.27 697.3374 2 1392.6748
3.2水蛭酶解多肽特征图谱分析方法学考察
3.2.1精密度考察
制备水蛭酶解多肽供试品溶液，连续进样6针，采集多肽成分UPLC-MS特征图谱，见图3所示。各特征离子峰保留时间RSD值均小于0.3%，峰面积RSD值均小于10%，表明水蛭酶解多肽特征图谱检测方法精密度良好。
3.2.2重复性考察
平行制备水蛭酶解多肽供试品溶液6份，分别采集多肽成分UPLC-MS特征图谱，如图4所示。各特征离子峰的保留时间RSD值均小于0.3%，峰面积RSD值均小于10%，表明水蛭酶解多肽供试品溶液制备方法重复性良好。
3.3.3稳定性考察
制备水蛭酶解多肽供试品溶液，在制备后0h、2h、4h、8h、12h进样，采集多肽成分UPLC-MS特征图谱，如图5所示。不同时间采集的水蛭酶解多肽特征峰保留时间RSD值均小于0.3%，峰面积RSD值均小于10%，表明水蛭酶解多肽供试品溶液在12h内稳定性良好。
4.水蛭药材酶解多肽成分特征图谱的检测
取10批水蛭药材，为水蛭科动物水蛭Hirudo nippocica Whitman的干燥全体，由哈尔滨中药四厂有限公司提供。分别制备水蛭酶解多肽供试品溶液，采集多肽成分UPLC-MS特征图谱。结果表明，10批水蛭药材多肽成分特征图谱特征峰一致，均检测到表1中的52个水蛭多肽成分特征离子峰，如图6所示。因此，这52个多肽特征离子组成的UPLC-MS特征图谱能够表征水蛭药材酶解多肽成分，能够用于水蛭药材的质量评价。
5.蚂蟥药材酶解多肽成分特征图谱的检测
取8批购自药材市场的蚂蟥药材，为水蛭科动物蚂蝗Whitmania pigra Whitman的干燥全体。分别制备蚂蟥酶解多肽供试品溶液（蚂蟥酶解多肽供试品溶液的制备方法同水蛭细粉的制备方法），采集多肽成分UPLC-MS特征图谱。结果表明，8批蚂蟥药材酶解多肽成分特征图谱特征峰一致，但是只检测到表1中的31个水蛭酶解多肽成分特征离子峰，如图7所示。即蚂蟥中不含水蛭中的4，5，10，12，13，16，17，31，32，38，39，40，42，44，45，46，47，48，49，51和52号峰。
因此，本发明的特征图谱能够有效区别两种水蛭基原，从而有效解决水蛭药材的基原鉴别及质量控制问题。
实施例2：
本实施例与实施例1的区别仅在于：
取水蛭细粉1.0g，精密称定，加人工胃液20mL，于37℃恒温水浴中振荡提取40min，加1%胃蛋白酶，摇匀，继续在37℃恒温水浴中振荡1.5h，立即置于90℃恒温水浴中振荡20min，然后以流水冷却至室温，离心，上清液加等体积甲醇，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液.
蚂蟥细粉的供试品溶液的制备方法同上。
本实施例中，色谱条件中，流动相的流速为0.5mL/min。
实施例3：
本实施例与实施例1的区别仅在于：
取50目水蛭细粉1.0g，精密称定，加人工胃液20mL，于37℃恒温水浴中振荡提取30min，加1%胃蛋白酶，摇匀，继续在30℃恒温水浴中振荡1h，立即置于80℃恒温水浴中振荡10min，然后以流水冷却至室温，离心，上清液加等体积甲醇，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液；
蚂蟥细粉的供试品溶液的制备方法同上。
实施例4：
本实施例与实施例1的区别仅在于：
取200目水蛭细粉1.0g，精密称定，加人工胃液20mL，于38℃恒温水浴中振荡提取40min，加2%胃蛋白酶，摇匀，继续在50℃恒温水浴中振荡1h，立即置于85℃恒温水浴中振荡12min，然后以流水冷却至室温，离心，上清液加等体积甲醇，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液；
蚂蟥细粉的供试品溶液的制备方法同上。
实施例5：
本实施例与实施例1的区别仅在于：
水蛭制剂包括芪蛭胶囊，生产企业：哈尔滨中药四厂有限公司；主要成份：
黄芪、何首乌、水蛭、桃仁、莪术、三棱、决明子、山楂、土鳖虫。
取芪蛭胶囊内的药粉4.0g，精密称定，加人工胃液20mL，于37℃恒温水浴中振荡提取40min，加1%胃蛋白酶，摇匀，继续在37~40℃恒温水浴中振荡2h，立即置于90℃恒温水浴中振荡20min，然后以流水冷却至室温，离心，上清液加等体积甲醇，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液。
蚂蟥制剂的供试品溶液的制备方法同上。
实施例6：
本实施例与实施例5的区别仅在于：
取芪蛭胶囊内的药粉2.5g，精密称定，加人工胃液20mL，于38℃恒温水浴中振荡提取35min，加1.5%胃蛋白酶，摇匀，继续在38℃恒温水浴中振荡1.5h，立即置于87℃恒温水浴中振荡18min，然后以流水冷却至室温，离心，上清液加等体积甲醇，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液。
蚂蟥制剂的供试品溶液的制备方法同上。
实施例7：
本实施例与实施例5的区别仅在于：
取芪蛭胶囊内的药粉1.0g，精密称定，加人工胃液20mL，于38℃恒温水浴中振荡提取37min，加1%胃蛋白酶，摇匀，继续在30℃恒温水浴中振荡1.5h，立即置于80℃恒温水浴中振荡10min，然后以流水冷却至室温，离心，上清液加等体积甲醇，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液。
蚂蟥制剂的供试品溶液的制备方法同上。
实施例8：
本实施例与实施例5的区别仅在于：
取芪蛭胶囊内的药粉1.0g，精密称定，加人工胃液20mL，于40℃恒温水浴中振荡提取40min，加2%胃蛋白酶，摇匀，继续在50℃恒温水浴中振荡2h，立即置于90℃恒温水浴中振荡12min，然后以流水冷却至室温，离心，上清液加等体积甲醇，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液。
蚂蟥制剂的供试品溶液的制备方法同上。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱，其特征在于：包括52个多肽成分色谱峰，其特征离子信息如下：
峰号 特征离子质荷比（m/z） 离子模式 分子量（Da） 1 404.20 [M+2H]<sup>2+</sup> 806.39 2 406.70 [M+2H]<sup>2+</sup> 811.40 3 473.73 [M+2H]<sup>2+</sup> 945.47 4 278.18 [M+2H]<sup>2+</sup> 554.35 5 576.25 [M+2H]<sup>2+</sup> 1150.51 6 394.23 [M+2H]<sup>2+</sup> 786.45 7 466.25 [M+2H]<sup>2+</sup> 930.50 8 444.73 [M+2H]<sup>2+</sup> 887.46 9 515.28 [M+2H]<sup>2+</sup> 1028.55 10 665.38 [M+2H]<sup>2+</sup> 1328.76 11 510.76 [M+2H]<sup>2+</sup> 1019.52 12 416.25 [M+2H]<sup>2+</sup> 830.51 13 442.28 [M+2H]<sup>2+</sup> 882.56 14 336.22 [M+2H]<sup>2+</sup> 670.44 15 547.30 [M+2H]<sup>2+</sup> 1092.61 16 583.55 [M+4H]<sup>4+</sup> 2330.20 17 491.80 [M+2H]<sup>2+</sup> 981.59 18 458.26 [M+2H]<sup>2+</sup> 914.51 19 478.60 [M+3H]<sup>3+</sup> 1432.80 20 648.01 [M+3H]<sup>3+</sup> 1941.04 21 474.27 [M+2H]<sup>2+</sup> 946.54 22 530.63 [M+3H]<sup>3+</sup> 1588.89 23 573.82 [M+2H]<sup>2+</sup> 1145.64 24 460.60 [M+3H]<sup>3+</sup> 1378.79 25 585.82 [M+4H]<sup>4+</sup> 2339.20 26 560.54 [M+4H]<sup>4+</sup> 2238.15 27 622.84 [M+2H]<sup>2+</sup> 1243.67 28 509.75 [M+2H]<sup>2+</sup> 1017.51 29 458.03 [M+4H]<sup>4+</sup> 1828.11 30 773.86 [M+2H]<sup>2+</sup> 1545.71 31 633.81 [M+2H]<sup>2+</sup> 1265.62 32 549.82 [M+2H]<sup>2+</sup> 1097.64 33 569.32 [M+2H]<sup>2+</sup> 1136.63 34 696.83 [M+2H]<sup>2+</sup> 1391.66 35 778.41 [M+3H]<sup>3+</sup> 2332.23 36 665.35 [M+2H]<sup>2+</sup> 1328.71 37 936.48 [M+2H]<sup>2+</sup> 1870.95 38 506.26 [M+2H]<sup>2+</sup> 1010.52 39 664.90 [M+2H]<sup>2+</sup> 1327.80 40 501.25 [M+2H]<sup>2+</sup> 1000.50 41 449.26 [M+2H]<sup>2+</sup> 896.53 42 792.40 [M+2H]<sup>2+</sup> 1582.79 43 760.91 [M+2H]<sup>2+</sup> 1519.82 44 569.10 [M+5H]<sup>5+</sup> 2840.49 45 612.83 [M+2H]<sup>2+</sup> 1223.66 46 1001.19 [M+3H]<sup>3+</sup> 3000.58 47 608.82 [M+2H]<sup>2+</sup> 1215.65 48 1012.54 [M+3H]<sup>3+</sup> 3034.61 49 973.39 [M+3H]<sup>3+</sup> 2917.17 50 638.35 [M+2H]<sup>2+</sup> 1274.71 51 957.00 [M+2H]<sup>2+</sup> 1912.01 52 697.34 [M+2H]<sup>2+</sup> 1392.68
。
2.根据权利要求1所述的一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：取水蛭细粉或含水蛭制剂粉末适量，精密称定，加人工胃液，水蛭细粉与人工胃液的质量体积g/mL比为1：20，水蛭制剂粉末与人工胃液的质量体积g/mL比为1：（5~20），于37~40℃恒温水浴中振荡提取至少30min，加1~2%胃蛋白酶，摇匀，继续在30~50℃恒温水浴中振荡至少1h，立即置于80~90℃恒温水浴中振荡10~20min，然后以流水冷却至室温，离心，上清液加等体积甲醇，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液；
供试品溶液利用液相色谱法进行分离，检测上述特征图谱的液相色谱流动相为：以十八烷基键合硅胶为色谱柱固定相，流动相为乙腈-0.1%甲酸水；色谱条件为：乙腈A-0.1%甲酸水B，0-5min，1%-10% A；5-10min，10-30%A；10-15min，30-60%A；流速0.3~0.5mL/min；
供试品溶液经液相色谱分离后，利用质谱法进行检测，正离子电喷雾电离，靶向采集所述特征离子，获得水蛭药材酶解多肽的LC-MS特征图谱。
3.根据权利要求2所述的一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱的检测方法，其特征在于：所述人工胃液的制备方法为：取浓盐酸9mL加蒸馏水稀释至1000mL，密闭，4℃冷藏备用。
4.根据权利要求2所述的一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱的检测方法，其特征在于：所述水蛭为水蛭科动物水蛭Hirudo nipponica Whitman的干燥全体。
5.根据权利要求2所述的一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱的检测方法，其特征在于：所述质谱条件为：离子源：（+）ESI；离子源毛细管电压：2.8KV；采样锥孔电压：40V；离子源温度：110℃；脱溶剂温度：400℃；锥孔气体流速：50 L/h；脱溶剂气体流速：800 L/h；采集质荷比范围：50Da-1200Da；数据采集分析软件：MassLynx 4.1。
6.根据权利要求2所述的一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱的检测方法，其特征在于：所述水蛭细粉或含水蛭制剂粉末的目数均为50-200目。
7.根据权利要求2~6任意一项所述的一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱的检测方法在水蛭药材质量控制中的应用。
8.根据权利要求2~6任意一项所述的一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱的检测方法在水蛭、蚂蟥鉴别中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述水蛭、蚂蟥包括药材粉或制剂。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述蚂蟥为水蛭科动物蚂蝗Whitmania pigra Whitman的干燥全体。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115290782A (zh) * 2022-08-01 2022-11-04 北京振东光明药物研究院有限公司 含水蛭、全蝎、僵蚕和/或土鳖虫的制剂的鉴别方法及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK630688D0 (da) * 1987-11-13 1988-11-11 Hoechst Ag Fremgangsmaade til isolering og rensning af hirudin
CN1844911A (zh) * 2006-01-24 2006-10-11 李振国 一种水蛭指纹图谱的建立方法和水蛭药材的鉴别方法
CN102914612A (zh) * 2011-08-06 2013-02-06 河北以岭医药研究院有限公司 一种菲牛蛭药材指纹图谱的测定方法
CN103558329A (zh) * 2013-11-25 2014-02-05 鲁南厚普制药有限公司 水蛭指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱
CN109187835A (zh) * 2018-09-17 2019-01-11 南京中医药大学 一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK630688D0 (da) * 1987-11-13 1988-11-11 Hoechst Ag Fremgangsmaade til isolering og rensning af hirudin
CN1844911A (zh) * 2006-01-24 2006-10-11 李振国 一种水蛭指纹图谱的建立方法和水蛭药材的鉴别方法
CN102914612A (zh) * 2011-08-06 2013-02-06 河北以岭医药研究院有限公司 一种菲牛蛭药材指纹图谱的测定方法
CN103558329A (zh) * 2013-11-25 2014-02-05 鲁南厚普制药有限公司 水蛭指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱
CN109187835A (zh) * 2018-09-17 2019-01-11 南京中医药大学 一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIAO, L等: "Peptides from two sanguinovorous leeches analyzed by ultra-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometric detector", PHARMACOGNOSY MAGAZINE, vol. 11, no. 41, pages 32 - 37 *
YANES, O等: "Functional screening of serine protease inhibitors in the medical leech Hirudo medicinalis monitored by intensity fading MALDI-TOF MS", MOLECULAR & CELLULAR PROTEOMICS, vol. 04, no. 10, pages 1602 - 1613, XP002672736, DOI: 10.1074/MCP.M500145-MCP200 *
徐佳;杨瑶;刘晓帆;吴立洁;刘杰;戴待;: "水蛭的高效液相指纹图谱研究", 环球中医药, no. 08, pages 596 - 599 *
徐长根;罗世书;谢艳华;: "水蛭冻干粉针剂指纹图谱评价", 第四军医大学学报, no. 22, pages 2667 - 2669 *
肖凌: "水蛭DNA鉴定、活性多肽分离及其作用机制的研究", CNKI博士学位论文全文库, no. 03, pages 1 - 139 *
袁晓环;杨旭东;崔荣军;包海花;: "水蛭注射液的HPLC指纹图谱", 中国医药工业杂志, no. 07, pages 530 - 532 *
袁晓环;杨旭东;王春涛;祖国美;: "复方水蛭注射液HPLC指纹图谱研究", 中国中药杂志, no. 15, pages 1825 - 1827 *
邱学伟;杨培民;代龙;刘国飞;: "水蛭仿生酶解有效部位HPLC指纹图谱的研究", 辽宁中医杂志, no. 12, pages 2436 - 2437 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115290782A (zh) * 2022-08-01 2022-11-04 北京振东光明药物研究院有限公司 含水蛭、全蝎、僵蚕和/或土鳖虫的制剂的鉴别方法及其应用

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