CN110261499B - 一种基于uplc-q-tof/ms检测萹蓄中化学成分的方法 - Google Patents

一种基于uplc-q-tof/ms检测萹蓄中化学成分的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于UPLC‑Q‑TOF/MS检测萹蓄中化学成分的方法，包括如下步骤：(1)取萹蓄粉末精密称定，然后与溶剂混合，称定重量；(2)将步骤(1)所得的萹蓄超声破碎，然后将超声过的萹蓄溶液摇匀，离心，过滤，取滤液，即得到待测样品；(3)用超高效液相色谱分离步骤(2)中的待测样品，然后用质谱检测，得化学成分物质峰，用分析软件对所述物质峰进行定性分析。所述方法通过筛选了液相色谱和质谱的条件，实现了快速检测萹蓄中多种化学成分，操作简便、快速、准确、高效，样品前处理简便，简化实验步骤，降低了成本，实现了萹蓄中多成分的快速定性或定量，对于提高萹蓄药材的质量标准有重要意义。

Description

一种基于UPLC-Q-TOF/MS检测萹蓄中化学成分的方法
技术领域
本发明涉及一种基于UPLC-Q-TOF/MS检测中药材中化学成分 中的方法，具体涉及一种基于UPLC-Q-TOF/MS检测萹蓄中化学成分 的方法。
背景技术
萹蓄(Polygonum aviculare L.)为蓼科蓼属一年生草本植物，又名扁竹、 竹叶草、扁竹蓼、乌蓼、牛鞭草等。味苦、微寒，具有利尿通淋、止痒、杀 虫之功效，临床主要用于小便短赤，热淋涩痛，皮肤湿疹，阴痒带下，虫积 腹痛。研究报道(S Granica,JPPiwowarski,AK Kiss,et al.Novel insight into qualitative standardization ofPolygoni avicularis herba(Ph.Eur.)[J].J Pharma and Biomed Anal,2013,72:216-222)， 其主要含有黄酮类、苯丙素类、酚酸类、甾醇类、萜类等多种活性成分，其 中黄酮类和酚酸类为萹蓄中主要成分。现代药理学研究(杨俊丽,黄丽丹,张 亚中,等.篇蓄的研究进展[J].安徽医药,2016,20(6):1025-1029.)表明萹蓄具有 解毒利尿、杀虫、抑菌消炎、保肝、降血糖、抗癌、提高机体免疫等多种药 理活性。
由于萹蓄药效物质基础尚不明确，药材的质量控制手段主要有传统的生 药学研究、以杨梅苷为对照的TLC法、HPLC指纹图谱、GC-MS法测定挥发 油，含量测定方面多集中在几种黄酮类的测定(如期刊文献胥秀英,郑一敏, 傅善权,等.高效液相色谱法测定萹蓄中金丝桃苷等3种有效成分的含量[J].时 珍国医医药,2006,17(4):563-564.和付庆荣,刘淑娟,王弘,等.RP-HPLC-UV法同 时测定萹蓄中8个黄酮类化合物的含量[J].中国药学,2014,23(3):170-176.)， 这些技术手段和方法难以全面系统的表征化学成分轮廓特征和控制药材的 内在质量。目前，液质联用技术已广泛应用于中药及复方物质基础方面的研 究，以液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(LC-Q-TOF-MS)为代表的一类 高分辨率、高灵敏度的液质联用技术在中药复杂体系成分快速鉴别领域的应 用越来越多。因此，建立一种能快速、高效、准确的测定萹蓄药材中主要化 学成分的方法，实现对其物质群的全面控制，为萹蓄的质量评价提供科学试 验依据，具有重要的意义。
现阶段，传统生药学研究，有时候带有一定的主观性，在复杂的中药材 质量控制中有一定的局限性；而经典的TLC法中存在大量的假阳性和假阴性 问题，易导致实验结论的偏差；以HPLC为主的中药指纹图谱技术基于从整 体面貌上辨认样品的真实性，在中药质量控制中发挥重要角色，但中药材基 原广泛、中药材受品种、产地、种植、采收、炮制等多种因素影响，难以控 制，不同药材其指纹图谱有一定的差异，实验室条件、仪器设备的不同也会 影响指纹图谱的重现性；GC-MS法更多的适用于含挥发性成分为主的中药材 质量控制的应用。
超高液相色谱(UPLC)相对传统的HPLC分离效果更好，分析速度更快， 非常适合多组分快速检测，而四级杆串联飞行时间质谱(Q-TOF)分辨率高、 灵敏度高，结合同位素分析和高分辨的分子量，能够实现分子量的精确测定， 适合复杂基质中组分的检测定性，因此UPLC-Q/TOF-MS已成为复杂基质中 多成分的有效快速准确的检测手段，一种简便、快速、准确、高效的检测萹 蓄中多成分的UPLC-Q/TOF-MS方法亟待开发出来。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种基于UPLC-Q/TOF-MS检测萹蓄中化学成分 的方法，所述方法操作简便、快速、准确、高效，样品前处理简便，简化了 完全分离和纯化，再一一鉴别的步骤，降低了成本。
用于解决问题的方案
为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种基于UPLC-Q-TOF/MS检测萹蓄中化学成分的方法，包括如 下步骤：
(1)取萹蓄粉末精密称定，然后与溶剂混合，称定重量；
(2)将步骤(1)所得的萹蓄超声破碎，然后将超声过的萹蓄 溶液摇匀，离心，过滤，取滤液，即得到待测样品；
(3)用超高效液相色谱分离步骤(2)中的待测样品，然后用质谱检测， 得化学成分物质峰，用分析软件对所述物质峰进行定性分析。
优选的，将步骤(1)中的萹蓄粉末过筛后再进行精密称定。
优选的，步骤(1)中的溶剂为甲醇、水或甲醇水溶液。
优选的，所述萹蓄粉末与溶剂的质量体积比为0.2-10g：10-100ml。
优选的，所述方法还包括以下步骤，在步骤(2)将萹蓄超声破碎后， 放冷，再称定重量，用步骤(1)中的溶剂补足减失的重量。
优选的，步骤(2)中超声的时间为5-120分钟，离心的转速为 10000～15000r/min，离心时间为5～60min。
优选的，步骤(3)中的超高效液相色谱的分离条件为，色谱柱为Waters ACQUITYUPLC BEH Shield RP18色谱柱、Waters UPLC CORTECS T3液相 色谱柱、Waters ACQUITYUPLC HSS T3液相色谱柱或Waters-ACQUITY UPLC BEH C18液相色谱柱，洗脱系统流动相为：流动相A为乙腈，流动相B 为体积浓度0.02～0.5％甲酸水溶液，流速为0.1-1ml/min。
优选的，洗脱系统流动相为：流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度 0.05～0.2％甲酸水溶液，流速为0.2-5ml/min，柱温为10-50℃，洗脱程序为下 表所述：
Figure BDA0002065043610000031
Figure BDA0002065043610000041
。
优选的，步骤(3)中质谱检测的条件为：离子源为双喷ESI离子源、大 气压化学电离、电子轰击电离、化学电离或快原子轰击，干燥气温度为 200-400℃，流量为1-20L/min，雾化器压力为10-100psi。
优选的，所述的分析软件为Agilent MassHunter Qualitative Analysissoftware B.08.00。
发明的效果
本发明采用UPLC-Q/TOF-MS方法，通过筛选液相色谱和质谱的条件， 实现了快速检测萹蓄中多种化学成分，操作简便、快速、准确、高效，样品 前处理简便，简化实验步骤，降低了成本。实现了萹蓄中多成分的快速定性 或定量，对于提高萹蓄药材的质量标准有重要意义。
附图说明
图1为采用Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色谱柱的分离效果 图；
图2为采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3液相色谱柱的分 离效果图；
图3为采用Waters-ACQUITY UPLC BEH C18液相色谱柱的 分离效果图；
图4样品的正、负离子模式下TIC图：A.样品的正离子模式下TIC图； B.样品的负离子模式下TIC图；
图5样品的BPC图：A.样品的正离子模式下BPC图；B.样品的负离子 模式下BPC图；
图6萹蓄药材中峰3(绿原酸)的：A.正离子提取离子流图(EIC)；B. 负离子提取离子流图(EIC)；C.一级正离子质谱图；D.一级负离子质谱图(样 品峰3的正、负EIC图、一级正、负离子棒状图、化学结构式)；
图7萹蓄药材中峰19(杨梅苷)的：A.正离子提取离子流图(EIC)； B.负离子提取离子流图(EIC)；C.一级正离子质谱图；D.一级负离子质谱图 (样品峰19的正、负EIC图、一级正、负离子棒状图)。
具体实施方式
本发明提供了一种基于UPLC-Q-TOF/MS检测萹蓄中化学成分的 方法，包括如下步骤：
(1)取萹蓄粉末精密称定，然后与溶剂混合，称定重量；
(2)将步骤(1)所得的萹蓄超声破碎，然后将超声过的萹蓄 溶液摇匀，离心，过滤，取滤液，即得到待测样品；
(3)用超高效液相色谱分离步骤(2)中的待测样品，然后用质谱检测， 得化学成分物质峰，用分析软件对所述物质峰进行定性分析。
在一项优选的实施方案中，将步骤(1)中的萹蓄粉末过筛，优选过筛 后再进行精密称定。
在一项或多项优选的实施方案中，步骤(1)中的溶剂为甲醇、水或甲 醇水溶液，优选为体积占比为30-70％的甲醇溶液，更优选为40-60％的甲醇 溶液，最优选为50％的甲醇溶液。
在一项或多项优选的实施方案中，所述萹蓄粉末与溶剂的质量体积比为 0.2-10g：10-100ml，优选为0.5-5g：10-50ml，更优选为1g：25ml。
在一项或多项优选的实施方案中，所述方法还包括以下步骤，在步骤(2) 将萹蓄超声破碎后，放冷，再称定重量，用步骤(1)中的溶剂补足减失的 重量。
在一项或多项更优选的实施方案中，步骤(2)中超声时间为5-120分钟， 优选为10～60分钟，10000～15000r/min，优选为11000～13000r/min，离心时间 为5～60min离心时间为10～30min。
在一项或多项更优选的实施方案中，步骤(3)中的超高效液相色谱的 分离条件为，色谱柱为本领域常见的超高效液相色谱柱，优选为Waters ACQUITY UPLC BEH ShieldRP18色谱柱，规格为2.1mm×100mm,1.7μm、 Waters UPLC CORTECS T3液相色谱柱，规格为150mm×2.1mm，1.6μm， Waters ACQUITY UPLC HSS T3液相色谱柱，规格为2.1mm×100mm,1.8μm， 或Waters-ACQUITY UPLC BEH C18液相色谱柱，规格为2.1mm×100 mm,18μm，更优选为Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色谱柱或 Waters ACQUITY UPLC HSS T3液相色谱柱。洗脱系统流动相为：流动相A 为乙腈，流动相B为体积浓度0.02～0.5％甲酸水溶液，流速为0.1-1ml/min。
在一项或多项更优选的实施方案中，洗脱系统流动相为：流动相A为乙 腈，流动相B为体积浓度0.05～0.2％甲酸水溶液，更优选为0.1％甲酸水溶液， 流速为0.2-5ml/min，优选为0.28/min，柱温为10-50℃，优选为30℃，洗脱程 序为下表所述：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～7 12→14 88→86
7～9 14 86
9～12 14→16 86→84
12～16 16→18 84→82
16～25 18→19 82→81
25～29 19→22 81→78
29～35 22→30 78→70
35～38 30→39 70→61
38～40 39→50 61→50
40～42 50 50
42～44 50→95 50→5
44～46 95 5
46～46.10 95→12 5→88
在一项或多项更优选的实施方案中，步骤(3)中质谱检测的条件为： 离子源为双喷ESI离子源、大气压化学电离、电子轰击电离、化学电离或快 原子轰击，优选为双喷ESI离子源，干燥气温度为200-400℃，优选为300℃， 流量为1-20L/min，优选为8L/min，雾化器压力为10-100psi，优选为35psi； 负离子模式下毛细管电压3500V，正离子模式下毛细管电压4000V，毛细 管出口电压175V，锥孔电压65V；采用高分辨模式进行数据采集，质荷比 采集范围m/z 100～2000，采样速度1spectra/s，采样时间1000ms/spectra； 负离子采用TFANH4(112.985587)和HP-0921(1033.988109)进行质量数 实时校准，正离子采用嘌呤(121.050873)和HP-0921(922.009798)进行 质量数实时校准，雾化压力5psi。
在一项或多项更优选的实施方案中，所述的分析软件为Agilent MassHunterQualitative Analysis software B.08.00。鉴定过程中一方面与自建 的数据库匹配，另一方面结合同位素和高分辨质量数与相关的文献、在线 Chemspider数据库查询，推测未在已有萹蓄数据库中的化学成分。
下面结合实施例对本发明提供的基于UPLC-Q-TOF-MS检测萹蓄中化学 成分的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为本发明保护范围的限定。
实施例所用的仪器、材料和试药
仪器：Aglent1290超高效液相色谱仪(Agilent,USA)和质谱Aglent UPLC-Q-TOF-MS(Agilent,USA)。试药：乙腈(色谱纯，ThermoFisher公 司)；水为屈臣氏蒸馏水；甲酸(分析纯，SIGMA公司)，萹蓄样品由天江 研究院提供。
实施例1
1、样品溶液的制备
取过四号筛的萹蓄粉末约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量， 用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，取出适量置离心管中，12000r/min高速 离心10min，滤过，取滤液，即得。
2、色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18(2.1mm×100 mm,1.7μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸-水为流动相B，柱温为30℃， 流速为每分钟0.28ml。
梯度洗脱条件如下表1：
表1色谱洗脱梯度
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～7 12→14 88→86
7～9 14 86
9～12 14→16 86→84
12～16 16→18 84→82
16～25 18→19 82→81
25～29 19→22 81→78
29～35 22→30 78→70
35～38 30→39 70→61
38～40 39→50 61→50
40～42 50 50
42～44 50→95 50→5
44～46 95 5
46～46.10 95→12 5→88
。分离效果见图1。
3、质谱检测条件
离子源为双喷ESI离子源，干燥气温度300℃，流量8L/min，雾化器压 力35psi；负离子模式下毛细管电压3500V，正离子模式下毛细管电压4000 V，毛细管出口电压175V，锥孔电压65V；采用高分辨模式进行数据采集， 质荷比采集范围m/z 100～2000，采样速度1spectra/s，采样时间1000 ms/spectra；负离子采用TFANH4(112.985587)和HP-0921(1033.988109) 进行质量数实时校准，正离子采用嘌呤(121.050873)和HP-0921(922.009798) 进行质量数实时校准，雾化压力5psi。
4、数据处理与分析
前期根据文献报道的有关萹蓄中的化学成分，数据检索主要通过中国知 网、化学专业数据库、PubMed、STN on the web等数据库完成，建立各成分 的信息数据库包括名称、分子式、精确质量数等，导入到数据分析软件Agilent MassHunter Qualitative Analysissoftware B.08.00中，质量偏差均设定在10 ppm以内，鉴定过程中一方面与自建的数据库匹配，另一方面结合同位素和 高分辨质量数与相关的文献、在线Chemspider数据库查询，推测未在已有 萹蓄数据库中的化学成分。
5、实验结果
本研究在借助UPLC-Q-TOF-MS技术分离鉴定出了萹蓄药材中39种化 学成分组成，包括黄酮类、乙酰化和没食子酰化黄酮醇醛酸苷、酚酸类等， 具体结果见表2。图4为待测样品的正、负离子模式下TIC(Total Ions Chromatograph)图，即总离子流色谱图，其中A为样品的正离子模式下TIC 图，B为样品的负离子模式下TIC图；图5为待测样品的BPC图(基峰图)， 其中A为样品的正离子模式下BPC图，B为样品的负离子模式下BPC图。 以绿原酸为例，绿原酸的结构为：
Figure BDA0002065043610000091
以绿原酸为 代表的酚酸类成分在负离子模式下响应大，易形成[M-H]-的准分子离子峰， 绿原酸由于结构中由咖啡酸和奎宁酸相连接，正离子模式下除[M+H]+峰外， 还观察到[M+Na]+峰和丢失奎宁酸结构单元(C7H12O6)形成的m/z 163[M+H-C7H12O6]+特征碎片峰，具体见附图6。
再以杨梅苷为例，杨梅苷的结构为：
Figure BDA0002065043610000092
以杨梅苷为代表的黄酮醇苷类正离子模式下均 形成[M+H]+、[M+Na]+峰，因结构中由黄酮醇苷元和一个糖部分组成，氧苷 键易断裂，分别形成319[M+H-C6H10O5]+的特征碎片峰，依次为杨梅素黄酮 醇苷元结构，具体见附图7。
表2检测到的39种化学成分
Figure BDA0002065043610000101
Figure BDA0002065043610000111
Figure BDA0002065043610000121
。
实施例2-3
实施例2-3和实施例1基本相同，区别仅在于色谱条件所采用的液相色 谱柱不同，实施例2和3分别采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3液相色谱 柱，规格为2.1mm×100mm,1.8μm，和Waters-ACQUITY UPLC BEH C18 液相色谱柱，规格为2.1mm×100mm,18μm。分离效果分别见图2和图3。
结果表明，萹蓄药材样品在在Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 液相色谱柱和Waters ACQUITY UPLC HSS T3液相色谱柱中可获得较好的 分离效果，采用Waters-ACQUITY UPLC BEH C18液相色谱柱会存在包峰现 象。
以上所述仅是本发明的优选实施方法，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应该视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种基于UPLC-Q-TOF/MS检测萹蓄中化学成分的方法，包括如下步骤：
(1)取萹蓄粉末精密称定，然后与溶剂混合，称定重量；
(2)将步骤(1)所得的萹蓄超声破碎，然后将超声过的萹蓄溶液摇匀，离心，过滤，取滤液，即得到待测样品；
(3)用超高效液相色谱分离步骤(2)中的待测样品，然后用质谱检测，得化学成分物质峰，用分析软件对所述物质峰进行定性分析；
步骤(1)中的溶剂为甲醇水溶液；
步骤(3)中的超高效液相色谱的分离条件为：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEHShield RP18色谱柱、Waters UPLC CORTECS T3液相色谱柱或Waters ACQUITY UPLC HSST3液相色谱柱，洗脱系统流动相为：流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度0.02～0.5％甲酸水溶液，流速为0.1-1ml/min，柱温为10-50℃，洗脱程序为下表所述：
时间/分钟 流动相A/％ 流动相B/％ 0～7 12→14 88→86 7～9 14 86 9～12 14→16 86→84 12～16 16→18 84→82 16～25 18→19 82→81 25～29 19→22 81→78 29～35 22→30 78→70 35～38 30→39 70→61 38～40 39→50 61→50 40～42 50 50 42～44 50→95 50→5 44～46 95 5 46～46.10 95→12 5→88
。
2.根据权利要求1所述的一种基于UPLC-Q-TOF/MS检测萹蓄中化学成分的方法，其特征在于，将步骤(1)中的萹蓄粉末过筛后再进行精密称定。
3.根据权利要求1所述的一种基于UPLC-Q-TOF/MS检测萹蓄中化学成分的方法，其特征在于，所述萹蓄粉末与溶剂的质量体积比为0.2-10g：10-100ml。
4.根据权利要求1所述的一种基于UPLC-Q-TOF/MS检测萹蓄中化学成分的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤，在步骤(2)将萹蓄超声破碎后，放冷，再称定重量，用步骤(1)中的溶剂补足减失的重量。
5.根据权利要求4所述的一种基于UPLC-Q-TOF/MS检测萹蓄中化学成分的方法，其特征在于，步骤(2)中超声的时间为5-120分钟，离心的转速为10000～15000r/min，离心时间为5～60min。
6.根据权利要求1所述的一种基于UPLC-Q-TOF/MS检测萹蓄中化学成分的方法，其特征在于，步骤(3)中质谱检测的条件为：离子源为双喷ESI离子源、大气压化学电离、电子轰击电离、化学电离或快原子轰击，干燥气温度为200-400℃，流量为1-20L/min，雾化器压力为10-100psi。
7.根据权利要求1所述的一种基于UPLC-Q-TOF/MS检测萹蓄中化学成分的方法，其特征在于，所述的分析软件为Agilent MassHunter Qualitative Analysis softwareB.08.00。
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