CN114113376B - 僵蚕特征多肽以及僵蚕、僵蚕水提物制品和其他僵蚕制品的鉴别方法 - Google Patents

僵蚕特征多肽以及僵蚕、僵蚕水提物制品和其他僵蚕制品的鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种僵蚕特征多肽以及僵蚕、僵蚕水提物制品和其他僵蚕制品的鉴别方法。所述僵蚕特征多肽包含氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的肽段或/和氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的肽段。与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：本发明提供一种僵蚕特征多肽，该僵蚕特征多肽能用于僵蚕及其制品尤其是僵蚕水提物制品的专属性鉴别，通过检测待鉴别样品中是否存在该僵蚕特征多肽即可实现僵蚕及其制品的鉴别。本发明解决了僵蚕的中药标准汤剂、中药配方颗粒及成方制剂因外观性状缺失而导致鉴别困难的问题，并且操作简单，为僵蚕及其制品尤其是僵蚕水提物制品的质量控制和评价提供依据。

Description

僵蚕特征多肽以及僵蚕、僵蚕水提物制品和其他僵蚕制品的 鉴别方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种僵蚕特征多肽以及僵蚕、僵蚕水提物制品和其他僵蚕制品的鉴别方法。
背景技术
僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori Linnaeus 4龄～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌Beauveria bassiana(Bals.)Vuillant而致死的干燥体，始载于《神农本草经》，列为中品。陶弘景云：“人家养蚕时，有合箱皆僵者，即暴躁都不坏，今见小白色，似有盐度者为好。”《本草图经》曰：“白僵蚕，生颖川平泽”，今所在养蚕处皆有之，用自僵死白色而条直着为佳”。《本草纲目》载：“蚕病风死，其色自白，故曰白僵蚕”。僵蚕主产于浙江、江苏、此外，四川、广东、陕西等地。多于春、秋季生产，将感染白僵菌病死的蚕干燥。以条粗、质硬、色白、断面光亮者为佳。僵蚕具有息风止痉、祛风止痛、化痰散结的功效，临床上用于肝风夹痰、惊痫抽搐、小儿急惊风、破伤风、中风口风热头痛、目赤咽痛、风疹瘙痒以及发颐痄腮。
僵蚕作为一种常用中药，在临床上应用广泛，《中国药典》、《国家中成药标准》、《中药成方制剂》等典籍中收录了175个含有僵蚕的中成药处方，然而，其质量标准研究并不完善。传统的僵蚕定性检测方法主要依据药材性状、红外线光谱等，例如：2020年版《中国药典》一部对僵蚕的质量控制局限于性状、显微鉴别、检测项及浸出物，暂无规定专属性较强的定性检测方法；赵建国在《傅里叶变换红外光谱法鉴定中药僵蚕》中建立了中药僵蚕的红外光谱的鉴别方法，为僵蚕的生药鉴定与品质评价提供参考。
目前，僵蚕的专属性定性方法主要采用DNA条形码技术，例如：贾静、石春林等在《市售动物药材僵蚕的DNA条形码鉴定研究》中基于PCR实现对僵蚕的检测。尽管PCR技术特异性强、灵敏度高，然而由于PCR技术采用了通用引物，因此在完成扩增后，还需要进行扩增产物测序并将测序结果与基因数据库中的序列做比对从而判断种属，步骤较多，耗时长，需要专门设备，难以在生产中用于僵蚕。特别是，如上例举的传统的专属性定性方法适用范围存在局限性，主要适用于僵蚕药材，而不适用于僵蚕制品(包括僵蚕水提物制品)的专属性定性鉴别，例如标准汤剂及中药配方颗粒的制备过程经历高温，期间特定的DNA片段遭到破坏，加上基质复杂，DNA提取更为困难。因此，如何专属性强地实现僵蚕及其制品的鉴别从而满足质量控制需要是亟待解决的技术问题，更是僵蚕水提物制品质量控制领域急需攻克的技术难题。
发明内容
基于以上背景技术，本发明的主要目的是提供一种僵蚕特征多肽，该僵蚕特征多肽能用于僵蚕及其制品尤其是僵蚕水提物制品的专属性鉴别，通过检测待鉴别样品中是否存在该僵蚕特征多肽即可实现僵蚕及其制品的鉴别。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种僵蚕特征多肽，所述僵蚕特征多肽包含氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的肽段或/和氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的肽段。
在其中一个实施例中，所述氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的肽段，母离子的m/z为823.36，子离子的m/z为1070.47、1345.57。
在其中一个实施例中，所述氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的肽段，母离子的m/z为637.29，子离子的m/z为825.36、926.40。
一种僵蚕、僵蚕水提物制品以及其他僵蚕制品的鉴别方法，所述鉴别方法包括检测待鉴别样品中的僵蚕特征性成分的步骤，所述僵蚕特征性成分为所述的僵蚕特征多肽。
在其中一个实施例中，检测待鉴别样品中的僵蚕特征性成分的步骤包括：
分别取所述待鉴别样品以及所述僵蚕特征性成分，制备供试品溶液和对照品溶液；采用超高效液相色谱质谱联用法对所述供试品溶液和所述对照品溶液进行检测。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱质谱联用法中，超高效液相色谱的条件包括：
固定相：C18色谱柱；
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为含甲酸体积百分比为0.08％～0.12％的甲酸水溶液，洗脱方式采用梯度洗脱。
在其中一个实施例中，梯度洗脱的条件包括：0min～3min，所述流动相A的体积百分比为3％；3min～8min，所述流动相A的体积百分比由3％上升至5％；8min～10min，所述流动相A的体积百分比为5％；10min～18min，所述流动相A的体积百分比由5％上升至7％；18min～19min，所述流动相A的体积百分比由7％上升至90％；19min～21min，所述流动相A的体积百分比为90％。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱质谱联用法中，超高效液相色谱的条件还包括：柱温为28℃～32℃。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱质谱联用法中，超高效液相色谱的条件还包括：流速为0.25mL/min～0.35mL/min。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱质谱联用法中，超高效液相色谱的条件还包括：进样量为4.5μL～5.5μL。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱质谱联用法中，质谱的条件包括：电喷雾正离子模式；多反应监测扫描；毛细管电压：0.45kV～0.55kV；离子源温度：480℃～520℃；溶剂气流速：850L/hr～950L/hr。
在其中一个实施例中，所述对照品溶液的制备包括如下步骤：取所述僵蚕特征性成分，用碳酸氢铵溶液溶解。
在其中一个实施例中，所述碳酸氢铵溶液含碳酸氢铵的质量百分比为0.8％～1.2％。
在其中一个实施例中，所述供试品溶液的制备包括如下步骤：将待鉴别样品置于碳酸氢铵溶液中提取，收集提取液，加胰蛋白酶酶解。
在其中一个实施例中，所述碳酸氢铵溶液含碳酸氢铵的质量百分比为0.8％～1.2％。
在其中一个实施例中，所述僵蚕水提物制品包含僵蚕标准汤剂、炒僵蚕标准汤剂、僵蚕中药配方颗粒、炒僵蚕中药配方颗粒和癫痫平片。
在其中一个实施例中，所述其他僵蚕制品包含中风回春丸、乳癖散结胶囊、医痫丸和小儿七珍丸。
与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
本发明提供一种僵蚕特征多肽，该僵蚕特征多肽能用于僵蚕及其制品尤其是僵蚕水提物制品的专属性鉴别，通过检测待鉴别样品中是否存在该僵蚕特征多肽即可实现僵蚕及其制品的鉴别。本发明解决了僵蚕的中药标准汤剂、中药配方颗粒及成方制剂等水提物制品因外观性状缺失而导致鉴别困难的问题，并且操作简单，为僵蚕及其制品尤其是僵蚕水提物制品的质量控制和评价提供依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为肽段A与人工合成多肽色谱图、一级质谱图及二级质谱图；
图2为肽段B与人工合成多肽色谱图、一级质谱图及二级质谱图；
图3为炒僵蚕中药配方颗粒专属性质谱图(m/z 823)；
图4为炒僵蚕中药配方颗粒专属性质谱图(m/z 637)；
图5为对照品、僵蚕药材、金龟子虫药材、面包虫药材、龟甲药材、土鳖虫药材、地龙药材、蝉蜕药材、鸡内金药材、水蛭药材的特征性验证MRM质谱图(m/z 823)；
图6为对照品、僵蚕药材、金龟子虫药材、面包虫药材、龟甲药材、土鳖虫药材、地龙药材、蝉蜕药材、鸡内金药材、水蛭药材的特征性验证MRM质谱图(m/z 637)；
图7为对照品、僵蚕标准汤剂、金龟子虫标准汤剂、面包虫标准汤剂、龟甲标准汤剂、土鳖虫标准汤剂、地龙标准汤剂、蝉蜕标准汤剂、鸡内金标准汤剂、水蛭标准汤剂的特征性验证MRM质谱图(m/z 823)；
图8为对照品、僵蚕标准汤剂、金龟子虫标准汤剂、面包虫标准汤剂、龟甲标准汤剂、土鳖虫标准汤剂、地龙标准汤剂、蝉蜕标准汤剂、鸡内金标准汤剂、水蛭标准汤剂的特征性验证MRM质谱图(m/z 637)；
图9为对照品、僵蚕药材、僵蚕饮片、僵蚕标准汤剂、僵蚕中药配方颗粒、炒僵蚕饮片、炒僵蚕标准汤剂、炒僵蚕中药配方颗粒MRM质谱图(m/z 823)；
图10为对照品、僵蚕药材、僵蚕饮片、僵蚕标准汤剂、僵蚕中药配方颗粒、炒僵蚕饮片、炒僵蚕标准汤剂、炒僵蚕中药配方颗粒MRM质谱图(m/z 637)；
图11为含僵蚕的成方制剂MRM质谱图(m/z 823)；
图12为含僵蚕的成方制剂MRM质谱图(m/z 637)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个端点。
本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
近年来，随着蛋白质组学的发展，2020年版《中国药典》一部已将阿胶的特征离子和特征多肽应用于阿胶的鉴别及含量测定中，该法更为快速、准确，更具专属性。然而，特征多肽在僵蚕及其制品中的研究还属空白。为此，本发明利用液质联用技术，结合蛋白组学，筛选出两段僵蚕的特征多肽，可应用于僵蚕(包括僵蚕药材、僵蚕饮片、炒僵蚕饮片)的专属性鉴别，还可用于僵蚕制品，包括僵蚕水提物制品以及其他僵蚕制品中僵蚕成分的专属性鉴别。为僵蚕及其制品特别是僵蚕水提物制品的质量控制和评价提供依据。
本发明所述的僵蚕水提物制品主要对应用僵蚕水提物制备的中药产品，包括但不限于：僵蚕标准汤剂、炒僵蚕标准汤剂、僵蚕中药配方颗粒、炒僵蚕中药配方颗粒以及成方制剂(例如癫痫平片)。
本发明所述的其他僵蚕制品主要对应用僵蚕水提物以外的其他药物形态(例如僵蚕粉碎物)制备的中药产品，包括但不限于中风回春丸、乳癖散结胶囊、医痫丸和小儿七珍丸。
本发明的技术方案包括：
第一方面，本发明提供一种僵蚕特征多肽，所述僵蚕特征多肽包含氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的肽段(记作“肽段A”)或/和氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的肽段(记作“肽段B”)。
SEQ ID No.1：GGSVSSTGSSSNTDSSTK；
SEQ ID No.2：GHLGTVSSTGSTSNTDSSSK。
在其中一个示例中，所述氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的肽段，母离子的m/z为823.36，子离子的m/z为1070.47、1345.57。
在其中一个示例中，所述氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的肽段，母离子的m/z为637.29，子离子的m/z为825.36、926.40。
第二方面，本发明提供一种僵蚕、僵蚕水提物制品和其他僵蚕制品的鉴别方法，所述鉴别方法包括检测待鉴别样品中的僵蚕特征性成分的步骤，所述僵蚕特征性成分为如上所述的僵蚕特征多肽。
本发明所述的僵蚕特征性成分，是指相对于其他中药材来讲，僵蚕独有的成分。
在其中一个示例中，检测待鉴别样品中的僵蚕特征性成分的步骤包括：
分别取所述待鉴别样品以及所述僵蚕特征性成分，制备供试品溶液和对照品溶液；采用超高效液相色谱质谱联用法对所述供试品溶液和所述对照品溶液进行检测。
在其中一个示例中，所述超高效液相色谱质谱联用法中，超高效液相色谱的条件包括：
固定相：C18色谱柱；
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为含甲酸体积百分比为0.08％～0.12％的甲酸水溶液，洗脱方式采用梯度洗脱。
本发明所述的C18色谱柱包括但不限于菲罗门Titank C18色谱柱(1.7μm，2.1mm×150mm)。
在其中一个示例中，梯度洗脱的条件包括：0min～3min，所述流动相A的体积百分比为3％；3min～8min，所述流动相A的体积百分比由3％上升至5％；8min～10min，所述流动相A的体积百分比为5％；10min～18min，所述流动相A的体积百分比由5％上升至7％；18min～19min，所述流动相A的体积百分比由7％上升至90％；19min～21min，所述流动相A的体积百分比为90％。
在其中一个示例中，所述超高效液相色谱质谱联用法中，超高效液相色谱的条件还包括：柱温为28℃～32℃，例如28℃、29℃、30℃、31℃、32℃。
在其中一个示例中，所述超高效液相色谱质谱联用法中，超高效液相色谱的条件还包括：流速为0.25mL/min～0.35mL/min，例如为0.25mL/min、0.30mL/min、0.35mL/min。
在其中一个示例中，所述超高效液相色谱质谱联用法中，超高效液相色谱的条件还包括：进样量为4.5μL～5.5μL，例如为4.5μL、5μL、5.5μL。
在其中一个示例中，所述超高效液相色谱质谱联用法中，质谱的条件包括：电喷雾正离子模式；多反应监测扫描；毛细管电压：0.45kV～0.55kV(例如0.45kV、0.5kV、0.55kV)；离子源温度：480℃～520℃(例如480℃、490℃、500℃、510℃、520℃)；溶剂气流速：850L/hr～950L/hr(例如850L/hr、900L/hr、950L/hr)。
采用如上所述的检测条件具有以下优势：缩短检测时间，节省检测成本；质谱条件的优化，使其响应增加等。
在其中一个示例中，所述对照品溶液的制备包括如下步骤：取所述僵蚕特征性成分，用碳酸氢铵溶液溶解。
在其中一个示例中，所述碳酸氢铵溶液含碳酸氢铵的质量百分比为0.8％～1.2％，例如为0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％。
在其中一个示例中，所述供试品溶液的制备包括如下步骤：将待鉴别样品置于碳酸氢铵溶液中提取，收集提取液，加胰蛋白酶酶解。
在其中一个示例中，所述碳酸氢铵溶液含碳酸氢铵的质量百分比为0.8％～1.2％，例如为0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％。
可以理解的是，在制备供试品溶液的过程中，可以根据待鉴别样品的种类的不同，选择合适的制备条件，例如合适的提取方式(例如僵蚕药材和饮片可以采用回流提取的方式、僵蚕标准汤剂和炒僵蚕标准汤剂可以采用超声提取的方式等)、合适量的胰蛋白酶。
可以理解的是，所述僵蚕水提物制品包括但不限于：僵蚕标准汤剂、炒僵蚕标准汤剂、僵蚕中药配方颗粒、炒僵蚕中药配方颗粒和癫痫平片。
可以理解的是，所述其他僵蚕制品包括但不限于：中风回春丸、乳癖散结胶囊、医痫丸和小儿七珍丸。需要说明的是，本发明的鉴别方法所涉步骤没有顺序限制。
本发明中，僵蚕标准汤剂、炒僵蚕标准汤剂、金龟子虫标准汤剂、面包虫标准汤剂、龟甲标准汤剂、鸡内金标准汤剂、水蛭标准汤剂、蝉蜕标准汤剂、地龙标准汤剂、土鳖虫标准汤剂，制备工艺包括但不限于如下举例的工艺：
(1)僵蚕标准汤剂、炒僵蚕标准汤剂、金龟子虫标准汤剂、面包虫标准汤剂、水蛭标准汤剂、地龙标准汤剂、土鳖虫标准汤剂：取饮片100g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加8倍量水，浸泡60分钟后，武火(500W)煮沸后文火(200W)保持微沸30分钟，煎液经350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。第二次加6倍量水，武火加热煮沸后文火保持微沸25分钟，煎液用350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，合并两次煎液。将煎液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.10MPa)至150ml的浸膏；在磁力搅拌下，分装至10ml棕色西林瓶中，每瓶分装体积为2ml，半加塞，分装完后转移至真空冷冻干燥机中冻干，取出，轧上铝盖，即得。
(2)龟甲标准汤剂：取饮片100g，加水煎煮二次，第一次煎煮加8倍量水，浸泡30分钟，武火(功率500W)煮沸后改文火(功率200W)再煎煮60分钟，用200目筛趁热过滤，滤液迅速冷水冷却；第二次煎煮加6倍量水，武火(功率500W)煮沸后改文火(功率200W)再煎煮40分钟，用200目筛趁热过滤，滤液迅速冷水冷却；合并两次滤液，减压浓缩至体积约为100ml，分装至10ml西林瓶中，每瓶分装2ml，真空冷冻干燥，取出，轧铝盖，即得。
(3)鸡内金标准汤剂：取饮片100g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加入9倍量水，浸泡30分钟后，武火(功率500W)煮沸后文火(功率200W)保持微沸30分钟，煎液经350目筛网趁热滤过，滤液迅速用冷水冷却。第二次加7倍量水，武火(功率500W)煮沸后文火(功率200W)保持微沸25分钟，煎液用350目筛网趁热滤过，滤液迅速用冷水冷却，合并两次煎液。将煎液转移至圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.08MPa～-0.1MPa)，转速50～90转/分钟，浓缩至体积约为100ml；在磁力搅拌下，精密吸取煎液2ml均匀分装于10ml西林瓶中，转移至真空冷冻干燥机中冻干，取出，轧铝盖，即得。
(4)蝉蜕标准汤剂：取蝉蜕饮片100g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加入14倍量水，浸泡30分钟后，武火(功率500W)煮沸后文火(功率200W)保持微沸30分钟，煎液经350目筛网趁热滤过，滤液迅速用冷水冷却。第二次加12倍量水，武火(功率500W)煮沸后文火(功率200W)保持微沸25分钟，煎液用350目筛网趁热滤过，滤液迅速用冷水冷却，合并两次煎液。将煎液转移至圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.08MPa～-0.1MPa)，转速50～90转/分钟，浓缩至体积约为100ml；在磁力搅拌下，精密吸取流浸膏2ml均匀分装于10ml西林瓶中，转移至真空冷冻干燥机中冻干，取出，轧铝盖，即得。
下述实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。
实施例1、特征多肽的筛选和验证
1供试品溶液的制备
(1)参照如下方法分别制备僵蚕药材、僵蚕饮片、炒僵蚕饮片、金龟子虫鲜品、面包虫鲜品的供试品溶液：
取本品粉末约1g，精密称定，置锥形瓶中，加1％碳酸氢铵溶液50mL，称定重量，回流10min，取出，放冷，用1％碳酸氢铵溶液补足减失重量，摇匀。
用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液1mL，加胰蛋白酶溶液200μL(取序列分析用胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含1mg的溶液，临用时配制)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，作为供试品溶液。
(2)参照如下方法分别制备僵蚕标准汤剂、炒僵蚕标准汤剂的供试品溶液：
取本品粉末约0.1g，精密称定，置锥形瓶中，加1％碳酸氢铵溶液50mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，取出，放冷，用1％碳酸氢铵溶液补重，摇匀。
用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液1mL，加胰蛋白酶溶液50μL(取序列分析用胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含1mg的溶液，临用时配制)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，作为供试品溶液。
(3)参照如下方法制备僵蚕中药配方颗粒的供试品溶液：
取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置锥形瓶中，加1％碳酸氢铵溶液50mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)60min，取出，放冷，用1％碳酸氢铵溶液补重，摇匀。
用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液1mL，加胰蛋白酶溶液300μL(取序列分析用胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含1mg的溶液，临用时配制)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，作为供试品溶液。
(4)参照如下方法制备炒僵蚕中药配方颗粒的供试品溶液：
取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置锥形瓶中，加1％碳酸氢铵溶液50mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，取出，放冷，用1％碳酸氢铵溶液补重，摇匀。
用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液500μL，加胰蛋白酶溶液300μL(取序列分析用胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含1mg的溶液，临用时配制)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，作为供试品溶液。
2数据采集
采用Vanquish超高效液相色谱仪和Q-Exactive超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱组合式高分辨质谱仪(美国ThermoFisher公司)对样品进行质谱数据采集。
色谱条件和质谱条件如下：
色谱条件：色谱柱：Waters BEH C18色谱柱(1.7μm，2.1mm×150mm)；流动相：乙腈-0.1％甲酸水溶液，按表1进行梯度洗脱；柱温：30℃；流速：0.30mL/min；进样量：5μL。
表1、梯度洗脱表
质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI+)；鞘气流速：35Arb；辅助气流速：10Arb；喷雾电压：3.80kV；毛细管温度：350℃；检测器温度：350℃；碰撞能量：30％；FullMS+ddms2模式进行全扫描，PRM模式进行确认。
3多肽筛选
将所采集的质谱数据导入Proteome Discoverer 2.4分析软件，采用Uniprot_bombyx的数据库进行搜库匹配，筛选得到僵蚕的专属性多肽序列，多肽序列交于生物公司合成。多肽具体信息如下：
表2、两段多肽的序列及监测离子对
表3、多肽GGSVSSTGSSSNTDSSTK序列的离子匹配信息表
表4、多肽GHLGTVSSTGSTSNTDSSSK序列的离子匹配信息表
#1 b+ b2+ b3+ Seq. y+ y2+ y3+ #2
1 58.02874 29.51801 20.01443 G / / / 20
2 195.08765 98.04746 65.70074 H 1852.85190 926.92959 618.28882 19
3 308.17172 154.58950 103.39542 L 1715.79299 858.40013 572.60252 18
4 365.19318 183.10023 122.40258 G 1602.70893 801.85810 534.90783 17
5 466.24086 233.62407 156.08514 T 1545.68746 773.34737 515.90067 16
6 565.30927 283.15827 189.10794 V 1444.63979 722.82353 482.21811 15
7 652.34130 326.67429 218.11862 S 1345.57137 673.28932 449.19531 14
8 739.37333 370.19030 247.12929 S 1258.53934 629.77331 420.18463 13
9 840.42101 420.71414 280.81185 T 1171.50732 586.25730 391.17396 12
10 897.44247 449.22487 299.81901 G 1070.45964 535.73346 357.49140 11
11 984.47450 492.74089 328.82968 S 1013.43817 507.22272 338.48424 10
12 1085.52218 543.26473 362.51224 T 926.40614 463.70671 309.47357 9
13 1172.55421 586.78074 391.52292 S 825.35847 413.18287 275.79101 8
14 1286.59713 643.80220 429.53723 N 738.32644 369.66686 246.78033 7
15 1387.64481 694.32604 463.21979 T 624.28351 312.64539 208.76602 6
16 1502.67175 751.83952 501.56210 D 523.23583 262.12155 175.08346 5
17 1589.70378 795.35553 530.57278 S 408.20889 204.60808 136.74115 4
18 1676.73581 838.87154 559.58345 S 321.17686 161.09207 107.73047 3
19 1763.76784 882.38756 588.59413 S 234.14483 117.57605 78.71980 2
20 / / / K 147.11280 74.06004 49.70912 1
4验证
按照上表的信息，将筛选到的上述肽段和人工合成肽段用PRM模式进行确认，得到二级质谱图。
通过对比人工合成肽段与样品筛选肽段的相同质荷比下的保留时间和二级离子碎片，结果显示上述2段特征多肽的保留时间和二级离子碎片均能与人工合成的一一对应，表明了所筛选多肽的序列均为正确序列。见图1和图2。
实施例2、特征多肽的验证和样品测定
1供试品溶液的制备
(1)参照如下方法分别制备僵蚕药材、僵蚕饮片、炒僵蚕饮片、金龟子虫药材、面包虫药材、龟甲药材、鸡内金药材、水蛭药材、蝉蜕药材、地龙药材、土鳖虫药材的供试品溶液：
取本品粉末约1g，精密称定，置锥形瓶中，加1％碳酸氢铵溶液50mL，称定重量，回流10min，取出，放冷，用1％碳酸氢铵溶液补足减失重量，摇匀。
用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液1mL，加胰蛋白酶溶液200μL(取序列分析用胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含1mg的溶液，临用时配制)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，作为供试品溶液。
(2)参照如下方法分别制备僵蚕标准汤剂、炒僵蚕标准汤剂、金龟子虫标准汤剂、面包虫标准汤剂、龟甲标准汤剂、鸡内金标准汤剂、水蛭标准汤剂、蝉蜕标准汤剂、地龙标准汤剂、土鳖虫标准汤剂的供试品溶液：
取本品粉末约0.1g，精密称定，置锥形瓶中，加1％碳酸氢铵溶液50mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，取出，放冷，用1％碳酸氢铵溶液补重，摇匀。
用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液1mL，加胰蛋白酶溶液50μL(取序列分析用胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含1mg的溶液，临用时配制)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，作为供试品溶液。
(3)参照如下方法制备僵蚕中药配方颗粒的供试品溶液：
取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置锥形瓶中，加1％碳酸氢铵溶液50mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)60min，取出，放冷，用1％碳酸氢铵溶液补重，摇匀。
用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液1mL，加胰蛋白酶溶液300μL(取序列分析用胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含1mg的溶液，临用时配制)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，作为供试品溶液。
(4)参照如下方法制备炒僵蚕中药配方颗粒的供试品溶液：
取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置锥形瓶中，加1％碳酸氢铵溶液50mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，取出，放冷，用1％碳酸氢铵溶液补重，摇匀。
用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液500μL，加胰蛋白酶溶液300μL(取序列分析用胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含1mg的溶液，临用时配制)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，作为供试品溶液。
(5)参照如下方法制备成方制剂(中风回春丸、乳癖散结胶囊、医痫丸、癫痫平片、小儿七珍丸)的供试品溶液：
取本品粉末约5g，精密称定，置锥形瓶中，加1％碳酸氢铵溶液25mL，称定重量，回流30min，取出，放冷，用1％碳酸氢铵溶液补足减失重量，摇匀。
用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液500μL，加胰蛋白酶溶液50μL(取序列分析用胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含1mg的溶液，临用时配制)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，作为供试品溶液。
2对照品溶液的制备
取肽段A和肽段B对照品适量，精密称定，加1％碳酸氢铵溶液分别制成每1ml含2μg的混合对照品溶液。
3色谱和质谱条件
采用Waters Xevo TQ-S Micro三重四极杆液质联用仪(沃特世公司)对样品进行测定。色谱条件和质谱条件如下：
色谱条件：色谱柱：菲罗门Titank C18色谱柱(1.7μm，2.1mm×150mm)；流动相：乙腈-0.1％甲酸水溶液，按下表进行梯度洗脱；柱温：30℃；流速：0.30mL/min；进样量：5μL。
表5、梯度洗脱表
质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI+)；MRM模式，即多反应监测扫描(multireaction monitoring)；毛细管电压：0.50kV；离子源温度：500℃；溶剂气流速：900L/hr。锥孔电压和碰撞能量如下表。
表6、监测离子对的碰撞能量和锥孔电压
4方法学验证(以炒僵蚕中药配方颗粒验证本发明鉴别方法)
(1)专属性考察
称取炒僵蚕中药配方颗粒适量，按“1供试品溶液的制备”项下方法制备成炒僵蚕中药配方颗粒供试品溶液；取空白溶剂，按照相同的方法制成缺炒僵蚕中药配方颗粒的空白溶剂溶液；再按照“2对照品溶液的制备”项下配制方法配制对照品溶液。
精密吸取供试品溶液、对照品溶液和空白溶剂溶液各5μl，注入液质联用仪，按照“3色谱与质谱条件”项下进行分析，结果见图3和图4。
结果显示：缺炒僵蚕中药配方颗粒的空白溶剂供试品溶液图谱在与肽段A和肽段B对照品色谱相应的保留时间处未检出特征离子峰，表明空白溶剂对方法中特征离子对的检出无干扰，方法具有专属性。
(2)仪器精密度考察
精密吸取“2对照品溶液的制备”项下制备的对照品溶液，按照“3色谱与质谱条件”项下色谱条件和质谱条件重复进样6次，记录峰面积，计算峰面积RSD值，结果见表7。
表7、仪器精密度结果表
结果显示，同一份对照品溶液连续进样6次，2对特征离子对保留时间和峰面积RSD值均小于3％，表明仪器精密度良好。
(3)稳定性考察
取炒僵蚕中药配方颗粒适量，按“1供试品溶液的制备”项下方法制备炒僵蚕中药配方颗粒供试品溶液，分别在0，2，5，8，10，12小时精密吸取5μl注入液质联用仪，按“3色谱与质谱条件”项下条件进行测定，以离子对的峰面积对溶液稳定性进行评价，测定结果见表8。
表8、稳定性考察结果
结果显示，供试品溶液在0，2，5，8，10，12小时分别进样，2对特征离子对峰面积RSD值范围在1.27％～4.41％，均小于5％，说明供试品溶液在12小时内稳定性良好。
(4)重复性考察
取同一批炒僵蚕中药配方颗粒约0.5g，精密称定，平行称定6份，按“1供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液6份。按“3色谱与质谱条件”项下条件测定，计算“峰面积/称样量”比值的RSD值，测定结果见表9。
表9、重复性考察结果
结果显示，同一批样品重复测定6次，“峰面积/称样量”比值的RSD值均小于5％，表明该方法重复性良好。
(5)耐用性考察
①不同色谱柱考察
比较了菲罗门Titank C18色谱柱(2.1mm×150mm,1.7μm)；Waters BEH C18色谱柱(2.1mm×150mm,1.7μm)；岛津Shim-pack C18-AQ色谱柱(2.1mm×150mm，1.9μm)3种不同品牌和类型的色谱柱对炒僵蚕中药配方颗粒特征离子峰的检出影响。
取炒僵蚕中药配方颗粒适量，按“2对照品溶液的制备”项下确定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取5μl注入液质联用仪，按“3色谱与质谱条件”项下条件进行测定，实验结果见表10。
表10、炒僵蚕中药配方颗粒不同色谱柱耐用性考察结果
注：1#色谱柱为菲罗门Titank C18色谱柱；
2#色谱柱为Waters BEH C18色谱柱；
3#色谱柱为岛津Shim-pack C18-AQ色谱柱
结果显示：所使用的3种色谱柱均能明显检出规定的两对特征离子对，表明不同牌子和型号的色谱柱对炒僵蚕中药配方颗粒的特征离子的检出鉴别无影响。
②不同柱温考察
比较30℃、28℃、32℃不同柱温对炒僵蚕中药配方颗粒特征离子峰的检出影响。
取炒僵蚕中药配方颗粒适量，按“1供试品溶液的制备”项下确定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取5μl注入液质联用仪，按“3色谱与质谱条件”项下条件进行测定，实验结果见表11。
表11、炒僵蚕中药配方颗粒不同柱温耐用性考察峰面积结果
结果显示：使用3个不同的柱温条件均能明显检出规定的两对特征离子对，表明柱温的小范围调整对炒僵蚕中药配方颗粒的特征离子的检出鉴别无影响。
③不同流速考察
比较0.30mL/min、0.27mL/min、0.33mL/min不同流速对炒僵蚕中药配方颗粒特征离子峰的检出影响。
取炒僵蚕中药配方颗粒(CG2012024)适量，按“1供试品溶液的制备”项下确定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取5μl注入液质联用仪，按“3色谱与质谱条件”项下条件进行测定，实验结果见表12。
表12、炒僵蚕中药配方颗粒不同流速耐用性考察峰面积结果
结果显示：使用3个不同的流速条件均能明显检出规定的两对特征离子对，表明流速的小范围调整对炒僵蚕中药配方颗粒的特征离子的检出鉴别无影响。
(6)小结
综上，对炒僵蚕中药配方颗粒质谱鉴别分析方法进行了专属性考察，特征峰不受溶剂峰干扰，方法专属；对方法的进样精密度、溶液稳定性和重复性进行了验证，结果均符合相应的要求。并对方法的耐用性进行了考察，表明不同色谱柱、不同流速以及小范围的柱温变动，对各色谱峰相对保留时间波动较小，方法的耐用性良好。
4样品测定-不同物种
由图5至图7可见，僵蚕药材及标准汤剂呈现与对照品一致的色谱峰，面包虫、金龟子虫、龟甲、鸡内金、水蛭、蝉蜕、地龙、土鳖虫的药材及标准汤剂在僵蚕的相应保留时间无色谱峰，说明所找到的两段肽段为僵蚕的特征多肽，可用于区别形态接近的动物和其他动物药。
5样品测定-僵蚕及其制品
由图8至图10可见，僵蚕药材、僵蚕饮片、僵蚕标准汤剂、僵蚕中药配方颗粒、炒僵蚕饮片、炒僵蚕标准汤剂、炒僵蚕中药配方颗粒呈现与对照品一致的色谱峰，表明所检测的两对离子对存在于僵蚕炮制品、含僵蚕的标准汤剂和中药配方颗粒中。
从药店购买中风回春丸、乳癖散结胶囊、医痫丸、癫痫平片和小儿七珍丸等含有僵蚕，并且采用原粉入药或水提工艺的成方制剂，采用所建立的僵蚕质谱鉴别方法进行检测，结果见图11和图12。结果显示，在这5种成方制剂中，均能检测出僵蚕成分，表明所建立的质谱鉴别方法能用于僵蚕及其制品中僵蚕成分的检测。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
序列表
<110> 广东一方制药有限公司
<120> 僵蚕特征多肽以及僵蚕、僵蚕水提物制品和其他僵蚕制品的鉴别方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 僵蚕(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Gly Gly Ser Val Ser Ser Thr Gly Ser Ser Ser Asn Thr Asp Ser Ser
1 5 10 15
Thr Lys
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 僵蚕(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Gly His Leu Gly Thr Val Ser Ser Thr Gly Ser Thr Ser Asn Thr Asp
1 5 10 15
Ser Ser Ser Lys
20

Claims (6)

1.一种僵蚕、僵蚕水提物制品以及其他僵蚕制品的鉴别方法，其特征在于，所述鉴别方法包括检测待鉴别样品中的僵蚕特征性成分的步骤，所述僵蚕特征性成分为僵蚕特征多肽；
所述僵蚕特征多肽包含氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的肽段和氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示的肽段；
检测待鉴别样品中的僵蚕特征性成分的步骤包括：
分别取所述待鉴别样品以及所述僵蚕特征性成分，制备供试品溶液和对照品溶液；采用超高效液相色谱质谱联用法对所述供试品溶液和所述对照品溶液进行检测；
所述超高效液相色谱质谱联用法中，超高效液相色谱的条件包括：
固定相：C18色谱柱；
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为含甲酸体积百分比为0.08%～0.12%的甲酸水溶液，洗脱方式采用梯度洗脱；
梯度洗脱的条件包括：
0min～3min，所述流动相A的体积百分比为3%；
3min～8 min，所述流动相A的体积百分比由3%上升至5%；
8min～10 min，所述流动相A的体积百分比为5%；
10min～18 min，所述流动相A的体积百分比由5%上升至7%；
18min～19 min，所述流动相A的体积百分比由7%上升至90%；
19min～21min，所述流动相A的体积百分比为90%；
所述超高效液相色谱质谱联用法中，超高效液相色谱的条件还包括：柱温为28℃～32℃；流速为0.25 mL/min～0.35mL/min；进样量为4.5μL～5.5μL；
所述超高效液相色谱质谱联用法中，质谱的条件包括：电喷雾正离子模式；多反应监测扫描；毛细管电压：0.45kV～0.55 kV；离子源温度：480℃～520℃；溶剂气流速：850L/hr～950 L/hr。
2.根据权利要求1所述的僵蚕、僵蚕水提物制品以及其他僵蚕制品的鉴别方法，其特征在于，SEQ ID No.1所示的肽段，母离子的m/z为823.36，子离子的m/z为1070.47、1345.57；SEQ ID No.2所示的肽段，母离子的m/z为637.29，子离子的m/z为825.36、926.40。
3.根据权利要求1或者2所述的僵蚕、僵蚕水提物制品以及其他僵蚕制品的鉴别方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备包括如下步骤：取所述僵蚕特征性成分，用碳酸氢铵溶液溶解。
4.根据权利要求3所述的僵蚕、僵蚕水提物制品以及其他僵蚕制品的鉴别方法，其特征在于，所述碳酸氢铵溶液含碳酸氢铵的质量百分比为0.8%～1.2%。
5.根据权利要求1、2以及4任一项所述的僵蚕、僵蚕水提物制品以及其他僵蚕制品的鉴别方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备包括如下步骤：将待鉴别样品置于碳酸氢铵溶液中提取，收集提取液，加胰蛋白酶酶解。
6.根据权利要求5所述的僵蚕、僵蚕水提物制品以及其他僵蚕制品的鉴别方法，其特征在于，所述碳酸氢铵溶液含碳酸氢铵的质量百分比为0.8%～1.2%。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114113376B (zh) * 2021-11-10 2023-08-29 广东一方制药有限公司 僵蚕特征多肽以及僵蚕、僵蚕水提物制品和其他僵蚕制品的鉴别方法
CN115290782A (zh) * 2022-08-01 2022-11-04 北京振东光明药物研究院有限公司 含水蛭、全蝎、僵蚕和/或土鳖虫的制剂的鉴别方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105683373A (zh) * 2013-10-25 2016-06-15 国立研究开发法人农业生物资源研究所 外源性基因表达增强剂
CN107118266A (zh) * 2017-04-13 2017-09-01 上海交通大学 一种具有α‑糖苷酶抑制活性的丝胶肽及其制备与应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9933416B1 (en) * 2013-07-30 2018-04-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Detection and quantification of polypeptides in plants without a reference standard by mass spectrometry
CN106048020A (zh) * 2016-06-15 2016-10-26 中国医学科学院药用植物研究所 动物药材僵蚕的基因身份证
US20180011107A1 (en) * 2016-07-07 2018-01-11 Genysis Lab Inc. Identification of the presence of specific polypeptides by liquid chromatography and mass spectrometry
CN107164471B (zh) * 2017-05-18 2020-08-07 华南农业大学 一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法
CN109521132A (zh) * 2018-11-16 2019-03-26 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 一种僵蚕hplc指纹图谱的建立方法
CN109521110A (zh) * 2018-11-16 2019-03-26 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 一种基于hplc指纹图谱评价僵蚕僵化程度的方法
CN110824032B (zh) * 2019-09-26 2021-10-01 成都中医药大学 一种僵蚕及其伪品的指纹图谱鉴别方法
CN114113376B (zh) * 2021-11-10 2023-08-29 广东一方制药有限公司 僵蚕特征多肽以及僵蚕、僵蚕水提物制品和其他僵蚕制品的鉴别方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105683373A (zh) * 2013-10-25 2016-06-15 国立研究开发法人农业生物资源研究所 外源性基因表达增强剂
CN107118266A (zh) * 2017-04-13 2017-09-01 上海交通大学 一种具有α‑糖苷酶抑制活性的丝胶肽及其制备与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Comparative Proteome Analysis of Multi- Layer Cocoon of the Silkworm, Bombyx mori;Yan Zhang等;《PLOS ONE》;第10卷(第4期);第1-14页 *

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