CN102269742A - 一种鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的超高效液相色谱方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用超高效液相色谱技术快速鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法。解决针对小麦种子贮藏蛋白中的高分子量谷蛋白亚基进行快速、准确的鉴定，优化超高效液相色谱的流动相条件和添加成分、色谱条件参数和色谱柱冲洗程序。本发明方法不仅可以快速的对不同小麦品种的高分子量亚基组成进行鉴定，而且可以准确鉴定出HPLC方法无法分离鉴定的高分子量谷蛋白亚基。本发明方法能对小麦品质以及杂交早期世代优质贮藏蛋白亚基进行快速、准确的鉴定与筛选。

Description

一种鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的超高效液相色谱方法及其应用

技术领域

本发明涉及小麦高分子量谷蛋白亚基的鉴定方法，特别是涉及通过超高效液相色谱（UPLC）技术对小麦高分子量谷蛋白亚基进行快速鉴定的方法。

背景技术

小麦的品质受诸多因素的综合影响，如生长环境、农艺措施和内在的基因型等，这些因素决定了小麦蛋白质的含量和质量。其中，蛋白质含量属于数量性状，主要受环境和农艺措施的影响；而蛋白质质量则属于质量性状，主要受基因型控制。麦谷蛋白的组成、含量及不同亚基的比例与小麦面粉的加工品质密切相关，尤其是高分子量谷蛋白亚基，其不同的编码位点、不同的亚基组成和不同的表达量对小麦的加工品质均有重要影响。

Payne等（1979）首先发现1Ax1与小麦面包的品质相关，随后国内外科研工作者对高分子量谷蛋白亚基与小麦加工品质的关系进行了大量的研究。高分子量谷蛋白是由三个基因位点编码的：Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1，这三个编码位点对小麦加工品质的影响各不相同。Lawrence等于1998年利用小麦不同位点的缺失体，研究了三个位点的品质效应，结果表明，Glu-D1和Glu-B1位点缺失的品系对小麦品质的影响要明显大于Glu-A1位点缺失的品系，并推断这是因为Glu-D1和Glu-B1位点编码的亚基数目较多的缘故。小麦高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）这三个位点对面筋强度和稳定性的影响按照由强到弱的顺序依次是：Glu-D1、Glu-B1和Glu-A1（Cornish et al，2001）。 Kolster等（1991）的研究也表明，Glu-D1、Glu-A1 × Glu-D1和Glu-B1 × Glu-D1对面包的体积均具有极其显著的影响，同时Glu-D1具有上位效应，如Glu-A1的1和2*亚基只有在与Glu-D1的5+10同时存在时才优于Glu-A1的null。

很多研究发现，不同的亚基组合对小麦面包的加工品质的影响各不相同。Branlard 等(Branlard G, Dardevet M (1985) Diversity of grain protein andbread wheat quality. II. Correlation between high molecular subunits of glutenin and flour quality characteristics. J Cereal Sci 3: 345-354. Branlard G, Dardevet M, Saccomano R, Lagoutte F, Gourdon J (2001) Genetic diversity of wheat storage proteins and bread wheat quality. Euphytica 119: 59-67.)的研究显示，2*、5 + 10、7 + 9 亚基与面筋强度和韧度呈正相关；2 + 12 亚基与面筋强度和韧度呈负相关；Glu-B1位点各亚基组合的作用大小为13+16＞=17+18＞=7+9=7+8=7=6+8。毛沛等(小麦遗传资源HMW麦醇溶蛋白亚基组成及其与面包烘烤品质关系的研究。中国农业科学1985, 28：22-27.)的研究表明，在10个常见的亚基组合中，Null，7 +9，5 + 10；Null，7 + 8，5 + 10；1，7 + 9，5 + 10 和 1，7 + 8，5 +10 组合的品质性状最好。许自成等 (许自成，段国新（1998）对小麦不同HMW麦谷蛋白亚基评分系统的评价。粮食储藏 1：76-82.)的研究认为，5+10亚基对小麦品质的贡献明显高于其它亚基，其次是7+8，2* 和 4+12亚基，而 6+8，2+12，20，Null亚基的作用较小。最近，国内一些研究结果表明，1Bx14+1By15 亚基组合同优良的面包加工品质呈正相关，一些研究中1Bxl4+1By15亚基组合的沉降值甚至高于1Bx7 +1By8亚基组合（Zhang 等，2002a，2002b；Song 等，2003）(Zhang XY, Pang BS, You G.X, Wang LF, Jia JZ, Dong YC (2002a) Allelic variation and genetic diversity at Glu-1 loci in Chinese wheat (Triticum aestivum L.) germplasms. Agri Sci in China 1: 1302-1310. Zhang XY, Dong YC, You GX, Wang LF, Li P, Jia JZ (2002b) Allelic variation of Glu-A1, Glu-B1, Glu-D1 in Chinese released wheat varieties in the last 50 years. Agri Sci in China 1: 36-44. Song J, Wu X, Liu J, Liu A, Zhao Z, Liu G (2003) Study on quality scoring system assessed by wheat high-molecular-weight glutenin subunits. Acta Agron Sinica 29: 829-834.)。刘丽等 (刘丽，何中虎，于亚雄，杨金华，程耿，胡银星（2003）小麦谷蛋白研究进展。西南农业学报 16：54-61.)的研究还发现，1Bx13+1By16、1Bx4+1By12亚基组合对小麦品质的评定也具有重要作用，其中1Bx4+1By12亚基组合的评分仅次于1Dx5+1Dy10亚基组合。另外，1Bx7+1By9以及1Bx14+1By15亚基组合对面包烘烤品质也有正向效应。此外，还发现亚基表达量的不同也会造成小麦品质的差异（Kolster和Vereiken，1993）(Kolster P, Vereiken JM (1993) Evaluating HMW glutenin subunits to improve breadmaking quality of Wheat. Cereal Food Worlds 38: 76-82.)。例如，1Dx5+1Dy10比1Ax1对小麦品质的影响较大，1Bx7+1By8和1Bx7+1By9比1Bx7有较好的品质效应，这些都是由于表达的亚基数量多，致使HMW-GS的总量增加。1Bx7亚基的过量表达也被证明能增加面筋的强度，提高小麦的加工品质。

谷蛋白的亚基组成对小麦的品质具有重要的影响。SDS-PAGE是迄今为止最为常用的鉴定高分子量谷蛋白亚基的方法，但是由于部分条带的迁移距离非常相近，不能鉴定全部的蛋白亚基，而且染色条带只能定性观察，无法进行蛋白定量分析。另外，SDS-PAGE分离时间长，一般需要一两天，而超高效液相色谱（UPLC）只需要30分钟，具有明显的优势。高效毛细管电泳（HPCE）分离速度快，重复性也好，但是有一些分子量相近的亚基无法区分，例如Glu-1Dy10和 Glu-1Dy12（Gao 等，2010）(Gao LY, Ma WJ, Chen J, Wang K, Li J, Wang SL, Bekes F, Appels R, Yan YM (2010) Characterization and Comparative Analysis of Wheat High Molecular Weight Glutenin Subunits by SDS-PAGE, RP-HPLC, HPCE, and MALDI-TOF-MS. J Agri Food Chem 58: 2777–2786.)。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱法（MALD I-TOF-MS）具有操作简便、省样品、测定时间短、灵敏、快速、准确和测定质量范围大等特点，在测定生物大分子和合成高聚物应用方面有特殊的优越性；但是对样品前期处理的要求很高，而且质谱仪器极为昂贵，难以广泛应用。反相高效液相色谱（RP-HPLC）虽然可以进行蛋白的定量分析，克服SDS-PAGE的一些弱点，但是对疏水性相近的亚基却无法分开（Dong 等，2009）(Dong K, Hu CY, Wang AL, Cai MH, Yan YM (2009) Characterization of HMW glutenin subunits in bread and tetraploid wheats by reversed-phase high-performance liquid chromatography. Cereal Res Commun 37: 65-72.)。

发明内容

最近发展起来的超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC）具有更小的柱子粒径，可以使谷蛋白的分离更快速、更高效，另外，其分析灵敏度也好，可以减少进样量、节省溶剂，在谷蛋白的分离分析上具有很大的优势。

目前使用的UPLC为Waters公司开发的，通过采用小颗粒色谱柱实现了对高效液相色谱（HPLC）技术瓶颈的突破。与HPLC相比，UPLC方法具有以下几个明显的优势：分辨度高，提高柱效40%-70%；速度快，理论上可以提高9倍；灵敏度高，可提高3倍。

本发明的目的是提供一种利用超高效液相色谱技术快速鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，解决针对小麦种子贮藏蛋白中的高分子量谷蛋白亚基进行快速、准确的鉴定，优化超高效液相色谱的流动相条件和添加成分、色谱条件参数和色谱柱冲洗程序。

具体的，本发明方法包括样品制备、超高效液相色谱分析和数据处理分析，其中样品制备在于用溶解液溶解小麦高分子量谷蛋白亚基，溶解液的组成为：以溶解液体积为计量基准，溶解液中乙腈的体积百分含量为溶解液体积的15-50%（具体可为21%），TFA的体积百分含量为溶解液体积的0.1%，其余为水。以上述溶解液来溶解小麦谷蛋白可以使蛋白和流动相混合得更好。

超高效液相色谱分析谷蛋白所需的流动相溶液为：

溶液A：0.1%体积百分含量的三氟乙酸（TFA）水溶液；

溶液B：含0.1%体积百分含量三氟乙酸（TFA）的乙腈（色谱级）溶液；

溶液C：10%体积百分含量的乙腈（色谱级）水溶液（溶液C主要用于进样前、后清洗针头）；

纯水均取自Milli-Q Gradient A10；

上述各溶液配好后，混匀，室温条件下70%功率超声10分钟。

虽然超高效液相色谱仪器自身有排气系统，但是色谱级的溶剂排除气泡，可以避免压力过高的现象发生，保护色谱柱，延长色谱柱寿命，帮助实验连续有效的进行。

超高效液相色谱的具体条件参数为：

流动相流速：0.6 mL/min；

色谱柱温度：60℃；

样品室温度：4℃；

流动相洗脱梯度：0-30min，洗脱梯度21%-47%；

所述流动相为溶液A和溶液B的混合液，洗脱梯度的变化是溶液B占流动相总体积的百分数。

洗脱时间：30 min。

为了能够连续检测样品和保证检测结果的准确性，在进行超高效液相色谱分析时要注意以下几个方面：1）进样前对色谱柱进行冲洗；2）当测定多个样品时，两次样品检测之间要用一定比例的流动相进行冲洗；3）检测结束后对色谱柱进行冲洗。

对色谱柱进行冲洗必须按如下的冲洗程序操作，具体条件参数为：

流动相流速：0.6 mL/min；

色谱柱温度：60℃；

样品室温度：4℃；

冲洗色谱柱的流动相梯度：0-15min，洗脱梯度5%-95%；15-20min，洗脱梯度95%-21%；

所述流动相为溶液A和溶液B的混合液，洗脱梯度的变化是溶液B占流动相总体积的百分数。

通过本发明方法可以建立标准HMW-GS超高效液相色谱图谱，进而形成对优质亚基进行鉴定的一套完整的技术体系。

本发明方法的优点在于：

（1）样品用量少：本发明方法只需要单粒种子20-30mg胚乳面粉，即可进行10次以上重复分析。另外，所提取的蛋白质干样可以长期保存而不影响分离效果。

（2）分离时间短：利用本发明方法，单个样品一般在30 min可以分离完成，而常规的SDS-PAGE方法一般需要1-2天时间，RP-HPLC方法也需要60 min。

（3）分离亚基的分辨度高，易于应用：酸性毛细管电泳（A-CE）或SDS-PAGE条件下，多数HMW-GS表现为一个主峰和1-3个副峰，干扰亚基的准确鉴定。理论上，UPLC技术每米理论塔板数远远高于RP-HPLC和SDS-PAGE方法。本发明方法可以对目前所鉴定的优质HMW谷蛋白亚基进行快速分离和鉴定，包括一些SDS-PAGE、CE和HPLC方法难以区分的亚基。

（4）重复性好：利用本发明方法可以获得高重复性分离。各重复间峰迁移时间和峰高的相对标准偏差（RSD）分别小于1%和3%，无明显的峰拖尾现象。

（5）分离自动化程度高：超高效液相色谱从进样到结果分析自动化程度高，简便易于操作，这是传统SDS-PAGE方法所无法比拟的。

（6）分析成本低：相对于传统的RP-HPLC和SDS-PAGE方法，本发明方法所需试剂的用量大大减少，而且不需要使用丙烯酰胺等有毒药品。因此，本发明方法是一种分析成本低、无毒害的分析方法。

通过反复摸索，本发明建立了一套利用UPLC技术鉴定不同小麦品种高分子量谷蛋白亚基的方法。不仅可以快速的对不同小麦品种的高分子量亚基组成进行鉴定，而且可以准确鉴定出HPLC方法无法分离鉴定的高分子量谷蛋白亚基。本发明方法能对小麦品质以及杂交早期世代优质贮藏蛋白亚基进行快速、准确的鉴定与筛选。

附图说明

图1为高产优质小麦品种郑麦9023 (N，7+8，2+12)高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）的超高效液相色谱连续10次分离重复性比较图谱。

图2A为小麦品种Hortag（1，17+18，5+10）高分子量谷蛋白亚基的UPLC标准图谱。

图2B为小麦品种Imbross（1，14+15，2+12）高分子量谷蛋白亚基的UPLC标准图谱。

图2C为斯卑尔特小麦品种Spelt 80（N, 7+9, 5+10）高分子量谷蛋白亚基的UPLC标准图谱。

图2D为斯卑尔特小麦品种Spelt127（1, 6.1, 2+12）高分子量谷蛋白亚基的UPLC标准图谱。

具体实施方式

小麦品种郑麦9023（张子福，王春峰：优质小麦郑麦9023栽培技术，安徽农业，2003年第10期，22）（河南农业科学院小麦研究所提供）、小麦品种Hortag（何中虎、晏月明：中国小麦品种品质评价体系建立与分子改良技术研究，中国农业科技出版社，2005）（中国农业科学院提供）、小麦品种Imbross（GAO LIYAN, WUJUN MA, JING CHEN, KE WANG, JING LI, SHUNLI WANG, FRANK BEKES, RUDI APPELS, AND YUEMING YAN*: Characterization and Comparative Analysis of Wheat High Molecular Weight Glutenin Subunits by SDS-PAGE, RP-HPLC, HPCE, and MALDI-TOF-MS, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2010, 58: 2777–2786）（由德国慕尼黑工业大学提供）、斯卑尔特小麦品种Spelt 80和Spelt 127（An, X. L., Y. M. Yan*,Y. H. Xiao, Q. Y. Li, S. L. K. Hsam and F. J. Zeller, Genetic diversity of European spelt wheat (Triticum spelta L.) revealed by glutenin subunit variations at Glu-1 and Glu-3 loci. Euphytica, 2005, 146(3): 193-201）（由德国慕尼黑工业大学提供），上述生物材料都是国内外免费发放的小麦品种，研究机构都有收藏，可以自由用于科学研究。

实施例1、利用超高效液相色谱鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基

1、材料取样

以小麦品种郑麦9023的种子作为试验材料，随机选取种子，加液氮研磨后称取20-30mg用于谷蛋白提取和超高效液相色谱分析。

2、样品制备

高分子量谷蛋白亚基 (HMW-GS) 的提取方法：

1）取上述品种的小麦种子，加液氮磨碎后称取30mg粉末放入1.5ml离心管中，加入1ml 70%体积百分含量的乙醇，涡旋45 min，13000 rpm离心10 min，去上清；

2）在步骤1）的沉淀中加1 ml 55%体积百分含量的异丙醇，65℃水浴30 min (期间手动震荡三次)，13000 rpm离心10 min，去上清并用滤纸吸干，重复3次；

3）在步骤2）的沉淀中加入100 μl溶液D（以溶液D的体积为计量基准，溶液D中异丙醇的体积百分含量为50%、二硫苏糖醇（DTT）的体积百分含量为1%，还含有终浓度为1M的 pH8.0的Tris-HCl），涡旋混匀，65℃水浴30 min (期间手动震荡三次)；

4）在步骤3）的溶液中加入100 μl溶液E（以溶液E的体积为计量基准，溶液E中异丙醇的体积百分含量为50%、4-乙烯吡啶的体积百分含量为1.4%，还含有终浓度为1M的 pH8.0的Tris-HCl），混匀，65℃水浴30 min (期间手动震荡三次)，13000 rpm离心15 min，取上清；

5）在步骤4）的上清液中加入-20℃预冷的纯丙酮，使丙酮的终浓度为60%，-20℃沉淀过夜，13000 rpm离心15 min，弃上清；

6）在步骤5）的沉淀中加入-20℃预冷的100%分析纯丙酮，将谷蛋白沉淀重悬洗涤，13000rpm离心10分钟，弃上清，重复1次；

7）在步骤6）的沉淀中加入100%分析纯乙醇，将谷蛋白沉淀重悬洗涤，13000rpm离心10分钟，弃上清，室温条件下干燥，获得谷蛋白沉淀；

8）按照1mg谷蛋白沉淀加入7µl溶解液（溶解液的组成为：以溶解液体积为计量基准，溶解液中乙腈的体积百分含量为溶解液体积的21%，三氟乙酸（TFA）的体积百分含量为溶解液体积的0.1%，其余为纯水）的比例充分混合，直到溶解为止（通常要一个晚上）；溶解后4℃条件下，13000rpm离心10分钟，即可进行超高效液相色谱分析。也可将沉淀在-20℃条件下保存备用。

3、超高效液相色谱（UPLC）

仪器设备：Waters公司生产的超高效液相色谱系统（配有软件用于系统操作和数据处理）。所用色谱柱为：ACQUITY UPLC™ BEH 300 C18 1.7 μm, 2.1 mm x 50 mm。

所用试剂：

溶液A：0.1%体积百分含量的三氟乙酸（TFA）水溶液；

溶液B：含0.1%体积百分含量三氟乙酸（TFA）的乙腈（色谱级）溶液；

溶液C：10%体积百分含量的乙腈（色谱级）水溶液；

纯水均取自Milli-Q Gradient A10；

上述各溶液配好后，混匀，室温条件下70%功率超声10分钟。

虽然超高效液相色谱仪器自身有排气系统，但是色谱级的溶剂排除气泡，可以避免压力过高的现象发生，保护色谱柱，延长色谱柱寿命，帮助实验连续有效的进行。

超高效液相色谱的具体条件参数为：

流动相流速：0.6 mL/min；

色谱柱温度：60℃；

样品室温度：4℃；

流动相洗脱梯度：0-30min，洗脱梯度21%-47%；

流动相为溶液A和溶液B的混合液，洗脱梯度的变化是溶液B占流动相总体积的百分数；溶液C主要用于进样前后清洗针头；

洗脱时间：30 min。

为了能够连续检测样品和保证检测结果的准确性，在进样前需要对色谱柱用一定比例的流动相进行冲洗，具体的色谱柱冲洗条件参数为：

流动相流速：0.6 mL/min；

色谱柱温度：60℃；

样品室温度：4℃；

冲洗色谱柱的流动相梯度：0-15min，洗脱梯度5%-95%；15-20min，洗脱梯度95%-21%；

流动相为溶液A和溶液B的混合液，洗脱梯度的变化是溶液B占流动相总体积的百分数。

数据处理：

利用Empower软件进行数据处理，同时将电泳结果数据导入Excel 对数据进行处理分析。

对小麦品种郑麦9023(N，7+8，2+12)高分子量谷蛋白亚基连续10次分离得到的重复性比较图谱如图1所示。

图1中显示的是第1、第5和第10次的分离图谱。其中，左侧为第1、第5和第10次重复进样得到的图谱，右侧为三个图叠加后的结果。

实施例2、利用超高效液相色谱鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基

1、材料取样

分别以小麦品种Hortag、小麦品种Imbross、斯卑尔特小麦品种Spelt 80和Spelt 127的种子作为试验材料，随机选取种子，加液氮研磨后分别称取20-30mg用于谷蛋白提取和超高效液相色谱分析。

2、样品制备

同实施例1。

3、超高效液相色谱（UPLC）

仪器设备：Waters公司生产的超高效液相色谱系统（配有软件用于系统操作和数据处理）。所用色谱柱为：ACQUITY UPLC™ BEH 300 C18 1.7 μm, 2.1 mm x 50 mm。

所用试剂：

溶液A：0.1%体积百分含量的三氟乙酸（TFA）水溶液；

溶液B：含0.1%体积百分含量三氟乙酸（TFA）的乙腈（色谱级）溶液；

溶液C：10%体积百分含量的乙腈（色谱级）水溶液；

纯水均取自Milli-Q Gradient A10；

上述各溶液配好后，混匀，室温条件下70%功率超声10分钟。

虽然超高效液相色谱仪器自身有排气系统，但是色谱级的溶剂排除气泡，可以避免压力过高的现象发生，保护色谱柱，延长色谱柱寿命，帮助实验连续有效的进行。

超高效液相色谱分析具体条件参数为：

流动相流速：0.6 mL/min；

色谱柱温度：60℃；

样品室温度：4℃；

流动相洗脱梯度：0-30min，洗脱梯度21%-47%；

流动相为溶液A和溶液B的混合液，洗脱梯度的变化是溶液B占流动相总体积的百分数；

洗脱时间：30 min。

为了能够连续检测样品和保证检测结果的准确性，在进样前需要对色谱柱用一定比例的流动相进行冲洗，具体的色谱柱冲洗条件参数为：

流动相流速：0.6 mL/min；

色谱柱温度：60℃；

样品室温度：4℃；

冲洗色谱柱的流动相梯度：0-15min，洗脱梯度5%-95%；15-20min，洗脱梯度95%-21%；

流动相为溶液A和溶液B的混合液，洗脱梯度的变化是溶液B占流动相总体积的百分数。

数据处理：

利用Empower软件进行数据处理，同时将电泳结果数据导入Excel 对数据进行处理分析。

小麦品种Hortag、Imbross、斯卑尔特小麦品种Spelt 80和Spelt 127高分子量谷蛋白亚基的超高效液相色谱分离图谱如图2所示。其中，图2A为小麦品种Hortag（1，17+18，5+10）高分子量谷蛋白亚基的UPLC标准图谱、图2B为小麦品种Imbross（1，14+15，2+12）高分子量谷蛋白亚基的UPLC标准图谱、图2C为斯卑尔特小麦品种Spelt 80（N, 7+9, 5+10）高分子量谷蛋白亚基的UPLC标准图谱、图2D为斯卑尔特小麦品种Spelt127（1, 6.1, 2+12）高分子量谷蛋白亚基的UPLC标准图谱。

Claims (7)

1.一种鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，是用超高效液相色谱方法对小麦高分子量谷蛋白亚基进行鉴定，根据其蛋白特征峰，确定小麦高分子量谷蛋白亚基的种类。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述超高效液相色谱方法包括如下步骤：

1）提取小麦高分子量谷蛋白亚基；

2）将步骤1）提取得到的小麦高分子量谷蛋白亚基进行超高效液相色谱检测；

所述高效液相色谱检测的参数为：

流动相流速：0.6 mL/min；

色谱柱温度：60℃；

样品室温度：4℃；

流动相洗脱梯度：0-30min，洗脱梯度21%-47%；

所述流动相为溶液A和溶液B的混合液，洗脱梯度的变化是溶液B占流动相总体积的百分数；

溶液A：0.1%体积百分含量的三氟乙酸水溶液；

溶液B：含0.1%体积百分含量三氟乙酸的乙腈溶液；

洗脱时间：30 min。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：在进样前，对色谱柱进行如下的冲洗程序：

流动相流速：0.6 mL/min；

色谱柱温度：60℃；

样品室温度：4℃；

冲洗色谱柱的流动相梯度：0-15min，洗脱梯度5%-95%，15-20min，洗脱梯度95%-21%；

所述流动相为溶液A和溶液B的混合液，洗脱梯度的变化是溶液B占流动相总体积的百分数；

溶液A：0.1%体积百分含量的三氟乙酸水溶液；

溶液B：含0.1%体积百分含量三氟乙酸的乙腈溶液。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述小麦高分子量谷蛋白亚基的提取方法为：

1）取小麦种子，磨碎后加入体积百分含量为70%的乙醇，去上清；

2）在步骤1）的沉淀中加入体积百分含量为55%的异丙醇，65℃水浴30 min，去上清；

3）在步骤2）的沉淀中加入100 μl溶液D，混匀，65℃水浴30 min；

所述溶液D由异丙醇、二硫苏糖醇、Tris-HCl和水组成；

所述溶液D中，异丙醇的体积百分含量为50%，二硫苏糖醇的体积百分含量为1%，Tris-HCl的终浓度为1M，pH值为8.0；

4）在步骤3）的溶液中加入100 μl溶液E，混匀，65℃水浴30 min，取上清；

所述溶液E由异丙醇、4-乙烯吡啶、Tris-HCl和水组成；

所述溶液E中，异丙醇的体积百分含量为50%，4-乙烯吡啶的体积百分含量为1.4%，Tris-HCl的终浓度为1M，pH值为8.0；

5）在步骤4）的上清液中加入-20℃预冷的丙酮，使丙酮的终浓度为60%，-20℃沉淀过夜，弃上清；

6）在步骤5）的沉淀中加入-20℃预冷的无水丙酮，将谷蛋白沉淀重悬洗涤，弃上清；

7）在步骤6）的沉淀中加入无水乙醇，将谷蛋白沉淀重悬洗涤，弃上清，室温条件下干燥，获得小麦高分子量谷蛋白亚基。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述小麦高分子量谷蛋白亚基在上样前用溶解液进行溶解；

所述溶解液由乙腈、三氟乙酸和水组成；

所述溶解液中，乙腈的体积百分含量为15-50%，三氟乙酸的体积百分含量为0.1%，其余为纯水。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述溶解液中，乙腈的体积百分含量为21%。

7.权利要求1-6任一所述的方法在小麦高分子量谷蛋白亚基鉴定中的应用。

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