CN103472182A

CN103472182A - 一种鉴定菊花远缘杂交胚胎败育相关蛋白的方法

Info

Publication number: CN103472182A
Application number: CN2013103854540A
Authority: CN
Inventors: 滕年军; 张凤姣; 黄至喆; 陈发棣; 房伟民; 蒋甲福; 管志勇; 陈素梅; 刘兆磊
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2013-08-29
Filing date: 2013-08-29
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2033-08-29
Also published as: CN103472182B

Abstract

本发明公开了一种鉴定菊花远缘杂交胚胎败育相关蛋白的方法，属于菊花育种与蛋白质组学领域。该方法包括：以栽培小菊作母本，野菊菊花脑作父本开展远缘杂交工作。授粉后不同时间剪下已授粉的花序，分别取形态发育完整、饱满的子房和形态发育异常、不饱满的子房，取样后立即在液氮中速冻后保存于-80℃冰箱中。样品用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质，保存于-80℃。最后运用iTRAQ与质谱技术快速鉴定差异蛋白，并进行生物信息学分析，获得与菊花远缘杂交育种中胚胎败育的相关蛋白。本发明针对菊花及其近缘属野生种，提供了一种快速、准确鉴定菊花胚胎发育过程中不同发育阶段的不同形态的胚胎差异蛋白，为解决菊花远缘杂交胚胎败育提供研究基础。

Description

一种鉴定菊花远缘杂交胚胎败育相关蛋白的方法

技术领域

本发明涉及菊花杂交育种与蛋白质组学领域，涉及菊花远缘杂交后胚胎在不同发育时期正常与败育胚胎差异蛋白的快速检测与鉴定方法，具体地说涉及一种鉴定菊花远缘杂交胚胎败育相关蛋白的方法。

背景技术

菊花原产中国，是我国十大传统名花、世界四大切花和十大盆花之一，在花卉生产中占有十分重要的地位。目前，国内菊花品种高达数千个，但多数观赏性状优良的品种各种抗性较差，而多数近缘种属的野生资源中却含有许多栽培菊品种所缺乏的优良性状，为此运用栽培品种与野生资源进行远缘杂交的方法将是改良菊花抗性的有效途径。

然而，已有研究表明，菊花远缘杂交中经常遇到各种生殖障碍，受精前障碍(pre-fertilization barriers)和受精后障碍(post-fertilization barriers)是导致菊花远缘杂交结实率低的主要因素，其中受精后障碍发生更为普遍，即杂交后虽能够完成受精作用过程，但胚胎发育过程遇到障碍，导致发育停止或者完全坏死，即胚胎败育，最终引起杂交不结实。

目前的研究主要集中在对胚胎发育的形态结构、组织化学等方面，如胚胎败育发生的时期和胚胎败育的组织结构特征等，很少从更深层次上开展研究。由于这些形态、组织等方面的变化从根本上说还是由基因和蛋白表达水平上的变化所引起，因此为了能真正弄清胚胎败育的机理，除了从细胞与结构水平上开展相关的研究外，还需要从分子水平上开展更为深入的研究。控制植物胚胎发育的基因通常高达数千种，直接从基因水平上着手很难找到控制胚胎败育的相关基因。而在最近10多年兴起与逐渐完善的蛋白质组学(proteomics)技术一方面可以同时分辨和鉴定上千个甚至更多的蛋白质，另一方面因为胚胎败育与蛋白质表达密切相关，因此，蛋白质组学将是研究植物胚胎败育较为理想的手段，准确、快速地鉴定出正常胚胎与败育胚胎的关键差异蛋白有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定菊花远缘杂交胚胎败育相关蛋白的方法。鉴定菊花正常胚胎与败育胚胎差异蛋白的方法，为克服菊花远缘杂交受精后障碍研究提供分子基础，实现不同菊属间各种优良基因的转移。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种鉴定菊花远缘杂交胚胎败育相关蛋白的方法，包括以下步骤：

1）以栽培菊花作母本，野菊作父本进行远缘杂交，分别于授粉后12d和18 d剪下已授粉的花序进行取样，授粉后12 d时取发育正常、饱满的子房，授粉后18 d时分别取发育正常、饱满的子房及发育异常、不饱满的子房；取样后立即在液氮中预处理1~2 h，然后于-80℃贮存；

2）将步骤1）所取得的样品分别用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质，得到授粉后12 d发育正常饱满子房的蛋白质、授粉后18 d发育正常饱满子房的蛋白质和发育异常不饱满子房的蛋白质，于-80℃保存；

3）将授粉后12 d发育正常饱满子房的蛋白质、授粉后18 d发育正常饱满子房的蛋白质和发育异常不饱满子房的蛋白质分别运用iTRAQ与质谱技术快速鉴定差异蛋白，并进行生物信息学分析。

所述的栽培菊花为‘雨花落英’，所述的野菊为菊花脑。

所述步骤1）所述远缘杂交方法为：选定父母本，在母本上选取发育良好的花蕾，在舌状花刚露色时去雄，即将内轮两性管状小花全部去除，同时剪去舌状花花瓣直到可见柱头，并严格进行套袋，待母本柱头伸出并开叉呈现锐角和分泌黏液时，于晴天10~15时收集已套袋的父本新鲜花粉，对母本进行授粉，授粉后立刻对母本雌蕊继续套袋隔离。

步骤2）中用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质的过程为：取样品在液氮预冷的研钵中迅速研磨至粉末状，加入提取液制成混合液，将混合液装入离心管中，放在冰上并在摇床上振荡后，在15,000 g，4℃下离心15min，取上清液，向上清液中加入洗涤液Ⅰ，充分震荡混匀，-20℃静止0.5~1.5h；然后在15,000 g，4℃下离心15 min，弃上清，向沉淀中加洗涤液Ⅱ洗涤，-20℃静止30 min以上，重复用洗涤液Ⅱ洗涤1~2次后冷冻干燥沉淀，将获得的蛋白质干粉于-80℃长期保存。

上述的提取液为：8M尿素、2%硫脲（g/ml，100ml提取液中含2g硫脲）、1%（v/v）Trition X-100、50 mM NaCl、20 mM Tris，pH =8.0；所述的洗涤液Ⅰ为：-20℃预冷丙酮加0.07% DTT（g/ml，100ml洗涤液Ⅰ中含0.07g DTT）和10% TCA（g/ml，100ml洗涤液Ⅰ中含10g TCA）；所述的洗涤液Ⅱ为：-20℃预冷丙酮加0.07% DTT（g/ml，100ml洗涤液Ⅱ中含0.07g DTT）。

步骤3）中运用iTRAQ与质谱技术快速鉴定差异蛋白主要包括以下步骤：样品前处理、第一维高pH反相色谱分离和第二维低pH反相色谱质谱联用数据采集，在利用生物信息学手段对数据分析基础上，获得与胚胎败育密切相关的蛋白；所述的样品前处理包括以下步骤：蛋白定量、蛋白纯化、蛋白酶解、肽段iTRAQ标记、去除残留标记试剂、脱盐。

所述的第一维高pH反相色谱分离的过程为：将样品前处理后得到的肽段粉末使用高pH流动相A溶解上样，使用梯度洗脱，0-30 min，流动相由5%B升至35%B；30-32 min，由35%B升至80%B；32-35 min保持80%B，35-36 min由80%B降至5%B，并保持14 min平衡色谱柱，高pH反相梯度共50 min；流速为200 μl/min，色谱柱保持在室温条件，使用紫外214 nm波长检测；色谱系统死时间(t0)为2 min，由4 min开始每隔2 min使用EP管收集馏分，最后第32-36 min收集为一管，共计收集15管，分别干燥成肽段粉末；所述的高pH流动相A为20 mM甲酸铵，pH=10.0，色谱纯氨水调节pH；高pH流动相B为20 mM甲酸铵，90%(v/v)乙腈，pH=10.0，色谱纯氨水调节pH。

所述的第二维低pH反相色谱质谱联用数据采集的过程为：1）将第一维高pH反相色谱分离得到的肽段干粉使用流动相A溶解，溶解后上样；2）上样流速为20 μl/min，上样5 min，肽段直接被捕集柱捕集；3）经过阀切换，使捕集柱和分析柱相连，同时启动Nano泵进行RP分离，启动质谱采集在线检测肽段；4）100 min内从5% B升至40% B，5 min内B从40%升至80%，然后1 min内B降至5%，以5%的B平衡色谱柱14 min，反相过程共120 min，流速为500 nL/min，色谱柱温度为35℃；所述的流动相A：5%(v/v)乙腈，0.1%(v/v)甲酸水溶液，pH=2.5，色谱纯甲酸调节pH；流动相B：90%(v/v)乙腈，0.1%(v/v)甲酸水溶液，pH=2.5，色谱纯甲酸调节pH。

质谱条件：离子源喷雾电压为1.2 kV，LTQ Orbitrap XL质谱仪加热毛细管设定为200℃，采用数据依赖模式自动在MS和MS/MS间切换采集，全扫描MS使用Orbitrap进行质心模式扫描，扫描范围为m/z 400-1800，分辨率设定为30,000（m/z 400处），线性离子阱(LTQ)离子最大引入时间为200 ms，自动增益控制(Automatic gain control, AGC)设定为1x10⁶，随后使用高能碰撞解离(Higher energy C-trap dissociation, HCD)对符合串级(MS/MS)碎裂条件的母离子进行碎裂并用orbitrap进行扫描，扫描分辨率设定为7500，扫描范围根据母离子质荷比自动控制，最低扫描范围固定为m/z=100处，最高到2000，对强度排名前6的离子进行MS/MS并进行Centroid模式扫描，进行MS/MS的最低离子强度值设定为8000，MS/MS时LTQ离子最大引入时间为800 ms，AGC控制设定为2x10⁵，母离子选择窗口设定为3道尔顿，对于单电荷和未知电荷数的离子不进行MS/MS采集，动态排除设定为每个母离子在10 s内进行2次MS/MS，之后排除180 s，排除窗口为母离子质荷比前10 ppm，母离子质荷比后30 ppm，MS/MS使用高纯氦气，40%的碰撞能量，碰撞反应40 ms。

上述的数据分析过程为：将第二维低pH反相色谱质谱联用采集的数据使用Protein Pilot软件的Paragon算法进行肽段、蛋白鉴定和定量，检索数据库为NCBI拟南芥和水稻种属非冗余数据库，搜索参数设置如下：胰蛋白酶，全酶切方式，最大漏切为2；固定修饰为半胱氨酸的methyl methanethiosulfonate (甲基硫代硫磺酸酯，MMTS)烷基化，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，肽段N端和赖氨酸的iTRAQ修饰；为降低假阳性结果，蛋白鉴定标准设定为ProtScore≥1.3（此时蛋白置信度≥95%），同时最少使用2条置信度≥95%的肽段进行蛋白定量；数据结果经过自动偏离校正以便消除标记样品合并时引入的误差。

在上述方法中，步骤1）选择母本时应选择生长强健，色泽、花型、姿态等优美的具有较高观赏价值的栽培菊，父本则根据母本需要改良的性状有针对性地选择，如选择各种抗性优良的野菊做父本，可以将野生菊的优良抗性基因转入到栽培菊花中以提高栽培品种的相应抗性。胚胎取样方法：在体视显微镜下（在体视显微镜下从形态上很容易辨别出正常与败育的胚胎）对不同发育阶段的正常与败育胚胎进行取样，取样后立刻在液氮中预处理1-2 h，然后贮存在-80℃条件下用于蛋白质组学和分子生物学研究。

同重标签标记的相对和绝对定量(iTRAQ)技术是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术，iTRAQ试剂盒包括四种同量的胺活性试剂，能对蛋白质水解的肽段进行标记，因此采用串联质谱方法，可以对肽段进行精确的鉴别和定量，可对多达4种或8种不同样本同时进行定量分析，并具有较高的重复性。通过该技术，可以快速鉴定出菊花胚胎发育不同时期的关键差异蛋白，为解决菊花远缘杂交中胚胎败育问题提供研究基础。

本发明方法中所述的室温为25±5℃。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种鉴定栽培菊与其近缘属野生种杂交授粉后一定时期内正常胚胎与败育胚胎关键差异蛋白的方法，具有快速、准确的特点，为解决菊花远缘杂交受精后胚胎败育问题提供研究基础。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明所提供的利用iTRAQ技术快速鉴定菊属与近缘属远缘杂交授粉后发育正常的胚胎与败育胚胎差异蛋白的方法，其具体实施示例如下：

1. 远缘杂交及取样

1.1 远缘杂交

以栽培小菊‘雨花落英’(2n=6x=54)作母本，选取发育良好的花蕾，在舌状花刚露色时去雄，即将内轮两性管状小花全部去除，同时剪去舌状花花瓣直到可见柱头（不伤及柱头），并严格进行套袋。待母本柱头伸出并开叉呈现锐角和分泌黏液时（去雄后 3-5 d），于晴天10~15时收集已套袋的父本菊花脑(2n=2x=18)的新鲜花粉，用毛笔对母本进行授粉，授粉后立刻对母本雌蕊继续套袋隔离。

1.2 胚胎取样

授粉后12 d时，剪下一部分已授粉的花序，用镊子取下每一朵小花，在体视显微镜下取每一朵小花的子房，并去除少部分发育不良的不饱满子房，最后将发育正常饱满的子房用锡箔纸包好立即在液氮中预处理1-2 h，然后贮存在-80℃条件下。

授粉后18 d时，剪下剩余的已授粉花序，用镊子取下每一朵小花，在体视显微镜下能观察到子房的饱满程度有差异，并将发育正常饱满的和发育异常不饱满的子房分开，分别用锡箔纸包好立即在液氮中预处理1-2 h，然后贮存在-80℃条件下。

2. 蛋白质提取

用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质。具体步骤如下：

2.1 溶液配制

本方法提蛋白所需的三种溶液分别为：

（1）提取液：8 M尿素、2%(g/ml) 硫脲、1%(v/v) Trition X-100、50 mM NaCl、20 mM Tris，pH =8.0；

（2）洗涤液Ⅰ：-20℃预冷丙酮加0.07% (g/ml)DTT（中文名：二硫苏糖醇）和10%(g/ml) TCA（三氯乙酸）；

（3）洗涤液Ⅱ：-20℃预冷丙酮加0.07% (g/ml)DTT。

注：DTT和TCA都是用的时候临时加。

2.2 蛋白提取

1）取0.5 g样品置于液氮预冷的研钵中，迅速研磨至粉末状，加入2ml提取液，然后将研钵放在冰上。

2）在提取液开始溶化时将其分装到2个2 ml的离心管中，然后将离心管横放在冰上，在摇床上振荡1 h。

3）在15,000 g，4℃下离心15 min，取上清液，向上清液中加入1ml洗涤液Ⅰ，充分震荡混匀，-20℃静止1 h左右。

4）在15,000 g，4℃下离心15 min，弃上清，向沉淀中加洗涤液Ⅱ，使沉淀悬浮于洗涤液Ⅱ中，-20℃静止30 min以上。

5）重复步骤4）1~2次，冷冻干燥沉淀，将获得的蛋白质干粉-80℃保存。

依照上述步骤进行蛋白提取，分别得到授粉后12 d发育正常饱满子房的蛋白质、授粉后18 d发育正常饱满子房的蛋白质和发育异常不饱满子房的蛋白质。

3. 快速鉴定差异蛋白，并进行生物信息学分析

将授粉后12 d发育正常饱满子房的蛋白质、授粉后18 d发育正常饱满子房的蛋白质和发育异常不饱满子房的蛋白质分别运用iTRAQ与质谱技术快速鉴定差异蛋白，并进行生物信息学分析。

3.1 样品前处理

3.1.1 蛋白定量：

使用Amersham 2-D Quant Kit（试剂盒）进行定量（GE公司，美国），流程如下：

1）使用试剂盒提供的2 mg/ml牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)，标准溶液按照下表配制标准曲线。第一管为空白，不包含蛋白。

管号

1

2

3

4

5

6

BSA体积

0 μl

1 μl

2 μl

4 μl

6 μl

10 μl

蛋白质量

0 μg

2 μg

4 μg

8 μg

12 μg

20 μg

2）使用iTRAQ 8标试剂盒的溶解液（Dissolution Buffer）30μl溶解100μg蛋白质干粉样品。每管样品吸取10 μl蛋白质样品溶液，添加500 μl丙酮（包括BSA标准曲线样品管），室温下旋转混悬2-3min后添加500 μl异丙醇，混悬均匀。

3）12,000 g下离心5 min，沉淀为蛋白，弃上清液。再次离心5 min，弃上清液。

4）添加100 μl 浓度为0.2 mol/L 的NaCl溶液和400 μl去离子水，混悬使得沉淀溶解。

5）添加1 μl Amersham 2-D Quant Kit（试剂盒）中的显色剂，颠倒混匀。

6）室温下孵育反应15-20 min。

7）在480 nm下使用去离子水作为参比液，读取样品和标准液的吸收值。注意应该在添加显色剂后的40 min内完成吸光度测定。该试剂盒使用时，吸光度值随着蛋白浓度的升高而降低。

8）根据标准液的吸光度值绘制标准曲线，根据标准曲线确定样品蛋白浓度。

9）样品浓度在1 μg/μl-2 μg/μl。

10）三组样品（授粉后12 d发育正常饱满子房的蛋白质样品、授粉后18 d发育正常饱满子房的蛋白质样品和发育异常不饱满子房的蛋白质样品）中，每样品吸取100 μg的样品转移至新的EP管内。

3.1.2 蛋白纯化

1）根据各个样品体积，添加5倍体积的预冷丙酮(-20℃)，于-20℃下过夜。

2）12,000 g下离心5 min，弃去上清，添加200 μl预冷丙酮清洗。

3）12,000 g下离心5 min，弃去上清。

4）氮气吹干。

3.1.3 酶解

1）用iTRAQ 8标试剂盒的溶解液30 μl溶解100 μg纯化后的固体沉淀蛋白样品；所述的溶解液：0.5 mol/L三乙基碳酸氢铵、 0.1%(w/v，g/ml) 十二烷基硫酸钠。

2）每样品添加1 μl变性剂溶液，混旋均匀。变性剂溶液为2%(w/v，g/ml)十二烷基硫酸钠溶液。

3）每样品添加2 μl还原剂，混旋均匀后，5,000 g离心。还原剂为5 mM的三羧甲基磷酸溶液。

4）于60℃下反应1 h。

5）5,000 g离心使得样品位于EP管底部。

6）每样品添加1 μl半胱氨酸封闭试剂（Cysteine Blocking Reagent），混旋均匀后，5,000 g离心得样品位于EP管底部，室温下反应10 min。

7）每样品添加测序级胰酶1 μl(0.6 μg/μl)，混旋均匀后，5,000 g离心得样品位于EP管底部。

8）37℃下酶解反应16 h。

3.1.4 iTRAQ标记

1、配制iTRAQ 8标试剂：

a) 于-20℃下取出8标试剂，使试剂恢复到室温（25±5℃）。

b) 1,000 g下离心使试剂位于管底。

c) 每管试剂添加50 μl异丙醇溶剂。

d) 混旋均匀后，5,000 g离心得酶解后的样品位于EP管底部。

2、将各个标记试剂添加至酶解后的样品溶液当中。1-1:118; 2-1:119; 3-1:121样品标号1-1的为授粉后12天所取的饱满子房；2-1为授粉后18天所取的饱满子房；3-1为授粉后18天所取的不饱满子房。

3）混旋均匀后，5,000 g离心得样品位于EP管底部。

4）吸取0.5 μl溶液，使用pH试纸测定pH值，添加1-5 μl iTRAQ8标试剂盒的溶解液，调整pH值至7.5-8.5。所述溶解液：0.5 mol/L三乙基碳酸氢铵, 0.1% (w/v，g/ml) 十二烷基硫酸钠。

5）室温下反应2 h。

6）将3管标记后的样品混合成一管。

7）混合均匀后5,000 g离心得样品位于EP管底部。

8）使用冷冻离心干燥机将标记后的混合肽段干燥成粉末。

3.1.5 去除残留标记试剂

使用Poly LC公司Poly SULFOETHYL A强阳离子交换柱脱去残留的标记试剂。混合肽段粉末使用强阳离子溶解液（10 mM磷酸钾，5%(v/v)乙腈，pH=2.5）200 μl溶解，溶解液使用流动注射泵以40 μl/min速度注入离子交换柱。使用400 μl溶解液注入交换柱洗下不保留物质，弃去流出液。注入200 μl洗脱液[10 mM磷酸钾，500 mM氯化钾，25%(v/v)乙腈，pH=2.5（磷酸调节）]，收集洗脱液。

3.1.6 脱盐

1）离子交换后的洗脱液使用冷冻离心干燥机干燥成粉末，以除去乙腈成分。

2）使用1%(v/v)乙腈，0.1%(v/v)三氟乙酸水溶液400 μl重溶。

3）C18脱盐柱（Sep-Pack Cartridge，Waters公司），使用60%(v/v)乙腈，0.1%(v/v) 三氟乙酸水溶液200 μl清洗。

4）使用1%(v/v)乙腈，0.1%(v/v)三氟乙酸水溶液600 μl平衡脱盐柱。

5）将重溶样品加入到脱盐柱内，使样品缓慢流过脱盐柱，标记肽段被脱盐柱捕集，盐等其它非疏水性小分子流出。

6）再添加200 μl 1%(v/v)乙腈，0.1%(v/v)三氟乙酸水溶液清洗脱盐柱，洗去残留的盐类。

7）添加300 μl 60%(v/v)乙腈，0.1%(v/v)三氟乙酸水溶液，使液体缓慢流过脱盐柱，将肽段洗脱下来，使用EP管收集洗脱液。

8）洗脱液使用冷冻离心干燥机内冻干，形成纯化后的标记肽段粉末。

3.2 第一维高pH反相色谱分离

高pH流动相A为20 mM甲酸铵，pH=10.0（色谱纯氨水调节）；高pH流动相B为20 mM甲酸铵，90%(v/v)乙腈，pH=10.0（色谱纯氨水调节）。高效液相色谱系统为岛津LC 20AD系统（shimadzu, 日本），色谱柱为sefex poly高pH色谱柱，2.1 mm内径，C18填料粒径5 μm，孔径肽段粉末使用高pH流动相A 100 μl溶解上样，使用梯度洗脱，0-30 min，流动相由5%B升至35%B；30-32 min，由35%B升至80%B；32-35 min保持80%B，35-36 min由80%B降至5%B，并保持14 min平衡色谱柱，高pH反相梯度共50 min。流速为200 μl/min，色谱柱保持在室温条件，使用紫外214 nm波长检测。色谱系统死时间(t0)为2 min，由4 min开始每隔2 min使用EP管收集馏分，最后第32-36 min收集为一管，共计收集15管，使用冷冻离心干燥机(RVC 2-25 Christ,德国)干燥成肽段粉末。

3.3 第二维低pH反相色谱质谱联用数据采集及分析

3.3.1 硬件系统

肽段使用反相纳升级液相色谱(Nano-RPLC)/ESI-MS/MS进行分析。

1）肽段捕集柱为500 μm x 2.0 mm Cap Trap C18捕集柱(Michrom Bioresour-ces, Auburn, USA)。

2）分析柱为15 cm x 100 μm Magic C18AQ纳升级色谱柱(Michrom Bioresources, Auburn, USA)，填料为3 μm粒径，

孔径的Magic C18。

3）液相系统为Nano Aquity UPLC system (Waters Corporation, Milford, USA)。

4）离子源为在线纳升级电喷雾离子源(Michrom Bioresources, Auburn, USA)。

5）质谱系统为LTQ Orbitrap XL (Thermo Electron Corp., Bremen, Germany)。

6）流动相A：5%(v/v)乙腈，0.1%(v/v)甲酸水溶液，pH=2.5（色谱纯甲酸调节）；

B：90%(v/v)乙腈，0.1%(v/v)甲酸水溶液，pH=2.5（色谱纯甲酸调节）。

3.3.2 反相色谱分离

1）肽段干粉使用51 μl流动相A溶解，溶解后上样50 μl。

2）上样流速为20 μl/min，上样5 min，肽段直接被捕集柱捕集，同时经过捕集柱的甲酸铵等盐溶液直接排入废液。

3）经过阀切换，使捕集柱和分析柱相连，同时启动Nano泵进行RP分离，启动质谱采集在线检测肽段。

4）100 min内从5% B升至40% B，5 min内B从40%升至80%，然后1min内B降至5%，以5%的B平衡色谱柱14 min，反相过程共120 min，流速为500 nL/min，色谱柱温度为35℃。

3.3.3 质谱条件

离子源喷雾电压为1.2 kV，LTQ Orbitrap XL质谱仪加热毛细管设定为200℃，采用数据依赖模式自动在MS和MS/MS间切换采集。全扫描MS使用Orbitrap进行质心模式(Centroid)扫描，扫描范围为m/z 400-1800，分辨率设定为30,000（m/z 400处）。线性离子阱(LTQ)离子最大引入时间为200 ms，自动增益控制(Automatic gain control, AGC)设定为1x10⁶，随后使用高能碰撞解离(Higher energy C-trap dissociation, HCD)对符合串级(MS/MS)碎裂条件的母离子进行碎裂并用orbitrap进行扫描，扫描分辨率设定为7500，扫描范围根据母离子质荷比自动控制，最低扫描范围固定为m/z=100处，最高到2000。对强度排名前6的离子进行MS/MS并进行Centroid模式扫描，进行MS/MS的最低离子强度值设定为8000。MS/MS时LTQ离子最大引入时间为800 ms，AGC控制设定为2x10⁵，母离子选择窗口设定为3道尔顿。对于单电荷和未知电荷数的离子不进行MS/MS采集，动态排除设定为每个母离子在10 s内进行2次MS/MS，之后排除180 s，排除窗口为母离子质荷比前10 ppm，母离子质荷比后30 ppm。MS/MS使用高纯氦气，40%的碰撞能量，碰撞反应40 ms。

3.3.4 数据分析

iTRAQ实验数据使用Protein Pilot软件(version 4.0, AppliedBiosystems, USA)的Paragon算法进行肽段、蛋白鉴定和定量。检索数据库为NCBI拟南芥（水稻）种属非冗余(non-redundant, nr)数据库（拟南芥2011_11，222070条序列；水稻2011_11，277623条序列）。搜索参数设置如下：胰蛋白酶(Trypsin)，全酶切方式，最大漏切为2。固定修饰为半胱氨酸(Cysteine)的methyl methanethiosulfonate (甲基硫代硫磺酸酯，MMTS)烷基化，可变修饰为甲硫氨酸(Methionine)的氧化，肽段N端和赖氨酸(lysine)的iTRAQ修饰。为降低假阳性结果，蛋白鉴定标准设定为ProtScore≥1.3（此时蛋白置信度≥95%），同时最少使用2条置信度≥95%的肽段进行蛋白定量。数据结果经过自动偏离校正以便消除标记样品合并时引入的误差。对于iTRAQ定量，使用Pro Group算法自动选择定量肽段来计算报告离子的峰强度，误差因子及p-value。

经过蛋白质组学数据的筛选，初步确定了以下所列的5个差异明显的关键蛋白，其中前4个与胚胎败育密切相关，第5个组蛋白主要起一些修饰作用。

菊花抗性育种和新品种选育中经常遇到受精后生殖障碍（即杂交后虽能够完成受精作用过程，但胚胎发育过程遇到障碍，导致发育停止或者完全坏死，最终引起杂交不结实），这是影响菊花抗性育种和新品种选育的一个重要因素，而引起受精后大量胚胎在其不同发育阶段败育，导致远缘杂交结实率低的原因还不清楚，为此，利用蛋白质组学技术，并整合分子生物学手段，将有助于从分子水平上阐明菊花远缘杂交胚胎败育的机理。通过本发明我们获得了在受精后生殖障碍过程中5个明显变化的关键蛋白，即这5个蛋白可能是导致胚胎发育不良的关键因子（尽管各个蛋白发挥的功能可能存在差异）。因此，通过本发明我们获得了引起菊花抗性种质创新和新品种选育中受精后生殖障碍的关键因子，这将为我们今后深入开展后续研究，最终从细胞和分子水平上阐明菊花胚胎败育的真正机理奠定了重要基础，然后我们会采取相应的措施有效克服受精后胚胎败育，最终能够加快菊花抗性种质创新和新品种选育的进程。

Claims

1.一种鉴定菊花远缘杂交胚胎败育相关蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的栽培菊花为‘雨花落英’，所述的野菊为菊花脑。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1）所述远缘杂交方法为：选定父母本，在母本上选取发育良好的花蕾，在舌状花刚露色时去雄，即将内轮两性管状小花全部去除，同时剪去舌状花花瓣直到可见柱头，并严格进行套袋，待母本柱头伸出并开叉呈现锐角和分泌黏液时，于晴天10~15时收集已套袋的父本新鲜花粉，对母本进行授粉，授粉后立刻对母本雌蕊继续套袋隔离。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2）中用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质的过程为：取样品在液氮预冷的研钵中迅速研磨至粉末状，加入提取液制成混合液，将混合液装入离心管中，放在冰上并在摇床上振荡后，在15,000 g，4℃下离心15 min，取上清液，向上清液中加入洗涤液Ⅰ，充分震荡混匀，-20℃静止0.5~1.5h；然后在15,000 g，4℃下离心15 min，弃上清，向沉淀中加洗涤液Ⅱ洗涤，-20℃静止30 min以上，重复用洗涤液Ⅱ洗涤1~2次后冷冻干燥沉淀，将获得的蛋白质干粉于-80℃长期保存。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的提取液为：8M尿素、2%硫脲、1% Trition X-100、50 mM NaCl、20 mM Tris，pH =8.0；所述的洗涤液Ⅰ为：-20℃预冷丙酮加0.07% DTT和10% TCA；所述的洗涤液Ⅱ为：-20℃预冷丙酮加0.07% DTT。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）中运用iTRAQ与质谱技术快速鉴定差异蛋白主要包括以下步骤：样品前处理、第一维高pH反相色谱分离和第二维低pH反相色谱质谱联用数据采集，在利用生物信息学手段对数据分析基础上，获得与胚胎败育密切相关的蛋白；所述的样品前处理包括以下步骤：蛋白定量、蛋白纯化、蛋白酶解、肽段iTRAQ标记、去除残留标记试剂、脱盐。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的第一维高pH反相色谱分离的过程为：将样品前处理后得到的肽段粉末使用高pH流动相A溶解上样，使用梯度洗脱，0-30 min，流动相由5%B升至35%B；30-32 min，由35%B升至80%B；32-35 min保持80%B，35-36 min由80%B降至5%B，并保持14 min平衡色谱柱，高pH反相梯度共50 min；流速为200μl/min，色谱柱保持在室温条件，使用紫外214 nm波长检测；色谱系统死时间(t0)为2 min，由4 min开始每隔2 min使用EP管收集馏分，最后第32-36 min收集为一管，共计收集15管，分别干燥成肽段粉末；所述的高pH流动相A为20 mM甲酸铵，pH=10.0，色谱纯氨水调节pH；高pH流动相B为20 mM甲酸铵，90%乙腈，pH=10.0，色谱纯氨水调节pH。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的第二维低pH反相色谱质谱联用数据采集的过程为：1）将第一维高pH反相色谱分离得到的肽段干粉使用流动相A溶解，溶解后上样；2）上样流速为20 μl/min，上样5 min，肽段直接被捕集柱捕集；3）经过阀切换，使捕集柱和分析柱相连，同时启动Nano泵进行RP分离，启动质谱采集在线检测肽段；4）100 min内从5% B升至40% B，5 min内B从40%升至80%，然后1min内B降至5%，以5%的B平衡色谱柱14 min，反相过程共120 min，流速为500 nL/min，色谱柱温度为35℃；所述的流动相A：5%乙腈，0.1%甲酸水溶液，pH=2.5，色谱纯甲酸调节pH；流动相B：90%乙腈，0.1%甲酸水溶液，pH=2.5，色谱纯甲酸调节pH。

质谱条件：离子源喷雾电压为1.2 kV，LTQ Orbitrap XL质谱仪加热毛细管设定为200℃，采用数据依赖模式自动在MS和MS/MS间切换采集，全扫描MS使用Orbitrap进行质心模式扫描，扫描范围为m/z 400-1800，分辨率设定为30,000（m/z 400处），线性离子阱(LTQ)离子最大引入时间为200 ms，自动增益控制设定为1x10⁶，随后使用高能碰撞解离对符合串级(MS/MS)碎裂条件的母离子进行碎裂并用orbitrap进行扫描，扫描分辨率设定为7500，扫描范围根据母离子质荷比自动控制，最低扫描范围固定为m/z=100处，最高到2000，对强度排名前6的离子进行MS/MS并进行Centroid模式扫描，进行MS/MS的最低离子强度值设定为8000，MS/MS时LTQ离子最大引入时间为800 ms，自动增益控制设定为2x10⁵，母离子选择窗口设定为3道尔顿，对于单电荷和未知电荷数的离子不进行MS/MS采集，动态排除设定为每个母离子在10s内进行2次MS/MS，之后排除180 s，排除窗口为母离子质荷比前10ppm，母离子质荷比后30 ppm，MS/MS使用高纯氦气，40%的碰撞能量，碰撞反应40 ms。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的数据分析过程为：将第二维低pH反相色谱质谱联用采集的数据使用Protein Pilot软件的Paragon算法进行肽段、蛋白鉴定和定量，检索数据库为NCBI拟南芥和水稻种属非冗余数据库，搜索参数设置如下：胰蛋白酶，全酶切方式，最大漏切为2；固定修饰为半胱氨酸的甲基硫代硫磺酸酯烷基化，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，肽段N端和赖氨酸的iTRAQ修饰；为降低假阳性结果，蛋白鉴定标准设定为ProtScore≥1.3（此时蛋白置信度≥95%），同时最少使用2条置信度≥95%的肽段进行蛋白定量；数据结果经过自动偏离校正以便消除标记样品合并时引入的误差。