CN109937363A - 用于识别微生物的质谱方法和试剂盒 - Google Patents

用于识别微生物的质谱方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明包含一种用于识别样品中的微生物的新颖方法和系统，所述样品包含可能干扰对所述微生物的识别的来自非微生物来源的蛋白质和其它生物材料(例如，来源于哺乳动物的蛋白质)。本文所述的方法和系统包含在质谱分析之前使用一次性色谱介质来纯化完整蛋白质。本文所述的色谱介质和方法可以快速且高效地从粗细胞裂解物中去除大部分干扰生物材料(例如，哺乳动物蛋白)，同时保持高信号强度并去除足够的一种或多种干扰蛋白以允许通过质谱分析来识别一种或多种微生物。

Description

用于识别微生物的质谱方法和试剂盒
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年8月25日提交的题为“用于识别干扰基质中的混合微生物的设备和方法(APPARATUS AND METHODS FOR IDENTIFICATION OF A MIX MICROORGANISM INAN INTERFERING MATRIX)”的芬兰申请号20165634的优先权和权益，所述芬兰申请整体并入本文。
背景技术
近年来，与用于识别微生物的传统方法相比，作为用于识别微生物的工具，质谱已经由于其准确性增加和结果时间(time-to-result)缩短而受到欢迎。迄今为止，用于微生物识别的最常见的质谱是基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱。在MALDI-TOF中，将未知微生物的细胞与合适的紫外光吸收基质溶液混合，并使其在样品板上干燥。替代性地，使用微生物细胞的提取物，而不是完整细胞。在转移到质谱仪的离子源之后，将激光束引导到样品以对蛋白质进行解吸和电离，并且收集时间相关的质谱数据。
通过MALDI-TOF方法产生的微生物质谱图揭示了构成微生物的“特征(fingerprint)”的完整肽、蛋白质和蛋白质片段的许多峰。这种方法依赖于未知微生物的质谱图中的峰曲线与包括使用基本相同的实验条件获得的已知微生物的光谱集合的参考数据库的模式匹配。分离的微生物的光谱与参考数据库中的光谱之间的匹配越好，在属、种或在一些情况下亚种层次下的生物体识别的置信水平越高。因为所述方法依赖于匹配MALDI-TOF质谱图中的峰的模式，所以不需要识别或以其它方式表征未知微生物的光谱中表示的蛋白质以将其识别。
已经使用了用于检测微生物的若干其它质谱方法——这些方法包含所谓的“自下而上(bottom-up)”和“自上而下(top-down)”方法。在自下而上方法中，蛋白质提取物可以用一种或多种蛋白酶消化，然后通过耦合到质谱的液相色谱对肽进行的一个或多个维度的分离。通过将蛋白水解肽或其串联质谱图的质量与从数据库预测的那些进行比较，可以识别肽并将多个肽识别组合成蛋白质识别。
在自上而下方法中，可以识别微生物，并且在一些情况下，通过分析在分离和质谱之前未经酶消化的完整蛋白质来定量微生物。从微生物中提取的完整蛋白质优选地通过一个或多个维度的液相色谱分离(但是在一些方法中，蛋白质提取物可以直接注入到质谱仪中)，然后注入到质谱仪中。可以在第一质谱步骤(MS)中通过确定提取物中足够数量的蛋白质的完整质量来识别生物体。在第二质谱步骤(MS/MS)中，来自第一质谱步骤的所选蛋白质可以在质谱仪中片段化——蛋白质的片段化模式可以用于增强第一步骤中的识别的确定性。自上而下方法的主要优点包含能够检测降解产物、序列变体和翻译后修饰的组合。
质谱的使用已经彻底改变了临床微生物学并且缩短了诊断时间且提高了诊断的准确性。然而，质谱分析，特别是MALDI-TOF，尚未被广泛用于一些临床样品，因为这些样品包含可能影响分析的可靠性和准确性的复杂基质(例如，源自哺乳动物的蛋白质)。例如，血液培养物代表微生物学实验室的最紧迫且最关键的样品。虽然关键的患者护理将最大程度地得益于使用质谱成功分析血液培养物(由于显著更快的结果时间)，但目前尚未广泛使用此应用，因为血液培养物样品仍然是质谱中最具挑战性的样品类型。事实上，MALDI-TOF通常仅为阳性血液培养物提供非常低的灵敏度和特异性(约70％到80％)。具有类似复杂基质的其它样品(例如，尿液和脑脊髓液)也提供低灵敏度和特异性。由于MALDI分析对具有复杂基质的样品的灵敏度非常低，因此存在产生真实阳性样品的假阴性的显著危险，并且可能甚至更糟糕的是，阴性样品的假阳性。
发明内容
本发明包含一种用于识别样品中的微生物的新颖方法和系统，所述样品包含可能干扰对所述微生物的识别的来自非微生物来源的蛋白质和其它生物材料(例如，来源于哺乳动物的蛋白质)。从来自疑似患有微生物感染的患者的流体、组织和培养物中识别微生物是临床微生物学中最关键的测定之一并且对于患者护理来说至关重要。可以使用完整蛋白质作为分析物通过质谱(MS)识别微生物，如已经使用MALDI-TOF或电喷雾电离(ESI)表明的。然而，除了一种或多种目标微生物之外，许多临床样品还包含非常复杂且具有挑战性的基质(例如，哺乳动物细胞、蛋白质、体液、介质组分等)。
在这种样品中，可以提取来自通过质谱识别所需的微生物的蛋白质，但是它们的信号可以被基质中的蛋白质(例如，哺乳动物来源的蛋白质)抑制或淹没。特别具有挑战性的基质的一个实例是血液。在疑似患有败血症的患者中，快速识别致病微生物可以字面上意味着生与死之间的差异。然而，当裂解红细胞时，血红蛋白以高浓度结合到细菌细胞，并且血红蛋白可以进入微生物裂解物中并且可以压倒来自一种或多种微生物的蛋白质的信号。挑战在于快速并有效地去除足够的血红蛋白以使微生物蛋白的信号可见，而不会去除如此多的蛋白质以至于整体信号强度太低。如但不限于尿液和脑脊髓液的流体呈现类似的基质挑战。
本文所述的方法和系统包含在质谱分析之前使用一次性色谱介质来纯化完整蛋白质。来自微生物提取物的蛋白质与色谱介质结合，在那里将它们洗涤，并且然后洗脱用于质谱分析。令人惊讶和出乎意料的是，已经发现本文所述的所述色谱介质和所述方法可以快速并有效地从粗细胞裂解物去除大部分干扰生物材料(例如哺乳动物蛋白)，同时保持高信号强度并去除足够的一种或多种干扰蛋白以允许通过质谱分析识别一种或多种微生物。
本文描述的过程可以非常快。同样，本发明的方法简单且快速，因为不需要对样品进行化学或酶消化，并且实时完成数据处理。来自培养物或(假设足够高的微生物负载)体液或表面拭子的样品制备可以在短到约15分钟(例如，15分钟到30分钟)内进行。质谱分析可以在几分钟内完成，例如，小于10分钟，小于5分钟或在约一分钟或更短时间内。初始质谱通常足以将一种或多种微生物识别为属或种水平。可以要求额外的质谱分析(例如，靶向的MS和MSn)以进一步表征在第一质谱步骤中识别的微生物，以例如识别菌株、亚种、病原体或血清型水平的一种或多种微生物，或者根据需要确定毒力因子、抗生素抗性标记、抗生素敏感性标记或其它特性。此第二阶段可以在几分钟内进行，例如，少于15分钟，少于10分钟或在约五分钟或更短时间内。两个阶段都依赖于检测和识别来自微生物的完整蛋白质，而不将那些蛋白质的化学、物理或酶促降解为其取代肽。
方法适用于各种不同的样品类型，包含来自临床样品的纯培养物或混合培养物样品，包含但不限于血液、脓液、尿液、泪液、鼻涕、淋巴液、滑液、脑脊髓液、粪便、痰、伤口和身体部位拭子、以及来自其它来源的样品，包含工业或环境样品，如食物(例如肉类和乳制品样品、水果和蔬菜)、饮料、土壤、水(例如城市废水)、空气和表面拭子。并且虽然以下讨论集中于通过蛋白质的表征来识别微生物，但是本文讨论的方法和系统同样适用于通过表征小分子、脂质或碳水化合物等中的一种或多种来识别微生物等。
在急性感染中，病原体通常大量存在。例如，在泌尿道或肾脏发炎的情况下，在一毫升尿液中存在约105到107个病原体。由于质谱分析仅需要约103到104个微生物，离心将立即产生足够量的病原体用于质谱识别。
如果离心样品中存在超过105种微生物病原体，则肉眼可见沉积的颗粒。但即使体液中的微生物病原体较少，快速提取和分解方法也可以成功应用于当时不可见的颗粒。病原体中蛋白质的提取过程非常快，并且仅在总分析时间内添加几分钟。
还可以直接培养体液中的病原体，例如，与通过直接培养全血袋的已知“血液培养物”方法一样。这种培养显著快于皮氏培养皿中生长的培养物，并且特别是在重度感染的情况下，通常可以在一小时内提供足够的病原体用于识别。
急性感染也可以由非病毒性病原体如病毒、衣原体和立克次氏体引起，其中任何一种都不能在营养培养基中培养，因为它们只能在宿主细胞中繁殖。在急性感染中，在体液中发现这些病原体的某些形式的数量非常多，并且尽管尺寸小，但可以在超速离心机中有效沉淀；它们可以通过质谱测量的其特定蛋白质来识别。本文描述的方法不限于细菌等的分析和识别。例如，病毒通常具有衣壳形式的高特征性外壳蛋白，其可以通过质谱识别。
在本公开的实施例中，描述了一种用于识别流体中的微生物的方法，所述流体包含来自除微生物之外的来源的生物材料(例如，干扰蛋白)。下述方法包含用于富集来自微生物的蛋白质和耗尽干扰生物材料的装置，以便可以识别样品中存在的一种或多种微生物。在一个实施例中，方法包含制备衍生自流体的裂解物，其中裂解物包含衍生自流体的蛋白质和来自微生物的蛋白质，并使裂解物与色谱介质接触，其中衍生自流体的蛋白质和来自微生物的蛋白质与色谱介质结合。方法进一步包含选择性地洗脱与色谱介质结合的蛋白质以产生至少一种经过洗脱的级分，并对至少一种经过洗脱的级分进行蛋白质质谱分析，以识别流体中一种或多种微生物的存在。在一个实施例中，至少一种经过洗脱的级分富含来自微生物的蛋白质并且耗尽衍生自流体的蛋白质。
在一个实施例中，流体可以是血液、血液培养物、尿液或脑脊髓液中的一种。在一个实施例中，干扰生物材料可以是流体中可以抑制或压倒来自微生物蛋白质的信号的任何物质。干扰生物材料的合适实例，在这种情况下是蛋白质，包含但不限于血红蛋白、防御素或其蛋白水解产物中的一种或多种。
在另一个实施例中，公开了一种用于识别流体中微生物的方法，所述流体包含干扰哺乳动物蛋白和来自微生物的蛋白质。在初始步骤中，方法包含从包含哺乳动物蛋白和来自微生物的蛋白质的流体制备裂解物。在一个实施例中，流体可以是全血、血液培养物、尿液或脑脊髓液中的一种或多种。在一个实施例中，裂解物通过以下制备：(a)如果流体中存在哺乳动物细胞，通过使哺乳动物细胞与被选择用于裂解哺乳动物细胞但不裂解微生物细胞的裂解剂接触来裂解哺乳动物细胞，(b)将微生物的细胞与裂解的哺乳动物细胞分离，(c)洗涤微生物的细胞，(d)裂解微生物的细胞以释放其内容物，以及(e)将未裂解的微生物细胞和细胞片段与微生物细胞的内容物分离。
方法进一步包含将衍生自微生物的蛋白质与哺乳动物蛋白分离。分离包含(a)提供含有色谱介质层的单次使用提取盒，(b)将裂解物加入提取盒并使裂解物流过色谱介质层，(c)用洗涤缓冲液洗涤提取盒；以及(d)选择性地洗脱与色谱介质结合的蛋白质，以产生至少一种经过洗脱的级分。在一个实施例中，选择性地洗脱可以包含使不同浓度的洗脱缓冲液流过色谱介质层，所述洗脱缓冲液包含10vol％到60vol％浓度范围内的极性有机溶剂。所述方法进一步包含对所述至少一种经过洗脱的级分进行蛋白质质谱分析，以识别血液样品中一种或多种感染物的存在。质谱分析技术的合适实例包含但不限于MALDI-TOF、ESI-MS或ESI-MSn(例如，MS/MS)。
在又另一个实施例中，公开了一种用于识别流体样品中的微生物的试剂盒。试剂盒包含样品裂解管，所述样品裂解管包括选择用于选择性地裂解样品中的哺乳动物细胞而不是待识别的微生物细胞的洗涤剂，微生物裂解缓冲液和单次使用提取盒，所述单次使用提取盒包括用于快速和选择性分离哺乳动物蛋白与微生物蛋白的色谱介质。所述试剂盒进一步包含识别流体中的所述微生物的说明书，其用于通过以下来实现：裂解体液中的哺乳动物细胞；裂解所述微生物的细胞；使用所述提取盒将所述微生物的蛋白质与哺乳动物蛋白分离；以及通过使所述微生物的蛋白质经历质谱分析来识别所述微生物。
因为本文所述的方法使用有限的一组试剂，所以本发明的方法适用于在样品制备和质谱的完全自动化系统内使用。
优选地，本发明的方法从样品制备到结果报告自动化。结果可以自动转移到医院的电子病历系统，在那里它们可以直接链接到患者治疗策略、保险、计费或用于流行病学报告。这种综合系统有助于对医院、地方、区域和全球各级的疫情进行流行病学跟踪。对于高通量实验室，可以将多个系统连接到中央计算机，所述计算机在报告之前整合来自不同仪器的数据。系统可以导入表型敏感性数据，其中它可以与本发明生成的识别、毒力、抗生素抗性和分型信息组合。
本发明的这些和其它目标以及特征将从以下描述和所附权利要求书变得更充分地明显，或者可以通过本发明的实践如下文阐述的来了解。
附图说明
为了进一步阐明本公开的上述和其它优点和特征，将通过参考在说明书中的附图中说明的具体实施例来提供本公开的更具体描述。应当了解，这些附图仅描绘了本公开的示出实施例，并且因此不被认为是限制其范围。将通过使用附图以额外的特征和细节来描述和解释本公开，其中：
图1是示出用于识别微生物的方法的流程图。
图2是根据本发明的实施例的提取盒的分解透视图。
图3是处于组装状态的图2的提取盒的纵向横截面透视图。
图4是在本公开的某些实施例中有用的血液培养物工作流程的流程图。
图5A到5D示出了根据本公开中描述的工作流程的样品制备后通过LC-ESI-MS分析微生物蛋白。分析的总离子色谱图示出在图5A中。图5B示出了人α-防御素。图5C示出了细菌蛋白质。图5D示出了人血红蛋白α和β链。
图6A到6D示出了在SPE尖端中纯化的完整微生物蛋白的ESI-MS分析。将来自大肠杆菌阳性血液培养物样品的完整蛋白质结合到SPE尖端中，并使用不同的ACN浓度-15％(A)、17.5％(B)、20％(C)或40％(D)-作为直接注入MS分析中的洗脱液通过ESI-MS分析。根据ACN浓度，可以看到不同量的微生物蛋白(标有*)和人血红蛋白(标有¤)。
图7示出了通过SPE-LC进行的含有细菌的尿液样品的全扫描电喷雾质谱图。扫描范围从m/z 600到m/z 1300。图中呈现的是例如代表来自大肠杆菌的DNA结合蛋白HU-α的不同电荷状态的峰，其m/z值为：682.03(+14)、734.42(+13)、795.45(+12)和867.85(+11)。
图8A和8B示出了通过ESI-MS分析的微生物蛋白。用两种不同的SPE-尖端材料，Poros R1(图8A)和RP-4H(图8B)洗脱蛋白质，并直接喷雾到MS进行全扫描分析，m/z范围为600到1300。
具体实施方式
本发明包含一种用于识别样品中的微生物的新颖方法和系统，所述样品包含可能干扰对所述微生物的识别的来自非微生物来源的蛋白质和其它生物材料(例如，来源于哺乳动物的蛋白质)。从来自疑似患有微生物感染的患者的流体、组织和培养物中识别微生物是临床微生物学中最关键的测定之一并且对于患者护理来说至关重要。可以使用完整蛋白质作为分析物通过质谱(MS)识别微生物，如已经使用MALDI-TOF或电喷雾电离(ESI)表明的。然而，除了一种或多种目标微生物之外，许多临床样品还包含非常复杂且具有挑战性的基质(例如，哺乳动物细胞、蛋白质、体液、介质组分等)。
本文所述的方法和系统包含在质谱分析之前以纯化完整蛋白质的色谱介质。来自微生物提取物的蛋白质与色谱介质结合，在那里将它们洗涤，并且然后洗脱用于质谱分析。令人惊讶和出乎意料的是，已经发现本文所述的所述色谱介质和所述方法可以快速并有效地从粗细胞裂解物去除大部分干扰生物材料(例如哺乳动物蛋白)，同时保持高信号强度并去除足够的一种或多种干扰蛋白以允许通过质谱分析识别一种或多种微生物。
现在参考图1，提供了用于快速提取和分析从微生物提取的蛋白质的方法100的一般工作流程的概述。可以使用各种独立仪器和装置手动执行方法100的步骤。替代性地，一些或所有步骤可以是自动化的。
在一个实施例中，流体样品是疑似含有未知微生物(例如，细菌、病毒或另一种感染物)的流体(例如，体液)。方法适用于各种不同的样品类型，包含来自临床样品的纯培养物或混合培养物样品，包含但不限于血液、脓液、尿液、泪液、鼻涕、淋巴液、滑液、脑脊髓液、粪便、痰、伤口和身体部位拭子、以及来自其它来源的样品，包含工业或环境样品，如食物(例如肉类和乳制品样品、水果和蔬菜)、饮料、土壤、水(例如城市废水)、空气和表面拭子。
通常，最适用于本文所述方法和系统的样品是具有挑战性基质的样品。具有挑战性基质的样品类型的一个实例是含有高度浓缩的外源或内源蛋白质、离子、脂质等的样品，其可以抑制或压倒衍生自未知微生物的蛋白质的质谱信号。具有可以干扰质谱分析的困难基质的常见分析样品的实例包含但不限于血液(全血或血液培养物)、尿液和脑脊髓液。在血液的情况下，血红蛋白是血液中重要的蛋白质组分，当它们被裂解时溢出红细胞。如果没有去除血红蛋白，它可以掩盖衍生自未知微生物的蛋白质。在尿液和脑脊髓液的情况下，最可能的干扰蛋白是防御素。防御素是小的富含半胱氨酸的蛋白质，其作为宿主防御肽起作用。它们对细菌、真菌和许多有包膜和无包膜的病毒具有活性。它们由18个到45个氨基酸组成，包含六个(在脊椎动物中)到八个保守的半胱氨酸残基。因为防御素参与防御微生物感染，所以防御素可能存在于尿液和脑脊髓液中，以响应本文所述的方法和系统被配置成检测的微生物剂的存在。
现在参考方法100的步骤120，方法进一步包含制备衍生自流体样品的裂解物的步骤。可以通过本领域已知的任何方法裂解流体样品中的细胞。通常，首先需要裂解样品中的任何哺乳动物细胞并处理其内容物。接下来，可以洗涤微生物细胞以从哺乳动物细胞去除尽可能多的残基。并且最后，可以裂解微生物细胞。
在一个实施例中，可以通过使流体样品与选择以裂解流体中的哺乳动物细胞但不裂解微生物细胞的裂解剂接触来裂解哺乳动物细胞(如果存在)。例如，某些洗涤剂(例如，非离子、阴离子、阳离子、两性离子洗涤剂)可能能够有效地裂解哺乳动物细胞。在另一个实例中，裂解剂可以是皂苷。皂苷是植物衍生的化合物，其是具有一个或多个亲水性糖苷部分与亲脂性三萜衍生物组合的两亲性糖苷。皂苷具有类似洗涤剂的性质，并且由于它们的双相性质，可能特别适合破坏哺乳动物细胞。相反，细菌细胞具有刚性细胞壁，使其能够通过洗涤剂处理保持完整。
在一个实施例中，步骤120可以进一步包含将微生物的细胞与裂解的哺乳动物细胞分离。例如，可以通过离心(例如，12,000g，2分钟)流体样品以集结微生物细胞并随后处理上清液完成分离。步骤120可以进一步包含洗涤微生物的细胞以洗去衍生自哺乳动物细胞的蛋白质。洗涤可以通过例如将微生物细胞重悬于合适的缓冲液(例如磷酸盐缓冲液、TRIS缓冲液等)中并且然后通过离心将其重排来完成。洗涤可以根据需要重复多次(例如，两次)。
在一个实施例中，步骤120可以进一步包含裂解微生物的细胞以释放其内容物。微生物细胞的裂解可以通过本领域已知的任何方法完成。微生物(例如细菌、真菌、支原体细胞、病毒等)的破坏可以通过本领域公知的机械、化学、酶和其它方法实现。机械方法包含珠击、使用压力如法式压力机等、超声处理、研磨、或本领域已知的其它方法。化学方法包含暴露于洗涤剂或离液剂如尿素、硫脲或胍HCL以裂解微生物细胞并溶解其内容物。替代性地，有机酸/溶剂混合物可以用于破坏细胞。酶促方法包含使用溶菌酶、溶葡萄球菌素或其它裂解酶在细菌细胞壁中形成“孔”，其允许内容物泄漏到周围溶液中。在一个实施例中，步骤120可以进一步包含从微生物细胞的内容物分离细胞片段和未裂解的微生物细胞以产生裂解物。在一个实施例中，可以将细胞重悬在小体积中用于微生物裂解，并且可以通过离心去除细胞片段。在这种情况下，可以通过回收上清液获得裂解物。如果裂解物没有充分浓缩用于质谱分析，则可以例如通过在降低的温度和降低的大气压下蒸发来浓缩裂解物。
在一个实施例中，步骤120中制备的裂解物可以在步骤130中与色谱介质接触。可以选择色谱介质以选择性地结合干扰蛋白、来自至少一种微生物的蛋白质或两者。同样地，可以选择色谱介质以选择性地至少部分地清洁或纯化来自至少一种微生物的蛋白质，使得可以通过质谱(例如，MADLI或LC/MS)识别至少一种微生物。色谱介质的合适实例包含但不限于反相或正相介质、离子交换介质、亲和色谱介质、尺寸排阻介质、疏水相互作用介质和其组合。
在一个实施例中，使裂解物与色谱介质接触包含提供其中具有选择量的色谱介质的容器，将裂解物加入容器并使裂解物与色谱介质混合。替代性地，可以将选择量的色谱介质添加到含有步骤120中获得的裂解物的管并与裂解物混合。进一步，使裂解物与色谱介质接触可以包含将色谱介质与裂解物分离。这通常可以通过离心集结色谱介质完成。这种分离也可以例如通过过滤完成。步骤130可以进一步包含用洗涤缓冲液洗涤色谱介质至少一次以去除未结合或非特异性结合的材料。用洗涤缓冲液洗涤之后，将色谱介质与洗涤缓冲液分离。如在前面的实例中，这通常可以通过离心或者替代性地过滤等完成。
在另一个实施例中，使裂解物与色谱介质接触可以包含提供含有色谱介质层的提取盒。含有介质的提取盒可以是本领域已知的任何提取盒。在一个实施例中，提取盒是单次使用的一次性柱。可以手动装载、洗涤、洗脱等提取盒，或者提取盒可以内嵌包含在液相色谱系统中。
在一个实施例中，提取盒可以包含固相提取(SPE)筒。在一些实施例中，SPE柱可以直接与高分辨率/高质量准确度质谱仪串联。在一个实施例中，SPE柱可以是具有少量二氧化硅的聚丙烯尖端或含有键合的C4、C8或C18的其它吸附剂或固定在柱中的其它官能团，例如StageTipTM柱(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))。在替代性实施例中，可以使用聚合物吸附剂或螯合剂。层体积可以小到1μL或更小，但也可以使用更大的体积。设备和方法非常适合于衍生自微生物细胞的复杂样品，因为每个SPE柱仅使用一次，从而最小化从一个样品到另一个样品的遗留问题。下面参考图2和3讨论固相提取盒(例如，固相提取盒)的具体实施例。
使裂解物与色谱介质接触可以进一步包含将裂解物添加到提取盒并允许裂解物流过色谱介质层，并且将洗涤缓冲液添加到提取盒并允许洗涤缓冲液流过色谱介质层。可以允许裂解物和洗涤缓冲液被动地流过柱，或者可以通过例如离心或正压迫使它们通过。
在使裂解物与色谱介质接触后，方法100可以进一步包含选择性地洗脱与色谱介质结合的蛋白质的步骤140。使用的洗脱方案可以至少在某种程度上取决于色谱介质的化学性质或与色谱介质结合的蛋白质的化学性质。在示例性实施例中，色谱介质是疏水相互作用介质(例如，反相介质)，并且洗脱缓冲液是水/有机混合物。例如，洗脱缓冲液可以包含水和乙腈，其范围为约5vol％乙腈到约75vol％乙腈(例如，约10vol％乙腈到约60vol％乙腈)。在一个实施例中，一种或多种蛋白质可以在至少一种级分中洗脱。例如，一种或多种蛋白质可以以不同的洗脱缓冲液比率洗脱并作为级分收集。在另一个实例中，一种或多种蛋白质可以以选定的洗脱缓冲液组成比率等度洗脱，并且可以收集单一级分。同样地，一种或多种蛋白质可以以两种或更多种选择的洗脱缓冲液组成比率等度洗脱，并且可以收集两种或更多种级分。
在选择性地洗脱与色谱介质结合的蛋白质的步骤140后，方法可以进一步包含使至少一种经过洗脱的级分经历蛋白质质谱分析的步骤。
如本文所用，术语“质谱”或“MS”是指基于它们的质荷比或“m/z”(有时也称为“Da/e”)的过滤、捕获、检测和测量离子的方法。通常，一种或多种感兴趣的分子，如微生物蛋白被电离并且随后将离子引入质谱仪器中，其中由于电场或磁场和电场的组合，离子遵循空间中的路径，这取决于质量(“m”或“Da”)和电荷(“z”或“e”)。
质谱仪将包含离子源，用于电离一个或多个级分并产生带电分子用于进一步分析。例如，可以通过基质辅助激光解吸电离(MALDI)或电喷雾电离(ESI)进行样品的电离。在MALDI中，可以将级分(或级分的一部分)与合适的“基质”(例如，3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(芥子酸)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA、α-氰基或α-基质)、或2,5-二羟基苯甲酸(DHB))组合，并点在板上并干燥。其次，脉冲激光照射斑点，触发样品和基质材料的消融和解吸。最后，分析物分子通过在烧蚀气体的热羽流中质子化或去质子化而被电离，并且然后可以加速到用于分析斑点中的蛋白质的任何质谱仪中。在ESI中，液滴流从带电锥体洗脱(例如，从色谱系统)，并通过渗碳、去质子化、失水等逐渐去溶剂化以形成蛋白质离子。然后可以将离子加速到用于分析蛋白质的质谱仪中。其它电离技术包含但不限于大气压化学电离(ACPI)、光电离、电子电离(EI)、化学电离(CI)、快速原子轰击(FAB)/液体二次离子质谱(LSIMS)、场电离、场解吸、热喷射/等离子体喷射电离和粒子束电离。本领域技术人员将理解，可以基于待测量分析物、样品类型、检测器类型、正模式与负模式的选择等来确定电离方法的选择。
在样品已经被电离之后，可以分析由此产生的带正电或带负电的离子以确定质荷比(即m/z)和信号强度。用于确定质荷比的合适分析仪包含四极分析仪、离子阱分析仪、傅立叶变换离子回旋共振(FTICR)分析仪、静电阱分析仪、磁扇区分析仪和飞行时间分析仪。可以通过使用几种检测模式来检测离子。例如，可以检测选择的离子(即，使用选择性离子监测模式(SIM))，或者替代性地可以使用选择的反应监测(SRM)或多反应监测(MRM)检测离子(MRM和SRM基本上是同样的实验。)。也可以通过扫描质量分析仪检测离子，以检测来自样品的所有离子。
在一个实施例中，可以使用四极分析仪确定质荷比。例如，在“四极”或“四极离子阱”仪器中，振荡射频(RF)场中的离子经历与RF信号的振幅、电极之间施加的直流(DC)电势和离子的m/z比成比例的力。可以选择电压和振幅，使得仅具有特定m/z的离子行进四极的长度，而所有其它离子都被偏转。因此，四极仪器可以充当“质量过滤器”、“质量分离器”或用于注入仪器中的离子的离子透镜。
人们通常可以通过使用“串联质谱”或“MS/MS”，例如通过使用三重四极质谱仪以提高MS技术的分辨率。在此技术中，可以在MS仪器中过滤从感兴趣的分子生成的第一离子或母体离子或前体离子，并且随后将这些前体离子碎裂以产生一种或多种第二离子或产物离子或片段离子，然后在第二MS程序中进行分析。通过仔细选择前体离子，仅来自特定分析物的离子被传递到碎裂室(例如，碰撞室)，其中与惰性气体原子的碰撞产生这些产物离子。由于前体离子和产物离子两者都是在给定的电离/碎裂条件下以可重复的方式产生的，因此MS/MS技术可以提供极其强大的分析工具。例如，离子选择或过滤和随后的碎裂的组合可以用于消除干扰物质，并且可以特别用于复杂样品中，如生物样品。
在另一个实施例中，可以使用含有能够高分辨率和精确质量确定的静电离子阱质量分析仪的混合质谱系统确定质荷比，例如含有四极质量分析仪的Q-ExactiveTM质谱仪系统(赛默飞世尔科技)和OrbitrapTM质量分析仪。在这里，离子由四极质量分析仪选择，然后传递到捕获装置中，在所述装置中收集给定的离子群，进行碰撞冷却，并以高能量和精确的轨迹注入Orbitrap质量分析仪中。替代性地，通过四极质量分析仪选择前体离子，将其传递到产生产物离子的碰撞室，然后将其传递到捕获装置中，在所述装置中收集给定的离子群，进行碰撞冷却，并以高能量和精确的轨迹注入Orbitrap质量分析仪中。离子以与(z/m)1/2成比例的频率跨阱轴向振荡，其中z是离子上的电荷，并且m是质量。检测这些振荡离子的图像电流，并使用傅立叶变换原理将频域数据转换成质谱信息。瞬态收集时间越长，后续质谱数据的分辨率越高。可以以超过200,000的值获得高分辨率数据，质量精度为5ppm或更高。
例如，来自色谱柱、可能含有一种或多种感兴趣的分析物的液体溶剂流进入LC-MS/MS分析仪的加热的雾化器界面，并且溶剂/分析物混合物转化为蒸气。衍生自感兴趣的分析物的离子可以在液相中形成，并且随后通过ESI源中的雾化或通过中性分析物与反应离子之间的反应在分析物进入气相时喷射到气相中。
在进入仪器之前，离子通过仪器的孔口并通过一系列透镜、四极、六极和类似装置。在一个实施例中，可以分析任何m/z值(例如，m/z的3、5、10、20、30、40、50、100、1800或更多道尔顿范围)的所选m/z窗口以确定一个或多个窗口中完整蛋白质的分子量。通常，较小的m/z窗口尺寸可以改善信噪比。除了上述m/z窗口尺寸之外，m/z窗口尺寸可以根据实验条件在任何地方动态调整。在另一个实施例中，允许来自一个或多个窗口的一个或多个预定离子进入碰撞室，在那里它们与中性气体分子(例如，氩气、氮气等)和片段碰撞。生成的碎片离子进入质量分析仪，碎片离子被分离并转发到检测器。在其它实施例中，其它碎裂过程可以包含但不限于通过红外多光子解离(IRMPD)吸收红外光子、通过包含电子转移解离(ETD)的离子-离子反应吸收单个UV光子、或不经历快速碎裂的电子转移产物离子的碰撞-活化、电子捕获解离(ECD)。在示例性实施例中，解离方法是高能碰撞诱导解离(HCD)。当离子与检测器碰撞时，它们产生模拟信号，进一步转换为数字信号。
所获取的数据被中继到计算机，所述计算机绘制电压与时间的关系。所得质谱图与传统HPLC方法中生成的色谱图类似。感兴趣的分析物的浓度可以通过计算色谱图中峰下面积，如果有任何色谱峰，或使用质谱中峰的强度来确定。样品中分析物或感兴趣的分析物(例如蛋白质)的浓度通过现有技术中已知的许多不同技术中的一种实现，包含外部或内部校准、相对定量、峰高或面积计数、标准添加、或现有技术中已知的任何其它方法。
参考图2和3，示出了可以在上述方法中采用的提取盒10(例如，单次使用提取盒)的实施例。所示的提取盒10可以用于从含有如蛋白质、肽、碳水化合物、脂质、核酸、盐和小分子等组分的混合物的样品提取如蛋白质或蛋白质片段等组分。提取盒10包含筒体12，所述筒体具有储液器部分14、提取介质部分16和套环18。
储液器部分14通常定位在筒体12的近端20处，并且包含入口24和用作储液器26的腔。储液器26由储液器部分14的内表面28限定，并且与提取介质部分16的腔32流体连通，所述腔通常定位在筒体12的远端30处。储液器26能够容纳一定体积的液体。在实施例中，储液器26的容积足以容纳引发提取介质42所需的液体体积、待提取样品的体积、洗涤溶液的体积和洗脱溶液的体积。例如，在一些提取方法中，在迫使样品通过位于提取介质部分16的腔32中的提取介质42之前，必须用合适的溶剂稀释样品。通常，稀释样品的步骤在单独的容器中进行。在示例性实施例中，储液器26的容积足以在将正压力施加到储液器26以将样品转移到提取介质之前直接在储液器26中稀释样品。在本发明的实施例中，储液器26的体积范围为约50μl到约1500μl。
在图2和3中所示的示例性实施例中，储液器26的内表面28包含靠近入口24的第一部分34，其提供储液器26的大部分容积，和靠近提取介质部分16的第二部分38。在图2和3中所示的示例性实施例中，储液器26的第一部分34的内表面28通常为截头圆锥形，并且在第一部分34的近端处的内径ID1与第一部分34的远端36处的内径ID2之间具有会聚角，其小于约10度，或者在替代性实施例中小于4度。如本文所用，会聚角是所指的表面与结构的中心轴线之间的角度，在本实例中，所述中心轴线是筒体12的中心轴线62。
在一个实施例中，储液器26可以具有被配置成相对于液体处理装置(例如，微量移液管或液相色谱系统)密封的形状，所述液体处理装置可以在储液器26中产生正气压以迫使储液器26中的液体通过提取介质42。在相关实施例中，提取介质部分16和/或套环18可以具有配置成液体接收器的形状，所述液体接收器被配置成接收流出提取介质部分16的液体(例如，洗脱液)。同样地，提取介质部分16的尺寸和形状可以被设计成联接到液体处理装置(例如，液相色谱系统)，所述液体处理装置被配置成接收来自提取介质部分16的下游流。
储液器26的第二部分38可以是漏斗形的并且具有朝提取介质部分16向内逐渐变细的环形壁，如图3所示。储液器26的第二部分38在第二部分38的近端48处的内径ID3与第二部分38的远端50处的内径ID4之间具有会聚角。在示例性实施例中，储液器的第一部分34的会聚角小于储液器26的第二部分38的会聚角。
在图3例示的实施例中，储液器26的第二部分38包含搁架52，当储液器过渡到储液器26与提取介质部分16的腔32之间的流体通道54中时，所述搁架进一步减小储液器26的直径。搁架52可以用作密封表面以与液体递送装置形成密封，如移液管尖端或中空探针，如空心陶瓷探针。图3的示例性实施例中的搁架52被示出为具有大致截头圆锥形状，其具有约45度到约90度范围内的钝角会聚角。
图3中所示的实施例包含储液器26与提取介质部分16的腔32之间的流体通道54。在此示例性实施例中，流体通道54是截头圆锥形的，并且会聚角通常小于约10度，并且在替代性实施例中，小于约1度。流体通道54的长度和内径使流体通道54的体积最小化，同时提供足够的流量以防止由限制流过流体通道54的流动引起的背压的累积。使流体通道54的体积最小化，以使提取盒中的死体积最小化。在实施例中，流体通道54的体积不超过约1000nl，并且可以在约1nl到约50nl的范围内。
提取介质部分16包含细长套管55，所述细长套管具有限定腔32的内表面56，其中安置有提取介质42。腔32包含与储液器26流体连通的入口端58和具有远离入口端58安置的开口59的出口端60。在实施例中，腔32是截头圆锥形的，具有小于约5度的会聚角，并且在替代性实施例中，会聚角可以在约0.2度到1度的范围内。在另一个替代性实施例中，截头圆锥形腔32的会聚角可以为约0.4度。在具有截头圆锥形腔32的实施例中，腔32的较大直径端朝提取介质42的插入点开口。用于替代性实施例的腔32的内径也在约0.5mm到约2.0mm的范围内，并且优选地在约0.75mm到约0.85mm的范围内。筒体12具有中心轴线62，所述中心轴线延伸穿过提取介质部分16的腔32。腔32在入口端58与出口端60之间沿中心轴线62具有长度L1。在实施例中，腔32的长度L1在约1mm到10mm的范围内。在另一个实施例中，腔32的长度L1在约3mm到约5mm的范围内，并且优选地在约3.5mm到约4.5mm的范围内。在实施例中，腔的长度L1对应于细长套管55的长度。
筒体12的套环18与细长套管55在共同方向上轴向延伸。在图2和3所示的实施例中，套环18具有封闭端72，所述封闭端联接到储液器部分14的外表面78，所述外表面邻近第一部分与第二部分34、38之间的过渡。在所示实施例中，套环18的外表面74与储液器部分14的外表面78连续。储液器部分14的外表面78、74和套环18可以是锥形的，具有小于15度的会聚角，并且在替代性实施例中，在约0.1度到约5度的范围内。
套环18具有开口末端端部70，其与细长套管55的出口端60间隔开。细长套管55的出口端60限定平面P1。套环18的末端端部70限定平面P2，所述平面至少延伸到由细长套管55的出口端60限定的平面P1。在实施例中，套环18的末端端部70的平面P2延伸超出细长套管55的出口端60的平面P1。在图2和3所示的实施例中，套环18的末端端部70的平面P2延伸超出细长套管55的出口端60的平面P1一段距离D1，所述距离足以通过第二提取盒的任何部分防止细长套管55的出口端60的接触。例如，距离D1可以在约0.1mm到约2mm的范围内，这取决于套环18的末端端部70处的内径ID5和套环18的末端端部70处的外径OD1或筒体12的近端20处的外径OD2中的较小者，足以通过第二提取盒的任何部分防止细长套管55的出口端60的接触。当提取盒10松散地储存在袋子或盒子中时，此结构防止对细长套管55的出口端60的损坏。平面P2延伸超过平面P1的额外益处是，当提取盒10由自动样品分析系统处理时，它防止细长套管55的出口端60的污染。例如，在自动分析系统中运输提取盒10的方法是使提取盒10通过引导管或软管从系统中的一个位置下降到另一个位置。如果细长套管55的出口端60暴露，即未被套环18保护，则如果出口端60接触输送管或软管的表面，则存在出口端60的携带污染的显著风险。本发明的套环18保护细长套管的出口端60不接触输送软管的表面，并且从而降低在同一软管中输送的不同提取盒之间的携带污染的风险。
套环18的末端端部70具有外径OD1，并且储液器26的入口24具有内径ID1，使得套环18的末端端部70可以不完全插入储液器26的入口24中。在实施例中，储液器的入口24的内径ID1不大于套环18的末端端部70的外径OD1。在另一个实施例中，储液器的入口24的内径ID1小于套环18的末端端部70的外径OD1。类似地，筒体12的近端20具有外径OD2，并且套环18的开口末端端部70具有内径ID5，使得筒体12的近端20可以不完全插入套环18的开口末端端部70中。在图2和3所示的实施例中，筒体12的近端20处的外径OD2包含任选的肩部76。在实施例中，套环18的开口末端端部70的内径ID5不大于筒体12的近端20的外径OD2。在另一个实施例中，套环18的开口末端端部70的内径ID5小于筒体12的近端20的外径OD2。当多个提取盒10与随机包装一起储存时，如在袋子或盒子中，提取盒10将不会一个堆叠在另一个内部，如果提取盒的一端能够装配在第二提取盒的末端中的开口内。提取盒10的这个方面使得自动化系统一次拾取一个提取盒10变得非常容易，并且允许提取盒10与自动化系统一起使用而无需分类并放入机架中。因此，提取盒10可以以松散的批次包装、销售、储存和插入自动分析系统，而无需将它们包装在机架或托盘中的特定位置和指定朝向，从而提高效率并节省金钱、空间和劳动力。
在图2和3所示的实施例中，筒体12的近端20包含任选的肩部76，其从邻近入口24的储液器部分14的外表面74向外突出。肩部76增加了筒体12的近端20的外径，并且提供了表面，所述表面可以被自动装置用于在处理期间悬挂提取盒10或者如果期望将提取盒10悬挂在托盘或机架系统中。
提取介质42安置在提取介质部分16的腔32中。提取介质42允许从混合样品提取所需组分。提取介质42可以将蛋白质与混合生物样品中的其它组分进行色谱分离。提取介质42的实施例能够可逆地结合小分子或大分子，如分子量为约1kDa到约200kDa的肽和蛋白质。当样品以约50μl/分钟到200μl/分钟的流速通过提取介质42时，提取介质42可以能够可逆地结合样品体积中至少1μg的蛋白质，所述样品体积的范围为约10μl到约100ml。提取介质42还可以基于所需的特性洗脱所需的组分，如组分的分子量、疏水性、电荷或组分对提取介质42的某方面的亲和力。在实施例中，当以约0.1μl/分钟到约20μl/分钟的流速洗脱时，提取介质42能够洗脱至少20％从混合样品结合的蛋白质，其中洗脱溶剂的体积范围为约1μl到约100μl。
在实施例中，提取介质42是固相提取介质，并且更具体地说，是具有高内部孔隙率的多孔整料介质80，其允许样品充分流过多孔整料介质80而不生成不期望的高背压。在实施例中，背压在200μl/分钟的流速下不超过约5巴。多孔整料介质80优选地能够承受至少200巴。多孔整料介质80的孔结构的益处在于其导致样品的曲折路径，其允许以快速流速快速对流传质。而且，多孔整料介质80不需要玻璃料以保持其在筒体12内的位置。
多孔整料介质80可以制备成护套内的连续层，如管82的区段。结果是在将管82切割成区段时，多孔整料介质80存在于用作提取介质42的微柱的全长中。
在图2和3所示的实施例中，提取介质42是多孔整料介质80，其从提取介质部分16的细长套管55的出口端60插入到筒体12的提取介质部分16的腔32中。在管82内制备多孔整料介质80并切割管82以形成微柱的益处是此方法避免在空气与聚合多孔整料介质之间的边界处形成半渗透或无孔层，如当多孔整料介质直接在移液管尖端内聚合时发生。半渗透或无孔层可以不利地影响所得多孔整料介质的流动特性。在多孔整料介质直接在提取介质部分16的腔32内形成的实施例中，可以通过形成穿过多孔整料介质中心的通道以减少半渗透或无孔层的不利影响，以增加样品通过提取介质的流速。然而，待捕获的高比例的组分可以保留在通道中并绕过多孔整料介质，从而需要多次通过样品以最大化提取。相反，在切割成段的管82内制备多孔整料介质80产生多孔圆筒，其中孔结构和孔隙跨直径并沿着多孔整料介质80的长度是均匀的。此制备方法导致样品流过多孔整料介质80，不受半渗透或无孔表面的阻碍，并导致跨多孔整料介质80的基本均匀的结合，从而在单次通过多孔整料介质80中提供所需组分的最大提取。
多孔整料介质80外侧上的管82提供有助于处理多孔整料介质80的保护层。例如，在提取盒10的制造期间，筒体12可以独立于多孔整料介质80形成。然后将多孔整料介质80插入筒体12的提取介质部分16的腔32中。在其中多孔整料介质80在管82的区段中形成的实施例中，管82允许多孔整料介质80更容易地处理以插入到提取介质部分16的腔32中。此外，当多孔整料介质80插入储液器部分14的腔32中时，管82的壁可以用作多孔整料介质80的支撑，并且可以用作抵靠腔32的内表面56的密封表面，用于防止多孔整料介质80周围的回流。
当在管82的区段中形成的多孔整料介质80插入储液器部分14的腔32中时，管82围绕多孔整料介质80压缩，以防止多孔整料介质80从管82挤出。
多孔整料介质80可以任选地联接到管82的内表面，以提高多孔整料介质80的挤出阻力。例如，可以处理管82的内表面以产生用于聚合多孔整料介质80的共价键附接点。为了激活如聚乙烯醚酮(PEEK)管等管的内表面，管的内部可以填充含有溶剂的反应溶液，如乙腈或丙腈(烷基腈衍生物)和偶氮类引发剂，如浓度为约1％到约10％(体积)的Vazo-64或Vazo-55。然后可以将填充的管加热到溶剂的10小时半衰期温度的至少80％，例如Vazo-64在64摄氏度下具有10小时的分解半衰期。可以使反应进行至少30分钟。可以用新鲜的反应溶液替换反应溶液，并使其额外持续至少30分钟。在实施例中，管的端部是密封的，生成至少5psi的内部背压。在另一个实施例中，在环境压力下连续补充反应溶液。然后从管去除反应溶液，并允许管用氮气流干燥。干燥之后，将聚合混合物注入活化管的内腔中。在多孔整料介质80的聚合期间，管内表面上的活化附接点结合到提取介质中。
当PEEK管用作示例性管时，可以使用其它类型的聚合物管，包含环烯烃共聚物(“COC”)和氟聚合物，如乙烯四氟乙烯(ETFE)、氟化乙烯丙烯(FEP)和其它氟聚合物。额外地，可以使用熔融石英管，并且在熔融二氧化硅水解之后通过共价结合含丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯的硅烷化试剂来活化。
管82的内径可以为约0.1mm到约1mm。在实施例中，管82的内径为约0.4mm到约0.6mm。在另一个实施例中，管的内径为约0.5mm。具有内部形成的多孔介质的管82可以被切割成某一长度，当与管的内径组合时，所述长度为多孔提取介质提供所需的体积。在实施例中，具有多孔整料介质80的管82的长度被切割成约6mm到约2mm的区段，并且在替代性实施例中，长度范围为约3mm到约5mm或约4mm。在多孔提取介质聚合之后，可以用管切割器，如IDEX A-350管切割器将管切割成所需长度。
多孔整料介质80可以通过在引发剂和成孔溶剂(致孔剂)存在下聚合包含合适的单体和/或聚合物的混合物来制备。所得多孔整料介质80具有直径范围为约50nm到约20,000nm的孔。多孔整料介质80可以具有约50nm到200nm或约750nm到10,000nm范围内的孔。多孔整料介质80可以是直径范围为约20nm到约10,000nm的聚合物小球。多孔整料介质80应该能够承受至少约200巴的压力。
单体可以选自含乙烯基的单体、含丙烯酸酯的单体、含甲基丙烯酸酯的单体、丙烯酰胺、经氟取代的乙烯和其组合。聚合物可以选自聚烯烃、聚酯、聚氨酯、聚酰胺和其组合。含乙烯基的单体可以包含乙烯基芳族单体，如经单乙烯基取代的芳族单体和经二乙烯基取代的芳族单体和其组合。示例性的乙烯基芳族单体包含二乙烯基苯、苯乙烯、经烷基取代的苯乙烯如乙基乙烯基苯、α-甲基苯乙烯、经烷基取代的α-甲基苯乙烯、经卤素取代的α-甲基苯乙烯如氯甲基苯乙烯和其组合。烷基取代可以包含多达18个碳原子。含丙烯酸酯的单体包含单-、二-和三-丙烯酸酯。甲基丙烯酸酯单体包含甲基丙烯酸单甲酯、二甲基丙烯酸酯和三甲基丙烯酸酯，如甲基丙烯酸缩水甘油酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、三羟甲基丙烷、丙烯酸三甲酯、甲基丙烯酸羟乙酯。在实施例中，单体、或至少两种单体的混合物、或至少一种单体和一种聚合物的混合物通常以约10vol.％到约60vol.％的量存在于聚合混合物中，并且在替代性实施例中，以约20vol.到约70vol.％的量存在于聚合混合物中。
致孔剂可以选自各种不同类型的材料。例如，合适的液体致孔剂包含脂族烃、芳族烃、酯、醇、酮、醚、可溶性聚合物的溶液和其混合物。示例性致孔剂包含4,4,4-三甲基戊烷、具有1个到12个碳原子的醇、甲苯、乙酸丁酯、1,4,丁二醇、水、丙酮、己烷、环己烷、环己醇、四氢呋喃(THF)和其组合。在实施例中，致孔剂通常以约20vol.％到约90vol％的量存在于聚合混合物中，并且在替代性实施例中，以约60vol.％到约80vol％的量存在于聚合混合物中。
引发剂可以包含热聚合引发剂、常规自由基聚合引发剂、光引发剂和氧化还原引发剂。合适的引发剂的实例包含过氧化物，如OO-叔戊基-O-(2-乙基己基)单过氧碳酸酯、二丙基过氧二碳酸酯和过氧化苯甲酰、偶氮化合物如偶氮二异丁腈(Dupont Vazo-64)、2,2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐和2,2'-偶氮双(异丁酰胺)二水合物和过硫酸铵和四甲基乙二胺(TMEDA)。在实施例中，引发剂通常以约0.2重量％到约5重量％的单体存在于聚合混合物中，并且在替代性实施例中，以约1重量％到约2重量％的单体存在于聚合混合物中。
聚合混合物的组分可以根据常规技术混合并注入管内部中并使其聚合。例如，在实施例中，用聚合混合物填充管并施加压力到约100psi。加压有助于防止聚合混合物中气泡的形成，因为在聚合期间的引发剂分解期间形成氮。在其它实施例中，管填充有聚合混合物，并且管的两端都被密封，同时允许聚合进行。当聚合进行时，密封管的两端导致管内部的压力增加，这防止形成氮气泡。在又另一个实施例中，管填充有聚合混合物，并且管的一端是密封的，并且管的另一端是敞开的，但放在小瓶中。在聚合步骤期间加热填充的管。将管的开口端定位在小瓶中允许液体膨胀，同时在聚合期间加热混合物，这防止由加热引起的压力增加，这可能不利地影响多孔整料介质的孔隙率。在使用光引发剂的实施例中，可以对填充的管进行UV照射。多孔整料介质和其制备方法的实例描述于美国专利号7,922,908中，其通过引用以其整体并入。
多孔整料介质80也可以是官能化的。例如，可以制备多孔整料介质80，其中环氧化物或卤化物官能团可以与胺或硫化物反应以产生例如阴离子交换介质或与例如羧酸、磷酸、磺酸反应以产生阳离子交换介质。然后可以进一步修饰这些基团以允许蛋白质、肽或免疫球蛋白的附着以产生亲和分离并提取介质。环氧基团可以直接与蛋白质、肽或免疫球蛋白反应或在转化为醛之后反应。可能的其它亲和介质包含固定化金属离子亲和色谱(IMAC)相和硼酸盐相。
适合用作多孔整料介质80的示例性多孔材料和制备这种材料的方法描述于美国专利号5,334,310和5,633,290中，其各自通过引用以其整体并入。
在替代性实施例中，提取介质42可以包含多个多孔和/或无孔珠，如玻璃、二氧化硅或聚合物珠，其包含在提取介质部分16的腔32中。在此实施例中，腔的入口端可以包含第一玻璃料，并且腔的出口端可以包含第二玻璃料。玻璃料的作用是防止珠子从腔逸出。将珠子填充到腔中足以允许足够的流速，同时不产生不期望的背压。示例性珠子描述于美国专利号6,783,672中，其通过引用以其整体并入。
在使用期间，在样品通过提取盒10之前，可以用润湿溶剂润湿提取介质42。在其中提取介质42包含多孔整料介质80的实施例中，多孔整料介质80可以用足够体积的润湿溶剂润湿，所述润湿溶剂可以包含有机溶剂如乙腈(ACN)和含水组分如具有0.2vol.％甲酸(FA)的水。通常，可以使用约10μl到约100μl的润湿溶剂以润湿多孔整料介质80。然后可以用平衡溶剂平衡多孔整料介质80，所述平衡溶剂可以包含水和约0.2vol.％FA。通常，可以使用约10μl到约100μl的平衡溶剂以平衡多孔整料介质80。然后迫使含有体积范围为10μl到100μl的感兴趣化合物，如蛋白质的样品通过提取盒10中的多孔整料介质80。可以任选地收集来自样品的流动用于额外分析。然后可以用洗涤溶液洗涤多孔整料介质80，所述洗涤溶液包含水和约0.1vol.到约0.2vol.％FA。通常，可以使用约10μl到约100μl的洗涤溶液以洗涤多孔整料介质80中捕获的样品。然后用洗脱溶液洗脱由多孔整料介质80捕获的化合物。洗脱溶液的含量和体积和洗脱时间可以根据所需的洗脱类型而变化。在需要快速洗脱的情况下，洗脱溶液可以包含水、约20vol.％到60vol.％范围内的有机组分和约0.2vol.％FA；使用约1μl到约100μl的洗脱溶液从多孔整料介质80洗脱捕获化合物。可以快速地将包含样品的液体溶液推过提取介质42。提取介质42中的化合物结合迅速发生，并且洗脱时间取决于所需的应用。使用快速梯度进行等度洗脱或洗脱可实现极快的性能，可以在需要高通量的情况下与自动化系统一起使用。当与高分辨率质谱组合使用时，可以使用快速洗脱以识别如蛋白质等化合物。在需要快速分析如微生物识别的情况下，这种方法可能是有用的。当需要更详细的分析时，可以缓慢进行洗脱，从而允许化合物根据所需的特性从提取盒10顺序洗脱，如分子量、电荷、疏水相互作用或与提取盒10的组分的其它亲和型相互作用。可以用短(例如，约5分钟)或长(例如，约30分钟)洗脱梯度进行缓慢洗脱。例如，在实施例中，洗脱溶剂中有机组分的百分比可以在整个梯度中连续或逐步增加，以允许在所需的持续时间内洗脱。较长的洗脱持续时间使得能够分析单个目标化合物，如微生物样品中的抗生素抗性标记物或来自活组织检查的癌症生物标记物。应用梯度进行有效化合物分离的可能性允许用户避免必须使用昂贵且耗时的分析柱。分析柱多次使用，需要洗涤步骤以避免从一个样品携带到另一个样品。本提取盒10可以是一次性的并且使用户能够避免洗涤步骤并从一个样品携带到另一个样品。
可以收集洗脱的化合物用于后续分析，直接进入分析系统(例如，LC-MS系统)，或与基质混合并点样用于MALDI分析。
上面呈现的提取盒10的额外讨论可以在美国专利申请号14/735,900中找到，其以其整体并入本文。
实例1
下面描述的是用于识别可以使用如上所述的提取盒(例如，单次使用提取盒)的微生物的方法。微生物(例如，感染物)可以在包含干扰哺乳动物蛋白和来自微生物的蛋白质的流体中。
在初始步骤中，方法包含从包含哺乳动物蛋白和来自微生物的蛋白质的流体(例如，全血、血液培养物、脑脊髓液或尿液)制备裂解物。在一个实施例中，裂解物可以通过以下制备：(a)如果流体中存在哺乳动物细胞，通过使哺乳动物细胞与被选择用于裂解哺乳动物细胞但不裂解微生物细胞的裂解剂(例如，天然或合成洗涤剂)接触来裂解哺乳动物细胞，(b)将微生物的细胞与裂解的哺乳动物细胞分离，(c)洗涤微生物的细胞，(d)裂解微生物的细胞以释放其内容物，以及(e)将未裂解的微生物细胞和细胞片段与微生物细胞的内容物分离。
方法进一步包含将衍生自微生物的蛋白质与哺乳动物蛋白分离。分离包含(a)提供含有色谱介质层的单次使用提取盒，(b)将裂解物加入提取盒并使裂解物流过色谱介质层，(c)用洗涤缓冲液洗涤提取盒；以及(d)选择性地洗脱与色谱介质结合的蛋白质，以产生至少一种经过洗脱的级分。在一个实施例中，选择性地洗脱可以包含使不同浓度的水性洗脱缓冲液流过色谱介质层，所述洗脱缓冲液包含10vol％到60vol％浓度范围内的极性有机溶剂(例如乙腈)。所述方法进一步包含对所述至少一种经过洗脱的级分进行蛋白质质谱分析，以识别血液样品中一种或多种感染物的存在。质谱分析技术的合适实例包含但不限于MALDI-TOF、ESI-MS或ESI-MSn(例如，MS/MS)。
本文描述的方法适用于许多类型的微生物和许多类型的基质。在一个实施例中，所述微生物是革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、古细菌、分枝杆菌、支原体、酵母、病毒和丝状真菌中的一种或多种。
在一个实施例中，可以通过使流体样品与选择以裂解流体中的哺乳动物细胞但不裂解微生物细胞的裂解剂接触来裂解哺乳动物细胞(如果存在)。例如，某些洗涤剂(例如，非离子、阴离子、阳离子、两性离子洗涤剂)可能能够有效地裂解哺乳动物细胞。在另一个实例中，裂解剂可以是皂苷。皂苷是植物衍生的化合物，其是具有一个或多个亲水性糖苷部分与亲脂性三萜衍生物组合的两亲性糖苷。皂苷具有类似洗涤剂的性质，并且由于它们的双相性质，可能特别适合破坏哺乳动物细胞。相反，细菌细胞具有刚性细胞壁，使其能够通过洗涤剂处理保持完整。
在一个实施例中，方法可以进一步包含将微生物的细胞与裂解的哺乳动物细胞分离。例如，可以通过离心(例如，12,000g，2分钟)流体样品以集结微生物细胞并随后处理上清液完成分离。方法可以进一步包含洗涤微生物的细胞以洗去衍生自哺乳动物细胞的蛋白质。洗涤可以通过例如将微生物细胞重悬于合适的缓冲液(例如磷酸盐缓冲液、TRIS缓冲液等)中并且然后通过离心将其重排来完成。洗涤可以根据需要重复多次(例如，两次)。
在一个实施例中，方法可以进一步包含裂解微生物的细胞以释放其内容物。微生物细胞的裂解可以通过本领域已知的任何方法完成。微生物(例如细菌、真菌、支原体细胞、病毒等)的破坏可以通过本领域公知的机械、化学、酶和其它方法实现。机械方法包含珠击、使用压力如法式压力机等、超声处理、研磨、或本领域已知的其它方法。化学方法包含暴露于洗涤剂或离液剂如尿素、硫脲或胍HCL以裂解微生物细胞并溶解其内容物。替代性地，有机酸/溶剂混合物可以用于破坏细胞。酶促方法包含使用溶菌酶、溶葡萄球菌素或其它裂解酶在细菌细胞壁中形成“孔”，其允许内容物泄漏到周围溶液中。在一个实施例中，方法可以进一步包含从微生物细胞的内容物分离细胞片段和未裂解的微生物细胞以产生裂解物。在一个实施例中，可以将细胞重悬在小体积中用于微生物裂解，并且可以通过离心去除细胞片段。在这种情况下，可以通过回收上清液获得裂解物。如果裂解物没有充分浓缩用于质谱分析，则可以例如通过在降低的温度和降低的大气压下蒸发来浓缩裂解物。
在一个实施例中，可以手动将细胞裂解物、一种或多种洗涤缓冲液、一种或多种洗脱缓冲液等添加到提取盒。可以通过重力流动、离心、正压、负压等将流体移动通过提取盒。在另一个实施例中，提取盒可以在液相色谱系统中内联，并且可以通过泵将一种或多种洗涤缓冲液、一种或多种洗脱缓冲液等添加到提取盒。
在使裂解物与色谱介质接触后，方法可以进一步包含选择性地洗脱与色谱介质结合的蛋白质。使用的洗脱方案可以至少在某种程度上取决于色谱介质的化学性质或与色谱介质结合的蛋白质的化学性质。在示例性实施例中，色谱介质是疏水相互作用介质(例如，反相介质)，并且洗脱缓冲液是水/有机混合物。例如，洗脱缓冲液可以包含水和乙腈，其范围为约5vol％乙腈到约75vol％乙腈(例如，约10vol％乙腈到约60vol％乙腈)。在一个实施例中，提取盒上的蛋白质是等度洗脱的。也就是说，可以以逐步的方式从提取盒洗脱蛋白质。例如，可以将含有20％、40％和60％乙腈的水性缓冲液添加到提取盒，并且可以收集洗脱的级分。在另一个实施例中，可以使具有增加的乙腈浓度的缓冲液梯度(例如，10vol％乙腈到60vol％乙腈)流过提取物，并且可以收集洗脱的级分。
在选择性地洗脱与色谱介质结合的蛋白质的步骤后，方法可以进一步包含使至少一种经过洗脱的级分经历蛋白质质谱分析(例如，MALDI、ESI-MS或ESI-MS/MS中的一种)的步骤。
实例2
下面描述的是用于识别可以包含如上所述的提取盒(例如，单次使用提取盒)的微生物的试剂盒。微生物(例如，感染物)可以在包含干扰哺乳动物蛋白和来自微生物的蛋白质的流体中。
试剂盒可以包含样品裂解管，所述样品裂解管包括选择用于选择性地裂解样品中的哺乳动物细胞而不是待识别的微生物细胞的洗涤剂(例如，管中干燥的洗涤剂)，微生物裂解缓冲液和单次使用提取盒，所述单次使用提取盒包括用于快速和选择性分离哺乳动物蛋白与微生物蛋白的色谱介质。所述试剂盒进一步包含识别流体中的所述微生物的说明书，其用于通过以下来实现：裂解体液中的哺乳动物细胞；裂解所述微生物的细胞；使用所述提取盒将所述微生物的蛋白质与哺乳动物蛋白分离；以及通过使所述微生物的蛋白质经历质谱分析来识别所述微生物。
在一个实施例中，所述试剂盒进一步包含被选择用于洗脱所述提取盒的至少一种经过洗脱的级分的洗脱缓冲液，所述经过洗脱的级分包括足以识别所述微生物的微生物蛋白。例如，洗脱缓冲液可以包含水和乙腈，其范围为约5vol％乙腈到约75vol％乙腈(例如，约10vol％乙腈到约60vol％乙腈)。
实例3
现在参考图4，本公开的具体方法。图4的流程图中所示的方法具体涉及用于从衍生自阳性血液培养物的裂解物中分离微生物的蛋白质与血红蛋白的方法。尽管如此，虽然图4中所示的方法是关于血液培养物描述的，但图4的方法适用于其它样品类型，如但不限于尿液、脑脊髓液和全血。方法还适用于衍生自临床样品的纯培养物或混合培养物，包含但不限于脓液、泪液、鼻涕、淋巴液、滑液、粪便、痰、伤口和身体部位拭子、以及来自其它来源的样品，包含工业或环境样品，如食物(例如肉类和乳制品样品、水果和蔬菜)、饮料、土壤、水(例如城市废水)、空气和表面拭子。
血液是适用于本文所述方法的良好实例，因为血液是通过质谱识别蛋白质的最具挑战性的基质之一。同样地，从疑似患有败血症的患者的阳性血液培养瓶识别微生物是临床微生物学中最重要的工作流程之一，并且对于患者护理是关键的。可以使用完整蛋白质作为分析物通过质谱(MS)识别微生物，如使用MALDI或ESI仪器所示。阳性血液培养物样品是非常复杂且具有挑战性的基质，除了目标微生物之外包含人血细胞、血浆和培养基组分。
图4中所示的方法包含SPE尖端以在MS分析之前纯化完整蛋白质。来自微生物提取物的蛋白质与SPE尖端结合，在那里它们被洗涤并随后洗脱到MS分析中。使用增加有机物(例如，乙腈(ACN))的LC梯度以分离结合到尖端的蛋白质，可以将微生物蛋白与人血红蛋白分离。
人血红蛋白(Hb)是干扰血液培养物样品的MS分析的主要组分。当裂解人红细胞时，血红蛋白以接近100mg/ml的浓度释放到液体。人血红蛋白由两条多肽链组成，即α(α)链和β(β)链。由于人血红蛋白使用活性结合机制与许多微生物结合，即使洗涤微生物集结粒也不能有效地去除污染蛋白。令人惊讶和出乎意料的是，发现本文其它地方更详细描述的SPE尖端可以用于从细菌肽快速分离血红蛋白。例如，工作流程400的样品制备可以在约10分钟到15分钟内完成，并且质谱分析可以在几分钟内完成，例如，小于10分钟、小于5分钟或在约一分钟或更短时间内完成。
工作流程400包含提供阳性血液培养物的第一步骤410。可以根据本领域公认的实践培养全血。通常，将血液收集在至少两个单独的无菌瓶中并与培养基混合用于好氧和厌氧培养。根据工作流程400，可以提交评分为微生物生长阳性的样品用于额外分析。
现在参考方法400的步骤420，方法进一步包含裂解样品中存在的人细胞(即，红细胞、血小板、白细胞等)的步骤。在所示的实施例中，通过使细胞与皂苷接触然后超声处理来裂解人细胞。在一个实施例中，可以将皂苷干燥到用于制备裂解物的管壁上。向管添加血液培养物再水化并活化皂苷。虽然在此实例中使用皂苷，但可以理解可以使用其它裂解剂，如但不限于某些洗涤剂(例如，非离子洗涤剂、阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、两性离子洗涤剂)。
在裂解哺乳动物细胞后，步骤430包含通过在例如12,000xg下离心2分钟从哺乳动物细胞分离微生物细胞，并且随后处理上清液。步骤440可以进一步包含洗涤微生物的细胞以洗去衍生自哺乳动物细胞的蛋白质(例如，血红蛋白)。洗涤可以通过例如在超声处理的帮助下将微生物细胞重悬于合适的缓冲液(例如磷酸盐+EDTA缓冲液、TRIS缓冲液等)中并且然后通过离心将其重排来完成。洗涤可以根据需要重复多次(例如，两次)。
在步骤440中洗涤后，可以在步骤450中裂解微生物的细胞以释放其内容物。微生物细胞的裂解可以通过本领域已知的任何方法完成。微生物(例如细菌、真菌、支原体细胞、病毒等)的破坏可以通过本领域公知的机械、化学、酶和其它方法实现。机械方法包含珠击、使用压力如法式压力机等、超声处理、研磨、或本领域已知的其它方法。化学方法包含暴露于洗涤剂或离液剂如尿素、硫脲或胍HCL以裂解微生物细胞并溶解其内容物。替代性地，有机酸/溶剂混合物可以用于破坏细胞。酶促方法包含使用溶菌酶、溶葡萄球菌素或其它裂解酶在细菌细胞壁中形成“孔”，其允许内容物泄漏到周围溶液中。在步骤450的所示实施例中，通过添加一定体积(例如，100μl)含有约50％甲酸和25％ACN的水性溶液，超声处理45秒，添加另一种一定体积(例如，100μl)的50％CAN，并且在12,000xg下离心5分钟来裂解微生物细胞。
通过从步骤450收集一定体积的上清液，稀释(例如，5x，如果需要)，并将澄清的裂解物加载到SPE柱上，可以在步骤460中纯化蛋白质用于质谱分析。可以选择SPE柱的色谱介质以选择性地结合干扰蛋白、来自至少一种微生物的蛋白质或两者。同样地，可以选择色谱介质以选择性地至少部分地清洁或纯化来自至少一种微生物的蛋白质，使得可以通过质谱(例如，MALDI或LC/MS)识别至少一种微生物。色谱介质的合适实例包含但不限于离子交换介质、亲和色谱介质、尺寸排阻介质、疏水相互作用介质和其组合。在一个实施例中，提取盒是单次使用的一次性柱。可以手动装载、洗涤、洗脱等提取盒，或者提取盒可以内嵌包含在液相色谱系统中。
在步骤450中纯化微生物的蛋白质可以进一步包含将裂解物添加到提取盒并允许裂解物流过色谱介质层，并且将洗涤缓冲液添加到提取盒并允许洗涤缓冲液流过色谱介质层。可以允许裂解物和洗涤缓冲液被动地流过柱，或者可以通过例如离心或正压迫使它们通过。
在步骤450中纯化微生物的蛋白质可以进一步包含选择性地洗脱与色谱介质结合的蛋白质。使用的洗脱方案可以至少在某种程度上取决于色谱介质的化学性质或与色谱介质结合的蛋白质的化学性质。在示例性实施例中，色谱介质是疏水相互作用介质(例如，反相介质)，并且洗脱缓冲液是水/有机混合物。例如，洗脱缓冲液可以包含水和乙腈，其范围为约5vol％乙腈到约75vol％乙腈(例如，约10vol％乙腈到约60vol％乙腈)。在一个实施例中，一种或多种蛋白质可以在至少一种级分中洗脱。例如，一种或多种蛋白质可以以不同的洗脱缓冲液比率(如在梯度中)洗脱并作为级分收集。在另一个实例中，一种或多种蛋白质可以以选定的洗脱缓冲液组成比率等度洗脱，并且可以收集单一级分。同样地，一种或多种蛋白质可以以两种或更多种选择的洗脱缓冲液组成比率等度洗脱，并且可以收集两种或更多种级分。
在纯化蛋白质的步骤460后，方法400可以进一步包含使至少一种经过洗脱的级分经历蛋白质质谱分析的步骤470。质谱分析的合适实例包含但不限于MALDI和LC-ESI-MS。
实例4到7:一种或多种微生物的识别
实例4-使用LyC富集和SPE-LC-ESI-MS分析从血液培养物识别微生物
使用图4的血液培养物工作流程将血液培养物样品纯化成提取物，可以进一步分析所述提取物以产生样品中存在的病原体的识别。在工作流程中，使用真实临床样品或加标样品作为起始材料。临床样品由HUSLAB(赫尔辛基医院区和Uusimaa实验室)提供；将来自患者的血液样品吸入BacT/ALERT(bioMérieux，USA)血液培养瓶中并置于BacT/ALERT 3D(bioMérieux，USA)血液培养仪器中直到阳性。在分析结果并且医院不再需要阳性血液培养瓶之后，从医院获得他们。血液培养仪器的阳性信号到获得样品的时间从一天(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)变化到七天(对于一些酵母和更罕见的病原体)。在实验室中使用捐赠的血液和来自内部培养物收集物的菌株来制备加标样品。通过在35℃下孵育过夜或在30℃下周末孵育，使来自培养物收集物的细菌在合适的培养板上恢复，如绵羊血琼脂、FAA琼脂、沙氏葡萄糖琼脂或巧克力琼脂。厌氧细菌在厌氧条件(使用例如AnaeroGen 2.5L，Oxoid，UK)下生长并且流感嗜血杆菌在CO2气氛(使用例如Pack-CO2，日本三菱煤气化工公司(Mitsubishi Gas Chemical Company，Japan))下生长。琼脂平板通常来自芬兰的Tammer-Tutkan Maljat。
为了产生加标样品，通常用1μl环接触来自培养的琼脂平板的一个菌落并接种到8ml血液中。然后将加标血液注入血液培养瓶中。例如，BacT/Alert FA Plus好氧或BacT/Alert FN Plus厌氧血液培养瓶(均为bioMérieux，France)分别用于好氧和厌氧微生物。将血液培养瓶在血液培养仪器中孵育，如BacT/ALERT 3D 60，bioMérieux，USA；VersaTrek，美国赛默飞世尔科技或BD BACTEC 9050，Becton Dickinson，USA，直到检测出阳性。
然后将样品从阳性血液培养瓶转移到样品小瓶中用于裂解加离心(LyC)富集。通常使用100μl到500μl范围的血液培养物样品体积。测试了几种不同的物种和菌株，包含革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和酵母。这些包含但不限于常见的败血症相关病原体，如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌。用0.1％皂苷制备样品小瓶，在罩中干燥一夜期间已经将所述皂苷干燥到样品小瓶壁。皂苷用于裂解红细胞并从其释放血红蛋白。进行两次洗涤/离心步骤以从样品去除空的红细胞和血红蛋白。具体地说，将小瓶以12,000×g离心2分钟(德国赛默飞世尔科技，MicroCL 21Centrifuge)，以使一种或多种微生物形成集结粒，并将裂解的红细胞和其释放的血红蛋白作为较轻的组分留在上清液中。在此阶段，集结粒仍然高度浓缩，来自血液培养物的红细胞和其它蛋白质可能会干扰进一步的分析方法。为了尽可能多地去除这些蛋白质，需要洗涤步骤。首先，通过移液去除上清液，并且然后将100μl到300μl体积的洗涤缓冲液，如10mM NaHPO4+1.8mM KH2PO4+1mM EDTA(pH～7.2)加入到小瓶。通过超声破碎集结粒(12秒开启，5秒关闭，12秒开启；100％振幅，3N的力)。为了去除空的红细胞并使微生物形成集结粒，将小瓶离心(30秒；12,000×g)并通过移液再次去除上清液。此洗涤周期通常重复两次以获得更纯的最终结果。
富集和洗涤阶段之后是裂解阶段，其中微生物被分解。在洗涤周期的最后离心之后，通过移液去除上清液，并且加入100μl裂解缓冲液(50％FA/25％ACN的H2O溶液)，然后混合。加入100μl储存缓冲液(50％ACN的H2O溶液)并将小瓶离心(5分钟；12,000x g)。最后，将提取物收集到蛋白质LoBind管(德国，埃彭多夫)中并储存在-80℃直到进一步分析。
对于固相提取(SPE)-液相色谱(LC)-电喷雾(ESI)-质谱(MS)分析，将衍生自裂解和离心方案的10μl提取物用40μl LC/MS兼容水(美国，赛默飞世尔科技)稀释以实现1:5稀释。然后通过SPE柱浓缩样品，其允许去除样品中的盐和一些小分子。将SPE材料用ACN(Thermo Fisher Scientific，UK)中的50μl 0.2％FA(西班牙，赛默飞世尔科技)润湿，然后在2,000xg(德国，埃彭多夫)下离心2分钟。通过向SPE中加入50μl 0.2％FA实现SPE的平衡，之后将SPE柱以2,000xg离心2分钟。在SPE制备之后，将50μl稀释的样品进料到柱中，并用50μl 0.2％Fa在10％ACN中洗涤柱。在加入并洗涤样品两者之后，再次离心柱(2,000x g，2分钟)。然后用MS分析样品。
将含有样品的SPE柱置于LC自动进样器中并开始LC-ESI-MS分析。溶剂A由0.1％甲酸和10％ACN的水溶液构成，并且溶剂B由0.1％甲酸的ACN构成。用8分钟ACN梯度(2％到33％B)通过柱实现蛋白质的洗脱。使用ESI源电离洗脱的蛋白质，并用Q Exactive HF质谱仪(德国赛默飞世尔科技)分析。使用具有ProSight PD节点(德国赛默飞世尔科技)的Proteome Discoverer软件(第2.0版)搜索获得的MS和MS/MS数据。
从阳性血液培养瓶(含有金黄色葡萄球菌)取出100μl样品，并按照上述方案制备。在图5A到5D中示出了通过LC-ESI-MS分析的血液培养物样品的总离子色谱图(图5A)和三个示例MS谱图(图5B到5D)，示出人源蛋白质与细菌蛋白质的分离。图5B示出了在1.8分钟处洗脱的人α-防御素。图5C示出了在4.0分钟处洗脱的细菌蛋白质。图5D示出了在7.5分钟处洗脱的人血红蛋白α和β链。
如上所述，将来自大肠杆菌阳性血液培养物样品的完整蛋白质结合到SPE尖端中。使用15％ACN(图6A)、17.5％ACN(图6B)、20％ACN(图6C)或40％ACN(图6D)洗脱蛋白质，并通过ESI-MS和直接注入进行分析。在图6A中，主要可以看到用15％ACN洗脱的微生物蛋白，但强度低(未选择用于进一步测试)。在图6B中，可以看到用17.5％ACN洗脱的微生物蛋白，再次其数量相对较少，但人血红蛋白未被洗脱。在图6C中，可见用20％ACN洗脱的微生物蛋白和人血红蛋白α链两者，但人血红蛋白的量低于最丰富的微生物蛋白。峰的强度总体上更高。在图6D中，人血红蛋白是用40％ACN洗脱的最丰富的蛋白质，并且由于高丰度的血红蛋白引起的抑制作用，仅可见少数微生物蛋白。
实例5-使用LyC富集并比较SPE-LC-ESI-MS与MALDI分析的微生物识别
为了比较MALDI Sepsityper试剂盒(Bruker Daltonics)与包含SPE尖端(赛默飞世尔科技)的Lysis+离心法(LyC)的效率，测试了一组具有挑战性的微生物。这包含但不限于常见的败血症相关病原体，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、表皮路邓葡萄球菌和绿色链球菌、无乳链球菌、化脓性链球菌。
取VersaTREK Redox血液培养瓶(美国赛默飞世尔科技)中生长的微生物样品，并且分别通过a)按照MALDI Sepsityper试剂盒-使用说明书和b)LyC方法进行处理。两种方法一式三份进行。在Sepsityper试剂盒工作流程中，样品在蛋白质沉淀之后在25μl 70％FA+25μl ACN中洗脱，这将导致与LyC+SPE提取体积相等的体积，或在12.5μl 70％FA+12.5μlACN中洗脱，这将导致与LyC+SPE提取相比2倍的浓度。在此专利描述的方案之后，用100μl起始材料进行LyC方法。
对于ESI质谱分析，将衍生自裂解和离心方案的10μl提取物用40μl LC/MS兼容水(美国，赛默飞世尔科技)稀释以实现1:5稀释。然后通过固相提取(SPE)浓缩样品，其允许去除样品中的盐和一些小分子。将SPE材料用ACN(Thermo Fisher Scientific，UK)中的50μl0.2％Fa(西班牙，赛默飞世尔科技)润湿，然后在2,000rpm(3 768G)(德国，埃彭多夫)下离心2分钟。通过向SPE中加入50μl 0.2％FA实现SPE的平衡，之后将SPE柱以2,000rpm离心2分钟。在SPE制备之后，将50μl稀释的样品进料到柱中，并用50μl 0.2％Fa在10％ACN中洗涤柱。在加入并洗涤样品两者之后，再次离心柱(2,000rpm，2分钟)。洗涤之后，将SPE尖端置于干净的Eppendorf管中，并加入5μl洗脱溶液。使用四种乙腈浓度(0.2％FA中的17.5％、20％、40％和60％)。将柱以11,000xg(Thermo Scientific Micro CL21Centrifuge)离心15秒以洗脱样品。洗脱之后立即通过汽车将样品在冰块上带到芬兰赫尔辛基的United MedixLaboratories(YML)。
将两种方法的所得提取物应用于bioMerieux Vitek MS仪器。将0.5μl样品置于MALDI板并加入1μl VITEK MS-CHCA基质以与MS(REF411071)一起使用。根据bioMerieux MALDI程序，通过YML进行分析。通过bioMerieux Vitek MS仪器进行的微生物识别基于ID评分。评分高于90％表示识别正确。
表1：使用商业试剂盒(Sepsityper，Bruker Daltonics)对血液培养物样品和此专利中描述的工作流程(LyC+SPE尖端)进行样品制备后用MALDI-TOF分析的结果的比较。来自八个阳性血液培养物的完整蛋白质与SPE尖端结合，并使用17.5％ACN、20％ACN、40％ACN或60％ACN洗脱。使用bioMerieux Vitek MS MALDI仪器分析所有洗脱液。通过以下编码报告最终结果(细菌识别)：白色场＝无细菌识别，-＝错误的细菌识别，+＝ID评分60<x<90且++＝ID评分≥90。尽管Sepsityper试剂盒与本公开的方法之间进行了类似的初始样品制备，但SPE提取盒的添加提高了将主题微生物正确识别到令人惊讶和意想不到的程度的可能性。同样地，这些数据表明存在优选但相对宽的范围(例如，约20％ACN到40％ACN)，其中细菌蛋白质可以从SPE提取盒洗脱以去除干扰的哺乳动物蛋白，从而允许通过MALDI明确识别细菌。
表1
表1，续
实例6-使用LyC富集和SPE-LC-ESI-MS分析从尿液样品识别微生物
尿液样品工作流程用于制备样品，导致提取物用于分析和识别样品内的一种和多种微生物。在工作流程实例中，使用加标样品作为起始材料。从琼脂收获细菌，用PBS洗涤并调节吸光度(A600nm＝1)，产生约1×109cfu/ml。将悬浮液离心并用健康志愿者的尿液重悬集结粒。将含有约106cfu/ml的150μl样品转移到样品小瓶，然后进行类似的洗涤和裂解阶段以及如实例4中所述的SPE-LC-ESI-MS分析。LC工作流程采用增加有机溶剂含量的梯度，有利于降低质谱中尿液化合物的干扰。几种细菌和甚至酵母可能引起尿道感染，并且这个实例包含大肠杆菌，这是这些感染最常见的原因。
图7中示出了读出光谱的实例，并且表2中列出了从样品识别的蛋白质。
表2.从尿液样品识别的蛋白质
簇 说明 分类系统
82581657 DNA结合蛋白HU-β Eco/Sfl
82581652 DNA结合蛋白HU-α Eco
123048783 50S核糖体蛋白L24 Eco
334305782 冷休克样蛋白CspE Eco/Sen
259491921 50S核糖体蛋白L33 Eic
226735184 30S核糖体蛋白S19 Eco
259646975 50S核糖体蛋白L30 Eco
226736319 50S核糖体蛋白L25 Eco
226708274 50S核糖体蛋白L32 Eco
Eco＝大肠杆菌；Sfl＝福氏志贺菌；Sen＝肠沙门氏菌；Eic＝爱德华菌。在表达两种分类法的情况下，两种识别都是合理的。
实例7-使用不同固相提取(SPE)材料的微生物识别工作流程
其中细胞已经被裂解的微生物样品和释放到溶液的蛋白质(微生物提取物)可以用固相提取(SPE)进一步处理，以便在分析之前浓缩蛋白质并去除小分子和盐，例如用质谱。通常，SPE材料包装在柱、尖端内或以例如96孔格式的形式包装。由于与材料和蛋白质的相互作用，材料允许蛋白质的结合。这些相互作用可以是例如亲水/疏水相互作用、离子-离子相互作用或对材料的亲和力。材料必须允许液体流过材料。从柱释放样品，例如增加疏水性或改变通过的溶剂的pH。这种去除可以一次、分步或渐变完成。借助于例如重力、注射器、泵或离心机将液体推过柱。
从大肠杆菌的提取物制备测试样品。通过在含有50vol.％甲酸(FA)和25vol.％乙腈(ACN)的溶剂中裂解大肠杆菌制备提取物。将FA和ACN浓度调节到37.5vol.％ACN和25vol.％FA。如用BCA分析所确定，测试样品中的蛋白质浓度为2mg/ml与3mg/ml之间。稀释测试样品并将1μg到11μg蛋白质应用于提取柱。此测试中使用的提取柱均为具有C8、SDB-XC或RP-4H化学成分的反相柱。SDB-XC(3M)是一种聚(苯乙烯二烯基苯)共聚物，它是球形、多孔和交联的。其它地方解释了RP-4H化学成分。使用两个ThermoFisher Scientific MSIA平台和ThermoFisher Scientific StageTip平台测试C8。
在将测试样品施加到提取柱之前，将介质用具有0.2vol.％FA。然后用含有水和0.2vol.％FA。将总量为1μg到11μg蛋白质的样品推过提取柱中的介质。收集来自样品的流出物用于分析。用含有水和0.1vol.％到0.2vol.％FA。用含有水、60vol.％ACN和0.2vol.％FA。收集洗脱的蛋白质用于分析。
分析流过(FT)样品和洗脱样品的蛋白质浓度。在一些结果中，将多个样品(3个到5个)的洗脱液组合，并在分析之前部分干燥到其原始体积的约1/3。使用Nanodrop BCA测定法(赛默飞世尔科技)确定蛋白质浓度。使用与FT和洗脱液样品中使用的相同的FA和ACN浓度制备牛血清白蛋白标准曲线。表3中提供了结果。
使用来自热带假丝酵母的提取物，用RP-4H尖端和POROS R1板进行另一个实验。将热带假丝酵母提取物制备为上述大肠杆菌提取物，并且将样品以1:5稀释稀释到水(10μl提取物和40μl水)。用具有0.2％FA的50μl ACN润湿加入SPE尖端介质的现有样品，并且将RP-4H尖端或POROS R1板离心以推动液体。然后用50μl 0.2％FA平衡介质，并在施加样品之前再次离心。将样品离心，并且在洗脱之前将介质用50μl 0.2％FA洗涤。用10μl具有0.2％FA的60％ACN洗脱介质以清洁lo结合容器。然后将洗脱液转化为Hamilton注射器并喷雾到质谱仪。图8A到8B示出了RP-4H(图8B)或POROS R1(图8A)纯化的热带假丝酵母的质谱图。
表3.结合不同SPE-尖端材料的大肠杆菌蛋白的实例。
本发明可以在不背离本发明的精神或必要特性的情况下以其它具体形式体现。所描述的实施例应在所有方面均被视为仅是说明性的而非限制性的。因此，本发明的范围是由所附权利要求书而不是由以上说明来指明。落入权利要求书的等效方案的含义和范围内的所有改变都将涵盖在权利要求书的范围内。

Claims (33)

1.一种用于识别流体中的微生物的方法，所述流体包括来自哺乳动物来源的干扰蛋白，所述方法包括：
制备裂解物，所述裂解物包括所述干扰蛋白和来自所述微生物的蛋白质；
使所述裂解物与色谱介质接触，其中所述干扰蛋白和来自所述微生物的所述蛋白质结合到所述色谱介质；
选择性地洗脱结合到所述色谱介质的蛋白质以产生至少一种经过洗脱的级分，其中来自所述微生物的所述蛋白质中富集了所述至少一种经过洗脱的级分并且所述干扰蛋白中缺少所述至少一种经过洗脱的级分；以及
使所述至少一种经过洗脱的级分经历蛋白质质谱分析以识别所述流体中一种或多种微生物的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述流体是血液、血液培养物、尿液或脑脊髓液之一。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述干扰蛋白包含血红蛋白、防御素或其蛋白水解产物中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的方法，其中制备所述裂解物包含：裂解所述微生物的细胞以释放其内容物。
5.根据权利要求4所述的方法，其进一步包括：将细胞片段和未裂解的微生物细胞与所述微生物细胞的所述内容物分离以产生所述裂解物。
6.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括：
提供所述流体；
使所述流体与被选择用于裂解所述流体中的哺乳动物细胞而不是所述微生物的细胞的裂解剂接触；
将所述微生物的所述细胞与经过裂解的哺乳动物细胞分离；
洗涤所述微生物的所述细胞。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述裂解物与色谱介质接触包含：
提供其中具有所选量的所述色谱介质的容器；
将所述裂解物加入所述容器并且使所述裂解物与所述色谱介质混合；
通过离心集结所述色谱介质以将所述色谱介质与所述裂解物分离；
在洗涤缓冲液介质中洗涤所述色谱介质；以及
集结所述色谱介质以将所述色谱介质与所述洗涤缓冲液分离；并且
其中选择性地洗脱结合到所述色谱介质的蛋白质是用洗脱缓冲液执行的。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述裂解物与色谱介质接触包含：
提供含有由所述色谱介质构成的层的提取盒；
将所述裂解物加入所述提取盒并且使所述裂解物流过所述色谱介质层；以及
将洗涤缓冲液加入所述提取盒并且使所述洗涤缓冲液流过所述色谱介质层；并且
其中选择性地洗脱结合到所述色谱介质的蛋白质是用洗脱缓冲液执行的。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述提取盒在液相色谱系统中是内联的，并且所述裂解物是通过泵加入所述提取盒的。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括水和范围为10vol％到60vol％的乙腈。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中蛋白质质谱分析是MALDI或ESI-MS之一。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述色谱介质选自由以下组成的组：反相介质、正相介质、离子交换介质、亲和色谱介质、尺寸排阻介质、疏水相互作用介质和其组合。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述色谱介质由以下制备：选自由以下组成的组的单体：含经取代或未经取代的乙烯基的单体、含经取代或未经取代的丙烯酸酯的单体、含经取代或未经取代的甲基丙烯酸酯的单体、丙烯酰胺、经氟取代的乙烯；选自由以下组成的组的聚合物：聚烯烃、聚酯、聚氨酯、聚酰胺；和其组合。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述单体包含至少两种单体的混合物，所述单体以10vol.％到70vol.％的量存在。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述色谱介质由以下中的任何两种或更多种的混合物制备：二乙烯基苯、苯乙烯和乙基乙烯基苯。
16.一种用于识别流体中的微生物的方法，所述流体包括干扰哺乳动物蛋白和来自所述微生物的蛋白质，所述方法包括：
制备裂解物，所述裂解物包含所述流体中的所述干扰哺乳动物蛋白和来自所述微生物的所述蛋白质，其中所述流体选自由以下组成的组：全血、血液培养物、尿液和脑脊髓液，其中制备所述裂解物包含：
裂解所述微生物的细胞以释放其内容物，所述内容物包括来自微生物的蛋白质；
将来自所述微生物的所述蛋白质与所述干扰哺乳动物蛋白分离，其中所述分离包含以下步骤：
(a)提供一次性提取盒，所述提取盒含有色谱介质层；
(b)将所述裂解物加入所述提取盒并且使所述裂解物流过所述色谱介质层；
(c)用洗涤缓冲液洗涤所述提取盒；以及
(d)选择性地洗脱结合到所述色谱介质的蛋白质以产生至少一种经过洗脱的级分，其中所述选择性地洗脱包含：流动不同浓度的洗脱缓冲液，所述洗脱缓冲液包含浓度范围为10vol％到60vol％的极性有机溶剂；以及
使所述至少一种经过洗脱的级分经历蛋白质质谱分析以识别血液样品中一种或多种感染物的存在。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述微生物是以下中的一种或多种：革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、古细菌、分枝杆菌、支原体、酵母、病毒和丝状真菌。
18.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括：将未裂解的微生物细胞和细胞片段与所述微生物细胞的所述内容物分离以产生所述裂解物。
19.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括以下步骤：
如果所述流体中存在哺乳动物细胞，则通过使所述哺乳动物细胞与被选择用于裂解所述哺乳动物细胞而不是所述微生物的所述细胞的裂解剂接触，从而裂解所述哺乳动物细胞；
将所述微生物的所述细胞与经过裂解的哺乳动物细胞分离；以及
洗涤所述微生物的所述细胞。
20.根据权利要求19所述的方法，其中被选择用于裂解所述哺乳动物细胞的所述裂解剂是洗涤剂。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述洗涤剂是皂苷。
22.根据权利要求16所述的方法，其中所述提取盒在液相色谱系统中是内联的，并且所述裂解物是通过泵加入所述提取盒的。
23.根据权利要求16所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括水和10vol％到60vol％的乙腈。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述提取盒上的所述蛋白质被等度洗脱。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述提取盒上的所述蛋白质以约10vol％到60vol％乙腈的梯度洗脱。
26.根据前述权利要求16到25中任一项所述的方法，其中蛋白质质谱分析是MALDI、ESI-MS、或ESI-MS/MS之一。
27.一种用于识别流体样品中的微生物的试剂盒，其包括：
样品裂解管，其包括被选择用于选择性地裂解所述样品中的哺乳动物细胞而不是待识别的所述微生物的细胞的洗涤剂；
微生物裂解缓冲液；
一次性提取盒，其包括用于快速且选择性地将哺乳动物蛋白与微生物蛋白分离的色谱介质；以及
识别流体中的所述微生物的说明书，其用于通过以下来实现：裂解体液中的哺乳动物细胞；裂解所述微生物的细胞；使用所述提取盒将所述微生物的蛋白质与哺乳动物蛋白分离；以及通过使所述微生物的蛋白质经历质谱分析来识别所述微生物。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其进一步包括被选择用于将至少一种经过洗脱的级分从所述提取盒洗脱掉的洗脱缓冲液，所述至少一种经过洗脱的级分包括足以识别所述微生物的微生物蛋白。
29.根据权利要求27或28所述的试剂盒，其中所述色谱介质选自由以下组成的组：离子交换介质、亲和色谱介质、尺寸排阻介质、疏水相互作用介质和其组合。
30.根据权利要求27、28或29所述的试剂盒，其中所述色谱介质由以下制备：选自由以下组成的组的单体：含经取代或未经取代的乙烯基的单体、含经取代或未经取代的丙烯酸酯的单体、含经取代或未经取代的甲基丙烯酸酯的单体；丙烯酰胺；聚烯烃；聚酯；聚氨酯、聚酰胺；经氟取代的乙烯；和其组合。
31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述单体包含至少两种单体的混合物，所述单体以10vol.％到70vol.％的量存在。
32.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述色谱介质由二乙烯基苯和乙基乙烯基苯的混合物制备。
33.根据权利要求27到32中任一项所述的试剂盒，其中蛋白质质谱分析是MALDI或ESI-MS之一。
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MARIJA BRGLES 等: ""Selectivity of monolithic supports under overloading conditions and their use for separation of human plasma and isolation of low abundance proteins"", 《J CHROMATOGR A》 *
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YINGDI ZHU 等: ""Sensitive and fast identification of bacteria in blood samples by immunoaffinity mass spectrometry for quick BSI diagnosis"", 《CHEM. SCI》 *
刘海洪: "MALDI TOF MS在细菌检测和鉴定中的应用", 《微生物学免疫学进展》 *
吕万胜等: "hVDAC1蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及其结构功能的初步表征", 《南京大学学报(自然科学)》 *
徐怀德: "《天然产物提取工艺学》", 30 June 2008, 中国轻工业出版社 *
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