ES2871549T3 - Métodos y kits de espectrometría de masas para identificar un microorganismo - Google Patents

Abstract

Un método para identificar un microorganismo en un líquido que comprende proteínas interferentes de una fuente de mamífero, en donde las proteínas interferentes incluyen preferentemente una o más hemoglobina, defensinas o sus productos de proteólisis, el método comprende: preparar un lisado, el lisado comprende las proteínas interferentes y las proteínas del microorganismo; poner en contacto el lisado con un medio cromatográfico, en donde las proteínas interferentes y las proteínas del microorganismo se unen al medio cromatográfico; eluir selectivamente las proteínas unidas al medio cromatográfico para producir al menos una fracción eluida, en donde la al menos una fracción eluida está enriquecida en las proteínas del microorganismo y reducida en las proteínas interferentes; y someter la al menos una fracción eluida a análisis de espectrometría de masas de proteínas, tal como MALDI o ESI-MS, para identificar la presencia de uno o más microorganismos en el líquido en donde el líquido es preferentemente uno de sangre, un hemocultivo, orina o líquido cefalorraquídeo.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y kits de espectrometría de masas para identificar un microorganismo

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad y el beneficio de la solicitud finlandesa núm. 20165634, presentada el 25 de agosto de 2017, titulada APPARATUS AND METHODS FOR IDENTIFICATION OF A MIX MICROORGANISM IN AN INTERFERING MATRIX.

Antecedentes

En los últimos años, la espectrometría de masas ha ganado popularidad como herramienta para identificar microorganismos debido a su mayor exactitud y menor tiempo de obtención de resultados en comparación con los métodos tradicionales para identificar microorganismos. Hasta la fecha, el método de espectrometría de masas más común usado para la identificación microbiana es la espectrometría de masas de desorción e ionización láser asistida por matriz y tiempo de vuelo (MALDI-TOF). En ^mA^lDI-TOF, las células de un microorganismo desconocido se mezclan con una solución de matriz adecuada que absorbe luz ultravioleta y se dejan secar en una placa de muestra. Alternativamente, se usa extracto de células microbianas en lugar de las células intactas. Después de la transferencia a la fuente de iones de un espectrómetro de masas, un rayo láser se dirige a la muestra para la desorción e ionización de las proteínas y los datos espectrales de masas dependientes del tiempo se recopilan. El espectro de masas de un microorganismo producido por los métodos MALDI-TOF revela una serie de picos de péptidos intactos, proteínas y fragmentos de proteínas que constituyen la "huella dactilar" del microorganismo. Este método se basa en la correspondencia de los patrones del perfil de picos en el espectro de masas de un microorganismo desconocido con una base de datos de referencia que comprende una colección de espectros de microorganismos conocidos obtenidos con el uso de sustancialmente las mismas condiciones experimentales. Cuanto mejor sea la correspondencia entre el espectro del microorganismo aislado y un espectro en la base de datos de referencia, mayor será el nivel de confianza en la identificación del organismo a nivel de género, especie o, en algunos casos, subespecie. Debido a que el método se basa en la correspondencia de los patrones de picos en los espectros de masas MALDI-TOF, no es necesario identificar o caracterizar de otro modo las proteínas representadas en el espectro del microorganismo desconocido para identificarlo. Y. Zhu y otros, Chemical Science (2016), vol. 7, núm. 5, páginas 2987-2995 describen la identificación sensible y rápida de bacterias en muestras de sangre por espectrometría de masas de inmunoafinidad para un diagnóstico rápido de BSI.

Se han usado varios métodos adicionales de espectrometría de masas para la detección de microorganismos -estos incluyen los denominados métodos "ascendentes" y "descendentes". En el enfoque ascendente, un extracto de proteína puede digerirse con una o más proteasas, seguido de una o más dimensiones de separación de los péptidos mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas. Al comparar las masas de los péptidos proteolíticos o sus espectros de masas en tándem con los predichos por una base de datos, se pueden identificar los péptidos y ensamblar múltiples identificaciones de péptidos en una identificación de proteína.

En el enfoque descendente, los microorganismos pueden identificarse y, en algunos casos, cuantificarse mediante el análisis de proteínas intactas que no se han sometido a digestión enzimática antes de la separación y espectrometría de masas. Las proteínas intactas extraídas de un microorganismo se separan preferentemente mediante una o más dimensiones de cromatografía líquida (aunque los extractos de proteínas se pueden infundir directamente en el espectrómetro de masas en algunos métodos), seguido de la infusión en un espectrómetro de masas. Los organismos pueden identificarse en una primera etapa de espectrometría de masas (MS) mediante la determinación de la masa intacta de un número suficiente de proteínas en el extracto. En una segunda etapa de espectrometría de masas (MS/MS), las proteínas seleccionadas de la primera etapa de espectrometría de masas pueden fragmentarse en el espectrómetro de masas; el patrón de fragmentación de las proteínas puede usarse para mejorar la certeza de la identificación en la primera etapa. Las principales ventajas del enfoque descendente incluyen la capacidad de detectar productos de degradación, variantes de secuencia y combinaciones de modificaciones postraduccionales.

El uso de la espectrometría de masas ha revolucionado la microbiología clínica y ha acortado los tiempos de diagnóstico y ha aumentado la precisión del diagnóstico. Sin embargo, el análisis de espectrometría de masas, MALDI-TOF en particular, no se ha adoptado ampliamente para algunas muestras clínicas porque estas muestras incluyen matrices complejas (por ejemplo, proteínas de origen mamífero) que pueden afectar la confiabilidad y exactitud del análisis. Por ejemplo, los hemocultivos representan la muestra más urgente y crítica para el laboratorio de microbiología. Si bien la atención del paciente crítico se beneficiaría más de un análisis exitoso de los hemocultivos con el uso de espectrometría de masas (debido a que el tiempo de obtención de resultados es significativamente más rápido), esta aplicación no se usa ampliamente en la actualidad porque las muestras de hemocultivo siguen siendo el tipo de muestra más problemáticas para la espectrometría de masas. De hecho, MALDI-TOF típicamente solo puede suministrar una sensibilidad y especificidad muy bajas para hemocultivos positivos (aproximadamente 70-80 %). Otras muestras con matrices igualmente complejas (por ejemplo, orina y líquido cefalorraquídeo) también suministran baja sensibilidad y especificidad. Debido a que la sensibilidad del análisis MALDI para muestras con matrices complejas es tan baja, existe un peligro significativo de producir falsos negativos para muestras verdaderamente positivas y, quizás incluso peor, falsos positivos para muestras negativas. Breve resumen

La presente invención incluye un nuevo método y un sistema para la identificación de microorganismos en muestras con proteínas y otro material biológico de fuentes que no son microorganismos (por ejemplo, proteínas de origen mamífero) que pueden interferir con la identificación de los microorganismos. La identificación de microbios a partir de líquidos, tejidos y cultivos de pacientes con sospecha de tener una infección microbiana es uno de los ensayos más críticos en microbiología clínica y es vital para la atención del paciente. Los microbios pueden identificarse por espectrometría de masas (MS) con el uso de proteínas intactas como analitos, como se ha demostrado con el uso de MALDI-TOF o ionización por electropulverización (ESI). Sin embargo, muchas muestras clínicas incluyen una matriz muy compleja y problemática (por ejemplo, células de mamífero, proteínas, líquidos corporales, componentes de medios, etc.) además del(de los) microorganismo(s) diana.

En tales muestras, las proteínas de los microorganismos que se necesita identificar por espectrometría de masas pueden extraerse, pero su señal puede verse suprimida o superada por proteínas que están en la matriz (por ejemplo, proteínas de origen mamífero). Un ejemplo de una matriz particularmente problemática es la sangre. En pacientes con sospecha de sepsis, la identificación rápida del microbio causal puede significar literalmente la diferencia entre la vida y la muerte. Sin embargo, cuando se lisan los glóbulos rojos, la hemoglobina se une a las células bacterianas en alta concentración y la hemoglobina puede pasar al lisado microbiano y puede superar la señal de las proteínas del(de los) microorganismo(s). El problema consiste en eliminar de manera rápida y eficiente una cantidad suficiente de la hemoglobina para permitir que la señal de las proteínas microbianas sea visible sin eliminar tanta proteína que la intensidad de la señal general sea demasiado baja. Los líquidos tales como, pero sin limitarse a, la orina y el líquido cefalorraquídeo presentan problemas de matriz similares.

Los métodos y sistemas descritos en el presente documento incluyen el uso de un medio cromatográfico de un solo uso para purificar proteínas intactas antes del análisis de espectrometría de masas. Las proteínas del extracto microbiano se unen al medio cromatográfico, donde se lavan y después se eluyen para el análisis de espectrometría de masas. De manera sorprendente e inesperada, se ha descubierto que el medio cromatográfico y los métodos descritos en el presente documento pueden eliminar de forma rápida y eficiente una porción sustancial de material biológico interferente (por ejemplo, proteínas de mamífero) de un lisado celular crudo mientras se conserva una alta intensidad de la señal y se elimina una cantidad de la(s) proteína(s) interferente(s) suficiente para permitir la identificación del(de los) microorganismo(s) mediante análisis de espectrometría de masas.

Los procedimientos descritos en el presente documento pueden ser extremadamente rápidos. Asimismo, el método de la presente invención es simple y rápido porque no hay necesidad de digestión química o enzimática de una muestra y el procesamiento de datos se realiza en tiempo real. La preparación de la muestra de un cultivo o (si se asume una carga microbiana suficientemente alta) un líquido corporal o un hisopado de superficie puede llevarse a cabo en tan solo aproximadamente 15 minutos (por ejemplo, de 15 a 30 minutos). El análisis de espectrometría de masas puede realizarse en unos pocos minutos, por ejemplo, menos de 10 minutos, menos de 5 minutos o dentro de aproximadamente un minuto o menos. La espectrometría de masas inicial generalmente es suficiente para identificar el(los) microorganismo(s) a nivel de género o especie. Es posible que se requieran análisis de espectrometría de masas adicionales (por ejemplo, MS dirigida y MSn) para caracterizar más el microorganismo identificado en la primera etapa de espectrometría de masas para, por ejemplo, identificar el(los) microorganismo(s) a nivel de cepa, subespecie, patovar o serovar o, según sea necesario, determinar factores de virulencia, marcadores de resistencia a antibióticos, marcadores de susceptibilidad a antibióticos u otras características. Esta segunda fase puede realizarse en unos pocos minutos, por ejemplo, menos de 15 minutos, menos de 10 minutos o dentro de aproximadamente cinco minutos o menos. Ambas fases se basan en la detección e identificación de proteínas intactas derivadas de los microorganismos, sin degradación química, física o enzimática de esas proteínas a sus péptidos sustituyentes.

El método es aplicable a una variedad de tipos de muestras diferentes, que incluyen muestras de cultivo puro o mixto derivadas de muestras clínicas que incluyen, sin limitación, sangre, pus, orina, líquido lagrimal, secreción nasal, linfa, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, heces, esputo, hisopados de heridas y sitios del cuerpo, y a muestras derivadas de otras fuentes, que incluyen muestras industriales o ambientales, tales como alimentos (por ejemplo, muestras de carne y productos lácteos, frutas y verduras), bebidas, suelo, agua (por ejemplo, aguas residuales municipales), aire e hisopados de superficies. Y si bien el siguiente análisis se enfoca en la identificación de microorganismos a través de la caracterización de proteínas, los métodos y sistemas analizados en el presente documento son igualmente aplicables a la identificación de microorganismos por medio de la caracterización de una o más moléculas pequeñas, lípidos o carbohidratos, y similares.

En las infecciones agudas, los patógenos usualmente están presentes en grandes cantidades. Por ejemplo, en el caso de la inflamación del tracto urinario o de los riñones, hay alrededor de 105 a 107 patógenos presentes en un mililitro de orina. Dado que solo se requieren alrededor de 103 a 104 microbios para el análisis de espectrometría de masas, la centrifugación producirá inmediatamente cantidades suficientes de patógenos para la identificación por espectrometría de masas.

Si hay más de 105 patógenos microbianos presentes en la muestra centrifugada, los sedimentos depositados son visibles a simple vista. Pero incluso si hay menos patógenos microbianos en el líquido corporal, se pueden aplicar con éxito métodos de extracción y descomposición rápidos a los sedimentos invisibles. Los procesos de extracción de las proteínas de los patógenos son muy rápidos y solo añaden unos minutos al tiempo total de análisis.

También es posible cultivar los patógenos en el líquido corporal directamente, como, por ejemplo, con el método conocido de "hemocultivo" mediante la incubación directa de la bolsa de sangre total. Dicho cultivo es significativamente más rápido que cultivar cultivos en placas de Petri y a menudo puede, particularmente en el caso de infecciones graves, proporcionar patógenos suficientes para su identificación en una hora.

Las infecciones agudas también pueden ser causadas por patógenos no microbianos como virus, Chlamydia y Rickettsia, ninguno de los cuales puede cultivarse en un medio nutritivo, ya que solo pueden multiplicarse en las células huésped. En las infecciones agudas, ciertas formas de estos patógenos se encuentran en cantidades extremadamente altas en los líquidos corporales y pueden precipitarse eficazmente en una ultracentrífuga a pesar de su pequeño tamaño; pueden identificarse por sus proteínas específicas medidas por espectrometría de masas. Los métodos descritos en el presente documento no están limitados al análisis e identificación de bacterias y similares. Por ejemplo, los virus tienen típicamente proteínas de cubierta muy características en forma de una cápside que pueden identificarse por espectrometría de masas.

En una modalidad de la presente descripción, se describe un método para identificar un microorganismo en un líquido que incluye material biológico (por ejemplo, proteínas interferentes) de una fuente distinta al microorganismo. El método descrito a continuación incluye medios para enriquecer las proteínas del microorganismo y reducir el material biológico interferente de modo que pueda identificarse el(los) microorganismo(s) presente(s) en la muestra. En una modalidad, el método incluye preparar un lisado derivado del líquido, en donde el lisado incluye proteínas derivadas del líquido y proteínas del microorganismo, y poner en contacto el lisado con un medio cromatográfico, en donde las proteínas derivadas del líquido y las proteínas del microorganismo se unen al medio cromatográfico. El método incluye además eluir selectivamente las proteínas unidas al medio cromatográfico para producir al menos una fracción eluida, y someter la al menos una fracción eluida a análisis de espectrometría de masas de proteínas para identificar la presencia de uno o más microorganismos en el líquido. En una modalidad, la al menos una fracción eluida se enriquece en las proteínas del microorganismo y se reduce en las proteínas derivadas del líquido.

En una modalidad, el líquido puede ser uno de sangre, un hemocultivo, orina o líquido cefalorraquídeo. En una modalidad, el material biológico interferente puede ser cualquier cosa en el líquido que pueda suprimir o superar la señal de las proteínas del microorganismo. Los ejemplos adecuados de material biológico interferente, que son proteínas en este caso, incluyen, pero no se limitan a, una o más de hemoglobina, defensinas o sus productos de proteólisis.

En otra modalidad, se describe un método para identificar un microorganismo en un líquido que incluye proteínas de mamífero interferentes y proteínas del microorganismo. En una etapa inicial, el método incluye preparar un lisado del líquido que incluye las proteínas de mamífero y las proteínas del microorganismo. En una modalidad, el líquido puede ser uno o más de sangre total, un hemocultivo, orina o líquido cefalorraquídeo. En una modalidad, el lisado se prepara al (a) lisar las células de mamífero, si están presentes en el líquido, al poner en contacto las células de mamífero con un agente de lisis seleccionado para lisar las células de mamífero pero no las células del microorganismo, (b) separar las células del microorganismo de las células de mamífero lisadas, (c) lavar las células del microorganismo, (d) lisar las células del microorganismo para liberar su contenido, y (e) separar las células del microorganismo no lisadas y los fragmentos de células del contenido de las células del microorganismo para producir el lisado.

El método incluye además separar las proteínas derivadas del microorganismo de las proteínas de mamífero. La separación incluye (a) proporcionar un cartucho de extracción de un solo uso que contiene un lecho de un medio cromatográfico, (b) añadir el lisado al cartucho de extracción y permitir que el lisado fluya a través del lecho de medio cromatográfico, (c) lavar el cartucho de extracción con un tampón de lavado; y (d) eluir selectivamente las proteínas unidas al medio cromatográfico para producir al menos una fracción eluida. En una modalidad, la elución selectiva puede incluir hacer fluir a través del lecho de medio cromatográfico diferentes concentraciones de un tampón de elución que incluye un solvente orgánico polar en un intervalo de concentración de 10 % en volumen a 60 % en volumen. El método incluye además someter la al menos una fracción eluida a análisis de espectrometría de masas de proteínas para identificar la presencia de uno o más agentes infecciosos en la muestra de sangre. Ejemplos adecuados de técnicas de análisis de espectrometría de masas incluyen, pero no se limitan a, MALDI-TOF, ESI-MS o ESI-MSn (por ejemplo, MS/MS).

En otra modalidad más, se describe un kit para identificar un microorganismo en una muestra de líquido. El kit incluye un tubo de lisis de muestra que comprende un detergente seleccionado para lisar selectivamente las células de mamífero en la muestra y no las células del microorganismo a identificar, un tampón de lisis de microorganismos y un cartucho de extracción de un solo uso que comprende un medio cromatográfico para una separación rápida y selectiva de las proteínas de mamífero de las proteínas microbianas. El kit incluye además instrucciones para la identificación del microorganismo en un líquido mediante la lisis de las células de mamífero en el líquido corporal; lisar las células del microorganismo; separar las proteínas del microorganismo de las proteínas de mamífero con el uso del cartucho de extracción; e identificar el microorganismo al someter las proteínas del microorganismo a un análisis de espectrometría de masas.

Debido a que los métodos descritos en el presente documento usan un conjunto limitado de reactivos, los métodos de la presente invención son adecuados para el uso dentro de un sistema completamente automatizado para la preparación de muestras y espectrometría de masas.

Preferentemente, el método de la presente invención se automatiza desde la preparación de la muestra hasta la notificación de los resultados. Los resultados pueden transferirse automáticamente al sistema de registros médicos electrónicos de un hospital, donde pueden vincularse directamente a las estrategias de tratamiento del paciente, al seguro, a la facturación o pueden usarse en informes epidemiológicos. Un sistema integrado de este tipo facilita el seguimiento epidemiológico de un brote a nivel hospitalario, local, regional y mundial. Para laboratorios de alta productividad, se pueden conectar múltiples sistemas a un ordenador central que integra los datos de los diferentes instrumentos antes de la notificación. El sistema puede importar datos de susceptibilidad fenotípica donde puede combinarse con información de identificación, virulencia, resistencia a antibióticos y tipificación generada por la invención.

Estos y otros objetivos y características de la presente invención resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas, o pueden aprenderse mediante la práctica de la invención como se expone a continuación.

Breve descripción de los dibujos

Para aclarar más lo anterior y otras ventajas y características de la presente descripción, se ofrecerá una descripción más particular de la descripción con referencia a modalidades específicas de la misma, que se ilustran en los dibujos adjuntos. Se aprecia que estos dibujos representan solo las modalidades ilustradas típicas de la invención y, por lo tanto, no deben considerarse limitantes de su alcance. La descripción se describirá y explicará con especificidad y detalle adicionales mediante el uso de los dibujos adjuntos en los que:

La Figura 1 es un diagrama de flujo que ilustra un método para identificar un microorganismo.

La Figura 2 es una vista en perspectiva desmontada de un cartucho de extracción de acuerdo con modalidades de la invención.

La Figura 3 es una vista en perspectiva en sección transversal longitudinal del cartucho de extracción de la Figura 2 en un estado ensamblado.

La Figura 4 es un diagrama de flujo del flujo de trabajo del hemocultivo útil en ciertas modalidades de la presente descripción.

Las Figuras 5A-5D ilustran el análisis de proteínas microbianas por LC-ESI-MS, después de la preparación de la muestra de acuerdo con el flujo de trabajo descrito en la presente descripción. El cromatograma de iones totales del análisis se muestra en la Figura 5A. La Figura 5B muestra alfa-defensinas humanas. La Figura 5C muestra proteínas bacterianas. La Figura 5D muestra las cadenas alfa y beta de hemoglobina humana.

Las Figuras 6A-6D ilustran el análisis ESI-MS de proteínas microbianas intactas purificadas en una punta de SPE. Las proteínas intactas de la muestra de hemocultivo positiva para Escherichia coli se unieron a la punta de SPE y se analizaron mediante ESI-MS con el uso de diferentes concentraciones de ACN - 15 % (A), 17,5 % (B), 20 % (C) o 40 % (D) - como un eluato en análisis de MS por infusión directa. En dependencia de la concentración de ACN, se pueden observar diferentes cantidades de proteínas microbianas (marcadas con *) y hemoglobina humana (marcadas con a).

La Figura 7 ilustra un espectro de masas por electropulverización de barrido completo de una muestra de orina que contiene bacterias realizado por medio de SPE-LC. El barrido varía de m/z 600 a m/z 1300. En la figura están presentes, por ejemplo, picos que representan diferentes estados de carga de la proteína de unión al ADN HU-alfa de Escherichia coli a los siguientes valores de m/z: 682,03 (+14), 734,42 (+13), 795,45 (+12) y 867,85 (+11).

Las Figuras 8A y 8B ilustran proteínas microbianas analizadas por ESI-MS. Las proteínas se eluyeron a partir de dos materiales de punta de SPE diferentes, Poros R1 (Figura 8A) y RP-4H (Figura 8B), y se pulverizaron directamente a MS para un análisis de barrido completo con un intervalo de m/z de 600 a 1300.

Descripción detallada

La presente invención incluye un nuevo método y un sistema para la identificación de microorganismos en muestras con proteínas y otro material biológico de fuentes que no son microorganismos (por ejemplo, proteínas de origen mamífero) que pueden interferir con la identificación de los microorganismos. La identificación de microbios a partir de líquidos, tejidos y cultivos de pacientes con sospecha de tener una infección microbiana es uno de los ensayos más críticos en microbiología clínica y es vital para la atención del paciente. Los microbios pueden identificarse por espectrometría de masas (MS) con el uso de proteínas intactas como analitos, como se ha demostrado con el uso de MALDI-TOF o ionización por electropulverización (ESI). Sin embargo, muchas muestras clínicas incluyen una matriz muy compleja y problemática (por ejemplo, células de mamífero, proteínas, líquidos corporales, componentes de medios, etc.) además del(de los) microorganismo(s) diana.

Los métodos y sistemas descritos en el presente documento incluyen medio cromatográfico para purificar proteínas intactas antes del análisis de espectrometría de masas. Las proteínas del extracto microbiano se unen al medio cromatográfico, donde se lavan y después se eluyen para el análisis de espectrometría de masas. De manera sorprendente e inesperada, se ha descubierto que el medio cromatográfico y los métodos descritos en el presente documento pueden eliminar de forma rápida y eficiente una porción sustancial de material biológico interferente (por ejemplo, proteínas de mamífero) de un lisado celular crudo mientras se conserva una alta intensidad de la señal y se elimina una cantidad de la(s) proteína(s) interferente(s) suficiente para permitir la identificación del(de los) microorganismo(s) mediante análisis de espectrometría de masas.

Con referencia ahora a la Figura 1, se proporciona una descripción general de un flujo de trabajo general de un método 100 para la extracción y análisis rápidos de proteínas extraídas de un microorganismo. Las etapas del método 100 pueden realizarse manualmente con el uso de una variedad de instrumentos y dispositivos independientes. Alternativamente, algunas o todas las etapas pueden automatizarse.

En una modalidad, la muestra de líquido es un líquido (por ejemplo, un líquido corporal) con sospecha de contener un microorganismo desconocido (por ejemplo, una bacteria, virus u otro agente infeccioso). El método es aplicable a una variedad de tipos de muestras diferentes, que incluyen muestras de cultivo puro o mixto derivadas de muestras clínicas que incluyen, sin limitación, sangre, pus, orina, líquido lagrimal, secreción nasal, linfa, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, heces, esputo, hisopados de heridas y sitios del cuerpo, y a muestras derivadas de otras fuentes, que incluyen muestras industriales o ambientales, tales como alimentos (por ejemplo, muestras de carne y productos lácteos, frutas y verduras), bebidas, suelo, agua (por ejemplo, aguas residuales municipales), aire e hisopados de superficies.

Típicamente, las muestras más aplicables a los métodos y sistemas descritos en el presente documento son muestras con matrices problemáticas. Un ejemplo de un tipo de muestra con una matriz problemática es una muestra que contiene proteínas, iones, lípidos y similares, endógenos o no propios altamente concentrados que pueden suprimir o superar la señal de espectrometría de masas de proteínas derivadas del microorganismo desconocido. Los ejemplos de muestras analíticas comunes con matrices difíciles que pueden interferir con el análisis de espectrometría de masas incluyen, pero no se limitan a, sangre (sangre total o hemocultivo), orina y líquido cefalorraquídeo. En el caso de la sangre, la hemoglobina es un componente proteico importante de la sangre que se libera de los glóbulos rojos cuando se lisan. Si no se elimina la hemoglobina, esta puede ocultar las proteínas derivadas del microorganismo desconocido. En el caso de la orina y el líquido cefalorraquídeo, las proteínas interferentes más probables son las defensinas. Las defensinas son proteínas pequeñas ricas en cisteína que funcionan como péptidos de defensa del huésped. Son activas contra bacterias, hongos y muchos virus envueltos y no envueltos. Consisten en 18-45 aminoácidos, que incluyen seis (en vertebrados) a ocho residuos de cisteína conservados. Debido a que las defensinas están involucradas en la defensa contra la infección microbiana, es probable que las defensinas puedan estar presentes en la orina y el líquido cefalorraquídeo en respuesta a la presencia del agente microbiano que los métodos y sistemas descritos en el presente documento están configurados para detectar.

Con referencia ahora a la etapa 120 del método 100, el método incluye además una etapa de preparar un lisado derivado de la muestra de líquido. Las células de la muestra de líquido pueden lisarse por cualquier medio conocido en la técnica. Típicamente, primero será necesario lisar cualquier célula de mamífero de la muestra y desechar su contenido. A continuación, las células microbianas pueden lavarse para eliminar tanto residuo como sea posible de las células de mamífero. Y por último, las células microbianas pueden lisarse.

En una modalidad, las células de mamífero (si están presentes) pueden lisarse al poner en contacto la muestra de líquido con un agente de lisis seleccionado para lisar las células de mamífero en el líquido pero no lisar las células del microorganismo. Por ejemplo, ciertos detergentes (por ejemplo, detergentes no iónicos, aniónicos, catiónicos, zwitteriónicos) pueden lisar eficazmente las células de mamífero. En otro caso, el agente de lisis puede ser una saponina. Las saponinas son compuestos de origen vegetal que son glucósidos anfipáticos que tienen uno o más restos glucósidos hidrófilos combinados con un derivado triterpénico lipófilo. Las saponinas tienen cualidades similares a las de los detergentes y, debido a su naturaleza bifásica, pueden ser particularmente adecuadas para romper células de mamífero. Por el contrario, las células bacterianas tienen una pared celular rígida que les permite permanecer intactas en el tratamiento con detergente.

En una modalidad, la etapa 120 puede incluir además separar las células del microorganismo de las células de mamífero lisadas. La separación puede realizarse, por ejemplo, por centrifugación (por ejemplo, a 12000 g durante 2 minutos) de la muestra de líquido para sedimentar las células microbianas y posteriormente desechar el sobrenadante. La etapa 120 puede incluir además lavar las células del microorganismo para eliminar las proteínas derivadas de las células de mamífero. El lavado puede realizarse, por ejemplo, por resuspensión de las células del microorganismo en un tampón adecuado (por ejemplo, tampón fosfato, tampón TRIS o similar) y después resedimentación por centrifugación. El lavado puede repetirse tantas veces como se considere necesario (por ejemplo, dos veces).

En una modalidad, la etapa 120 puede incluir además lisar las células del microorganismo para liberar su contenido. La lisis de las células del microorganismo puede realizarse por cualquier medio conocido en la técnica. La ruptura de los microorganismos (por ejemplo, células de bacterias, hongos, micoplasma, virus y similares) puede lograrse por medios mecánicos, químicos, enzimáticos y otros como se conocen comúnmente en la técnica. Los enfoques mecánicos incluyen molino de bolas, uso de presión como prensa francesa y similares, ultrasonidos, trituración u otros métodos conocidos en la técnica. Los métodos químicos incluyen la exposición a detergentes o caótropos tales como urea, tiourea o guanidina HCl para lisar las células microbianas y solubilizar su contenido. Alternativamente, pueden utilizarse mezclas de ácidos/solventes orgánicos para romper las células. Los métodos enzimáticos incluyen el uso de lisozima, lisostafina u otras enzimas líticas para formar "agujeros" en las paredes de las células bacterianas que permiten que el contenido se libere hacia la solución circundante. En una modalidad, la etapa 120 puede incluir además separar los fragmentos de células y las células no lisadas del microorganismo del contenido de las células del microorganismo para producir el lisado. En una modalidad, las células pueden resuspenderse en un pequeño volumen para la lisis de microorganismos y los fragmentos de células pueden eliminarse por centrifugación. En tal caso, el lisado puede obtenerse por recuperación del sobrenadante. Si el lisado no está lo suficientemente concentrado para el análisis de espectrometría de masas, el lisado puede concentrarse, por ejemplo, por evaporación a temperatura reducida y presión atmosférica reducida.

En una modalidad, el lisado preparado en la etapa 120 puede ponerse en contacto con un medio cromatográfico en la etapa 130. El medio cromatográfico puede seleccionarse para unir selectivamente las proteínas interferentes, las proteínas del al menos un microorganismo o ambos. Asimismo, el medio cromatográfico puede seleccionarse para limpiar o purificar selectivamente al menos parcialmente las proteínas del al menos un microorganismo de modo que el al menos un microorganismo pueda identificarse por espectrometría de masas (por ejemplo, MADLI o LC/MS). Ejemplos adecuados de medios cromatográficos incluyen, pero no se limitan a, medios de fase normal o de fase inversa, medios de intercambio iónico, medios cromatográficos de afinidad, medios de exclusión por tamaño, medios de interacciones hidrófobas y sus combinaciones.

En una modalidad, poner en contacto el lisado con el medio cromatográfico incluye proporcionar un recipiente que contenga una cantidad seleccionada del medio cromatográfico, añadir el lisado al recipiente y permitir que el lisado se mezcle con el medio cromatográfico. Alternativamente, puede añadirse una cantidad seleccionada del medio cromatográfico al tubo que contiene el lisado obtenido en la etapa 120 y mezclarla con el lisado. Además, poner en contacto el lisado con el medio cromatográfico puede incluir separar el medio cromatográfico del lisado. Esto puede realizarse típicamente mediante la sedimentación del medio cromatográfico por centrifugación. Tal separación también podría realizarse, por ejemplo, mediante filtración. La etapa 130 puede incluir además lavar el medio cromatográfico al menos una vez con un tampón de lavado para eliminar el material no unido o unido de forma inespecífica. Después de lavar con el tampón de lavado, el medio cromatográfico se separa del tampón de lavado. Como en el ejemplo anterior, esto puede realizarse típicamente con centrifugación, o alternativamente, filtración o similar.

En otra modalidad, poner en contacto el lisado con un medio cromatográfico puede incluir proporcionar un cartucho de extracción que contiene un lecho del medio cromatográfico. El cartucho de extracción que contiene el medio puede ser cualquier cartucho de extracción conocido en la técnica. En una modalidad, el cartucho de extracción es un cartucho desechable de un solo uso. El cartucho de extracción puede cargarse, lavarse, eluirse, etc. manualmente o el cartucho de extracción puede incluirse en línea en un sistema de cromatografía líquida.

En una modalidad, el cartucho de extracción puede incluir un cartucho de extracción en fase sólida (SPE). En algunas modalidades, el cartucho de SPE puede estar en línea directamente con un espectrómetro de masas de alta resolución/alta exactitud de masas. En una modalidad, el cartucho de SPE puede ser una punta de polipropileno con un pequeño volumen de sílice u otro sorbente que contenga C4, C8 o C18 unido u otros grupos funcionales inmovilizados en el cartucho, por ejemplo, un cartucho StageTip™ (Thermo Fisher Scientific). En modalidades alternativas, pueden usarse sorbentes poliméricos o agentes quelantes. El volumen del lecho puede ser tan pequeño como 1 |jl o menos, pero también pueden usarse volúmenes mayores. El aparato y el método se adaptan bien a las muestras complejas derivadas de las células microbianas porque cada cartucho de SPE se usa solo una vez, lo que minimiza los problemas de arrastre de una muestra a otra. Una modalidad específica de un cartucho de extracción en fase sólida (por ejemplo, un cartucho de extracción en fase sólida) se analiza a continuación con referencia a las Figuras 2 y 3.

Poner en contacto el lisado con el medio cromatográfico puede incluir además añadir el lisado al cartucho de extracción y permitir que el lisado fluya a través del lecho de medio cromatográfico, y añadir un tampón de lavado al cartucho de extracción y permitir que el tampón de lavado fluya a través del lecho de medio cromatográfico. Se puede dejar que el lisado y el tampón de lavado fluyan pasivamente a través del cartucho o pueden forzarse, por ejemplo, por centrifugación o presión positiva.

Después de poner en contacto el lisado con el medio cromatográfico, el método 100 puede incluir además una etapa 140 de elución selectiva de las proteínas unidas al medio cromatográfico. El protocolo de elución usado puede depender al menos en cierta medida de la química del medio cromatográfico o de la química de las proteínas unidas al medio cromatográfico. En una modalidad ilustrativa, el medio cromatográfico es un medio de interacciones hidrófobas (por ejemplo, un medio de fase inversa) y el tampón de elución es una mezcla acuosa/orgánica. Por ejemplo, el tampón de elución puede incluir agua y acetonitrilo en un intervalo de aproximadamente 5 % en volumen de acetonitrilo a aproximadamente 75 % en volumen de acetonitrilo (por ejemplo, aproximadamente 10 % en volumen de acetonitrilo a aproximadamente 60 % en volumen de acetonitrilo). En una modalidad, la(s) proteína(s) puede(n) eluirse en al menos una fracción. Por ejemplo, la(s) proteína(s) puede(n) eluirse a diferentes relaciones de tampón de elución y recolectarse como fracciones. En otro caso, la(s) proteína(s) puede(n) eluirse isocráticamente a una relación de composición de tampón de elución seleccionada y puede recolectarse una sola fracción. Asimismo, la(s) proteína(s) puede(n) eluirse isocráticamente a dos o más relaciones de composición de tampón de elución seleccionadas y pueden recolectarse dos o más fracciones.

Después de la etapa 140 de elución selectiva de las proteínas unidas al medio cromatográfico, el método puede incluir además una etapa de someter al menos una fracción eluida a análisis de espectrometría de masas de proteínas.

Los términos "espectrometría de masas" o "MS", como se usan en el presente documento, se refieren a métodos de filtración, captura, detección y medición de iones en base a su relación masa a carga, o "m/z" (también denominada en ocasiones "Da/e"). En general, una o más moléculas de interés, tales como las proteínas microbianas, se ionizan y los iones se introducen posteriormente en un instrumento de espectrometría de masas donde, debido a una combinación de campos eléctricos o magnéticos y eléctricos, los iones siguen una trayectoria en el espacio que depende de la masa ("m" o "Da") y la carga ("z" o "e").

El espectrómetro de masas incluirá una fuente de iones para ionizar la(s) fracción(ones) y crear moléculas cargadas para su posterior análisis. Por ejemplo, la ionización de la muestra puede realizarse mediante desorción e ionización por láser asistida por matriz (MALDI) o ionización por electropulverización (ESI). En MALDI, una fracción (o una porción de una fracción) puede combinarse con una "matriz" adecuada (por ejemplo, ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico (ácido sinapínico), ácido a-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA, alfa-ciano o alfa-matriz) o ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB)) y colocarse sobre una placa y secarse. En segundo lugar, un láser pulsado irradia un sitio, lo que desencadena la ablación y desorción de la muestra y el material de la matriz. Por último, las moléculas de analito se ionizan al protonarse o desprotonarse en la columna caliente de gases ablacionados, y después pueden acelerarse en cualquier espectrómetro de masas que se use para analizar las proteínas en el sitio. En ESI, se eluye una corriente de gotitas líquidas (por ejemplo, de un sistema de cromatografía) de un cono cargado y se desolvatan gradualmente para formar iones de proteína por protonación, desprotonación, pérdida de agua y similares. Después, los iones pueden acelerarse en cualquier espectrómetro de masas que se use para analizar las proteínas. Otras técnicas de ionización incluyen, pero no se limitan a, ionización química a presión atmosférica (ACPI), fotoionización, ionización electrónica (EI), ionización química (CI), bombardeo de átomos rápidos (FAB)/espectrometría de masas de iones secundarios líquida (LSIMS), ionización de campo, desorción de campo, ionización por termopulverización/pulverización de plasma e ionización por haz de partículas. El experto en la técnica comprenderá que la elección del método de ionización puede determinarse en base al analito a medir, el tipo de muestra, el tipo de detector, la elección del modo positivo frente al negativo, etc.

Una vez que la muestra se ha ionizado, los iones cargados positivamente o cargados negativamente así creados pueden analizarse para determinar una relación masa a carga (es decir, m/z) y la intensidad de la señal. Los analizadores adecuados para determinar las relaciones masa a carga incluyen analizadores de cuadrupolo, analizadores de trampa de iones, analizadores de resonancia de ciclotrón de iones de transformada de Fourier (FTICR), analizadores de trampa electrostática, analizadores de sector magnético y analizadores de tiempo de vuelo. Los iones pueden detectarse con el uso de varios modos de detección. Por ejemplo, pueden detectarse iones seleccionados (es decir, con el uso de un modo de monitorización de iones selectivo (SIM)), o alternativamente, los iones pueden detectarse con el uso de monitorización de reacción seleccionada (SRM) o monitorización de reacciones múltiples (MRM) (MRM y SRM son esencialmente el mismo experimento.). Los iones también pueden detectarse mediante el barrido de los analizadores de masas para detectar todos los iones de la muestra.

En una modalidad, la relación masa a carga puede determinarse con el uso de un analizador de cuadrupolo. Por ejemplo, en un instrumento de "cuadrupolo" o "trampa de iones cuadrupolo", los iones en un campo de radiofrecuencia (RF) oscilante experimentan una fuerza proporcional a la amplitud de la señal de RF, el potencial de corriente continua (CC) aplicado entre electrodos, y la relación m/z del ion. El voltaje y la amplitud pueden seleccionarse de modo que solo los iones que tengan una m/z particular viajen a lo largo del cuadrupolo, mientras que todos los demás iones se desvían. Por lo tanto, los instrumentos de cuadrupolo pueden actuar como un "filtro de masa", un "separador de masa" o una lente de iones para los iones inyectados en el instrumento.

A menudo se puede mejorar la resolución de la técnica de MS mediante el empleo de "espectrometría de masas en tándem" o "MS/MS", por ejemplo, por medio de un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo. En esta técnica, un primer ion, u original o precursor, generado a partir de una molécula de interés puede filtrarse en un instrumento de MS, y estos iones precursores posteriormente se fragmentan para producir uno o más segundos iones, productos o fragmentos, que después se analizan en un segundo procedimiento de MS. Mediante una selección cuidadosa de los iones precursores, solo los iones de analitos específicos pasan a la cámara de fragmentación (por ejemplo, una celda de colisión), donde la colisión con los átomos de un gas inerte produce estos iones productos. Debido a que tanto los iones precursores como los productos se producen de manera reproducible bajo un conjunto dado de condiciones de ionización/fragmentación, la técnica MS/MS puede proporcionar una herramienta analítica extremadamente poderosa. Por ejemplo, la combinación de selección o filtración de iones y posterior fragmentación puede usarse para eliminar las sustancias interferentes, y puede ser particularmente útil en muestras complejas, tales como muestras biológicas.

En otra modalidad, la relación masa a carga puede determinarse con el uso de un sistema de espectrómetro de masas híbrido que contiene un analizador de masas con trampa de iones electrostática que puede realizar una determinación de la masa exacta y con alta resolución, por ejemplo, un sistema de espectrómetro de masas Q-Exactive™ (Thermo Fisher Scientific) que contiene un analizador de masas cuadrupolo y un analizador de masas Orbitrap™. Aquí, el analizador de masas de cuadrupolo selecciona los iones, después pasan a un dispositivo de captura donde la población de iones dada se recolecta, se enfría por colisión y se inyecta a alta energía y trayectoria precisa en el analizador de masas Orbitrap. Alternativamente, el analizador de masas de cuadrupolo selecciona los iones precursores, que pasan a una celda de colisión donde se producen los iones productos, que después pasan a un dispositivo de captura donde la población de iones dada se recolecta, se enfría por colisión y se inyecta a alta energía y trayectoria precisa en el analizador de masas Orbitrap. Los iones oscilan axialmente en la trampa a una frecuencia proporcional a (z/m)1/2 donde z es la carga del ion y m es la masa. Se detecta la corriente de imagen de estos iones oscilantes y los datos del dominio de frecuencia se convierten en información espectral de masas con el uso del principio de las transformadas de Fourier. Cuanto mayor sea el tiempo de recolección transitoria, mayor será la resolución de los datos espectrales de masas posteriores. Se pueden obtener datos de alta resolución a valores superiores a 200000 con exactitudes de masa de 5 ppm o mejores.

Por ejemplo, un flujo de solvente líquido de una columna cromatográfica, que posiblemente contenga uno o más analitos de interés, ingresa a la interfaz nebulizadora calentada de un analizador LC-MS/MS y la mezcla de solvente/analito se convierte en vapor. Los iones derivados de los analitos de interés pueden formarse en la fase líquida y posteriormente expulsarse a la fase gaseosa por nebulización en la fuente de ESI o por reacciones entre analitos neutros e iones reactivos a medida que los analitos ingresan a la fase gaseosa.

Los iones pasan a través del orificio del instrumento y pasan por una variedad de lentes, cuadrupolo, hexapolo y dispositivos similares antes de ingresar al instrumento. En una modalidad, se pueden analizar ventanas de m/z seleccionadas de cualquier valor de m/z (por ejemplo, un intervalo de 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1800 o más dalton de m/z) para determinar los pesos moleculares de las proteínas intactas en la(s) ventana(s). En general, los tamaños de ventana de m/z más pequeños pueden mejorar la relación señal a ruido. Además de los tamaños de ventana de m/z indicados anteriormente, el tamaño de ventana de m/z puede ajustarse dinámicamente en cualquier lugar en dependencia de las condiciones experimentales. En otra modalidad, se permite que los iones predeterminados de la(s) ventana(s) pasen a la celda de colisión donde chocan con moléculas de gas neutro (por ejemplo, argón, nitrógeno o similares) y se fragmentan. Los iones fragmentados generados se pasan al analizador de masas donde los iones fragmentados se separan y se envían al detector. En otras modalidades, otros procesos de fragmentación pueden incluir, pero no se limitan a, la absorción de fotones infrarrojos por medio de la disociación de fotones múltiples infrarrojos (IRMPD), la absorción de un solo fotón UV, a través de reacciones iónicas que incluyen la disociación por transferencia de electrones (ETD) o la activación por colisión de iones producto de transferencia de electrones que no experimentan una fragmentación rápida, disociación por captura de electrones (ECD). En una modalidad ilustrativa, el método de disociación es la disociación inducida por colisión de alta energía (HCD). Cuando los iones chocan con el detector, producen una señal analógica que luego se convierte en una señal digital.

Los datos adquiridos se transmiten a un ordenador, que representa gráficamente el voltaje frente al tiempo. Los cromatogramas de masas resultantes son similares a los cromatogramas generados en los métodos tradicionales de HPLC. Las concentraciones de los analitos de interés pueden determinarse mediante el cálculo del área debajo de los picos en el cromatograma, si hay picos cromatográficos, o con el uso de la intensidad de los picos en el espectro de masas. La concentración del analito o analitos de interés (por ejemplo, proteínas) en la muestra se realiza por medio de una de las muchas técnicas diferentes conocidas en el estado de la técnica que involucran calibraciones externas o internas, cuantificación relativa, altura de pico o recuentos de área, adición de patrón o cualquier otro método conocido en el estado de la técnica.

Con referencia a las Figuras 2 y 3, se ilustra una modalidad de un cartucho de extracción 10 (por ejemplo, un cartucho de extracción de un solo uso) que puede emplearse en el método descrito anteriormente. El cartucho de extracción ilustrado 10 puede usarse para extraer un componente, tal como proteína o fragmento de proteína, de una muestra que contiene una mezcla de componentes tales como proteínas, péptidos, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, sales y moléculas pequeñas. El cartucho de extracción 10 incluye un cuerpo del cartucho 12 que tiene una porción de depósito 14, una porción de medio de extracción 16 y un collar 18.

La porción de depósito 14 se encuentra generalmente en el extremo proximal 20 del cuerpo del cartucho 12 e incluye una entrada 24 y una cavidad que funciona como depósito 26. El depósito 26 está definido por la superficie interior 28 de la porción de depósito 14 y está en comunicación a través de líquido con la cavidad 32 de la porción de medio de extracción 16, que generalmente se encuentra en el extremo distal 30 del cuerpo del cartucho 12. El depósito 26 puede contener un volumen de líquido. En una modalidad, el volumen del depósito 26 es suficiente para contener el volumen de líquido necesario para cebar el medio de extracción 42, el volumen de la muestra a extraer, el volumen de las soluciones de lavado y el volumen de la solución de elución. Por ejemplo, en algunos métodos de extracción, es necesario diluir una muestra con un solvente adecuado antes de forzar la muestra a través del medio de extracción 42 que se encuentra en la cavidad 32 de la porción de medio de extracción 16. Típicamente, la etapa de dilución de la muestra se realiza en un recipiente separado. En la modalidad ilustrativa, el volumen del depósito 26 es suficiente para diluir la muestra directamente en el depósito 26 antes de aplicar presión positiva al depósito 26 para transferir la muestra al medio de extracción. En una modalidad de la invención, el depósito 26 tiene un volumen que varía de aproximadamente 50 pl a aproximadamente 1500 pl.

En la modalidad ilustrativa ilustrada en las Figuras 2 y 3, la superficie interior 28 del depósito 26 incluye una primera porción 34 próxima a la entrada 24 que proporciona la mayor parte del volumen del depósito 26 y una segunda porción 38 próxima a la porción de medio de extracción 16. En la modalidad ilustrativa ilustrada en las Figuras 2 y 3, la superficie interior 28 de la primera porción 34 del depósito 26 tiene generalmente forma troncocónica y tiene un ángulo de convergencia entre el diámetro interior ID1 en el extremo proximal de la primera porción 34 y el diámetro interior ID2 en el extremo distal 36 de la primera porción 34 que menor que aproximadamente 10 grados o, en una modalidad alternativa, de menor que 4 grados. Como se usa en el presente documento, el ángulo de convergencia es el ángulo entre la superficie a la que se hace referencia y el eje central de la estructura, que, en el presente caso, es el eje central 62 del cuerpo del cartucho 12.

En una modalidad, el depósito 26 puede tener una forma configurada para sellarla contra un dispositivo de manipulación de líquidos (por ejemplo, una micropipeta o un sistema de cromatografía líquida) que puede crear una presión de aire positiva en el depósito 26 para forzar el líquido en el depósito 26 a través del medio de extracción 42. En una modalidad relacionada, la porción de medio de extracción 16 y/o el collar 18 pueden tener una forma configurada para un receptor de líquido configurado para recibir líquidos (por ejemplo, un eluato) que fluyen fuera de la porción de medio de extracción 16. Asimismo, la porción de medio de extracción 16 puede tener el tamaño y la forma para acoplarse a un dispositivo de manipulación de líquidos (por ejemplo, un sistema de cromatografía líquida) configurado para recibir flujo corriente abajo desde la porción de medio de extracción 16.

La segunda porción 38 del depósito 26 puede tener forma de embudo y tener una pared anular que se estrecha hacia dentro hacia la porción de medio de extracción 16, como se ilustra en la Figura 3. La segunda porción 38 del depósito 26 tiene un ángulo de convergencia entre el diámetro interior ID3 en el extremo proximal 48 de la segunda porción 38 y el diámetro interior ID4 en el extremo distal 50 de la segunda porción 38. En la modalidad ilustrativa, el ángulo de convergencia de la primera porción 34 del depósito es menor que el ángulo de convergencia de la segunda porción 38 del depósito 26.

En la modalidad ejemplificada en la Figura 3, la segunda porción 38 del depósito 26 incluye un entrepaño 52 que reduce aún más el diámetro del depósito 26 a medida que pasa al conducto de líquido 54 entre el depósito 26 y la cavidad 32 de la porción de medio de extracción 16. El entrepaño 52 puede funcionar como una superficie de sellado para formar un sello con un dispositivo de suministro de líquido, tal como una punta de pipeta o una sonda hueca como una sonda cerámica hueca. El entrepaño 52 en la modalidad ilustrativa de la Figura 3 se ilustra con una forma generalmente troncocónica con un ángulo obtuso de convergencia en un intervalo de aproximadamente 45 grados a aproximadamente 90 grados.

La modalidad ilustrada en la Figura 3 incluye un conducto de líquido 54 entre el depósito 26 y la cavidad 32 de la porción de medio de extracción 16. En esta modalidad ilustrativa, el conducto de líquido 54 tiene forma troncocónica y el ángulo de convergencia es típicamente menor que aproximadamente 10 grados, y en una modalidad alternativa, es menor que aproximadamente 1 grado. El conducto de líquido 54 tiene una longitud y un diámetro interno que minimiza el volumen del conducto de líquido 54 mientras que al mismo tiempo proporciona suficiente flujo para evitar una acumulación de contrapresión causada por una restricción del flujo a través del conducto de líquido 54. El volumen del conducto de líquido 54 se minimiza para minimizar el volumen muerto en el cartucho de extracción. En una modalidad, el volumen del conducto de líquido 54 no excede aproximadamente 1000 nl y puede estar en un intervalo de aproximadamente 1 nl a aproximadamente 50 nl.

La porción de medio de extracción 16 incluye un manguito alargado 55 que tiene una superficie interior 56 que define una cavidad 32 con un medio de extracción 42 dispuesto en su interior. La cavidad 32 incluye un extremo de entrada 58 en comunicación a través de líquido con el depósito 26 y un extremo de salida 60 que tiene una abertura 59 dispuesta alejada del extremo de entrada 58. En una modalidad, la cavidad 32 tiene forma troncocónica con un ángulo de convergencia de menos de aproximadamente 5 grados, y en una modalidad alternativa, el ángulo de convergencia puede variar de aproximadamente 0,2 grados a 1 grado. En otra modalidad alternativa, el ángulo de convergencia de la cavidad 32 de forma troncocónica puede ser de aproximadamente 0,4 grados. En modalidades que tienen una cavidad 32 de forma troncocónica, el extremo de mayor diámetro de la cavidad 32 se abre hacia el punto de inserción para el medio de extracción 42. El diámetro interno de la cavidad 32 para la modalidad alternativa también varía de aproximadamente 0,5 mm a aproximadamente 2,0 mm, y preferentemente de aproximadamente 0,75 mm a aproximadamente 0,85 mm. El cuerpo del cartucho 12 tiene un eje central 62 que se extiende a través de la cavidad 32 de la porción de medio de extracción 16. La cavidad 32 tiene una longitud L1 a lo largo del eje central 62 entre el extremo de entrada 58 y el extremo de salida 60. En una modalidad, la longitud L1 de la cavidad 32 está en un intervalo de aproximadamente 1 mm a 10 mm. En otra modalidad, la longitud L1 de la cavidad 32 está en un intervalo de aproximadamente 3 mm a aproximadamente 5 mm y preferentemente está en un intervalo de aproximadamente 3,5 mm a aproximadamente 4,5 mm. En una modalidad, la longitud L1 de la cavidad corresponde con la longitud del manguito alargado 55.

El collar 18 del cuerpo del cartucho 12 se extiende axialmente en una dirección común con el manguito 55 alargado. En la modalidad ilustrada en las Figuras 2 y 3, el collar 18 tiene un extremo cerrado 72 que está acoplado a la superficie externa 78 de la porción de depósito 14 adyacente a la transición entre la primera y segunda porciones 34, 38. En la modalidad ilustrada, la superficie externa 74 del collar 18 es continua con la superficie externa 78 de la porción de depósito 14. Las superficies externas 78, 74 de la porción de depósito 14 y el collar 18 pueden estrecharse con un ángulo de convergencia de menos de 15 grados y, en una modalidad alternativa, en un intervalo de aproximadamente 0,1 grados a aproximadamente 5 grados.

El collar 18 tiene un extremo terminal abierto 70 que está separado del extremo de salida 60 del manguito alargado 55. El extremo de salida 60 del manguito alargado 55 define un plano P1. El extremo terminal 70 del collar 18 define un plano P2 que se extiende al menos hasta el plano P1 definido por el extremo de salida 60 del manguito alargado 55. En una modalidad, el plano P2 del extremo terminal 70 del collar 18 se extiende más allá del plano P1 del extremo de salida 60 del manguito alargado 55. En la modalidad ilustrada en las Figuras 2 y 3, el plano P2 del extremo terminal 70 del collar 18 se extiende más allá del plano P1 del extremo de salida 60 del manguito alargado 55 en una distancia D1 suficiente para evitar el contacto del extremo de salida 60 del manguito alargado 55 con cualquier porción de un segundo cartucho de extracción. Por ejemplo, la distancia D1 puede variar de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 2 mm, que, en dependencia del diámetro interior ID5 en el extremo terminal 70 del collar 18 y el diámetro exterior OD1 más pequeño en el extremo terminal 70 del collar 18 o el diámetro exterior OD2 en el extremo proximal 20 del cuerpo del cartucho 12, puede ser suficiente para evitar el contacto del extremo de salida 60 del manguito alargado 55 con cualquier porción de un segundo cartucho de extracción. Esta estructura evita el daño al extremo de salida 60 del manguito alargado 55 cuando los cartuchos de extracción 10 se almacenan sueltos en una bolsa o caja. Un beneficio adicional del plano P2 que se extiende más allá del plano P1 es que evita la contaminación del extremo de salida 60 del manguito alargado 55 cuando el cartucho de extracción 10 se manipula en un sistema de análisis de muestras automatizado. Por ejemplo, un método para transportar cartuchos de extracción 10 en sistemas de análisis automatizados es hacer que el cartucho de extracción 10 caiga a través de una tubería o manguera guía desde una ubicación en el sistema a otra ubicación. Si el extremo de salida 60 del manguito alargado 55 está expuesto, es decir, no protegido por un collar 18, existe un riesgo significativo de contaminación por arrastre del extremo de salida 60 si el extremo de salida 60 entra en contacto con las superficies de la tubería o manguera de transporte. El collar 18 de la presente invención protege al extremo de salida 60 del manguito alargado del contacto con las superficies de la manguera de transporte y de este modo disminuye el riesgo de contaminación por arrastre entre diferentes cartuchos de extracción transportados en la misma manguera.

El extremo terminal 70 del collar 18 tiene un diámetro exterior OD1 y la entrada 24 del depósito 26 tiene un diámetro interior ID1 de manera que el extremo terminal 70 del collar 18 no se puede insertar completamente en la entrada 24 del depósito 26. En una modalidad, el diámetro interior ID1 de la entrada 24 del depósito no es mayor que el diámetro exterior OD1 del extremo terminal 70 del collar 18. En otra modalidad, el diámetro interior ID1 de la entrada 24 del depósito es menor que el diámetro exterior OD1 del extremo terminal 70 del collar 18. Igualmente, el extremo proximal 20 del cuerpo del cartucho 12 tiene un diámetro exterior OD2 y el extremo terminal abierto 70 del collar 18 tiene un diámetro interior ID5 de manera que el extremo proximal 20 del cuerpo del cartucho 12 puede no insertarse completamente en el extremo terminal abierto 70 del collar 18. En la modalidad ilustrada en las Figuras 2 y 3, el diámetro exterior OD2 en el extremo proximal 20 del cuerpo del cartucho 12 incluye un reborde 76 opcional. En una modalidad, el diámetro interior ID5 del extremo terminal abierto 70 del collar 18 no es mayor que el diámetro exterior OD2 del extremo proximal 20 del cuerpo del cartucho 12. En otra modalidad, el diámetro interior ID5 del extremo terminal abierto 70 del collar 18 es menor que el diámetro exterior OD2 del extremo proximal 20 del cuerpo del cartucho 12. Cuando se almacenan varios cartuchos de extracción 10 juntos con un empaquetado aleatorio, tal como en una bolsa o caja, los cartuchos de extracción 10 no se apilarán uno dentro del otro como sucedería si un extremo del cartucho de extracción pudiera caber dentro de una abertura en un extremo de un segundo cartucho de extracción. Este aspecto de los cartuchos de extracción 10 hace que sea significativamente más fácil para un sistema automatizado recoger un cartucho de extracción 10 a la vez y permite que los cartuchos de extracción 10 se utilicen con sistemas automatizados sin clasificarlos y colocarlos en soportes. Por lo tanto, los cartuchos de extracción 10 pueden empaquetarse, venderse, almacenarse e insertarse en un sistema analítico automatizado en lotes sueltos sin la necesidad de empaquetarlos en posiciones específicas y orientación específica en un soporte o bandeja, lo que mejora de este modo la eficiencia y ahorra dinero, espacio y mano de obra.

En la modalidad ilustrada en las Figuras 2 y 3, el extremo proximal 20 del cuerpo del cartucho 12 incluye un reborde opcional 76 que se proyecta hacia fuera desde la superficie externa 74 de la porción de depósito 14 adyacente a la entrada 24. El reborde 76 aumenta el diámetro exterior del extremo proximal 20 del cuerpo del cartucho 12 y proporciona una superficie que puede usarse en dispositivos automatizados para colgar el cartucho de extracción 10 durante la manipulación o si se desea colgar el cartucho de extracción 10 en un sistema de bandeja o soporte.

El medio de extracción 42 se dispone en la cavidad 32 de la porción de medio de extracción 16. El medio de extracción 42 permite la extracción de un componente deseado de una muestra mixta. El medio de extracción 42 puede separar cromatográficamente proteínas de otros componentes en una muestra biológica mixta. Las modalidades del medio de extracción 42 pueden unirse de manera reversible a moléculas pequeñas o macromoléculas tales como péptidos y proteínas que tienen un peso molecular que varía de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 200 kDa. El medio de extracción 42 puede unir de manera reversible al menos 1 |jg de proteína en un volumen de muestra que varía de aproximadamente 10 j l a aproximadamente 100 ml cuando la muestra se pasa a través del medio de extracción 42 a una velocidad de flujo en el intervalo de aproximadamente 50 jl/min a 200 jl/min. El medio de extracción 42 también puede eluir el componente deseado en base a una característica deseada tal como el peso molecular del componente, la hidrofobicidad, la carga o la afinidad del componente por un aspecto del medio de extracción 42. En una modalidad, el medio de extracción 42 puede eluir al menos 20 % de las proteínas unidas de la muestra mixta cuando se eluye a una velocidad de flujo que varía de aproximadamente 0,1 jl/min a aproximadamente 20 jl/min con un volumen de solvente de elución que varía de aproximadamente 1 j l a aproximadamente 100 jl.

En una modalidad, el medio de extracción 42 es un medio de extracción en fase sólida y, más particularmente, un medio monolítico poroso 80 que tiene una alta porosidad interna que permite un flujo suficiente de una muestra a través del medio monolítico poroso 80 sin generar altas contrapresiones indeseables. En una modalidad, la contrapresión no excede de aproximadamente 5 bar a una velocidad de flujo de 200 jl/min. El medio monolítico poroso 80 preferentemente puede resistir al menos 200 bar. Un beneficio de la estructura porosa del medio monolítico poroso 80 es que produce una trayectoria tortuosa para la muestra que permite una rápida transferencia de masa por convección a velocidades de flujo rápidas. Además, un medio monolítico poroso 80 no requiere una frita para mantener su posición dentro del cuerpo del cartucho 12.

El medio monolítico poroso 80 puede prepararse como un lecho continuo dentro de una funda, tal como una sección de tubo 82. El resultado es que al cortar el tubo 82 en secciones, el medio monolítico poroso 80 está presente en toda la longitud de una microcolumna que funciona como medio de extracción 42.

En la modalidad ilustrada en las Figuras 2 y 3, el medio de extracción 42 es un medio monolítico poroso 80 que se inserta en la cavidad 32 de la porción de medio de extracción 16 del cuerpo del cartucho 12 desde el extremo de salida 60 del manguito alargado 55 de la porción de medio de extracción 16. Un beneficio de preparar el medio monolítico poroso 80 dentro del tubo 82 y cortar el tubo 82 para formar una microcolumna es que este método evita la formación de una capa semipermeable o no porosa en el límite entre el aire y el medio monolítico poroso polimerizante, tal como ocurre cuando se deja que el medio monolítico poroso se polimerice directamente dentro de la punta de una pipeta. La capa semipermeable o no porosa puede afectar negativamente a las características de flujo del medio monolítico poroso resultante. En las modalidades en las que el medio monolítico poroso se forma directamente dentro de la cavidad 32 de la porción de medio de extracción 16, los efectos adversos de la capa semipermeable o no porosa pueden reducirse mediante la formación de un conducto a través del centro del medio monolítico poroso para aumentar la velocidad de flujo de la muestra a través del medio de extracción. Sin embargo, una alta proporción del componente a capturar puede permanecer en el conducto y desviar el medio monolítico poroso, lo que requiere de este modo múltiples pasadas de la muestra a través del medio para una extracción máxima. Por el contrario, la preparación del medio monolítico poroso 80 dentro del tubo 82 que se corta en segmentos produce un cilindro poroso donde la estructura porosa y la porosidad son uniformes en todo el diámetro y a lo largo de la longitud del medio monolítico poroso 80. Este proceso de preparación produce el flujo sin obstáculos de una muestra a través del medio monolítico poroso 80 por superficies semipermeables o no porosas y produce una unión sustancialmente uniforme en todo el medio monolítico poroso 80 para proporcionar la máxima extracción del componente deseado en una sola pasada a través del medio monolito poroso 80.

El tubo 82 en el exterior del medio monolítico poroso 80 proporciona una capa protectora que ayuda a manipular el medio monolítico poroso 80. Por ejemplo, durante la fabricación del cartucho de extracción 10, el cuerpo del cartucho 12 puede formarse independientemente del medio monolítico poroso 80. El medio monolítico poroso 80 se inserta después en la cavidad 32 de la porción de medio de extracción 16 del cuerpo del cartucho 12. En modalidades en las que el medio monolítico poroso 80 se formó en una sección del tubo 82, el tubo 82 permite que el medio monolítico poroso 80 se manipule más fácilmente para su inserción en la cavidad 32 de la porción de medio de extracción 16. Además, cuando el medio monolítico poroso 80 se inserta en la cavidad 32 de la porción de depósito 14, la pared del tubo 82 puede actuar como un soporte para el medio monolítico poroso 80 y puede actuar como una superficie de sellado contra la superficie interior 56 de la cavidad 32 para evitar el reflujo alrededor del medio monolítico poroso 80.

Cuando el medio monolítico poroso 80 formado en una sección del tubo 82 se inserta en la cavidad 32 de la porción de depósito 14, el tubo 82 se comprime alrededor del medio monolítico poroso 80 para evitar que el medio monolítico poroso 80 se extruya del tubo 82.

El medio monolítico poroso 80 puede acoplarse opcionalmente a la superficie interior del tubo 82 para mejorar la resistencia a la extrusión del medio monolítico poroso 80. Por ejemplo, la superficie interior del tubo 82 puede tratarse para crear puntos de unión de enlace covalente para el medio monolítico 80 poroso polimerizante. Para activar la superficie interior de un tubo tal como un tubo de polietilén éter cetona (PEEK), el interior del tubo puede llenarse con una solución de reacción que contiene un solvente tal como acetonitrilo o propionitrilo (derivados de alquilnitrilo) y un iniciador de clase azo tal como Vazo-64 o Vazo-55 en una concentración de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 % (volumen). Después, el tubo lleno puede calentarse a un mínimo del 80 % de la temperatura de vida media de 10 horas del solvente, por ejemplo, Vazo-64 tiene una vida media de descomposición de 10 horas a 64 grados Celsius. Se puede dejar que la reacción prosiga durante al menos 30 minutos. La solución de reacción puede reemplazarse con solución de reacción nueva y dejar que prosiga durante una duración adicional de al menos 30 minutos. En una modalidad, los extremos del tubo se sellan lo que genera una contrapresión interna de al menos 5 psi. En otra modalidad, la solución de reacción se repone continuamente a presión ambiente. Después, la solución de reacción se extrae del tubo y el tubo se deja secar con una corriente de nitrógeno. Después de secar, la mezcla de polimerización se inyecta en la luz del tubo activado. Durante la polimerización del medio monolítico poroso 80, los puntos de unión activados en la superficie interior del tubo se incorporan al medio de extracción.

Si bien se usa un tubo de PEEK como tubo ilustrativo, pueden usarse otros tipos de tubos poliméricos, que incluyen copolímeros de olefinas cíclicas ("COC") y fluoropolímeros tales como etileno tetrafluoroetileno (ETFE), etileno propileno fluorado (FEP) y otros fluoropolímeros. Además, puede usarse un tubo de sílice fundida que se activa mediante la unión covalente de un reactivo de silanización que contiene acrilato o metacrilato después de la hidrólisis de la sílice fundida.

El tubo 82 puede tener un diámetro interior que varía de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 1 mm. En una modalidad, el diámetro interior del tubo 82 varía de aproximadamente 0,4 mm a aproximadamente 0,6 mm. En otra modalidad, el diámetro interior del tubo es de aproximadamente 0,5 mm. El tubo 82 con medio poroso formado en el interior puede cortarse a una longitud que, cuando se combina con el diámetro interior del tubo, proporcione el volumen deseado para el medio de extracción poroso. En una modalidad, la longitud del tubo 82 con medio monolítico poroso 80 se corta en secciones que varían de aproximadamente 6 mm a aproximadamente 2 mm y en una modalidad alternativa, la longitud varía de aproximadamente 3 mm a aproximadamente 5 mm o es de aproximadamente 4 mm. Después de la polimerización del medio de extracción poroso, el tubo puede cortarse a la longitud deseada con un cortador de tubos tal como un cortador de tubos IDEX A-350.

El medio monolítico poroso 80 puede prepararse mediante la polimerización de una mezcla que incluye monómeros y/o polímeros adecuados en presencia de un iniciador y un solvente formador de poros (porógeno). El medio monolítico poroso resultante 80 tiene poros que varían en diámetro de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 20000 nm. El medio monolítico poroso 80 puede tener poros en el intervalo de aproximadamente 50 nm - 200 nm o aproximadamente 750 - 10000 nm. El medio monolítico poroso 80 puede ser glóbulos de polímero que tienen un diámetro que varía de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 10000 nm. El medio monolítico poroso 80 debe poder resistir al menos aproximadamente 200 bar de presión.

Los monómeros pueden seleccionarse de monómeros que contienen vinilo, monómeros que contienen acrilato, monómeros que contienen metacrilato, acrilamida, etileno fluorosustituido y sus combinaciones. Los polímeros pueden seleccionarse de poliolefina, poliéster, poliuretano, poliamida y sus combinaciones. Los monómeros que contienen vinilo pueden incluir monómeros aromáticos de vinilo tales como monómeros aromáticos sustituidos con monovinilo y monómeros aromáticos sustituidos con divinilo y sus combinaciones. Los monómeros vinil aromáticos ilustrativos incluyen divinilbenceno, estireno, estireno sustituido con alquilo tal como etilvinilbenceno, alfametilestireno, alfa-metilestireno sustituido con alquilo, alfa-metilestireno sustituido con halógeno tal como clorometil estireno y sus combinaciones. Las sustituciones de alquilo pueden incluir hasta 18 átomos de carbono. Los monómeros que contienen acrilato incluyen mono-, di- y tri-acrilatos. Los monómeros de metacrilato incluyen mono-, di- y trimetacrilatos tales como metacrilato de glicidilo, dimetacrilato de etileno, trimetilolpropano, acrilato de trimetilo, metacrilato de hidroxietilo. En una modalidad, los monómeros, o mezclas de al menos dos monómeros, o mezclas de al menos un monómero y un polímero, están generalmente presentes en la mezcla de polimerización en una cantidad de aproximadamente 10 % en volumen a aproximadamente 60 % en volumen, y en una modalidad alternativa, en una cantidad de aproximadamente 20 % en volumen a aproximadamente 70 % en volumen.

El porógeno puede seleccionarse de una variedad de diferentes tipos de materiales. Por ejemplo, los porógenos líquidos adecuados incluyen hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos aromáticos, ésteres, alcoholes, cetonas, éteres, soluciones de polímeros solubles y mezclas de los mismos. Los porógenos ilustrativos incluyen 4,4,4-trimetilpentano, alcoholes que tienen de 1 a 12 átomos de carbono, tolueno, acetato de butilo, 1,4, butanodiol, agua, acetona, hexano, ciclohexano, ciclohexanol, tetrahidrofurano (THF) y sus combinaciones. En una modalidad, el porógeno está generalmente presente en la mezcla de polimerización en una cantidad de aproximadamente 20 % en volumen a aproximadamente 90 % en volumen, y en una modalidad alternativa, de aproximadamente 60 % en volumen a aproximadamente 80 % en volumen.

Los iniciadores pueden incluir iniciadores de polimerización térmica, iniciadores de polimerización por radicales libres convencionales, fotoiniciadores e iniciadores redox. Ejemplos de iniciadores adecuados incluyen peróxidos tales como OO-t-amil-O-(2etilhexil)monoperoxicarbonato, dipropilperoxidicarbonato y peróxido de benzoilo, compuestos azo tales como azobisisobutironitrilo (Dupont Vazo-64), 2,2'-azobis(2-amidinopropano)diclorhidrato y 2,2'-azobis(isobutiramida)dihidrato, y persulfato de amonio y tetrametiletilendiamina (^t M^e D^a ). En una modalidad, el iniciador está generalmente presente en la mezcla de polimerización en una cantidad de aproximadamente 0,2 % en peso a aproximadamente 5 % en peso de los monómeros y en una modalidad alternativa, de aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 2 % en peso de los monómeros.

Los componentes de la mezcla de polimerización pueden mezclarse de acuerdo con técnicas habituales e inyectarse en el interior del tubo y dejarse polimerizar. Por ejemplo, en una modalidad, el tubo se llena con la mezcla de polimerización y se aplica una presión de aproximadamente 100 psi. La presurización ayuda a evitar la formación de burbujas en la mezcla de polimerización a medida que se forma nitrógeno durante la descomposición del iniciador durante la polimerización. En otras modalidades, el tubo se llena con la mezcla de polimerización y ambos extremos del tubo se sellan mientras se deja que prosiga la polimerización. El sellado de ambos extremos del tubo produce una mayor presión en el interior del tubo a medida que prosigue la polimerización, lo que evita la formación de burbujas de nitrógeno. En otra modalidad más, el tubo se llena con la mezcla de polimerización y un extremo del tubo se sella y el otro extremo del tubo se deja abierto pero se coloca en un vial. El tubo lleno se calienta durante la etapa de polimerización. La ubicación del extremo abierto del tubo en un vial permite la expansión del líquido mientras la mezcla se calienta durante la polimerización, lo que evita los aumentos de presión causados por el calentamiento que podrían afectar negativamente la porosidad del medio monolítico poroso. En modalidades que utilizan un fotoiniciador, el tubo lleno puede someterse a irradiación UV. Ejemplos de medios monolíticos porosos y métodos para prepararlos se describen en la patente de Estados Unidos núm. 7,922,908.

El medio monolítico poroso 80 también puede funcionalizarse. Por ejemplo, el medio monolítico poroso 80 puede prepararse donde la funcionalidad epóxido o haluro puede hacerse reaccionar con aminas o sulfuros para crear, por ejemplo, medios de intercambio aniónico o con, por ejemplo, ácido carboxílico, ácido fosfórico, ácido sulfónico para crear medios de intercambio catiónico. Después, estos grupos pueden modificarse adicionalmente para permitir la unión de proteínas, péptidos o inmunoglobulinas para crear medios de separación y extracción por afinidad. Los grupos epóxido pueden reaccionar directamente con proteínas, péptidos o inmunoglobulinas o después de la conversión en aldehído. Otros medios de afinidad que son posibles incluyen fases de cromatografía de afinidad a iones metálicos inmovilizados (IMAC) y fases de boronato.

Materiales porosos ilustrativos adecuados para el uso como medio monolítico poroso 80 y los métodos para preparar tales materiales se describen en las patentes de Estados Unidos núm. 5,334,310 y 5,633,290.

En una modalidad alternativa, el medio de extracción 42 puede incluir una pluralidad de perlas porosas y/o no porosas, tales como perlas de vidrio, sílice o poliméricas, que están contenidas en la cavidad 32 de la porción de medio de extracción 16. En esta modalidad, el extremo de entrada de la cavidad puede incluir una primera frita y el extremo de salida de la cavidad puede incluir una segunda frita. Las fritas funcionan para evitar que las perlas se escapen de la cavidad. Las perlas se empaquetan en la cavidad lo suficiente para permitir una velocidad de flujo suficiente sin crear una contrapresión indeseable. Se describen perlas ilustrativas en la patente de Estados Unidos núm. 6,783,672.

Durante el uso, antes de que una muestra se pase a través del cartucho de extracción 10, el medio de extracción 42 puede humedecerse con un solvente humectante. En modalidades en donde el medio de extracción 42 incluye un medio monolítico poroso 80, el medio monolítico poroso 80 puede humedecerse con un volumen suficiente de un solvente humectante que puede incluir un solvente orgánico tal como acetonitrilo (ACN) y un componente acuoso tal como agua con 0,2 % en volumen de ácido fórmico (FA). Típicamente, pueden usarse de aproximadamente 10 pl a aproximadamente 100 pl de solvente humectante para humedecer el medio monolítico poroso 80. El medio monolítico poroso 80 puede equilibrarse después con un solvente de equilibrio que puede incluir agua y aproximadamente 0,2 % en volumen de fA. Típicamente, pueden usarse de aproximadamente 10 pl a aproximadamente 100 pl de solvente de equilibrio para equilibrar el medio monolítico poroso 80. Después, las muestras que contienen compuestos de interés, tales como proteínas, en volúmenes que varían de 10 pl a 100 pl, se fuerzan a través del medio monolítico poroso 80 en el cartucho de extracción 10. El flujo de material no unido de las muestras puede recolectarse opcionalmente para un análisis adicional. El medio monolítico poroso 80 puede lavarse después con una solución de lavado que incluye agua y aproximadamente 0,1 % en volumen a aproximadamente 0,2 % en volumen de FA. Típicamente, pueden usarse aproximadamente 10 |jl a aproximadamente 100 |jl de solución de lavado para lavar la muestra capturada en el medio monolítico poroso 80. Los compuestos capturados en el medio monolítico poroso 80 se eluyen después con una solución de elución. El contenido de la solución de elución y los volúmenes y tiempos de elución pueden variar en dependencia del tipo de elución que se desee. Cuando se desea una elución rápida, la solución de elución puede incluir agua, un componente orgánico en un intervalo de aproximadamente 20 - 60 % en volumen, y aproximadamente 0,2 % en volumen de FA; se usa de aproximadamente 1 j l a aproximadamente 100 j l de solución de elución para eluir los compuestos de captura del medio monolítico poroso 80. Las soluciones líquidas, que incluyen la muestra, pueden forzarse rápidamente a través del medio de extracción 42. La unión del compuesto en el medio de extracción 42 ocurre rápidamente y el tiempo de elución depende de la aplicación deseada. La elución isocrática o elución con el uso de gradientes rápidos permite un rendimiento extremadamente rápido que puede usarse con sistemas automatizados en circunstancias en las que se desea una alta productividad. Cuando se usa en combinación con espectrometría de masas de alta resolución, es posible identificar compuestos tales como proteínas con el uso de elución rápida. Tales métodos pueden ser útiles cuando se necesita un análisis rápido, tal como la identificación microbiana. Cuando se desea un análisis más detallado, la elución puede realizarse lentamente lo que permite que los compuestos eluyan secuencialmente del cartucho de extracción 10 de acuerdo con una característica deseada, tal como peso molecular, carga, interacción hidrófoba u otra interacción de tipo por afinidad con componentes del cartucho de extracción 10. La elución lenta puede realizarse con un gradiente de elución corto (por ejemplo, aproximadamente 5 minutos) o largo (por ejemplo, aproximadamente 30 minutos). Por ejemplo, en una modalidad, el porcentaje de componente orgánico en el solvente de elución puede aumentarse de forma continua o gradual a lo largo del gradiente para permitir la elución en una duración deseada. Las duraciones de elución más largas permiten el análisis de un único compuesto diana, tal como un marcador de resistencia a antibióticos en una muestra microbiana o un biomarcador de cáncer de una biopsia. La posibilidad de aplicar un gradiente para una separación de compuestos eficaz permite al usuario evitar tener que usar un cartucho analítico caro y que consume mucho tiempo. Las columnas analíticas se usan varias veces y requieren etapas de lavado para evitar el arrastre de una muestra a otra. El presente cartucho de extracción 10 puede ser desechable y permite al usuario evitar las etapas de lavado y el arrastre de una muestra a la siguiente.

Los compuestos eluidos pueden recolectarse para un análisis posterior, pasarse directamente a un sistema de análisis (por ejemplo, un sistema LC-MS) o mezclarse con una matriz y depositarse para el análisis MALDI.

Se puede encontrar un análisis adicional del cartucho de extracción 10 presentado anteriormente en la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 14/735,900.

Ejemplo 1

A continuación se describe un método para identificar un microorganismo que puede usar un cartucho de extracción (por ejemplo, un cartucho de extracción de un solo uso) como el descrito anteriormente. El microorganismo (por ejemplo, un agente infeccioso) puede estar en un líquido que incluye proteínas de mamífero interferentes y proteínas del microorganismo.

En una etapa inicial, el método incluye preparar un lisado del líquido (por ejemplo, sangre, hemocultivo, líquido cefalorraquídeo u orina) que incluye las proteínas de mamífero y las proteínas del microorganismo. En una modalidad, el lisado puede prepararse al (a) lisar las células de mamífero, si están presentes en el líquido, al poner en contacto las células de mamífero con un agente de lisis (por ejemplo, un detergente natural o sintético) seleccionado para lisar las células de mamífero pero no las células del microorganismo, (b) separar las células del microorganismo de las células de mamífero lisadas, (c) lavar las células del microorganismo, (d) lisar las células del microorganismo para liberar su contenido, y (e) separar las células del microorganismo y los fragmentos de células del contenido de las células del microorganismo para producir el lisado.

El método incluye además separar las proteínas derivadas del microorganismo de las proteínas de mamífero. La separación incluye (a) proporcionar un cartucho de extracción de un solo uso que contiene un lecho de un medio cromatográfico, (b) añadir el lisado al cartucho de extracción y permitir que el lisado fluya a través del lecho de medio cromatográfico, (c) lavar el cartucho de extracción con un tampón de lavado; y (d) eluir selectivamente las proteínas unidas al medio cromatográfico para producir al menos una fracción eluida. En una modalidad, la elución selectiva puede incluir hacer fluir a través del lecho de medio cromatográfico diferentes concentraciones de un tampón de elución acuoso que incluye un solvente orgánico polar (por ejemplo, acetonitrilo) en un intervalo de concentración de 10 % en volumen a 60 % en volumen. El método incluye además someter la al menos una fracción eluida a análisis de espectrometría de masas de proteínas para identificar la presencia de uno o más agentes infecciosos en la muestra de sangre. Ejemplos adecuados de técnicas de análisis de espectrometría de masas incluyen, pero no se limitan a, MALDI-TOF, ESI-MS o ESI-MSn (por ejemplo, MS/MS).

El método descrito en el presente documento es aplicable a muchos tipos de microorganismos y tipos de matrices. En una modalidad, el microorganismo es uno o más de una bacteria grampositiva, bacteria gramnegativa, arqueas, micobacterias, micoplasmas, levaduras, virus y hongos filamentosos.

En una modalidad, las células de mamífero (si están presentes) pueden lisarse al poner en contacto la muestra de líquido con un agente de lisis seleccionado para lisar las células de mamífero en el líquido pero no lisar las células del microorganismo. Por ejemplo, ciertos detergentes (por ejemplo, detergentes no iónicos, aniónicos, catiónicos, zwitteriónicos) pueden lisar eficazmente las células de mamífero. En otro caso, el agente de lisis puede ser una saponina. Las saponinas son compuestos de origen vegetal que son glucósidos anfipáticos que tienen uno o más restos glucósidos hidrófilos combinados con un derivado triterpénico lipófilo. Las saponinas tienen cualidades similares a las de los detergentes y, debido a su naturaleza bifásica, pueden ser particularmente adecuadas para romper células de mamífero. Por el contrario, las células bacterianas tienen una pared celular rígida que les permite permanecer intactas en el tratamiento con detergente.

En una modalidad, el método puede incluir además separar las células del microorganismo de las células de mamífero lisadas. La separación puede realizarse, por ejemplo, por centrifugación (por ejemplo, a 12000 g durante 2 minutos) de la muestra de líquido para sedimentar las células microbianas y posteriormente desechar el sobrenadante. El método puede incluir además lavar las células del microorganismo para eliminar las proteínas derivadas de las células de mamífero. El lavado puede realizarse, por ejemplo, por resuspensión de las células del microorganismo en un tampón adecuado (por ejemplo, tampón fosfato, tampón TRIS o similar) y después resedimentación por centrifugación. El lavado puede repetirse tantas veces como se considere necesario (por ejemplo, dos veces).

En una modalidad, el método puede incluir además lisar las células del microorganismo para liberar su contenido. La lisis de las células del microorganismo puede realizarse por cualquier medio conocido en la técnica. La ruptura de los microorganismos (por ejemplo, células de bacterias, hongos, micoplasma, virus y similares) puede lograrse por medios mecánicos, químicos, enzimáticos y otros como se conocen comúnmente en la técnica. Los enfoques mecánicos incluyen molino de bolas, uso de presión como prensa francesa y similares, ultrasonidos, trituración u otros métodos conocidos en la técnica. Los métodos químicos incluyen la exposición a detergentes o caótropos tales como urea, tiourea o guanidina HCl para lisar las células microbianas y solubilizar su contenido. Alternativamente, pueden utilizarse mezclas de ácidos/solventes orgánicos para romper las células. Los métodos enzimáticos incluyen el uso de lisozima, lisostafina u otras enzimas líticas para formar "agujeros" en las paredes de las células bacterianas que permiten que el contenido se libere hacia la solución circundante. En una modalidad, el método puede incluir además separar fragmentos de células y células no lisadas del microorganismo del contenido de las células del microorganismo para producir el lisado. En una modalidad, las células pueden resuspenderse en un pequeño volumen para la lisis de microorganismos y los fragmentos de células pueden eliminarse por centrifugación. En tal caso, el lisado puede obtenerse por recuperación del sobrenadante. Si el lisado no está lo suficientemente concentrado para el análisis de espectrometría de masas, el lisado puede concentrarse, por ejemplo, por evaporación a temperatura reducida y presión atmosférica reducida.

En una modalidad, el lisado celular, el(los) tampón(ones) de lavado, el(los) tampón(ones) de elución, etc., pueden añadirse al cartucho de extracción manualmente. Los líquidos pueden moverse a través del cartucho de extracción con flujo por gravedad, centrifugación, presión positiva, presión negativa o similares. En otra modalidad, el cartucho de extracción puede estar en línea en un sistema de cromatografía líquida y el(los) tampón(ones) de lavado, el(los) tampón(ones) de elución, etc., pueden añadirse al cartucho de extracción mediante una bomba.

Después de poner en contacto el lisado con el medio cromatográfico, el método puede incluir además eluir selectivamente las proteínas unidas al medio cromatográfico. El protocolo de elución usado puede depender al menos en cierta medida de la química del medio cromatográfico o de la química de las proteínas unidas al medio cromatográfico. En una modalidad ilustrativa, el medio cromatográfico es un medio de interacciones hidrófobas (por ejemplo, un medio de fase inversa) y el tampón de elución es una mezcla acuosa/orgánica. Por ejemplo, el tampón de elución puede incluir agua y acetonitrilo en un intervalo de aproximadamente 5 % en volumen de acetonitrilo a aproximadamente 75 % en volumen de acetonitrilo (por ejemplo, aproximadamente 10 % en volumen de acetonitrilo a aproximadamente 60 % en volumen de acetonitrilo). En una modalidad, las proteínas del cartucho de extracción se eluyen isocráticamente. Es decir, las proteínas pueden eluirse del cartucho de extracción de forma gradual. Por ejemplo, pueden añadirse tampones acuosos que contienen 20 %, 40 % y 60 % de acetonitrilo al cartucho de extracción y pueden recolectarse las fracciones eluidas. En otra modalidad, un gradiente de tampón con concentración creciente de acetonitrilo (por ejemplo, 10 % en volumen de acetonitrilo a 60 % en volumen de acetonitrilo) puede hacerse fluir a través de la extracción y pueden recolectarse las fracciones eluidas.

Después de la etapa de elución selectiva de las proteínas unidas al medio cromatográfico, el método puede incluir además una etapa de someter al menos una fracción eluida a análisis de espectrometría de masas de proteínas (por ejemplo, uno de MALDI, ESI-MS o ESI-MS/MS).

Ejemplo 2

A continuación se describe un kit para identificar un microorganismo que puede incluir un cartucho de extracción (por ejemplo, un cartucho de extracción de un solo uso) como el descrito anteriormente. El microorganismo (por ejemplo, un agente infeccioso) puede estar en un líquido que incluye proteínas de mamífero interferentes y proteínas del microorganismo.

El kit puede incluir un tubo de lisis de muestra que comprende un detergente (por ejemplo, un detergente secado en el tubo) seleccionado para lisar selectivamente las células de mamífero en la muestra y no las células del microorganismo a identificar, un tampón de lisis de microorganismos y un cartucho de extracción de un solo uso que comprende un medio cromatográfico para la separación rápida y selectiva de las proteínas de mamífero de las proteínas microbianas. El kit incluye además instrucciones para la identificación del microorganismo en un líquido mediante la lisis de las células de mamífero en el líquido corporal; lisar las células del microorganismo; separar las proteínas del microorganismo de las proteínas de mamífero con el uso del cartucho de extracción; e identificar el microorganismo al someter las proteínas del microorganismo a un análisis de espectrometría de masas.

En una modalidad, el kit incluye además un tampón de elución seleccionado para eluir al menos una fracción eluida del cartucho de extracción que comprende una proteína microbiana suficiente para la identificación del microorganismo. Por ejemplo, el tampón de elución puede incluir agua y acetonitrilo en un intervalo de aproximadamente 5 % en volumen de acetonitrilo a aproximadamente 75 % en volumen de acetonitrilo (por ejemplo, aproximadamente 10 % en volumen de acetonitrilo a aproximadamente 60 % en volumen de acetonitrilo).

Ejemplo 3

Con referencia ahora a la Figura 4, un método específico de la presente descripción. El método ilustrado en el diagrama de flujo de la Figura 4 se refiere específicamente a un método para separar proteínas de un microorganismo de una hemoglobina en un lisado derivado de un hemocultivo positivo. No obstante, si bien el método ilustrado en la Figura 4 se describe en relación con el hemocultivo, el método de la Figura 4 es aplicable a otros tipos de muestras tales como, pero sin limitarse a, orina, líquido cefalorraquídeo y sangre total. El método también es aplicable a cultivos puros o mixtos derivados de muestras clínicas que incluyen, sin limitación, pus, líquido lagrimal, secreción nasal, linfa, líquido sinovial, heces, esputo, hisopados de heridas y sitios del cuerpo, y a muestras derivadas de otras fuentes que incluyen muestras industriales o ambientales tales como alimentos (por ejemplo, muestras de carne y productos lácteos, frutas y verduras), bebidas, suelo, agua (por ejemplo, aguas residuales municipales), aire e hisopados de superficies.

La sangre es un buen ejemplo de la aplicabilidad de los métodos descritos en el presente documento porque la sangre es una de las matrices más problemáticas para la identificación de proteínas por espectrometría de masas. Asimismo, la identificación de microbios a partir de frascos de hemocultivo positivos de pacientes con sospecha de sepsis es uno de los flujos de trabajo más importantes en microbiología clínica y es crítica para la atención del paciente. Los microbios pueden identificarse por espectrometría de masas (MS) con el uso de proteínas intactas como analitos, como se ha demostrado con el uso de instrumentos de MALDI o ESI. La muestra de hemocultivo positiva es una matriz muy compleja y problemática, que incluye células sanguíneas humanas, plasma y componentes de medios, además del microorganismo diana.

El método ilustrado en la Figura 4 incluye una punta de SPE para purificar proteínas intactas antes del análisis de MS. Las proteínas del extracto microbiano se unen a la punta de SPE, donde se lavan y luego se eluyen al análisis de MS. Con el uso de un gradiente de LC de aumento de compuesto orgánico (por ejemplo, acetonitrilo (ACN)), para separar las proteínas unidas a la punta, las proteínas microbianas pueden separarse de la hemoglobina humana. La hemoglobina (Hb) humana es el componente principal que interfiere en el análisis de MS de las muestras de hemocultivo. Cuando se lisan los glóbulos rojos humanos, la hemoglobina se libera al líquido en concentraciones cercanas a 100 mg/ml. La hemoglobina humana consiste en dos cadenas polipeptídicas, las cadenas alfa (a) y beta (p). Dado que la hemoglobina humana se une a muchos microbios con el uso de un mecanismo de unión activo, incluso el lavado del sedimento microbiano no elimina eficazmente la proteína contaminante. De manera sorprendente e inesperada, se encontró que la punta de SPE descrita en otra parte del presente documento con mayor detalle pudo usarse para separar rápidamente la hemoglobina de los péptidos bacterianos. Por ejemplo, la preparación de la muestra del flujo de trabajo 400 puede realizarse en aproximadamente 10-15 minutos y el análisis de espectrometría de masas puede realizarse en unos pocos minutos, por ejemplo, menos de 10 minutos, menos de 5 minutos o dentro de aproximadamente un minuto o menos.

El flujo de trabajo 400 incluye una primera etapa 410 de proporcionar un hemocultivo positivo. La sangre total puede cultivarse de acuerdo con las prácticas aceptadas en la técnica. Típicamente, la sangre se recolecta en al menos dos frascos estériles separados y se mezcla con medios para cultivo aeróbico y anaeróbico. Las muestras calificadas como positivas para el crecimiento microbiano pueden enviarse para un análisis adicional de acuerdo con el flujo de trabajo 400.

Con referencia ahora a la etapa 420 del método 400, el método incluye además un etapa de lisis de las células humanas (es decir, glóbulos rojos, plaquetas, glóbulos blancos, etc.) presentes en la muestra. En la modalidad ilustrada, las células humanas se lisan al poner en contacto las células con saponina seguido de ultrasonidos. En una modalidad, la saponina puede secarse sobre las paredes del tubo usado para preparar el lisado. La adición del hemocultivo al tubo rehidrata y activa la saponina. Si bien se usa saponina en este ejemplo, se apreciará que pueden usarse otros agentes de lisis, tales como, pero sin limitarse a, ciertos detergentes (por ejemplo, detergentes no iónicos, aniónicos, catiónicos, zwitteriónicos).

Después de la lisis de las células de mamífero, la etapa 430 incluye la separación de las células del microorganismo de las células de mamífero por centrifugación a, por ejemplo, 12 000 x g durante 2 minutos y posteriormente desechar el sobrenadante. El etapa 440 puede incluir además lavar las células del microorganismo para eliminar las proteínas derivadas de las células de mamífero (por ejemplo, hemoglobina). El lavado puede realizarse, por ejemplo, por resuspensión de las células del microorganismo en un tampón adecuado (por ejemplo, tampón fosfato EDTA, tampón TRIS o similar) con la ayuda de ultrasonidos y después resedimentación por centrifugación. El lavado puede repetirse tantas veces como se considere necesario (por ejemplo, dos veces).

Después del lavado en la etapa 440, las células del microorganismo pueden lisarse para liberar su contenido en la etapa 450. La lisis de las células del microorganismo puede realizarse por cualquier medio conocido en la técnica. La ruptura de los microorganismos (por ejemplo, células de bacterias, hongos, micoplasma, virus y similares) puede lograrse por medios mecánicos, químicos, enzimáticos y otros como se conocen comúnmente en la técnica. Los enfoques mecánicos incluyen molino de bolas, uso de presión como prensa francesa y similares, ultrasonidos, trituración u otros métodos conocidos en la técnica. Los métodos químicos incluyen la exposición a detergentes o caótropos tales como urea, tiourea o guanidina HCl para lisar las células microbianas y solubilizar su contenido. Alternativamente, pueden utilizarse mezclas de ácidos/solventes orgánicos para romper las células. Los métodos enzimáticos incluyen el uso de lisozima, lisostafina u otras enzimas líticas para formar "agujeros" en las paredes de las células bacterianas que permiten que el contenido se libere hacia la solución circundante. En la modalidad ilustrada de la etapa 450, las células del microorganismo se lisan mediante la adición de un volumen (por ejemplo, 100 |jl) de una solución acuosa que contiene aproximadamente 50 % de ácido fórmico y ACN al 25 %, ultrasonidos durante 45 segundos, adición de otro volumen (por ejemplo, 100 jl) de CAN al 50 % y centrifugación durante 5 min. a 12000 x g.

Las proteínas pueden purificarse en la etapa 460 para el análisis de espectrometría de masas al recolectar un volumen del sobrenadante de la etapa 450, diluir (por ejemplo, 5x, si es necesario) y cargar el lisado clarificado en un cartucho de SPE. El medio cromatográfico del cartucho de SPE puede seleccionarse para unir selectivamente las proteínas interferentes, las proteínas del al menos un microorganismo o ambos. Asimismo, el medio cromatográfico puede seleccionarse para limpiar o purificar selectivamente al menos parcialmente las proteínas del al menos un microorganismo de modo que el al menos un microorganismo pueda identificarse por espectrometría de masas (por ejemplo, MALDI o LC/MS). Ejemplos adecuados de medios cromatográficos incluyen, pero no se limitan a, medios de intercambio iónico, medios cromatográficos de afinidad, medios de exclusión por tamaño, medios de interacciones hidrófobas y sus combinaciones. En una modalidad, el cartucho de extracción es un cartucho desechable de un solo uso. El cartucho de extracción puede cargarse, lavarse, eluirse, etc. manualmente o el cartucho de extracción puede incluirse en línea en un sistema de cromatografía líquida.

La purificación de las proteínas del microorganismo en la etapa 450 puede incluir además añadir el lisado al cartucho de extracción y permitir que el lisado fluya a través del lecho de medio cromatográfico, y añadir un tampón de lavado al cartucho de extracción y dejar que el tampón de lavado fluya a través del lecho de medio cromatográfico. Se puede dejar que el lisado y el tampón de lavado fluyan pasivamente a través del cartucho o pueden forzarse, por ejemplo, por centrifugación o presión positiva.

La purificación de las proteínas del microorganismo en la etapa 450 puede incluir además eluir selectivamente las proteínas unidas al medio cromatográfico. El protocolo de elución usado puede depender al menos en cierta medida de la química del medio cromatográfico o de la química de las proteínas unidas al medio cromatográfico. En una modalidad ilustrativa, el medio cromatográfico es un medio de interacciones hidrófobas (por ejemplo, un medio de fase inversa) y el tampón de elución es una mezcla acuosa/orgánica. Por ejemplo, el tampón de elución puede incluir agua y acetonitrilo en un intervalo de aproximadamente 5 % en volumen de acetonitrilo a aproximadamente 75 % en volumen de acetonitrilo (por ejemplo, aproximadamente 10 % en volumen de acetonitrilo a aproximadamente 60 % en volumen de acetonitrilo). En una modalidad, la(s) proteína(s) puede(n) eluirse en al menos una fracción. Por ejemplo, la(s) proteína(s) puede(n) eluirse a diferentes relaciones de tampón de elución (es decir, en un gradiente) y recolectarse como fracciones. En otro caso, la(s) proteína(s) puede(n) eluirse isocráticamente a una relación de composición de tampón de elución seleccionada y puede recolectarse una sola fracción. Asimismo, la(s) proteína(s) puede(n) eluirse isocráticamente a dos o más relaciones de composición de tampón de elución seleccionadas y pueden recolectarse dos o más fracciones.

Después de la etapa 460 de purificación de las proteínas, el método 400 puede incluir además una etapa 470 de someter al menos una fracción eluida a análisis de espectrometría de masas de proteínas. Ejemplos adecuados de análisis de espectrometría de masas incluyen, pero no se limitan a, MALDI y LC-ESI-MS.

EJEMPLOS 4-7: IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMO(S)

Ejemplo 4 - Identificación microbiana a partir de hemocultivo con el uso de enriquecimiento por LyC y análisis SPE-LC-ESI-MS

El flujo de trabajo de hemocultivo de la Figura 4 se usó para purificar las muestras de hemocultivo en un extracto que pudo analizarse posteriormente para producir una identificación de los patógenos presentes en la muestra. En el flujo de trabajo, se usaron muestras clínicas reales o muestras enriquecidas como material de partida. Las muestras clínicas fueron proporcionadas por HUSLAB (Distrito Hospitalario de Helsinki y Laboratorio de Uusimaa); se extrajeron muestras de sangre de los pacientes en frascos de hemocultivo BacT/ALERT (bioMérieux, Estados Unidos) y se colocaron en un instrumento de hemocultivo BacT/ALERT 3D (bioMérieux, Estados Unidos) hasta que dieron positivo. Después de analizar los resultados y cuando el hospital ya no necesitaba los frascos de hemocultivo positivos, estos se obtuvieron del hospital. El tiempo desde la señal positiva del instrumento de hemocultivo hasta la obtención de las muestras varió de un día (Escherichia coli y Staphylococcus aureus) a siete días (para algunas levaduras y patógenos más raros). Las muestras enriquecidas se prepararon en el laboratorio con el uso de sangre donada y cepas de la colección de cultivos interna. Las bacterias de la colección de cultivos se revivieron en una placa de cultivo adecuada, tal como agar sangre de oveja, agar FAA, agar dextrosa Sabouraud o agar chocolate mediante la incubación a 35 °C durante la noche o a 30 °C durante el fin de semana. Las bacterias anaeróbicas se cultivaron en condiciones anaeróbicas (con el uso de, por ejemplo, AnaeroGen 2,5 L, Oxoid, Reino Unido) y H. influenzae en atmósfera de CO2 (con el uso de, por ejemplo, Pack-CO2, Mitsubishi Gas Chemical Company, Japón). Las placas de agar eran comúnmente de Tammer-Tutkan Maljat, Finlandia.

Para producir muestras enriquecidas, usualmente se tocó una colonia de las placas de agar cultivadas con un asa de 1 |jl y se inoculó en 8 ml de sangre. Después, la sangre enriquecida se inyectó en un frasco de hemocultivo. Por ejemplo, se usaron frascos de hemocultivo aeróbico BacT/Alert FA Plus o anaeróbico BacT/Alert FN Plus (ambos de bioMérieux, Francia) para microorganismos aeróbicos y anaeróbicos, respectivamente. Los frascos de hemocultivo se incubaron en un instrumento de hemocultivo, tal como BacT/ALERT 3D 60, bioMérieux, Estados Unidos; VersaTrek, Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos o BD BACTEC 9050, Becton Dickinson, Estados Unidos, hasta que se detecte positivo.

Después, la muestra se transfirió de un frasco de hemocultivo positivo a un vial de muestra para enriquecimiento por lisis más centrifugación (LyC). Se usaron habitualmente volúmenes de muestra de hemocultivo comprendidos entre 100 j l y 500 jl. Se probaron varias especies y cepas diferentes, que incluyen bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas y levaduras. Estas incluyeron, pero no se limitaron a, patógenos comunes relacionados con la sepsis tales como Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans. El vial de muestra se preparó con saponina al 0,1 % que se había secado en la pared del vial de muestra durante una noche de secado en la campana. La saponina se usó para lisar los glóbulos rojos y liberar hemoglobina de ellos. Se realizaron dos etapas de lavado/centrifugación para eliminar los glóbulos rojos vacíos y la hemoglobina de la muestra. Específicamente, el vial se centrifugó durante 2 minutos a 12 000 * g (Centrífuga MicroCL 21, Thermo Fisher Scientific, Alemania), para que el(los) microorganismo(s) forme(n) un sedimento y los glóbulos rojos lisados y su hemoglobina liberada permanezcan en el sobrenadante como los componentes más ligeros. En esta etapa, el sedimento todavía estaba muy concentrado con glóbulos rojos y otras proteínas del hemocultivo que podrían interferir con los métodos de análisis posteriores. Para eliminar la mayor cantidad posible de estas proteínas, se necesitaron etapas de lavado. Primero, se eliminó el sobrenadante con pipeta y después se añadió al vial un volumen que varió de 100 a 300 j l de tampón de lavado, tal como NaHPO4 10 mM KH2PO41,8 mM EDTA 1 mM (pH ~7,2). El sedimento se descompuso por ultrasonidos (12 s encendido, 5 s apagado, 12 s encendido; 100 % de amplitud, una fuerza de 3 N). Para eliminar los glóbulos rojos vacíos y conseguir que los microorganismos formen un sedimento, el vial se centrifugó (30 s; 12 000 * g) y el sobrenadante se eliminó nuevamente con pipeta. Este ciclo de lavado se repitió usualmente dos veces para lograr un resultado final más puro.

La fase de enriquecimiento y lavado fue seguida de una fase de lisis, donde se descompusieron los microbios. Después de la centrifugación final del ciclo de lavado, se eliminó el sobrenadante con pipeta y se añadió 100 j l de tampón de lisis (FA al 50 %/ACN al 25 % en H2O), seguido de mezcla. Se añadió 100 j l de tampón de almacenamiento (ACN al 50 % en H2O) y el vial se centrifugó (5 min; 12000 x g). Por último, el extracto se recolectó en un tubo de proteína LoBind (Eppendorf, Alemania) y se almacenó a -80 °C hasta su posterior análisis.

Para el análisis de extracción en fase sólida (SPE) - cromatografía líquida (LC) - electropulverización (ESI) -espectrometría de masas (MS), se diluyó 10 j l de extracto derivado del protocolo de lisis y centrifugación con 40 j l de agua compatible con LC/MS (Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos) para lograr una dilución de 1:5. Después, la muestra se concentró mediante una columna de SPE lo que permitió la eliminación de sales y algunas de las moléculas pequeñas de la muestra. El material de SPE se humedeció con 50 j l de FA al 0,2 % (Thermo Fisher Scientific, España) en ACN (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido), seguido de una centrifugación de 2 min a 2000 x g (Eppendorf, Alemania). El equilibrio de SPE se logró mediante la adición de 50 j l de FA al 0,2 % a la SPE, después de lo cual la columna de SPE se centrifugó a 2000 x g durante 2 min. Después de la preparación de SPE, se introdujo en la columna 50 j l de la muestra diluida y la columna se lavó con 50 j l de FA al 0,2 % en ACN al 10 %. Después de añadir y lavar la muestra, la columna se volvió a centrifugar (2000 x g, 2 min). Después, la muestra se analizó con MS.

La columna de SPE que contenía la muestra se colocó en un automuestreador de LC y se inició el análisis LC-ESI-MS. El solvente A estaba compuesto por ácido fórmico al 0,1 % y ACN al 10 % en agua y el solvente B estaba compuesto por ácido fórmico al 0,1 % en ACN. La elución de las proteínas se logró con un gradiente de ACN de 8 min (2 a 33 % de B) a través de la columna. Las proteínas de elución se ionizaron con el uso de una fuente ESI y se analizaron con un espectrómetro de masas Q Exactive HF (Thermo Fisher Scientific, Alemania). Los datos adquiridos de MS y MS/MS se buscaron con el software Proteome Discoverer (versión 2.0) con nodos ProSight PD (Thermo Fisher Scientific, Alemania).

Se tomó una muestra de 100 j l de un frasco de hemocultivo positivo (que contenía S. aureus) y se preparó siguiendo el protocolo descrito anteriormente. En las Figuras 5A-5D se muestran el cromatograma de iones totales (Figura 5A) y tres espectros de MS de ejemplo (Figuras 5B-5D) de una muestra de hemocultivo analizada por LC-ESI-MS que muestra la separación de las proteínas de origen humano de las proteínas bacterianas. La Figura 5B muestra alfa-defensinas humanas que eluyen a los 1,8 min. La Figura 5C muestra proteínas bacterianas que eluyen a los 4,0 min. La Figura 5D muestra las cadenas alfa y beta de hemoglobina humana que eluyen a los 7,5 min. Las proteínas intactas de la muestra de hemocultivo positiva para Escherichia coli se unieron en la punta de SPE como se describió anteriormente. Las proteínas se eluyeron con el uso de ACN al 15 % (Figura 6A), ACN al 17,5 % (Figura 6B), ACN al 20 % (Figura 6C) o ACN al 40 % (Figura 6D) y se analizaron mediante ESI-MS e infusión directa. En la Figura 6A, pueden observarse proteínas en su mayoría microbianas que eluyen con ACN al 15 %, pero con baja intensidad (no seleccionadas para pruebas posteriores). En la Figura 6B, pueden observarse proteínas microbianas que eluyen con ACN al 17,5 %, de nuevo en una cantidad relativamente baja, pero no eluye hemoglobina humana. En la Figura 6C, son visibles las proteínas microbianas y la cadena alfa de hemoglobina humana que eluyen con ACN al 20 %, pero la hemoglobina humana en menor cantidad que las proteínas microbianas más abundantes. La intensidad de los picos es mayor en general. En la Figura 6D, la hemoglobina humana es la proteína más abundante que eluye con ACN al 40 % y solo unas pocas proteínas microbianas son visibles debido al efecto de supresión causado por la gran abundancia de hemoglobina.

Ejemplo 5 - Identificación microbiana con el uso de enriquecimiento por LyC y comparación del análisis SPE-LC-ESI-MS frente al análisis MALDI

Para comparar la eficiencia del kit de MALDI Sepsityper (Bruker Daltonics) con el método de lisis centrifugación (LyC) que incluye la punta de SPE (Thermo Fisher Scientific), se probó un conjunto problemático de microorganismos. Este incluyó, pero no se limitó a, patógenos comunes relacionados con la sepsis tales como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. lugdunensis y Streptococcus viridians, S. agalactiae, S. pyogenes.

Una muestra del microorganismo, cultivado en frascos de hemocultivo VersaTREK Redox (Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos), se tomó y procesó mediante a) el kit de MALDI Sepsityper - según las instrucciones de uso y b) el método LyC, respectivamente. Ambos métodos se realizaron por triplicado. En el flujo de trabajo del kit Sepsityper, la muestra se eluyó después de la precipitación de proteínas en 25 j l de FA al 70 % 25 j l de ACN, que produciría un volumen igual al volumen de extracción de LyC+SPE, o en 12,5 j l de FA al 70 % 12,5 j l de ACN, lo que produciría una concentración 2x en comparación con la extracción por LyC+SPE. El método LyC se realizó con 100 j l de material de partida según el protocolo descrito en esta patente.

Para el análisis de espectrometría de masas ESI, se diluyó 10 j l de extracto derivado del protocolo de lisis y centrifugación con 40 j l de agua compatible con LC/MS (Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos) para lograr una dilución 1:5. Después, la muestra se concentró mediante una extracción en fase sólida (SPE) lo que permitió la eliminación de sales y algunas de las moléculas pequeñas en la muestra. El material de SPE se humedeció con 50 j l de FA al 0,2 % (Thermo Fisher Scientific, España) en ACN (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido), seguido de una centrifugación de 2 min a 2000 rpm (3768 G) (Eppendorf, Alemania). El equilibrio de SPE se logró mediante la adición de 50 j l de FA al 0,2 % a la SPE, después de lo cual la columna de SPE se centrifugó a 2000 rpm durante 2 min. Después de la preparación de SPE, se introdujo en la columna 50 j l de la muestra diluida y la columna se lavó con 50 j l de FA al 0,2 % en ACN al 10 %. Después de añadir y lavar la muestra, la columna se volvió a centrifugar (2000 rpm, 2 min). Después del lavado, la punta de SPE se colocó en un tubo Eppendorf limpio y se añadió 5 j l de solución de elución. Se usaron cuatro concentraciones de acetonitrilo (17,5 %, 20 %, 40 % y 60 % en FA al 0,2 %). La columna se centrifugó a 11000 x g (centrífuga Thermo Scientific Micro CL21) durante 15 segundos para eluir la muestra. Las muestras se llevaron en bloques de hielo a United Medix Laboratories, Helsinki, Finlandia (YML) en automóvil inmediatamente justo después de la elución.

Los extractos resultantes de ambos métodos se aplicaron al instrumento de MS bioMerieux Vitek. Se llevaron 0,5 j l de muestra a una placa de MALDI y se añadió 1 j l de matriz VITEK MS-CHCA para el uso con VITEK® MS (REF 411071). Los análisis se realizaron mediante ^y M^l de acuerdo con el procedimiento de MALDI bioMerieux. La identificación microbiana por medio del instrumento de MS bioMerieux Vitek se basa en la puntuación de ID. Una puntuación superior al 90 % indica una identificación correcta.

Tabla 1: Comparación de los resultados analizados con MALDI-TOF seguida de la preparación de la muestra con el uso de un kit comercial (Sepsityper, Bruker Daltonics) para muestras de hemocultivo y el flujo de trabajo descrito en esta patente (LyC punta de SPE). Las proteínas intactas de ocho hemocultivos positivos se unieron a la punta de SPE y se eluyeron con el uso de ACN al 17,5 %, 20 %, 40 % o 60 %. Todos los eluatos se analizaron con el uso del instrumento de MS MALDI bioMerieux Vitek. Los resultados finales (identificación bacteriana) se informan mediante el siguiente código: campo blanco = sin identificación bacteriana, - = identificación bacteriana incorrecta, = puntuación de ID 60 < x < 90 y + = puntuación de ID > 90. A pesar de una preparación de muestra inicial similar entre el kit Sepsityper y el método de la presente descripción, la adición del cartucho de extracción de SPE mejora la probabilidad de identificación correcta de los microbios en cuestión en un grado sorprendente e inesperado. Asimismo, estos datos indican que existe un intervalo preferido pero relativamente amplio (por ejemplo, aproximadamente 20-40 % de ACN) en el que las proteínas bacterianas pueden eluirse del cartucho de extracción de SPE para eliminar las proteínas de mamífero interferentes, lo que permite la identificación definitiva de la bacterias por MALDI.

Tabla 1

Tabla 1, cont.

Ejemplo 6 - Identificación microbiana de muestras de orina con el uso de enriquecimiento por LyC y análisis SPE-LC-ESI-MS

El flujo de trabajo de la muestra de orina se usó para preparar muestras que conducen a extractos para el análisis y la identificación del(de los) microbio(s) dentro de las muestras. En el ejemplo de flujo de trabajo, se usaron muestras enriquecidas como material de partida. Las bacterias se recogieron del agar, se lavaron con PBS y la absorbancia se ajustó (A600 nm = 1), para producir aproximadamente 1 x 109 ufc/ml. La suspensión se centrifugó y el sedimento se resuspendió con orina de un voluntario sano. Se transfirieron muestras de 150 pl que contenían aproximadamente 106 ufc/ml a un vial de muestra, seguido de fases de lavado y lisis similares así como análisis SPE-LC-ESI-MS como se explica en el Ejemplo 4. El flujo de trabajo de LC usó un gradiente de contenido creciente de solvente orgánico, lo que resultó ventajoso para disminuir la interferencia de los compuestos de la orina en los espectros de masas. Varias bacterias e incluso levaduras pueden causar infecciones del tracto urinario y este ejemplo incluye Escherichia coli, que es la causa más común de estas infecciones.

En la Figura 7 se muestra un ejemplo de un espectro de lectura y en la Tabla 2 se enumeran las proteínas identificadas de la muestra.

Tabla 2. Proteínas identificadas de la muestra de orina

Ejemplo 7 - Flujo de trabajo de identificación microbiana con diferente material de extracción en fase sólida (SPE) Una muestra microbiana, donde las células se han lisado y las proteínas se liberaron a la solución (un extracto microbiano) puede procesarse posteriormente con extracción en fase sólida (SPE) para concentrar las proteínas y eliminar las moléculas pequeñas y las sales antes del análisis, por ejemplo con espectrometría de masas. Típicamente, el material de SPE se empaqueta dentro de una columna, punta o en forma de, por ejemplo, formato de 96 pocillos. El material permite la unión de las proteínas debido a interacciones con el material y las proteínas. Estas interacciones pueden ser, por ejemplo, interacciones hidrófilas/hidrófobas, interacciones iónicas o afinidad por el material. El material debe permitir un flujo de líquido a través del material. La muestra se libera de la columna, por ejemplo, por aumento de la hidrofobicidad o cambio del pH del solvente que pasa. Esta eliminación puede realizarse una vez, por etapas o con gradiente. El líquido se fuerza a través de la columna con la ayuda de, por ejemplo, gravedad, jeringa, bomba o centrífuga.

Las muestras de prueba se prepararon a partir de extractos de Escherichia coli. El extracto se preparó mediante la lisis de E. coli en un solvente que contenía ácido fórmico (FA) al 50 % en volumen y acetonitrilo (ACN) al 25 % en volumen. Las concentraciones de FA y ACN se ajustaron a ACN al 37,5 % en volumen y FA al 25 % en volumen. La concentración de proteína en las muestras de prueba estaba entre 2 mg/ml y 3 mg/ml, según se determinó con el análisis de BCA. Las muestras de prueba se diluyeron y se aplicó de 1 |jg a 11 |jg de proteína a las columnas de extracción. Las columnas de extracción usadas en esta prueba eran todas columnas de fase inversa con química C8, SDB-XC o RP-4H. SDB-XC (3M) es un copolímero de poli(estirendivinilbenceno) que es esférico, poroso y reticulado. La química de RP-4H se explica en otra parte. C8 se probó con dos plataformas ThermoFisher Scientific MSIA y la plataforma ThermoFisher Scientific StageTip.

Antes de aplicar las muestras de prueba a las columnas de extracción, el medio se humedeció con ACN que tiene FA al 0,2 % en volumen. Después, el medio se equilibró con una solución que contenía agua y FA al 0,2 % en volumen. Las muestras que tenían una cantidad total de 1 jg a 11 jg de proteína se forzaron a través del medio en la columna de extracción. El flujo de material no unido de las muestras se recolectó para su análisis. El medio se lavó con una solución que contenía agua y FA al 0,1-0,2 % en volumen. Las muestras de proteína se eluyeron del medio con una solución que contenía agua, ACN al 60 % en volumen y FA al 0,2 % en volumen. Las proteínas eluidas se recolectaron para su análisis.

Las muestras de flujo de material no unido (FT) y las muestras eluidas se analizaron para determinar la concentración de proteína. En algunos resultados, los eluatos de múltiples muestras (3-5) se combinaron y se secaron parcialmente hasta aproximadamente 1/3 de su volumen original antes de analizarse. La concentración de proteína se determinó con el uso del ensayo de BCA en Nanodrop (Thermo Fisher Scientific). Las curvas estándar de albúmina de suero bovino se prepararon con el uso de las mismas concentraciones de FA y ACN que se usaron en las muestras de FT y eluato. Los resultados se proporcionan en la Tabla 3.

Otro experimento se realizó con puntas de RP-4H y placas POROS R1 con el uso de extractos de Candida tropicalis. El extracto de C. tropicalis se preparó como el extracto de E. coli anterior y la muestra se diluyó en agua a una dilución de 1:5 (10 j l de extracto y 40 j l de agua). Antes de la adición de la muestra, el medio de la punta de SPE se humedeció con 50 j l de ACN con FA al 0,2 % y las puntas de RP-4H o la placa POROS R1 se centrifugaron para forzar el paso del líquido. Después, los medios se equilibraron con 50 j l de FA al 0,2 % y se volvieron a centrifugar antes de la aplicación de la muestra. La muestra se centrifugó y el medio se lavó con 50 j l de FA al 0,2 % antes de la elución. Los medios se eluyeron con 10 j l de ACN al 60 % con FA al 0,2 % para limpiar los recipientes con poca unión. A continuación, los eluyentes se transformaron en una jeringa Hamilton y se rociaron en el espectrómetro de masas. Las Figuras 8A-8B muestran los espectros de masas de C. tropicalis purificado con RP-4H (Figura 8B) o POROS R1 (Figura 8A).

Tabla 3. Ejemplos de la unión de proteínas de E. coli a diferentes materiales de punta de SPE.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   i. Un método para identificar un microorganismo en un líquido que comprende proteínas interferentes de una fuente de mamífero, en donde las proteínas interferentes incluyen preferentemente una o más hemoglobina, defensinas o sus productos de proteólisis, el método comprende:

   preparar un lisado, el lisado comprende las proteínas interferentes y las proteínas del microorganismo; poner en contacto el lisado con un medio cromatográfico, en donde las proteínas interferentes y las proteínas del microorganismo se unen al medio cromatográfico;

   eluir selectivamente las proteínas unidas al medio cromatográfico para producir al menos una fracción eluida, en donde la al menos una fracción eluida está enriquecida en las proteínas del microorganismo y reducida en las proteínas interferentes; y

   someter la al menos una fracción eluida a análisis de espectrometría de masas de proteínas, tal como MALDI o ESI-MS, para identificar la presencia de uno o más microorganismos en el líquido en donde el líquido es preferentemente uno de sangre, un hemocultivo, orina o líquido cefalorraquídeo.
2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde preparar el lisado incluye lisar las células del microorganismo para liberar su contenido, preferentemente el método comprende además separar los fragmentos de células y las células no lisadas del microorganismo del contenido de las células del microorganismo para producir el lisado.
3. 3. El método de la reivindicación 2, que comprende además:

   proporcionar el líquido;

   poner en contacto el líquido con un agente de lisis seleccionado para lisar las células de mamífero en el líquido pero no las células del microorganismo;

   separar las células del microorganismo de las células de mamífero lisadas;

   lavar las células del microorganismo.
4. 4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde poner en contacto el lisado con un medio cromatográfico incluye:

   proporcionar un recipiente que contiene una cantidad seleccionada del medio cromatográfico; añadir el lisado al recipiente y dejar que el lisado se mezcle con el medio cromatográfico; sedimentar el medio cromatográfico por centrifugación para separar el medio cromatográfico del lisado;

   lavar el medio cromatográfico en un medio de tampón de lavado; y

   sedimentar el medio cromatográfico para separar el medio cromatográfico del tampón de lavado; y en donde la elución selectiva de las proteínas unidas al medio cromatográfico se realiza con un tampón de elución.
5. 5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde poner en contacto el lisado con un medio cromatográfico incluye:

   proporcionar un cartucho de extracción que contiene un lecho del medio cromatográfico; añadir el lisado al cartucho de extracción y dejar que el lisado fluya a través del lecho de medio cromatográfico; y

   añadir un tampón de lavado al cartucho de extracción y dejar que el tampón de lavado fluya a través del lecho de medio cromatográfico; y

   en donde la elución selectiva de las proteínas unidas al medio cromatográfico se realiza con un tampón de elución, en donde, preferentemente, el cartucho de extracción está en línea en un sistema de cromatografía líquida y el lisado se añade al cartucho de extracción mediante una bomba, y en donde, preferentemente, el tampón de elución comprende agua y acetonitrilo en un intervalo de 10 % en volumen a 60 % en volumen.
6. 6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el medio cromatográfico se selecciona del grupo que consiste en medios de fase inversa, medios de fase normal, medios de intercambio iónico, medios cromatográficos de afinidad, medios de exclusión por tamaño, medios de interacciones hidrófobas y sus combinaciones.
7. 7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el medio cromatográfico se prepara a partir de monómeros seleccionados del grupo que consiste en monómeros que contienen vinilo sustituidos o no sustituidos, monómeros que contienen acrilato sustituidos o no sustituidos, monómeros que contienen metacrilato sustituidos o no sustituidos, acrilamida, etileno fluorosustituido, polímeros seleccionados del grupo que consiste en poliolefina, poliéster, poliuretano, poliamida y sus combinaciones, en donde, preferentemente, los monómeros incluyen una mezcla de al menos dos monómeros presentes en una cantidad de 10 % en volumen a 70 % en volumen.
8. 8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el medio cromatográfico se prepara a partir de una mezcla de dos o más de: divinilbenceno, estireno y etilvinilbenceno.
9. 9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

   preparar un lisado que incluye las proteínas de mamífero interferentes y las proteínas del microorganismo del líquido, en donde el líquido se selecciona del grupo que consiste en sangre total, un hemocultivo, orina y líquido cefalorraquídeo, en donde preparar el lisado incluye:

   lisar las células del microorganismo para liberar su contenido, el contenido comprende proteínas de los microorganismos, preferentemente separar además las células del microorganismo no lisadas y los fragmentos de células del contenido de las células del microorganismo para producir el lisado; separar las proteínas del microorganismo de las proteínas de mamífero interferentes, en donde la separación incluye las etapas de:

   (a) proporcionar un cartucho de extracción de un solo uso que contiene un lecho de medio cromatográfico;

   (b) añadir el lisado al cartucho de extracción y dejar que el lisado fluya a través del lecho del medio cromatográfico;

   (c) lavar el cartucho de extracción con un tampón de lavado; y

   (d) eluir selectivamente las proteínas unidas al medio cromatográfico para producir al menos una fracción eluida, en donde la elución selectiva incluye hacer fluir diferentes concentraciones de un tampón de elución que incluye un solvente orgánico polar en un intervalo de concentración de 10 % en volumen a 60 % en volumen; y

   someter la al menos una fracción eluida a análisis de espectrometría de masas de proteínas, tal como MALDI, ESI-MS o ESI-MS/MS, para identificar la presencia de uno o más agentes infecciosos en la muestra de sangre, en donde, preferentemente, el microorganismo es uno o más de bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas, arqueas, micobacterias, micoplasmas, levaduras, virus y hongos filamentosos.
10. 10. El método de la reivindicación 9, que comprende además las etapas de:

    lisar células de mamífero, si están presentes en el líquido, al poner en contacto las células de mamífero con un agente de lisis seleccionado para lisar las células de mamífero pero no las células del microorganismo;

    separar las células del microorganismo de las células de mamífero lisadas; y

    lavar las células del microorganismo.
11. 11. El método de la reivindicación 10, en donde el agente de lisis seleccionado para lisar las células de mamífero es un detergente, preferentemente saponina.
12. 12. El método de la reivindicación 9, en donde el cartucho de extracción está en línea en un sistema de cromatografía líquida y el lisado se añade al cartucho de extracción mediante una bomba.
13. 13. El método de la reivindicación 9, en donde el tampón de elución comprende agua y 10 % en volumen a 60 % en volumen de acetonitrilo, en donde, preferentemente, las proteínas del cartucho de extracción se eluyen isocráticamente o en donde las proteínas del cartucho de extracción se eluyen en un gradiente de aproximadamente 10 % en volumen a 60 % en volumen de acetonitrilo.
14. 14. Un kit para identificar un microorganismo en una muestra de líquido, que comprende:

    un tubo de lisis de muestra que comprende un detergente seleccionado para lisar selectivamente las células de mamífero en la muestra y no las células del microorganismo a identificar;

    un tampón de lisis de microorganismos;

    un cartucho de extracción de un solo uso que comprende un medio cromatográfico para la separación rápida y selectiva de las proteínas de mamífero de las proteínas microbianas; y

    instrucciones para la identificación del microorganismo en un líquido al lisar las células de mamífero en el líquido corporal; lisar células del microorganismo; separar las proteínas del microorganismo de las proteínas de mamífero con el uso del cartucho de extracción; e identificar el microorganismo al someter las proteínas del microorganismo a un análisis de espectrometría de masas, tal como MALDI o ESI-MS, que preferentemente comprende además un tampón de elución seleccionado para eluir al menos una fracción eluida del cartucho de extracción que comprende una proteína microbiana suficiente para la identificación del microorganismo.
15. 15. El kit de la reivindicación 14, en donde el medio cromatográfico se selecciona del grupo que consiste en medios de intercambio iónico, medios cromatográficos de afinidad, medios de exclusión por tamaño, medios de interacciones hidrófobas y sus combinaciones.
16. 16. El kit de la reivindicación 14 o 15, en donde el medio cromatográfico se prepara a partir de monómeros seleccionados del grupo que consiste en monómeros que contienen vinilo sustituidos o no sustituidos, monómeros que contienen acrilato sustituidos o no sustituidos, monómeros que contienen metacrilato sustituidos o no sustituidos, acrilamida, poliolefina, poliéster, poliuretano, poliamida, etileno fluorosustituido y sus combinaciones, en donde los monómeros incluyen preferentemente una mezcla de al menos dos monómeros presentes en una cantidad de 10 % en volumen a 70 % en volumen.
17. 17. El kit de la reivindicación 16, en donde el medio cromatográfico se prepara a partir de una mezcla de divinilbenceno y etilvinilbenceno.