CN115290782A - 含水蛭、全蝎、僵蚕和/或土鳖虫的制剂的鉴别方法及其应用 - Google Patents

含水蛭、全蝎、僵蚕和/或土鳖虫的制剂的鉴别方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药药物分析方法技术领域，尤其是涉及一种含水蛭、全蝎、僵蚕和/或土鳖虫的制剂的鉴别方法及其应用。所述鉴别方法，包括如下步骤：采用UPLC‑QqQ/MS对制剂的供试品溶液进行检测，获得MRM色谱图；液相色谱条件：色谱柱为Hss T3C18色谱柱；柱温为30±5℃；以甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱；质谱条件：ESI+模式，采用多反应监测采集方式。本发明采用上述方法可对含水蛭、全蝎、僵蚕、土鳖虫4味动物药中的任一种或多种的制剂进行定性鉴别，该方法专属性强、灵敏度高，可以有效提高制剂的质量控制。

Description

含水蛭、全蝎、僵蚕和/或土鳖虫的制剂的鉴别方法及其应用
技术领域
本发明涉及中药药物分析方法技术领域，尤其是涉及一种含水蛭、全蝎、僵蚕和/或土鳖虫的制剂的鉴别方法及其应用。
背景技术
中药材按其来源属性分为植物药、动物药、矿物药3类，其中动物类药材是动物的组织、器官、腺体、体液、分泌物以及皮、骨、角、甲和胎盘等的加工品。2015年版《中国药典》一部共收载55种动物药材、1种动物药材提取物和458种含有动物药材的制剂，占全部品种的18％。动物药药理作用显著，但由于其化学活性成分类型多样、成分复杂、分析方法欠缺等原因，现有动物药质量及质控标准存在较大问题，主要表现：①质控标准缺失或不完善；②动物药由于脂肪及蛋白含量高，易吸收空气中的水分而潮解，从而产生霉变；同时容易产生虫蛀及色泽变化、有效成分降解等问题。如何对动物药进行有效监测，对保证动物药药用安全具有重要意义。
2020版《中国药典》一般采用性状、显微鉴别、薄层色谱等方法对动物药进行鉴别。然而，上述传统方法缺乏特异性，且需要经验丰富的实验员。此外，由于加工的原因，动物药失去了组成物种的微观和形态特征，因此，很难发现含动物药的制剂中是否包含动物药。动物药的成分主要是复杂的大分子，如蛋白质和多肽。近年来动物药的质量控制研究主要集中在内源性小分子的质量标记(Q-Marker)的定量，如总多糖、核苷、氨基酸等。然而，由于动物药中内源性小分子丰富，无法找出物种特异性标记物。因此，对这一类天然药物进行大分子监测并揭示其内在差异是一项具有挑战性的任务，因此有必要制定一种新的策略来对含动物药的制剂如芪蛭通络胶囊中的动物药进行质量控制。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的一个目的在于提供含水蛭、全蝎、僵蚕和/或土鳖虫的制剂的鉴别方法，以解决现有技术中存在的含动物药的制剂质量控制困难等技术问题。
本发明的又一目的在于提供含水蛭、全蝎、僵蚕和/或土鳖虫的制剂的鉴别方法在芪蛭通络胶囊的质量控制中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
含水蛭、全蝎、僵蚕和/或土鳖虫的制剂的鉴别方法，包括如下步骤：
采用液质联用法UPLC-QqQ/MS对制剂的供试品溶液进行检测，获得MRM色谱图；
所述液质联用法UPLC-QqQ/MS的条件包括：
液相色谱条件：色谱柱为Hss T3 C18色谱柱；柱温为30±5℃；以甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱；
质谱条件：ESI+模式，离子源温度为100～150℃，毛细管电压为2.5～3.5kV，锥孔电压为15～30V，除溶剂温度为400～500℃，除溶剂气体流速为800～1000L/h，采用多反应监测采集方式。
本发明采用上述方法对含水蛭、全蝎、僵蚕、土鳖虫4味动物药中的任一种或多种的制剂进行定性鉴别，该方法专属性强、灵敏度高，可以有效提高含上述几味动物药的制剂的质量控制。
本发明的鉴别方法，适用于含上述4味动物药中一味、两味、三味或四味的制剂，如可以对单独含有水蛭、全蝎、僵蚕或土鳖虫的制剂进行鉴别，也可对含有水蛭、全蝎、僵蚕和土鳖虫的任意两味的制剂进行鉴别，还可以对含有水蛭、全蝎、僵蚕和土鳖虫的任意三味的制剂进行鉴别，可以对同时含有水蛭、全蝎、僵蚕和土鳖虫四味的制剂进行鉴别。
在本发明的具体实施方式中，还包括：将获得的MRM色谱图与特征图谱进行比对；
所述特征图谱的构建方法包括：
(a)采用液质联用法UPLC-QTOF/MS采集水蛭、全蝎、僵蚕和土鳖虫各单味药的供试品溶液的总离子流色谱图；对所述总离子流色谱图进行预处理得到二维的离子强度图；
(b)对步骤(a)UPLC-QTOF/MS采集的数据进行主成分分析和正交偏最小方差分析，筛选出特征离子；
(c)根据步骤(b)得到的特征离子，在多反应监测模式下进行检测，获得特征离子的MRM色谱图，得到特征离子对。
在本发明的具体实施方式中，将制剂的MRM色谱图与水蛭、全蝎、僵蚕和/或土鳖虫单味药的MRM色谱图比对。当制剂的MRM色谱图中包括在单味药MRM色谱图中的水蛭、全蝎、僵蚕和/或土鳖虫的特征离子对时，则认为制剂中含有水蛭、全蝎、僵蚕和/或土鳖虫；反之，则判断为未检出该动物药。
在本发明的具体实施方式中，水蛭、全蝎、僵蚕、土鳖虫药材中的特征离子信息分别如下：
水蛭：
①m/z 469.28，保留时间10.8(10.75～10.85)min；
②m/z 449.24，保留时间11.9(11.85～11.95)min；
③m/z 950.96，保留时间12.7(12.65～12.75)min；
④m/z 810.40，保留时间13.7(13.65～13.75)min；
⑤m/z 834.90，保留时间15.4(15.35～15.45)min；
⑥m/z 866.94，保留时间19.3(19.25～19.35)min；
⑦m/z 652.86，保留时间21.7(21.65～21.75)min；
全蝎：
①m/z 236.15，保留时间7.9(7.85～7.95)min；
②m/z 251.15，保留时间6.3(6.25～6.35)min；
③m/z 249.17，保留时间10.5(10.45～10.55)min；
④m/z 265.17，保留时间5.7(5.65～5.75)min；
⑤m/z 295.30，保留时间7.1(7.05～7.15)min；
⑥m/z 301.33，保留时间10.2(10.15～10.25)min；
僵蚕：
①m/z 593.81，保留时间18.35(18.30～18.40)min；
②m/z 703.91，保留时间30.80(30.75～30.85)min；
③m/z 719.41，保留时间6.30(6.25～6.35)min；
④m/z 933.38，保留时间5.50(5.45～5.55)min；
⑤m/z 1186.69，保留时间18.35(18.30～18.40)min；
土鳖虫：
①m/z 1105.80，保留时间25.6(25.55～25.65)min；
②m/z 599.41，保留时间29.3(29.25～29.35)min；
③m/z 904.39，保留时间33.9(33.85～33.95)min。
在本发明的具体实施方式中，步骤(a)中，采用Progenesis QI软件对所述总离子流色谱图进行预处理得到二维的离子强度图；步骤(b)中，采用EZinfo software对步骤(a)UPLC-QTOF/MS采集的数据进行主成分分析和正交偏最小方差分析。
在本发明的具体实施方式中，步骤(a)中，液质联用法UPLC-QTOF/MS的条件包括：
液相色谱条件：色谱柱为Hss T3 C18色谱柱；柱温为30±5℃；以甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱；
质谱条件：ESI+模式，离子源温度为100～150℃，毛细管电压为2.5～3.5kV，锥孔电压为15～30V，除溶剂温度为400～500℃，除溶剂气体流速为800～1000L/h，采用MSEcontinuum采集方式，扫描范围50～1500amu。
在本发明的具体实施方式中，步骤(c)中，采用UPLC-QqQ/MS检测，所述检测的条件包括：ESI+模式，离子源温度为100～150℃，毛细管电压为2.5～3.5kV，锥孔电压为15～30V，除溶剂温度为400～500℃，除溶剂气体流速为800～1000L/h。
在本发明的具体实施方式中，所述梯度洗脱的程序包括：0～25min，流动相A的体积分数由97％变至80％；25～45min，流动相A的体积分数由80％变至50％。
在本发明的具体实施方式中，所述流动相A中，甲酸的体积分数为0.05％～0.15％，如为0.1％。
在本发明的具体实施方式中，所述梯度洗脱的流速为0.25～0.35mL/min，如0.3mL/min。
在本发明的具体实施方式中，所述色谱柱的规格为2.1mm×100mm，1.8μm。在实际操作中，所述色谱柱可以为Waters ACQUITYTM UPLC，Hss T3 C18(2.1mm×100mm，1.8μm)色谱柱。
在本发明的具体实施方式中，所述制剂的供试品溶液为胰蛋白酶酶解液；各单味药的供试品溶液为各单味药的胰蛋白酶酶解液。所述供试品溶液的制备包括：以水作为提取溶剂对制剂或各单味药进行提取处理，收集液体并蒸干，用碳酸氢铵溶液溶解，加入胰蛋白酶溶液，于37±1℃酶解10～14h。
在实际操作中，提取溶剂与制剂的用量比为(5～10)mL﹕1g，如7.5mL﹕1g；提取溶剂与单味药的用量比为(25～35)mL﹕1g，如30mL﹕1g。
在本发明的具体实施方式中，所述提取处理包括：于密闭容器中，加热至120±5℃煮沸10～14h。在实际操作中，可在安瓿瓶中进行所述提取处理。
在实际操作中，用碳酸氢铵溶液溶解定容后，用微孔滤膜(0.22μm)过滤，收集续滤液。
在本发明的具体实施方式中，所述胰蛋白酶溶液的浓度为1.8～2.2mg/mL，如2mg/mL。所述胰蛋白酶溶液的配制包括：以碳酸氢铵溶液溶解胰蛋白酶。
在本发明的具体实施方式中，所述胰蛋白酶溶液与续滤液的体积比为1﹕(8～12)，如1﹕10。
在本发明的具体实施方式中，所述碳酸氢铵溶液中，碳酸氢铵的质量分数为0.8％～1.2％，如1％。进一步的，以2g制剂计，所述碳酸氢铵溶液的用量为溶解并定容至10mL；以0.5g单味药计，所述碳酸氢铵溶液的用量为溶解并定容至10mL。
在本发明的具体实施方式中，步骤(a)中，所述预处理包括：归一化处理、峰对齐处理、峰提取处理和去卷积化处理。进一步的，所述预处理的参数设定为：保留时间范围为1～45min，质谱范围为50～2000。
在本发明的具体实施方式中，步骤(b)中，筛选出特征离子的方法包括：正交偏最小方差分析中，分别判别分析评价两组之间的差异，X轴和Y轴分别表示同一组样本之间的变量和相关性，得到的散点图中，每一点代表化合物的精确质量数-保留时间数据(EMRT数据)；X轴代表变量，数据点与原点的距离表示的相对贡献度大小，一个数据点距离中心点越远，该点对样品差异的贡献越大，即“S”型曲线两端的数据代表在此组中对差异贡献度最大的离子。因此，在“S”型曲线两端筛选两组之间的特征多肽，即特征离子。
在本发明的具体实施方式中，所述制剂还包括地龙。
在本发明的具体实施方式中，地龙药材中的特征离子信息如下：
①m/z 828.43，保留时间7.90(7.85～7.95)min；
②m/z 612.37，保留时间12.9(12.85～12.95)min；
③m/z 519.78，保留时间14.5(14.45～14.55)min；
④m/z 676.44，保留时间19.6(19.55～19.65)min；
⑤m/z 649.87，保留时间30.1(30.05～30.15)min。
在本发明的具体实施方式中，所述制剂包括芪蛭通络胶囊。
芪蛭通络胶囊是由黄芪、水蛭、人参等26味中药组成，包括21味植物药和5味动物药，动物药分别为水蛭、全蝎、僵蚕、土鳖虫、地龙，这5味动物药的投料量仅占总处方的13.3％，其中水蛭、全蝎、僵蚕、土鳖虫为原粉入药，而地龙需和其他21味植物药一起进行水煎煮提取，故制剂中5味动物药因其浓度低、基质干扰大很难进行质量控制方法的建立。本发明建立了芪蛭通络胶囊中4味原粉入药的动物药的高专属性检测方法，可用于芪蛭通络胶囊的质量控制。
在本发明的具体实施方式中，所述芪蛭通络胶囊中，水蛭、全蝎、僵蚕和土鳖虫的特征离子包括：m/z 593.84(保留时间为17.85～17.95min)、m/z 449.28(保留时间为11.71～11.81min及13.21～13.31min)、m/z 265.16(保留时间为5.42～5.52min)、m/z 251.35(保留时间为5.99～6.09min)、m/z 295.30(保留时间为6.68～6.78min)、m/z 301.13(保留时间为9.76～9.86min)、m/z249.41(保留时间为9.98～10.08min)、m/z 1105.8(保留时间为25.13～25.23min)、m/z 599.5(保留时间为28.95～29.05min)、m/z 904.6(保留时间为33.86～33.96min)。其中，m/z 449.28归属于水蛭，m/z 593.84归属于僵蚕，m/z 265.16、m/z 251.35、m/z 295.30、m/z 301.13、m/z 249.41归属于全蝎，m/z 1105.8、m/z 599.5、m/z904.6归属于土鳖虫。
在本发明的具体实施方式中，所述芪蛭通络胶囊中，水蛭、全蝎、僵蚕和土鳖虫的特征离子对包括：m/z 593.84→249.45；m/z 593.84→910.71；m/z 449.28→233.39；m/z449.28→374.54；m/z 265.16→136.11；m/z 265.16→206.27；m/z 251.35→192.30；m/z251.35→234.30；m/z 295.30→236.33；m/z 295.30→278.06；m/z 301.13→242.34；m/z301.13→284.22；m/z 249.41→190.27；m/z 249.41→232.42；m/z 1105.8→657.34；m/z1105.8→835.59；m/z 599.5→355.44；m/z 599.5→468.22；m/z 904.6→263.38；m/z904.6→479.24。
本发明还提供了上述含水蛭、全蝎、僵蚕和/或土鳖虫的制剂的鉴别方法在芪蛭通络胶囊的质量控制中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的方法可以同时有效鉴别多种动物药，其准确性和效率都高于传统的性状鉴别及显微鉴别等方法，并可以有效避免传统鉴别法中假阳性和假阴性情况的出现，对动物类药材含量非常低、组成又非常复杂的中成药也可以得到准确可靠的鉴别结果，能有效提高其质量控制水平；
(2)本发明的方法用于芪蛭通络胶囊的检测，可以保证芪蛭通络胶囊中水蛭、僵蚕、全蝎、土鳖虫的特征肽离子同时被检测到，方法专属性强，耐用性好，具有良好的重复性与准确度，从而更好的实现对芪蛭通络胶囊的质量控制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1的水蛭、地龙、全蝎、僵蚕、土鳖虫的总离子流色谱图；其中A-水蛭，B-地龙，C-全蝎，D-僵蚕，E-土鳖虫；
图2为本发明实施例1的主成分分析图；
图3为本发明实施例1的正交偏最小方差分析的散点图；
图4为本发明实施例1的僵蚕中1个特征离子m/z 593.8137在5种动物药样品中的相对强度分布；
图5为本发明实施例1的水蛭、地龙、僵蚕、土鳖虫、全蝎混合样品的MRM色谱图；其中，A-土鳖虫，B-地龙，C-僵蚕，D-水蛭，E-全蝎；
图6为本发明实施例2的芪蛭通络胶囊中动物药的11个特征离子的MRM色谱图；其中，A-土鳖虫，B-地龙，C-僵蚕，D-水蛭，E-全蝎；
图7为本发明实施例2的芪蛭通络胶囊中动物药的11个特征离子的二级质谱图；其中，A-m/z 265.17；B-m/z 251.15；C-m/z 295.17；D-m/z 301.13；E-m/z 249.41；F、G-m/z449.28；H-m/z 593.84；I-m/z 1105.80；J-m/z 599.50；K-m/z 904.60；
图8为本发明实施例2的芪蛭通络胶囊的特征图谱；
图9为本发明专属性试验中各阴性对照品溶液的色谱图；其中，A-缺土鳖虫阴性对照；B-缺全蝎阴性对照；C-缺僵蚕阴性对照；D-缺水蛭阴性对照；E-芪蛭通络胶囊样品。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
具体实施方式中的对专属性、检测限与定量限、精密度、线性关系及范围、重复性、溶液稳定性等项目的验证，按照现行版《中华人民共和国药典》附录中有关的指导原则进行方法学验证。
本发明中所涉及的特征离子的质荷比m/z以及保留时间的数值可存在仪器允许误差范围内的波动。
本发明具体实施例中采用的材料、仪器及试剂等信息可以如下：
仪器：Waters AcquityTM超高效液相系统，Waters Synapt G2-S Q-TOF MS系统，及Waters AcquityTM超高效液相系统，Waters Xevo TQ-XS三重四杆质谱联用仪DEMO系统，Waters AcquityHssT3色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，热循环干燥箱(FED-115)，恒温恒湿培养箱(climacell 111)。
试剂：胰蛋白酶(质谱级)，亮氨酸脑啡肽(质谱级)，甲酸(色谱纯)均购自Sigma公司；乙腈(色谱纯)购自美国Fisher公司；碳酸氢铵(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；甲酸(分析纯)：DIKMA；纯净水为Milli-Q纯水。微孔滤膜(0.22μm)购自Millipore(Billerica,MA,USA)。
材料样品：芪蛭通络胶囊4批(规格为每粒装0.5g)，批号分别为：20201005、20200906、20200910、20201002，均由山西振东制药股份有限公司提供。黄芪、水蛭、人参、麦冬、五味子、当归、川芎、毛冬青、赤芍、鸡血藤、丹参、制何首乌、红花、泽兰、土鳖虫、地龙、僵蚕、郁金、姜黄、全蝎、天麻、肉桂、羌活、猪牙皂、胆南星、冰片26味饮片均由山西振东制药股份有限公司提供，经检验均符合《中国药典》2020版一部中各味药项下要求。
本发明中采用动物药水蛭、僵蚕、土鳖虫各16批，全蝎15批，地龙10批，详细信息见表1。
表1动物药样品信息
Figure BDA0003775944970000101
Figure BDA0003775944970000111
备注：“SZ”代表水蛭；“DL”代表地龙；“QX”代表全蝎；“JC”代表僵蚕；“TBC”代表土鳖虫
实施例1
本实施例提供了含水蛭、全蝎、僵蚕和/或土鳖虫的制剂的鉴别方法，包括如下步骤：
(1)溶液配制：
胰蛋白酶溶液：取质谱级胰蛋白酶，加1wt％碳酸氢铵水溶液溶解，制成2mg/mL的胰蛋白酶溶液。
空白溶液：取1wt％碳酸氢铵水溶液，用微孔滤膜(0.22μm)过滤，取续滤液200μL，置微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液20μL，摇匀，37℃恒温酶解12h。
各单味药供试品溶液：取水蛭、地龙、全蝎、僵蚕、土鳖虫样品，分别取样品粉末0.5g，于20mL安瓿瓶中，加15mL水，120℃加热煮沸12h，冷却，过滤，蒸干，用1wt％碳酸氢铵水溶液溶解定容至10mL，用微孔滤膜(0.22μm)过滤，取续滤液200μL，置微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液20μL，摇匀，37℃恒温酶解12h，制得各单味药供试品溶液。
芪蛭通络胶囊供试品溶液的制备：取芪蛭通络胶囊样品粉末2g，于20mL安瓿瓶中，加15mL水，120℃加热煮沸12h，冷却，过滤，蒸干，用1wt％碳酸氢铵水溶液溶解定容至10mL，用微孔滤膜(0.22μm)过滤，取续滤液200μL，置微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液20μL，摇匀，37℃恒温酶解12h，制得芪蛭通络胶囊供试品溶液。
阴性样品的制备：按照芪蛭通络胶囊处方，分别取除水蛭、僵蚕、全蝎和土鳖虫的其他药味，按照供试品溶液的制备方法分别制成缺水蛭、缺全蝎、缺僵蚕、缺土鳖虫的阴性对照溶液。
(2)检测条件
液相色谱条件：采用Waters ACQUITYTM UPLC，Hss T3 C18(2.1mm×100mm，1.8μm)色谱柱，柱温为30℃，样品室温度为6℃，进样量为5μL；流动相A为0.1vt％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流速为0.3mL/min，梯度洗脱程序见表2。
表2梯度洗脱程序表
Figure BDA0003775944970000121
质谱①条件：Waters Synapt G2-S Q-TOF MS系统，模式为ESI+，离子源温度为120℃；毛细管电压为3.0kV，锥孔电压为20V；除溶剂温度为450℃，除溶剂气体流速为800L/h；数据采集时采用亮氨酸脑啡肽进行及时质量校正，以保证采集质量数的准确性与重复性。采用MSEcontinuum采集方式，扫描范围50～1500amu，扫描时间为0.2s；碰撞气体为高纯氩气，设定高低2个能量通道交替采集数据得到目标化合物的分子离子和碎片离子。低能量通道的碰撞能量为6V，高能量通道的碰撞能量为10～40V的梯度能量。
质谱②条件：Waters Xevo TQ-XS三重四杆质谱联用仪DEMO系统，模式为ESI+，离子源温度为120℃；毛细管电压为3.0kV；除溶剂温度为450℃，除溶剂气体流速为800L/h；采用多反应监测(MRM)采集方式，扫描时间为0.2s；碰撞气体为高纯氩气。
(3)检测步骤
利用Waters AcquityTM超高效液相系统及Waters Synapt G2-S Q-TOF MS系统，在上述液相色谱和质谱①条件下，分别对各个胰蛋白酶酶解的供试品溶液进行LC-MS数据的采集与分析，分别得到水蛭、地龙、全蝎、僵蚕、土鳖虫的总离子流色谱图(total ionchromatography，TIC)，见图1。
(4)数据分析
将UPLC-Q-TOF/MS所采集的不同单味药材的总离子流色谱图导入Progenesis QI软件中进行预处理。经过归一化(Normalication)、峰对齐(Peak Alignment)、峰提取(PeakPicking)、去卷积化(Deconvolution)过程以获得适合用于后期多元统计分析的数据。其中，去卷积化也负责将同一保留时间的不同物质分开。保证将分析中每个步骤的原始数据可视化而不会丢失数值，分析参数设定为：保留时间范围为1～45min，质谱范围为50～2000。将LC-MS数据中每一个数据点转换成精确质量数-保留时间数据对(exact massretention time EMRT)，将三维LC-MS数据转换成2D的离子强度图，在这些条件下，将相应的预处理结果进行保存，用于后期统计分析。最终的ESI+模式数据集包含19545个化合物离子。
采用EZinfo software(v 3.0)，对UPLC-Q-TOF/MS采集的数据使用无监督的主成分分析检测水蛭、地龙、全蝎、僵蚕、土鳖虫药材的差异及分组趋势，分析结果见图2。从图中可知，5种药材分别落在不同的区域。此结果表明5种动物药之间存在明显差异，说明有相应特征成分的存在。
进一步对水蛭、地龙、全蝎、僵蚕、土鳖虫进行因子分析：
第1组：水蛭单独一组，地龙、全蝎、僵蚕及土鳖虫分为一组；
第2组：地龙单独一组，水蛭、全蝎、僵蚕及土鳖虫分为一组；
第3组：土鳖虫单独一组，地龙、全蝎、僵蚕及水蛭分为一组；
第4组：全蝎单独一组，地龙、水蛭、僵蚕及土鳖虫分为一组；
第5组：僵蚕单独一组，地龙、全蝎、水蛭及土鳖虫分为一组；
利用正交偏最小方差(OPLS-DA)模型识别不同动物药中成分的差异。采用OPLS-DA分别判别分析评价两组之间的差异，X轴和Y轴分别表示同一组样本之间的变量和相关性。所得到的散点图如图3所示(以僵蚕为例)，在散点图中，每一点都代表化合物的精确质量数-保留时间数据(EMRT)。X轴代表变量，数据点与原点的距离表示的相对贡献度大小，一个数据点距离中心点越远，该点对样品差异的贡献越大，即“S”型曲线两端的数据代表在此组中对差异贡献度最大的离子。因此，在“S”型曲线两端筛选两组之间的特征多肽(Markerpeptide)，即特征离子。
具体以僵蚕为例进行数据分析，即僵蚕和水蛭、地龙、僵蚕、全蝎进行分组对比，图3中接近S型曲线左下角的EMRT数据对为僵蚕区别于水蛭、地龙、僵蚕、全蝎的特征肽段的数据信息，其中，僵蚕特征离子在73个样品中的相对离子强度分布如图4所示，这些特征离子在16个僵蚕样品中均可被检出，而在其他4味动物药样品中几乎未检出，选取1个具有代表性的特征离子进行分析，其质谱图中同位素峰与主峰的差值多数为0.5Da，说明该特征离子为双电荷离子，详细结果为：25.060min-m/z 593.8137；8.38min-m/z 583.8135，结果见图4。
由于OPLS-DA使用算法在实验组之间进行强制分离，可能会导致统计上不可靠的结论，且没有验证。因此本发明对OPLS-DA筛选出的特征离子在总离子流图中分别进行提取验证，以确保它们在其它样品中不存在。最后，这些特征离子只能在僵蚕中检测到，在其他4味动物药中检测不到。用同一方法对水蛭、地龙、土鳖虫、全蝎中的特征离子进行了测定。结果水蛭、地龙、僵蚕、全蝎和土鳖虫药材分别检测到7、5、5、6、3个特征离子。表3列出了每个动物药的特征离子的详细信息，在特征离子确定后，选择的特征离子对应的子离子时进行电压优化。此外，每个特征离子在验证时(采用UPLC-QQQ/MS)使用选择离子Selected IonRecoring(SIR)模式进行，对应MRM色谱图如图5所示。
本实施例的方法可以分别检测到水蛭、地龙、僵蚕、全蝎和土鳖虫药材中的特征离子，也可以同时检测到水蛭、地龙、僵蚕、全蝎和土鳖虫药材中的特征离子，几味动物药材之间互不干扰，也进一步说明了本实施例的方法可以用于含上述五味动物药材中任一味、两味、三味、四味和五味的制剂的鉴别。比如，可以用于含任一味动物药材的制剂或含以下动物药材组合的制剂的鉴别：
水蛭和地龙；水蛭和僵蚕；水蛭和全蝎；水蛭和土鳖虫；地龙和僵蚕；地龙和全蝎；地龙和土鳖虫；僵蚕和全蝎；僵蚕和土鳖虫；全蝎和土鳖虫；水蛭、地龙和僵蚕；水蛭、地龙和全蝎；水蛭、地龙和土鳖虫；水蛭、僵蚕和全蝎；水蛭、僵蚕和土鳖虫；水蛭、全蝎和土鳖虫；地龙、僵蚕和全蝎；地龙、僵蚕和土鳖虫；地龙、全蝎和土鳖虫；僵蚕、全蝎和土鳖虫；水蛭、地龙、僵蚕和全蝎；水蛭、地龙、僵蚕和土鳖虫；水蛭、地龙、全蝎和土鳖虫；水蛭、僵蚕、全蝎和土鳖虫；地龙、僵蚕、全蝎和土鳖虫；水蛭、地龙、僵蚕、全蝎和土鳖虫。
表3水蛭、全蝎、僵蚕、土鳖虫、地龙酶解多肽离子及碎片离子的相关质谱信息
Figure BDA0003775944970000161
实施例2
本实施例提供了芪蛭通络胶囊的鉴别方法，包括如下步骤：
(1)按照实施例1的方法得到每个动物药的特征离子的详细信息；
(2)将实施例1配制的芪蛭通络胶囊供试品溶液进行UPLC-QqQ/MS(多反应监测模式)检测；液相色谱条件同实施例1；质谱条件同实施例1质谱②条件。
(3)检测结果
由于制剂组成复杂，各动物药在处方中所占比例较低，五种动物药物仅占21种植物药的13.3％(w/w)，故部分特征离子在制剂样品中响应较低。地龙由于在制剂工艺中需要经过水煎煮提取，受到基质干扰较大的原因，其对应的特征离子在制剂中未找到，结果见图6。最后，在芪蛭通络胶囊样品中检测到11个特征离子，包括水蛭的2个、僵蚕1个、土鳖虫5个、全蝎3个特征离子。各动物药在芪蛭通络胶囊中的特征离子见表4。芪蛭通络胶囊中11个特征离子对应的MRM色谱图6。
表4芪蛭通络胶囊中11个特征离子信息表
Figure BDA0003775944970000171
(4)特征离子对的建立
将实施例1配制的芪蛭通络胶囊供试品溶液利用Waters Acquity TM超高效液相系统及Waters XevoTM TQ-S MS系统进行检测。液相色谱条件同实施例1；质谱条件(UPLC-QQQ-MS)为：Waters Xevo TQ-XS三重四杆质谱联用仪DEMO系统，采用电喷雾离子源，正离子模式下检测，毛细管电压为3.0kV，离子源温度为450℃；除溶剂气体流速为800L/h；在选择离子模式和子离子模式下，分别优化其传输电压(Fragmentation)和碰撞能量(CollisionEnergey CE)，在二级质谱图中分别筛选响应较高的两个离子为子离子，相对应的二级质谱图如图7所示，详细的优化条件信息如表5所示，锥孔电压在10～50V，碰撞能量在15～35V。
表5芪蛭通络胶囊中11个特征离子及其碎片离子的相关质谱信息
Figure BDA0003775944970000181
根据上述结果，构建了芪蛭通络胶囊中水蛭、全蝎、僵蚕和土鳖虫的酶解多肽特征图谱，如图8所示，其中，峰1～5归属于全蝎，峰6～7归属于水蛭，峰8归属于僵蚕，峰9～11归属于土鳖虫。这10组离子对分别是：m/z 593.84→249.45；m/z 593.84→910.71；m/z449.28→233.39；m/z 449.28→374.54；m/z 265.16→136.11；m/z 265.16→206.27；m/z251.35→192.30；m/z 251.35→234.30；m/z 295.30→236.33；m/z 295.30→278.06；m/z301.13→242.34；m/z 301.13→284.22；m/z 249.41→190.27；m/z 249.41→232.42；m/z1105.8→657.34；m/z 1105.8→835.59；m/z 599.5→355.44；m/z 599.5→468.22；m/z904.6→263.38；m/z 904.6→479.24。
方法学验证
1、胰蛋白酶用量及酶解时间考察
参照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则3405肽图检查法中的溶剂条件，考察酶解时间和酶的用量。在温度37℃，相对湿度90％的恒温恒湿箱内酶解，于2、5、8、12、16、24h分别进样，结果见表6。酶解12h时芪蛭通络胶囊色谱图中各特征峰响应值达到最高，故酶解时间选择12h。样品与酶的比例分别设置为2﹕1、5﹕1、10﹕1、20﹕1、50﹕1考察酶的用量。当样品与酶比例在5﹕1和10﹕1时，酶解12h的样品色谱图中各特征峰响应值一致。综合考虑各个因素，选择样品与胰蛋白酶的比例为10﹕1，酶解12h。
表6芪蛭通络胶囊中11个色谱峰酶解时间考察结果
Figure BDA0003775944970000191
Figure BDA0003775944970000201
2、专属性试验
分别取缺水蛭、缺僵蚕、缺全蝎、缺土鳖虫阴性样品各2g，按实施例1中的阴性对照溶液的制备方法操作，按实施例2步骤(2)的色谱条件及质谱条件进样检测。记录各色谱图，见图9。结果表明各特征离子均无阴性干扰，专属性良好。
3、精密度试验
精密量取实施例1中的芪蛭通络胶囊供试品溶液，按实施例2步骤(2)的色谱条件及质谱②条件重复进样6次。记录上述11个色谱峰的保留时间和峰面积。计算各色谱峰的保留时间及峰面积的RSD％。结果表明，上述11个色谱峰的保留时间(见表7)和峰面积(见表8)的RSD(％)均＜5％，符合要求，精密度实验结果良好。
表7 11个色谱峰的保留时间在精密度试验考察中的结果
No. S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11
1 5.54 6.11 6.81 9.93 10.13 11.87 13.37 18.03 25.30 29.11 33.92
2 5.53 6.10 6.79 9.91 10.11 11.84 13.35 18.01 25.28 29.09 33.92
3 5.51 6.08 6.77 9.88 10.08 11.82 13.32 17.99 25.27 29.08 33.92
4 5.51 6.08 6.77 9.88 10.08 11.82 13.32 17.98 25.25 29.07 33.92
5 5.49 6.07 6.76 9.86 10.06 11.80 13.31 17.97 25.25 29.07 33.92
6 5.49 6.06 6.75 9.85 10.05 11.79 13.30 17.96 25.23 29.05 33.92
均值 5.51 6.08 6.78 9.89 10.09 11.82 13.33 17.99 25.26 29.08 33.92
RSD(％) 0.37 0.31 0.32 0.31 0.30 0.24 0.20 0.14 0.10 0.07 0.00
表8 11个色谱峰的峰面积在精密度试验考察中的结果
Figure BDA0003775944970000202
Figure BDA0003775944970000211
4、重复性试验
分别按照实施例1的芪蛭通络胶囊供试品溶液的制备方法制备6份芪蛭通络胶囊供试品溶液，按实施例2步骤(2)的色谱条件及质谱②条件进样检测。记录上述11个色谱峰的保留时间和峰面积。计算各色谱峰的保留时间及峰面积的RSD％。结果表明，上述11个色谱峰的保留时间(见表9)和峰面积(见表10)的RSD(％)均＜5％，符合要求，方法重复性较好。
表9 11个色谱峰的保留时间在重复性试验考察中的结果
No. S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11
1 5.47 6.05 6.73 9.83 10.03 11.77 13.26 17.93 25.21 29.03 33.92
2 5.46 6.04 6.72 9.82 10.02 11.76 13.27 17.92 25.20 29.02 33.92
3 5.46 6.03 6.72 9.81 10.01 11.76 13.26 17.91 25.19 29.02 33.92
4 5.47 6.05 6.73 9.82 10.02 11.76 13.26 17.91 25.19 29.01 33.92
5 5.46 6.04 6.73 9.82 10.02 11.76 13.27 17.91 25.18 29.00 33.92
6 5.46 6.03 6.73 9.82 10.02 11.76 13.26 17.90 25.18 29.01 33.92
均值 5.46 6.04 6.73 9.82 10.02 11.76 13.26 17.91 25.19 29.02 33.92
RSD(％) 0.09 0.15 0.08 0.06 0.06 0.03 0.04 0.06 0.05 0.04 0.00
表10 11个色谱峰的峰面积在重复性试验考察中的结果
Figure BDA0003775944970000212
Figure BDA0003775944970000221
5、稳定性试验
精密量取实施例1中的芪蛭通络胶囊供试品溶液，按实施例2步骤(2)的色谱条件及质谱②条件的方法分别在0、2、4、8、12、16h进样检测。记录上述11个色谱峰的保留时间和峰面积。计算各色谱峰的保留时间及峰面积的RSD％。结果表明，上述11个色谱峰的保留时间(见表11)和峰面积(见表12)的RSD(％)均＜5％，符合要求，供试品溶液稳定性在16h内稳定性良好。
表11 11个色谱峰的保留时间在稳定性试验考察中的结果
No. S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11
0h 5.54 6.11 6.81 9.83 10.13 11.87 13.37 18.03 25.30 29.11 33.92
2h 5.53 6.10 6.79 9.82 10.11 11.84 13.35 18.01 25.28 29.09 33.92
4h 5.51 6.08 6.77 9.88 10.08 11.82 13.32 17.98 25.25 29.07 33.92
8h 5.47 6.05 6.77 9.84 10.04 11.78 13.28 17.94 25.23 29.05 33.92
12h 5.47 6.04 6.73 9.82 10.03 11.78 13.27 17.93 25.21 29.03 33.92
16h 5.46 6.04 6.73 9.82 10.02 11.77 13.27 17.91 25.19 29.01 33.92
均值 5.50 6.07 6.77 9.84 10.07 11.81 13.31 17.97 25.24 29.06 33.92
RSD(％) 0.63 0.51 0.47 0.24 0.45 0.34 0.33 0.26 0.17 0.13 0.00
表12 11个色谱峰的峰面积在稳定性试验考察中的结果
Figure BDA0003775944970000222
Figure BDA0003775944970000231
6、样品检测
取3个不同批次的芪蛭通络胶囊粉末，分别按照实施例1的芪蛭通络胶囊供试品溶液的制备方法制备6份芪蛭通络胶囊供试品溶液，按实施例2步骤(2)的色谱条件及质谱②条件进样检测。结果3批样品中均可检出11个特征离子。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.含水蛭、全蝎、僵蚕和/或土鳖虫的制剂的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用UPLC-QqQ/MS对制剂的供试品溶液进行检测，获得MRM色谱图；
所述UPLC-QqQ/MS的条件包括：
液相色谱条件：色谱柱为Hss T3 C18色谱柱；柱温为30±5℃；以甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱；
质谱条件：ESI+模式，离子源温度为100～150℃，毛细管电压为2.5～3.5kV，锥孔电压为15～30V，除溶剂温度为400～500℃，除溶剂气体流速为800～1000L/h，采用多反应监测采集方式。
2.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于，还包括：将获得的MRM色谱图与特征图谱进行比对；
所述特征图谱的构建方法包括：
(a)采用UPLC-QTOF/MS采集水蛭、全蝎、僵蚕和土鳖虫各单味药的供试品溶液的总离子流色谱图；对所述总离子流色谱图进行预处理得到二维的离子强度图；
(b)对步骤(a)UPLC-QTOF/MS采集的数据进行主成分分析和正交偏最小方差分析，筛选出特征离子；
(c)根据步骤(b)得到的特征离子，在多反应监测模式下进行检测，获得特征离子的MRM色谱图，得到特征离子对。
3.根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，步骤(a)中，所述UPLC-QTOF/MS的条件包括：
液相色谱条件：色谱柱为Hss T3 C18色谱柱；柱温为30±5℃；以甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱；
质谱条件：ESI+模式，离子源温度为100～150℃，毛细管电压为2.5～3.5kV，锥孔电压为15～30V，除溶剂温度为400～500℃，除溶剂气体流速为800～1000L/h，采用MSEcontinuum采集方式，扫描范围50～1500amu；
优选的，步骤(c)中，所述检测的条件包括：ESI+模式，离子源温度为100～150℃，毛细管电压为2.5～3.5kV，锥孔电压为15～30V，除溶剂温度为400～500℃，除溶剂气体流速为800～1000L/h。
4.根据权利要求1或3所述的鉴别方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序包括：0～25min，流动相A的体积分数由97％变至80％；25～45min，流动相A的体积分数由80％变至50％。
5.根据权利要求1或3所述的鉴别方法，其特征在于，所述流动相A中，甲酸的体积分数为0.05％～0.15％；
和/或，所述梯度洗脱的流速为0.25～0.35mL/min；
和/或，所述色谱柱的规格为2.1mm×100mm，1.8μm。
6.根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，所述制剂的供试品溶液为胰蛋白酶酶解液；各单味药的供试品溶液为各单味药的胰蛋白酶酶解液；
优选的，所述供试品溶液的制备包括：以水作为提取溶剂对制剂或各单味药进行提取处理，收集液体并蒸干，用碳酸氢铵溶液溶解，加入胰蛋白酶溶液，于37±1℃酶解10～14h。
7.根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，步骤(a)中，所述预处理包括：归一化处理、峰对齐处理、峰提取处理和去卷积化处理；
优选的，所述预处理的参数设定为：保留时间范围为1～45min，质谱范围为50～2000。
8.根据权利要求1-3或6-7中任一项所述的鉴别方法，其特征在于，所述制剂还包括地龙；
优选的，所述制剂包括芪蛭通络胶囊。
9.根据权利要求8所述的鉴别方法，其特征在于，所述芪蛭通络胶囊中，水蛭、全蝎、僵蚕和土鳖虫的特征离子包括：m/z 593.84、m/z 449.28、m/z 265.16、m/z 251.35、m/z295.30、m/z 301.13、m/z 249.41、m/z 1105.8、m/z 599.5、m/z 904.6；
优选的，所述芪蛭通络胶囊中，水蛭、全蝎、僵蚕和土鳖虫的特征离子对包括：m/z593.84→249.45；m/z 593.84→910.71；m/z 449.28→233.39；m/z 449.28→374.54；m/z265.16→136.11；m/z 265.16→206.27；m/z251.35→192.30；m/z 251.35→234.30；m/z295.30→236.33；m/z295.30→278.06；m/z 301.13→242.34；m/z 301.13→284.22；m/z249.41→190.27；m/z 249.41→232.42；m/z 1105.8→657.34；m/z1105.8→835.59；m/z599.5→355.44；m/z 599.5→468.22；m/z 904.6→263.38；m/z 904.6→479.24。
10.权利要求1-9任一项所述的鉴别方法在芪蛭通络胶囊的质量控制中的应用。
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