DK173231B1 - Fremgangsmåde til udvinding af glykopeptidiske antibiotika - Google Patents

Description

DK 173231 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til udvinding af glykopeptidiske antibiotika fra vandige opløsninger stammende fra gæringssupper eller processtrømme .

5 Eksempler på glykopeptidiske antibiotika på hvil ke fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes er vancomycin, actaplanin, ristocetin, avoparcin, actino-idin, LL-AM-374, A 477, OA 7653, A 35512 B, A 515668, AAD 216, A 41030, A 47934, A-40926 (europæisk patentan-10 søgning nr. 85112406.5) og de enkelte faktorer, derivater, pseudoaglykoner og aglykoner deraf samt teicopla-nin og teicoplanin-agtige forbindelser.

Adskillelse af biologisk aktive materialer, herunder antibiotika, fra vandige medier ved absorption på 15 en fast matrix er beskrevet i US patentskrift nr.

3531463. I det tilfælde anvendes der ikke-ionogene, ma-kroretikulære, vanduopløselige polyvinylbenzenharpikser.

Udvinding af ristocetin fra den filtrerede gæringssuppe med adsorption til kationbytterharpikser indehol-20 dende sure grupper er beskrevet i britisk patentskrift nr. 813.559. Udvinding og rensning af vancomycin og ac-taplanin-antibiotika ved adsorption til makroporøse, ik-ke-funktionelle styren-divinylbenzen-kopolymerharpikser er beskrevet i US patentskrift nr. 4.440.753.

25 Adskillelse af de enkelte faktorer af antibioti kum A-4696 (actaplanin) fra et renset præparat af A-4696-kompleks ved søjlekromatografering på en polyamidkolonne er beskrevet i US patentskrift nr. 4.322.406.

Fremstilling af krystallinsk A-4696 fra råt A-30 4696-hydroklorid, isoleret fra gæringssuppen, er beskrevet i US patentskrift 4.064.233. I dette tilfælde omfatter isolering af råt A-4696-kompleks fra gæringssuppen flere besværlige operationer såsom adsorption på en kolonne med aktiveret kul, eluering, eliminering af sulfat-35 ioner, koncentrering, opløsning i vand, yderligere absorption på aktiveret kul, yderligere eluering med en salt-syre/acetone-opløsning, koncentrering af eluatet og ud- 2 DK 173231 B1 fældning af råt A-4696-hydroklorid ved tilsætning af metanol.

Det isolerede rå A-4696-hydroklorid opløses derpå i vand og opløsningen føres over en kolonne af polyamid-5 harpiks, der derefter vaskes med en vandstrøm. Den antibiotiske aktivitet udvindes derefter fra effluenten ved inddampning og opløses yderligere i vand/metanol, syrnes med HC1 og udfældes ved tilsætning af acetone for at give det rensede hydroklorid af A-4696, der derpå omkrystal-10 liseres fra vand/ætanol.

Adskillelse af de enkelte faktorer af antibiotikum A-35512 fra en prøve af det isolerede kompleks ved højtydende væskekromatografering (HPLC) under anvendelse af en polyamidharpiks som stationær fase er beskrevet i 15 OS patentskrift nr. 4.122.168. I dette tilfælde udføres den forudgående adskillelse af komplekset fra gæringssuppen ved absorption på en makroporøs nonionisk polystyrenharpiks ("Amberlite"® XAD-4).

Eksempler på udvinding og rensning af glykopep-20 tidiske antibiotika ved affinitetskromatografering på en immobiliseret ligand indeholdende et D-alanyl-D-alanin oligopeptid er beskrevet i de europæiske patentansøgningspublikationer nr. henholdsvis 122.969 og 132.117.

Ifølge den foreliggende opfindelse har det nu 25 vist sig at glykopeptidiske antibiotika hensigtsmæssigt kan isoleres fra vandige opløsninger der indeholder disse stoffer ledsaget af betydelige mængder af adskillige uønskede produkter af forskellige arter og oprindelse ved absorption på visse polyamid-kromatografiharpikser, ef-30 terfulgt af eluering med vandige blandinger.

Opfindelsens genstand er således en fremgangsmåde til udvinding af glykopeptidiske antibiotika fra vandige opløsninger stammende fra gæringssupper eller processtrømme, og fremgangsmåden er ejendommelig ved at man bringer 35 en sådan vandig opløsning i kontakt med en polyamid-kromatograf iharpiks med evne til at absorbere den antibiotiske aktivitet, skiller harpiksen fra den vandige opløs- 3 DK 173231 B1 ning, vasker harpiksen med et vandigt blandings-eluerings-middel og udvinder det glykopeptidiske antibiotikum fra elueringsmidlet.

Typiske vandige opløsninger indeholdende glykopep-5 tidiske antibiotika ledsaget af uønskede produkter er gæringssupper som er filtreret fra mycelierne, eller delvis rensede processtrømme.

Eksempler på de ovennævnte uønskede ledsagestof-fer er farvede urenheder, biprodukter, ikke opbrugte re-10 aktanter fra fremstillingsprocessen og salte og vandopløselige komponenter af gæringsmedier.

Ingen af de ovenfor refererede tilfælde beskriver isolering af glykopeptidiske antibiotiske stoffer fra vandige opløsninger stammende fra gæringssupper eller pro-1 5 cesstrømme ved hjælp af absorption på en polyamidmatrix.

Den ovenfor citerede litteratur viser blot,at kromato-grafering på en polyamidmatrix kan bruges til adskillelse af et glykopeptidisk antibiotikumkompleks i dets enkelte komponenter efter at det er blevet isoleret fra gæ-20 ringssuppen på anden måde. Alle specikke eksempler på isolering af glykopeptidiske antibiotika fra gæringssuppen ved absorption på en fast matrix, der er omtalt i den forannævnte litteratur, går ud på anvendelse af ionbytter-harpikser eller makroporøse nonioniske polystyrénharpik-25 ser.

Ifølge et særligt træk ved opfindelsen kan brugen af polyamidharpikser hensigtsmæssigt finde anvendelse ved udvindings- og rensningstrinene i en fremstillingsproces for teicoplanin og teicoplaninlignende forbindelser.

30 Teicoplanin er et glykopeptidisk antibiotikumkompleks som frembringes af Actinoplanes teichomyceticus nov. sp.

ATCC 31121 og som er virksom mod anaerobe grampositive bakterier. Som det bruges ved biologiske anvendelser består teicoplanin i det væsentlige af faktor A2 (T-A2) led-35 saget af en mindre mængde faktor Α^ (T-A3). Faktor der i de sædvanlige kromatografiske systemer (fx tynd-lagskromatografering og papirkromatografering) opfører 4 DK 173231 B1 sig som et homogent produkt udviser ved undersøgelse med reversfase-højtydende kromatografering fem hovedkomponenter af meget ensartet polaritet, betegnet TA2-1, TA2-2, TA2-3, TA2-4 og TA2-5. Se fx A. Borghi et al., 5 Journal of Antibiotics bind 37, nr. 6, side 615-620, juni 1984. Teicoplanin og dets hovedkomponenter er karakteriseret ved tilstedeværelse af både en primær aminofunk-tion og en karboxylisk funktion.

Med betegnelsen "teicoplanin" som anvendt i nær-10 værende beskrivelse sigtes til produktet som beskrevet ovenfor. Med betegnelsen "teicoplaninlignende forbindelser" sigtes til hver af de enkelte faktorer T-A2 og T-A^, såvel som de fem hovedkomponenter af T-Aj og blandinger deraf i hvilket som helst mængdeforhold som fx dem der 15 fremkommer ved tilsætning af passende prækursorer til gæringsmedier i overensstemmelse med britisk patentansøgning nr. 8.512.795. Betegnelsen "teicoplaninlignende forbindelser" omfatter også teicoplanin-aglykon og pseu-doaglykoner identificeret i den tidligere litteratur som 20 antibiotika L 17046 (europæisk patentansøgning nr.

119.574), L 17054 (europæisk patentansøgningspublikation nr. 119.575) og L 17392 (europæisk patentansøgningspublikation nr. 146.053) såvel som de halvsyntetiske derivater såsom estere og amider af teicoplanin og dets agly-25 kon og pseudoaglykoner (se fx International patentansøgning PCT/EP85/00262, britisk patentansøgning nr. 8522574, og europæisk patentansøgninger nr. 85113810.7 og 86112226.5).

Isolering af teicoplanin fra den filtrerede gæ-30 ringssuppe fra Actinoplanes teichomyceticus nov. sp.

ATCC 31121 som beskrevet i litteraturen (M.R. Bardone et al., Journal of Antibiotics bind 31, nr. 3, side 170-177, marts 1978) indebærer ekstraktion med butanol ved sur pH-værdi efterfulgt af vaske- og koncentreringsoperationer.

35 Denne fremgangsmåde såvel som en hvilken som helst alternativ brug af stærkt sure ionbytterharpikser bevirker nogen nedbrydning af sukkerdelen. Brugen af stærkt basiske 5 DK 173231 B1 ionbytterharpikser begunstigere på den anden side e-pimerisering, der fører til tab af biologisk aktivitet.

Desuden begunstiger den ringe specificitet af de ioniske harpikser ikke fraskillelse af de glykopeptidiske anti-5 biotika fra alle de farvede urenheder og biprodukter som er indeholdt i de vandige opløsninger. Nonioniske makropo-røse harpikser (såvel som ionbytterharpikser) har den u-lempe at de næsten irreversibelt binder betydelige mængder antibiotisk stof, og eluering deraf fordrer betingel-10 ser som ikke er forenelige med produktets kemiske stabilitet. Anvendelse af affinitetskromatografering på immo-biliserede ligander indeholdende D-alanyl-D-alaninoligo-peptider har, omend de er effektive, alvorlige økonomiske ulemper ved arbejde i industriel målestok.

15 Polyamidharpikser som har vist sig nyttige ved den foreliggende fremgangsmåde til fraskillelse af glykopeptidiske antibiotika fra vandige opløsninger, og navnlig af teicoplanin, teicoplaninlignende forbindelser og antibiotikum A 40926, udvælges blandt de polyamid-søj-20 lekromatografiharpikser som i almindelighed identificeres som polykaprolaktam, nyloner (6/6, 6/9, 6/10 og 6/12) og tværbundet polyvinylpyrrolidon. Disse kromatografiske polyamidharpikser karakteriseres i almindelighed ved et * porerumfang (ml/g) der ligger mellem 1 og 5, et over-25 fladeareal* (m2/g) melisn 1 og 100, en tilsyneladende massefylde (g/ml) mellem 0,15 og 0,50, en gennemsnitlig porediameter* (Angstrom) mellem 100 og 3000 og en partikelstørrelsesfordeling ved hvilken mindst 40% af partiklerne har en størrelse under 300 pm.

30 Særlige eksempler på kommercielt tilgængelige po- lyamid-søjlekromatografiharpikser der egner sig til brug ved den foreliggende fremgangsmåde er følgende: polyamidharpikserne "Polyamide-CC 6", "Polyamide-SC 6", "Poly-amide-CC 6,6", Polyamide-CC 6AC" og "Polyamide-SC 6AC" 35 fra Macherey-Nagel & Co. (Vesttyskland), polyvinylpyrro-lidonharpiks PVP-CL fra Aldrich Chemie GmbH & Co., KG (Vesttyskland), polyamidharpiksen PA 400 fra M. Woelm 6 DK 173231 B1 (Vesttyskland). Fx har to af de ovenfornævnte harpikser følgende egenskaber:

Pore- Overflade- Tilsynela- Gennemsnit- Partikel- rumfang*, areal*, dende mas- lig pore- størrelses- 5 Harpiks ml/g m/g sefylde, diameter*, fordeling

g/ml A

Polyamid- 3,4 16,5 0,25 2000 60%< SC 6 350 ym 10 PA 400 2,8 21,5 0,28 1000 100%< 300 ym * Målt med et kviksølvporosimeter model Serie 200 fra C. Erba SpA, Milano, Italien 15

Ved en almen udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen overføres en vandig opløsning stammende fra gæringssuppen med et glykopeptidisk antibiotikum filtreret fra myceliekagen eller en processtrøm stam-20 mende fra denne suppe eller fra eft kemisk modificeringsreaktion på et glykopeptidisk antibiotikum (navnlig tei-coplanin, en teicoplaninlignende forbindelse eller antibiotikum A 40926) på en polyamidharpikskolonne med en strømningshastighed for væsken gennem kolonnen, der kan 25 være fra ca. 20 ml/cm i timen til ca. 400 ml/cm . Når der ønskes en høj strømningshastighed påføres den vandige opløsning på kolonnen under vakuum og under sugning fra bunden eller undertryk, eller under anvendelse af en polyamidharpiks med større partikelstørrelse. I sidstnævn-30 te tilfælde iagttages der en svag nedgang i harpiksens adsorptionskapaticitet.

Polyamidharpiksen kan også sættes til den vandige opløsning indeholdende den antibiotiske- aktivitet og blandes grundigt dermed i en forudbestemt tidsperio-35 de som kan variere fra en halv time til seks timer hvorpå den opbrugte opløsning fjernes.

Gæringssuppen eller den processtrøm fra hvilken 7 DK 173231 B1 den vandige opløsning indeholdende den antibiotiske aktivitet udvindes, fremstilles ved standardprocesser i forsøgsmålestok eller industriel målestok og indbefatter også de tilfælde hvor der foretages forskellige til-5 sætninger af passende prækursorer under gæringsprocessen for selektivt at forøge andelen af de enkelte hovedkomponenter af et glykopeptidisk antibiotikumkompleks, se fx britisk patentansøgning nr. 8512795.

pH-værdien af suppen eller den vandige opløsning 10 som bringes i kontakt med polyamidharpiksen, kan være mellem 4 og 10, fortrinsvis mellem 5 og 8. Den opløsning som bringes i kontakt dermed kan indeholde varierende mængder af vandblandbare opløsninger for at forhindre udfældning af faste materialer som ville kunne tilstoppe kolon-15 nen.

Koncentrationen af den antibiotiske aktivitet i den vandige opløsning, der underkastes udvindingsbehandlingen ifølge den foreliggende opfindelse, kan variere indenfor vide grænser. Under de praktiske betingelser 20 der anvendes for tiden ved operationer i halvteknisk eller industriel målestok er den i almindelighed fra 50 til 20000 ppm (vægt/rumfang, dvs. forholdet mellem fast stof og væske som mellem gram og ml).

Når styrken af udgangssuppen ikke er for lav mu-25 liggør en enkelt passage gennem polyamidharpiksen at en tilfredsstillende renhedsgrad opnås.

Den mængde polyamidharpiks der bruges pr. vægtenhed antibiotisk aktivitet som er til stede i den vandige opløsning, afhænger i almindelighed af den anvendte har-30 piks' absorptionseffektivitét. Absorptionseffektiviteten af hver harpiks kan bestemmes ved forudgående forsøg ved at man succesivt tilsætter flere delportioner af en prøve af en vandig opløsning indeholdende det glykopeptidiske antibiotikum i en vis koncentration gennem en kolonne pakket 35 med et givet rumfang af polyamidharpiksen.

Portionerne af eluatet fra kolonnen undersøges ved HPLC for at bestemme indholdet af det glykopeptidiske 8 DK 173231 B1 antibiotikum. Når HPLC-analysen viser at eluatet af en given portion af forsøgsprøven indeholder antibiotisk aktivitet, tages dette som tegn på at polyamidharpiksen er blevet mættet, og mængden af absorberet antibiotikum be-5 regnes ud fra det samlede rumfang af eluatet, som ikke udviste nogen antibiotisk aktivitet.

Fortrinsvis er det rumfang polyamid, der bruges i en udvindingsproces i halvteknisk eller industriel målestok i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, 10 større end det mætningsrumfang som kan bestemmes på den ovenfor beskrevne måde.

For tiden er mængdeforholdet mellem polyamid-kromatografiharpiksen og den glykopeptidiske antibiotiske aktivitet som skal udvindes fra den vandige opløs-15 ning, sædvanligvis mellem ca. 50 og 250, fortrinsvis mellem 60 og 200 liter harpiks pr. kg antibiotisk aktivitet som er til stede i opløsningen.

Polyamidharpiks-elueringen udføres i almindelighed ved stuetemperatur under tyngdekraftens indvirkning 20 eller under sugning eller påført tryk ved anvendelse som elueringsmiddel af en vandig opløsningsmiddelblanding, fortrinsvis en opløsningsmiddelblanding af vand og et eller flere vandblandbare organiske opløsningsmidler, fx en lavt kogende alkanol, acetone, metylætylketon, tetra-25 hydrofuran, dioxan og/eller acetonitril.

De mest foretrukne elueringsmiddelblandinger er vandige opløsninger indeholdende vand og en lavt kogende alkanol (fx metanol) eller acetone, i et rumfangsforhold fra omkring 1:9 til 9:1, hvortil der er sat en passende 30 mængde af en syre eller en base scm er opløselig i nævnte blanding for at opretholde eluatets pH-værdi i området mellem 3 og 11. Der kan også bruges pufringsopløsninger for at holde pH-værdien på det ønskede niveau.

Egnede tilsætninger til dette formål er fx mine-35 ralske syrer, myresyre, eddikesyre, fortyndede vandige alkalimetalhydroxider såsom natriumhydroxid, kaliumhydroxid, natriumbikarbonat, natriumkarbonat, ammoniak, bis- 9 DK 173231 B1 (2-hydroxyætylamin), natriumhydrogenfosfatpuffere og lignende forbindelser.

Ved en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan den første portion af elue-5 ringsmiddelblandingen have en lavere pH-værdi end den sidste portion, og pH-værdien sættes gradvist op under elueringen, hvorved det bliver muligt at eliminere de mest sure urenheder med eluatets første fraktioner. I dette tilfælde kan den første elueringsportion fx indeholde 10 vandigt natriumbikarbonat som base, mens de mellemliggende portioner kan indeholde natriumkarbonat og de sidste portioner indeholde natriumhydroxid. Det er imidlertid også muligt at man efter eliminering at de mest sure urenheder gennemfører elueringen af det antibiotiske ved 15 en sur pH-værdi ved anvendelse af en af de ovennævnte syrer. Lignende virkninger kan også opnås ved anvendelse af gradienter af en gradient af vandblandbare opløsningsmidler eller stigende koncentrationer af pufringssalte.

20 Eluateme opsamles i flere fraktioner som neutrali seres til pH 7 og analyseres ved HPLC. De fraktioner som indeholder glykopeptidisk aktivitet forenes og koncentreres under vakuum. Det glykopeptidiske antibiotikum udvindes fra den koncentrerede vandige opløsning ved sæd-25 vanlige fremgangsmåder. Fx kan det udfældes fra den koncentrerede vandige opløsning ved tilsætning af et vandblandbart organisk opløsningsmiddel hvori det glykopeptidiske antibiotikum har lav opløselighed, fx acetone. En anden udvindingsproces, der ikke behøver tilsætning af vand-30 blandbaré'opløsningsmidler er baseret på filtrering af det udfældede antibiotikum ved en pH-værdi nær dets iso-elektriske punkt fra den koncentrerede opløsning efter henstående i nogle få timer ved lav temperatur, fx 5°C.

I nogle tilfælde, navnlig i tilfælde hvor eluater-35 ne indeholder en uønsket mængde uorganiske salte, der gør det ved koncentrering uvundne produkt lidet egnet til direkte anvendelse i farmaceutisk praksis, foretræk- DK 173231 B1 το kes det at kombinere en hvilken som helst yderligere koncentrering af eluatet med en afsaltningsproces. Denne operation kan udføres samtidig med at man udnytter en ultrafiltreringsteknik (fx ved at anvende membraner fra 5 Filmtec Co. med en afskæring på 500-1000 Dalton) eller ved at hælde eluatet gennem en ikke-ionogen makroreti-kulær tværbunden harpiks (fx "Amberlite"^ XAD-7 eller andre harpikser af den type der er beskrevet i US patentskrifterne nr. 3.531.463, 3.663.467 og britisk patent-10 skrift nr. 1.581.671), hvorved det glykopeptidiske antibiotikum adsorberes fra den vandige blanding og derefter elueres med en blanding af acetone og vand.

De glykopeptidiske antibiotika der udvindes ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde har meget tilfredssti1-15 lende renhedsgrad i sammenligning med den der opnås ved anvendelse af andre, hidtil kendte udvindingsprocesser eller ved anvendelse af harpikser af andre typer som fx makroporøse harpikser. Udvindingsudbyttet fra den filtrerede gæringssuppe eller fra processtrømme med frem-20 gangsmåden ifølge den forliggende opfindelse er også meget gunstige i sammenligning med dem der kan opnås med de forannævnte, kendte fremgangsmåder.

Når fx fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes på teicoplanin, kan antibiotikumproduktet fra kolonnen 25 allerede udvise en renhedsgrad som er meget nær ved den standard som er ansat for stoffets anvendelse i farmaceutisk praksis. I praksis behøves et sådant produkt til anvendelse i en farmaceutisk injicerbar dosisform kun at underkastes en yderligere behandling til eliminering af 30 pyrogene stoffer, fx ved at man behandler opløsningen deraf i vand eller en blanding af vand og et vandblandbart organisk opløsningsmiddel med aktiveret kul.

Når de omhandlede polyamidharpikser er brugt en gang til udvinding af et glykopeptidisk antibiotikum, 35 kan de bruges i mange efterfølgende absorptions-desorp-tionskredsløb. Før genanvendelse af polyamidharpiksen gennemføres der sædvanligvis vask med vand med mindst 11 DK 173231 B1 5 lejerumfang demineraliseret vand. Efter tre eller fire fuldstændige kredsløb foretrækkes det at vaske harpiksen med et fortyndet hydroxid (pH 12) indtil en pH-værdi på 12 er konstant, hvorpå harpiksen vaskes på ny med demi-5 neraliserede vand til neutralitet.

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

I eksemplerne er alle HPLC-kontroller udført ved hjælp af et Hewlett Packard-apparat model 1084 udstyret 10 med en UV (254 mp) detektor og en reversfase C 18 forpakket kolonne ("Erbasil"® 5, 250 x 4 mm).

De mobile faser er: (A) 0,02M vandigt Na^PO^/ CH^CN 95:5 (rumfang), (B) 0,02M vandigt NaH2P04/ CH^CN 25:75 (rumfang). Gradientelueringen var fra 8% B 15 til 55% B i 40 minutter. Strømningshastigheden 1,5 ml/ minut.

Eksempel 1 20 170 1 teicoplanin-gæringssuppe som er befriet for myceliekage førtes ved pH 8 i løbet af 10 timer gennem en 15x100 cm glaskolonne fyldt med 10,5 1 polyamidharpiks ("Polyamide-CC 6" til søjlekromatografering, partikelstørrelse 50-160 pm, tilsyneladende massefylde 0,20 g/ml, 25 Macherey Nagel, Vesttyskland) og holdtes under vakuum med sugning fra bunden. Den gennemsnitlige strømnings-hastighed var 100 ml/cm h.

Den således udtømte suppe (170 1) indeholdt mindre end 5% af den teicoplanin-aktivitet som suppen inde-30 holdt fra begyndelsen og mére end 80% af alle de mere polære komponenter i suppen (uønskede faste stoffer og farvede organiske materialer). Efter vask med 50 1 demineraliseret vand udførtes eluering med harpiksen med 50 1 af en blanding metanol/vand 9:1 (rumfang) indeholdende 35 en gradient fra 0,3 til 1,0 g/1 natriumkarbonat.

Eluatet opsamledes i fem fraktioner på hver 10 1.

Hver fraktion neutraliseredes til pH 7 med vandig mine- 12 DK 173231 B1 ralsyre og analyseredes ved HPLC-analyse. Kun to fraktioner (20 1) af eluatet forenedes og den resulterende opløsning (indeholdende mere end 90% af den eluerede aktivitet) koncentreredes under nedsat tryk ved 45-50°C 5 til 3,3 1 vandig rest-suspension.

Der sattes 13,2 1 acetone til den ovennævnte koncentrerede teicoplanin-suspension under omrøring. Bundfaldet henstod i 3 timer ved stuetemperatur og den klare ovenstående acetone dekanteredes.

10 Det faste stof fraskiltes ved filtrering og kagen opslammedes med acetone ved stuetemperatur. Produktet filtreredes på ny og tørredes natten over under vakuum ved stuetemperatur.

Teicoplanin, der i henhold til HPLC var 85,7% 15 rent, vandtes med et udvindingsudbytte på 81,9%, regnet på den mikrobiologiske aktivitet der fra begyndelsen indeholdtes i den gærede suppe (vand- og opløsningsmiddelindhold: 11,5 vægt%; uorganisk rest: 2,8 vægt%).

Det 16,5 1 moderlud indeholdt ca. 2% af udgangs-20 teicoplaninmængden.

Absorptionseffektiviteten af harpiksen bestemtes præliminært ved følgende fremgangsmåde.

360 ml af en koncentreret opløsning indeholdende 3,1 g/1 råt teicoplanin sattes i portioner på 50 ml til 25 en kolonne pakket med 15 g (60 ml) våd "Polyamide-CC 6" harpiks. Hver portion på 50 ml af eluatet analyseredes ved HPLC for at bestemme teicoplaninindholdet. 250 ml af opløsningen førtes gennem kolonnen og der iagttoges ikke noget teicoplanin i det eluerede opløsningsmiddel. Den 30 efterfølgende portion indeholdt 0,7 g/ml aktivitet. Det te antoges at vise at 15 g harpiks var blevet mættet med 0,9 g teicoplanin. Denne værdi svarer til 67 1 "Polyamide-CC 6" harpiks pr. kg teicoplanin.

35 13 DK 173231 B1

Eksempel 2 Følgende forsøg udførtes på filtrerede gæringssupper vundet ved tilsætning til gæringsmediet af passende prækursorer for de enkelte komponenter af teicoplanin 5 faktor A2 ifølge britisk patentansøgning nr. 8.512.795.

"Polyamide-CC 6” harpiks af samme type som anvendt i eksempel 1 brugtes som adsorberende matrix. 60 1 gæret suppe som var frigjort for myceliekagen førtes over på en kolonne indeholdende 8 1 af harpiksen pr. kg aktivi- 10 tet. Efter vask med demineraliseret vand blev aktiviteten elimineret og udfældet ved den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 1. Teicoplanin, der ifølge HPLC var 86% rent, udvandtes i et udbytte på 77% (vand- og opløsningsmiddelindhold 9,1%; uorganiske 15 rester 4,7%).

Eksempel 3 300 1 filtreret gæringssuppe vundet ved tilsæt-2Q ning af L-valin til gæringsmedium i overensstemmelse med britisk patentansøgning nr. 8.512.795 førtes ved pH 6 gennem en 19 x 100 cm glaskolonne indeholdende 25 1 "Po-lyamide-SC 6" (partikelstørrelse og andre egenskaber som beskrevet foran). Den opbrugte suppe indeholdt ikke 2^ noget teicoplanin. Efter vask af kolonnen med 50 1 demineraliseret vand vaskedes harpiksen med 50 1 af en vandig opløsning af 0,05M natriumacetat (pH 8). Mere end 90% af de faste urenheder som var til stede i udgangssuppen viste sig at blive elimineret. Derefter blev det 2q antibiotiske stof elueret med 50 1 af en blanding af acetone/vand 40:60, reguleret til pH 4 med eddikesyre.

De nyttige fraktioner indeholdende 85% af udgangs-antibiotikummet forenedes og androg 30 1. Ved koncentrering under nedsat tryk ved pH 6,5-7 nedsattes opløsningens 25 rumfang til ca. 12 1. Ved tilsætning af vandig saltsyre nedsattes pH-værdien igen, nu til 3,5-4, og det udfældede hvide fast stof opsamledes efter henstående i 3 timer 14 DK 173231 B1 ved +5°C. Kagen vaskedes med acetone og filtreredes på ny. Efter tørring vandtes teicoplanin i et udvindingsudbytte på 74% og udviste ved HPLC en renhed på 83% (vand- og opløsningsmiddelindhold 14,1%, uorganiske re-5 ster 2,1%).

Eksempel 4 450 g råt deglukoteicoplanin, vundet ifølge et 1 g af de eksempler der findes i EPA-publikation nr.

146.053, opløstes i 7 1 vand ved pH 8 og opløsningen førtes gennem en glaskolonne (17 x 100 cm) indeholdende 26 1 "Polyamide-PA 400" (M. Woelm). Se ovennævnte beskrivelse med hensyn til partikelstørrelse og andre egenska-15 ber. Efter vask med 50 1 demineraliseret vand elueredes kolonnen med 250 1 af en blanding metanol/vand 9:1 indeholdende 0,035% v/r Na^O^.

De nyttige fraktioner, 100 1, forenedes og indeholdt 85% af det tilførte deglukoteicoplanin. Opløsnin-2Q gen koncentreredes derefter under nedsat tryk ved pH 6,5 indtil et restrumfang på 9 1. Efter afkøling filtreredes suspensionen og filterkagen vaskedes med acetone.

Efter tørring vandtes der 211 g deglukoteicoplanin med en renhed ifølge HPLC på 83% (indhold af vand og opløs-25 ningmiddel 12,2%) i et udbytte på 79%, regnet på aktiviteten af udgangsmaterialet i henhold til HPLC.

Eksempel 5 96 g råt antibiotikum L 17046, vundet som beskre-vet i EPA-publikation nr. 119.574 (HPLC-bestemmelse 68%) opløstes i 1 1 af en blanding vand/metanol 95:5 (rumfang) ved pH 8,2 og opløsningen førtes gennem en glaskolonne (10 x 100 cm) indeholdende 5 1 "Polyamide-SC 6".

Efter vask med 5 1 demineraliseret vand vaskedes kolonnen 35 med 5 1 af en blanding vand/metanol 1:1 (rumfang). Elue-ringen udførtes med en blanding af metanol/vand 9:1 (rumfang) indeholdende 0,03% v/r Na2CO.j. De nyttige fraktio- 15 DK 173231 B1 ner indeholdende 53,9 g L 17046 (83% af udgangsaktivite-ten ifølge HPLC) forenedes. Ved at gå frem på samme måde som i eksempel 4 vandtes der 55,5 g L 17046 med en renhed ifølge HPLC på 89% (vandindhold 11%).

5

Eksempel 6

En gæret suppe indeholdende antibiotikum A 40926 kompleks, vundet som beskrevet i EPA-ansøgning nr.

10 85112406.5, frigjort for myceliemasse ved filtrering ved en pH-værdi mellem 8,5 og 10,5, syrnedes til pH 3 med svovlsyre.

Det udfældede rå materiale opsamledes ved filtrering og opløstes derpå i vand ved pH 7 og førtes ind i 15 en glaskolonne indeholdnde "Polyamide-SC 6AC" fra Mache-rey-Nagel & Co. (120 1 harpiks pr. kg antibiotisk aktivitet). Efter vask med demineraliseret vand gennemførtes der en vask med 0,2M fosfatpuffer pH 8 for at fjerne yderligere farvet materiale. I stedet kan man tilsæt-20 te små mængder detergenter (fx natriumlaurylsulfat) til vand med samme formål. Søjlens indhold elueredes derefter med 1%s ammoniakvand indeholdende ca. 75% af den antibiotiske udgangsaktivitet. Den vandige opløsning bragtes til pH 3,5 ved tilsætning af 10% v/r vandig HC1 og 25 afkøledes derefter til 5°C i nogle få timer. Det udfældede produkt fraskiltes ved filtrering, vaskedes grundigt med isafkølet vand og tørredes derefter; der vandtes derved antibiotisk-kompleks A 40926 som var i det væsentlige rent i henhold til HPLC.

30 Ved et yderligere forsøg, hvor den gærede fil trerede suppe førtes direkte til kolonnen, vandtes der efter pH-regulering til 7 et A 40926 som var 70% rent (HPLC). En anden passage på "Polyamide-SC 6AC" eller et adsorptions-desorptions-kredsløb på en affinitetshar-35 piks gav et, i henhold til HPLC, rent materiale.

63 16 DK 173231 B1

Eksempel 7 13,5 råt antibiotikum N -[3-(dimetylaminopropyl)]-tei-coplanin A2-amidacetat vundet som beskrevet i eksempel 1 i europæisk patentansøgning nr. 86112226.5, opløstes 5 i 600 ml vand ved pH 6,5 og opløsningen førtes gennem en glaskolonne indeholdende 250 g "Polyamide-SC 6" (0,ΙΟ, 3 mm). Efter vask med 500 ml vand ved pH 6,5 gennemførtes der eluering med en blanding metanol/vand 3:7 (rumfang) ved samme pH-værdi.

10 De nyttige fraktioner, ca. 1500 ml, forenedes og indeholdt ca. 75% af det tilførte antibiotikum. Efter afdestillering af metanol under vakuum bragtes den tilbageværende vandige opløsnings pH til 8,5 og det udfældede faste stof opsamledes efter afkøling, vaskedes med 15 vand og tørredes under vakuum. Der vandtes 5,8 g 85% 63 HPLC-rent N -[3-(dimetylaminopropyl)]-teicoplanin i et totalt udbytte på 70%.

20 25 30 35

Claims (11)

1. Fremgangsmåde til udvinding af glykopeptidiske antibiotika fra vandige opløsninger stammende fra gæringssupper eller processtrømme, kendetegnet 5 ved at man bringer den vandige opløsning i kontakt med en polyamid-søjlekromatografiharpiks med evne til at adsorbere nævnte antibiotiske aktivitet, hvorpå man skiller harpiksen fra den vandige opløsning, vasker harpiksen med et vandigt blandings-elueringsmiddel og udvin-10 der det glykopeptidiske antibiotikum fra elueringsmid- let.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at polyamid-søjlekromatografiharpiksen er udvalgt blandt polykaprolaktam, nylon 6/6, nylon 6/9, nylon 15 6/10, nylon 6/12 og tværbundet polyvinylpyrrolidon.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved at der anvendes en polyamid-søjlekromatografiharpiks som har et porerumfang (bestemt ved hjælp af et kvik-sølvporosimeter) mellem 1 og 5 ml/g, et overfladeareal 20 (bestemt ved hjælp af en kviksølvporosimeter) mellem 1 og 100 m /g, en tilsyneladende massefylde mellem 0,15 og 0,50 g/ml, en gennemsnitlige porediameter, bestemt ved hjælp af et kviksølvporosimeter, mellem 100 og 3000 A og en partikelstørrelsesfordeling hvor mindst 40% af 25 partiklerne har en størrelse på under 300 ym.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at harpiksen er udvalgt blandt "Polyamide-CC 6", "Polyamide-SC 6", "Polyamide-CC 6,6", "Polyamide-CC 6AC", "Polyamide-SC 6AC", "Polyvinylpyrrolidone PVP-CL" og 30 "Polyamide PA 400".

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved at man indstiller den filtrerede gæringssuppes eller processtrøms' pH til en værdi mellem 4 og 10, fortrinsvis mellem 5 og 8. 35 DK 173231 B1

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de * foregående krav, kendetegnet ved at forholdet mellem polyamid-kromatografiharpiksen og den glykopepti-diske antibiotiske aktivitet indstilles til mellem ca. 5 50 og ca. 250, fortrinsvis mellem 60 og ca. 200 1 har piks pr. kg antibiotisk aktivitet indeholdt i opløsningen .

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet ved elueringen fra poly- 10 amid-søjlekromatografiharpiksen udføres ved at man som elueringsmiddel bruger en pufret vandig opløsning eller en vandig opløsningsmiddelblanding, fortrinsvis en opløsningsmiddelblanding af vand og et eller flere vandblandbare organiske opløsningsmidler udvalgt blandt lav-15 kogende alkanoler, acetone, metylætylketon, tetrahydro-furan, dioxan og acetonitril.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved at elueringsblandingen er en vandig blanding indeholdende vand og en lavt kogende alkanol eller acetone 20. et mængdeforhold mellem ca. 1:9 og ca. 9:1 (rumfang) og ved,at eluatets pH-værdi holdes i området mellem 3 og 11.

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved at det glyko- 25 peptidiske antibiotikum er udvalgt blandt vancomycin, actaplanin, ristocetin, avoparcin, actinoidin, LL-AM-374, A 477, OA 7653, A 35512 B, A 515668, AAD 216, A 41030, A 47934, A-40926, de enkelte faktorer, derivater, pseudo-aglykoner og aglykoner deraf, teicoplanin og teicoplanin-30 lignende forbindelser.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved at det glykopeptidiske antibiotikum er udvalgt blandt teicoplanin, A-40926 og teicoplaninlignende forbindelser. 35 DK 173231 B1

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved at den teicoplaninlignende forbindelse er en af følgende forbindelser: deglukoteicoplanin, antibiotikum L-17046, teicoplanin faktor T-A2, en af de 5 fem hovedkomponenter af faktor T-A^, et teicoplanin- amid og blandinger deraf i et hvilket som helst mængdeforhold. 10 15 20 25 30 35