JPS62250000A - 糖ペプチド抗生物質の回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、発酵ブロス（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂ
ｒｏｔｈｓ）又はプロセス流（ｐｒｏｅｅ！１ｓＳｊｒ
ｅｌｌｌｆｉ８）から得られる水性溶液からの糖ペプチ
ド抗生物質（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｉｃ　ａｎｔｉｂ
ｉｏｔｉｃｓ）の回収に関する。

本発明の方法を適用することができる糖ペプチド抗生物
質の例としては下記のものが挙げられる：バンコマイシ
ン（ｖａｎｃｏｍｙｃ　ｉｎ）、アクタプラニン（ａｃ
ｔａｐｌａｎｉｎ）、リストセチン（ｒｉｓｔｏｃｅｔ
ｉｎ）、アボパルシン（ａｖｏｐａｒｃ　ｉｎ）、アク
ヂノイジン（ａｃｔｉｎ。

１ｄｉｎ）、ＬＬ−ＡＭ−３７４、Ａ　４７７．０Ａ７
６５３、Ａ　　３５５１．２　　Ｂ、Ａ　　５１５６６
８、ＡＡＤ　　２１６、Ａ　　４１０３０、Ａ４７９３
４、Ａ　　４０９２６（ヨーロッパ特許出願第８５１１
２４０６１２４．０６．５号）、それらの個々の因子、
誘導体及び擬アグリコン類（ｐｓｃｕｄｏ−ｎｇｌｙｃ
ｏｎｅＳ）及びアグリコン類、ティコプラニン（ｔｃｉ
ｃｏｐｌａｎｉｎ）及びデイコプラニン類似化合％ｌ　
（ｔ、ｅｉｃｏｐｌａｎｉｎ−１ｉｋｅ　ｃｏｍｐｏｕ
ｎｄｓ）。

固体マトリックス上への吸収により水性培地から抗生物
質を含む生物学的に活性な物質を分離することは、米国
特許第３５３１４．６３号に記載されている。この場合
には、非イオン発生性（ｎｏｎ−ｉｏｎｏｇｅｎｉｃ）
の、巨大網目の、水に不溶性のポリビニルベンゼン樹脂
が使用されている。

酸性基を含有する陽イオン交換樹脂士への吸着による、
ろ過した発酵ブロスからのリス■・セチンの回収は、英
国特許第８１．３５５９号に記載されている。マクロポ
ーラスな非官能性スチレン−ジビニルベンゼンコポリマ
ー樹脂上への吸着による、バンコマイシン及びアクタプ
ラニン抗生物質の回収及び精製は米国特許第４４４０７
５３号に記載されている。

ポリアミドカラム」二のカラムクロマトグラフィーによ
り、Ａ−４６９６複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）の精製した
調製物から抗生物質Ａ−４６９６（アクタプラニン）の
単一因子（ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒｓ）を分離する
ことは米国特許第４３２２／１０６号に記載されている
。

発酵ブロスから単離された粗Ａ　−４６９６塩酸塩から
の結晶性Ａ−４６９６の調製は米国特許第１１０６４２
３３号に記載されている。この場合に、発酵ブロスから
の粗Ａ−４６９６複合体の単離には、幾つかの厄介な操
作、例えば、炭素カラム上への吸収、溶出、硫酸イオン
の除去、濃縮、水への溶解、更に活性炭士、への吸収、
更に塩酸／アセトン溶液による溶出、溶出液の濃縮、メ
タノールの添加による粗Ａ−４６９６塩酸塩の沈でんが
伴う。

次いで、単離された粗Ａ−４６９６塩酸塩を水に溶解し
、溶液をポリアミド樹脂カラムに通し、次いでポリアミ
ド樹脂カラムを水流で洗浄する。

次いで抗生物質活性を蒸発により流出液から回収し、更
に水／メタノール中に溶解し、ＨＣＩで酸性にし、アセ
Ｉ・ンの添加により沈でんさせて精製したＡ−４６９６
の塩酸塩を得、次いでこれを水／エタノールから再結晶
させる。

固定相としてポリアミド樹脂を使用する高速液体クロマ
トグラフィーにより、単離された複合体の試料から抗生
物質Ａ−３５５１２の単一因子を分離することは、米国
特許第４１２２１６８号に記載されている。この場合に
、発酵ブロスからの複合体の先の分能は、マクロポーラ
スな非イオン性ポリスチレン樹脂（アンバーライトＸＡ
Ｄ−４）上への吸収により行なわれた。

Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンオリゴペプチドを含有する
固定化されたリガンド上のアフィニティークロマトグラ
フィーによる糖ペプチド抗生物質の回収及び精製の例は
、ヨーロッパ特許出願公開第１２２９６９号及び第１３
２１１７号にそれぞれ記載されている。

本発明に従えば、成る種のポリアミドクロマトグラフィ
ー樹脂上に吸収させ、次いで水性混合物で溶出すること
により、種類及び起源が異なる相当な量の幾つかの所望
されない生成物を同伴した糖ペプチド抗生物質を含有す
る水性溶液から、糖ペプチド抗生物質を好適に単離する
ことができることが見出された。

７一 本発明の目的は、実際には、発酵ブロス又はプロセス流
から得られる水性溶液から糖ペプチド抗生物質を回収す
る方法において、該水性溶液を、前記抗生物質活性を吸
収することができるポリアミドクロマトグラフィー樹脂
と接触させ、該樹脂を該水性溶液から分離し、該樹脂を
水性混合物溶出剤で洗浄し、該溶出剤から糖ペプチド抗
生物質を回収することを特徴とする方法である。

所望されない生成物を同伴した糖ペプチド抗生物質を含
有する典型的な水性溶液は、菌糸体（ｍｙｃｅｌｉａ）
からろ過された発酵ブロス又は部分的に精製されたプロ
セス流である。

上記の所望されない同伴生成物の例は、例えば、製造プ
ロセスの着色した不純物、副生物、使い尽くされていな
い反応成分、並びに発酵培地の塩及び水溶性成分である
。

前記し、た場合のいずれも、ポリアミドマトリックス上
での吸収によって、発酵ブロス又はプロセス流から得ら
れる水性溶液から糖ペプチド抗生物質を単離することを
述べていない。前記した文献は、糖ペプチド抗生物質複
合物７）（他の手段により発酵ブロスから単離されて後
、糖ペプチド抗生物質複合物をその単一成分に分肉「す
るために、ポリアミドマトリックス上でのクロマトグラ
フィーを使用することができることのみを教示している
。

前記文献に記載された固体マトリックス上の吸収による
、発酵ブロスからの糖ペプチド抗生物質の単離の特定の
例は、すべて、イオン交換樹脂又はマクロポーラスな非
イオン性ポリスチレン樹脂の使用に関するものである。

本発明の特定の観点に従えば、ティコプラニン及びティ
コプラニン類似化合物の製造方法の回収及び精製工程に
、ポリアミド樹脂の好適な用途が見出だされる。ティコ
プラニンは、アクヂノプラ色ミ　　−イコマイセ　クス
　り、ニスビニ。

Ａ　Ｔ　ＣＣ３１１２１（Ａｃ、ｉｎｎｅｓｔｅｉｃｏ
ｍｙｃｅｔ籾リー厖α謬釦−１＾ＴＣＣ３す１２１）に
より生産された糖ペプチド抗生物質複合物であり、そし
てダラム陽性菌に対して活性である。その生物学的用途
に使用されるティコプラニンは、本質的に、少址の因子
Ａ３（Ｔ−Ａ３）を伴う因子Ａ２（Ｔ−Ａ２”）から成
る。普通のクロマトグラフィー系（例えば、薄層クロマ
トグラフィー及びペーパークロマトグラフィー）におい
ては、均一生成物として挙動する因子Ａ２は、逆相高性
能クロマＩ・グラフィーにより検査すると、ＴＡ２−ｌ
、ＴＡ２−２、’Ｔ”Ａ２−３、Ｔ　Ａ　２−　／ｌ、
及びＴΔ２−５と命名された非常に類似した極性を持っ
た５種の主成分を示す。

例えば、ニー、ボルギ等、、（＾、Ｂｏｒｇｈｉ　ｃｔ
　ａｌ）、ジ、Ｖ−ナル　オブ　アンチバイオチックス
、第３７巻、第６号、６１５−６２０頁、１９８４年６
月号、（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔ、１ｂｉｏｔｉ
ｃｓ、Ｖｏｌ、　３７、Ｎｏ、６、ｐｐ、　６１５−６
２０、Ｊｕｎｅ　１９８４）参照。ティコプラニン及び
その主成分は一級アミノ及びカルボキシル基の存在によ
り特徴イ］けられる。

本明細書において使用した゛ティコプラニン′”という
用語は、前記の如き生成物を意味することを意図する。

“ティコプラニン類似化合物”という用語は、単一因子
Ｔ−Ａ２及びＴ　　Ａ３の各々、Ｔ−Ａ２の５種の主成
分の各々、及び任意の割合のそれらの混合物、例えば、
英国特許出願第８５１２７９５号に従って発酵培地に適
当な前駆体を添加することにより得られる混合物、を意
味することを意図する。用語゛デイコプラニン類似化合
物パには抗生物質Ｌ−１７０４６（ヨーロッパ特許出願
第１１９５７４号）、Ｌ、−１７０５４（ヨーロッパ特
許出願第１１９５７５号）及びＬ　　１７３９２　（ヨ
ーロッパ特許出願第１．　／１６０５３−号）として先
行文献において同定されたティコプラニンアグリコン及
び擬アクリコン類並びにナイロン。

ラニン及びそのアグリコン及び擬アグリコンのエステル
及びアミドの如き、半合成誘導体（例えは、国際出願、
ＰＣＴ／ＥＰ８５１００２６２、英国特許出願第８５２
２５７４号、ヨー口・ソノ＜特許出願第８５１１３８１
０．７号及び第８６１１２２２６．５号（又は特願昭６
１−２１　／ｌ　１８５　）参照）も包含される。

先行文献［エム、アール、バートン等、、ジャーナル　
オブ　ア〉′チバイオチツクス、第３１巻、第３号、１
７０−１７７頁、１９７８年３月号、（Ｍ、Ｒ，Ｂａｒ
ｄｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　Ａ
ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ。

Ｖｏｌ、　３ｌ、Ｎｏ、３、ｐｐ、　１７０−１７７、
Ｎａｒｃｌ＋　　１９７８］に記載の、アクチノプラネ
ス　テーイージヱイー±１ノームームー７．エスピー−
、ＡＴＣＣ３］　１２１　（Ａｅｌ、１ｎｏｐｌａｎｅ
ｓ　ｔｅｉｃｏｍ　ｃｅｔｉｃｕｓ　ｎｏｖ、９−、　
ＡＴＣＣ３］１２１）（’）ろ過された発酵ブロスから
のティコプラニンの単離には、酸性ｐ　Ｈでのブタノー
ルによる抽出、それに続く洗浄及び濃縮操作が伴う。こ
の方法及びそれに替わる強酸性イオン交換樹脂の使用は
、糖部分の幾分の劣化を引き起こす。反対に、強塩基性
イオン交換樹脂の使用は、エビ化を促進し、これは生物
学的活性の損失に導く。イオン性樹脂の不十分な特異性
は、水性溶液中に含まれる着色した不純物及び副生物の
すべてからの糖ペプチド抗生物質の分離を有利にしない
。

非イオン性マクロポーラス樹脂（及びイオン交換樹脂）
は、相当な址の抗生物質を殆ど不可避的に結合するとい
う欠点を持っており、従って、その溶出には、生成物の
化学的安定性に適合しない条件を必要とする。Ｄ−アラ
ニル−Ｄ−アラニンオリゴペプチドを含有する固定化さ
れたりカント上のアフィニティークロマトグラフィーの
使用は、有効ではあるが、工業的規模の操作には重大な
経済的欠点が伴う。

水性溶液からの糖ペプチド抗生物質の分離方法、特に、
ティコプラニン、ティコプラニン類似化合物及び抗生物
質Ａ、−４０９２６の分離方法において有用であること
が見出だされたポリアミド樹脂は、一般に、ポリカプロ
ラクタム、ナイロン（６／６．６／９．６／１０、及び
６／１２）及び架橋したポリビニルピロリドンと呼ばれ
るポリアミドカラムクロマトグラフィー樹脂から選ばれ
る。

上記クロマ１〜グラフイーポリアミド樹脂は、一般に、
１乃至５（ｍｆ／ｇ＞の細孔容積（＊）（ｐｏｒｅ　Ｖ
Ｏ１ｕ＋＊ｅ）、１乃至１０１００（／ｇ）の表面積（
＊）、０．１５乃至０．５０（ｇ／ｍｆｆ）の見掛けの
密度、１００乃至３０００　（オングストローム単位）
の平均細孔径（ａｖｅｒａｇｅ　ｐｏｒｅ　ｄｉａｍｅ
ｔｅｒ）及び、粒子の少なくとも４０％が３００μより
小さい寸法を持つ粒径分布により特徴付けられる。

本発明の態様に好適な市販のポリアミドカラムクロマｔ
・グラフィー樹脂の特定の例は下記のとおりである： ポリアミド樹脂、マヘレイーナーゲル社（Ｍａｃｈｅｒ
ｅｙ−Ｎａｇｅｌ＆ｃｏ、）（西ドイツ）のポリアミド
−ＣＣ６、ポリアミド−ＳＣ６、ポリアミド−ＣＣ６，
６、ポリアミド−ＣＣ６ＡＣ、ポリアミド−ＳＣ６ＡＣ
、アルドリッヒヘミー社（＾ＩｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｅ
　Ｇｍｂｈ＆Ｃｏ、ＫＧ）　（西ドイツ）のポリビニル
ピロリドン樹脂　ＰＶＰ＝ＣＬ、エム、ブエルム社（Ｍ
、Ｗｏｅｌｍ）　（西ドイツ）のポリアミド樹脂　ＰＡ
　４００゜例えば、上記樹脂の２種類のものは下記特性
を持っている： 細孔容積（＊）表面積（＊）見掛け　平均線樹脂　　（
ｍ１／ｇ）　　　　（Ｔｎ２／ｇ）　　の密度　孔径（
＊）粒径分布６ｈり一一頂γ−−−−−− ポリアミ ドーＳＣ６３，４１６，５０，２５２０００６０％＜３
５０゜ＰＡ４００　　　２．８　　　　２１．５　　０
．２８　　１０００　１００５＜３００ｐ（リイタリー
国、ミラノ市のシー、エルバ社（Ｃ，Ｅｒｂａ　Ｓｐ＾
。

Ｍｉｌａｎｏ、　Ｉｔａｌｙ）の水銀ポロシメーター２
００型（ｍｅｒｃｕｒｙｐｏｒｏｓｉｍｅｔｅｒ　ｍｏ
ｄｅｌ　５ｅｒｉｅ　Ｚｏｏ）で測定した１５一 本発明の態様の一般的方法に従えば、菌糸体ケーク（Ｂ
ｃｅｌｉａｌ　ｃａｋｅ）からろ過された糖ペプチド抗
生物質の発酵プロからス又は、該発酵ブロスから誘導さ
れたプロセス流から又は、糖ペプチド抗生物質（特に、
ティコプラニン、ティコプラニン類似化合物又は抗生物
質Ａ−４０９２６）に対する化学的修飾反応から得られ
る水性溶液を、ポリアミド樹脂カラムに、約２０ｍ１／
ｃｍ２／時間乃至約４００　ｍ（１７ｃ　ｍ２／時間の
範囲にあることができる、カラムを通る流体の流速で加
える。高い流速が必要である場合には、底部からの吸引
による真空下に又は圧力下に又は大きい粒径を有するポ
リアミド樹脂を使用して、水性溶液をカラムに加える。

後者の場合には、樹脂の吸着容量の僅かな減少がみられ
る。

別法として、ポリアミド樹脂を、抗生物質活性を含む水
性溶液に加え、１／２時間乃至６時間の所定の期間十分
に混合することができ、次いで使い尽くされた溶液を除
去する。

抗生物質活性を含む水性溶液を得るための発酵＝１６− ブロス又はプロセス流は、標準パイロット又は工業的規
模の方法に従って製造され、そして、糖ペプチド抗生物
質複合物の単一主成分の割合を選択的に増加させるため
に発酵プロセス中に適当な前駆体を様々に添加した場合
も包含される。例えば、英国特許出願第８５１２７９５
号参照。

ポリアミド樹脂と接触させられるブロス又は水性溶液の
ｐ）（値は４乃至１０、好ましくは５乃至８の範囲であ
ることができる。接触させられるべき溶液は、カラムを
詰まらせる固体物質の沈でんを防止するために種々の量
の水に混和性の溶媒を含有することができる。

本発明に従う回収操作に付される水性溶液中の抗生物質
活性の濃度は、広い範囲内で変えることができる。パイ
ロット及び工業的規模の操作に最近適用される実際の条
件下では、それは　一般に、５０乃至２０，０ＯＯｐ、
ｐ、ｍ、＜ｗ／ｖ）の範囲である。

出発ブロスの効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）が余り低くない場
合には、ポリアミド樹脂を１回だけ通過させれば満足な
程度の純度に達する。

水性溶液中に含まれた抗生物質活性の重量単位当たり使
用されるポリアミド樹脂の址は、一般に、使用される樹
脂の吸収効率に依存している。各樹脂の吸収効率は、成
る濃度て０．ζペプチド抗生物質を含有する水性溶液の
サンダルの幾つかの小分けされた部分を、引き続いて、
成る容積のポリアミド樹脂を充てんし／こカラ１＼に添
加して通ずことによる予備アッセイにより決定すること
ができる。

糖ペプチド抗生物質含有率を決定するなめに、カラムの
溶出液の一部をＨＰＬＣにより検査することができる。

試験サンプルの成る部分の溶出液が抗生物質活性を含む
ことがＨＰＬ、Ｃにより示される場合には、これは、ポ
リアミド樹脂が飽和されたことを示すものと考えられ、
そして吸着された抗生物質の量は、抗生物質括ｆしを示
さなかった溶出液の全容置から計算される。

好ましくは、本発明に従ってパイロット又は工業的規模
の回収に使用されるポリアミドの容量は、前記した如く
して決定される飽和容量より大きい。

最近の操作においては、ポリアミドクロマ１〜クラフイ
ー樹脂と、水性溶液から回収されるべき糖ペプチド抗生
物質活性との割合は、普通は、溶液中に含まれる抗生物
質活性１．　ｋ　ｇにつき樹脂約５０乃至約２５０ｌ、
好ましくは約６０乃至約２００１の範囲である。

ポリアミド樹脂溶出は、一般に、水性溶媒混合物、好ま
しくは、水と水に混和性の有機溶媒、例えば、低級アル
カノール、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒド
ロフラン、ジオキサン及びアセトニトリルの内の１種又
はそれより多くの種類のものとの溶媒混合物を溶出剤と
して使用することによって、重力により又は吸引もしく
は圧力下に、室温で行なわれる。

最も好ましい溶出剤混合物は、溶出液のｐ　Ｈ値を３乃
至１１の範囲に維持するように該混合物に可溶性の酸又
は塩基の速当坂を添加した、水と低級アルカノール（例
えばメタノール）又はアセ１ヘンとを約１：９乃至約９
：１（ｖ／ｖ）の範囲の割合で含有する水性溶液である
。

ｐＨ値を所望のレベルに維持するために、緩衝溶液を使
用するとともできる。

この目的に有用な添加物は、例えば、鉱酸、ギ酸、酢酸
、希水性アルカリ金属水酸化物、例えば、水酸化ナトリ
ウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナト
リウム、アンモニア、ビス（２−ヒドロキシエチルアミ
ン）、リン酸水素ナトリウム及び同様なものである。

本発明の好ましい態様に従えば、溶出剤混合物の最初の
部分は、最後の部分より低いｐＨ値を持つことができ、
そしてｐＨ値は溶出中に徐々に増加させ、かくして溶出
液の最初の画分により酸性の不純物の除去を可能とする
。この場合に、最初の溶出剤部分は、例えば、塩基とし
て水性炭酸水素ナトリウムを含有することができるが、
中間部分は炭酸ナトリウムを含有することができ、そし
て最後の部分は水酸化す）−リウムを含有することがで
きる。あるいは又、より酸性の不純物を除去した後、前
記した酸の１つを使用することによつて酸性ｐＨ値で抗
生物質の溶出を行うことができる。水に混和性の溶媒の
勾配又は増加していく濃度の緩衝作用塩の勾配を使用す
ることによって同様な効果を得ることもできる。

溶出液を幾つかの画分にして集め、これらをｐＨ７に中
和し、ＨＰＬＣにより分析する。糖ペプチド抗生物質活
性を含む両分を一緒にしそして真空下に濃縮する。普通
の方法によって前記濃縮された水性溶液から糖ペプチド
抗生物質を回収する。

例えば、糖ペプチド抗生物質の溶解性が低い水に混和性
の有機溶媒、例えば、アセトンの添加により、前記濃縮
された水性溶液からそれを沈でんさせることができる。

水に混和性の溶媒の添加を必要としない別の回収方法は
、低温、例えば５°Ｃで数時間放置した後、濃縮された
溶液から、沈でんした抗生物質をその等電点付近のｐ　
Ｈでろ過することに基づいている。

成る場合には、特に、溶出液が、濃縮により回収された
生成物を実際の製薬に直接使用することを不適当ならし
める所望されない景の無機塩を含有する場合には、溶出
液を更に濃縮することと脱塩工程とを結合することが好
ましい。この操作は、限外ろ適法を適用することにより
〔例えば、５゜０−１０００ダルトンのカットオフを有
する、ライ゛　ルムデク社（ＦＩｌ、ＭＴＥｅ　Ｃｏ。

）の膜を使用することにより）又は、非イオン発生性巨
大網目架橋樹脂（例えば、アンバーライＴ−ＸＡＤ−７
又は米国特許第３５３１４６３号、米国特許第３６６３
４６７号及び英国特許第１５８１６７１号に記載の如き
他の樹脂）を通して溶出液を流すことにより、同時に行
うことができ、それにより糖ペプチド抗生物質は水性混
合物から吸着され、次いでアセトン／水混合物で溶出さ
れる。

−Ｆ記の方法により回収された糖ペプチド抗生物雪は、
従来公知の異なる回収方法を使用することによって又は
、例えば、マクロポーラスな樹脂の如き異なる種類の樹
脂を使用することによって得られる純度と比較して、非
常に満足な程度の純度を持っている。本発明の方法に従
う、ろ過された発酵ブロス又はプロセス流からの回収の
収率も又、前記した先行技術の方法により得られる収率
と比較して非常に好ましい。

例えば、本発明の方法をティコプラニンに適用する場合
には、カラムからの抗生物質生成物は、実際の製薬に使
用するための標準設定に非常に近い純度を既に示すこと
ができる。実際的に言えば、製薬学的に注射可能な投与
形態で使用するなめには、このような生成物は、例えば
、水又は水／混和性有機溶媒中のその溶液を活性炭で処
理するなどの如き、発熱物質を除去する処理に付するだ
けでよい。

糖ペプチド抗生物質の回収に一度使用されたポリアミド
樹脂は、多数の引き続く吸収−脱着サイクルに使用する
ことができる。ポリアミド樹脂を再使用する前に、少な
くとも５床容量の脱塩水で水洗を行うのが普通である。

３回又は４回の完全サイクルの後、ＰＨ１２で一定にな
るまで樹脂を希カセイアルカリ（ｐＨ１２）で洗浄し、
次いで中性になるまで脱塩水で樹脂を再び洗浄するのが
好ましい。

＝２３− 下記実施例により本発明が更に良く理解されるであろう
。下記実施例は限定する目的ではない。

火１鮭 ＵＶ（２５４ｍμ）検出器と逆相Ｃ１８プレバツクドカ
ラム〔エルバシル（Ｅｒｂａｓｉ　ｌ）　５．２５０×
４ｍｍ］を備えたヒユーレットパラカード装置１０８４
型（■ｅａ＋１ｅｔｔ　Ｐａｅｋａｒｄ　ａｐｐａｒａ
ｔｕｓ　Ｎｏ、　１０８４）を使用することによってす
べてのＨＰ　Ｌ　Ｃ制御を行った。

移動相は、（Ａ）０．０２Ｍ水性ＮａＨ２ＰＯ。

／　ＣＨ３ＣＮ　９５　：　５　（ｖ　／　ｖ　）、（
Ｂ）０．０２Ｍ水性ＮａＨ２ＰＯ４／ＣＨ＊ＣＮ２５　
：　７５　（ｖ／ｖ）である。

勾配溶出は４０分で８８％乃至８５５％であった。流速
１．５ｍ１／分。

割１涯Ｙ 菌糸体ケークから分離したティコプラニン発酵ブロス１
７０１を、ポリアミド樹脂（カラムクロマトグラフィー
用ポリアミド−ＣＣ６、粒径５〇−１６０μ、見掛けの
密度０．２０ｇ／ｍｌ、マヘ＝２４− レイ　ナーゲル社、西ドイツ）１０．５Ｎを詰めた１　
５　Ｘ　１００　ｃ　ｍガラスカラムに、ｐＨ８で１０
時間道し、そして底部からの吸引によって真空に保った
。平均流速は１００　ｍｌ／　ｃ　ｒｒｔ２ｈであった
。

使用済みのブロス（１７０ｔりは、出発ティコプラニン
活性の５％以下とブロスの極性が大きい成分のすべて（
所望されない固体及び着色した有機物質）の８０％以上
とを含有していた。脱塩水５０１で洗浄した後、炭酸ナ
トリウム０．３ｇ／ｌから１．０ｇ／ｌまでの勾配を含
むメタノール／水９／１　（ｖ／ｖ）の混合物５０１に
より樹脂の溶出を行った。

溶出液を各１０１の５つの画分にして集めた。

各両分を水性鉱酸でｐＨ７に中和し、そしてＨＰＬＣ分
析により分析した。溶出液の２つのみの画分（２０１）
を−緒にし、得られる溶液（溶出された活性の９０％以
上を含有する）を減圧下に４５−５０℃で濃縮して、３
．３１の水性残留懸濁液とした。

アセトン１３．２Ｎを上記濃縮ティコプラニン懸濁液に
撹拌下に加えた。

沈でんを室温で３時間放置し、透明なＩｆ液アセトンを
デカンテーションした。

固体をろ過により分離し、ケークを室温でアセＩ・ンに
よりスラッジにした。

生成物を再びろ過し、室温で真空下に一夜乾燥した。

ＨＰＬＣで８５．７％純度のティコプラニンが、発酵ブ
ロス中に含まれた初めの微生物学的活性に対して８１．
９％の回収収率で得られた（水及び溶媒含有率：１１．
５重景％、無機残留物：２，８重量％）。

１６．５１の母液は出発ティコプラニンの約２％を含有
していた。

樹脂の吸収効率は下記の方法により予め決定した。

■ティコプラニン３．］、ｇ／Ｎを含有する濃縮した溶
液３６０ｒｏｆｆを、湿潤ポリアミド−ＣＣ６樹脂１５
ｇ（６０ｒｎＮ）を詰めたカラムに５０ｍ１ずつ加えた
。溶出液を５０ｍ１毎に、ＨＰ　Ｌ　Ｃにより分析して
ティコプラニン含有率を決定した。溶液２５０ｍ１をカ
ラムに通し、そして溶離した溶媒中にはティコプラニン
は観察されなかった。その後の部分は約０　、７　ｇ／
　ｍ　（ｌの活性を含んでいた。

これは、樹脂１５ｇがティコプラニン０．９ｇにより飽
和されたことを示すものと考えられる。この値はティコ
プラニン１ｋｇ当たり６７１のポリアミド−ＣＣ６に相
当する。

火施Ｌ４ユ 発酵培地に、英国特許第８５１２７９５号に従うティコ
プラニン因子Ａ２の単一成分の適当な前駆体を加えるこ
とによって得られたろ過した発酵ブロスに対して下記の
実験を行った。

実施例１に使用したのと同じ種類のポリアミド−ＣＣ６
樹脂を吸着剤マトリックスとして使用した。

菌糸体ケークから分離した発酵ブロス６０１を活性１ｋ
ｇ当たり樹脂８１を含有するカラムに通した。脱塩水で
洗浄した後、活性を溶出し、実施例１に記載の方法に従
って沈でんさせた。８６％ＨＰＬＣ純度のティコプラニ
ンが、７７％の収率で回収された（水及び溶媒含有率９
．１％、無機残留物４，７％）。

′ＩＪＬｔＬＢ！Ｌ３Ｌ 英国特許出願第８５１２７９５号に従って発酵培地にＩ
、−バリンを加えることによって得られたろ過した発酵
ブロス３００１を、２５１のポリアミド−ＳＣ６（粒径
及び他の特性は前記した）を含有するｌ、　９　Ｘ　１
００　ｃ　ｍのガラスカラムにｐ　Ｈ６で通した。消耗
したブロスはティコプラニンを含有していなかった。脱
塩水５０！でカラムを洗浄した後、酢酸ナトリウム０．
０５Ｍ　（ｐＨ８）の水性溶液５０１で樹脂を洗浄した
。出発ブロス中に存在している固体不純物の９０％以上
が除去されている。次いで、酢酸でｐＨ４に調節し７た
アセトン／水４０　：　６０混合物５０１により抗生物
質を溶出した。出発抗生物質の８５％を含有する有用な
両分を一緒にプールした（３ＯＮ）。ｐ　Ｈ６。

５−７における減圧千の？Ｊｌ！ｉ縮によって、溶液の
容積は約１２１に減少した。水性塩化水素酸を加え＝２
８− ることにより、ｐＨを再び３．５−４に下げ、＋５℃で
３時間放置した後洗でんした白色固体を集めた。ケーク
をアセトンで洗浄し、再びろ過した。

乾燥の後、７４％の回収収率でティコプラニンが得られ
、そして８３％のＨＰＬＣ純度を示したく水及び溶媒含
有率１４．１％、無機残留物２．１％）。

支Ｗ鮭先 Ｆ、、Ｐ、Ａ、公開第１４．６０５３号に記載の実施例
の１つに従って得られた粗デグルコテイコプラニン（ｄ
ｅｇｌｕｃｏｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎ）４５０　ｇをｐ
Ｈ８の水７１に溶解し、この溶液を、ポリアミド−ＰＡ
４００（エム、ブエルム社）２６１を含有するガラスカ
ラム（１７Ｘ１００ｃｍ＞に通した。粒径及び他の特性
については前述の説明参照。脱塩水５ＯＮで洗浄した後
、０．０３５％（ｗ／ｖ）Ｎａ２ＣＯ３を含有するメタ
ノール／水９：１混合物５０ｐでカラムを溶出した。

有用な画分（１００Ｎ）をプールすると、仕込まれたデ
グルコテイコプラニンの８５％を含有していた。次いで
、残留容積が９１になるまで、溶液をｐＨ６，５で減圧
下に濃縮した。冷却の後、懸濁液をろ過し、そしてケー
クをアセトンで洗浄した。乾燥の後、８３％ＨＰ　Ｌ　
Ｃ純度のデグルコデイコプラニン（２１］、　ｕ、水及
び溶媒含有率１２．２％）が７９％収率（出発１−ｒ　
Ｉ）　１．、　Ｃ活性に対して）で得られた。

実一方［ Ｅ、Ｉ）、Ａ、公開第１１９５７４号に記載の如くした
得られた粗抗生物質Ｌ−１７０４６（ＨＰＬ、Ｃアッセ
イ６８％）９６ｇをｐＨ８，２の水／メタノール９５：
５混合物（ｖ／ｖ）Ｉｌ中に溶解し、この溶液を、５１
のポリアミド−ＳＣ６を含有するガラスカラム（１０Ｘ
　１００　ｃ　ｍ　）に通した。脱塩水５１で洗浄した
後、水／メタノール］　：　１　（Ｖ／Ｖ）の混合物５
１でカラムを洗浄した。０．０３％（ｗ／ｖ）Ｎａ２Ｃ
Ｏ３を含有するメタノール／水９：１（ｖ／ｖ）混合物
で溶出を行った。５３．９ｇノＬ　−１，７０４６（出
発ＨＰＬＣ活性の８３％）を含有する有用な両分を一緒
にプールした。実施例４記載の方法と同じ方法に従って
、８９％ＨＰ　１．、　Ｃ純度で５５．５ｇのＬ−１７
０４６が得られた（水含有率１１％）。

え１許灸 ８．５乃至１０．５のｐ　Ｈでのろ過により菌糸体塊（
ｍｙｃｅｌｉａｌ　ｍａｓｓ）から分離した、Ｅ、Ｐ、
Ａ、第８５１１２４０６．５号に記載の如くして得られ
た抗生物質Ａ４０９２６複合体を含有する発酵ブロスを
、硫酸によりｐＨ３に酸性化した。

沈でんした粗製物質をろ過により集め、次いで、ｐＨ７
の水に溶解し、マヘレイーナーゲル社のポリアミド−Ｓ
Ｃ６ＡＣを含有する（抗生物質活性１ｋｇ当たり樹脂１
２Ｏｎ＞ガラスカラムに供給した。脱塩水で洗浄した後
、ｐＨ８の０．２Ｍリン酸塩緩衝液で洗浄して、追加の
着色物質を除去した。別法として、少量の洗剤（例えば
、ラウリル硫酸ナトリウム）を同じ目的で水に加えるこ
とができる。次いで、カラム内容物を、出発抗生物質活
性の約７５％を含有する１％水性アンモニアで溶出した
。１０％（ｗ／ｖ）水性ＭＣＩの添加によって、水性溶
液のｐＨを３．５にし、次いで５℃で数時間冷却した。

沈でんした生成物をろ過により分離し、氷冷水で十分に
洗浄し、次いで、乾燥して、ＨＰＬＣで実質的に純粋な
Ａ４０９２６抗生物質複合体が得られた。

発酵ろ過ブロスを直接カラムに供給する別の実験におい
ては、ｐ）（を７に調節した後、７０％純度の（）（Ｐ
ＬＣ）Ａ４０９２６が得られた。ポリアミド−３Ｃ６Ａ
Ｃ上に２回目の通過をさせるか又はアフィニティー樹脂
１ユの吸着／脱着サイクルにより、ＨＰＬＣで純粋な物
質が得られた。

実施例７ ヨーロツパ特許出願第８６１１２２２６．５号（又は特
願昭６１−２１４１８５）の実施例１に記載の如くして
得られた粗製Ｎ６″’−Ｃ３−（ジメチルアミノ）プロ
ピル）］ティコプラニンＡ、アミドアセテ−１１３，５
ｇを、ｐＨ６，５の水６００ｍ１に溶解し、この溶液を
、２５０ｇのポリアミドＳＣ６（０，１，−０，３ｍｍ
）を大有するガラスカラムに通した。ｐＨ６，５で水５
００ｍ６で洗浄した後、同じｐＨでメタノール／水３ニ
ア＝３２− （Ｖ／Ｖ）混合物により溶出を行った。

有用な両分（約１．５００ｍｆｉ）をプールすると、仕
込まれた抗生物質の約７５％を含有していた。

真空下にメタ、ノールを留去した後、残留水溶液のｐＨ
を８．５にし、沈でんした固体を冷却のｆ＆Ａめ、１１
．Ｖ、乾燥した。８５％ＨＰＬＣ純度のＮ６３−Ｃ３−
（ジメチルアミノ）プロピル）］ティコプラニン５．８
ｇが、７０％の全収率で得られた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、発酵ブロス又はプロセス流から得られる水性溶液か
   ら糖ペプチド抗生物質を回収する方法において、該水性
   溶液を、前記抗生物質活性を吸収することができるポリ
   アミドカラムクロマトグラフィー樹脂と接触させ、該樹
   脂を該水性溶液から分離し、該樹脂を水性混合物溶出剤
   で洗浄し、該溶出剤から糖ペプチド抗生物質を回収する
   ことを特徴とする方法。 ２、前記カラムクロマトグラフィーポリアミド樹脂が、
   ポリカプロラクタム、ナイロン６／６、ナイロン６／９
   、ナイロン６／１０、ナイロン６／１２及び架橋したポ
   リビニルピロリドンから選ばれたものである特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ３、前記カラムクロマトグラフィーポリアミド樹脂が、
   １ｍｌ／ｇ乃至５ｍｌ／ｇの範囲の細孔容積（水銀ポロ
   シメーターにより決定して）と、１ｍ＾２／ｇ乃至１０
   ０ｍ＾２／ｇの範囲の表面積（水銀ポロシメーターによ
   り決定して）と、０．１５ｇ／ｍｌ乃至０．５０ｇ／ｍ
   ｌの範囲の見掛けの密度と、１００乃至３０００オング
   ストローム単位の範囲の平均細孔径（水銀ポロシメータ
   ーにより決定して）と、粒子の少なくとも４０％が３０
   ０μより小さい寸法を有する粒径分布とにより特徴付け
   られる、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、前記樹脂が、ポリアミド−ＣＣ６、ポリアミド−Ｓ
   Ｃ６、ポリアミド−ＣＣ６．６、ポリアミド−ＣＣ６Ａ
   Ｃ、ポリアミド−ＳＣ６ＡＣ、ポリビニルピロリドンＰ
   ＶＰ＝ＣＬ、ポリアミドＰＡ４００から選ばれたもので
   ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、ろ過した発酵流又はプロセス流のｐＨが４乃至１０
   、好ましくは５乃至８の範囲にある特許請求の範囲第１
   項乃至第４項のいずれかに記載の方法。 ６、ポリアミドクロマトグラフィー樹脂と糖ペプチド抗
   生物質活性との割合が、溶液中に含有されている抗生物
   質活性１ｋｇ当たり樹脂約５０乃至約２５０ｌ、好まし
   くは約６０乃至約２００ｌの範囲にある特許請求の範囲
   第１項乃至第５項のいずれかに記載の方法。 ７、溶出剤として、緩衝化水溶液又は、水性溶媒混合物
   、好ましくは、水と、低級アルカノール、アセトン、メ
   チルエチルケトン、テトラハイドロフラン、ジオキサン
   及びアセトニトリルから選ばれた１種又はそれより多く
   の混和性有機溶媒との溶媒混合物を使用することによっ
   て、前記ポリアミドカラムクロマトグラフィー樹脂から
   の溶出を行う特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれ
   かに記載の方法。 ８、前記溶出剤混合物が、水と低級アルカノール又はア
   セトンを約１：９（ｖ／ｖ）乃至約９：１（ｖ／ｖ）の
   範囲の割合で含有する水性混合物であり、溶出液のｐＨ
   を３乃至１１の範囲に維持する、特許請求の範囲第７項
   記載の方法。 ９、前記糖ペプチド抗生物質が、バンコマイシン、アク
   タプラニン、リストセチン、アボパルシン、アクチノイ
   ジン、ＬＬ−ＡＭ−３７４、Ａ４７７、ＯＡ７６５３、
   Ａ３５５１２Ｂ、 Ａ５１５６６８、ＡＡＤ２１６、Ａ４１０ ３０、Ａ４７９３４、Ａ４０９２６（ヨーロッパ特許出
   願第８５１１２４０６．５号）、それらの個々の因子、
   誘導体及び擬アグリコン類及びアグリコン類、テイコプ
   ラニン及びテイコプラニン類似化合物から選ばれたもの
   である特許請求の範囲第１項乃至第８項のいずれかに記
   載の方法。 １０、糖ペプチド抗生物質がテイコプラニン、Ａ−４０
   ９２６及びテイコプラニン類似化合物から選ばれたもの
   である特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、前記テイコプラニン類似化合物が、下記の化合物
   ：デグルコテイコプラニン、抗生物質Ｌ−１７０４６、
   テイコプラニン因子Ｔ−Ａ＿２、因子Ｔ−Ａ＿２の５種
   の主成分の１種、ヨーロッパ特許出願第８６１１２２２
   ６．５号（又は特願昭６１−２１４１８５）に記載のテ
   イコプラニンアミド及び任意の割合のそれらの混合物：
   の１つである特許請求の範囲第１０項記載の方法。