PT1516626E - Composição de teicoplania com actividade antibiótica melhorada - Google Patents

Description

ΕΡ 1 516 626 /PT

DESCRIÇÃO "Composição de teicoplanina com actividade antibiótica melhorada."

Campo do Invento 0 presente invento refere-se a uma composição de teicoplanina com melhor actividade antibiótica, à sua utilização como fármaco, e a um método para produzir uma composição de teicoplanina com actividade antibiótica melhorada.

Antecedentes do Invento A teicoplanina é um glicopéptido antibiótico produzido por Actinoplanes teicomyceticus e foi identificada durante um programa de investigação cientifica que visava encontrar novas moléculas de origem microbiana que inibissem a síntese da parede celular bacteriana (Referência 1). Foi descrita pela primeira vez em 1978 e dez anos depois foi introduzida na prática clínica em Itália (Referência 2). Segundo Lancini (Referência 3) os antibióticos glicopeptídicos podem ser classificados em quatro grupos, com base na sua estrutura química:

Grupo I (ou o tipo Vancomicina) possui aminoácidos alifáticos nas posições 1 e 3;

Grupo II (ou o tipo avoparcina) possui resíduos aminoácidos aromáticos nas posições 1 e 3;

Grupo III (ou o tipo ristocetina) semelhante ao grupo II excepto numa ligação éter que une os aminoácidos aromáticos nas posições 1 e 3;

Grupo IV (ou o tipo teicoplanina) possui a mesma disposição de aminoácidos que o grupo III mais um resíduo ácido gordo ligado à osamina. A teicoplanina partilha muitas características químicas e microbiológicas com a vancomicina mas possui actividade superior contra muitas bactérias Gram-positivas e é menos nefrotóxica (Referência 2 e Referência 4). 2

ΕΡ 1 516 626 /PT A estrutura molecular da teicoplanina é representada aqui na Figura 1. Como todos os antibióticos glicopeptidicos, a teicoplanina contém um heptapéptido linear central, no qual cinco dos sete aminoácidos são comuns a todos os membros do seu grupo. Os restantes dois (posições 1 e 3) estão unidos por uma ligação éter (Referência 3). Três porções açúcar estão ligadas aos grupos arilo dos aminoácidos 7, 6 e 4, nomeadamente uma D-manose, uma N-acetil-D-glucosamina e uma N-aril-D-glucosamina, respectivamente. Esses açúcares não possuem nenhuma actividade biológica in vitro, mas são importantes para conferir diferentes propriedades farmacocinéticas (Referência 5). A teicoplanina compreende diferentes componentes, incluindo cinco moléculas muito semelhantes, denominadas teicoplanina A2-1 (TA2-1) a teicoplanina A2-5 (TA2-5), que diferem apenas na natureza da porção acilo (ácidos gordos Cio e Cu) ; RS-1 a RS-4; um componente mais polar teicoplanina A3-1 (TA3-1), que não tem o resíduo N-acil-D- glucosamina e teicoplanina TA3-2, que não tem também o grupo D-manose. A substituição dos resíduos açúcar com hidrogénio resulta no centro aglícona, que é considerado como um componente da teicoplanina A3. As estruturas moleculares dos diferentes componentes são aqui apresentados na Figura 2. A Referência 7 revela que a teicoplanina é um complexo antibiótico que consiste em cinco factores intimamente relacionados que podem ser transformados em pseudogliconas e, finalmente, numa única aglícona, com a remoção consecutiva de três unidades de açúcar por hidrólise ácida. A US4239751 (Referência 9) revela o isolamento de diferentes componentes da teicoplanina. 0 Quadro IV mostra que a TA3 possui menor actividade antibiótica do que a TA2. A US4994555 (Referência 10) diz, na coluna 2, linhas 51-53: "Conforme utilizada na sua aplicação biológica, a teicoplanina consiste essencialmente em factor A2 (TA2) acompanhado por quantidades menores de factor A3 (T-A3)". A Referência 11 revela a determinação da estrutura e as propriedades físico-químicas da teicoplanina. 3

ΕΡ 1 516 626 /PT Ο Targocid® é um produto comercial de teicoplanina da Aventis Pharma.

Sumário do Invento 0 problema a resolver com o presente invento é proporcionar uma composição de teicoplanina com actividade antibiótica melhorada. A solução baseia-se no facto de os actuais inventores terem identificado que se podia obter um efeito sinergético positivo produzindo uma composição de teicoplanina com uma razão correcta entre as quantidades de TA2 e TA3. 0 trabalho experimental dos actuais inventores confirmou a arte anterior que ensinava que TA3 relativamente puro, por exemplo, possui menor actividade antibiótica do que TA2, por exemplo. Apesar disso, os presentes inventores produziram composições diferentes de teicoplanina, onde adicionaram quantidades cada crescentes de TA3 de modo a obterem uma razão TA3:TA2 maior. Contrariamente aos ensinamentos da arte, eles verificaram que num determinado intervalo de % (mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2), era possivel produzir uma composição de teicoplanina com melhor actividade antibiótica, devido a um efeito sinergético de TA2 e TA3 na composição. A Figura 3 é um gráfico que apresenta um exemplo ilustrativo disto. Como composição de referência foi utilizado o produto comercial de teicoplanina, o Targocid®. Com base numa conhecida análise HPLC de Targocid® padrão na arte, determinou-se que o Targocid® possui uma %(mg de TA3-l)/(mg de TA3-1 + TA2) de cerca de 6,5%. Os dados da figura 3 mostram que foi possivel, misturando-lhe TA3-1, produzir uma composição de teicoplanina com maior actividade antibiótica do que o Targocid®. Mais especificamente, na gama de %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) de 6,75% a 60%, as composições testadas tiveram uma actividade antibiótica claramente maior do que o Targocid®. A fim de purificarem os componentes TA2 e TA3, os actuais inventores analisaram (por HPLC) uma composição comercial de teicoplanina obtida da Xingchang Pharma (China). Esta composição tinha uma %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) de cerca de 10%. 4

ΕΡ 1 516 626 /PT

Os actuais inventores não sabiam de quaisquer outras composições farmacêuticas de teicoplanina comerciais relevantes, conhecidas publicamente, que tivessem uma %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) superior a 10%.

Consequentemente, um primeiro aspecto do invento refere-se a uma composição de teicoplanina, compreendendo uma quantidade eficaz de componentes teicoplanina ou um seu sal ou derivado farmaceuticamente aceitáveis e um transportador farmaceuticamente aceitável, onde a composição compreende uma %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) na gama de 11% a 60%.

Um segundo aspecto do invento refere-se à utilização de uma composição farmacêutica de teicoplanina de acordo com o primeiro aspecto do invento para a produção de um medicamento para o tratamento de uma infecção provocada por microorganismos num paciente.

Segundo se explicou anteriormente, os actuais inventores identificaram que era possível produzir uma composição de teicoplanina onde existisse um efeito sinergético positivo de TA2 e TA3. Este ensinamento pode ser utilizado para produzir uma composição de teicoplanina com actividade antibiótica melhorada.

Consequentemente, um terceiro aspecto do invento refere-se a um método para produzir uma composição de teicoplanina com melhor actividade antibiótica compreendendo os seguintes passos: (i) produzir duas ou mais composições de teicoplanina compreendendo %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) diferentes, no intervalo de 5% a 60%, medidas por análise de HPLC; (ii) analisar a actividade antibiótica das composições; (iii) identificar uma composição onde exista um efeito sinergético de TA2 e TA3 e que possua uma actividade melhorada pretendida.

Um quarto aspecto do invento refere-se a um método para produzir uma composição de teicoplanina compreendendo TA2 e TA3, o referido método compreende a hidrólise de uma composição contendo TA2, e.g. por tratamento com um ácido ou uma enzima. 5

ΕΡ 1 516 626 /PT

Desenhos FIGURA 1: Estrutura molecular do complexo de teicoplanina. FIGURA 2: Estrutura molecular dos diferentes componentes de teicoplanina. FIGURA 3: Apresentação gráfica de dados que mostram que, misturando TA3-1, é possível produzir uma composição de teicoplanina com maior actividade antibiótica do que o Targocid®. Para mais detalhes ver a secção 3 do Exemplo 1, aqui. FIGURA 4: Apresenta o diagrama de HPLC de Targocid®, uma composição de teicoplanina (Richet) e uma composição de teicoplanina descrita mais detalhadamente aqui nos Exemplos de trabalho. DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO Composição de teicoplanina 0 termo TA2 é uma abreviatura padrão para teicoplanina A2. Aqui, este termo compreende teicoplanina que possua três porções hidrato de carbono, tais como as cinco moléculas muito semelhantes denominadas teicoplanina A2-1 (TA2-1) a teicoplanina A2-5 (TA2-5) e RS-1 a RS-4. Também, o termo TA2 compreende os seus derivados, tais como os derivados que foram alterados no substituinte R (ver Figura 1) . Os exemplos de R são dados na arte anterior e são conhecidos dos peritos na arte. Os exemplos de estruturas moleculares de componentes TA2 diferentes são aqui apresentados nas Figuras 1 e 2. De preferência, o termo TA2 denota aqui os componentes de teicoplanina seleccionados do grupo que consiste em teicoplanina A2-1 (TA2-1) a teicoplanina A2-5 (TA2-5) e RS-1 a RS-4, ou o termo denota a soma de dois ou mais componentes de teicoplanina com três porções hidrato de carbono, tal como a soma de 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais das teicoplaninas mais predominantes na composição. Mais preferencialmente, o termo TA2 denota aqui os componentes de teicoplanina seleccionados do grupo que consiste em teicoplanina A2-1 (TA2-1) a teicoplanina A2-5 (TA2-5), ou a soma destes, i.e. o grupo A2 de teicoplanina (A2-1 + A2-2 + A2-3 + A2-4 + A2-5). Ainda com 6

ΕΡ 1 516 626 /PT mais preferência, o termo TA2 denota aqui apenas o componente de teicoplanina TA2-2. 0 termo TA3 é uma abreviatura padrão para teicoplanina A3. Aqui, este termo compreende componentes de teicoplanina possuindo duas (e.g. TA3-1), uma (e.g. TA3-2) ou nenhuma porção hidrato de carbono (e.g. teicoplanina aglicona), quer individualmente, quer em combinação (e.g. a quantidade de todas as teicoplaninas possuindo duas ou menos porções hidrato de carbono ou a soma de TA3-1 e TA3-2). De preferência o termo TA3 denota aqui apenas os componentes de teicoplanina TA3-1. As estruturas moleculares de TA3-1, que é o componente presentemente preferido de TA3, e ο TA3-2 são aqui apresentados na Figura 1 e 2.

As quantidades especificas de TA3 e TA2 na composição podem ser determinadas por qualquer meio adequado e presentemente prefere-se a análise por HPLC. Resumidamente, essa análise por HPLC compreende os seguintes passos: (i) ter uma solução de amostra adequada de uma quantidade específica da composição; (ii) efectuar o teste de HPLC com uma quantidade adequada da solução de amostra em conformidade com as condições de funcionamento padrão correctas, e medir a área do pico de TA2 e a área do pico de TA3 através de um método de integração automático adequado.

Na secção 1.3.3 do Exemplo 1 do presente documento proporciona-se um protocolo preferido adequado para a análise por HPLC. Na Figura 4 é apresentado um diagrama típico de HPLC. A Figura 4 mostra o diagrama de HPLC de Targocid®, de uma composição de teicoplanina (Richet) e de uma composição de teicoplanina aqui descrita mais detalhadamente nos exemplos de trabalho.

Numa concretização preferida, a composição de teicoplanina compreende uma %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) no intervalo de 13% a 50%, medida por análise de HPLC, com mais preferência, a composição de teicoplanina compreende uma % (mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) no intervalo de 15% a 40%, medida por análise de HPLC, ainda com mais preferência, a composição de teicoplanina compreende uma %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) no intervalo de 18% a 40% e mais preferencialmente, a composição de teicoplanina compreende uma %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) no intervalo de 20% a 40%. Outros exemplos nos intervalos possuem 7

ΕΡ 1 516 626 /PT o limite inferior seleccionado do grupo que consiste nos valores: 12%; 14%; 16%; 17%; 19%; 21% ; 22%; 23%; 24% ou 25 %, e o limite superior seleccionado do grupo que consiste nos valores: 35%; 45%; 50%; 55%; ou 30%, estes valores podem ser combinados livremente para formar intervalos.

De preferência, a composição de teicoplanina compreende mais de 600 mg de matéria seca de componentes TA2 e TA3 activos, por grama de composição de matéria seca.

Pode-se preferir produzir a composição de teicoplanina numa quantidade relativamente grande para proporcionar e.g. a composição de teicoplanina na forma de um denominado produto bruto. Esse produto bruto pode ser utilizado para produzir e.g. várias composições farmacêuticas individuais de teicoplanina. Consequentemente, pode preferir-se que a composição de teicoplanina tenha um peso total de composição de pelo menos 100 g, mais preferencialmente pelo menos 500 g. A composição farmacêutica individual possui, de preferência, um teor de 1 mg a 1000 mg de teicoplanina.

Conforme foi anteriormente explicado, a composição farmacêutica de teicoplanina comercial Targocid® foi utilizada como referência em exemplos experimentais aqui descritos e com base nos efeitos sinergéticos identificados de TA2 e TA3, os actuais inventores conseguiram preparar, rotineiramente, composições com uma actividade antibiótica melhor do que o Targocid®. Medido pelo protocolo de análise de HPLC da secção 1.3.3 do exemplo 1 do presente documento, o Targocid® possui uma %(mg de TA3-l)/(mg de TA3-1 + TA2) de 6,5%.

Consequentemente, uma concretização preferida do invento refere-se a uma composição de teicoplanina como a descrita aqui, onde a composição possui uma actividade antibiótica melhor do que uma composição de teicoplanina correspondente que tem uma %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) de 6,5%, onde a actividade antibiótica é medida através de um teste microbiológico de difusão em ágar usando Staphylococcus aureus ATCC 6538 como estirpe de teste e onde a potência latente medida (UI por mg de TA2 + TA3/g de composição) é utilizada para calcular a actividade antibiótica.

Proporciona-se aqui na secção 1.3.4.1 do Exemplo 1 um teste microbiano de difusão em ágar adequado. 8

ΕΡ 1 516 626 /PT A lógica de fundo da unidade de potência latente (UI por mg de TA2 + TA3) pode ser ilustrada por observação do Quadro 2, da secção 2, do Exemplo 1. Aqui pode observar-se que a potência antibiótica é medida para as composições como (Ul/mg de composição). Uma vez que também são conhecidas as quantidades de TA2 e TA3 da composição, é possível calcular a potência latente (UI por mg de TA2 + TA3) tal como se efectuou neste Quadro 2.

De preferência, a potência latente da composição de teicoplanina, conforme aqui foi descrita, é pelo menos 5 UI mais elevada que a composição de teicoplanina correspondente que possui uma % (mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) de 6,5%, mais preferencialmente esta é pelo menos 30 UI mais elevada do que a composição de teicoplanina correspondente que possui uma %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) de 6,5%, ainda mais preferencialmente esta é pelo menos 50 UI mais elevada do que a composição de teicoplanina correspondente que possui uma %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) de 6,5%, e com a maior preferência esta é pelo menos 100 UI mais elevada do que a composição de teicoplanina correspondente que possui uma %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) de 6,5%. Em algumas circunstâncias pode ser difícil obter actividade superior a 1000 UI. A expressão "composição de teicoplanina correspondente que possui uma %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) de 6,5%" deve ser entendida como uma composição de referência padrão no sentido de que, para além das quantidades de TA3 + TA2 especificas, deve compreender os mesmos componentes, sal e etc. que a composição de teicoplanina que é avaliada relativamente à sua melhor actividade antibiótica.

Os componentes de teicoplanina podem ser convertidos em sais, tais como sais e derivados farmaceuticamente aceitáveis, como ésteres e éteres, e outros equivalentes químicos, que, numa composição de teicoplanina como a aqui descrita, são todos abrangidos pelo presente invento. Os sais e derivados podem ser preparados por procedimentos padrão conhecidos pelos peritos na especialidade. Os sais como os sais de sódio e de potássio, por exemplo, podem ser preparados tratando os componentes de teicoplanina com bases de sódio ou de potássio adequadas. 9

ΕΡ 1 516 626 /PT

Os ésteres e os éteres podem ser preparados através dos métodos fornecidos na literatura, por exemplo, em Advanced Organic Synthesis, 4th Edition, J. March, John Wiley & Sons., 1992. 0 grupo amina da porção açúcar pode sofrer alquilação ou acetilação, e.g. com cloridratos através de procedimentos padrão conhecidos pelos peritos na especialidade.

Os equivalentes químicos podem ser complexos estáveis com iões metálicos, e.g. metais de transição como La3+, Sm3+, Eu3+, Gd3+, que são típicos para derivados de ácido tetrâmico e podem ser preparados pelos métodos fornecidos na literatura (K. Tanaka et. al., Chem. Pharm. Buli. 1979, 27,1901; K.

Matsuo, Chem. Pharm. Buli. 1980, 28, 2494).

As ligações duplas da cadeia lateral alquilo podem sofrer redução pelos métodos fornecidos na literatura, por exemplo em P.N. Rylander, "Hydrogenation Methods", Academic Press, Nova Iorque (1985), Capítulo 2, ou podem sofrer hidro-halogenação pelos métodos descritos por H.O. House em "Modern Synthetic Reactions", W.A. Benjymin, Inc., Nova Iorque (1972), pp. 446-452. Os derivados hidroxilados podem ser produzidos por reacção entre as ligações duplas e reagentes como o OSO4 conforme 0 descrito na literatura, e.g. em Chem. Rev. 1980, 80, 187.

Os derivados podem também ser produzidos por conversão das ligações duplas em epóxidos por oxidação, e.g. com MCPBA, conforme foi descrito em Advanced Organic Synthesis, 4th Edition, J. March, John Wiley & Sons., 1992. A composição de teicoplanina pode ser uma composição farmacêutica de teicoplanina. Nesse caso, e.g. a composição de teicoplanina pode compreender opcionalmente transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Por "transportador farmaceuticamente aceitável" conforme aqui é utilizado entenda-se um ou mais diluentes de enchimento sólidos ou líquidos, compatíveis, ou substâncias formadoras de cápsulas. Por "compatível", segundo aqui é usado, entenda-se que os componentes da composição conseguem ser misturados sem interagirem de forma a diminuírem substancialmente a eficácia farmacêutica da composição total em situações de utilização vulgar. 10

ΕΡ 1 516 626 /PT

Alguns exemplos de substâncias que podem servir como transportadores farmacêuticos são sais; açúcares, tais como a lactose, glucose e sacarose; amidos como o amido de milho e o amido de batata; celulose e os seus derivados tais como a carboximetilcelulose sódica, etilcelulose e acetatos de celulose; goma adragante em pó; malte; gelatina; talco; ácidos esteáricos; estearato de magnésio; sulfato de cálcio; óleos vegetais, tais como os óleos de amendoim, óleos de sementes de algodão; óleo de sésamo; azeite; óleo de milho e óleo de teobroma; polióis tais como propilenoglicol, glicerina, sorbitol, manitol, e polietilenoglicol; ágar; ácidos alginicos; água; água sem pirogénios; salino isotónico; e solução tampão de fosfato; pulverizado de leite magro; assim como outras substâncias compatíveis, não tóxicas, usadas em formulações farmacêuticas.

Podem estar presentes, também, agentes molhantes, de enchimento e lubrificantes, tais como laurilsulfato de sódio; assim como agentes corantes, agentes aromatizantes, lubrificantes, excipientes, agentes de formação de comprimidos, estabilizantes, antioxidantes e conservantes. A composição farmacêutica de teicoplanina como a aqui descrita pode ser administrada por via intramuscular, intravenosa, oral ou por outra via de administração.

Uma composição farmacêutica de teicoplanina, como a aqui descrita, com outras substâncias farmaceuticamente activas pode ser preparada misturando os compostos activos com um ou mais auxiliares e/ou excipientes farmacologicamente tolerados tais como, por exemplo, substâncias de enchimento, emulsivos, lubrificantes, aromatizantes de disfarce, corantes ou tamponantes, e convertendo a mistura numa forma farmacêutica adequada tal como, por exemplo, comprimidos, comprimidos revestidos, cápsulas, grânulos, pós, emulsões, suspensões, ou soluções adequadas para administração parentérica.

Exemplos de auxiliares e/ou excipientes que podem ser mencionados são a goma adragante, lactose, talco, ágar, poliglicóis, etanol, e água. Para a administração parentérica são adequadas e preferidas as suspensões ou soluções em água. É também possível administrar as substâncias activas por exemplo, sem veículos ou diluentes, numa forma adequada, por exemplo, em cápsulas. 11

ΕΡ 1 516 626 /PT

De preferência, a composição de teicoplanina é na forma de um pulverizado (como um pó para injecção), em particular um pulverizado compreendendo cloreto de sódio ou glicose. Actualmente preferidos são os pós com cloreto de sódio (0,5% a 15%) .

De preferência, a composição farmacêutica de teicoplanina, conforme se descreve aqui, é proporcionada junto com instruções farmaceuticamente relevantes adequadas. As instruções explicam, preferencialmente, informações farmaceuticamente relevantes tal como e.g. a informação qualitativa e quantitativa da composição, forma farmacêutica, indicações terapêuticas e método de administração (incluindo doses recomendadas).

Utilização de uma composição farmacêutica de teicoplanina para o tratamento de uma infecção provocada por microorganismos num paciente

Uma composição farmacêutica de teicoplanina, como a que se descreve aqui, pode ser administrada a animais, tais como mamíferos, incluindo humanos, como fármacos por si só, em misturas com um outro, e na forma de composições farmacêuticas que permitam administração parentérica.

Consequentemente, o termo "paciente" refere-se a um animal, tal como um mamífero, incluindo um paciente humano. De preferência é um paciente humano.

Sabe-se que a teicoplanina é particularmente eficaz contra uma infecção com bactérias Gram-positivas, em particular com bactérias estafilococos.

Uma composição farmacêutica de teicoplanina pode ser administrada por via oral, intramuscular, intravenosa, ou por outra via de administração.

Como é hábito, a formulação galénica e o método de administração, assim como o intervalo de dosagem que se adequam, num caso específico, dependem da espécie a tratar e do estado do respectivo problema ou doença, e podem ser optimizados usando os métodos conhecidos na arte. O Compêndio de Medicina electrónico do Reino Unido refere em relação ao Targocid® que uma dose diária correcta 12

ΕΡ 1 516 626 /PT recomendável pode ser cerca de 3 mg de Targocid®/kg de peso de um adulto normal.

Consequentemente, em média, a dose diária de composição farmacêutica de teicoplanina num paciente pode ser de 0,05 mg/kg de peso a 50 mg/kg de peso, mais preferencialmente de 1 mg/kg de peso a 20 mg/kg. Método para produzir uma composição de teicoplanina com melhor actividade antibiótica:

Conforme foi anteriormente referido, um terceiro aspecto do invento refere-se a um método para produzir uma composição de teicoplanina com melhor actividade antibiótica compreendendo os seguintes passos: (i) produzir duas ou mais composições de teicoplanina compreendendo diferentes % (mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) no intervalo de 5% a 60%, medidas por análise por HPLC. (ii) analisar a actividade antibiótica das composições; (iii) identificar uma composição onde exista um efeito sinergético de TA2 e TA3 e que tenha uma actividade antibiótica melhorada desejada. A ideia global de fundo deste método refere-se ao efeito sinergético de TA2 e TA3 aqui identificado.

De preferência, no passo (i) produz-se duas ou mais composições de teicoplanina compreendendo diferentes % de (mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) no intervalo de 7,5% a 50%, mais preferencialmente no passo (i) produz-se duas ou mais composições de teicoplanina compreendendo diferentes %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) no intervalo de 15% a 40% e ainda mais preferencialmente no passo (i) produz-se duas ou mais composições de teicoplanina compreendendo diferentes %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) no intervalo de 20% a 40%.

De preferência, produz-se no passo (i) quatro ou mais das diferentes composições de teicoplanina.

Numa concretização preferida, a composição identificada do passo (iii) possui uma actividade antibiótica mais elevada do que uma composição correspondente de teicoplanina que tenha uma %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) de 6,5%, onde a actividade 13

ΕΡ 1 516 626 /PT antibiótica é medida por um teste microbiológico de difusão em ágar usando Staphylococcus aureus ATCC 6538 como estirpe de teste e onde a potência latente medida (UI por mg de TA2 + TA3/g de composição) é utilizada para calcular a actividade antibiótica. 0 teste e a potência latente devem ser efectuados, de preferência, como se descreveu anteriormente.

De preferência, o método para produzir uma composição de teicoplanina compreende ainda o seguinte passo: (iv) produzir uma composição farmacêutica de teicoplanina, compreendendo uma quantidade eficaz de componentes de teicoplanina ou um seu sal ou derivado farmaceuticamente aceitável e um transportador farmaceuticamente aceitável, onde a %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) da composição farmacêutica é uma % que corresponde à % da composição identificada do passo (iii) de acordo com o terceiro aspecto do invento. 0 termo "corresponde" no passo (iv) deve ser entendido de modo bastante amplo no sentido em que a % (mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) especifica da composição farmacêutica pode variar um pouco em relação à composição identificada do passo (iii) de acordo com o terceiro aspecto do invento. A % da composição identificada pode ser a % óptima no que diz respeito à actividade antibiótica. No entanto, o perito pode escolher modifica-la ligeiramente numa composição de teicoplanina especifica por diferentes razões, tal como e.g. economia de produção.

De preferência, a composição farmacêutica de teicoplanina do passo (iv) anterior é uma composição de teicoplanina que possui a característica de uma composição de teicoplanina de acordo com o primeiro aspecto e com as concretizações relacionadas do presente invento.

Um aspecto separado do invento refere-se a uma composição de teicoplanina como aqui se descreveu que foi obtida através de um método para produzir uma composição de teicoplanina como a aqui descrita.

Os peritos conhecem diferentes estratégias de rotina para produzir composições de teicoplanina compreendendo diferentes 14

ΕΡ 1 516 626 /PT %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2). Uma maneira é purificar TA3 a partir de e.g. uma composição comercial de teicoplanina e utilizar essa TA3 purificada para enriquecer uma composição de teicoplanina de interesse, para produzir uma composição com quantidades cada vez maiores de TA3. Ver aqui os exemplos de trabalho para uma ilustração disto. 0 TA2 pode ser transformado por hidrólise em TA3, onde o grupo N-acil-D-glucosamina com a cauda ácido gordo é removido da estrutura de base glicopéptido (ver aqui Figura 1) . Esta hidrólise é efectuada, preferencialmente, com o produto de teicoplanina bruto obtido por fermentação. A hidrólise pode ser ácida, básica ou enzimática, tal como a efectuada por meio de tratamento ácido (presentemente preferido em condições moderadas) e enzimas. Uma outra via que originará maiores quantidades de TA3 no produto de fermentação.

Consequentemente, um aspecto separado do invento refere-se a um método para produzir uma composição de teicoplanina compreendendo TA2 e TA3, enriquecida com TA3 (em comparação com o material inicial), compreendendo o referido método a hidrólise de uma composição contendo TA2 e TA3 (tal como uma composição (material inicial) que possua uma razão TA3/(TA2+TA3) (p/p) superior a 0,01; 0,03; 0,05; 0,07; 0,08; 0,09; 0,10; ou mesmo superior a 0,11 ou 0,12), e.g. por tratamento com um ácido ou uma enzima. O produto final possui preferencialmente uma razão inferior a 80%. De preferência, a hidrólise é realizada sobre uma composição de teicoplanina bruta obtida da fermentação, sem separação dos componentes teicoplanina TA2 e/ou TA3. A hidrólise é, de preferência, efectuada em condições moderadas, tal como em condições onde o pH é superior a 0, tal como superior a 1 ou 2, ou mesmo superior a 3. Quando a hidrólise é efectuada como hidrólise ácida, é actualmente preferido que a hidrólise seja efectuada a um valor de pH entre 0 e 5, ou usando ácido clorídrico a uma concentração entre 0,1 N e 1 N. A teicoplanina pode ser dissolvida num solvente orgânico polar (tal como num álcool) ou numa mistura com água durante a hidrólise. Um passo opcional do método para produzir a composição de teicoplanina compreende misturar uma composição que compreende TA3 e/ou TA2 com o produto de hidrólise, a fim de obter uma composição de teicoplanina padronizada. A composição adicionada pode ser ela própria produzida por hidrólise ou por fermentação. De modo 15

ΕΡ 1 516 626 /PT vantajoso, a hidrólise de TA2 em TA3 deve ser parcial, para se obter directamente uma composição de teicoplanina possuindo uma razão TA3/(TA2+TA3) desejada. A composição de teicoplanina, obtenível pelo método de acordo com o terceiro e quarto aspectos do invento, é também um aspecto do presente invento. A composição obtenível possui preferencialmente uma razão TA3/(TA2+TA3) (p/p) inferior a 0,95 (tal como inferior a 0,9; 0,8; 0,7: 0,6; 0,5; 0,4 ou mesmo inferior a 0,35) e de preferência uma razão TA3/(TA2+TA3) (p/p) superior a 0,05 (tal como superior a 0,07; 0,08, 0,09; 0,10; 0,11; 0,12; 0,13; 0,14; 0,15; 0,16; 0,17; 0,18; 0,19; 0,20; 0,21; 0,22; 0,23 ou mesmo superior a 0,25). Numa concretização preferida, a razão TA3/(TA2+TA3) (p/p) na composição de teicoplanina é superior a 5% mas inferior a 90%; e a razão TA3/(TA2+TA3) (p/p) é diferente de 6,5% (e.g. fora do intervalo de 6,25% a 6,75%, ou fora do intervalo de 6% a 7%) assim como diferente de 10% (e.g. fora do intervalo de 9,75% a 10,25%, ou fora do intervalo de 9,5% a 10,5%). TA3 é de preferência TA3-1 e/ou TA2 é preferencialmente a soma (TA2-1 + TA2-2 + TA2-3 + TA2-4 + TA2-5). Presentemente, a mais preferida é uma composição de teicoplanina de acordo com o primeiro aspecto do invento ou as suas concretizações conforme aqui se descreveu. EXEMPLOS:

Exemplo 1: Análise do efeito sinergético de TA3-1 e TA2-2 em diferentes composições.

1.1 MATERIAIS

1.2 EQUIPAMENTO

1.3 MÉTODOS 1.3.1 PURIFICAÇÃO DE TEICOPLANINA A3-1 1.3.2 PURIFICAÇÃO DE TEICOPLANINA A2-2

1.3.3 ANALISE POR HPLC

1.3.4 DETERMINAÇÃO DE POTÊNCIA 16

ΕΡ 1 516 626 /PT

2 RESULTADOS

3 DISCUSSÃO

4 CONCLUSÃO

1.1 MATERIAIS

Utilizam-se as seguintes fontes de teicoplanina.

Fontes Nome Lote Aventis Targocid 031951 e 021972 Alpharma Lotes in house Richet Teicoplanina 22188 Xinchang Pharma (China) Bulk Teicoplanin 991022-6 WHO*’ Padrão Internacional WHO/NIBSC 90/704 *) É utilizado, para análise, um padrão de trabalho que foi calibrado com o padrão internacional de WHO. A menos que se especifique algo em contrário, todos os outros materiais descritos nos exemplos são quimicos padrão de laboratório. 1.2 Equipamento A menos que se especifique algo em contrário, todo o equipamento descrito nos exemplos é equipamento padrão de laboratório relevante. 1.3 Métodos 1.3.1 Purificação de teicoplanina A3-1

Para preparar um produto bruto com maior teor de TA3-1 (produzido por Alpharma) converteu-se teicoplanina TA2 em solução de etanol a 50%, por hidrólise ácida (adicionou-se HC1 1M, resultando pH=0,6) a temperaturas elevadas numa mistura bruta de TA2 e TA3 (incluindo a TA3-2 e a T-aglicona) e secou-se por congelação. 17

ΕΡ 1 516 626 /PT

Para preparar TA3-1 puro, purificou-se material chinês por HPLC de fase reversa preparativa em C18. Apurou-se a solução resultante por HPLC de fase normal para remover o sal em excesso e secou-se para formar um pó. Confirmou-se a identidade dos componentes por FIA-LC-MS. 1.3.2 Purificação de teicoplanina A2-2

Preparou-se o componente TA2-2 puro, utilizando os mesmos métodos utilizados para ο TA3-1. 1.3.3 Analise por HPLC para a determinação de actividade 0 método de HPLC vulgarmente utilizado no laboratório de processo a jusante:

Coluna: Pré-coluna RP18 Waters Xterra®, 3,5 pm, 4,6 χ 150 mm

Coluna de Guarda RP18 Waters xterra®, 5 pm, 3,9 χ 20 mm

28 °C

Forno da Coluna:

Tampão: formato de amónio a 0,2%, pH 7,0

Dissolveu-se 4,0 g de formato de amónio em aproximadamente 2L de água Milli-Q. Ajustou-se o pH para 7,0 com NH3. Ajustou-se o volume total com exactidão para 2,0 L com água Milli-Q. Filtrou-se o tampão através de um filtro de 0,45 pm antes da utilização.

Fase Móvel: Eluente A: 90% de Tampão 10% de acetonitrilo (ACN) Eluente B: 35% de tampão

65% de ACN O gradiente de fase móvel está apresentado no Quadro 1. 18

ΕΡ 1 516 626 /PT

Quadro 1: Gradiente utilizado para a análise por HPLC

Passo Tempo (min) Caudal (ml/min) % de A v/v % de B v/v Curva1 0 0 1,5 85 15 6 1 1 1,3 73 27 6 2 3,5 1,3 72 28 11 3 13 1,5 60 40 6 6 13,5 1,5 0 100 6 7 15 1,5 0 100 6 8 16 1,5 85 15 6 9 23 1,5 85 15 6 10 30 0, 05 85 15 6 1 6 Refere-se a um gradiente linear passo atrasado e 11 refere -se a um gradiente do

Detecção: UV, 280 nm

Padrão: Targocid, 0,210 g/1.

Injectou-se de 10 a 200 μΐ, correspondendo a 2,1-42 pg, de teicoplanina A2 para uma curva de calibração de 5 pontos, registada no inicio da sequência e após todas as 30.aS amostras. Aceitou-se uma variância nas respostas (= à área total dos cinco componentes TA2) até +/- 3%. Aceitou-se também uma variância no tempo de retenção até 10%.

Preparação de amostras a jusante

Diluiram-se amostras liquidas com tampão de HEPES 25 mM, pH 7, até aproximadamente 0,25 - 2 g/1 e injectaram-se 20 μΐ da amostra diluida. Prepararam-se as soluções usadas para as determinações de potência e injectaram-se directamente 20 μΐ. Pesaram-se os pós, aproximadamente 25 mg, para um copo de medida de 25 ml e dissolveram-se em tampão HEPES 25 mM, pH 7 e injectaram-se 20 μΐ.

Preparação do tampão HEPES: dissolveu-se 2,98 g de HEPES em aproximadamente 450 ml de água Milli-Q. Ajustou-se o pH para 7,0 com NaOH. Ajustou-se o volume total para exactamente 500 ml com água Milli-Q. 19

ΕΡ 1 516 626 /PT

Fez-se automaticamente a integração dos cromatogramas no intervalo de 3 a 13 minutos pela "linha de base vale a vale" com o software da Waters Millenium e registaram-se as áreas dos picos de TA3-1, TA2-1, TA2-2, TA2-3, TA2-4 e TA2-5 definidos. 0 software efectuou automaticamente todos os cálculos de massas (mg de actividade/g de pó) utilizando a curva de calibração para a TA2 e a sequência de informação sobre o peso das amostras e diluições. Utilizou-se a área combinada dos cinco componentes TA2 para os cálculos do teor de mg de TA2/g de pó. Para calcular o teor de TA3-1, multiplicou-se a área desse pico por um factor de 0,83 para compensar o menor peso molecular de TA3-1. Calculou-se manualmente a distribuição de percentagens de TA3-1 e TA2 dividindo a respectiva massa de TA3-1 e TA2, respectivamente, pela massa total, i.e. mg de (TA3-l)/mg de (TA3-1 + TA2). 1.3.4 Determinação da potência

Determinou-se a potência da teicoplanina TA2, TA3-1 individualmente ou em combinações por testes de difusão em ágar. Para além disso, investigou-se o efeito antimicrobiano de produtos puros ou contaminados através da determinação da concentração inibitória mínima (MIC) por um teste de "MIC" modificado em tabuleiros de microtitulação. 1.3.4.1 Determinação por difusão em ágar

Potência Microbiológica por difusão em ágar

Efectuou-se o teste de potência em conformidade com o "Teste microbiológico, teicoplanina" a seguir descrito. O método do teste corresponde geralmente a USP 25 e Ph. Eur 4a. ed., mas difere de ambos no que diz respeito à estirpe de teste e da USP 25 no que diz respeito aos orifícios do ágar (tanques) quando preferidos aos cilindros. Realiza-se o teste na forma de concepção 2,2 conforme está descrito na secção <111> do USP. 20

ΕΡ 1 516 626 /PT

Materiais e equipamento especifico

Meio: Nutriente Antibiótico da arte de ágar (Difco) : 0001-01-8.

Tampão: Organismo Teste:

Tampão fosfato 0,2 M, pH 8,0 de Staphylococcus aureus ATCC 6538 ou Bacillus subtilis ATCC 6633.

Padrão Padrão de trabalho calibrado com o padrão de

Antibiótico: USP e o padrão de Ph. Eur. Alternativamente padrão de referencia USP ou Ph.Eur.

Placas Vidro com moldura de alumínio (28,5x28,5 cm).

Grandes:

Procedimento

Pesagem e dissolução de padrão e amostras para soluções de reserva, aproximadamente 900 Ul/ml.

Padrão de teicoplanina: aproximadamente 25,0 mg em 4,0 ml de água e tampão ad 25,0 ml.

Amostra: aproximadamente 25,0 mg em 4,0 ml de água e tampão ad 25,0 ml. Ajustar a quantidade de amostra em conformidade com a real quantidade de padrão pesado.

Diluir o padrão e amostra com tampão, para as seguintes concentrações: teste de 2 pontos.

Solução 1 Elevada: Aproximadamente 400 Ul/ml,

Solução 2 Baixa: Aproximadamente 100 Ul/ml,

Aplicar nas placas em conformidade com uma concepção de quadrado latino 8x8.

Imediatamente após a aplicação, colocar as placas na incubadora a 34,0°C ± 2°C, durante 16-18 horas.

Resultados

Ler cuidadosamente os diâmetros da zona com uma ampliação de 10x e uma precisão de 0,1 mm. 21

ΕΡ 1 516 626 /PT

Análise estatística: para os cálculos e validação, seguir as linhas orientadoras estabelecidas em Ph. Eur. e em USP. Utilizar um programa de computador para todos os cálculos.

Nas experiências de dopagem (spiking) a quantidade da amostra investigada (quantidade de pó pesado) foi reduzida e substituída por uma quantidade correspondente de material de dopagem ou misturaram-se soluções de reserva em razões definidas.

1.3.4.2 Determinação de valores de MIC

Utilizou-se T3-1 pura (teicoplanina R59.193.9 96% de TA2-X, 4% de TA3-1) e suas misturas. A estirpe de teste utilizada foi a S. aureus ATCC 6538 em concentrações finais de 5xlOs/ml e 5xl04/ml respectivamente. Realizou-se o teste em tabuleiros de microtitulação como alteração a um teste de MIC vulgar. Em vez de se utilizar duplas diluições, utilizou-se 0,40-1,20 pg/ml com divisões de 0,20 μΐ e 1,0-4,0 μΐ/ml com divisões de 1,0 μΐ. Incubaram-se os tabuleiros a 37°C. Examinaram-se os poços após 24 horas e anotou-se qualquer crescimento visível. Definiu-se o valor "MIC" como a menor concentração de teicoplanina que não apresentou crescimento visível. 2. Resultados

Realizou-se uma série de experiências de dopagem com diferentes níveis de TA3-1 e determinou-se a potência das misturas resultantes por difusão em ágar. Os resultados estão resumidos no Quadro 2. 22

ΕΡ 1 516 626 /PT

Quadro 2: Resultados de experiências de dopagem

Amostra Teor de TA2 mg/g de pó Teor de TA3 mg/g de pó Potência UI/mg de pó Potência latente UI/mg de (TA2 + TA3-1) Padrão de trabalho de Targocid 690 48 917 1243 TA3-1 TKO-002-03-0 4 1 829 570 687 Richet 612 32 811 1226 Richet 605 32 761 1195 Richet + 5% de TA3-1 627 67 856 1233 Richet + 10% de TA3-1 601 96 896 1286 Richet + 15% de TA3-1 562 142 987 1402 Richet + 20% de TA3-1 528 183 1054 1482 Richet + 25% de TA3-1 504 214 1068 1487 R59.174.NaCl 585 27 745 1217 R59.174.NaCl + 11,8% de TA3-1 890 R59.174.NaCl + de 13,5% TA3-1 581 156 980 1330 R59.174.NaCl + 20% de TA3-1 555 222 1020 1312 R59.174.NaCl + 21,1% de TA3-1 965 R59.193.9 731 27 828 1092 R59.193.9 + 5% de TA3-1 705 68 930 1204 R59.195.28 788 19 982 1217 R59.195.28 + 5% de TA3-1 750 55 988 1227 R59.195.28 + 10% de TA3-1 721 96 1061 1299 R59.195.28 + 15% de TA3-1 680 132 1124 1384 R59.195.28 + 20% de TA3-1 632 177 1163 1438 R59.195.28 + 25% de TA3-1 584 224 1214 1502 TA2-2 TKO-002-03-05 770 23 807 1017 TA2-2 + 5% TA3-1 744 65 874 1080 TA2-2 + 10% TA3-1 694 106 955 1194 TA2-2 TKO-002-03-05 767 14 776 994 TA2-2 + 5% de TA3-1 785 49 853 1023 TA2-2 + 10% de TA3-1 753 81 886 1062 TA2-2 + 15% de TA3-1 709 121 990 1193 TA2-2 + 20% de TA3-1 6 6 6 16 6 1065 1280 TA2-2 + 25% de TA3-1 1093 TA2 é o teor total de TA2-1 a TA2-5, e TA3 é o teor de TA3-1.

Todas as experiências de dopagem revelaram claramente um efeito sinergético de TA3-1 nos testes de potência por difusão em ágar. Para reforçar a evidência, realizaram-se algumas 23

ΕΡ 1 516 626 /PT experiências com uma análise antimicrobiana modificada de teicoplanina, dopada com diferentes quantidades de TA3-1. Realizou-se em meio liquido ao contrário dos testes de difusão em ágar e determinou-se os valores de MIC. Os resultados encontram-se resumidos no Quadro 3.

Quadro 3: Valores de "MIC" de teicoplanina e/ou TA3-1 sobre S.aureus ATCC6538

Amostra MIC (ug/ml) MIC teg/ml) 5xl05/ml S.aureus 5xl04/ml S.aureus R59.193.9 (a) 0,6 O 1 o TA3-1 (b) 2-3 2-3 90% de (a) + 10% de (b) O 1 o 0,4 3. Discussão

Os resultados deste estudo indicam uma potência muito menor de TA3-1 (570 Ul/mg de pó) do que a de TA2-2 (807 Ul/mg) . Adicionando apenas o efeito do teor de A3-1 em produtos de potência elevada não explicaria, portanto, só por si, a potência mais elevada. A única explicação razoável seria que ο TA3 adiciona um efeito sinergético.

Neste estudo adicionámos diferentes quantidades de TA3 a uma gama de diferentes produtos de teicoplanina, incluindo o componente individual TA2-2 purificado, com potências microbianas variáveis só. A substituição de 5 a 25% de amostra de teicoplanina com a quantidade correspondente de TA3-1 aumentou invariavelmente a potência microbiana da amostra, medida em Ul/mg de pó. Os dados também provaram que o potencial (= à quantidade real de teicoplanina no pó) aumentou quando ο TA2 activo foi substituído por TA3-1 pouco activo, indicando um efeito sinergético entre TA2 e TA3. Os resultados podem ser visualizados numa representação gráfica conforme mostra a Figura 3 aqui.

Comparando as potenciais potências (Ul/mg de TA2+TA3-1) na Figura 3, é visível um efeito sinergético de TA3-1 com os outros componentes de teicoplanina na representação. Mesmo os produtos com potência elevada são melhores quando algum do TA2 é substituído com TA3-1. 24

ΕΡ 1 516 626 /PT

Como também pode ser observado a partir da Figura 3, o efeito sinergético parece ocorrer quando a razão de TA3-1 para ο TA2 + TA3-1 total é superior a 5% e aumentar constantemente até pelo menos cerca de 25 a 30% onde pode subsistir ligeiramente embora não se tenha investigado outra dopagem.

Os resultados da determinação de MIC apoiaram as constatações dos testes de difusão em ágar. O efeito antimicrobiano individual do TA3-1 sobre S. aureus foi muito menor do que o da teicoplanina. 4. Conclusão

Ao longo deste estudo reunimos provas do efeito sinérgico proposto entre as teicoplaninas A2 e A3. O mecanismo dessa sinergia ainda não é clara, mas as determinações por difusão em ágar e de MIC de amostras puras e dopadas mostraram que existe um verdadeiro efeito sinergético entre ο TA3 e ο TA2. REFERÊNCIAS:

Referência 1: Goldstein, B. et al, (1994), Teicoplanin in Glycopeptide Antibiotics, ed. Nagarajan, R., Mareei Dekker, Inc., N.Y, N.Y., Chapter 8, pp. 273-307.

Referência 2: Parenti, F. et al, (2000), Teicoplanin

Chemistry and Microbiology, J. Chemotherapy, 12: 5-14.

Referência 3: Yao, R.C. and Crandall, L.W., (1994),

Glycopeptides, Classification, Occurrence, and Discovery in Glycopeptide antibiotics, ed. Nagarajan, R., Mareei Dekker, Inc., N.Y, N.Y., Chapter 1, pp. 1-27.

Referência 4: Janknegt, R., (1991), Teicoplanin in

Perspective, Pharmaceutisch Weekblad Scientific Edition, 13: 153-160.

Referência 5: Reynolds P.E., (1989), Structure,

Biochemistry and Mechanism of Action of Glycopeptide Antibiotics, Review, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., vol. 8, No. 11: 943-950.

Referência 7: Malabarba, A. et al. (1984), Teicoplanin, Antibiotics from Actinoplanes teichomyceticus nov. sp., VI. 25

ΕΡ 1 516 626 /PT

Chemical Degradation: Physico-chemical and Biological

Properties of Acid Hydrolysis Products, The Journal of Antibiotics, Vol. XXXVII, no 9, 988-999.

Referência 8: Malabarba, A. et al.r (1987), Glycopeptide Antibiotic L 17054, US 4,645,827

Referência 9: US4239751

Referência 10: US4994555

Referência 11: Coronelli, C. et al: "Teicoplanin:

Chemical, physicochemical and biological aspects" Farmaco, Edizione Scientifica, (1987), 42(10), 767-86.

Lisboa,

Claims (8)

1. ΕΡ 1 516 626 /PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Composição de teicoplanina, compreendendo uma quantidade eficaz de componentes de teicoplanina ou de um seu sal, onde a composição compreende uma %(mg de TA3)/(mg de TA3 + mg de TA2) no intervalo de 16% a 55%, medida por análise de HPLC.
2. 2. Composição de teicoplanina de acordo com a reivindicação 1, onde TA2 é o total dos componentes de teicoplanina TA2-1 a TA2-5 e onde TA3 é o componente teicoplanina TA3-1.
3. 3. Composição de teicoplanina de acordo com as reivindicações 1 ou 2, onde a composição compreende uma %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) no intervalo de 18% a 40%, medida por análise de HPLC.
4. 4. Composição de teicoplanina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, onde a composição possui uma actividade antibiótica mais elevada do que uma composição de teicoplanina correspondente que possui uma %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) de 6,5%, onde a actividade antibiótica é medida por um teste microbiológico de difusão em ágar usando como estirpe de teste Staphylococcus aureus ATCC 6538 e onde a potência latente medida (UI por mg de TA2 + TA3) é utilizada para calcular a actividade antibiótica.
5. 5. Composição de teicoplanina de acordo com a reivindicação 4, onde a potência latente da composição de teicoplanina é pelo menos 30 UI superior à composição de teicoplanina correspondente que possui uma %(mg de TA3)/(mg de TA3 + TA2) de 6,5%.
6. 6. Utilização de uma composição de teicoplanina de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma infecção provocada por microorganismos num paciente, tal como uma infecção provocada por bactérias Gram-positivas, em particular bactérias estafilococos.
7. 7. Método para produzir uma composição de teicoplanina compreendendo TA2 e TA3, compreendendo o referido método a hidrólise de uma composição contendo TA2, e.g. por tratamento ΕΡ 1 516 626 /PT 2/2 com um ácido ou uma enzima, onde a composição de teicoplanina possui uma razão TA3-1/(TA2+TA3-1) (p/p) no intervalo de 16% a 55%.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, onde a hidrólise é realizada numa composição de teicoplanina bruta obtida por fermentação, sem separação dos componentes de teicoplanina TA2 e TA3. Lisboa,