DE60310717T2

DE60310717T2 - Teicoplanin-Zubereitung mit verbesserter antibiotischer Wirkung

Info

Publication number: DE60310717T2
Application number: DE60310717T
Authority: DE
Inventors: Trine Suhr-Jessen; Torben Koch; Jorn Thyme; Anita Mathiesen; Tiemen Geen Pieter Reijns
Original assignee: Alpharma ApS
Current assignee: Xellia Pharmaceuticals ApS
Priority date: 2003-09-17
Filing date: 2003-09-17
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2023-09-18
Also published as: WO2005025599A1; CN1871023A; US20070287663A1; EP1516626B1; EP1670496A1; ES2421598T3; DK1516626T3; CN1871023B; EP1516626A1; US7919470B2; EP1670496B1; PT1516626E; CA2538842A1; AU2004271688B2; JP2007505841A; SI1516626T1; ES2278101T3; CA2538842C; NO20061368L; AU2004271688A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG:
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Teicoplaninzusammensetzung mit verbesserter antibiotischer Aktivität, deren Verwendung als ein Pharmazeutikum sowie ein Verfahren zur Herstellung einer Teicoplaninzusammensetzung mit verbesserter antibiotischer Aktivität.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG:
Teicoplanin ist ein Glykopeptidantibiotikum, das von Actinoplanes teicomyceticus produziert wird und im Verlauf eines wissenschaftlichen Forschungsprogramms entdeckt wurde, welches zum Ziel hatte, neue Moleküle mikrobiellen Ursprungs zu finden, die die bakterielle Zellwandsynthese inhibieren (Referenz 1). Es wurde erstmals im Jahr 1978 beschrieben und zehn Jahre später in Italien in die klinische Praxis eingeführt (Referenz 2). Gemäß Lancini (Referenz 3) können Glykopeptidantibiotika aufgrund ihrer chemischen Struktur in vier Gruppen klassifiziert werden:

Gruppe I (oder der Vancomycin-Typ) weist aliphatische Aminosäuren an den Positionen 1 und 3 auf;
Gruppe II (oder der Avoparcin-Typ) weist aromatische Aminosäurereste an den Positionen 1 und 3 auf;
Gruppe III (oder der Ristocetin-Typ) ist ähnlich wie die Gruppe II bis auf eine Etherverbindung, die die aromatischen Aminosäuren an den Positionen 1 und 3 verbindet
Gruppe IV (oder der Teicoplanin-Typ) besitzt die gleiche Aminosäureanordnung wie die Gruppe III und darüber hinaus einen am Aminozucker befestigten Fettsäurerest.

Teicoplanin hat viele chemische und mikrobiologische Eigenschaften mit Vancomycin gemeinsam, es weist jedoch eine höhere Aktivität gegen viele grampositive Bakterien auf und ist weniger nephrotoxisch (Referenz 2 und Referenz 4).
Die molekulare Struktur von Teicoplanin ist hierin in 1 dargestellt. Wie alle Glykopeptidantibiotika enthält Teicoplanin im Kern ein lineares Heptapeptid, in dem fünf der sieben Aminosäuren in allen Mitgliedern seiner Gruppe vorkommen. Die verbleibenden zwei (Positionen 1 und 3) sind durch eine Etherbindung miteinander verbunden (Referenz 3). An den Arylgruppen der Aminosäuren 7, 6 und 4 sind drei Zuckerreste befestigt, nämlich eine D-Mannose, ein N-Acetyl-D-Glucosamin bzw. ein N-Acyl-D-Glucosamin. Diese Zucker weisen in vitro keine biologische Aktivität auf, sind aber bei der Vermittlung von verschiedenen pharmakokinetischen Eigenschaften von Bedeutung (Referenz 5).
Teicoplanin umfasst verschiedenen Komponenten, einschließend fünf eng miteinander verwandte Moleküle, bezeichnet als Teicoplanin A2-1 (TA2-1) bis Teicoplanin A2-5 (TA2-5), die sich lediglich hinsichtlich der Beschaffenheit des Acylrestes (C₁₀- und C₁₁-Fettsäuren) unterscheiden; RS-1 bis RS-4; eine polarere Komponente Teicoplanin A3-1 (TA3-1), welcher der N-Acyl-D-Glucosaminrest fehlt, und Teicoplanin TA3-2, welchem auch die D-Mannose-Gruppe fehlt. Substitution der Zuckerreste durch Wasserstoffe ergibt das Kernaglykon, das als eine Teicoplanin A3-Komponente angesehen wird. Die molekularen Strukturen der unterschiedlichen Komponenten sind hierin in 2 dargestellt.
Referenz 7 offenbart, dass Teicoplanin ein antibiotischer Komplex ist bestehend aus fünf eng verwandten Faktoren, die in Pseudoaglikone transformiert werden können und letztlich in ein einzelnes Aglikon mit aufeinanderfolgender Entfernung von drei Zuckereinheiten durch Säurehydrolyse.
US 4239751 (Referenz 9) beschreibt die Isolierung von verschiedenen Teicoplaninkomponenten. Tabelle IV zeigt, dass TA3 eine geringere antibiotische Aktivität aufweist als TA2.
In US 4994555 (Referenz 10) heißt es in Spalte 2, Zeilen 51-53: "Wie entsprechend seiner biologischen Verwendung eingesetzt, besteht Teicoplanin im wesentlichen aus dem Faktor A2 (T-A2), begleitet von einer geringeren Menge des Faktors A3 (T-A3)".
Referenz 11 offenbart Strukturbestimmung und physikochemische Eigenschaften von Teicoplanin.
Targocid^® ist ein kommerzielles Teicoplaninprodukt von Aventis Pharma.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Teicoplaninzusammensetzung mit verbesserter antibiotischer Aktivität bereitzustellen.
Die Lösung dieser Aufgabe basiert auf der Feststellung der Erfinder der vorliegenden Erfindung, dass durch die Herstellung einer Teicoplaninzusammensetzung mit einem geeigneten Verhältnis der Mengen an TA2 und TA3 ein positiver synergistischer Effekt erzielt werden kann. Die experimentelle Arbeit der Erfinder bestätigte den Stand der Technik dahingehend, dass relativ reines TA3 an sich eine geringere biologische Aktivität aufweist als TA2 an sich. Trotzdem stellten die Erfinder verschiedene Teicoplaninzusammensetzungen her, zu denen sie immer größere Mengen von TA3 hinzufügten, um ein erhöhtes TA3:TA2-Verhältnis zu erhalten. Entgegen dem Stand der Technik fanden sie, dass es innerhalb eines bestimmten Bereichs von % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) aufgrund eines synergistischen Effekts von TA2 und TA3 in der Zusammensetzung möglich war, eine Teicoplaninzusammensetzung mit einer verbesserten antibiotischen Aktivität herzustellen.
3 ist ein Graph, der ein erläuterndes Beispiel dafür zeigt. Das kommerzielle Teicoplaninprodukt Targocid^® wurde als Bezugszusammensetzung verwendet. Basierend auf einem Standardverfahren, das im Stand der Technik als HPLC-Analyse von Targocid^® bekannt ist, wurde bestimmt, dass Targocid^® % (mg TA3-1)/(mg TA3-1 + TA2) von etwa 6,5% aufweist. Die Daten aus 3 zeigen, dass es durch Beimischen von TA3-1 möglich war, eine Teicoplaninzusammensetzung mit einer höheren antibiotischen Aktivität als Targocid^® herzustellen. Genauer gesagt, innerhalb eines Bereichs von % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) zwischen 6,75% und 60% wiesen die getesteten Zusammensetzungen eine deutlich höhere antibiotische Aktivität auf als Targocid^®.
Um TA2- und TA3-Komponenten aufzureinigen, analysierten die Erfinder der vorliegenden Erfindung (mittels HPLC) eine Teicoplaninzusammensetzung von Xingchang Pharma (China). Diese Zusammensetzung wies % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) von etwa 10% auf.
Den Erfindern der vorliegenden Erfindung sind keinerlei andere öffentlich bekannte und kommerziell relevante pharmazeutische Teicoplaninzusammensetzungen mit % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) von mehr als 10% bekannt.
Dementsprechend betrifft ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Teicoplaninzusammensetzung umfassend eine wirksame Menge von Teicoplaninkomponenten oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder Derivats davon sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei die Zusammensetzung % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) in einem Bereich zwischen 11% und 60% umfasst.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer pharmazeutischen Teicoplaninzusammensetzung gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Infektion durch Mikroorganismen in einem Patienten.
Wie oben erläutert, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass es möglich ist, eine Teicoplaninzusammensetzung herzustellen, die einen positiven synergistischen Effekt von TA2 und TA3 aufweist. Von dieser Lehre kann Gebrauch gemacht werden, um eine Teicoplaninzusammensetzung mit verbesserter antibiotischer Aktivität herzustellen.
Dementsprechend betrifft ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Teicoplaninzusammensetzung mit verbesserter antibiotischer Aktivität umfassend die folgenden Schritte:

(i) Herstellung von zwei oder mehreren Teicoplaninzusammensetzungen umfassend verschiedene % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) in einem Bereich zwischen 5% und 60%, gemessen mittels HPLC-Analyse;
(ii) Analyse der antibiotischen Aktivität der Zusammensetzungen;
(iii) Identifizierung einer Zusammensetzung, die einen synergistischen Effekt von TA2 und TA3 sowie eine erwünschte verbesserte Aktivität aufweist.

Ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Teicoplaninzusammensetzung umfassend TA2 und TA3, wobei besagtes Verfahren die Hydrolyse einer TA2 enthaltenden Zusammensetzung umfasst, beispielsweise mittels Behandlung mit einer Säure oder einem Enzym.
ZEICHNUNGEN:
1: Molekulare Struktur des Teicoplaninkomplexes.
2: Molekulare Struktur der verschiedenen Teicoplaninkomponenten.
3: Graphische Darstellung von Daten, die zeigt, dass es durch Beimischung von TA3-1 möglich war, eine Teicoplaninzusammensetzung mit einer höheren antibiotischen Aktivität als Targocid^® herzustellen. Für nähere Details siehe Abschnitt 3 des hierin angeführten Beispiels 1.
4: Zeigt das HPLC-Diagramm von Targocid^®, einer Teicoplaninzusammensetzung (Richet) und einer Teicoplaninzusammensetzung, die hierin in den Arbeitsbeispielen detaillierter beschrieben wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:
Teicoplaninzusammensetzung:
Der Begriff TA2 ist eine gebräuchliche Kurzbezeichnung für Teicoplanin A2. Hierin umfasst dieser Begriff Teicoplanin mit drei Kohlenwasserstoffresten, so wie die fünf eng miteinander verwandten Moleküle, bezeichnet als Teicoplanin A2-1 (TA2-1) bis Teicoplanin A2-5 (TA2-5), sowie RS-1 bis RS-4. Der Begriff TA2 umfasst ebenfalls Derivate davon, so wie Derivate, die bezüglich des Substituenten R verändert wurden (siehe 1). Beispiele für R werden im Stand der Technik gegeben und sind dem Fachmann bekannt. Beispiele für molekulare Strukturen verschiedener TA2-Komponenten sind hierin in 1 und 2 gezeigt. Vorzugsweise bezeichnet der Begriff TA2 hierin die Teicoplaninkomponenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Teicoplanin A2-1 (TA2-1) bis Teicoplanin A2-5 (TA2-5) und RS-1 bis RS-4, oder der Begriff bezeichnet die Summe von zwei oder mehreren Teicoplaninkomponenten mit drei Kohlenwasserstoffresten, so wie die Summe der 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder mehr der in der Zusammensetzung überwiegend vorhandenen Teicoplanine. Noch bevorzugter bezeichnet der Begriff TA2 hierin die Teicoplaninkomponenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Teicoplanin A2-1 (TA2-1) bis Teicoplanin A2-5 (TA2-5), oder die Summe derselben, d.h. die Teicoplanin A2-Gruppe (A2-1 + A2-2 + A2-3 + A2-4 + A2-5). Noch mehr bevorzugt bezeichnet der Begriff TA2 hierin lediglich die Teicoplaninkomponente TA2-2.
Der Begriff TA3 ist eine gebräuchliche Kurzbezeichnung für Teicoplanin A3. Hierin umfasst dieser Begriff Teicoplaninkomponenten mit zwei (z. B. TA3-1), einem (z. B. TA3-2) oder keinem Kohlenwasserstoffrest (z. B. Teicoplanin-Aglycon), entweder einzeln oder in Kombination (z. B. die Menge aller Teicoplanine mit zwei oder weniger Kohlenwasserstoffresten oder die Summe von TA3-1 und TA3-2). Bevorzugt bezeichnet der Begriff TA3 hierin lediglich die Teicoplaninkomponente TA3-1. Die molekularen Strukturen von TA3-1, bei dem es sich um die gegenwärtig bevorzugte TA3-Komponente handelt, und TA3-2 sind hierin in 1 und 2 gezeigt.
Die spezifischen Mengen von TA3 und TA2 in der Zusammensetzung können mittels eines beliebigen geeigneten Verfahrens bestimmt werden; gegenwärtig wird die HPLC-Analyse bevorzugt. Kurz gesagt umfasst eine solche HPLC-Analyse die folgenden Schritte: (i) Vorliegen einer geeigneten Probenlösung einer spezifischen Menge der Zusammensetzung, (ii) Durchführung des HPLC-Tests mit einer geeigneten Menge der Probenlösung gemäß geeigneten Standardbetriebsbedingungen und Messung der Spitzenbereiche von TA2 und TA3 mittels eines geeigneten automatischen Integrationsverfahrens.
Ein geeignetes bevorzugtes HPLC-Analyseprotokoll ist hierin in Abschnitt 1.3.3 von Beispiel 1 gegeben. Ein typisches HPLC-Diagramm ist in 4 dargestellt. 4 zeigt das HPLC-Diagramm von Targocid^®, einer Teicoplaninzusammensetzung (Richet) und einer Teicoplaninzusammensetzung, die hierin in den Arbeitsbeispielen detaillierter beschrieben ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Teicoplaninzusammensetzung % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) in einem Bereich zwischen 13% und 50%, gemessen mittels HPLC-Analyse, mehr bevorzugt umfasst die Teicoplaninzusammensetzung % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) in einem Bereich zwischen 15% und 40%, gemessen mittels HPLC-Analyse, noch bevorzugter umfasst die Teicoplaninzusammensetzung % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) in einem Bereich zwischen 18% und 40% und am meisten bevorzugt umfasst die Teicoplaninzusammensetzung % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) in einem Bereich zwischen 20% und 40%. Andere Beispiele für Prozentbereiche haben als untere Grenze einen Wert ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Werten: 12%; 14%; 16%; 17%; 19%; 21%; 22%; 23%; 24% oder 25%, und als obere Grenze einen Wert ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Werten: 35%; 45%; 50%; 55%; oder 30%; diese Werte können zur Abgrenzung von Bereichen beliebig miteinander kombiniert werden.
Bevorzugt umfasst die Teicoplaninzusammensetzung mehr als 600 mg Trockenmasse von aktiven TA2- und TA3-Komponenten pro g Trockenmasse der Zusammensetzung.
Es kann bevorzugt sein, die Teicoplaninzusammensetzung in einer relativ großen Menge herzustellen, um beispielsweise die Teicoplaninzusammensetzung als ein sogenanntes Massenprodukt bereitzustellen. Solch ein Massenprodukt kann beispielsweise dazu verwendet werden, verschiedene einzelne pharmazeutische Teicoplaninzusammensetzungen herzustellen. Dementsprechend kann es bevorzugt sein, dass die Teicoplaninzusammensetzung ein Gesamtgewicht der Zusammensetzung von wenigstens 100 g, mehr bevorzugt von wenigstens 500 g aufweist. Die einzelne pharmazeutische Zusammensetzung weist bevorzugt einen Gehalt von 1 mg bis 1.000 mg Teicoplanin auf.
Wie zuvor erläutert wurde die kommerzielle pharmazeutische Teicoplaninzusammensetzung Targocid^® als Referenz in den hierin beschriebenen experimentellen Beispielen verwendet und, basierend auf den festgestellten synergistischen Effekten von TA2 und TA3, waren die Erfinder der vorliegenden Erfindung routinemäßig dazu in der Lage, Zusammensetzungen mit einer besseren antibiotischen Aktivität als Targocid^® herzustellen. Gemessen mittels des HPLC-Analyseprotokolls aus Abschnitt 1.3.3 des nachfolgenden Beispiels 1 weist Targocid^® % (mg TA3-1)/(mg TA3-1 + TA2) von 6,5% auf.
Dementsprechend betrifft eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine wie hierin beschriebene Teicoplaninzusammensetzung, wobei die Zusammensetzung eine bessere antibiotische Aktivität aufweist als eine entsprechende Teicoplaninzusammensetzung, die % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) von 6,5% aufweist, wobei die antibiotische Aktivität mittels eines mikrobiologischen Agardiffusionsassays unter Verwendung von Staphylococcus aureus ATCC 6538 als Teststrang gemessen wird und die antibiotische Aktivität anhand der gemessenen potentiellen Wirksamkeit (IU pro mg TA2 + TA3/g Zusammensetzung) berechnet wird.
Ein geeigneter mikrobiologischer Agardiffusionsassay wird hierin in Abschnitt 1.2.4.1 von Beispiel 1 bereitgestellt.
Die der Einheit der potentiellen Wirksamkeit (IU pro mg TA2 + TA3) zugrunde liegende Logik kann anhand der Tabelle 2 aus Abschnitt 2 des hierin angeführten Beispiels 1 veranschaulicht werden. Dabei ist zu erkennen, dass die antibiotische Wirksamkeit für die Zusammensetzung als solche gemessen wird (IU/mg Zusammensetzung). Da die in der Zusammensetzung vorliegenden Mengen von TA2 und TA3 ebenfalls bekannt sind, ist es möglich, die potentielle Wirksamkeit (IU pro mg TA2 + TA3) so wie in Tabelle 2 durchgeführt zu berechnen.
Vorzugsweise ist die potentielle Wirksamkeit der wie hierin beschriebenen Teicoplaninzusammensetzung um mindestens 5 IU höher als die der entsprechenden Teicoplaninzusammensetzung mit % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) von 6,5%, bevorzugter ist sie um mindestens 30 IU höher als die der entsprechenden Teicoplaninzusammensetzung mit % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) von 6,5%, noch bevorzugter ist sie mindestens 50 IU höher als die der entsprechenden Teicoplaninzusammensetzung mit % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) von 6,5% und am meisten bevorzugt ist sie mindestens 100 IU höher als die der entsprechenden Teicoplaninzusammensetzung mit % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) von 6,5%. Unter gewissen Umständen kann es schwierig sein, eine Aktivität zu erreichen, die um mehr als 1.000 IU erhöht ist.
Der Begriff "entsprechende Teicoplaninzusammensetzung mit % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) von 6,5%," soll eine Standardbezugszusammensetzung bezeichnen, und zwar in dem Sinn, dass besagte Zusammensetzung neben den spezifischen Mengen and TA3 und TA2 auch die gleichen Komponenten, Salze etc., umfassen sollte wie die Teicoplaninzusammensetzung, die im Hinblick auf ihre verbesserte antibiotischen Aktivität beurteilt wird.
Die Teicoplaninkornponenten können umgewandelt werden in Salze, so wie pharmazeutisch verträgliche Salze und Derivate wie Ester und Ether und andere chemische Äquivalente, die alle in einer wie hierin beschriebenen Teicoplaninzusammensetzung durch die vorliegende Erfindung abgedeckt sind. Die Salze und Derivate können mittels dem Fachmann bekannten Standardverfahren hergestellt werden. Salze wie Natrium- und Kaliumsalze können beispielsweise hergestellt werden, indem man Teicoplaninkomponenten mit geeigneten Natrium- oder Kaliumbasen behandelt.
Ester und Ether können gemäß den in der Literatur angegebenen Verfahren hergestellt werden, z. B. in Advanced Organic Synthesis, 4. Auflage, J. March, John Wiley & Sons., 1992. Die Aminogruppe des Zuckerrests kann alkyliert oder acetyliert werden, beispielsweise mit sauren Chloriden gemäß dem Fachmann bekannten Standardverfahren. Chemische Äquivalente können stabile Komplexe mit Metallionen sein, d.h. Übergangsmetalle wie La³⁺, Sm³⁺, Eu³⁺, Gd³⁺, welche typisch für Tetramsäurederivate sind und gemäß den in der Literatur angegebenen Verfahren hergestellt werden können (K. Tanaka et. al., Chem. Pharm. Bull. 1979, 27, 1901; K. Matsuo, Chem. Pharm. Bull. 1980, 28, 2494). Die Doppelbindungen der Alkylseitenkette können gemäß den in der Literatur angegebenen Verfahren reduziert werden, z. B. in P. N. Rylander, "Hydrogenation Methods", Academic Press, New York (1985), Kap. 2, oder sie können mittels von H. O. House in "Modern Synthetic Reactions", W. A. Benjymin, Inc., New York (1972), Seiten 446-452, beschriebener Verfahren hydrohalogenisiert werden. Hydroxylierte Derivate können hergestellt werden mittels der Reaktion der Doppelbindungen mit Reagenzien so wie OsO₄, wie in der Literatur beschrieben, beispielsweise in Chem. Rev. 1980, 80, 187. Derivate können ebenfalls durch Umwandlung der Doppelbindungen in Epoxide mittels Oxidation gebildet werden, beispielsweise mit MCPBA, wie beschrieben in Advanced Organic Synthesis, 4. Auflage, J. March, John Wiley & Sons., 1992.
Bei der Teicoplaninzusammensetzung kann es sich um eine pharmazeutische Teicoplaninzusammensetzung handeln. In solch einem Fall kann beispielsweise die Teicoplaninzusammensetzung optional pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen. Wie hierin verwendet bezeichnet „pharmazeutisch verträglicher Träger" einen oder mehrere kompatible feste oder flüssige Füllstoffe/Verdünnungsmittel oder Verkapselungsmittel. Wie hierin verwendet bedeutet „kompatibel", dass die Komponenten der Zusammensetzung dazu in der Lage sind, miteinander vermischt zu werden, ohne auf eine Weise miteinander zu interagieren, die die pharmazeutische Wirksamkeit der Gesamtzusammensetzung unter gewöhnlichen Gebrauchsbedingungen wesentlich vermindern würde.
Einige Beispiele für Substanzen, die als pharmazeutische Träger dienen können, sind: Salze; Zucker, so wie Lactose, Glucose und Saccharose; Stärken so wie Mais- und Kartoffelstärke; Zellulose und deren Derivate so wie Natriumcarboxymethylzellulose, Ethylcellulose und Zelluloseacetate; pulverisierter Traganth; Malz; Gelatine; Talkum; Stearinsäuren; Magnesiumstearat; Calciumsulfat; Pflanzenöle so wie Erdnussöle, Baumwollsamenöl, Sesamöl, Olivenöl, Maisöl und Theobrominöl; Polyole so wie Propylenglykol, Glycerin, Sorbitol, Mannitol und Polyethylenglykol; Agar; Algininsäuren; Wasser; pyrogenfreies Wasser; isotonische Salzlösung; und Phosphatpufferlösung; entrahmtes Milchpulver; ebenso wie andere nicht-toxische kompatible Substanzen, die in pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden.
Feuchthaltemittel, Füllstoffe und Schmiermittel so wie Natriumlaurylsulfat, ebenso wie Farbstoffe, Geschmacksstoffe, Gleitmittel, Hilfsstoffe, Tablettierungsmittel, Stabilisatoren, Antioxidantien und Konservierungsstoffe können ebenfalls anwesend sein.
Die wie hierin beschriebene pharmazeutische Teicoplaninzusammensetzung kann intramuskulär, intravenös, oral oder über andere Administrationswege verabreicht werden.
Eine wie hierin beschriebene pharmazeutische Teicoplaninzusammensetzung mit anderen pharmazeutisch aktiven Substanzen kann hergestellt werden, indem man die aktiven Verbindungen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen und/oder Exzipienten vermischt, so wie z. B. Füllstoffe, Emulgatoren, Schmiermittel, geschmacksmaskierende Stoffe, Farbstoffe oder Puffersubstanzen, und die Mischung in eine geeignete pharmazeutische Form umwandelt, so wie beispielsweise Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulat, Pulver, Emulsionen, Suspensionen oder zur parenteralen Verabreichung geeignete Lösungen.
Beispiele für Hilfsstoffe und/oder Exzipienten, die genannt werden können, sind Traganth, Lactose, Talkum, Agar, Polyglykole, Ethanol und Wasser. Geeignet und bevorzugt zur parenteralen Verabreichung sind wässrige Suspensionen oder Lösungen. Es ist ebenfalls möglich, die aktiven Substanzen an sich, ohne Vehikel oder Verdünnungsmittel, in einer geeigneten Form, beispielsweise in Kapseln, zu verabreichen.
Bevorzugt liegt die Teicoplaninzusammensetzung in Form eines Pulvers vor (so wie ein Pulver zur Injektion), insbesondere ein Pulver umfassend Natriumchlorid oder Glukose. Gegenwärtig bevorzugt sind Pulver mit Natriumchlorid (0,5% bis 15%).
Bevorzugt wird die wie hierin beschriebene pharmazeutische Teicoplaninzusammensetzung zusammen mit geeigneten pharmazeutisch relevanten Anweisungen bereitgestellt. Diese Anweisungen erläutern bevorzugt pharmazeutisch relevante Informationen, so wie beispielsweise Qualität und Quantität der Zusammensetzung, pharmazeutische Form, therapeutische Indikationen sowie Art der Verabreichung (einschließend empfohlene Dosen).
Verwendung einer pharmazeutischen Teicoplaninzusammensetzung zur Behandlung einer Infektion durch Mikroorganismen in einem Patienten.
Eine wie hierin beschriebene pharmazeutische Teicoplaninzusammensetzung kann verabreicht werden an Tiere, so wie Säuger, einschließend Menschen, als eigenständiges Pharmazeutikum alleine, miteinander vermischt sowie in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die parenterale Verabreichung gestatten.
Dementsprechend bezeichnet der Begriff „Patient" ein Tier, so wie einen Säuger, einschließend einen menschlichen Patienten. Bevorzugt handelt es sich um einen menschlichen Patienten.
Es ist bekannt, dass Teicoplanin wirksam gegen eine Infektion mit grampositiven Bakterien ist, insbesondere mit staphylokokkischen Bakterien.
Eine pharmazeutische Teicoplaninzusammensetzung kann oral, intramuskulär, intravenös oder über andere Administrationswege verabreicht werden.
Wie üblich können die galenische Formulierung, das Verfahren der Verabreichung sowie der Dosierungsbereich, die in einem spezifischen Fall geeignet sind, von der zu behandelnden Spezies und dem Status der jeweiligen Beschwerden oder der jeweiligen Krankheit abhängen und unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren optimiert werden.
Das "UK electronic Medicines Compendium" gibt bezüglich Targocid^® an, dass eine geeignete zu empfehlende Tagesdosis bei etwa 3 mg Targocid^®/kg Körpergewicht eines normalen Erwachsenen liegt.
Dementsprechend kann im Durchschnitt die Tagesdosis einer pharmazeutischen Teicoplaninzusammensetzung für einen Patienten zwischen 0,05 mg/kg Körpergewicht und 50 mg/kg Körpergewicht liegen, bevorzugter zwischen 1 mg/kg Körpergewicht und 20 mg/kg Körpergewicht.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Teicoplaninzusammensetzung mit verbesserter antibiotischer Aktivität:
Wie bereits zuvor erwähnt, betrifft ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Teicoplaninzusammensetzung mit verbesserter antibiotischer Aktivität umfassend die folgenden Schritte:

(i) Herstellung von zwei oder mehreren Zusammensetzungen umfassend verschiedene % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) in einem Bereich zwischen 5% und 60%, gemessen mittels HPLC-Analyse;
(ii) Analyse der antibiotischen Aktivität der Zusammensetzungen;
(iii) Identifizieren einer Zusammensetzung, die einen synergistischen Effekt von TA2 und TA3 sowie eine erwünschte verbesserte antibiotische Aktivität aufweist.

Der Grundgedanke hinter diesem Verfahren betrifft den hierin identifizierten synergistischen Effekt von TA2 und TA3.
Bevorzugt werden in Schritt (i) zwei oder mehrere Teicoplaninzusammensetzungen umfassend verschiedene % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) in einem Bereich zwischen 7,5% und 50% hergestellt, mehr bevorzugt werden in Schritt (i) zwei oder mehrere Teicoplaninzusammensetzungen umfassend verschiedene % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) in einem Bereich zwischen 15% und 40% hergestellt und noch mehr bevorzugt werden in Schritt (i) zwei oder mehrere Teicoplaninzusammensetzungen umfassend verschiedene % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) in einem Bereich zwischen 20% und 40% hergestellt. Bevorzugt werden in Schritt (i) vier oder mehrere der verschiedenen Teicoplaninzusammensetzungen hergestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die identifizierte Zusammensetzung aus Schritt (iii) eine höhere antibiotische Aktivität auf als eine entsprechende Teicoplaninzusammensetzung mit % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) von 6,5%, wobei die antibiotische Aktivität mittels eines mikrobiologischen Agardiffusionsassays unter Verwendung von Staphylococcus aureus ATCC 6538 als Teststrang gemessen wird und die antibiotische Aktivität anhand der gemessenen potentiellen Wirksamkeit (IU pro mg TA2 + TA3/g Zusammensetzung) berechnet wird.
Der Assay und die potentielle Wirksamkeit sollten bevorzugt so wie oben beschrieben hergestellt bzw. herbeigeführt werden.
Bevorzugt umfasst das Verfahren zur Herstellung einer Teicoplaninzusammensetzung den folgenden weiteren Schritt:

(iv) Herstellung einer pharmazeutischen Teicoplaninzusammensetzung umfassend eine wirksame Menge von Teicoplaninkomponenten oder einem pharmazeutisch verträglichen Salz oder Derivat davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) der Zusammensetzung ein %-Wert ist, der dem %-Wert der identifizierten Zusammensetzung aus Schritt (iii) des dritten Aspekts der vorliegenden Erfindung entspricht.

Der Begriff „entspricht" in diesem Schritt (iv) sollte als relativ umfassend verstanden werden, und zwar in dem Sinn, dass der spezifische % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) der pharmazeutischen Zusammensetzung bezüglich der identifizierten Zusammensetzung aus Schritt (iii) des dritten Aspekts der vorliegenden Erfindung etwas variieren kann. Der %-Wert der identifizierten Zusammensetzung kann im Hinblick auf die antibiotische Aktivität der optimale %-Wert sein. Es ist jedoch möglich, dass der Fachmann diesen Wert in einer spezifischen Teicoplaninzusammensetzung aus verschiedenen Gründen geringfügig modifizieren möchte, z. B. im Hinblick auf die Produktionswirtschaftlichkeit.
Bei der pharmazeutischen Teicoplaninzusammensetzung aus dem obigen Schritt (iv) handelt es sich bevorzugt um eine Teicoplaninzusammensetzung mit den Eigenschaften einer Teicoplaninzusammensetzung des ersten Aspekts und damit verwandten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Ein gesonderter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine wie hierin beschriebene Teicoplaninzusammensetzung, die mittels eines wie hierin beschriebenen Verfahrens zur Herstellung einer Teicoplaninzusammensetzung erhalten wurde.
Dem Fachmann sind verschiedene Routinestrategien zur Herstellung von Teicoplaninzusammensetzungen umfassend verschiedene % (mg TA3)/(mg TA3 + TA2) bekannt. Es ist eine Möglichkeit, beispielsweise TA3 aus einer kommerziellen Teicoplaninzusammensetzung aufzureinigen und dieses aufgereinigte TA3 dazu zu verwenden, eine relevante Teicoplaninzusammensetzung anzureichern, um eine Zusammensetzung mit zunehmenden Mengen von TA3 herzustellen. Siehe die hierin angegebenen Arbeitsbeispiele zur Veranschaulichung dieses Prinzips.
TA2 kann mittels Hydrolyse in TA3 transformiert werden, wobei die N-Acyl-D-Glucosamingruppe mit dem Fettsäureschwanz aus der Glykopeptid-Basenstruktur entfernt wird (siehe nachfolgende 1). Diese Hydrolysierung wird bevorzugt mit dem aus der Fermentation erhaltenen Teicoplanin-Rohprodukt durchgeführt. Die Hydrolyse kann sauer, basisch oder enzymatisch sein, so wie sie mittels Säurebehandlung (gegenwärtig bevorzugt unter milden Bedingungen) oder mittels Enzymen durchgeführt wird. Es wäre eine weitere Möglichkeit, die Fermentationsbedingungen derart anzupassen, dass größere Mengen an TA3 in dem Fermentationsprodukt entstehen.
Dementsprechend betrifft ein gesonderter Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Teicoplaninzusammensetzung umfassend TA2 und TA3, die mit TA3 angereichert ist (im Vergleich zum Ausgangsmaterial), wobei besagtes Verfahren die Hydrolyse einer TA2 enthaltenden Zusammensetzung, so wie einer TA2 und TA3 enthaltenden Zusammensetzung (so wie einer Zusammensetzung (Ausgangsmaterial) mit einem Verhältnis TA3/(TA2 + TA3) (w/w) von mehr als 0,01; 0,03; 0,05; 0,07; 0,08; 0,09; 0,10; oder sogar mehr als 0,11 oder 0,12) umfasst, beispielsweise mittels Behandlung mit einer Säure oder einem Enzym. Das Endprodukt weist bevorzugt ein Verhältnis unter 80% auf. Bevorzugt wird die Hydrolyse an einer aus Fermentation erhaltenen Teicoplanin-Rohzusammensetzung durchgeführt, ohne die Teicoplaninkomponenten TA2 und/oder TA3 zu trennen. Die Hydrolyse wird bevorzugt unter milden Bedingungen durchgeführt, so wie unter Bedingungen, bei denen der pH höher als 0 ist, so wie höher als 1 oder 2, oder sogar höher als 3. Wird die Hydrolyse als eine saure Hydrolyse durchgeführt, so ist es gegenwärtig bevorzugt, dass die Hydrolyse bei einem pH-Wert zwischen 0 und 5 oder unter Verwendung von Salzsäure in einer Konzentration zwischen 0,1 N und 1 N durchgeführt wird. Während der Hydrolyse kann das Teicoplanin in einem polaren organischen Lösungsmittel (so wie Alkohol) oder einer Mischung davon mit Wasser gelöst werden. Ein optionaler Schritt des Verfahrens zur Herstellung der Teicoplaninzusammensetzung umfasst das Mischen einer Zusammensetzung umfassend TA3 und/oder TA2 mit dem Hydrolyseprodukt, um eine standardisierte Teicoplaninzusammensetzung zu erhalten. Die hinzugefügte Zusammensetzung selbst kann mittels Hydrolysierung oder mittels Fermentation hergestellt werden. Vorteilhafterweise sollte die Hydrolyse von TA2 zu TA3 teilweise erfolgen, um auf direktem Weg eine Teicoplaninzusammensetzung mit dem gewünschten Verhältnis TA3/(TA2 + TA3) zu erhalten.
Eine Teicoplaninzusammensetzung, die mittels des Verfahrens des dritten oder vierten Aspekts der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann, ist ebenfalls ein Aspekt der vorliegenden Erfindung. Die Zusammensetzung, die so erhalten werden kann, weist bevorzugt ein TA3/(TA2 + TA3) (w/w)-Verhältnis von weniger als 0,95 (so wie weniger als 0,9; 0,8; 0,7: 0,6; 0,5; 0,4 oder sogar weniger als 0,35) und bevorzugt ein TA3/(TA2 + TA3) (w/w)-Verhältnis von mehr als 0,05 (so wie mehr als 0,07; 0,08, 0,09; 0,10; 0,11; 0,12; 0,13; 0,14; 0,15; 0,16; 0,17; 0,18; 0,19; 0,20; 0,21; 0,22; 0,23 oder sogar mehr als 0,25) auf. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Verhältnis TA3/(TA2 + TA3) (w/w) in der Teicoplaninzusammensetzung über 5% aber unter 90%; des weiteren ist das Verhältnis TA3/(TA2 + TA3) (w/w) ein anderes als 6,5% (z. B. außerhalb eines Bereichs zwischen 6,25% und 6,75% oder außerhalb eines Bereichs zwischen 6% und 7%) und ebenso ein anderes als 10% (z. B. außerhalb eines Bereichs zwischen 9,75% und 10,25% oder außerhalb eines Bereichs zwischen 9,5% und 10,5%). TA3 ist bevorzugt TA3-1 und/oder TA2 ist bevorzugt die Summe: (TA2-1 + TA2-2 + TA2-3 + TA2-4 + TA2-5). Gegenwärtig ist eine Teicoplaninzusammensetzung des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung oder der wie hierin beschriebenen Ausführungsformen davon am meisten bevorzugt.
BEISPIELE:
Beispiel 1: Analyse des synergistischen Effekts von TA3-1 und TA2-2 in verschiedenen Zusammensetzungen.

1.1 MATERIALIEN
1.2 AUSSTATTUNG
1.3 VERFAHREN 1.3.1 AUFREINIGUNG VON TEICOPLANIN A3-1 1.3.2 AUFREINIGUNG VON TEICOPLANIN A2-2 1.3.3 HPLC-ANALYSE 1.3.4 BESTIMMUNG DER WIRKSAMKEIT
2 ERGEBNISSE
3 DISKUSSION
4 SCHLUSSFOLGERUNG

1.1: MATERIALIEN
Es werden die folgenden Teicoplaninquellen verwendet.

*) Zur Analyse wird ein Arbeitsstandard verwendet, der gegen den internationalen WHO-Standard kalibriert wurde.

Sofern nicht anders angegeben, handelt es sich bei allen anderen in den Beispielen beschriebenen Materialien um standardgemäße Laborchemikalien.
1.2 Ausstattung
Sofern nicht anders angegeben, handelt es sich bei allen in den Beispielen beschriebenen Ausstattungen um standardgemäße Laborausstattungen.
1.3 Verfahren
1.3.1 Aufreinigung von Teicoplanin A3-1
Zur Herstellung eines Rohprodukts mit einem erhöhten Gehalt an TA3-1 (hergestellt von Alpharma) wurde Teicoplanin TA2 in 50% Ethanollösung mittels saurer Hydrolyse (1 M HCl wurde hinzugegeben, resultierender pH = 0,6) bei erhöhten Temperaturen in ein Rohgemisch aus TA2 und TA3 (einschließend TA3-2 und das T-Aglykon) umgewandelt und gefriergetrocknet.
Zur Herstellung von reinem TA3-1 wurde das Material von Xinchang Pharma (China) mittels vorbereitender Reversed-Phase-C18 HPLC aufgereinigt. Die resultierende Lösung wurde mittels Normal-Phase-HPLC verfeinert, um überschüssiges Salz zu entfernen, und zu einem Pulver getrocknet. Die Identität der Komponenten wurde mittels FIA-LC-MS bestätigt.
1.3.2 Aufreinigung von Teicoplanin A2-2
Eine reine TA2-2-Komponente wurde unter Verwendung der gleichen Verfahren wie für TA3-1 hergestellt.
1.3.3 HPLC-Analyse zur Bestimmung der Aktivität
Das nachfolgend im Prozesslabor routinemäßig angewandte HPLC-Verfahren:

Säule	Waters Xterra^® RP18, 3,5 μm, 4.6 × 150 mm
Vorsäule	Waters Xterra^® RP18 Guard-Säule, 5 μm, 3,9 × 20 mm
Säulenofen	28°C
Puffer	0,2 % Ammoniumformiat, pH 7,0 4,0 g Ammoniumformiat wurden in etwa 21 Milli-Q-Wasser aufgelöst. Der pH wurde mittels NH₃ auf 7,0 eingestellt. Das Gesamtvolumen wurde mit Milli-Q-Wasser auf exakt 2,01 gebracht. Vor dem Gebrauch wurde der Puffer durch einen 0,45 μm-Filter gefiltert.
Mobile Phase	Eluent A: 90 % Puffer 10 % Acetonitril (ACN)
	Eluent B: 35 % Puffer 65 % ACN

Der Gradient der mobilen Phase ist in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1. Zur HPLC-Analyse verwendeter Gradient

¹ 6 bezieht sich auf einen linearen Gradienten und 11 bezieht sich auf einen verzögerten Stufengradienten
Detektion: UV, 280 nm
Standard: Targocid, 0,210 g/l.

10 bis 200 μl, entsprechend 2,1-42 μg Teicoplanin A2, wurden für eine 5-Punkte-Kalibrierungskurve injiziert und zu Beginn und nach jeder 30. Probe der Sequenz aufgenommen. Varianzen in der Antwort (= über den gesamten Bereich der fünf TA2-Komponenten) wurde bis zu +/– 3 % akzeptiert. Varianzen in der Retentionszeit bis zu 10 % wurden ebenfalls akzeptiert.
Nachfolgende Herstellung von Proben:
Flüssige Proben wurden mit 25 mM HEPES-Puffer, pH 7, bis etwa 0,25-2 g/l verdünnt und 20 μl der verdünnten Probe wurden injiziert. Zur Bestimmung der Wirksamkeit verwendete Lösungen wurden hergestellt und 20 μl davon wurden direkt injiziert.
Pulver, etwa 25 mg, wurden in eine 25 ml Messflasche abgewogen und in 25 mM HEPES-Puffer, pH 7, aufgelöst und 20 μl davon wurden injiziert.
Herstellung von HEPES-Puffer: 2,98 g HEPES wurden in etwa 450 ml Milli-Q-Wasser aufgelöst. Der pH wurde mittels NaOH auf 7,0 eingestellt. Das Gesamtvolumen wurde mit Milli-Q-Wasser auf exakt 500 ml gebracht.
Die Chromatogramme wurden automatisch in einem Bereich zwischen 3 und 13 Minuten mit Hilfe der „Tal-zu-Tal-Basis" in der Waters Millenium Software integriert und die definierten Spitzenbereiche von TA3-1, TA2-1, TA2-2, TA2-3, TA2-4 und TA2-5 wurden aufgenommen. Alle Massenberechnungen (mg Aktivität/g Pulver) wurden unter Verwendung der Kalibrierungskurve für TA2 und der Sequenzinformation bezüglich des Gewichts der Proben und der Verdünnungen automatisch von der Software durchgeführt. Der kombinierte Bereich der fünf TA2-Komponenten wurde zur Berechnung des Gehalts an mg TA2/g Pulver verwendet. Zur Berechnung des Gehalts an TA3-1 wurde dieser Spitzenbereich mit dem Faktor 0,83 multipliziert, um das geringere Molekulargewicht von TA3-1 auszugleichen. Die prozentuale Verteilung von TA3-1 und TA2 wurde von Hand berechnet, und zwar mittels Division der jeweiligen Masse von TA3-1 bzw. TA2 durch die Gesamtmasse, d.h. mg (TA3-1)/mg (TA3-1 + TA2).
1.3.4 Bestimmung der Wirksamkeit
Die Wirksamkeit von Teicoplanin TA2, TA3-1 allein oder kombiniert wurde mittels Agardiffusionsassays bestimmt. Des weiteren wurde der antimikrobielle Effekt von reinen und beimpften (gespikten) Produkten untersucht, indem man die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) durch einen modifizierten "MIC-Test" auf Mikrotiterplatten bestimmte.
1.3.4.1 Bestimmung mittels Agardiffusion
Mikrobiologische Wirksamkeit mittels Agardiffusion

Der Wirksamkeitstest wird gemäß dem nachfolgend beschriebenen „Microbiological assay, Teicoplanin" durchgeführt. Das Assayverfahren entspricht im allgemeinen der USP 25 und der Ph. Eur., 4. Auflage, unterscheidet sich jedoch von beiden hinsichtlich des Teststrangs und von der USP hinsichtlich der Agarlöcher (Ponds), welche den Zylindern vorgezogen werden. Der Test wird im 2,2-Design durchgeführt, wie in Abschnitt <111> der USP beschrieben. Materialien und spezifische Ausstattung

Medien:	Antibiotischer Nähragar (Difco) Art: 0001-01-8.
Puffer:	0,2 M Phosphatpuffer, pH 8,0
Testorganismus:	Staphylococcus aureus ATCC 6538 oder Bacillus subtilis ATCC 6633.
Antibiotischer Standard:	Arbeitsstandard kalibriert gegen den USP-Standard und den Ph. Eur.-Standard. Alternativ USP- oder Ph. Eur.-Ref-Standard.

Große Platten:

Glas mit Aluminiumrahmen (28,5 × 28,5 cm).

Vorgehensweise
Wiegen und Auflösen von Standard und Proben für Stammlösungen, etwa 900 IU/ml:
Teicoplaninstandard: etwa 25,0 mg in 4,0 ml Wasser und Puffer ad 25,0 ml. Probe: etwa 25,0 mg in 4,0 ml Wasser und Puffer ad 25,0 ml. Einstellen der Probenmenge gemäß der tatsächlichen Menge von gewogenem Standard.
Verdünnen von Standard und Probe mit Puffer in den folgenden Konzentrationen: 2-Punkt-Assay:

Lösung 1 Hoch: etwa 400 IU/ml,

Lösung 2 Niedrig: etwa 100 IU/ml,
Aufbringen auf Platten in einem 8 × 8 Latin-Square-Design.
Unmittelbar nach dem Aufbingen Platzieren der Platten im Inkubator bei 34,0°C +/– 2°C, für 16-18 Stunden.
Ergebnisse
Vorsichtiges Auslesen der Zonendurchmesser mit einer 10-fachen Vergrößerung und einer Präzision von 0,1 mm. Statistische Auswertung: Zur Berechnung und Validierung sollen die in der Ph. Eur. und der USP angegebene Richtlinien befolgt werden. Für alle Berechnungen soll ein Computerprogramm verwendet werden.
In den Spiking-Experimenten wurde die Menge der untersuchten Probe (Menge des gewogenen Pulvers) reduziert und durch eine entsprechende Menge an Spiking-Material ersetzt oder es wurden Stammlösungen mit definierten Verhältnissen gemischt.
1.3.4.2 Bestimmung der MIC-Werte
Es wurden reines TA3-1, (Teicoplanin R59.193.9 96% TA2-X, 4% TA3-1) und Mischungen davon verwendet. Der Teststrang war S. aureus ATCC 6538 in Endkonzentrationen von 5 × 10⁵/ml bzw. 5 × 10⁴/ml. Der Test wurde in Mikrotiterplatten als eine Abwandlung eines gewöhnlichen MIC-Tests durchgeführt. Anstelle von zweifachen Verdünnungen wurden 0,40-1,20 μg/ml mit 0,20 μl-Unterteilungen und 1,0-4,0 μl/ml mit 1.0 μl-Unterteilungen verwendet. Die Platten wurden bei 37°C inkubiert. Die Wells wurden nach 24 Stunden untersucht und erkennbares Wachstum wurde notiert. Der "MIC"-Wert wurde definiert als die niedrigste Teicoplaninkonzentration, die kein erkennbares Wachstum aufwies.
2. Ergebnisse
Es wurden eine Reihe von Spiking-Experimenten mit verschiedenen TA3-1-Spiegeln durchgeführt und die Wirksamkeit der daraus resultierenden Gemische wurde mittels Agardiffusion bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Tabelle 2 Ergebnisse der Spiking-Experimente

TA2 ist der Gesamtgehalt an TA2-1 bis TA2-5 und TA3 ist der Gehalt an TA3-1.

Alle Spiking-Experimente zeigten deutlich einen synergistischen Effekt von TA3-1 in den Wirksamkeitstests mittels Agardiffusion. Um die Beweiskraft zu stärken, wurden einige Experimente mittels einer modifizierten antimikrobiellen Analyse von Teicoplanin durchgeführt, das mit verschiedenen Mengen an TA3-1 beimpft (gespikt) war. Im Gegensatz zu den Agardiffusionstests wurden diese Experimente in flüssigem Medium durchgeführt und die MIC-Werte wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3 "MIC"-Werte von Teicoplanin und/oder TA3-1 auf S. aureus ATCC6538
3. Diskussion
Die Ergebnisse aus dieser Studie zeigen, dass TA3-1 eine weitaus niedrigere Wirksamkeit (570 IU/mg Pulver) aufweist als TA2-2 (807 IU/mg). Die bloße Addition des Effekts des Gehalts von TA3-1 in hochwirksamen Produkten an sich würde daher die höhere Wirksamkeit nicht erklären. Es wäre die einzig vernünftige Erklärung, dass TA3 einen synergistischen Effekt beiträgt.
Im Rahmen dieser Studie fügten wir verschiedene Mengen an TA3 zu einer Reihe verschiedener Teicoplaninprodukte hinzu, einschließend die aufgereinigte TA2-2-Einzelkomponente, mit lediglich variabler mikrobieller Wirksamkeit. Das Ersetzen von 5 bis 25% der Teicoplaninprobe durch die entsprechende Menge von TA3-1 erhöhte kontinuierlich die mikrobielle Wirksamkeit der Probe, gemessen in IU/mg Pulver. Die Daten belegten ebenso, dass sich das Potential (= die tatsächliche Qualität des Teicoplanin im Pulver) erhöhte, wenn aktives TA2 durch TA3-1 mit niedriger Aktivität ersetzt wurde, was auf einen synergistischen Effekt zwischen TA2 und TA3 hindeutet. Die Ergebnisse können in einem graphischen Plot wie in der nachfolgenden 3 gezeigt visualisiert werden.
Beim Vergleich der potentiellen Wirksamkeiten (IU/mg TA2 + TA3-1) in 3 ist in dem Plot ein synergistischer Effekt von TA3-1 mit den anderen Teicoplaninkomponenten zu sehen. Sogar Produkte mit hoher Wirksamkeit werden noch verbessert, wenn ein Teil des TA2 durch TA3-1 ersetzt wird.
Wie ebenfalls aus 3 zu ersehen ist, scheint der synergistische Effekt aufzutreten, wenn das Verhältnis von TA3-1 zu Gesamt-TA2 + TA3-1 über 5 % liegt, und kontinuierlich auf wenigstens etwa 25 bis 30% anzusteigen, wo er dann geringfügig zurückgeht, wenngleich weiteres Beimpfen (Spiking) nicht untersucht wurde.
Die Ergebnisse aus der MIC-Bestimmung unterstützten die Erkenntnisse aus den Agardiffusionsassays. Der antimikrobielle Effekt von TA3-1 alleine auf S. aureus war wesentlich geringer als der von Teicoplanin.
4. Schlussfolgerung
Mit dieser Studie sammelten wir Beweise für den vorgeschlagenen Synergieeffekt zwischen Teicoplanin A2 und A3. Der Mechanismus dieser Synergie ist noch unklar, doch zeigten sowohl Agardiffusion als auch MIC-Bestimmungen von reinen und beimpften (gespikten) Proben, dass tatsächlich ein synergistischer Effekt zwischen TA3 und TA2 vorliegt.
REFERENZEN:

Referenz 1 Goldstein, B. et al, (1994), Teicoplanin in Glycopeptide Antibiotics, Hrsg. Nagarajan, R., Marcel Dekker, Inc., N. Y, N. Y., Kapitel 8, Seiten 273-307.
Referenz 2 Parenti, F. et al, (2000), Teicoplanin Chemistry and Microbiology, J. Chemotherapy, 12: 5-14.
Referenz 3 Yao, R.C. und Crandall, L.W., (1994), Glycopeptides, Classification, Occurrence, and Discovery in Glycopeptide antibiotics, Hrsg. Nagarajan, R., Marcel Dekker, Inc., N.Y, N.Y., Kapitel 1, Seiten 1-27.
Referenz 4 Janknegt, R., (1991), Teicoplanin in Perspective, Pharmaceutisch Weekblad Scientific Edition, 13: 153-160.
Referenz 5 Reynolds P. E., (1989), Structure, Biochemistry and Mechanism of Action of Glycopeptide Antibiotics, Review, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., Bd. 8, Nr. 11: 943-950.
Referenz 7 Malabarba, A. et al. (1984), Teicoplanin, Antibiotics from Actinoplanes teichomyceticus nov. sp., VI. Chemical Degradation: Physico-chemical and Biological Properties of Acid Hydrolysis Products, The Journal of Antibiotics, Bd. XXXVII, Nr. 9, 988-999.
Referenz 8 Malabarba, A. et al., (1987), Glycopeptide Antibiotic L 17054, US 4,645,827 .
Referenz 9 US 4239751
Referenz 10 US 4994555
Referenz 11 Coronelli, C. et al., (1987), Teicoplanin: chemical, physicochemical and biological aspects, Farmaco, Edizione Scientifica 42:767-86

Claims

Eine Teicoplaninzusammensetzung umfassend eine wirksame Menge von Teicoplaninkomponenten oder eines Salzes davon, wobei die Zusammensetzung %(mg TA3)/(mg TA3 + mg TA2) im Bereich von 16% bis 55% umfasst, gemessen durch HPLC-Analyse.
Die Teicoplaninzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei TA2 die Gesamtheit der Teicoplaninverbindungen TA2-1 bis TA2-5 ist und wobei TA3 die Teicoplaninverbindung TA3-1 ist.
Die Teicoplaninzusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zusammensetzung %(mg TA3)/(mg TA3 + TA2) im Bereich von 18% bis 40% umfasst, gemessen durch HPLC-Analyse.
Die Teicoplaninzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zusammensetzung eine höhere antibiotische Aktivität hat als eine entsprechende Teicoplaninzusammensetzung, die ein %(mg TA3)/(mg TA3 + TA2) von 6,5% aufweist und wobei die antibiotische Aktivität durch einen mikrobiologischen Agar-Diffusionsassay unter Verwendung von Staphylococcus aureus ATCC 6538 als Teststamm gemessen wird und die gemessene potentielle Wirksamkeit (IE pro mg TA2 + TA3) verwendet wird, um die antibiotische Aktivität zu berechnen.
Die Teicoplaninzusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die potentielle Wirksamkeit der Teicoplaninzusammensetzung um mindestens 30 IE höher ist als die der entsprechenden Teicoplaninzusammensetzung, die ein %(mg TA3)/(mg TA3 + TA2) von 6,5% aufweist.
Verwendung einer Teicoplaninzusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Infektion mit Mikroorganismen in einem Patienten, wie eine Infektion mit Gram-positiven Bakterien, insbesondere mit Staphylokokken.
Verfahren zur Herstellung einer Teicoplaninzusammensetzung umfassend TA2 und TA3, das Verfahren umfassend Hydrolyse einer TA2-haltigen Zusammensetzung, z. B. durch Behandlung mit einer Säure oder einem Enzym, wobei die Teicoplaninzusammensetzung ein Verhältnis von TA3-1/(TA2 + TA3-1) (Gewicht/Gewicht) im Bereich von 16% bis 55% aufweist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Hydrolyse mit einer unbehandelten, durch Fermentation erhaltenen, Teicoplaninverbindung, ohne Abtrennung der Teicoplaninverbindungen TA2 und TA3, durchgeführt wurde.