KR960002868B1

KR960002868B1 - 글리코펩티드 항생물질의 회수 방법

Info

Publication number: KR960002868B1
Application number: KR1019870003415A
Authority: KR
Inventors: 판조네 기암바티스타; 기안안토니오 아나클레토
Original assignee: 그루포 레페티트 에스.피.에이.; 레나토 스가르비
Priority date: 1986-04-11
Filing date: 1987-04-10
Publication date: 1996-02-27
Also published as: HUT43868A; ZA872298B; IE870783L; DK170587A; CA1320795C; IL82118A; JPS62250000A; ATE86631T1; KR870010075A; US4994555A; IL82118A0; JPH07116230B2; IE59748B1; EP0241758A2; ES2053460T3; EP0241758A3; DE3784538D1; HU197926B; DK170587D0; GB8608798D0

Abstract

내용 없음.

Description

글리코펩티드 항생물질의 회수 방법

본 발명은 발효액 또는 처리 유출물로부터 생성되는 수용액으로부터 글리코펩티드 항생물질을 회수하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 위한 방법을 적용할 수 있는 글리코펩티드 항생물질의 예로서는 반코마이신, 악타플라닌, 리스토세틴, 아보파르신, 악티노이딘, LL-AM-374, A 477, OA 7653, A 35512 B, A 515668, AAD 216, A 41030, A 47934, A-40926(유럽 특허 출원 제85112406.5호 참조) 및 그의 개개 인자, 유도체 및 슈도-아글리콘 및 아글리콘, 테이코플라닌 및 테이코플라닌-유사 화합물을 들 수 있다.

항생물질을 포함하는 생물학적으로 활성인 물질을 수용성 매질로부터 고체 기질 상에 흡수시킴으로써 분리하는 방법이 미합중국 특허 제3,531,463호에 기재되어 있다. 이 경우에는 비이온발생체인, 거대 망상 수불용성 폴리비닐벤젠 수지가 사용된다.

여과된 발효액으로부터 산성 기를 함유하는 양이온 교환 수지상에 흡착시킴으로써 리스토세틴을 회수하는 방법이 영국 특허 제813559호에 기재되어 있다.

반코마이신 및 악타플라닌 항생물질을 거대 공극 비관능성 스티렌-디비닐벤젠 코폴리머 수지 상에서 흡착시켜서 회수 및 정제시키는 방법이 미합중국 특허 제4,440,753호에 기재되어 있다.

항생물질 A-4696(악타플라닌) 복합체의 정제된 제조물로부터 폴리아미드 컬럼 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의하여 항생물질 A-4696의 단일 인자를 분리하는 방법이 미합중국 특허 제4,322,406호에 기재되어 있다.

발효액으로부터 단리시킨 조 A-4696 염산염으로부터 결정상 A-4696을 제조하는 방법이 미합중국 특허 제4,064,233호에 기재되어 있다. 이 경우에, 조 A-4696 복합체를 발효액으로부터 단리시키는 방법에는 목탄 컬럼 상에서의 흡수, 용출, 황산 이온의 제거, 농축, 물 중에 용해, 활성탄상에서의 추가 흡스, 염산/아세톤 용액을 사용한 추가 용출, 용출액의 농축 및 메탄올 첨가에 의한 조 A-4696 염산염의 석출과 같은 몇개의 취금이 어려운 작업이 포함된다.

이어서 단리된 조 A-4696 염산염을 물 중에 용해시킨 후, 이 용액을 폴리아미드 수지 컬럼에 통과시키고, 흐르는 물로 세척한다. 이어서 유출물로부터 증발에 의해 항생물질 활량을 회수한 후, 추가로 물/메탄올 중에 용해시키고, HCI을 첨가해서 산성화시킨 다음, 아세톤을 첨가해서 석출시켜서 정제된 A-4696 염산염을 얻고, 이것을 물/에탄올을 사용해서 재결정화시킨다.

단리된 복합체 시료로부터 정지상으로서 폴리아미드 수지를 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 항생물질 A-35512의 단일 인자를 분리하는 방법이 미합중국 특허 제4,122,168호에 기재되어 있다. 이 경우에, 발효액으로부터 거대 공극 비이온성 폴리스티렌 수지(Amberlite XAD-4) 상에서의 흡수에 의해 복합체의 사전 분리를 행한다.

D-알라닌-D-알라닌 올리고펩티드를 함유하는 고정된 리간드 상에서 친화 크로마토그래피에 의해 글리코펩티드 항생물질을 회수 및 정제하는 방법의 예가 유럽 특허 공개 제122969호 및 동 제132117호에 각각 기재되어 있다.

본 발명에 의하면, 글리코펩티드 항생물질은 바람직하지 않은 몇가지 상이한 생성물과 원물이 상당량 수반된, 상기 물질을 함유하는 수용액으로부터, 특정 폴리아미드 크로마토그래피 수지 상에서 흡수시킨 후, 수성 혼합물을 사용해서 용출시킴으로써 적합하게 단리시킬 수 있음이 발견되었다.

본 발명의 목적은 사실상, 발효액 또는 처리 유출물로부터 생성되는 수용액을 글리코펩티드 항생물질 활량을 흡수할 수 있는 폴리아미드 크로마토그래피 수지와 접촉시킨 후, 수지를 수용액으로부터 분리하고, 이 수지를 수정 용출제혼합물로 세척한 다음, 글리코펩티드 항생물질을 상기 용출제로부터 회수하는 것으로 이루어진, 상기 수용액으로부터 글리코펩티드 항생물질을 회수하는 방법에 있다.

비목적 생성물이 수반된, 글리코펩티드 항생물질을 함유하는 수용액으로서 전형적인 것은 균사체로부터 여과된 발효액 또는 일부 정제된 처리 유출물이다.

상기한, 수반되는 비목적 생성물의 예로서는 유색 불순물, 부산물, 제조 공정의 비소모 반응 물질 및 발효 매질의 염 및 수용성 성분등을 들 수 있다.

상기한 논문 중 어떠한 논문에서도, 발효액 또는 처리 유출물로부터 생성되는 수용액으로부터 글리코펩티드 항생물질을 폴리아미드 기질 상에서 흡수에 의해 단리시키는 방법이 기재되어 있지 않다. 상기한 문헌에는 단지 글리코펩티드 항생물질 복합체를 발효액으로부터 다른 방법에 의해 단리시킨 후 그의 단일 성분으로 분리하는데 폴리아미드 기질 상에서의 크로마토그래피를 사용할 수 있음을 지적하고 있다. 상기한 문헌에서 언급된, 글리코펩티드 항생물질을 발효액으로부터 고상 기질 상에서 흡수시킴으로써 단리시키는 방법에 관한 특정 실시예들은 모두 이온 교환 수지 또는 거대 공극 비이온성 폴리스테렌 수지의 사용을 주시하고 있다.

본 발명의 특정 면에 의하면, 폴리아미드 수지의 사용은 테이코플라닌 및 테이코플라닌-유사 화합물의 제조 공정중 회수 및 정체 단계에서 적합하게 적용됨이 발견되었다. 테이코플라닌은 균주 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스[Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC번호 제31121호(이 균주는 1983년 5월 19일자로 한국과학기술원에 기탁번호 제830519-07911호로 기탁되고, 1983년 6월 7일자 특허출원 제2517호와 관련해서 1983년 6월 21일자로 대한민국 특허청에 미생물 수탁번호 통지서를 제출한 바 있음)]에 의해 생성된 글리코펩티드 항생물질 복합체로서, 혐기성 그람 양성 박테리아에 대하여 유효하다. 이 테이코플라닌은 생물학적 분야에 사용될 때에는 주로 소량의 인자 A₃(T-A3)이 수반된 인자 A₂(T-A2)로 된다. 통상 크로마토그래피 시스텀(예를들면, 박층 크로마토그래피 및 페이퍼 크로마토그래피)에서 균일 생성물질로서 나타나는 인자 A₂는, 역상 고성능 크로마토그래피로 조사했을때 TA2-1, TA2-2, TA2-3, TA2-4 및 TA2-5로서 표시되는, 매우 유사한 극성을 갖는 5개의 주요성분을 나타낸다[예를들면, 에이. 보기(A. Boghi) 등의 Journal of Antibiotics, 제37권, 제6호, 제615-620페이지(1984년 6월) 참조]. 테이코플라닌 및 그의 주요 성분들은 일급 아니노 관능기와 카르복실관능기가 모두 존재하는 것이 특징이다.

본 명세서에서 사용된 "테이코플라닌"이란 용어는 상기한 바와같은 생성물을 의미한다. "테이코플라닌-유사 화합물"이란 용어는 각 단일 인자 T-A2 및 T-A3 및 각T-A2의 5개 주요 성분 및 그의 임의 비율혼합물, 예를들면 영국 특허 출원 제8512795호에 기재되어 있는 방법에 의해 적당한 전구체를 발효 매질에 첨가하여 얻을 수 있는 것 등을 의미한다. "테이코플라닌-유사 화합물"이란 용어에는 또한 종래 문헌에서 항생물질 L 17046(유럽특허 공개 제119574호 참조), L 17054(유럽 특허 공개 제119575호 참조) 및 L 17392(유럽특허 공개 제146053호 참조)로서 동정된 테이코플라닌 아글리콘 및 슈도-아글리콘, 및 테이코플라닌의 에스테르 및 아미드 및 그의 아글리콘 및 슈도-아글리콘(예를들면, 국제특허 출원 PCT/EP85/00262, 영국 특허 출원 제8522574호, 유럽 특허 출원 제85113810.7호 및 동 제86112226.5호 참조)과 같은 반합성 유도체가 포함된다.

종래 문헌[엠. 알. 바돈(M. R. Bardone) 등의 Journal of Antibiotics, 제31권, 제3호, 제170-177페이지(1978년 3월) 참조]에 기재되어 있는, 균주 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스(ATCC 번호 제31121호)의 여과된 발효액으로부터 테이코플라닌을 단리시키는 방법에는 산성 pH에서 부탄올을 사용해서 추출시킨 후, 세척하고 농축시키는 공정이 포함된다. 강산성 이온 교환 수지의 별법 사용은 물론, 이 처리는 당성분중 일분가 분해되는 현상이 발생된다. 이에 반하여, 강염기성 이온 교환 수지를 사용하면 에피머화가 용이하게 되어 생물학적 활량이 손실된다. 더우기, 이온 수지의 열등한 특이성으로, 수용액중에 함유된 유색 불순물과 부산물 모두로부터 글리코펩티드 항생물질을 분리하는 공정이 용이하지 않게 된다. 비이온성 거대 공극 수지(및 이온 교환 수지)는 항생물질중 상단한 양을 거의 비가역적으로 결합시키므로, 용출에 있어서 생성물의 화학적 안정성과 상용될 수 없는 조건이 요구된다는 결정을 갖는다. D-알리닌-D-알라닌 올리고펩티드를 함유하는 고정된 리간드 상에서의 친화 크로마토그래피를 사용하면 효과적이긴 하나, 산업적 규모의 공정에서 심각한 경제적인 문제를 갖는다.

수용액으로부터 글리코펩티드 항생물질, 특히 테이코플라닌, 테이코플라닌 유사 화합물 및 항생물질 A 40926을 분리하는 공정에서 유용한 것으로 발견된 폴리아미드 수지는 일반적으로, 폴리카프로락탐, 나일론(6/6, 6/9, 6/10 및 6/12) 및 가교 폴리비닐피롤리돈으로서 동정된 폴리아미드 컬럼 크로마토그래피 수지중에서 선택된다. 상기 크로마토그래피 폴리아미드 수지는 일반적으로, 1 내지 5㎖/g의 공극 용적^(*), 1 내지 100m²/g의 표면적^(*), 0.15 내지 0.50g/㎖의 겉보기 밀도, 100 내지 3000Å 단위의 평균 공극 직경^(*)및 입자 중 적어도 40%가 300μ 미만의 입도를 갖는 입도 분포로써 특징지워진다.

본 발명의 실시 태양에 적합한, 현재 시판되고 있는 폴리아미드컬럼 크로마토그래피 수지의 구체적인 예로는 폴리아미드 수지, Polyamide-CC 6, Polyamide-SC 6, Polyamide-CC 6.6, Polyamide-CC 6AC 및 Polyamide-SC 6AC[독일연방공화국 소재의 마헤레이-니겔 운트코.(Macherey-Nagel & Co.)제품], 폴리비닐피롤리돈 수지 PVP-CL[독일연방공화국 소재의 알드리히 케미 게엠베하 운트 코., 카게(Aldrich Chemie GmbH & Co, KG)제품], 폴리아미드 수지 PA 400[독일연방공화국 소재의 엠. 보엘름(M. Woelm)제품)을 들 수 있다. 예를들면, 상기한 수지 중 2개의 수지에 대한 특성은 다음과 같다.

(*) 수은 포로시미터 모델 Serie 200 [이탈리아공화국, 밀라노 소재의 씨. 에르바 에스피에이(C. Erba SpA) 제품)으로 측정하였음

본 발명에 의한 실시 태양의 일반적인 처리에 의하면, 균사체 케이크로부터 여과된 글리코펩티드 항생물질의 발효액 또는 상기 발효액 또는 글리코펩티드 항생물질(특히, 테이코플라닌, 테이코플라닌-유사 화합물 또는 항생물질 A 40926)에 대한 화학적 변형 반응으로부터 유도된 처리 유출물로부터 생성되는 수용액을 약 20㎖/㎠/ 시간 내지 약 400㎖/㎠/시간의 유액 컬럼 유속으로 폴리아미드 수지 컬럼에 유입시킨다. 높은 유속디 요구되는 경우에는, 수용액을 저부로부터 흡입하면서 진공하에, 또는 압력하에 또는 보다 큰 입도를 갖는 폴리아미드 수지를 사용하여 컬럼에 가한다. 후자의 경우에 수지의 흡착능이 약간 감소된다.

다른 방법으로서, 폴리아미드 수지를 항생물질 활량을 함유하는 수용액에 첨가하여, 0.5시간 내지 6시간의 설정된 시간 동안 완전히 혼합한 후, 이어서 소모된 용액을 제거할 수 있다.

항생물질 활량을 함유하는 수용액을 얻을 수 있는 발효액 또는 처리 유출물은 표준 시험 규모 또는 산업 규모의 처리에 의해 생산되며, 글리코펩티드 항생물질을 복합체중 단일 주요 성분의 비를 선택적으로 증가시키기 위해 발효 공정중에 적당한 전구체를 상이하게 첨가하는 경우도 포함된다(예를들면, 영국 특허 출원 제8512795호 참조).

폴리아미드 수지와 접촉하는 발효액 또는 수용액의 pH값은 4 내지 10, 적합하기로는 5 내지 8일 수 있다. 접촉되는 용액에는 컬럼을 막히게 하는 고상 물질의 석출을 방지하기 위하여 물과 혼화될 수 있는 용매를 변화량으로 함유시킬 수 있다.

본 발명에 따라 회수 처리를 행하려는 수용액중 항생물질 활량의 농도는 광범위하게 변화할 수 있으며, 일반적으로, 최근 시험 규모 및 산업 규모의 작업에 적용되는 실제조건 하에서 50 내지 20,000ppm(w/v)의 범위이다.

출발물질인 발효액의 효능이 그다지 낮지 않은 경우에는, 만족할만한 순도를 얻기 위하여 폴리아미드 수지를 1성분만 통과하게 할 수 있다.

수용액중에 함유된 항생물질 활량의 중량 단위에 대해 사용되는 폴리아미드 수지의 양은 일반적으로 사용되는 수지의 흡수능에 좌우된다. 각 수지의 흡수능은 글리코펩티드 항생물질을 함유하는 수용액 시료중 몇개의 세분된 부분을 일정 농도로 폴리아미드 수지로 일정 용적을 충전시킨 컬럼을 통하여 계속해서 첨가함으로써 예비 분석을 통하여 측정할 수 있다. 글리코펩티드 항생물질의 함량을 결정하기 위해서는 컬럼 용출 액중 일부를 HPLC에 의해 조사한다. HPLC 분석 결과 시험 시료중 일정 부분의 용출액에 항생물질 활량이 함유된 것으로 판정되었을 때, 이것을 폴리아미드 수지가 포화된 것으로 여기고, 항생물질 활량을 나타내지 않은 용출액의 총적으로부터 항생물질의 흡수량을 산정한다.

본 발명에 의한 시험 또는 산업 규모의 회수 공정에 사용되는 폴리아미드의 적합한 용적은 상기한 방법에서 측정될 수 있는 포화용적 보다 큰 것이다.

현 작업에서, 폴리아미드 크로마토그래피 수지와 수용액으로부터 회수되는 글리코펩티드 항생물질 활량의 비는 통상적으로 용액중에 함유된 항생물질 활량 ㎏에 대해 수지 약 50 내지 약 250

, 적합하기로는 약 60 내지 약 200

이다.

폴리아미드 수지 용출은 일반적으로 실온에서, 중량에 의해, 또는 흡인 또는 압력하에 용출제로서 수성용매 혼합물, 적합하기로는 물과 1개 이상의 물과 혼화될 수 있는 용매(예, 저급 알칸올, 아세톤, 메틸에틸케톤, 테트라히드로푸란, 디옥산 및 아세토니트릴)의 용매 혼합물을 사용하여 행한다.

가장 적합한 용출제혼합물은 물과 저급 알칸올(예, 메탄올) 또는 아세톤을 약 1:9 내지 약 9:1(v/v)의 비율로 함유하고, 용출액의 pH를 3 내지 11로 유지하기 위해서 이 혼합물 중에 용해될 수 있는 산 또는 염기 적당량을 첨가한 수용액이다. 또한 pH 값을 소정 수준으로 유지하기 위하여 완충액을 사용할 수도 있다.

상기 목적에 유용한 첨가물로서는 예를들면, 무기산, 포름산, 아세트산, 묽은 알칼리금속 수산화물(예, 수산화나트륨, 수산화칼륨), 중탄산나트륨, 탄산나트륨, 암모니아, 비스(2-히드록시 에틸아민)수용액, 인산 수소나트륨 완충액 등을 들 수 있다.

본 발명의 적합한 실시 태양에 따르면, 용출액 혼합물중 제1부분은 최종 부분 보다 낮은 pH값을 갖도록 하고, 용출 도중에 pH값을 점차로 증가시킴으로써 용출액의 제1분획물을 사용하여 산성 불순물이 보다 많게 제거될 수 있다. 이 경우에, 제1용출액 부분에는 예를들면, 염기로서 증탄산나트륨 수용액을 함유시킬 수 있으며, 중간 부분에는 탄산나트륨을, 최종 부분에는 수산화나트륨을 함유시킬 수 있다. 다른 방법으로서, 보다 산성인 불순물을 제거한 후, 산성 pH에서 상기한 산 중 어느 하나를 사용하여 항생물질을 용출시킬 수도 있다. 또한, 물과 혼화될 수 있는 용매 구배를 사용하거나, 완충염의 농도를 증가시켜서도 유사한 효과를 얻을 수 있다.

용출액은 몇개의 분획물로 모아서, pH 7로 중화시킨 후, HPLC에 의해 분석한다. 글리코펩티드 항생물질 활량을 함유하는 분획물을 합한 후, 진공 하에서 농축시킨다. 이 농축된 수용액으로부터 통상의 처리에 의해 글리코펩티드 항생물질을 회수한다. 예를들면, 농축된 수용액으로부터 글리코펩티드가 낮은 용해도를 갖게 되는, 물과 혼화될 수 있는 유기 용매, 예를들면 아세톤을 첨가하여 석출시킬 수 있다. 물과 혼화될 수 있는 용매를 첨가할 필요가 없는 다른 방법의 회수 처리는 저온, 예를들면 5℃에서 수 시간 동안 방치한 후, 석출된 항생물질을 그의 등전점 부근의 pH에서 농축된 용액으로부터 여과하는 것에 근거한다.

경우에 따라서, 특히 용출액에, 농축에 의해 회수된 생성물이 제약에서 직접 사용되기에 부적당하게 만드는 바람직하지 못한 양의 무기염이 함유된 경우에는, 용출액의 추가 농축을 탈염 처리와 병행하는 것이 적합하다. 이 작업은 초여과 기술(예를들면, 500-1000 달톤의 분리능을 갖는, 필름텍 코.(FILMTEC CO.)제품의 막을 사용함)을 적용하거나, 용출액을 비이온발생적 거대망상 가교수지(예를들면, Amberlite XAD-7 또는 미합중국 특허 제3,531,463호, 동 제3,663,467호 및 영국 특허 제1,581,671호에 기재되어 있는 기타 종류의 수지)에 통과시킴으로써 글리코펩티드 항생물질을 수용성 혼합물로부터 흡착시키고, 이어서 아세톤/물 혼합물을 사용하여 용출시켜서 동시에 행할 수 있다.

상기 방법으로 회수된 글리코펩티드 항생물질은 이제까지 알려진 다른 회수 방법을 사용하거나, 다른 종류의 수지, 예를들면 거대 공극 수지를 사용하여 얻을 수 있는 순도에 비해서 매우 만족할만한 순도를 갖는다. 본 발명의 방법에 따른, 여과된 발효액 또는 처리 유출물로부터의 회수 수율 또한 상기한 종래 공정의 방법을 통해서 얻을 수 있는 것에 비해 매우 양호하다.

예를들면, 본 발명에 의한 방법을 테이코플라닌에 적용하는 경우에, 컬럼으로부터의 항생물질 생성물은 이미 제약 업계에서 설정한 사용 표준치에 매우 근접한 순도를 나타낼 수 있다. 실제조건에서, 제약학적 주사 투여형에 사용하기 위해서는 상기 생성물을 단지 피로겐-물질 제거 처리, 예를들면, 이를 물 또는 물/혼화될 수 있는 유기 용매중에 용해시킨 용액을 활성탄으로 추가 처리하는 것만이 요구된다.

글리코펩티드 항생물질의 회수에 일단 사용된 폴리아미드 수지는 수회의 연속 흡수-탈착 사이클에 이용할 수 있다. 폴리아미드 수지를 재사용하기 전에 통상적으로 탈염수를 적어도 5층 용적 이상 사용하여 수세를 행한다. 3 또는 4회의 완전한 사이클을 행한 후에는, 수지를 pH 12가 일정하게 될 때까지 묽은 부식제(pH12)로 세척하고, 이어서 탈염수로 중성이 될 때까지 세척하는 것이 적합하다.

이하, 비제한적 실시예에 의해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다.

[실시예]

HPLC 검출은 모두 UV(254mμ) 검출기와 C18로 미리 충전시킨 역상 컬럼(Erbasil 5, 250×4㎜)을 장치한 Hewlett Packard 장치모델 1084를 사용하여 행하였다.

이동상으로서는 (A) 0.02M NaH₂PO₄/CH₃CN 95:5(v/v) 수용액, (B) 0.02M NaH₂PO₄/CH₃CN 25:75(v/v) 수용액을 사용하였다. 용출 구배는 40분 내에 B 8% 내지 55%로 하였고, 유속은 1.5㎖/분이었다.

[실시예 1]

균사체 케이크가 함유되지 않도록 제조한 테이코플라닌 발효액 170

를 pH 8에서, 폴리아미드 수지(컬럼크로마토그래피용 Polyamide-CC 6, 입도 50-160μ, 겉보기 밀도 0.20g/㎖, 독일연방공화국 소재의 마헤레이 나겔 제품) 10.5

로 충전시킨 15×100㎝ 유리 컬럼에 10시간 내에 통과시킨 후, 바닥으로부터 흡입시키면서 진공하에 방치하였다. 평균 유속은 100㎖/㎠/시간 이었다.

소모된 발효액(170

)에는 출발물 테이코플라닌 활량이 5% 미만, 발효액중 보다 극성인 성분(부적합한 고상물 및 유색 유기 물질)이 모두 80% 이상 함유되어 있었다. 수지를 탈염수 50

로 세척한 후, 탄산나트륨을 0.3 내지 1.0g/

의 구배로 함유시킨 메탄올/물 9/1(v/v) 혼합물 50

를 사용해서 용출시켰다.

용출액을 각각 10

씩 5개의 분획물로 모은 후, 각 분획물을 무기산 수용액을 첨가하여 pH 7로 중화시키고, HPLC에 의해 분석하였다. 용출액 중 2개의 분획물(20

)만을 합하여, 생성된 용액(용출된 활량을 90% 이상 함유함)을 45

-50℃에서 감압하에 잔류현탁 수용액이 3.3

로 될 때까지 농축시켰다.

상기 농축된 테이코플라닌 현탁액에 아세톤 13.2

를 교반하여 첨가하였다. 침전물을 실온에서 3시간 동안 방치한 후, 맑은 아세톤 상징액을 경사제거하였다.

고상물을 여과에 의해 분리하고, 아세톤을 사용하여 케이크를 실온에서 슬러지시켰다. 생성물을 재여과시키고, 실온에서 진공하에 철야 건조시켰다.

HPLC에 의한 순도가 85.7%인 테이코플라닌을 발효액 중에 함유된 출발물의 미생물적 활량에 대하여 81.9%의 회수율로 얻었다(물과 용매 함량 11.5중량%, 무기 잔류물 2.8중량%).

모액 16.5

에는 출발 물질인 테이코플라닌이 약 2% 함유되어 있었다.

수지의 흡수능은 다음과 같은 방법에 의해 미리 측정하였다.

조 테이코플라닌 3.1g/

를 함유하는 농축된 용액 360㎖를 축축한 Polyamide-CC 6 수지15g(60㎖)으로 충전시킨 컬럼에 50㎖씩 첨가하였다. 각 50㎖의 용출액을 HPLC에 의해 분석하여 테이코플라닌의 함량을 측정하였다. 용액 250㎖를 컬럼에 통과시킨 결과, 용출된 용매 중에는 테이코플라닌이 검출되지 않았다. 차후 부분에는 활량이 약 0.7g/㎖ 함유되어 있었다. 이것은 수지 15g이 테이코플라닌 0.9g에 의해 포화되었음을 지시하는 것으로 간주하였다. 이 값은 테이코플라닌 ㎏당 Polyamide-CC 6 주지 67

에 해당한다.

[실시예 2]

영국 특허 출원 제8512795호에 기재되어 있는 방법에 따라 발효 매질에 테이코플라닌 인자 A₂의 단일 성분의 적당한 전구체를 첨가하여 얻은 여과된 발효액에 대하여 다음과 같은 실험을 행하였다.

상기 실시예 1에서 사용한 수지와 동일한 종류의 Polyamide-CC 6 수지를 흡착 기질로서 사용하였다. 균사체 케이크가 함유되지 않도록 제조한 발효액 60

를 활량 ㎏당 수지 84

를 함유하는 컬럼상에 통과시켰다. 이것을 탈염수로 세척한 후, 활량을 상기 실시예 1에 기재된 방법으로 용출시키고, 석출시켰다. 그 결과, 86%의 HPLC 순도를 갖는 테이코플라닌을 77%의 수율로 회수하였다(물과 용매 함량 9.1%, 무기 잔류물 4.7%).

[실시예 3]

영국 특허 출원 제8512795호에 기재되어 있는 방법에 따라 L-발린을 발효 매질에 첨가하여 얻은 여과된 발효액 300

를 pH 6에서 Polyamide-SC 6(입도 및 기타 특성은 상기한 바와 같음) 25

를 함유하는 19×100㎝ 유리 컬럼에 통과시켰다. 소모된 발효액에는 테이코플라닌이 전혀 함유되어 있지 않았다. 컬럼을 탈염수 50

로 세척한 후, 이 수지를 0.05M 아세트산나트륨 수용액(pH 8) 50

로 세척하였다. 그 결과 출발물질 발효액중에 존재하는 고상 불순물줄 90% 이상이 제거되었다. 이어서 항생물질을 아세트산을 첨가하여 pH 4로 조절한 아세톤/물 40:60 혼합물 50

로 용출시켰다. 출발 항생물질을 85% 함유하는 유용한 분획물을 모았다(30

).

이것을 pH 6.5-7에서 감압하에 농축시켜서 용액의 용적을 약 12

로 감소시켰다. 여기에 염산 수용액을 첨가하여 pH를 3.5-4로 다시 저하시키고, ＋5℃에서 3시간 동안 방치한 후, 석출된 백색 고상물을 모았다. 이 케이크를 아세톤으로 세척한 후, 다시 여과시켰다. 이것을 건조시킨 후, 테이코플라닌을 74%의 회수율로 얻었고, 이것은 83%의 HPLC 순도를 나타내었다(물과 용매 함량 14.1%, 무기 잔류물 2.1%).

[실시예 4]

유럽 특허 공개 제146053호에 기재되어 있는 실시예중 어느 한 실시예의 방법에 의해 얻은 조 데글루코테이코플라닌 450g을 pH 8에서 물 7ℓ중에 용해시킨 후, 이 용액을 Polyamide-PA 400[엠. 보엘름(M.Woelm) 제품, 입도 및 기타 특성은 상기 참조] 26ℓ를 함유하는 유리 컬림(17×10㎝)에 통과시켰다. 컬럼을 탈염수 50ℓ로 세척한 후, Na₂CO₃를 0.035%(w/v) 함유하는 메탄올/물 9 : 1 혼합물 250ℓ로 용출시켰다.

유용한 분획물(100ℓ)을 모은 결과, 부하된 데글루코테이코플라닌이 85% 함유되어 있다. 이어서 용액을 pH 6.5에서 잔류 용적이 9ℓ로 될 때까지 감압하에서 농축시켰다. 이것을 냉각시킨 후, 현탁액을 여과시키고, 케이크를 아세톤으로 세척하였다. 이것을 건조시킨 후, 83%의 HPLC 순도를 갖는 데클루코테이코플라닌(물과 용매 함량 12.2%) 211g을 79% 수율(출발물의 HPLC 활량에 대하여)로 얻었다.

[실시예 5]

유럽 특허 공개 제119574호에 기재되어 있는 방법으로 얻은 조항생물질 L 17046(HPLC 분석 68%) 96g을 pH 8.2에서 물/메탄올 95 : 5(v/v) 혼합물 1ℓ중에 용해시킨 후, 이 용액을 Polyamide-SC 65ℓ를 함유하는 유리 컬럼(10×100㎝)에 통과시켰다. 컬럼을 탈염수5ℓ로 세척한 후, 물/메탄올 1 : 1(v/v) 혼합물 5ℓ로 세척하였다. 이것을 Na₂CO₃를 0.03%(w/v) 함유하는 메탄올/물 9 : 1(v/v) 혼합물을 사용하여 용출시켰다. L 17046 53.9g(출발물의 HPLC 활량의 83%)을 함유하는 유용한 분획물을 모아서, 상기 실시예 4에 기재한 방법과 동일한 방법으로 처리한 결과, 89%의 HPLC 순도를 갖는 L 170465 5.5g을 얻었다(물 함향 11%).

[실시예 6]

pH 8.5 내지 10.5에서 여과시켜서, 균사체 덩어리가 함유되지 않게, 유럽 특허 출원 제85112406.5호에 기재되어 있는 방법으로 제조한 항생물질 A 40926 복합체를 함유하는 발효액을 황산을 첨가하여 pH 3으로 산성화시켰다.

석출된 조 물질을 여과에 의해 모으고, 이어서 pH 7에서 물 중에 용해시킨 후, 마헤레이-나겔 운트 코. 제품인 Polyamide-SC 6AC(항생물질 활량 ㎏당 수직 120

)를 함유하는 유리 컬럼에 유입시켰다. 이것을 탈염수로 세척한 후, 0.2M 인산염 완충액(pH 8)으로 세척하여 부가의 유색 물질을 제거하였다. 다른 방법으로서, 동일한 목적을 위해서 소량의 세정제(예, 라우릴 황산 나트륨)를 물에 첨가할 수도 있다. 이어서 컬럼 내용물을 1% 암모니아 수용액으로 용출시켜서 출발 항생물질 활량의 약 75%를 얻었다. 수용액을 10%(w/v) HCI 수용액을 첨가하여 pH 3.5로 만들고, 이어서 5℃에서 수시간 동안 냉각시켰다. 석출된 생성물을 여과에 의해 분리하고, 빙냉수로 완전히 세척한 후, 건조시켜서 HPLC 분석으로 상당히 순수한 A 40926 항생물질 복합체를 얻었다.

여과시킨 발효액을 컬럼에 직접 투입하는 추가 실험에서는 pH를 7로 조절한 후, 70%의 순도(HPLC)를 갖는 A 40926을 얻었다. 이것을 Polyamide-SC 6AC에 2차로 통과시키거나, 친화 수지 상에서 흡착/탈착 사이클을 반복한 결과, HPLC 분석으로 순수한 물질을 얻었다.

[실시예 7]

유럽 특허 출원 제86112226.5호의 실시예 1에 기재되어 있는 방법으로 얻은 조 항생물질 N⁶³-[3-(디메틸 아미노)프로필]테이코 플라닌 A₂아미드 아세테이트 13.5g을 pH 6.5에서 물 600㎖ 중에 용해시킨 후,이 용액을 Polyamide-SC 6 250g을 함유하는 유리 컬럼(0.1-0.3㎜)에 통과시켰다. 이것을 pH 6.5에서 물 500㎖로 세척한 후, 동일한 pH에서 메탄올/물 3:7(v/v) 혼물로 용출시켰다.

유용한 분획물(약 1,500㎖)을 모든 결과, 여기에서는 부하된 항생물질이 약 75% 함유되어 있었다. 이것을 진공하에 증류하여 메탄올을 제거한 후, 잔류 수용액의 pH를 8.5로 만들고, 석출된 고상물을 냉각시킨후, 모은 다음, 물로 세척하고, 건조시킨 결과, 85%의 HPLC 순도를 갖는 N⁶³-[3-(디메틸아민)프로필]테이코플라닌 5.8g을 총 70%의 수율로 얻었다.

Claims

발효액 또는 처리 유출물로부터 생성되는 수용액으로부터 글리코펩티드 항생물질을 회수하는 방법에 있어서, 상기 수용액을 상기 항생물질 활성을 흡수할 수 있는 폴리아미드 컬럼 크로마토그래피 수지와 접촉시키고, 상기 수지를 수용액으로부터 분리하고, 상기 수지를 수성 용출제혼합물로 세척한 다음, 상기 용출제로부터 글리코펩티드 항생물질을 회수하는 것을 특징으로 하는 글리코펩티드 항생물질의 회수 방법.
제1항에 있어서, 컬럼 크로마토그래피 폴리아미드 수지는 폴리카프로락탐, 나일론 6/6, 나일론 6/9, 나일론 6/10, 나일론 6/12 및 가교 폴리비닐피롤리돈중에서 선택되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 컬럼 크로마토그래피 폴리아미드 수지는 공극 용적(수은 포로시미터로 측정한 값)이 1 내지 5㎖/g이고, 표면적(수은 포로시미터로 측정한 값)이 1 내지 100M²/g이며, 겉보기 밀도가 0.15 내지 0.50g/㎖이고, 평균 공극 직경(수은 포로시미터로 측정한 값)이 100 내지 3000Å 단위이며, 입도 분포가 입자중 적어도 40%가 300μ 미만의 입도를 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, 수지는 Polyamide-CC 6, Polyamide-SC 6, Polyamide-CC 6.6, Polyamide-CC 6AC, Polyamide-SC 6AC, 폴리비닐피롤리돈 PVP-CL 및 Polyamide PA-400 중에서 선택되는 것인 방법.
제1항, 제2항, 제3항 및 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 여과된 발효물 또는 처리 유출물의 pH는 4 내지 10인 것인 방법.
제1항, 제2항, 제3항 및 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 폴리아미드 크로마토그래피 수지와 글리코펩티드 항생물질 활성비는 용액중에 함유된 항생물질 활성 1㎏에 대해서 수지 약 50 내지 약 250ℓ인 것인 방법.
제1항, 제2항, 제3항 및 제4항중 어느 하나의 항에 있어서, 폴리아미드컬럼 크로마토그래피 수지로부터의 용출을 용출제로서 완충시킨 수용액 또는 수성 용매 혼합물을 사용하여 행하는 것인 방법.
제7항에 있어서, 용출제혼합물은 물과 저급 알칸올 또는 아세톤을 약 1:9 내지 약 9:1(v/v)%의 비율로 함유하는 수성 혼합물이고, 이 용출액의 pH는 3 내지 11로 유지되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 글리코펩티드 항생물질이 반코마이신, 악타플라닌, 리스토세틴, 아보파르신, 악티노이딘, LL-AM-374, A 477, OA 7653, A 35512 B, A 515668, AAD 216, A41030, A 47934, A-40926(유럽 특허 출원 제85112406.5호 참조), 이들의 각개 인자, 유도체 및 슈도-아글리콘과 아글리콘과, 테이코플라닌 및 테이코플라닌 유사 화합물중에서 선택되는 것인 방법.
제9항에 있어서, 글리코펩티드 항생물질은 테이코플라닌, A-40926 및 테이코플라닌 유사 화합물중에서 선택되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 테이코플라닌 유사 화합물은 데글루코테이코플라닌, 항생물질 L-17046, 테이코플라닌 인자 T-A₂, 인자 T-A₂의 주요 성분중 어느 하나, 테이코플라닌, 아미드 및 이들의 임의 비율의 혼합물중 어느 하나인 것인 방법.