KR0140263B1

KR0140263B1 - 재조합 인간 인터페론 베타의 정제방법

Info

Publication number: KR0140263B1
Application number: KR1019950005213A
Authority: KR
Inventors: 김동수; 한승재; 김규돈
Original assignee: 성재갑; 주식회사 엘지화학
Priority date: 1995-03-14
Filing date: 1995-03-14
Publication date: 1998-06-15
Also published as: KR960034217A

Abstract

본 발명은 인터페론 베타가 봉입체 형태로 생성된 재조합 대장균을 파쇄하여 봉입체를 포함하는 침전물을 분리하고, 상기 침전물을 세척하여 구아니딘염 용액에 용해시키고, 상기 용액에 암모늄 설페이트를 첨가하여 단백질을 침전시키고, 상기 단백질 침전물을 계면활성제를 포함하는 완충 용액에 용해시커 젤 여과 크로마토그래피하여 인터페론 베타를 함유하는 분획을 수집하고, 유기 용매를 사용하여 상기 수집된 분획으로부터 계면활성제가 제거된 단백질 침전물을 제조하고, 상기 단백질 침전물을 용해시켜 단백질 원상화 조건하에서 원상화시키는 단계를 포함하는,인터페론 베타의 개선된 제조 방법에 관한 것으로 활성 인터페론 베타를 고수율로 제조할 수 있게 한다.

Description

재조합 인간 인터페론 베타의 정제방법

제1도는 G-75크로마토그래피의 크로마토그램과 SDS-PAGE분석 결과이고,

제2도는 S-100크로마토그래피의 크로마토그램과 SDS-PAGE결과이고,

제3도는 인터페론 베타 구조의 원상화를 위한 조건을 도식화한 것이다.

본 발명은 재조합 인간 인터페론 베타의 대량 정제 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유전공학적인 기법에 의해 인간의 유전자를 박테리아에서 발현하게 함으로써 대량으로 만들어진 인터페론 베타를 높은 활성을 갖는 고순도의 단백질로 정제하는 방법에 관한 것이다.

인터페론 베타는 인체내에서는 섬유아세포에서 만들어지면 166개의 아미노산으로 구성된, 분자량이 약 22,000정도되는 당단백질이다. 한편, 재조합 인간 인터페론 베타는 박테리아를 숙주로 해서 인위적으로 만들어진 분자량 약 19,000정도의 단백질로 당은 결합되어 있지 않다. 인터페론 베타는 다발성 경화증, B, C형 만성 활동성 간염, 육아종, 피부 악성 흑색종, 급성 C형 간엽에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

유전적으로 형질전환된 대장균에서 발현된 인터페론 베타는 그 폴리펩타이드의 덩어리인 봉입체로서 만들어지는데, 이 상태에서는 천연형의 인터페론 베타와 그 구조, 물리적 성질, 생리학적 활성 등이 같지 않다. 따라서 이러한 봉입체로부터 인터페론 베타를 순수하게 정제하고, 활성을 갖는 단백질 분자로 구조적으로 재구성할 때 비로소 의약적 제제로서 사용할 수 있게 된다. 이러한 방법의 한 예로 유기용매 추출 및 몇 가지의 크로마토그래피를 통해 정제한 인터페론 베타가 항 바이러스 활성을 갖는다는 보고가 있다(Method in Enzymology119, 86(183-192)). 미합중국 특허 제 4,46,940호에도 이와 유사하게 인터페론 베타를 회수, 정제해서 생리활성을 갖도록 하는 기술이 개시되어 있다.

의약적인 제제로서 인터페론 베타가 유용하게 사용되기 위해서는 생리적 활성을 유지하는 순수한 단백질로 정제되어야 하며, 대량생산이 가능하여야 하고, 또한 의약적인 제제로서 적합한 조성이 이루어져야 한다. 대장균으로부터 인터페론 베타를 정제하는 방법으로 지금까지 알려진 기술들은, 다음과 같은 몇가지 문제점들을 내포하고 있다. 즉, 이온교환 크로마토그래피를 사용하거나 역상 크로마토그래피를 사용했을 때 인터페론 베타가 컬럼에 부착되어 용출이 잘 되지 않는 경우가 있으며 이런 경우 수율이 낮아 대량생산에 부적합하다거나, 또는 SDS, 트리톤 X-100등 의약적 제제로서 혀용되지 않은, 또는 제거되지 않았을 대 인체에 해로울 수 있는 계면활성제를 사용하고 그것을 충분히 제거할 수 있는 방법을 자세히 기술하지 않고 있다. 이외에도 천연형 인터페론 베타가 당단백질인데 비해 재조합 인터페론 베타는 당이 결여되어 있고 소수성이 매우 큰 단백질이기 때문에 정제과정에서 사용한 계면활성제 등의 용해제를 제거했을 경우 인터페론 베타가 용해도가 매우 낮아져서 생리적인 수소이온 농도에서 대부분 용해되지 않는 문제점이 있다. 예를 들면, 상기의 문헌(Method in Enzymology119, 86(183-192))에 기술된 방법은 SDS를 제거하는 방법이 제시되어 있지 않으며, 상기 미합중국 특허 제 4,462,940호에서는 pH11에서 다이아여과함으로써 SDS를 10ppm이하로 줄였으나, 이 경우 인터페론 베타의 용해도를 유지시키기 위해서는 pH를 7.5로 조정하고 5% 정도의 HSA(human serum albumin)를 첨가해야 한다. 그러나 인터페론 베타를 pH11에 장시간 노출시킬 경우 단백질이 매우 불안정해지는 단점이 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 이러한 문제점들을 개선하여 높은 순도와 생리학적 활성을 갖는 인터페론 베타를 대량으로 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

이러한 본 발명의 목적에 따라, 인터페론 베타가 봉입체 형태로 생성된 재조합 대장균을 파쇄하여 봉입체를 포함하는 침전물을 분리하고, 상기 침전물을 세척하여 구아니딘염 용액에 옹해시키고, 상기 용액에 암모늄 설페이트를 첨가하여 단백질을 침전시키고, 상기 단백질 침전물을 계면 활성제를 포함하는 완충 용액에 용해시켜 젤 여과 크로마토그래피하여 인터페론 베타를 함유하는 분획을 수집하고, 유기 용매를 사용하여 상기 수집된 분획으로부터 계면 활성제가 제거된 단백질 침전물을 제조하고, 상기단백질 침전물을 용해시켜 단백질 원상화 조건 하에서 원상화시키는 단계를 포함하는, 생리학적 활성을 갖는 인터페론 베타를 고순도 및 수율로 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

인터페론 베타가 봉입체 형태로 생성된 재조합 대장균은 에틸렌디아미노에틸 트리아세트산(EDTA)을 포함한 완충용액 중에서 파쇄하는데 상기 완충 용액의 pH는 약 8.5내지 9.0 정도가 바람직하다. 세포파쇄는 당해 분야에 공지된 여러 방법 중의 하나를 사용하여 수행할 수 있으나, 대량 정제에는 공기충격을 주는 기계로 연속적인 파쇄가 가능한 마이크로 플루이다이저를 사용하는 것이 바람직하다.

파쇄된 대장균 세포를 원심분리하여 수용성 단백질을 제거하고 단백질 봉입체를 포함하는 침전물을 회수하고 상기 침전물은 계면활성제가 포함된 완충용액으로 세척하여 불순단백질을 용해시켜 제거하고 불용성 봉입체만을 회수한다. 이때 계면활성제는 트리톤계통이나, 데옥시콜레이트가 사용될 수 있으며 특히 트리톤 X-100이 적당하다. 트리톤 X-100이 사용될 경우 0.1-0.2%의 농도로 사용한다. 이 세척과정에서 라이소자임을 첨가해 37℃에서 30분간 반응시킴으로써 더욱 정제된 봉입체를 회수할 수 있다.

세척된 봉입체는 원심분리에 의해서 회수하며 구아니딘 염 용액, 바람직하게는 8M염산구아니딘염에 녹인 후 암모늄설페이트를 이용하여 단백질을 침전시킨다. pH는 7.5내지 9.0, 바람직하게는 pH8.5인 상태에서, 포화된 암모늄설페이트 용액을 1/2부피 첨가함으로써 단백질을 침전시킨다.

침전된 단백질은 계면활성제, 예를 들면 소듐도데실설페이트(SDS)에 녹이는데, 이때 계면활성제의 농도는 0.5 내지 2.0%가 바람직하다.

그 후 두 단계의 젤여과 크로마토그래피에 의해 고순도의 인터페론 베타폴리펩타이드를 정제한다. 상기 젤여과 크로마토그래피는 G-75 및 S-100컬럼을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 크로마토그래피 단계는 디티오트레이톨이나 2-머캡토 에탄올에 의해 단백질이 환원된 상태에서 수행하는 것이 바람직하다.

정제된 인터페론 베타를 용해하고 있는 계면활성제 용액은 유기 용매, 예를 들면 아세톤을 같은 부피로 첨가하여 계면활성제를 침전시켜 제거한 후, 단백질 구조를 원상화시켜 생리활성을 재현시키기 위해 단백질 원상화 조건하에서 반응시킨다. 예를 들면, 우선 8M염산구아니딘 용액에 상기 침전물을 녹인 후 단백질 구조 원상화를 위한 완충용액으로 희석시킨다. 이러한 원상화 과정은 4내지 10℃에서 실시되는데, 상기 단백질 용액을 단백질구조 원상화를 위한 완충용액에 최종 단백질 농도가 50내지 150㎍/㎖, 염산구아니딘 용액의 농도가 0.8내지 1.0M이 되게 희석하고 3시간 이상 10시간 정도 방치한 다음, 투석이나 다이아여과에 의해 염산 구아니딘염을 제거함으로써 원상화시킬 수 있다.

단백질 구조 원상화를 위한 상기 완충용액으로는 pH 6내지 8의 트윈계 계면활성제를 0.002-0.2% 포함하는 완충용액이 바람직하다.

이러한 과정을 거처 10ppm이하의 계면활성제만을 포함하며 3∼3 × 10⁷IU/mg의 항바이러스 생리활성을 갖는 인터페론 베타를 제조할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의거 구체적으로 설명되나 본 발명의 범위가 이에 의해 제한되지는 않는다.

실시예

(단계 1)세포파쇄

인터페론 베타 유전자를 포함하는 재조합 대장균(KFCC 10717)을 10ℓ의 발효배지에서 배양하여 상기 유전자를 발현시킨 후, 원심분리하여 세포 침전물을 수집하여 50mM 트리스-HCI pH8.8및 25mM EDTA가 포함된 완충용액에 1:5(w/v)로 현탁시킨 후 8,000xg에서 원심분리한 침전물을 50mM트리스-HCI pH 8.5, 5mM EDTA완충용액에 현탁한 후 마이크로플루이다이저(microfluidizer)로 0-10,000psig 의 기압강하로 3회 통과시켰다.

(단계 2)봉입체 세척

파쇄된 세포현탁액 2L를 8,000xg에서 1시간 원심분리해서 얻은 침전물을 20mM트리스-HCI pH8.8및 1mM EDTA 및 0.2%트리톤 X-100이 포함된 완충용액(A)에 현탁하여 라이소자임을 400mg첨가해 37℃에서 30분 교반하고 8,000xg에서 1시간 동안 원심분리하였다. 침전물을 같은 완충용액(A)에 한번 더 현탁하여 교반한 후 12,500xg에서 30분 동안 원심분리하였다. 침전물은 8M염산구아니딘염 용액 500㎖에 녹인 후 NaOH로 pH8.5되게 조정하고 포화된 암모늄설페이트 250㎖을 첨가하였다. 12,500xg로 30분동안 원심분리하여 침전물을 회수하고 이를 증류수로 세척하였다.

(단계 3)젤여과 크로마토그래피

상기 (단계 2)에서 수득한 침전물을 5% SDS, 0.5% 2-머캡토에탄올 80㎖에 녹여 약 두사긴에 걸쳐 녹였다. 이 시료를 0.5% SDS, 50mM소듐 아세테이트 pH5.5완충용액으로 평평화시킨 G-75컬럼에 주입시켜 시간당 2.5㎖㎝^2-1h^-1의 속도로 흘려주면서 용출시켰다. 용출된 단백질 분획을 15% SDS-PAGE(SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동)로 확인한 후 인터페론 베타 분획을 모아서 1/2부피의 아세톤을 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 제1도는 상기 G-75크로마토그래피의 결과를 크로마토그램과 SDS-PAGE로 나타낸 것이다. 이 단계에서는 인터페론 베타보다 작은 분자량의 불순물을 포함한 분획을 제거함으로써 순도 약 93%정도의 단백질을 얻을 수 있다.

상기 침전물을 다시 5% SDS에 녹여, 50mM소듐아세테이트 pH5.5, 1% SDS, 0.2M NaCl완충용액으로 평형시킨 S-100컬럼에 주입해서 3.8㎖㎝^2-1h^-1의 속도로 용출시켰다. 15%SDS-PAGE에 의해 인터페론 베타를 포함하는 분획을 확인하고 순수한 분획만을 모았다. 정제된 인터페론 베타를 은 염색법(silver staining)으로 분석한 결과 약98%이상의 순도를 갖는 것으로 확인되었다. 제2도는 s-100에 의한 크로마토그래피의 결과를 크로마토그램과 SDS-PAGE로 확인한 결과이며, 이단계에서 인터페론 베타보다 큰 분자량을 가진 불순물이 제거된다.

(단계 4) SDS제거 및 생리활성 재현

상기(단계 3)에서 수집한 분획에 1배 부피의 아세톤을 조금씩 섞어 약 10분정도 교반한 후 8,000xg에서 10분간 원심분리하였다. 침전물을 50% 아세톤으로 세척한 후, 600㎖의 염산구아니딘염에 녹이고 디티오트레이톨을 35㎖첨가하였다. 상기 용액을 4℃로 미리 냉각시켜 놓은 0.01% 트윈 80(Tween 80)이 포함된 10mM인산염 완충용액(pH 7.6)6ℓ로 희석하였다, 희석된 용액을 4℃에서 10시간 방치하고 1.5ℓ로 농축한 뒤 5배 부피의 PBS(phosphate buffered sline)로 다이아여과하여 구아니딘 염을 제거하였다. 최종 정제된 인터페론 베타의 활성을 항 바이러스 방법(J. A. Amstrong, Methods in Enzymology 78, 381)으로 측정한 결과 3×10⁷IU/㎎으로 나타났다.

제3도는 정제된 인터페론 베타 용액에서 SDS를 제거하고, 단백질 구조를 원상화시키고 생리적인 수소이온 농도에서 용해될 수 있도록 하는 조건을 도식화한 것이다. 제3도에서 가로축은 트윈의 농도를 나타낸ㄷ. 제3도에서 보듯이, 재조합 인터페론 베타는 소수성이 매우 크기 때문에 단백질 구조를 원상화시키는 과정에서 매우 낮은 농도를 유지해야 하며, 적정한 양의 계면 활성제가 존재하는 상태에서는 서로 엉기지 않는다.

Claims

인터페론 베타가 봉입체 형태로 생성된 재조합 대장균을 파쇄하여 봉입체를 포함하는 침전물을 분리하고, 상기 침전물을 세척하여 구아니딘염 용액에 용해시키고, 상기 용액에 암모늄 설페이트를 첨가하여 단백질을 침전시키고, 상기 단백질 침전물을 계면활성제를 포함하는 완충 용액에 용해시켜 젤 여과 크로마토그래피하여 인터페론 베타를 함유하는 분획을 수집하고, 유기 용매를 사용하여 상기 수집된 분획으로부터 계면활성제가 제거된 단백질 침전물을 제조하고, 상기 단백질 침전물을 용해시켜 단백질 원상화 조건하에서 원상화시키는 단계를 포함하는, 인터페론 베타의 개선된 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 봉입체를 포함하는 침전물을 비이온성 계면활성제인 트리톤 X-100을 0.1내지 0.2% 포함하는 완충용액으로 세척하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 완충용액에 라이소자임을 추가로 첨가하는 방법.
제1항에 있어서, 사익 구아니딘염 용액이 8M염산 구아니딘 염 용액임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 유기용매로 아세톤을 사용하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 계면활성제를 제거한 단백질 침전물을 8M염산구아니딘염에 용해시킨 후 pH6내지 8의 완충용액으로 상기 염산구아니딘염의 농도가 0.8 내지 1.0M이 되도록 희석하는 단계를 포함하는 단백질 원상화 조건에서 원상화시킴을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 완충용액은 트윈계 계면활성제를 0.002 내지 0.02% 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.