KR920000099B1

KR920000099B1 - 효모에서 발현된 인간성장호르몬의 정제방법

Info

Publication number: KR920000099B1
Application number: KR1019900003465A
Authority: KR
Inventors: 원특연; 최형배; 서정원; 한규범
Original assignee: 주식회사 럭키; 최근선
Priority date: 1990-03-15
Filing date: 1990-03-15
Publication date: 1992-01-09
Also published as: KR910016925A

Abstract

내용 없음.

Description

효모에서 발현된 인간성장호르몬의 정제방법

제1도는 본 발명의 정제과정에 따라 얻어진 중간생성물 및 최종생성물을 15% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)하여 나타낸 것이다.

본 발명은 효모에서 발현된 인간성장호르몬을 고순도로 분리정제하는 방법에 관한 것이다.

인간성장호르몬은 뇌하수체에서 생성하는 191개의 아미노산기로 구성된 분자량 약 21,500의 펩타이드 호르몬으로서, 주로 왜소증 치료에 사용되어 왔다(Raben, M.S.J. Clin.Endocr.18, 901(1958)).

종래에는 죽은 사람의 뇌하수체에서 인간성장호르몬을 추출 및 정제하여 사용하여 왔으며, 최근에는 유전공학기술을 이용하여 대장균에서 인간성장호르몬을 발현 및 분리 정제하는 방법이 사용되고 있다(대한민국 특허공고 제89-1244호 및 제87-701호와 특허공개 제87-2258호 및 제84-8696호).

그러나 대장균을 이용하는 경우에는 인간성장호르몬을 제거해야 하는 문제점이 있는 바, 이러한 문제점을 해결하기 위해 본 발명자들은 대장균이 아닌 효모를 이용하여 인간성장호르몬을 제조하는 방법을 개발하고, 이를 대한민국 특허출원 제88-18191호 및 제88-18192호로 출원한 바 있다.

더 나아가, 본 발명자들은 이 효모로부터 인간성장호르몬을 균질하면서도 높은 생리활성을 유지하도록 정제할 수 있는 새로운 방법을 개발하고자 예의 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 인간성장호르몬을 높은 생리활성을 가지며 임상에 적용가능하도록 고순도로 대량 정제시키는 방법을 제공하는데 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 제조합 효모로부터 인간성장호르몬을 분리정제하는데 있어서, (가) 인간성장호르몬이 발현되어 있는 효모를 완충용액에 현탁 및 분쇄시킨 후,pH를 상승시키고, 잔해물을 제거한 다음, (나) pH를 저하시킨 후 가용성 단백질을 제거하고, pH를 상승시켜 단백질을 용해시키고, pH를 다시 5.0 내지 6.5의 범위로 저하시킨 후 침전물을 제거하여서 상등액을 얻은 다음, (다) 음이온 교환 크로마토그라피하고, (라) 겔 여과 크로마토그라피한 후, (마) 음이온 교환 크로마토그라피하고, (바) 소수성 겔 크로마토그라피한 다음, (사) 글리신/소듐 포스페이트 혼합용액에 용매 투석시켜서 효모로부터 인간성장호르몬을 정제하는 방법을 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명의 정제방법을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 인간성장호르몬이 발현되어 있는 효모를 완충용액[10mM Tris(Tris-히드록시메틸아미노에탄), 10mM EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)에 현탁시키고, 0.5 내지 0.75mm 직경의 유리구슬로 갈아서 세포벽을 분쇄시킨 다음, 이를 원심분리시켜서 침전된 세포 잔해물을 제거한다.

그 다음, 상기에서 얻어진 상등액에 아세트산을 첨가하여 pH를 저하시켜서 인간성장호르몬을 비롯한 일부 단백질을 침전시키고 이를 원심 분리하여 가용성 단백질을 제거하였다. 침전된 단백질에 가성소다를 첨가하여 pH를 상승시켜서 용해시키고, 이 용액에 다시 아세트산을 첨가하여 pH를 적당히, 바람직하게는 pH 5.0 내지 6.5의 범위로 저하시켜준 후 침전된 불순물을 원심 분리하여 제거한다.

이렇게 하여 얻어진 상등액은 pH를 적당하게 맞춘 후에 곧바로 음이온 교환 크로마토그라피에 적용시킬 수 있으며, 혹은 가성소다를 넣어 침전된 단백질을 용해시켜 용액으로 만든 후 세라믹여과막(Millipore사 제품), 특히 구멍크기가 0.2μm 또는 0.45μm인 막으로 여과한 다음에, 이 여과액을 음이온 교환 크로마토그라피에 적용시킬 수 있다. 이때 겔로는 DE-52(Whatman사 제품) 또는 DEAE_세파로즈(Pharmacia사 제품) 등을 사용할 수 있다. 상기 칼럼을 통과시켜 유리된 단백질은 제거하고 겔에 흡착된 단백질은 100mM NaCl로 용출시킨다.

용출된 용액에 적당한 농도의 요소를 넣은 후 농축하여 이를 겔 여과 크로마토그라피에 적용시키는 바, 이때 겔로는 세파크릴 S-200(Pharmacia 사 제품), S-300(Pharmacia사 제품) 등을 사용할 수 있다. 여기에서 용출되어진 다분획을 전기영동하여서 인간성장호르몬의 순도가 80%이상 되는 부분을 수집한다.

상기에 의해 80%이상의 순도로 정제된 인간성장호르몬을 다시 음이온 교환 크로마토그라피한다. 이때 겔로는 DE-52셀룰로스(Whatman사 제품) 또는 DEAE-세파로즈(Pharmacia사 제품)을 사용할 수 있다.

단백질을 겔에 흡착시킨 후 완충용액[10mM Tris, 60mM NaCl, pH 7.5]으로 세척하고, 완충용액[10mM Tris, 70mM NaCl]으로 용출시킨다.

그런 다음, 이 용출된 용액에 적당한 농도로 염화나트륨을 첨가한 후 소수성 크로마토그라피한다. 이때 겔로는 페닐세페로즈 CL-4B(Pharmacia사 제품), 부틸세파로즈 CL-4B(Pharmacia사 제품) 또는 옥틸세파로즈 CL-4B(Pharmacia사 제품)를 사용할 수 있다. 여기에서 용출되어진 각 분획을 전기영동하여서 인간성장호르몬의 순도가 95%이상 되는 부분을 수집한다.

이로써, 높은 생리활성을 갖는 인간성장호르몬을 고순도로 정제할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 인간성장호르몬이 발현된 효모는 본 출원인에 의한 대한민국 특허출원 제88-18191호 및 제88-18192호에 의한 것이며, 이에 따른 인간성장호르몬 발현벡터[pYLBC-GAP-HGH]를 함유하는 미생물 Saccharomyces cerevisiae[pYLBC-GAP-HGH]는 한국종균협회에 1988년 12월 27일자 기탁 번호 KFCC-10668호로 기탁되어 있고, 인간성장호르몬 발현벡터[pYLBC-A/G-HGH]를 함유하는 미생물 Saccharomyces cerevisiae[pYLBC-A/G-HGH]는 한국종균협회에 1988년 12월 27일자 기탁번호 KFCC-10669로 기탁되어 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

인간성장호르몬이 발현된 효모 500g을 1500ml의 완충용액[10mM Tris, 10mM EDTA; pH 8.0]에 현탁시킨 후, 0.5 내지 0.75mm의 유리구슬을 넣은 다이노밀에서 5분간 분쇄시켰다. 여기에 1N NaOH를 넣어 pH 11로 상승시킨 후, 이를 10,000xg에서 10분간 원심 분리하여 상등액을 회수하였다.

이때 얻어진 상등액에 10% 아세트산을 첨가하여 pH 4.0로 저하시킨 후, 이를 10,000xg에서 10분간 원심분리하여 침전물층을 회수하였다. 침전물 1500ml의 증류수를 넣고 1N NaOH를 첨가하여 pH 11로 상승시킨 후 10시간 동안 교반시켜서 용해시켰다. 여기에 다시 0.2% 아세트산을 첨가하여 pH 5.5로 저하시킨 후 이를 10,000xg에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다.

상기 상등액을 pH 8.0이 되도록 조절한 후에 완충용액[10mM Tris, pH 8.0]으로 미리 평형시킨 DE-52(Whatman사 제품, 재질: 셀룰로스) 컬럼(5×10cm)에 1ml/min의 속도로 통과시키면서 겔에 흡착시키고, 컬럼에 다시 완충용액] 10mM Tris, pH 8.0]을 통과시켜서 컬럼내에 유리된 상태로 남아있는 단백질을 모두 제거하였다. 그 다음 완충용액[10mM Tris, 100mM NaCl: pH 8.0]을 이용하여서 겔에 흡착되어 있던 단백질을 용출시켰다. 이때의 용출속도는 2ml/min으로 하였다.

상기 용출된 분획에 2M의 요소농도가 되도록 요소를 첨가하고 한외여과막(Amicon사 제품)을 이용하여 부피가 20ml가 되도록 농축한 다음, 완충용액[10mM Tris, pH 8.0]으로 미리 평형시킨 S-200(Pharmacia사 제품, 재질: 교차 결합된 아가로즈)으로 겔 여과 크로마토그라피하였다. 용출된 각 분획을 15% 소디움도데실설페이트-폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)하여 덴시토미터 스캔닝한 결과 인간성장호르몬의 순도가 80%이상이 되는 분획만을 수집하였다.

상기 수집한 분획을 완충용액[10mM Tris,pH 7.5]으로 미리 평형시킨 DE-52(Whatman사 제품, 재질: 셀룰로스)컬럼(5×10cm)에 2ml/min속도로 통과시키면서 겔에 흡착시켰다. 컬럼에 다시 완충용액[10mM Tris, pH 7.5]을 통과시켜 컬럼내에 유리된 상태로 남아있는 단백질을 모두 제거하고, 완충용액[10mM Tris, 60mM NaCl]을 통과시켜 세척하였다. 그 다음, 용액[10mM Tris, 70mM NaCl]를 통과시켜 겔을 흡착되어 있던 단백질을 용출시켰다. 용출된 각 분획을 15% SDS-PAGE하여 덴시토미터스캐닝한 결과 인간성장호르몬 순도가 90%이상이 되는 분획만을 수집하였다.

상기 수집한 분획에 염화나트륨을 2M 농도로 첨가하고 완충용액[10mM Tris, 2M NaCl, pH 7.5]으로 미리 평형시킨 페닐 세파로즈 CL-4B(Pharmacia사 제품, 재질: 교차 결합된 아가로즈) 컬럼(5×10cm)에 통과시키면서 겔에 흡착시키고 컬럼에 완충용액[10mM Tris, 2M NaCl, pH 7.5]을 통과시켜 유리된 상태로 남아 있는 단백질을 모두 제거하였다. 그 다음 완충용액[10mM Tris, 1M NaCl, pH 7.5] 및 완충용액[10mM Tris, pH 7.5]을 이용하여서 NaCl의 농도구배가 1M부터 0M까지 되도록 선형구배시켜서 용출시켰다. 용출된 각 분획을 15% SDS-PAGE하여 덴시토미터 스캐닝한 결과 인간성장호르몬의 순도가 95%이상되는 분획만을 수집하였다.

상기 분획을 한외여과막(Amicon사 제품)을 이용하여 농축시킨 후 완충용액[0.27M 글리신, 0.6mM 소듐 포스페이트, pH 7.4]에 충분히 용매투석시켜 250mg(역가 2.5IU/mg)의 인간성장호르몬을 얻었다.

상기 과정에 따른 단계별 중간생성물 및 최종 생성물과 단백질 표준시료를 15% SDS-PAGE하여 그 결과를 제1도에 나타내었는 바, 제1레인은 단백질 표준시료로서 위로부터 가인산분해효소/소의 혈청알부민/오브알부민/탄산탈수효소/라이소자임이고, 제2레인은 인간성장호르몬이 발현된 효모를 분쇄시킨 것이며, 제3레인은 제2레인의 분쇄물을 10,000xg에서 원심분리하여 세포잔해물을 제거하고 난 후의 상등액이며, 제4레인은 제3레인의 상등액을 pH4로 저하시켰을 때 침전된 단백질을 용해시킨 시료이며, 제5레인은 제4레인의 시료를 pH 5.5로 상승시켜 침전된 불순물을 제거한 상등액이며, 제6레인은 제5레인의 상등액을 음이온 교환 크로마토그라피하여 겔에 흡착되어진 단백질을 용출시킨 부분이고, 제7레인은 제6레인의 상등액을 겔 여과 크로마토그라피한 다음에 용출시킨 부분이며, 제8레인은 제7레인의 상등액을 음이온 교환 크로마토그라피한 부분이고, 제9레인은 제8레인의 상등액을 소수성 크로마토그라피하여 정제가 완료된 인간성장호르몬이다.

[실시예 2]

인간성장호르몬이 발현된 효모 1000g을 3000ml의 완충용액[10mM Tris, 10mM EDTA; pH 8.0]에 현탁시킨 후, 0.5 내지 0.75mm의 유리구슬을 넣은 다이노밀에서 5분간 분쇄시켰다. 여기에 1N NaOH를 넣어 pH 11로 상승시킨 후, 이를 10,000xg에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 이때 얻어진 상등액에 10% 아세트산을 첨가하여 pH 4.0로 저하시킨 후, 이를 10,000xg에서 10분간 원심분리하여 가용성 단백질을 제거하고 침전물층을 회수하였다.

침전물에 3000ml의 증류수를 넣고 1n NaOH를 첨가하여 pH 11로 상승시킨 후 10시간 동안 교반시켜서 용해시킨 다음, 세라믹여과막(Millipore사 제품)으로 여과하고, 그 여과액을 한외여과막(Amicon사 제품)을 이용하여 농축하였다. 세라믹여과(0.2μg) 실험결과를 다음의 표에 나타내었다.

[표]

그 다음, 상기 농축액을 실시예 1과 동일하게 DE-52크로마토그라피, S-200겔 여과 크로마토그라피, DE-52크로마토그라피, 페닐 세파로즈 CL-4B크로마토그라피를 차례로 수행한 결과 실시예 1에서와 같이 순도 95% 이상의 인간성장호르몬 500mg을 얻었다.

Claims

재조합 효모로부터 인간성장호르몬을 분리정제하는데 있어서, (가) 인간성장호르몬이 발현되어 있는 효모를 완충용액에 현탁 및 분쇄시킨 후,pH를 상승시키고, 잔해물을 제거한 다음, (나) pH를 저하시킨 후 가용성 단백질을 제거하고, pH를 상승시켜 단백질을 용해시키고, pH를 다시 5.0 내지 6.5의 범위로 저하시킨 후 침전물을 제거하여서 상등액을 얻은 다음, (다) 음이온 교환 크로마토그라피하고, (라) 겔 여과 크로마토그라피한 후, (마) 음이온 교환 크로마토그라피하고, (바) 소수성 겔 크로마토그라피한 다음, (사) 글리신/소듐 포스페이트 혼합용액에 용매 투석시켜서 효모로부터 인간성장호르몬을 정제하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (다) 및 (마)단계의 음이온 교환 크로마토그라피는 DE-52셀룰로스 또는 DEAE-세파로즈를 이용하여 실시되는 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (라)단계의 겔 여과 크로마토그라피는 세파크릴 S-200 또는 S-300을 이용하여 실시되는 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (바)단계의 소수성 겔 크로마토그라피는 페닐-세파로즈 CL-4B, 부틸세파로즈 CL-4B 또는 옥틸세파로즈 CL-4B를 이용하여 실시되는 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (나)단계에서 얻어진 상등액을 세라믹 여과막으로 여과한 후 그 여액을 상기 (다)단계의 음이온 교환 크로마토그라피에 사용하는 것임을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 세라믹 여과막은 그 구멍크기가 0.2μm 또는 0.45μm인 것임을 특징으로 하는 방법.