KR100841599B1 - 칼슘 이온-결합 단백질의 정제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 칼슘 이온-결합 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 킬레이트제를 첨가하는 것과 같은 전처리 하지 않고 칼슘 이온-결합 단백질 및 오염물을 포함하는 액상 샘플로부터 단순하고 효율적인 방식으로 칼슘-결합 단백질을 분리 및 정제하는 방법을 제공하는 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 칼슘 이온의 존재하에 단백질을 양이온 교환 담체와 접촉시켜 칼슘 이온-결합 단백질을 교환 담체에 흡착시키고, 세척한 후 상기 단백질을 용출시키는 것을 포함하는 칼슘 이온-결합 단백질을 정제하는 방법, 및 본 발명의 방법에 의해 수득된 실질적으로 오염물을 갖지 않는 칼슘 이온-결합 단백질에 관한 것이다.

Description

칼슘 이온-결합 단백질의 정제 방법{Method of purifying calcium ion-binding protein}

본 발명은 양이온 교환 방법에 의해 칼슘 이온-결합 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 칼슘의 존재하에 칼슘 이온-결합 단백질을 양이온 교환 담체와 접촉시켜 상기 단백질을 양이온 교환 담체에 흡착시키고, 세척한 후, 양이온 교환 담체로부터 상기 단백질을 용출시키는 것을 포함하는, 칼슘 이온-결합 단백질 정제 방법, 및 상기 방법에 의해 수득된, 실질적으로 오염물을 포함하지 않는 칼슘 이온-결합 단백질에 관한 것이다.

오염물로부터 관심의 대상이 되는 단백질을 분리 및 정제하기 위하여 상기 단백질의 분자크기, 표면상의 전하 또는 용해도와 같은 물리화학적 성질을 이용한다. 단백질 화학분야에서 통상 사용되는 정제 방법은 예를 들면, 염처리(salt out), 한외여과, 등전침전, 전기영동, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등을 포함한다. 상당히 다양하고 상이한 단백질이 존재하는 살아있는 조직, 세포 또는 혈액으로부터 관심의 대상이 되는 단백질을 정제하는 경우, 상기 방법은 자주 여러가지 방식으로 조합된다. 그러나, 특정한 종류의 단백질이 통상 공유하고 있는 성질을 사용하여 더욱 특이적으로 정제하는 방 법을 제공할 수 있다.

예로서, 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제하는 유일한 방법은 일본 특허 공개공보 제 200180/1990호에 기재된 바와 같이 2가 양이온-결합 단백질을 특이적을 정제시키기 위해 2가 양이온-결합 단백질을 음이온 교환 수지에 흡착시킨 후 그로부터 2가 양이온으로 용출시키는 것이다. 이 방법에 따라, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이트제를 2가 양이온-결합 단백질을 포함하는 용액에 가하여 우선 2가 이온을 제거한다. 이후, 생성된 용액을 MonoQ와 같은 음이온 교환 수지와 접촉시켜 2가 양이온-결합 단백질을 음이온 교환 수지에 흡착시킨다. 최종적으로, 염화나트륨 및 염화칼슘을 가하여 음이온 교환 수지로부터 2가 양이온-결합 단백질을 용출시킨다. 그러나, 대부분의 자연발생 단백질은 생리 조건하에서 음이온이므로 관심의 대상이 되는 단백질외의 다수의 오염물이 음이온 교환 수지에 우선적으로 흡착되기 때문에 원하는 단백질을 효과적으로 정제하는 것을 방해한다. 그러므로, 원하는 단백질을 음이온 교환 수지에 흡착시켜 정제하는 이 방법은 소량의 단백질 용액에 대하여 또는 정제 과정의 사전 공정에서 바람직하게 사용된다.

일본 특허 공개공보 제 258286/1995호에 염화칼슘을 비타민 K-의존 단백질을 포함하는 용액에 가하고 생성된 용액을 음이온 교환 수지에 통과시켜 오염 단백질 로부터 원하는 단백질을 분리시키는 음이온 교환 방법에 의해 칼슘 이온-결합, 비타민 K-의존 단백질을 정제하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 이 방법은 특히 다량으로 수행하는 경우 원하는 단백질을 포함하는 다량의 분획을 통과시켜야 한다는 점에서 불리하고 따라서 연속되는 과정은 곤란할 것이다.

칼슘 이온-결합 단백질중 하나인 아넥신 V는 항응고 활성, 각막상피-확장 활성, 및 포스포리파제 A₂ 억제 활성과 같은 생리학적 활성을 갖는 당쇄를 포함하지 않는, 분자량이 약 34kDa인 단순 단백질이다. 아넥신 V는 인간 태반을 포함하는 생체내 다양한 조직 및 분비물에 분포되어 있다고 공지되어 있다(Chem. Pharma. Bull., 38, 1957-1960, 1990). 아넥신 V는 칼슘 이온에 의해 지질막에 결합하는 능력을 갖기 때문에 칼슘 이온-결합 단백질로 명명된다.

아넥신 V는 인간 또는 동물의 기관으로부터 추출되었다(일본 특허 공개공보 174023/1987). 그러나, 현재는 유전자 재조합 기술을 사용하여 E. Coli 및 효모에서 제조될 수 있다(일본 특허 공개공보 20095/1989 및 219875/1991).

아넥신 V는 통상 침전, 막여과 및 원심분리로 아넥신 V-포함 용액을 전처리한 후, 황산암모늄 분별결정, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마그래피 및 친화도 크로마토그래피의 조합에 의해 정제되었다(Jurgen Romisch et al., Biochem. J. 272, 223-229, 1990; T. R. Hawthorne et al., Journal of Biotechnology 36, 129-143, 1994).

발명의 개시

그러나, 이 방법들은 정제 공정이 복잡하고 다량의 노동 및 시간을 요구하여 곤란하다는 점에서 불리하고 생산성 및 수율과 관련하여 장애에 부딪힐 수 있고, 이는 산업 규모로 아넥신 V를 정제함에 적절치 못하게 한다. 또한, 대규모 정제 방법으로서 이 방법은 아넥신 V의 정제도를 증진시키기 위하여 다소 비싼 헤파린 세파로스를 사용하기 때문에 경제적인 측면에서 불리하다. 앞서, 본 발명자는 단백질 용액을 전처리하여 어느 정도까지 오염물을 제거한 후 생성된 용액상에서 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 아넥신 V를 정제하는 방법을 제공하였다(일본 특허 공개공보 219875/1991). 이 방법은 산업 규모로 아넥신 V를 정제할 수 있지만 본 발명의 방법보다 월등하지 않을 것이다.

상기 기재된 바와 같이, 산업 규모로 사용되기 위하여 통상의 방법은 비용, 효율 및 처리면에서 문제를 안고 있다.

본 발명의 목적은 킬레이트제의 첨가와 같은 전처리없이 칼슘 이온-결합 단백질 및 오염물을 포함하는 액상 샘플로부터 단순하고 효율적인 방식으로 칼슘-결합 단백질을 분리 및 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 방법에 의해 수득된 고순도 아넥신 V를 제공하는 것이다.

이러한 상황하에, 본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위하여 조사하였고 칼슘 이온-결합 단백질중 하나인 아넥신 V가 염화칼슘의 존재하에 거의 중성 pH에서 SP-세파로스 양이온 교환 담체에 흡착된다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 아넥신 V는 칼슘 이온 존재하에서 SP-세파로스 양이온 교환 담체에 특이적으로 흡착되지만 칼슘 이외의 2가 양이온, 예를 들면, 마그네슘 이온의 존재하에서는 거의 흡착되지 않았다는 점에 주목하였다. 이 발견과 함께, 본 발명자들은 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 다량의 아넥신 V-생산 세포 균질액에 염화칼슘을 가하고 생성된 균질액을 염화 칼슘을 포함하는 염화암모늄 완충액으로 평형화된 SP-세파로스 양이온 교환 담체와 접촉시켰다. 세척 후, 칼슘 이온의 존재하에 염화칼슘을 감소 또는 제거하거나 염화나트륨을 포함하는 염화암모늄 완충액으로 용출시켜 고순도의 아넥신 V를 성공적으로 정제하였다. 또한, pH 9.0에서 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 잔재하는 미량의 프로테아제를 성공적으로 제거할 있었다.

따라서, 본 발명은 염화칼슘의 존재하에 SP-세파로스 양이온 교환 담체를 사용하여, 자연 발생되거나 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 칼슘 양이온-결합 단백질의 정제 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득된 자연 발생되거나 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 칼슘 양이온-결합 단백질을 포함한다.

도면의 간단한 설명

도 1A 및 1B는 아넥신 V 구조 유전자의 클로닝 및 상기 유전자로 형질전환된 효모 세포의 제조의 모식도이다.

도 2는 (a) 양이온 교환 크로마토그래피전의 샘플, (b) 양이온 교환 크로마토그래피에 통과된 분획, 및 (c) 세척 후 양이온 교환 크로마토그래피로부터 용출된 분획의 겔 여과 크로마토그래피의 결과를 나타낸다.

도 3은 세척 후 양이온 교환 크로마토그래피로부터 용출된 분획의 겔 여과 크로마토그래피의 결과를 나타낸다.

도 4는 SP-세파로스로부터의 아넥신 VI의 용출 패턴을 나타낸다.

도 5는 아넥신 VI의 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 사진이다. 레인 1: BioRad 프리스테인된 마커 단백질; 포스포리파제 B(116,000), BSA(80,000), 오브알부민(52,500), 탄산 안하이드라제(34,900), 소이빈 트립신 억제제(29,900), 라이소자임(21,800); 레인 2: 아넥신 VI 표준; 레인 3; DEAE-Toyopearl로 용출(샘플); 레인 4: SP-세파로스, 분획 5; 레인 5; 분획 7; 레인 6: 분획 9; 레인 7; 분획 16; 레인 8; 분획 51;레인 9 분획 54; 및 레인 10; 분획 57.

도 6은 SP-세파로스로부터의 응고 인자 X의 용출 패턴을 나타낸다.

도 7은 응고 인자 X의 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 사진이다. 레인 1: BioRad 프리스테인된 마커 단백질; 포스포리파제 B(116,000), BSA(80,000), 오브알부민(52,500), 탄산안하이드라제(34,900), 소이빈 트립신 억제제(29,900), 라이소자임(21,800); 레인 2: 상업적으로 이용가능한 응고 인자 X; 레인 3; 분획 4; 레인 4; 분획 7; 레인 5: 분획 11; 레인 6; 분획 12.

본 발명을 수행하는 최상의 모드

본 발명의 방법은 칼슘 이온의 존재하에 칼슘 양이온-결합 단백질을 포함하는 액상 샘플을 양이온 교환 담체와 접촉시킨 후, 칼슘 이온의 농도를 감소시키거나 제거하고/거나 카운터 이온(염)의 농도를 증가시켜 단백질을 용출 및 회수하는 방법을 포함한다. 본 발명의 방법은 고순도로 칼슘 양이온-결합 단백질을 생산할 수 있다. 양이온 교환 담체와의 접촉 과정은 배쓰식(in a batch) 또는 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 크로마토그래피를 사용하는 경우, 생산 규모에 따라 칼럼 크기를 적절하게 선택할 수 있다.

본 원에서 사용되는 바, 양이온 교환 담체는 제한하는 것은 아니지만, SP-세파로스, CM-세파로스, CM-셀룰로오스, SE-셀룰로오스, S-스페로덱스, SP-스페로실 등을 포함하고, 이들 모두는 상업상 이용가능하다. 이중, SP-세파로스가 바람직하게 사용된다.

담체와 접촉시키는 단백질 용액의 양은 용액의 농도 또는 흡착에 대한 담체의 능력에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, SP-세파로스의 경우, 단백질의 0.1 내지 30g/ℓ의 담체가 사용될 수 있다. 바람직하게 단백질의 15 내지 20g/ℓ의 담체가 사용될 수 있다.

양이온 교환 담체에 대한 흡착시 유속은 1 내지 150cm/h, 바람직하게 15 내지 100cm/h, 더욱 바람직하게 50 내지 80cm/h일 수 있다. 한편, 양이온 교환 담체로부터 흡착된 단백질의 용출에 대한 유속은 1 내지 150cm/h, 바람직하게 30 내지 100cm/h, 더욱 바람직하게 30 내지 80cm/h일 수 있다.

양이온 교환 담체에 대한 흡착 또는 양이온 교환 담체로부터의 흡착된 단백질의 용출을 위해 사용될 수 있는 완충액은 이온 교환 크로마트그래피에서 통상 사용되는 어느 완충액, 염화암모늄 완충액, 시트레이트 완충액, 아세테이트 완충액 및 Tris-HCl 완충액을 포함한다. 이중, 염화암모늄 완충액이 바람직하다. 완충액의 농도는 5 내지 100mM, 바람직하게 10 내지 40mM의 범위일 수 있다. 완충액은 pH 5 내지 10, 바람직하게는 단백질 분해효소가 제거되는 조건인 pH 8 내지 9.5으로 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게, 20mM(약 pH 9.0)의 염화암모늄 완충액이 사용된다.

칼슘 이온의 공급원으로서, 칼슘 이온을 공급할 수 있는 어느 기질, 염화칼슘, 탄산칼슘, 바람직하게 염화칼슘을 사용할 수 있다.

다량의 염화칼슘을 조직 또는 세포 또는 혈장의 균질액에 가하는 경우, 수소성 단백질 또는 고분자 화합물이 염처리의 결과로서 침전되기도 한다. 따라서, 칼슘 이온은 바람직하게 칼슘 양이온-결합 단백질이 양이온 교환 담체에 결합하고 이로부터 분리될 수 있도록 할 뿐만 아니라 칼슘 이온-결합 단백질을 포함하는 액상 샘플로부터 침전물을 형성하지 않도록 하는 양으로 사용될 수 있다.

칼슘 양이온-결합 단백질을 양이온 교환 담체에 흡착시키기 위하여 5 내지 100mM 농도의 칼슘 이온이 바람직하게 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게, 10 내지 30mM 농도의 칼슘 이온이 사용될 수 있다. 양이온 교환 담체에 흡착 및 이로부터의 용출을 위해 사용되는 완충액과 혼합하여, 20mM 염화암모늄을 포함하는 20mM 염화암모늄 완충액(pH 9.0)를 바람직하게 사용할 수 있다.

완충액중 칼슘 이온의 수준을 제거 또는 감소시키거나 칼슘 이온외의 다른 카운터 이온을 첨가하거나, 또는 둘 모두에 의해 흡착된 칼슘 양이온-결합 단백질을 담체로부터 용출시킬 수 있다. 카운터 이온은 Na⁺, Li⁺, K⁺ 이온 등을 포함한다. 바람직하게, 1 내지 500mM, 더욱 바람직하게 50 내지 500mM, 더욱더 바람직하게 50 내지 300mM 염화나트륨을 염화암모늄 완충액에 가하여, 가장 바람직하게 200mM 염화나트륨을 20mM 염화칼슘을 포함하는 20mM 염화암모늄 완충액(pH 9.0)에 가하여 용출을 수행할 수 있다. 또한, 흡착된 칼슘 이온-결합 단백질은 단지 염화칼슘 수 준을 5mM 미만으로 감소시켜 담체로부터 용출시킬 수 있다.

본 발명의 방법은, 단독으로 사용되는 경우에도, 80% 이상의 순도로 칼슘 이온-결합 단백질의 정제를 제공할 수 있다. 그러나, 다른 정제 방법과 조합하여 더욱 효과적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 칼슘 이온-결합 단백질을 포함하는 액상 샘플이 불용성 물질로 오염된 경우, 본 발명의 방법에 앞서 원심분리, 염처리, 막여과 등과 같이 불용성 물질을 제거하는 전처리를 바람직하게 수행한다.

상기 기재된 방법외에도, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 포함하는 다양한 크로마토그래피 방법의 다른 정제 방법을 본 발명의 방법과 함께 수행하여 고순도의 칼슘 이온-결합 단백질을 제공할 수 있다. 본 발명의 방법은 상기 기재된 방법의 어느 공정에서 사용될 수 있다. 바람직하게, 칼슘 이온-결합 단백질을 포함하는 샘플을 전처리하여 불용성 물질을 제거한 후, 본 발명의 방법을 사용하고, 음이온 교환 크로마토그래피를 한다. 더욱 특히, 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 수득한 아넥신 V-포함 분획을 50mM 염화나트륨을 포함하는 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4)으로 평형화된 Q-세로파스 칼럼에 사용하고, 세척한 후, 50mM 내지 500mM 농도의 염화나트륨의 선형 구배로 용출을 수행하여 더욱 고순도의 아넥신 V를 수득한다.

본 발명의 방법에 의해 정제되는 칼슘 이온-결합 단백질은 전형적으로 아넥신 I, II, III, IV, V, VI 및 VII를 포함하지만 응고 인자 X와 같이 칼슘 이온에 결합하는 능력을 갖는 어느 단백질일 수 있다.

본 발명의 방법은 자연 발생되거나 칼슘 이온-결합 단백질을 생산하도록 유전적으로 조작된 동물로부터의 혈액, 체액 및 조직 균질액, 및 식물 세포, 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포 및 동물 세포를 포함하는 재조합 세포의 세포 균질액 및 배양 상등액에 효율적으로 사용될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 방법은 칼슘 이온-결합 단백질을 생산하는 재조합 효모 세포에서 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 방법은 아넥신 V를 생산하는 효모 세포의 세포 균질액 또는 배양 상등액에서 사용될 수 있다.

따라서, 특정 생리학적 활성을 갖는, 제조된 아넥신 V는 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 안정화제 또는 방부제와 혼합되어 주사세, 안구 드롭제, 경구용 제제, 좌제와 같은 통상의 투여형의 약제학적 제제로 제형화될 수 있다.

본 발명에 따라, 칼슘 이온-결합 단백질을 고순도로 정제하는 효율적인 방법이 제공된다. 또한, 실질적으로 오염물을 갖지 않는, 본 발명의 방법에 의해 수득된 칼슘 이온-결합 단백질이 제공된다.

본 발명의 방법에 따라, 생리적 조건하에서 음전하인 대부부의 단백질을 양이온 교환 담체에 통과시켜, 칼슘 이온과 복합체를 형성할 수 있는 칼슘 이온-결합 단백질을 담체에 우선적으로 흡착시킨다. 따라서, 본 발명의 방법은 원하는 단백질외의 단백질을 오염시켜 양이온 교환 담체의 흡착 수용능력을 저하시키지 않고 한번에 다량의 샘플을 처리할 수 있다.

제조예: 아넥신 V를 생산하는 재조합 효모 세포의 제조

아넥신 V를 생산하는 재조합 효모 세포를 특허 공개공보(일본 특허 공개공보 219875/1991)에 기재된 바와 같이 제조하였다. 도 1은 재조합 효모 세포의 제조를 도식적으로 나타내고 여기서 용어 "CPB-I"은 "아넥신 V"를 언급한다.

(1) 아넥신 V 구조 유전자의 클로닝

인간 태반 cDNA 라이브러리(Clontech Laboratories, Inc.)로부터, 항-아넥신 V 모노클로날 항체를 사용하여 면역선별(immunoscreen)에 의해 아넥신 V 구조 유전자를 포함하는 파지를 분리하였다. 이어서 DNA를 파지로부터 제조하고 제한효소 EcoRI으로 분해하여 단편을 생산한 후, pUC118 벡터의 EcoRI 사이트내로 삽입하du pMKT7을 작제하였다.

(2) 발현 플라스미드의 작제

플라스미드 pMKT7을 제한효소 NcoI 및 SacI으로 분해하고 아넥신 V 구조 유전자를 포함하는 DNA 단편을 아가로스 전기영동에 의해 분리하였다. 합성 링커를 첨가하여 DNA 단편의 양 말단을 XhoI 및 BamHI 사이트로 전환시켰다. 생성된 DNA 단편을 발현 벡터 pPS1의 XhoI 및 BamHI 사이트내로 삽입시켜 발현 벡터 pAPCPBI을 작제하였다.

(3) 재조합 효모 세포의 제조

숙주 효모 세포(사카로마이세스 세레비시아에 AH22(Saccharomyces cerevisiace AH22)을 리튬 아세테이트 기술에 의해 발현 플라스미드 pAPCPBI으로 형질전환시켰다. 형질전환 후, 류신이 결핍된 아가 배지상에 출현한 콜로니를 분리 하고 발현 수준을 측정하였다. 더욱 높은 발현 수준을 갖는 클론을 선별하고 아가 배지에 반복하여 심고, 콜로니를 분리하고 발현 수준을 측정하여 안정한 재조합 효모 세포를 수득하였다.

실시예 1: 재조합 아넥신 V의 정제

(1) 아넥신 V-생산 재조합 효모 세포의 배양

아넥신 V-생산 재조합 효모 세포를 3일동안 28℃에서 2ℓ의 합성 선별 배지상에서 배양하였다. 이어서 재조합 효모 세포를 88ℓ의 선별 배지에 접종하고 2일동안 28℃에서 배양하였다. 재조합 효모 세포를 810 ℓ의 반합성 배지(1ℓ배지중 40g 수크로오스, 5g 효모 추출물, 5g 황산암모늄 및 0.5g 황산마그세슘 셉타하이드레이트(septahydrate))로 이동시키고 24시간동안 28℃에서 배양을 계속하였다.

(2) 정제전 다량의 아넥신 V의 전처리

다량의 배양액을 0.1㎛ 막 필터로 여과하여 물리적으로 파열된 재조합 효소 세포를 프렌치 프레스(French press)형 세포 호모게네이터(homogenater)로 회수하였다. 파열된 세포 현탁액을 막 필터로 여과하고 여액을 한외여과기로 농축시켯다. 등전 침전을 위해 농축액에 아세트산을 가하였다(pH 5.0). 형성된 침전물을 막 필터로 여과하고 침전물을 제거하였다. 이어서, 여액의 pH를 암모니아를 사용하여 9.0으로 조정하고 여액을 한외여과기에 의해 재농축시켰다(전처리 용액).

(3) 양이온 교환 크로마토그래피(염화칼슘 수준을 감소시키거나 제거함에 의한 용출)

전처리 용액에 염화칼슘 용액을 가하여 최종 농도를 20mM으로 하고 SP-세파 로스(Pharmacia)로 양이온 교환 크로마토그래피시켰다. 특히, 염화칼슘으로 보충된 전처리 용액을 20mM 염화칼슘 및 50mM 염화나트륨을 포함하는 20mM 염화암모늄 완충액(pH 9.0)으로 평형화된 칼럼에 사용하였다. 완충액을 세척하고, 칼럼을 추가로 20mM 염화칼슘을 포함하는 20mM 염화암모늄 완충액(pH 9.0)으로 세척하였다. 이후, 아넥신 V를 20mM 염화암모늄 완충액(pH 9.0)으로 용출시켰다.

(4) 양이온 교환 크로마토그래피(염화나트륨 수준의 증가에 의한 용출)

공정 (3)과 같이, 전처리 용액을 염화칼슘 용액과 함께 최종 농도 20mM까지 가하고 SP-세파로스로 양이온 교환 크라마트그래피하였다. 특히, 염화칼슘으로 보충된 전처리 용액을 20mM 염화칼슘 및 50mM 염화나트륨을 포함하는 20mM 염화암모늄 완충액(pH 9.0)으로 평형화된 칼럼에 사용하였다. 완충액을 세척하고, 20mM 염화칼슘을 포함하는 20mM 염화암모늄 완충액(pH 9.0)으로 50mM 내지 300mM 이하의 염화나트륨의 선형 구배 농도에 의해 아넥신 V를 용출시켰다(흡착 및 용출시 유속: 56.7cm/h).

도 2는 각각 (a) 양이온 교환 크로마토그래피전의 샘플, (b) 양이온 교환 크로마토그래피에 통과된 분획, 및 (c) 양이온 교환 크로마토그래피로부터 용출된 분획의 겔 여과 크로마토그래피에 의해 수득된 용출 패턴을 나타낸다. 125.6cm/h의 유속으로 0.14M NaCl을 포함하는 10mM 인산 완충액(pH 7.2)로 평형화된 TSKgel G3000 SWx1(7.8mm(ID)x30cm)에 20㎕의 샘플을 사용하는 겔 여과 크로마토그래피를 수행하였다. 양이온 교환 크로마토그래피로부터 용출된 분획에 대한 겔 여과 크로마토그래피의 결과를 표 1에 나타내었고 여기서 순도는 용출 패턴으로부터 얻었다.

(5) 음이온 교환 크로마토그래피(통상의 기술과 비교)

전처리 용액에 대하여 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 50mM 염화나트륨을 포함하는 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4)으로 평형화된 Q-세파로스 (Pharmacia) 칼럼에 전처리 용액을 사용하였다. 세척후, 50mM 내지 300mM 이하의 염화나트륨의 선형 구배 농도에 의해 용출시켰다. 용출된 분획에 대한 겔 여과 크로마토그래피에의 결과를 표 1에 나타낸다.

통상의 기술에 의해 수득된 아넥신 V 및 본 발명의 방법에 의해 수득된 것을 추가의 정제 방법으로 추가 정제한 후 그들의 항-응고 활성을 측정하였다. 일본 약전(제 13 개정본, p900-901)에 기재된 바와 같이 나트륨 헤파린의 정량화와 동일하 방식으로 항-응고 활성을 측정하였다. 1mg 표준 샘플(통상의 기술에 의해 정제된 아넥신 V)에 의해 유도된 응고에 대한 연장 시간을 1 유니트(U)로 정의하여 항-응고 활성을 산정하였다. 결과, 본 발명의 방법에 의해 수득된 아넥신 V의 불활성화는 관찰되지 않았다(표 1).

표 1

	음이온 교환 크로마토그래피	양이온 교환 크로마토그래피
순도(%)	81.86	100
활성도(U/mg)	0.9 내지 1.0	0.9 내지 1.0

실시예 2: 재조합 아넥신 V의 정제

20mM 염화칼슘 및 50mM 염화나트륨을 포함하는 20mM 염화암모늄 완충액(pH 9.0)을 대신하여 20mM 염화칼슘 및 50mM 염화나트륨을 포함하는 20mM 시트레이트 완충액(pH 6.0)을 사용하고, 공정(4)의 양이온 교환 크로마토그래피에서 20mM 염화칼슘을 포함하는 20mM 염화암모늄 완충액(pH 9.0)으로 50mM 내지 300mM 이하의 선형 구배 농도의 염화나트륨을 대신하여 20mM 시트레이트 완충액(pH 6.0)을 사용하는 것을 제외하고 실시예 1에서와 같이 재조합 아넥신 V의 정제하였다. 유속 또한 흡착시 15.6 내지 54.6 cm/h 용출시 39cm/h로 변경하였다.

도 3은 양이온 교환 크로마토그래피로부터 용출된 분획의 겔 크로마토그래피에 의해 수득된 용출 패턴을 나타낸다.

실시예 3: 태반으로부터 아넥신 VI의 정제

양막 및 탯줄을 제외한 하나의 태반(약 500g)을 조각으로 자르고, 2ℓ의 생리 식염수로 세척하고, 고기 분쇄기로 다졌다. 5mM 염화칼슘, 0.1% Triton X-100 및 5mM 벤즈아미딘을 포함하는 400㎖의 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4)를 가한 후, 민스(mince)를 회전식 혼화기로 균질화하였다. 균질액을 20분동안 10,000rpm에서 원심분리하여 침전물을 회수하고, 50mM EDTA를 포함하는 300㎖의 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4)중에 재현탁시키고 균질화하였다. 균질액을 20분동안 10,000rpm에서 재 원심분리하고 상등액 추출물을 회수(약 300㎖)하고, 이것에 63g의 황산암모늄을 가하여 30% 포화 황산암모늄 용액을 제조하였다. 원심분리하여 침전물을 제거한 후, 상등액에 54g의 황산암모늄(60% 포화 황산암모늄)을 가하고 침전된 아넥신 VI 분획을 회수하였다. 염 농도를 80%로 황산암모늄이 포화될 때까지 증가시킨 경우 형성된 침전물에서 아넥신 V를 우선적으로 회수할 수 있었다.

60% 포화 황산암모늄으로 형성된 침전물을 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4)중 에 용해시키고 동일한 완충액에 대하여 투석시켰다. 투석된 용액(80㎖)을 동일한 완충액으로 평형화된 DEAE-Toyopearl(3x20cm)에 흡착시켰다. 동일한 완충액으로 세척한 후, 동일한 완충액(180㎖) 내지 0.3M NaCl을 함유하는 50mM Tris-HCl 완충액(180㎖)의 선행 구배로 용출시켰다(각 분획: 4㎖/튜브). 관심의 대상이 되는 아넥신 VI가 분획 번호 46 내지 50에서 용출되었다. 이 아넥신 VI 분획을 20mM 염화암모늄(pH 9.0)에 대하여 투석시키고, 염화칼슘을 가하여 최종적으로 20mM 염화칼슘을 포함하는 염화칼슘 완충액(pH 9.0)을 제조하였다. 투석된 용액을 20mM 염화칼슘을 포함하는 20mM 염화칼슘 완충액(pH 9.0)으로 평형화된 SP-세파로스 FF(1.5x8cm)에 흡착시켰다(도 4; 분획 번호 1 내지 15). 동일한 완충액으로 세척한 후, 0.5M NaCl로 보충된 동일한 완충액으로 용출을 수행하였다(도 4; 분획 번호 45 내지 70). 각 공정에서 샘플을 비-환원성 SDS-PAGE에 의해 분석하였고 결과를 도 5에 나타낸다.

실시예 4: 응고 인자 X의 정제

상업적으로 사용가능한 응고 인자 X(약 1mg)를 20mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)에 대하여 투석시키고, 1/10 양의 200mM 염화칼슘을 가하여 최종적으로 20mM 염화칼슘을 포함하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)을 제조하였다. 투석된 용액을 20mM 염화칼슘을 포함하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)으로 평형화된 SP-세파로스 FF(0.8x7cm)에 흡착시켰다. 20mM 염화칼슘을 포함하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)으로 세척한 후, 0.3M 염화칼슘을 포함하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH 9.0)으로 용출을 수행하였다. 모든 공정에서, 5mM 벤즈아미딘을 가하였다(벤즈아미딘은 본질 적으로 A280에서 UV 흡수를 나타내기 때문에, 용출 패턴은 명확하지 않다: 도 6). 각 공정에서 분획을 비-환원성 SDS-PAGE에 의해 분석하였고 결과를 도 7에 나타낸다.

Claims (35)

1) 칼슘 이온의 존재하에 샘플을 양이온 교환 담체와 접촉시켜 칼슘 이온-결합 단백질을 교환 담체에 흡착시키고;

2) (a) 칼슘 이온의 농도를 감소 또는 제거하거나,

(b) 칼슘 이온외의 카운터 이온을 가하거나, 또는

(c) 상기 (a) 및 (b) 양자 모두에 의해 상기 교환 담체로부터 흡착된 칼슘 이온-결합 단백질을 용출시키는 것을 포함하는,

양이온 교환 담체를 사용하여 칼슘 이온-결합 단백질을 포함하는 샘플로부터 상기 단백질을 정제하는 방법.

제 1항에 있어서, 흡착 공정을 5 내지 100mM 칼슘 이온의 존재하에 수행하는 방법.

제 2항에 있어서, 흡착 공정을 10 내지 30mM 칼슘 이온의 존재하에 수행하는 방법.

제 1항에 있어서, 흡착 공정을 1 내지 150cm/h의 유속으로 수행하는 방법.

제 4항에 있어서, 흡착 공정을 15 내지 100cm/h의 유속으로 수행하는 방법.

제 4항에 있어서, 흡착 공정을 50 내지 80cm/h의 유속으로 수행하는 방법.

제 1항에 있어서, 용출 공정을 칼슘 이온의 농도를 5mM 미만으로 감소시켜 수행하는 방법.

제 1항에 있어서, 용출 공정을 1 내지 500mM의 칼슘 이온외의 카운터 이온을 가하여 수행하는 방법.

제 1항에 있어서, 용출 공정을 50 내지 500mM의 칼슘 이온외의 카운터 이온을 가하여 수행하는 방법.

제 1항에 있어서, 용출 공정을 50 내지 300mM의 칼슘 이온외의 카운터 이온을 가하여 수행하는 방법.

제 1항에 있어서, 카운터 이온이 Na⁺, Li⁺ 및 K⁺로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.

제 1항에 있어서, 용출 공정을 1 내지 150cm/h의 유속으로 수행하는 방법.

제 12항에 있어서, 용출 공정을 30 내지 100cm/h의 유속으로 수행하는 방법.

제 12항에 있어서, 용출 공정을 30 내지 80cm/h의 유속으로 수행하는 방법.

제 1항에 있어서, 양이온 교환 담체가 SP-세파로스, CM-세파로스, CM-셀룰로오스, SE-셀룰로오스, S-스페로덱스 및 SP-스페로실로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.

제 1항에 있어서, 칼슘 이온-결합 단백질이 아넥신 I, II, III, IV, V, VI 및 VII로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.

제 1항에 있어서, 샘플이 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 칼슘 이온-결합 단백질을 포함하는 방법.

제 1항에 있어서, 흡착 및 용출 공정을 pH 5 내지 10에서 수행하는 방법.

제 18항에 있어서, 흡착 및 용출 공정을 pH 8 내지 9.5에서 수행하는 방법.

제 19항에 있어서, 흡착 및 용출 공정을 pH 9에서 수행하는 방법.

제 1항에 있어서, 흡착 공정을 10 내지 30mM 칼슘 이온의 존재하에 pH 8 내지 9.5에서 15 내지 100cm/h의 유속으로 수행하고; 용출 공정을 30 내지 80cm/h의 유속으로 칼슘 이온의 농도를 5mM 미만으로 감소시키거나 Na⁺, Li⁺ 및 K⁺로 구성된 그룹으로부터 선택되는 50 내지 300mM의 카운터 이온을 가하여 수행하고; 양이온 교환 담체가 SP-세파로스이고; 칼슘 이온-결합 단백질이 아넥신 V이고; 샘플이 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 아넥신 V를 포함하고; 프로테아제를 샘플로부터 제거하는 방법.

제 1항에 있어서, 흡착 공정을 10 내지 30mM 칼슘 이온의 존재하에 pH 8 내지 9.5에서 15 내지 100cm/h의 유속으로 수행하고; 용출 공정을 30 내지 80cm/h의 유속으로 칼슘 이온의 농도를 5mM 미만으로 감소시키거나 Na⁺, Li⁺ 및 K⁺로 구성된 그룹으로부터 선택되는 500mM의 카운터 이온을 가하여 수행하고; 양이온 교환 담체가 SP-세파로스이고; 칼슘 이온-결합 단백질이 아넥신 VI이고; 샘플이 자연 발생 아넥신 VI을 포함하고; 프로테아제를 샘플로부터 제거하는 방법.

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