SU1184434A3 - Способ выделени надокисной дисмутазы из белковых растворов - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НАДОКИСНОЙ ДИСМУТАЗЫ ИЗ БЕЛКОВЫХ РАСТВОРОВ, включающий хроматографию ферментсодержащего белкового раствора на катионообменной смоле, отличающ и и с   тем, что, с целью увеличени  выхода и повышени  степени чнстоты фермента, хроматографию ферментсодержащего белкового раствора ведут при рН 4,7-5,0 на катионообменной смоле с той же пол рностью, что и надокисна  дисмутаза, причем в качестве катионообменной смолы используют карбоксиметипцеллкшозу или декстраны, содержапдае карбоксиметильные или сульфопропипьные группы , или агарозы, содержащие карбоксиО ) метильные группы. С

Description

1 Изобретение относитс  к способу извлечени  содержащей медь и цинк надокисной дисмутазы (НЕД) из водных растворов, содержащих указанный энзим совместно с сопутствующими протеинами. Надокисные дисмутазы представл ют стэбой энзимы, каталитически воздействующие на дисмутацию надокисного радикала 0 до кислорода и перекиси водорода 207 2Н х- 11 - О Энзимы, обладающие этим свойством выделены из многочисленных различны организмов, Надокисные дисмутазы, содержащие медь и цинк в их активных участках обнаружены в цитоплазме эвкариотов. Эти энзимы представл ют собой двумерные молекулы, которые про вл ют высокую степень гомологии в свойственной им последовательности аминокислот lj . Другой класс надокисных дисмутаз содержащих железо или марганец в их |активных участках, обнаружен в прокариотах и эвкарлютной митохондрии. СледЬвательно, у этого класса имеет место большое сходство в составе аминокислот и Ц -оконечных аминокислот . Однако существенна  гомологи  между двум  классами надокисных дксмутаз отсутствует. По-видимому функци  Дисмутаз состоит в защите клеток аэробных организмов от токсических воздействий перекисного радикала,  вл ющегос  побочным продуктом реакции-кислорода в организме . Считают, что надокисный радикал вызьгаает различные воспалительные процессы в ткан х и что он содействует по влению ревматоидных артритов . По этой причине предложено использовать надокисную дисмутазу дл  л чени  воспалительных заболеваний и,в можно , ревматоидных артритов. Терапевтическое действие содержащей мед и цинк надокисной дисмутазы в отношении воспалительных заболеваний ус тановлено опытным путем. Таким обра зом, большое значение имеет разрабо ка способа измельчени  содержащей медь и цинк надокисной дисмутазы в промьшшенком масштабе и с высоким выходом. . Среди содержащих медь и цинк надокисных дисмутаз в наибольшей степени изучен бычий энзим. Так, 4 известны полна  последовательность аминокислот и рентгеновска  структура этого энзима. Кроме того, проведены исследовани  разнообразными спектроскопическими способами. Содержащую медь и цинк надокисную дисмутазу, быков и других высших животных, извлекают, например, из органов и тканей, в особенности из печени, путем экстрагировани  мелко изрубленной ткани холодным буферным раствором, а в случае крови путем гемолиза эритроцитов. После этого, в обоих случа х, из полученного раствора водорастворимых протеинов производ т извлечение НЕД. Извлечение осуществл ют, например, путем фракционированного осаждени  органическими растворител ми или сульфатом аммони , в произвольном случае - в сочетании с денатурацией лобильных по отношению к нагреванию протеинов, вызываемой нагреванием в присутствии ионов двухвалентных металлов, или хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе или на других ионообменньпс смолах. Низкомолекул рные загр зн ющие примеси обычно удал ют из очищенного раствора путем диалига или подвергают такой раствор фильтрованию с помощью гел  на геле декстрана. Известен способ очистки энзима посредством пропускани  раствора эн-; Зима через буферный раствор, обладаю-щий ионной силой до 10 мол рной концентрации, при рН 5,5-8, наход щийс  в колонне с ионообменной смолой, причем эта смола обладает группировками слабоосновного или слабокислотного характера, привлекающими ионы противоположной пол рности . В качестве смолы может быть использована карбоксиметилцеллюлоза, однако этот продукт в интервале рН . 5,5-8 не обладает противоположной пол рностью относительно НЕД 21. Известен двухфазный способ извлечени  содержащей медь и цинк надокисной дисмутазы из дрожжей согласно которому полученную после замораживани  и оттаивани  плотную дрожжевую массу, перемешивают прцблизительно в таком же объеме смеси этанола с хлороформом в объемном соотношении 5:3 в течение нескольких часов при 25°С. Затем смесь центрифугируют, всплывший прозрачный слой смешивают с твердым вторичным кислым фосфатом кали  (К,НРО), выделенную солью органическую фазу отдел ют и осветл ют центрифугированием. После этого осаждают протеины добавлением холодного ацетона, осадок повторно раствор ют в холодном фосфатном буфере при рН 7,8 и очищают от имею щих коричневатый цвет примесей микрогранулированной диэтиламиноэтилцеллюлозой ДЕ-32. Светло-зеленый фильтрат диализуют относительно фос фатного буфера при-рН 7,8 и после осветлени  центрифугированием хрома тографируют на колонке, содержащей ДЕ-32 З. В результате обработки водных растворов протеина согласно известному способу или не удаетс  получит достаточно чистмй продукт, или же процессы настолько сложны, что привод т к слишком малому выходу чисто го энзима. Цель изобретени  - увеличение вы хода и повышение степени чистоты фермента. Дл  достижени  цели согласно спо собу выделени  надокисной дисмутазы из белковых растворов, включающему хромс-тографию ферментсодержащего белкового раствора на катионообменной смоле, хроматографию ферментсодержащего белкового раствора ведут при рН 4,7-5,0 на катионообменной смоле с той же пол рностью, что и ,надокисна  дисмутаза, причем в качестве катионообменной смолы исполь зуют карбоксиметилцеллюлозу или дек страны, содержащие карбоксиметильные или сульфопропильные группы, или агарозы, содержащие карбоксиметильные группы. Пример 1. Процесс согласно изобретению обеспечивает хорошее вьиеление НЕД из смеси с другими, имеющимис  в наличии протеинами, в водных растворах, полученных из ука занных. различных сырьевых материалов , несмотр  на то, что согласно теории монообменныё смолы про вл ют сродство лишь к веществам, имеющим противоположную пол рность. Таким образом, катионообменные смолы и НЕ могут иметь одну и ту же пол рность в предлагаемом интервале рН. В качестве катионообменных смол могут быть использованы следующие: различные марки карбоксиметилцеллюлозы , в частности КМ-23 и КМ-52 (фирмы Ватман Лимитед, Великобритани ) , карбоксиМетилцеллюлоза КМ- Сефацел (фирмы Фармациа Фаин Кеми-. келз АБ, Швеци ), имеющий поперечные св зи декстран, замещенный карбоксиметильными группами, под названием КМ-Сефадекс (фирмь: Фармаци  Фаин Ке шкелз АБ), имеющий поперечные св зи декстран, замещенный сульфопропильными группами, под названием СП-Сефадекс (фирма Фармациа Фаин Кемикелз АБ), и имеюща  поперечные св зи агароза, замещенна  карбоксиметильными группами, под названием КМ-Сефароза КЦ-6Б (фирма Фармаци  Фаин Кемикелз АБ). Хроматографирование раствора на катионообменной смоле может осуществл тьс  периодически путем перемешивани  гранулированного ионообмени- вающего продукта в растворе, однако более выгодно осуществл ть эту операцию в колонне. Така  операци  легко осуществима в услови х крупномасштабного производства и обеспечивает адсорбцию всего энзима на ионообменной смоле. После очистки раствора посредством ионообменной хроматографии, активные фракции продукта, отмытые из адсорбента, можно дополнительно очищать по известному способу фильтровани  с применением гел  или фракционированного спиртового осаддени , дополнительно подверга  очищенный продукт хроматографировачию один или несколько раз. Предпочтительно диализовать активные фракции против дистиллированной воды и концентрировать досуха, желательно путем высушивани  вымораживанием. Пример 2. 2,5 л диэтилового эфира добавл ют к 20 кг хлебопекарных дрожжей (Saccharotnyces cerevisial ) и смесь оставл ют на 30 мин при перемешивании. После дополнительного примерно 2-часового перемешивани  при .С добавл ют 20 л гор чей воды, довод т рН до 7,5 и продолжают перемешивание 4 часа при 45°С. После дальнейшего 16-часового перемешивани , сопровождающегос  постепенным снижением температуры до , довод т рН до 4,8 и суспензию осветл ют центрифугированием при 2000-кратном значении G р течение 30 мин.

Дл  удалени  соединений с низкой молекул рной массой полученную после центрифугировани  жидкость п тикратно разбавл ют буфером в виде 0,01 -Н раствора ацетата натри  при 4,8 и сокращают в объеме до 10л, примен   ультрафильтрование. Последнюю процедуру повтор ют дважды

К концентрированному раствору добавл ют 1 л микрогранулированной карбоксиметилцеллюлозы КМ-52 (фирма Ватман Лимитед), котора  уравновешена с помощью 0,025 М раствора ацетата натри  в качестве буфера , и смесь перемешивают 1 ч. Карбоксиметилцеллюлозу собирают в колонну диаметром 30 см, промывают 10 л буфера Е виде 0,025 М раствора ацетата натри  при рН 4,8 и-перенос т в колонну диаметром 10 см. В этой колонне осухцествл ют отмывку из адсорбента раствором ацетата натри  при наличии линейного градиента концентрации (0,,200 М) при рН 4,8 в общем объеме 6 л. Скорость перемещени  потока 400 мл/ч. Собирают фракции по 30 мл. Собранные активные фракции, имеющие интенсивно-красную окраску, объедин ют и концентрируют посредством ультрафильтровани  до проведени  высушивани  вымораживанием.

Пробу, полученную после высушивани  вьпугораживанием, повторно раствор ют в 50 мл 0,025 М раствора ацетата натри , служащего буфером, при рН 4,8 и перенос т в 5-40 см колонну с гелем декстрана (Сефадекс Г-50 Суперфайн, фирма Фармаци  Фаин Кемикелз АБ), уравновешенного относительно ацетатного буфера. Наход щийс  в колонне адсорбент отмывают 1 л 0,025 М раствора ацетата натри  при рН 4,8 и собирают фракции по 5 мл. Скорость движени  потока составл ет 110 МП/ч. В результате хроматографировани  на геле зелена , содержаща  медь и цинк-, перекисна  дисмутаза отдел етс  от красного гемипротеина, хот  обе полосы расположены очень близко.

Активные фракции объедин ют и перенос т в 510 см колонну, заполненную СМ-52 и уравновешенную 0,025 М раствором ацетата натри  при рН 4,7. Адсорбент, наход щийс  в колонне, отмьгоают при наличии линейного градиента изменени  концентрации ацетата (0,025-- 0,200М) при рН 4,8. Примен ют общий объем 1200 мл при скорости движени  потока 200 мл/ч и собирают фракции по 6 мл. Активные фракции объедин ют, диализуют относительно дистиллированной воды и высушивают вымораживанием.

Фильтрование с наличием гел  можно повторить при проведени  осаждени спиртом. Пробу, высушенную вымора- живанием, после периодически проведеной операции с СМ-52 раствор ют в 100 мл буфера в виде 0,005 М раствора фосфата кали  при рН 7,0 и постепенно добавл ют 57 мл этанола. После 10-минутного центрифугировани  при 13000 об/мин добавл ют еще одну порцию 166 мл этанола к жидкости, полученной после центрифугировани . Осадок собирают центрифугированием при 13000 об/мин и повторно раствор ют в 50 мл буфера в виде 0,025 М раствора ацетата натри  при рН 4,8. После этого пробу перенос т в колонну с СМ-52, как описано вьше активные фракции диализуют против дистиллированной воды, затем высушивают вымораживанием.

Результаты очистки даны в табл.1

Выход после фракционировани  с применением КМ-52, что предусматривает 115-кратную степень очистки по отношению к концентрату после ультрафильтровани , составл ет 75% от общего числа единиц в концентрате. Если катионообменное хроматографирование провод т таким же образом, но с применением других катионообменных смол получают следующие выхода НЕД, %: .

КМ-5275

Км-2361

КМ-Сефадекс Г50 75 КМ-Сефароза КЛ-6Б 85 СП-Сефадекс64

Пример 3. Гемолиз и очистка гемоглобина.

7 л декантированной крови, котора  уже содержит около 2 л плазмы и таким образом соответствует приблизительно 5 л уплотненных кров ных телец, смешивают с 7 л 96%-ного этанола при интенсивном перемешивании. Через 1 ч добавл ют 15 л деионизированной воды и продолжают перемещивание еще 30 мин.

Суспензию центрифугируют на центрифуге с ксрзинкой, типа MSE, приблизительно при 2000 об/мин и полученную Плотную массу гемоглобина промывают .2 л воды до опустошени  центрифуги . Получают 29,1 л выделенной на центрифуге жидкости.

Вьщеление углекислотной ангидразы .

Выделенную на центрифуге жидкость обрабатьшают на 1X12 см цилиндрической .матрице. Сефароза - глицилтирознназобензолсульфонамид . Углекислотнуто ангидразу отмьшают из адсорбента 0,2 М водным раствором тиоцианата кали , содержащим 0,05 моль трис -сульфата и имеющим рН 6,5.

Вьщелеине НЕД и каталазы.

Раствор, содержащий НЕД и каталазу , довод т до рН 4,75 с помощью 1 М уксусной кислоты и пропускают через 20 см колонну, заполненную плотным слоем 2 л КМ-23, который уравновешен в 20 мМ ацетатом натри  в качестве б5гфера, рН 4,8. Скорость движени  потока приблизительно 15 л/ч. Затем ионообменник промьшают 15 л буфера в виде 20 мМ ацетата натри , рН 4,8.

Отмьшку из адсорбента, наход щегос  в колонне, производ т при линейном градиенте 3 л 1000 мМ и 3 л 200 мМ ацетата натри  и скорости движени  потока 1,5 л/ч. НЕД отмьюают приблизительно при 150 мМ ацетате натри .

Каталазу отмывают из адсорбента с помощью О,1 М раствора фосфата натри  в виде буфера.

Фракции, содержащие НЕД и каталазу , собирают раздельно и ультрафильтруют на мембране ДДС-600 в камере

ДЦС-МФ (фирма Де данкске Суккер Фаб рикер А/С).

Очистка НЕД..

Раствор НЕД диафильтруют с применением 10 мМ натрий-фосфатного буфера при рН 7,5 и дополнительно очищают хроматографией на ДЕ-52 колонне 58 см, уравновешенной 10 мМ натрийфосфатным буфером при рН 7,5. Колонку про вл ют при линейном градиенте мл 10 мМ натрий-фосфатного буфера , рН 7,5 содержащего ,125 М хлорид натри . Скорость движени  потока 110 мл/ч. Собирают фракции по 10 МП.

Фракции, содержащие НЕД, объедин ют . Удельна  активность и адсорбционный спектр свидетельствуют о чистоте энзима.

Очистка каталазы.

Раствор каталазы после ультрафильровани  очищают путем фракционировани  сульфатом аммони .

Регенераци  колонны КМ-23. После отмывки каталазы через колонку пропускают 3 л 0,5 М раствора гидрата окиси натри , затем 3 л воды. Далее через колонку пропускают 3 л 0,5 М раствора хлористоводородной кислоты, после этого 3 л воды и 3 л натрийацетатного буфера при рН 4,8.

Колонну в заключение обрабатывают 20 мМ натрий-ацетатным буферо.м при рН 4,8 до тех пор, пока проводимость и рН жидкости, вымытой из адсорбента, не станут такими же, как у буфера. После этого колонка готова дл  употреблени .

Результаты вьщелени  и очистки НЕД, каталазы и углекислотной ангндразы из 5 л красных кров ных телец приведены в табл. 2.

г

O - О

о

о.

со ЧО

fo

1Л

о о

to

- о

ъ

CN

о о

см ю

VD CN

СТч

о о о

О г00

о

СУч

ГЛ

о о о г

LO

00 а

о а

О О го о со

OS

4D

CN

m

СО

о о

CJ

«

ел

+ о

о

C-J

ю

«ч

г

о

о I

ЧО tго

2

см

о

го

LO

7 л декантированной крови+7 л эта-:

14 иолаI

Добавление 15л воды

Центрифугиров ание и промывка 2

300 82 1,3 2

0,25

290 79

290 79 0,30

1600

100

11000

100

1400

87

Claims (1)

1. СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НАДОКИСНОЙ ДИСМУТАЗЫ ИЗ БЕЛКОВЫХ РАСТВОРОВ, включающий хроматографию ферментсодержащего белкового раствора на катионообменной смоле, отличающ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода и повышения степени чистоты фермента, хроматографию ферментсодержащего белкового раствора ведут при pH 4,7-5,0 на катионообменной смоле_с той же полярностью, что и надокисная дисмутаза, причем в качестве катионообменной смолы используют карбоксиметипцеллюлозу или декстраны, содержащие карбоксиметильные или сульфопропипьные труп- § пы, или агарозы, содержащие карбоксиметильные группы.

   SU <„, 1184434 >