JPS5840472B2 - カリクレイン含有液中のキニン分解酵素の除去法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はカリクレイン含有液からキニン分解酵素を除去
する方法に関するものである。

更に詳細には、本発明は咄乳動物臓器より得られるカリ
クレインから簡単にキニン分解酵素を除去し、高純度の
カリクレインを製造する方法に関するものである。

一般に、カリクレインは、動物生体内各所で生産される
一種の蛋白分解酵素として知られている。

カリクレインは血漿中のキニノーゲンから生理活性ペプ
チド、キニンを特異的かっ、すみやかに遊離させるキニ
ン遊離酵素としての活性を有しているが、循環器系疾患
の治療剤として有効であることが分って注目されるに至
っている。

そして、医薬としてのカリクレインの需要は、近年増加
の一途をたどり、特に高純度カリクレインの安価にして
多量生産が切望されるようになった。

しかしながら、カリクレインは、給源として動物臓器を
原料とするため、共存する異種蛋白質が非常に、多く、
高純度カリクレインを得るのはきわめて困難である。

特に、カリクレインによって生成したキニンに作用する
キニン分解酵素は混入を許されるものではなく、完全に
除去されなければならないものである。

従来のカリクレインの精製方法としては、硫安塩析、溶
媒沈澱、カチオン及びアニオン交換体を用いたイオン交
換クロマト、ゲル１過等の組合せを行う方法等があるが
、これらいづれの方法においても、カリクレイン標品中
のキニン分解酵素を完全に除くことは極めて困難であっ
た。

キニン分解酵素は、生体内において、カリクレインによ
ってキニノーゲンから遊離される生理活性ペプチドであ
るキニンに作用し、それを不活性化する。

カリクレインの生理作用は、このキニンの作用に由来す
るものであるから、カリクレイン標品中のキニン分解酵
素含量は医薬品としてのカリクレインの品質を左右する
ことになるのである。

キニン分解活性を有する酵素としてはトリプシン、カル
ボキシペプチダーセ等があるが、これらの酵素は上記イ
オン交換クロマトグラフィ等の方法によって完全ではな
いにしても大部分は除くことが可能である。

しかし、本発明者等ｃ３ これらの酵素を完全に除いた
カリクレイン標品中に、なおも強いキニン分解活性を示
すペプチダーゼが存在することを認めた。

このペプチダーゼは、等電点（ＰＩ）が４．５付近にあ
るなど蛋白質的な性質がカリクレイン（ＰＩ３９〜４２
）と類似しており、通常の方法では両者を完全に分離す
ることは困難である。

このペプチダーゼを除く方法として、カリクレインの特
異的吸着担体を用いるアフイニテイクロマトグラフイが
考えられる。

これは、大豆トリフシン阻害剤、トリフロール等の天然
蛋白性阻害剤等を結合させた不溶性担体な用いて、カリ
クレインを特異的に吸着させるものである。

しかし、この方法は、リガンドとして用いられる天然蛋
白性阻害剤等がきわめて高価であることなどの理由から
大量精製には適していない。

本発明者らは、カリクレインからキニン分解酵素を容易
に除去できる大量処理法を求めて研究した結果、カルボ
キシアルキル−水不溶性担体結合物がカリクレイン中の
キニン分解酵素を特異的に吸着することを見出し、本発
明を完成するに至った。

本発明はキニン分解酵素を含有する粗カリクレイン含有
液を、カルボキシアルキル化合物を水不溶性担体に結合
させて得られるカルボキシアルキル−水不溶性担体結合
物に接触せしめ、キニン分解酵素を吸着、除去せしめる
ことを特徴とするカリクレイ含有液からキニン分解酵素
の除去法である。

本発明においては、まず、一般式 ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎＮＩ（２（ただし、ｎは２〜９
、好ましくは２〜６）で表わされるω−アミノ−脂肪酸
を水溶性担体に結合させてＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ水不
溶性担体結合物（ただし、ｎは２〜９を示す）が調製さ
れる、ここに用いるω−アミノ−脂肪酸は３−アミノ−
プロピオン酸、４−アミノ−酪酸、５−アミノ−吉草酸
、６−アミノ−カプロン酸、７−アミツーエナント酸、
８−アミノ−カプリル酸、９−アミノ−ペラルゴン酸、
１０−７ミノカプリン酸があげられる。

また、水不溶性担体としては、不活性で疎であり、不溶
性であり、しかも親水性であるような不溶性担体でなげ
ればならず、例えば、アガロース（登録商標セファロー
ス：ファルマシア・ファインケミカル社製）、デキスト
ラン（登録商標セファデックス：ファルマシア。

ファインケミカル社製）、セルロース、パウダーポリア
クリルアマイドゲル（登録商標バイオゲル：バイオラド
社製）などが用いられる。

結合反応としては通常の方法を用いることができる。

例えば、不溶性担体として多糖類を使う場合には、担体
である多糖をＰＨＩＩでＢｒＣＮ処理することによって
活性化し、次いで、例えば、６アミノーｎ−カプロン酸
溶液（ＰＨ８〜１０）に活性化した担体を加え数時間攪
拌すると、ＨＯＯＣ（ＣＨ２） ５−担体結合物が得ら
れる。

同様にＮａ Ｉ ０４を用いて活性化した場合には、活
性化した担体を酸性ＰＨ１例えばＰＨ５に調整したりガ
ント溶液に加え、数時間攪拌の後ＮａＢＨ４によって還
元することによって担体結合物を得ることができる。

ここに得られるＨＯＯＣ（ＣＨ２）ｎ−水不溶性担体結
合物肛酸性ＰＨ１好ましくは５前後のＰＨでカリクレイ
ン含有液を接触させると、カリクレインおよび大部分の
蛋白質は吸着されないが、キニン分解能を有するペプチ
ダーゼ、キニン分解酵素はほぼ完全に吸着される。

この方法によって、キニン分解活性がＯ〜５ ｎｇ Ｂ
Ｋｄｅｃｏｍｐ、／ｍｍ／ Ｋ ｕのカリクレイン標品
を得ることができる。

この際、カリクレインは担体に吸着しないので、溶離の
操作は不要で、カリクレイン活性の９５〜１００％が未
吸着区分に回収される。

また、用いた吸着担体は、塩溶液あるいは酸・アルカリ
溶液等で再生することによって再び使用することができ
る。

なお、本発明の実施例において用いた活性測定法は次の
通りである。

■、 カリクレイン生理活性 ９屋等の方法〔ザ、ジャーナル・オフ。

バイオケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ５８巻。

２０１頁（１９５６年〕〕に従って行なった。

２、プロテアーゼ活性 クニンツ（Ｋｕｎｉｔｚ ）の方法〔ザ、ジャーナル・
オフ。

ゼネラル、フイジオロジー（Ｊ。Ｇｅｎ、 Ｐｈｙｒｉ
ｏｌ ） ３０巻、２９１頁（１９４７年）〕に準じて
カゼイン分解活性をプロテアーゼ活性とした。

合成ブラジキニンを基質として、３０℃、２５分反応し
残存ブラジキニン量によるモルモット回腸の収縮から分
解されたブラジキニン量を求め、キニン分解活性とし ｎｇ ＢＫ ｄｅｃｏ ｍｐ、／ ｍｉｎ／ Ｋｕ で
値を表示した。

次に本発明の実施例を示す。

実施例 １ 豚膵臓脱脂粉末２．５ ｋｇを２５１の水に懸濁させ４
８℃、１時間水抽出後、アセトン３５〜５５％の分画沈
降を行ない、得られる沈澱を水に溶解後、６Ｎ酢酸にて
ＰＨ４，５とし生じる濁りを沢過してカリクレイン含有
液を得た。

一方ＰＨ４，５の５０ｍＭ酢酸緩衝液であらかじめ平衡
化したアンバーライトＣＧ−５０のカラムに上記カリク
レイン含有液を流し、カリクレインを吸着後０．２ Ｍ
食塩を含むＰＨ５，０の酢酸緩衝液でカリクレインを溶
出した（疎水的−イオン的クロマトグラフィ）。

この溶出液を脱塩した後、２Ｎ酢酸にてＰＨ５，０とし
、あらかじめ、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ＰＨ５，０）で平
衡化したカルボキシ・プロピル−セルロースのカラム（
６００ｍのに流し、未吸着区分３゜５１を限外１過法に
より脱塩・濃縮し、凍結乾燥を行ない精製カリクレイン
１．７１を得た。

精製カリクレインの生理活性は１０９Ｋｕ／ｗｕ？、キ
ニン分解活性は１．０ ｎｇ ＢＫ ｄｅｃｏｍｐ、
／ｍｉｎ／ Ｋｕ であった。

実施例 ２ 豚生膵６ｋｇをミンチ後６１の水に懸濁させ４８°Ｃ１
１時間水抽出後、エチルアルコール２０〜７０％にて分
画沈降を行ない得られる沈澱を水に溶解後６Ｎ酢酸にて
ＰＨ４，５とし、生じる沈澱を沢過しカリクレイン含有
液を得た。

このカリクレイン含有液を実施例１に準じて、アンバー
ライトＣＧ−５０吸着・溶離、脱塩、ＰＨ調整した後、
あらかじめ２０ｍＭ酢酸緩衝液（ＰＨ５，０）で平衡化
シタカルボキシ・ペンチル−セルロースのカラム（３０
０ｍ／？）に流し、未吸着区分３．Ｏｌを限外ｐ適法に
まり脱塩・濃縮し、凍結乾燥を行ない精製カリクレイン
１０グを得た。

精製カリクレインの生理活性は１００Ｋｕ／１ｎ９、キ
ニン分解活性は３．３ ｎｇ ＢＫ ｄｅｃｏｍ ｐ、
／ｍｉｎ／Ｋｕ であった。

実施例 ３ 豚膵臓脱脂粉末５ｋｙを実施例１に準じて、水抽出、ア
セトン分画後、ＰＨ処理を行ないカリクレイン含有液を
得た。

一方、あらかじめＰＨ４，５の０．１５Ｍ酢酸緩衝液で
平衡化したデュオライトＡ・７０カラムに上記カリクレ
イン含有液を流し、カリクレインを吸着させた後、ＰＨ
４，５の２Ｍ酢酸緩衝液でカリクレインを溶出した。

得られた溶離液を脱塩し更にＰＨ５に調整し、２０ｍＭ
酢酸緩衝液（ＰＨ５，０）で平衡化したカルボキシ・ペ
ンチル−セファロースカラム（７００ｍＡ）に流し、未
吸着区分６１を限外１過法により脱塩・濃縮後、凍結乾
燥を行ない精製カリクレイン３．３１を得た。

精製カリクレインの生理活性は１１２ Ｋｕ ／ｍ９、
キニン分解活性は２．５ ｎｇ ＢＫ ｄｅｃｏ ｍｐ
、／ｍｉｎ／Ｋｕであった。

実施例 ４ 豚膵臓脱脂粉末２ｋｙを実施例１に準じて、水抽出、ア
セトン分画後、ＰＨ処理を行ないカリクレイン含有液を
得た。

このカリクレイン含有液に１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を
加えＰＨ６とし、あらかじめ調製したリン酸カルシウム
ゲルを加えカリクレインをゲルに吸着せしめ、ゲルを懸
濁液より分離後、０．４．Ｍ食塩を含むＰＨ６の０．０
８Ｍ燐酸緩衝液で洗浄し更に１Ｍ食塩を含むＰＨ６の０
．２５Ｍ燐酸緩衝液でカリクレインを溶離した。

得られた溶離液を脱塩しＰＨ５に調整し、２０ｍＭ酢酸
緩衝液（ＰＨ５）で平衡化したカルボキシ・プロピル−
セルロースカラム（５００ｍ０に流し、未吸着区分３１
を脱塩・濃縮後、凍結乾燥を行ない精製カリクレイン１
４グを得た。

精製カリクレインの生理活性は８５Ｋｕ／■、キニン分
解活性は２．０ｎｇＢＫｄｅｃｏｍｐ、／ｍ／Ｋｕであ
った。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ キニン分解酵素を含有する粗カリクレイン含有液を
   、カルボキシアルキル化合物を水不溶性担体に結合させ
   て得られるカルボキシアルキル−水不溶性担体結合物に
   接触せしめ、キニン分解酵素を吸着、除去せしめること
   を特徴とするカリクレイン含有液中のキニン分解酵素の
   除去法。