JPS5830034B2 - カリクレインの精製法 - Google Patents
カリクレインの精製法Info
- Publication number
- JPS5830034B2 JPS5830034B2 JP53147254A JP14725478A JPS5830034B2 JP S5830034 B2 JPS5830034 B2 JP S5830034B2 JP 53147254 A JP53147254 A JP 53147254A JP 14725478 A JP14725478 A JP 14725478A JP S5830034 B2 JPS5830034 B2 JP S5830034B2
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- JP
- Japan
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- kallikrein
- water
- acetate buffer
- activity
- insoluble carrier
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、カリクレインの精製方法に関するものである
。
。
更に詳細には、本発明は、哺乳動物臓器より得られるカ
リクレインを簡単に且つ大量に高純度に精製する方法に
関するものである。
リクレインを簡単に且つ大量に高純度に精製する方法に
関するものである。
一般に、カリクレインは、動物生体内各所で生産される
一種の蛋白分解酵素として知られている。
一種の蛋白分解酵素として知られている。
カリクレインは血漿中のキニノーゲンから活性ペプチド
、キニンを特異的かつ、すみやかに遊離させるキニン遊
離酵素としての活性を有しているが、循環器系疾患の治
療剤として有効であることが分って注目されるに至って
いる。
、キニンを特異的かつ、すみやかに遊離させるキニン遊
離酵素としての活性を有しているが、循環器系疾患の治
療剤として有効であることが分って注目されるに至って
いる。
そして、医薬としてのカリクレインの需要は、近年増加
の一途をたどり、特に高純度カリクレインの安価にして
多量生産が切望されるようになった。
の一途をたどり、特に高純度カリクレインの安価にして
多量生産が切望されるようになった。
しかしながら、カリクレインは、給源として動物臓器を
原料とするため、共存する異種蛋白質が非常に多く、高
純度カリクレインを得るのはきわめて困難である。
原料とするため、共存する異種蛋白質が非常に多く、高
純度カリクレインを得るのはきわめて困難である。
従来のカリクレインの精製方法としては、硫安塩析、溶
媒沈澱、カチオン及びアニオン交換体を用いたイオン交
換クロマト、ゲル済過等の組合せを行う方法、高価な試
薬であるインヒビターを用いるアフィニティークロマト
を行う方法等があるが、これらいづれの方法においても
、精製されたカリクレインを安価にして、かつ、多量生
産する工業的方法としては確立されていない。
媒沈澱、カチオン及びアニオン交換体を用いたイオン交
換クロマト、ゲル済過等の組合せを行う方法、高価な試
薬であるインヒビターを用いるアフィニティークロマト
を行う方法等があるが、これらいづれの方法においても
、精製されたカリクレインを安価にして、かつ、多量生
産する工業的方法としては確立されていない。
本発明者らは、より簡単な方法で効率的なカリクレイン
の精製方法を求めて研究したところ、一般式Ｎ Ｈ２（
ＣＨ２） ｎ Ｎ Ｈ２（ただし、ｎ ＝ ２〜８）で
表わされる化合物を水不溶性担体に結合させたＮ Ｈ２
（ＣＨ２）ｎ−水不溶性担体結合物（ただし、ｎ −”
２〜８）に、カリクレインが特異的に吸着し、かつ容
易に溶離されることを認め、安価にして高純度なカリク
レインを得ることに成功し、本発明を完成したものであ
る。
の精製方法を求めて研究したところ、一般式Ｎ Ｈ２（
ＣＨ２） ｎ Ｎ Ｈ２（ただし、ｎ ＝ ２〜８）で
表わされる化合物を水不溶性担体に結合させたＮ Ｈ２
（ＣＨ２）ｎ−水不溶性担体結合物（ただし、ｎ −”
２〜８）に、カリクレインが特異的に吸着し、かつ容
易に溶離されることを認め、安価にして高純度なカリク
レインを得ることに成功し、本発明を完成したものであ
る。
本発明においては、まず、一般式
Ｎ Ｈ２（ＣＨ２）ｎＮ Ｈ２（ただし、ｎは２〜８を
示す）で表わされるα−ω−ジアミノアルカンを水不溶
性担体に結合させてＮ Ｈ２（ＣＨ２）ｎ−水不溶性担
体結合物（ただし、ｎは２〜８を示す）が調製される。
示す）で表わされるα−ω−ジアミノアルカンを水不溶
性担体に結合させてＮ Ｈ２（ＣＨ２）ｎ−水不溶性担
体結合物（ただし、ｎは２〜８を示す）が調製される。
ここに用いるα−ω−ジアミノアルカンとしては、エチ
レンジアミン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジ
アミノブタン、１゜５−ジアミノペンクン、１，６−ジ
アミツヘキサン、■、７−ジアミノへブタン、１，８−
ジアミノオクタンがあげられる。
レンジアミン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジ
アミノブタン、１゜５−ジアミノペンクン、１，６−ジ
アミツヘキサン、■、７−ジアミノへブタン、１，８−
ジアミノオクタンがあげられる。
また、水不溶性担体としては、不活性で組線であり、不
溶性であり、しかも親水性であるような不溶性担体でな
ければならず、例えば、アガロース（登録商標セファロ
ース：ファルマシア・ファインケミカル社製）、デキス
トラン（登録商標セファデツクス：ファルマシア・ファ
インケミカル社製）、セルロース・パウダー、ポリアク
リルアマイドゲル（登録商標バイオゲル：バイオラド社
製）などが用いられる。
溶性であり、しかも親水性であるような不溶性担体でな
ければならず、例えば、アガロース（登録商標セファロ
ース：ファルマシア・ファインケミカル社製）、デキス
トラン（登録商標セファデツクス：ファルマシア・ファ
インケミカル社製）、セルロース・パウダー、ポリアク
リルアマイドゲル（登録商標バイオゲル：バイオラド社
製）などが用いられる。
結合反応は、まず、水不溶性担体をブロムシアンで活性
化し、これにα−ω−ジアミノアルカンを添加した緩衝
液を添加することによって達成される。
化し、これにα−ω−ジアミノアルカンを添加した緩衝
液を添加することによって達成される。
ここにＮＨ２（ＣＨ２）。−水不溶性担体結合物（ただ
し、ｎは２〜８を示す）が得られる。
し、ｎは２〜８を示す）が得られる。
ここに得られるＭＨ２（ＣＨ２） ｎ水不溶性担体結合
物にｐＨ４，５〜８、好ましくはｐＨ５においてカリク
レイン含有液を接触させ、カリクレインを吸着させる。
物にｐＨ４，５〜８、好ましくはｐＨ５においてカリク
レイン含有液を接触させ、カリクレインを吸着させる。
ここで、カリクレインのみがＮＨ２（ＣＨ２）。
−水不溶性担体結合物に吸着され、カリクレイン含有液
には普通含まれているキニナーゼは全く吸着されずに流
下してしまうので、−回の吸着操作だけでキニナーゼを
含まない高純度カリクレインを得ることができるもので
ある。
には普通含まれているキニナーゼは全く吸着されずに流
下してしまうので、−回の吸着操作だけでキニナーゼを
含まない高純度カリクレインを得ることができるもので
ある。
カリクレインを吸着した担体結合物は、ｐＨ４，５〜８
、好ましくはｐＨ５で０．１５Ｍ以上の食塩などの電解
質を含む溶液にて処理し、簡単にカリクレインを溶離せ
しめることができる。
、好ましくはｐＨ５で０．１５Ｍ以上の食塩などの電解
質を含む溶液にて処理し、簡単にカリクレインを溶離せ
しめることができる。
なお本発明の試験例及び実施例において用いた活性測定
法は次の通りである。
法は次の通りである。
■、カリクレインの生理活性
９屋等の方法〔ザ・ジャーナル・オフ・バイオケミスト
リー（Ｊ−Ｂ ｉ ｏｃｈｅｍ、 ）、５８巻、２０１
頁（１９５６年）〕に従って行った。
リー（Ｊ−Ｂ ｉ ｏｃｈｅｍ、 ）、５８巻、２０１
頁（１９５６年）〕に従って行った。
２、プロテアーゼ活性
クニツツ（Ｋｕｎｉ ｔｚ ）の方法〔ザ・ジャーナル
・オフ・ゼネラル・フイジオロジ−（Ｊ、Ｇｅｎ。
・オフ・ゼネラル・フイジオロジ−（Ｊ、Ｇｅｎ。
Ｐｈｙｓｉｏｌ−）、３０巻、２９０頁（１９４７年）
〕に準じてカゼイン分解活性をプロテアーゼ活性とした
。
〕に準じてカゼイン分解活性をプロテアーゼ活性とした
。
３、キニナーゼ活性
合成ブラジキニンを基質として、３０℃、２５分反応し
残存ブラジキニン量によるモルモット回腸の収縮から分
解されたブラジキニン量を求め、キニナーゼ活性として
ｎｇ ＢＫｄ ｅ ｃ ｏｍｐ 、 、／ ｍｍ／Ｋｕ
で値を表示した。
残存ブラジキニン量によるモルモット回腸の収縮から分
解されたブラジキニン量を求め、キニナーゼ活性として
ｎｇ ＢＫｄ ｅ ｃ ｏｍｐ 、 、／ ｍｍ／Ｋｕ
で値を表示した。
次に本発明の試験例及び実施例を示す。
試験例 １
パンクレアチンを水に懸濁させ、４８℃、１時間水抽出
後、アセトン分画を行い、これを水に溶解し、ｐＨを５
．０に調製し、生じた沈澱を除いてカリクレイン含有液
を得た。
後、アセトン分画を行い、これを水に溶解し、ｐＨを５
．０に調製し、生じた沈澱を除いてカリクレイン含有液
を得た。
一方、セファロース４Ｂをブロムシアンで活性化し、こ
れにＮＨ２（ＣＨ２） ｎＮＨ２（ｎ ＝２ 、４゜６
．８を共有結合させてＮ Ｈ２（ＣＨ２） ｎ−セファ
ロースを得、これをカラムに充填し、ｐＨ５，０の２０
ｍＭ酢酸緩衝液で平衡化する。
れにＮＨ２（ＣＨ２） ｎＮＨ２（ｎ ＝２ 、４゜６
．８を共有結合させてＮ Ｈ２（ＣＨ２） ｎ−セファ
ロースを得、これをカラムに充填し、ｐＨ５，０の２０
ｍＭ酢酸緩衝液で平衡化する。
これに上記カリクレイン含有液を通液し、ｐＨ５，０の
２０ｍＭ酢酸緩衝液で洗浄後、ｐＨ５，０の０．１ Ｍ
酢酸緩衝液、０．２Ｍ ＮａＣ１ｊを含む同緩衝液で
溶出を行った。
２０ｍＭ酢酸緩衝液で洗浄後、ｐＨ５，０の０．１ Ｍ
酢酸緩衝液、０．２Ｍ ＮａＣ１ｊを含む同緩衝液で
溶出を行った。
その結果は次の表１に示される。
表１から明らかなように、いづれの吸着担体にもカリク
レインは吸着され、塩濃度を変化させることによって溶
出されることが認められる。
レインは吸着され、塩濃度を変化させることによって溶
出されることが認められる。
又、カリクレインと吸着担体との結合力は、吸着担体の
炭素鎖が長くなればなる程、強くなることが認められる
。
炭素鎖が長くなればなる程、強くなることが認められる
。
用様な結果が、ｐＨ４，０、６゜０ 、８．０において
も得られるけれどもｐＨ８，０付近は、共存するプロテ
アーゼであるトリプシンなどの作用最適ｐＨであり、カ
リクレインがこれらプロテアーゼにより分解、失活され
るのであまり好ましいｐＨでない。
も得られるけれどもｐＨ８，０付近は、共存するプロテ
アーゼであるトリプシンなどの作用最適ｐＨであり、カ
リクレインがこれらプロテアーゼにより分解、失活され
るのであまり好ましいｐＨでない。
又、ｐｉ”１４．０においては、カリクレインの安定性
が悪く、徐々に失活してゆく。
が悪く、徐々に失活してゆく。
従って、プロテアーゼが作用し難く、又、カリクレイン
の安定性も良いｐＨ５，０付近で行うのが好ましい。
の安定性も良いｐＨ５，０付近で行うのが好ましい。
実施例 １
セルロース・パウダーを過ヨウ素酸ナトリウムで活性化
し、これにＮ Ｈ２（ＣＨ２） ａ Ｎ Ｈ２を共有結
合させてＮ Ｈ２（ＣＨ２） ａ−セルロースを得、５
００ｒｆＬｌをカラムに充填し、ＰＨ５，０の２０ｍＭ
酢酸緩衝液で平衡化する。
し、これにＮ Ｈ２（ＣＨ２） ａ Ｎ Ｈ２を共有結
合させてＮ Ｈ２（ＣＨ２） ａ−セルロースを得、５
００ｒｆＬｌをカラムに充填し、ＰＨ５，０の２０ｍＭ
酢酸緩衝液で平衡化する。
一方、豚膵臓脱脂粉末２．５ ｋｇを２５Ａ’の水に懸
濁させ、４８℃、１時間水抽出後、アセトン３５〜５５
％の分画沈降を行い、得られる沈澱を水に溶解後、６Ｎ
酢酸にてｐＨ５，０とし生じる濁りを口過してカリクレ
イン含有液４．ＯＡを得た。
濁させ、４８℃、１時間水抽出後、アセトン３５〜５５
％の分画沈降を行い、得られる沈澱を水に溶解後、６Ｎ
酢酸にてｐＨ５，０とし生じる濁りを口過してカリクレ
イン含有液４．ＯＡを得た。
このカリクレイン含有液を上記Ｎ Ｈ２（ＣＨ２） ａ
−セルロースに通液し、カリクレインを吸着させ、５０
ｍＭのＮａＣｌ１を含むｐＨ５，０の２０ｍＭ酢酸緩衝
液で洗浄後、２００ｍＭのＮａＣ１を含むｐＨ５，０の
２０ｍＭ酢酸緩衝液で該吸着体からカリクレインを溶出
し、溶出液２．５４を得た。
−セルロースに通液し、カリクレインを吸着させ、５０
ｍＭのＮａＣｌ１を含むｐＨ５，０の２０ｍＭ酢酸緩衝
液で洗浄後、２００ｍＭのＮａＣ１を含むｐＨ５，０の
２０ｍＭ酢酸緩衝液で該吸着体からカリクレインを溶出
し、溶出液２．５４を得た。
この溶出液を脱塩・濃縮後凍結乾燥を行い、精製カリク
レイン２．２ｇを得た。
レイン２．２ｇを得た。
精製カリクレインの生理活性を測定したところ、８５Ｋ
ｕ／■であり、キニナーゼ活性は６．５ｎｇＢＫｄｅｃ
ｏｍｐｖ／ｍｉｎ／ｉ（ｕであった。
ｕ／■であり、キニナーゼ活性は６．５ｎｇＢＫｄｅｃ
ｏｍｐｖ／ｍｉｎ／ｉ（ｕであった。
実施例 ２
豚膵臓脱脂粉末２．５ｋｇを実施例１と同様に処理して
、カリクレイン含有液４．Ｏｌを得た。
、カリクレイン含有液４．Ｏｌを得た。
一方試験例１と同様にしてＮＨ２（ＣＨ２） ｓ−セフ
ァロースを得、５００ｒｒＬｌをカラムに充填し、ｐＨ
５，０の２０ｍＭ酢酸緩衝液で平衡化した後、上記カリ
クレイン含有液を通液し、カリクレインを吸着させる。
ァロースを得、５００ｒｒＬｌをカラムに充填し、ｐＨ
５，０の２０ｍＭ酢酸緩衝液で平衡化した後、上記カリ
クレイン含有液を通液し、カリクレインを吸着させる。
５０ｍＭＮａｃ＃を含むｐＨ５，０の２０ｍＭ酢酸緩衝
液で洗浄後、３００ｍＭＭａＣＡ’を含むｐＨ５，０の
２０ｍＭ酢酸緩衝液でカリクレインを溶出し、溶出液２
．５１を得た。
液で洗浄後、３００ｍＭＭａＣＡ’を含むｐＨ５，０の
２０ｍＭ酢酸緩衝液でカリクレインを溶出し、溶出液２
．５１を得た。
溶出液を脱塩濃縮後、凍結乾燥を行い精製カリクレイン
１．２ｇを得た。
１．２ｇを得た。
精製カリクレインの生理活性を測定したところ１４０Ｋ
ｕ／■であり、キニナーゼ活性は５．３ｎ ｇ Ｂ Ｋ
ｄ ｅ ｃ ｏｍｐ 、ｍｉ ｎ／’Ｋｕであった。
ｕ／■であり、キニナーゼ活性は５．３ｎ ｇ Ｂ Ｋ
ｄ ｅ ｃ ｏｍｐ 、ｍｉ ｎ／’Ｋｕであった。
実施例 ３
豚生膵臓１０ｋｇをミンチ後１０ｎの水に懸濁させ、４
８℃、１時間抽出後、エチルアルコール２０〜７０％に
て分画沈降を行い、得られる沈澱を水に溶解後、６Ｎ−
酢酸にてｐＨ５，０とし、生じる濁りを口過し、カリク
レイン含有液６１１を得た。
８℃、１時間抽出後、エチルアルコール２０〜７０％に
て分画沈降を行い、得られる沈澱を水に溶解後、６Ｎ−
酢酸にてｐＨ５，０とし、生じる濁りを口過し、カリク
レイン含有液６１１を得た。
一方セルロース・パウダーを過ヨウ素酸ナトリウムで活
性化し、ＮＨ２（ＣＨ２）４ ＮＨ２を共有結合させて
ＮＨ２（ＣＨ２）４−セルロースを得、５００−をカラ
ムに充填し、ｐＨ５，０の２０ｍＭ酢酸緩衝液で平衝化
する。
性化し、ＮＨ２（ＣＨ２）４ ＮＨ２を共有結合させて
ＮＨ２（ＣＨ２）４−セルロースを得、５００−をカラ
ムに充填し、ｐＨ５，０の２０ｍＭ酢酸緩衝液で平衝化
する。
上記カリクレイン含有液を該カラムに通液し、５０ｍＭ
ＮａＣ／を含むｐＨ５，０の２０ｍＭ酢酸緩衝液で洗浄
後、２００ｍＭＮａＣｌを含むｐＨ５，０の２０ｍＭ酢
酸緩衝液でカリクレインを溶出し、溶出液４１を得た。
ＮａＣ／を含むｐＨ５，０の２０ｍＭ酢酸緩衝液で洗浄
後、２００ｍＭＮａＣｌを含むｐＨ５，０の２０ｍＭ酢
酸緩衝液でカリクレインを溶出し、溶出液４１を得た。
溶出液を脱塩濃縮後、凍結乾燥を行い、精製カリクレイ
ン１．９ｇを得た。
ン１．９ｇを得た。
精製カリクレインの生理活性を測定したところ、７５Ｋ
ｕ／■であり、キニナーゼ活性は、１２ｎｇＢＫｄｅｃ
ｏｍｐ／Ｋｕであった。
ｕ／■であり、キニナーゼ活性は、１２ｎｇＢＫｄｅｃ
ｏｍｐ／Ｋｕであった。
実施例 ４
豚膵臓脱脂粉末２′ｋｇを２０１の水に懸濁させ、６Ｎ
酢酸でｐＨ４，５とし、４℃で３時間抽出した後、抽出
残渣を濾過によって除き抽出液２１を得た。
酢酸でｐＨ４，５とし、４℃で３時間抽出した後、抽出
残渣を濾過によって除き抽出液２１を得た。
この抽出液を実施例１と同様にｐＨ５，０の酢酸緩衝液
で平衝化した８００ｍのＮＨ２（ＣＨ２）６−セルロー
スのカラムに通液し、カリクレインを吸着させる。
で平衝化した８００ｍのＮＨ２（ＣＨ２）６−セルロー
スのカラムに通液し、カリクレインを吸着させる。
５０ｍＭのＮａＣ１を含むｐＨ５，０の２０ｍＭ酢酸緩
衝液で洗浄後、２００ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ５，０
の２０ｍＭ酢酸緩衝液で溶出し、溶出液４１を得た。
衝液で洗浄後、２００ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ５，０
の２０ｍＭ酢酸緩衝液で溶出し、溶出液４１を得た。
溶出液を脱塩濃縮後、凍結乾燥を行い精製カリクレイン
１．９ｇを得た。
１．９ｇを得た。
精製カリクレインの生理活性を測定したところ８０ Ｋ
ｕ／１ｒ１９、キニナーゼ活性は６．０ ｎ ｇ Ｂ
Ｋ ｄ ｅ ｃ ｏｍｐ／ｍｉ ｎ／Ｋｕであった。
ｕ／１ｒ１９、キニナーゼ活性は６．０ ｎ ｇ Ｂ
Ｋ ｄ ｅ ｃ ｏｍｐ／ｍｉ ｎ／Ｋｕであった。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １一般式 ＮＨ２（ＣＨ）ｎＮ中２ （ただし、ｎは２〜８を示す） で表わされるα−ω−ジアミノアルカンを水不溶性担体
に結合させた Ｎ Ｈ２（ＣＨ２）ｒｉ−水不溶性担体結合物（ただし
、ｎは２〜８を示す） に、カリクレイン含有液を接触せしめ、カリクレインを
特異的に吸着せしめ、しかる後、吸着したカリクレイン
を溶離せしめることを特徴とするカリクレインの精製法
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53147254A JPS5830034B2 (ja) | 1978-11-30 | 1978-11-30 | カリクレインの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53147254A JPS5830034B2 (ja) | 1978-11-30 | 1978-11-30 | カリクレインの精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5574793A JPS5574793A (en) | 1980-06-05 |
| JPS5830034B2 true JPS5830034B2 (ja) | 1983-06-27 |
Family
ID=15426063
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP53147254A Expired JPS5830034B2 (ja) | 1978-11-30 | 1978-11-30 | カリクレインの精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5830034B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6337297Y2 (ja) * | 1983-03-31 | 1988-10-03 | ||
| JPH0334498Y2 (ja) * | 1985-07-30 | 1991-07-22 |
-
1978
- 1978-11-30 JP JP53147254A patent/JPS5830034B2/ja not_active Expired
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6337297Y2 (ja) * | 1983-03-31 | 1988-10-03 | ||
| JPH0334498Y2 (ja) * | 1985-07-30 | 1991-07-22 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5574793A (en) | 1980-06-05 |
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