JPS61246131A - 新しいタイプのプラスミノ−ゲン活性化因子及びその調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 主粟上二机皿分■ 本発明は、動物血漿中に存在するプラスミノーゲンに特
異的に働いて、血栓溶解作用を有する生理的活性なプラ
スミンに変換する新しいタイプのプラスミノーゲン活性
化因子（プラスミノーゲンアクチヘーターと称せられる
）に関する。

従来■弦止五ｌ 現在、血栓塞栓症（Ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｃ　ｄ
ｉｓｏｒｄｅｒｓ）の治療には、ヒトの尿又は腎臓細胞
培養物から得られたウロキナーゼ、及びβ−熔血性連鎖
球菌（β−ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｉ）の培養液の濾液から単離されたスＩ・レプトキ
ナーゼがプラスミノーゲンアクチベーターとして線維素
溶解剤に用いられている。

しかしながら、ウロキナーゼは線維素（フィブリン）に
対する親和性が低く、かつ大量投与に起因する出血等の
副作用を有し、一方ストレプトキナーゼは微生物由来の
酵素タンパクであるためヒトに投与した場合アレルギー
を起すなどの懸念があり、したがって、これらを血栓塞
栓症の治療剤として通用するうえで決して問題がないと
は言えない。

近年、これらのブラスミノーゲンアクチヘーターとは異
なり、生体の組織中に存在する組織型プラスミノーゲン
アクチベーターが注目されてきている。

この組織型プラスミノーゲンアクチベーターは、上記ウ
ロキナーゼ及びストレプトキナーゼと分子量の点で区別
されるプラスミノーゲンアクチベーターであって、Ｒｉ
ｊｋｅｎ＆Ｃｏ１１ｅｎ　（ジャーナルオプ　バイオロ
ジカル　ケミストリイ　（Ｊ、Ｂ、Ｃ，・韮、７０３５
〜７０４１、（１９８１）、トロンボシス　ヘモスタス
（Ｔｈｒｏｍｂ　、　ｌｌａｅｍｏｓ　ｔａｓ　＋　（
Ｓ　ｔｕ　ｔ　ｔｇａｒ　ｔ）旦、２９４〜２９６　（
１９８２））により、ヒトのメラノーマ細胞の培養上清
から単離、精製して採取されたものである。その後、更
にこのヒトメラノーマ細胞由来の組織型プラスミノーゲ
ンアクチベーターについて、Ｐｅｎｎ１ｃａ　ｅｔ　ａ
ｌ、　（ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ、）３０１．２１４
〜２２１　（１９８３））は分子の一次構造であるアミ
ノ酸配列を決定し、またＢｅｎｎｅｔ　　（）ロンボシ
ス　へモスシス（Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔａｓ＋
）　５０．１０６（１９８３）　）は糖鎖の結合位置が
異なる２種のバリアントが存在し、両バリアント間に分
子量的に３０００の差異があることを明らかにしている
。　また、他の組織型ブラスミノーゲンアクチベーター
として、Ｖｅｔｔｅｒ　１ｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　（ジ
ャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリイ（Ｊ、
Ｂ、Ｃ，）、剣［，５７５〜５７８　（１９７９）、〔
ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリイ（Ｊ
、Ｂ、Ｃ，）、匡、３６６５〜３６７２　（１９８０）
　）は、ヒト胎児肺細胞由来の正常線維芽細胞ＩＭＲ−
９０が産生ずるプラスミノーゲンアクチベーターについ
て報告しており、このアクチベーターには分子量５０．
０００〜６０　、０００のウロキナーゼ型プラスミノー
ゲンアクチベーターと、抗ウロキナーゼ抗体に中和され
ない分子３７７３．０００の新しい型のプラスミノーゲ
ンアクチベーターが存在していることを明らかにしてい
る。

更に、Ｗｉｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　　Ｃカンサー　リ
サーチ（Ｃａｎｓｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、）　４０．
９３３〜９３８　（１９８０））も８週令のヒト胎児肺
由来線維芽細胞が分子１ｉ６０，０００のウロキナーゼ
型プラスミノーゲンアクチベーターと、抗ウロキナーゼ
抗体に中和されない分子量約７０，０００の新しい型の
プラスミノーゲンアクヂベーターを産生ずることを確認
している。

而して、ヒト胎児肺由来正常線維芽細胞が産生ずる上記
新しい型のプラスミノーゲンアクチベーターについては
その単離、精製が未だ十分なされていないため、その酵
素化学的性質も一次構造も明らかにされていない。

したがって、ヒト胎児肺由来正常線維芽細胞が産生ずる
上記の新しいタイプのブラスミノーゲンアクチベーター
が前述のヒトメラノーマ由来の組織型ブラスミノーゲン
アクチベーターと同一物質であるかどうかは勿論のこと
、それらの分子の一次構造に差異があるかどうかについ
ても未だ明らかにされていない。

なお、ヒト胎児肺由来正常線維芽細胞の培養液から上記
新しいタイプのプラスミノーゲンアクチベーターを分離
、精製する方法として、従来、亜鉛キレートセファロー
スカラム、ウロキナーゼに対する抗血清から得られる抗
体カラム、フィブリンカラム、コンカナバリンＡ（Ｃｏ
ｎＡ）セファロースカラム及びアルギニンセファロース
カラム等の組合わせによる精製法（特開昭５９−５１２
２０号）が知られている。しかしながら、この方法では
上記カラ、ムとプラスミノーゲンアクチベーターとの結
合が特異的でないため、高純度のものを得ることは不可
能である。因に、一般に亜鉛キレートセファロースカラ
ムを用いる精製では、カラムの流速は１０．２　ｍｌ　
／ｃｉ／ｈｒであるための大量の培養液を迅速に処理す
るには実際上適さず、また、ウロキナーゼの抗血清から
得られる抗体カラムを用いて上記培養液中に混在するウ
ロキナーゼタイプのアクチベーターを除去する方法では
、上記抗体自体が混合物であるためタンパク質当りの抗
体力値が低くて、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアク
チベーターに対する親和性、抗体の安定性及びカラムク
ロマトグラフィーの条件が均一でないため、抗体カラム
による上記ウロキナーゼ型のアクチベーターの吸着効率
が低（、したがって、該アクチベーターの除去のために
は抗体カラムへの通液を何回も繰返して行なうことが必
要となるので実用的でない。

が　゛　しようとする１　占 上記ヒト胎児肺由来正常線維芽細胞が産生ずる新しいタ
イプのブラスミノーゲンアクチベーターの単離、精製上
の問題点は、前述したように、該アクチベーターは同時
に産生されるウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベ
ーターと共存していてそれらの選択的分離が困難である
ことに基づいている。　（因に、前述のヒトメラノーマ
細胞はウロキナーゼ型のアクチベーターを産生じない）
。

すなわち、ヒト胎児肺由来正常線維芽細胞を培養して得
られる上記２種類のプラスミノーゲンアクチベーターが
共存する培養液から、ウロキナーゼ型のアクチベーター
を特異的に選択除去するか、あるいは新しい型のアクチ
ベーターを特異的に選択分取することが必須であるが、
前述したとおり、未だ有効な分離方法は確立されていな
い。　本発明者は、ヒト胎児肺由来の正常（２倍体）線
維芽細胞の培養により産生される前記新しいタイプのプ
ラスミノーゲンアクチベーターをそれと同時に産生され
るウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターから
効率よく分離して精製し得る方法について検討した結果
、上述した問題点を解決することに成功した。

すなわち、本発明者は、ヒト胎児肺由来正常線維芽細胞
を培養して得られるプラスミノーゲンアクチベーター含
有培養液を、イオン交換クロマトグラフィーに通液する
と新しいタイプのものとウロキナーゼタイプのもののア
クチベーターが共にカラムに完全に吸着され、ついで、
この吸着を溶出すると両方のアクチベーターが９０％以
上の高い回収率で溶出され、しかも上記培養液に対して
１０〜２０倍濃縮された状態で、かつ比活性が２０〜３
０倍に向上した部分精製された上記２種のアクチベーグ
ーの溶出画分が得られること、及びこの２種のアクチベ
ーターの溶出画分を、新しいタイツノアクチベーターに
対して拮抗阻害剤として作用する特定物質をリガンドと
して用いたアフイニテイクロマトグラフイーに通液し、
ついで特定な溶出条件で溶出させることにより、該両分
からウロキナーゼ型のブラスミノーゲンアクチベーター
を特異的に除去でき、その結果、該アクチベーターの汚
染のない、比活性の高い新しいタイプのブラスミノーゲ
ンアクチベーターを高収率で分取し得ることを見出し、
本発明をなすに至った。

したがって、本発明はヒト胎児肺由来正常（２倍体）線
維芽細胞の培養により産生されるプラスミノーゲンアク
チベーター含有培養液から選択的に分離し、精製して得
られる高純度の新しいタイプのブラスミノーゲンアクチ
ベーター及びその調製方法を提供することを目的とする
ものである。

以下本発明について詳しく説明する。

会ｊ廊料Ｗ戊 本発明の特徴は、ヒト胎児肺由来正常（２倍体）線維芽
細胞により産生されるプラスミノーゲンアクチベーター
から分離、精製して得られる、下記の酵素化学的性質を
有するブラスミノーゲンアクチベーターにある。

（イ）分子量　ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動による測定で６５．ＯＱＯ〜７２．０００（ロ）基質
Ｓ−２２８８に対するＫＬＩｌ値（ＬＩｌｏｌｅ／　ｆ
！　）ＫＬＩｌ：　１．１６Ｘ１０−’ Ｖｔａａｘ　（ｍｏｌｅ／　＋＊ｉｎ、ｕｎｉｔ）シｌ
ｌ１ａｘ：１．７ＸｌＯ−”て基質Ｓ−２２８８は、カ
ビ（ｋａｂｉ）社製の合成　　“基質（トリペプチドか
ら成る）である〕（ハ）至適ｐＨ及び安定ｐｌ＋範囲７
．５〜９．０．５〜１０（ニ）比活性（ＩＵ／ｍｇ）　
　　　　　　　１０．４　Ｘ　１０′＋（ホ）作用適温
の範囲（℃）　　　　　３９〜４１（へ）活性阻害金属
イオン　Ｃｏ”、ｚｎ　２４″、ｃｄ２＋、Ｈｇ　２４
ｐ、Ｎｉ２＋及びＣｕ　２＋（ト）フィブリン親和性（
結合比率、％）８３．１（チ）コンカナバリンＡカラム
への吸着性　有（す）抗ウロキナーゼポリクローナル 抗体による活性中和　　全く中和されない（ヌ）耐熱性
（残存活性％） また、本発明は、上記ブラスミノーゲンアクチベーター
を取得するための方法、すなわち、ヒト胎児肺由来正常
２倍体線維芽綱胞を培養して得られるプラスミノーゲン
活性化因子含有培養液を、イオン交換クロマトグラフィ
ーで処理し、得られる溶出画分を、ｐ−アミノベンツア
ミジンまたはε−アミノカプロイルベンツアミジンをリ
ガンドとしたアフイニテイクロマトグラフイーで処理し
て該プラスミノーゲン活性因子中のウロキナーゼ型プラ
スミノーゲン活性因子を選択的に溶出除去し、ついで前
記新しいタイプのプラスミノーゲンアクチベーターの溶
出画分を分離、精製することを特徴とする。

本発明に係るブラスミノーゲンアクチベーターは上記（
イ）乃至（ヌ）の酵素化学的性質により特徴づけられる
ものであって新しいタイプのブラスミノーゲンアクチベ
ーターと言い得るものである。すなわち、前述したとお
り、ヒト胎児肺由来正常線維芽細胞がブラスミノーゲン
アクチベーターを産生ずることは知られているけれども
、その単離、精製が未だ確立さていないため、化学物質
として特定されるに至っていなかったものである。

本発明のブラスミノーゲンアクチベーターは、上述した
酵素化学的性質にみられるように、比活性及びフィブリ
ンに対する親和性が非常に高く、かつ耐熱性が優れてい
るという特性を有し、これらの特性と分子量及び抗ウロ
キナーゼポリクローナル抗体により活性が中和されない
点でウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターと
明確に区別され、また組織型であるヒトメラノーマ由来
のブラスミノーゲンアクチベーターとはアミノ酸組成（
後記表１参照）においてリジン含量が明らかに低く、逆
にグリシン含量が高い点で区別されるものである。

。　占を　ｔするための 次に、本発明に係るブラスミノーゲンアクチベーターの
調製方法について説明する。

本発明では、ヒト胎児肺由来の正常２倍体線維芽細胞を
培養して得られる無血清培養液（この培養液中には本発
明のプラスミノーゲンアクチベーターとウロキナーゼプ
ラスミノーゲンアクチベーターが産生される）を、第一
ステップとしてイオン交換クロマトグラフィーに通液し
て上記２種のプラスミノーゲンアクチベーターを完全に
吸着させる。なお、上記培養に当ってはプロテオースペ
プトンの少量を添加して本発明のプラスミノーゲンアク
チベーターの産生の誘導を行なう。

ここで用いるイオン交換クロマトグラフィーには陽イオ
ン交換樹脂、特にカラムの流速を早めたい場合には陽イ
オン交換膜を用いたカラム（例えばＡＭＦ社製カートリ
ッジタイプのＳＰカラム）が好ましい。このイオン交換
クロマトグラフィーに上記無血清培養液を通液するに当
っては、カラムを緩衝液で平衡化した後に通液する。例
えばベット容量に換算して１１の容量を有する陽イオン
交換膜カラム（例えばゼータプレツブ５Ｐ−１０００）
を用いる場合には、カラムを１／１００Ｍ酢酸緩衝液で
ｐＨ４，０〜４．５に平衡化した後、ｐＨを４．０〜４
．５の範囲に調整した無血清培養液を６〜３Ｑ　Ｎ　／
ｈｒ程度の流速で通液すると、該培養液中の上記２種の
プラスミノーゲンアクチベーターはカラムに完全に吸着
される。

ついで、カラムに吸着された両プラスミノーゲンアクチ
ベーターを、該カラムの平衡化に用いた緩衝液で十分洗
浄した後、１．０〜２．０Ｍ　ＮａＣ１及び０．０１％
ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０を含む１／１００　Ｍ酢酸
緩衝液を用いｐｌ＋４．０〜４．５において溶出させる
。

この溶出により、上記培養液に比し１０〜２０倍に濃縮
された状態で、比活性が２０〜３０倍に向上した両プラ
スミノーゲンアクチベーターが混在した両分が９０％以
上の高収率で得られる。

すなわち、上記イオン交換クロマトグラフィーの処理に
より上記両ブラスミノーゲンアクチベーターが可成り精
製されること（いわゆる部分精製される）がわかる。

また、上記と同じ培養液を、陽イオン交換膜に代えて同
じベット容量を有する従来使用された亜鉛キレートセフ
ァロースカラムを用いて処理した場合、上記両ブラスミ
ノーゲンアクチベーターを完全に吸着させるには２００
ｍ１／ｈｒの流速で通液させることが必要であったこと
からみて、陽イオン交換膜クロマトグラフィーは亜鉛キ
レートセファロースカラムに比べて約３０〜５０倍以上
の速度で培養液からブラスミノーゲンアクチベーターを
部分精製し得ることがわかる。

本発明では、次に第２ステツプとして、上述のようにし
て得られた２種のプラスミノーゲンアクチベーターが混
在する溶出画分を、アフイニテイクロマトグラフイーで
処理して該溶出画分中のウロキナーゼ型ブラスミノーゲ
ンアクチベーターを選択的に分離除去する。

ここで用いるアフイニテイクロマトグラフイーには、本
発明のプラスミノーゲンアクチベーターの拮抗阻害剤で
あるｐ−アミノベンツアミジンもしくはε−アミノカプ
ロ２イルベンツアミジンをリガンドとしたアフイニテイ
クロマトグラフイーを通用する。すなわち、これらのリ
ガンドを、０００基を有する不溶性担体、例えばＣＨ−
セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）に化学的に結合
させて作成したアフイニテイクロマトグラフイーを用い
る。

このようなアフイニテイクロマトグラフイーに上記溶出
画分を通液すると、リガンドとしてのｐ−′アミノベン
ツアミジン又はε　アミノカプロイルベンツアミジンは
セリンプロテアーゼに対して拮抗阻害作用を有するため
、セリンプロテアーゼの１種であるウロキナーゼ型プラ
スミノーゲンアクチベーターも本発明のプラスミノーゲ
ンアクチベーターと共にアフイニテイ力ラムに吸着され
るものの、後者の方が前者に比し上記拮抗阻害剤に強く
結合されるため、これらの吸着後の溶出条件を選択する
ことによりウロキナーゼ型のアクチベーターを選択的に
溶出して分離できるようになる。

例えば、上記溶出条件として、１．０　Ｍ　ＮａＣ１及
び０．０１％Ｔｗｅｅｎ　８０を含む１／１００　Ｍリ
ン酸緩衝液を用い、ｐ）＋　７．５でカラムを洗浄して
未吸着不純物を除去した後、０．４〜０．５１１　Ｎａ
Ｃｌを含む１／１０門酢酸緩衝液を用い、ｐｕ　４．０
で溶出を行なうと、抗ウロキナーゼポリクローナル抗体
により完全に活性が中和される性質を有するウロキナー
ゼ型プラスミノーゲンアクチベーターのみが選択的に溶
出され、ついでなおもカラムに強く吸着して残存するウ
ロキナーゼ型のアクチヘーターを０．１〜０．２Ｍアル
ギニン及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ　８０を含む１／１０
０Ｍリン酸緩衝液を用いてｐＨ７，５で熔出すると、上
記残存するウロキナーゼプラスミノーゲンアクチヘータ
ーのみが完全に溶出される。この溶出を行なった後、最
後に０．４〜０．５Ｍアルギニン及び０．０１％Ｔｗｅ
ｅｎ　８０．１．０Ｍ　ＫＳＣＮを含む１／１００　Ｍ
リン酸緩衝液を用いｐＨ７，５で溶出を行なうと、抗ウ
ロキナーゼポリクローナル抗体により全く活性が中和さ
ない、本発明に係るプラスミノーゲンアクチベーターが
溶出される。

このようにして得られる新しいタイプのプラスミノーゲ
ンアクチベーターの溶出画分は、上記第一ステップにお
ける陽イオン交換膜クロマトグラフィーの処理により得
られた両プラスミノーゲンアクチベーターを含む溶出画
分に対して８０〜９０％以上の高収率で得られ、かつ該
溶出画分中のプラスミノーゲンアクチベーターに比べて
２０〜３０倍の比活性を有する。

なお、この比活性は元の培養液中のプラスミノーゲンア
クチベーターに比べて５００〜６００倍に向上する。

本発明では、上述のようにして得られた新しいタイプの
プラスミノーゲンアクチヘーターの溶出画分をゲル濾過
により精製してその比活性を更に向上することができる
。すなわち、上記溶出画分を濃縮した後、セファデック
スＧ−１５０もしくはセファクリルＳ−２００（ファル
マシア社製）を用いたゲル濾過で精製すると、ウロキナ
ーゼ型のプラスミノーゲンアクチベーターの汚染の全く
ない、比活性が元の培養液に比べ２０００倍以上にも達
する１００．０００　ＩＵ／ｍ／！タンパク以上の高純
度のプラスミノーゲンアクチベーター標品が取得される
。

次に、このようにして得られる新しいタイプのプラスミ
ノーゲンアクチベーターのアミノ酸組成を、従来のヒト
メラノーマ細胞由来、並びに子宮由来のプラスミノーゲ
ンアクチベーターの各アミノ酸組成との対比において表
１に示す。

発１廊Ｂ九ｌ 叙上のとおり、本発明によると、ヒト胎児肺由来の正常
線維芽細胞の培養により産生される新しいタイプのプラ
スミノーゲンアクチベーターを、陽イオン交換クロマト
グラフィーとアフイニテイクロマトグラフイーを組合わ
せて上記細胞の培養液を精製処理することにより、該培
養液中に混在するウロキナーゼ型のプラスミノーゲンア
クチベーターによる汚染を伴なうことなく高収率で取得
することが可能となり、更に、上記両クロマトグラフィ
ーに加えてゲル濾過による精製を行なうことにより、）
００．０００１１／＋ｎ　１以上の極めて高純度で、し
かも高収率（６０〜７３％）で取得し得るようになる。

また、本発明によると、ヒト胎児肺由来正常線維芽細胞
の培養液を大量でかつ迅速に精製処理することができ、
イオン交換クロマトグラフィーに用いたイオン交換樹脂
やイオン交換膜は再生して繰返して使用可能であり、ま
た、アフイニテイクロマトグラフィーに用いたカラムも
ブラスミノーゲンアクチベーターを溶出した後、１／Ｉ
ＯＭ　酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）で洗浄し、ついで水で
洗浄し、更に、０．５Ｍ　ＮａＣ１を含む１／１００Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で洗浄することにより繰返
し使用し得るので、上述した精製システムの組合わせか
ら成る本発明による新しいタイプのプラスミノーゲンア
クチベーターの調製法は工業上の実用性が高いと言い得
る。

以下に実施例を示して本発明に係るプラスミノーゲンア
クチベーターの調製法及びその効果を更に具体的に説明
する。

１里週上 陽イオン交換膜カラムクロマトグラフィーによる部分精
製； ヒト胎児肺由来の正常２倍体線維芽細胞ＩＭＲ−９０（
八ＴＣＣ、、ＣＣＬ−１８６）を常法により培養し、１
％プロテオースペプトンで新しいタイプのプラスミノー
ゲンアクチベーター産生の誘導を行なって得られた無血
清培養液６２β（ＩＵ０ＩＵ／ｍ　１　）を塩酸でｐＨ
４，’５に調整した後、１／１００　Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ４゜５）に平衡化した陽イオン交換膜カラム（ＡＭＦ
社製、ゼータプレツブ５Ｐ−１０００）に１０ｊ２／ｈ
ｒの流速で通液し、上記培養液中に産生された新しいタ
イプのブラスミノーゲンアクチベーターとウロキナーゼ
型のプラスミノーゲンアクチベーターを完全に吸着させ
た。ついでカラムを１／１００　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４
，５）で洗浄して未吸着成分を除去した後、１、ＯＭ　
ＮａＣ１及びＱ、ＯＩ　Ｔｗｅｅｎ　８０を含む１／１
００　Ｍ酢酸Ｉｆｉ液（ｐＨ４，５）で上記両ブラスミ
ノーゲンアクチベーターを溶出させた。この溶出により
、全活性収率９０．８％、濃縮倍率１２倍及び比活性が
２１．１倍に上昇した両プラスミノーゲンアクチベータ
ーから成る溶出画分が得られた。

次に、参考として原料の培養液と上記溶出両分の性状を
表２に示す。

アフイニテイクロマトグラフイーによる精製：上述のよ
うにして得られた溶出画分のうちから７２万ＩＩを分取
し、Ｎ　ａ　Ｏｌｌでｐｉｌ　７．５に調整した後、叶
アミノベンツアミジンー〇１１セファロース４Ｂアフイ
ニテイカラム（φ４ｃｍ、　４００ｍ　ｌ　）に２００
ｍ　ｊｉ！　／　ｈｒの流速で通液し、該溶出画分中の
両プラスミノーゲンアクチベーターをカラムに完全に吸
着させた。

ついでカラムを、１．ＯＭ　ＮａＣ１及び０．０１％Ｔ
ｗｅｅｎ　８０を含む１／１００　Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）で洗浄して未吸着成分を除去した後、０．５
Ｍ　ＮａＣ１及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ　８０を含む１
／ＩＯＭ酢酸緩衝液（ｐｉｌ４．０）を用い、ついで０
．２Ｍアルギニン及びＴｗｅｅｎ　８０を含む１／１０
０　Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７，４）を用いてカラムに
吸着しているウロキナーゼ型のプラスミノーゲンアクチ
ベータ−（このアクチベーターは抗ウロキナーゼポリク
ローナル抗体により活性が完全に中和される）を非特異
的に吸着している不純物とともに溶出させて除去した。

上記溶出後、０．５Ｍアルギニン及び０．０１％Ｔｗｅ
ｅｎ８０を含む１／１００　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
４）を用いてカラムに吸着している新しいタイプのプラ
スミノーゲンアクチベーターを溶出させた。

このアフイニテイクロマトグラフイーによる精製工程中
の両プラスミノーゲンアクチベーターの溶出パターンを
添付の第１図に示した。また、上述のようにして得られ
た新しいタイプのプラスミノーゲンアクチベーターの溶
出画分の性状を前記陽イオン交換膜カラムから得られた
溶出画分の性状と対比して表３に示す。

表３にみられるとおり、アフイニテイカラムからの溶出
画分の全活性収率は、ウロキナーゼ型のプラスミノーゲ
ンアクチベーターが除去されているため８１％であるが
、新しいタイプのプラスミノーゲンアクチベーターに基
づ（と活性収率は９１．５％となり、高収率であること
がわかる。また、この溶出画分の濃縮倍率は２．５とな
り、比活性が２７．３倍に上昇したことがわかる。

ス星±１ 本例は、実施例１で得られた新しいタイプのプラスミノ
ーゲンアクチベーターの溶出画分をゲル濾過により精製
してその純度を更に向上させた態様を示したものである
。

実施例１で得られた新しいタイプのブラスミノーゲンア
クチベーターの溶出画分（５８３，０００ｌ１ｌ）に、
それの濃縮時での吸着を阻止するためにＫＳＣＮを最終
濃度が１．６Ｍになるように添加し、ラボカセット濃縮
システム　（日本ミリポアミリテッド製）を用いて濃縮
した後、１．６Ｍ　ＫＳＣＮ及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ
８０を含む１／１００　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）
で平衡化したセファクリルＳ−２００カラム（φ２　、
５ｃ＋ｓＸ　９５ｃｎ＋）を用いてゲル濾過を行なった
。このゲル濾過の溶出パターンを添付の第２図に示した
。また、ゲル濾過により得られた新しいタイプのプラス
ミノーゲンアクチベーター画分の性状を、原料の培養液
の性状と対比して表４に示す。

表４にみられるとおり、ゲル濾過により精製して得られ
るプラスミノーゲンアクチベーターの元の培養液からの
全活性収率は６２゜７％であるが、ウロキナーゼ型プラ
スミノーゲンアクチベーターを除去したプラスミノーゲ
ンアクチベーターに基づくと７０．６％の高い活性収率
で、比活性が１０４，０００ＩＵ／ｍｇタンパクの高純
度のプラスミノーゲンアクチベーター標品を取得し得る
ことがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明におけるアフイニテイクロマトグラフ
イーによる精製処理で得られる本発明のプラスミノーゲ
ンアクチベーターとウロキナーゼ型のブラスミノーゲン
アクチベーターとの溶出パターンを例示したものであり
、第２図はゲル濾過により得られる本発明のプラスミノ
ーゲンアクチベーターの溶出パターンを例示したもので
ある。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の酵素化学的性質を有することを特徴とする
   ヒト胎児肺由来正常２倍体線維芽細胞により産生される
   新しいタイプのプラスミノーゲン活性因子； （イ）分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
   による測定で６５，０００〜７２，０００ （ロ）基質Ｓ−２２８８に対するＫｍ値（ｍｏｌｅ／ｌ
   ）Ｋｍ：１．１６×１０＾−＾３ Ｖｍａｘ（ｍｏｌｅ／ｍｉｎ．ｕｎｉｔ）Ｖｍａｘ：１
   ．７×１０＾−＾８ （ハ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲　７．５〜９．０、５
   〜１０ （ニ）比活性（ＩＵ／ｍｇ）　１０．４×１０＾４ （ホ）作用適温の範囲（℃）　３９〜４１ （ヘ）活性阻害金属イオン　Ｃｏ＾２＾＋、Ｚｎ＾２＾
   ＋、Ｃｄ＾２＾＋、Ｈｇ＾２＾＋、Ｎｉ＾２＋及びＣｕ
   ＾２＾＋ （ト）フィブリン親和性（結合比率、％）　８３．１ （チ）コンカナバリンＡカラムへの吸着性　有 （リ）抗ウロキナーゼポリクローナル抗体による活性中
   和　全く中和されない （ヌ）耐熱性（残存活性％） ６０℃で６０分間加熱　１００．０％ ９５℃で５分間加熱　１００．０％
2. （２）ヒト胎児肺由来正常２倍体線維芽細胞を培養して
   得られるプラスミノーゲン活性化因子含有培養液を、イ
   オン交換クロマトグラフィーで処理し、得られる溶出画
   分を、ｐ−アミノベンツアミジンまたはε−アミノカプ
   ロイルベンツアミジンをリガントとしたアフイニテイク
   ロマトグラフイーで処理して該プラスミノーゲン活性因
   子中のウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性因子を選択
   的に溶出除去し、ついで特許請求の範囲第（１）項記載
   の酵素化学的性質を有するプラスミノーゲン活性因子の
   溶出画分を分離精製することを特徴とする新しいタイプ
   のプラスミノーゲン活性因子の調製方法。
3. （３）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性因子を溶出
   除去した後に得られる上記プラスミノーゲン活性因子の
   溶出画分をゲル濾過により精製する特許請求の範囲第（
   ２）項記載の調製方法。