JPS58121793A - ウロキナ−ゼの回収方法 - Google Patents
ウロキナ−ゼの回収方法Info
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- JPS58121793A JPS58121793A JP57003290A JP329082A JPS58121793A JP S58121793 A JPS58121793 A JP S58121793A JP 57003290 A JP57003290 A JP 57003290A JP 329082 A JP329082 A JP 329082A JP S58121793 A JPS58121793 A JP S58121793A
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- solution
- insoluble carrier
- monoclonal antibody
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明扛、ウロキナーゼを含む溶液から分子量４５００
０ないし６８０００のウロキナーゼを分子量を低下させ
ること表く、高純度、高収率で回収する方法に関するも
のである。
０ないし６８０００のウロキナーゼを分子量を低下させ
ること表く、高純度、高収率で回収する方法に関するも
のである。
近年注目されている高分子ウロキナーゼは、人尿あるい
扛人腎細胞培養液に含まれる分子量４５０ＵＬｌないし
６８０００の繊維素溶解＃累であり、その製剤は血栓症
、心筋梗塞の治療薬として広く知られている。また、抗
癌剤との併用効果の確認と共に大量投与による治療が行
なわれている。したがって、用いるウロキナーゼに起源
して、その製剤中に混在している副作用を発する物質を
除去した高純度ウロキナーゼの提供が臨床医学上非常に
望まれている。
扛人腎細胞培養液に含まれる分子量４５０ＵＬｌないし
６８０００の繊維素溶解＃累であり、その製剤は血栓症
、心筋梗塞の治療薬として広く知られている。また、抗
癌剤との併用効果の確認と共に大量投与による治療が行
なわれている。したがって、用いるウロキナーゼに起源
して、その製剤中に混在している副作用を発する物質を
除去した高純度ウロキナーゼの提供が臨床医学上非常に
望まれている。
従来、ウロキナーゼの取得法としては、硫酸）（リウム
、ケイ酸およびその塩類、活性炭等への吸着、または各
種イオン交換体、を用いる方法がある。
、ケイ酸およびその塩類、活性炭等への吸着、または各
種イオン交換体、を用いる方法がある。
また、アフィニティークロマト法としては、リジンま＊
、はアルギニンを不Ｓａ担体に吸着させて用いる方法（
％開閉４９−１２５５８４）、セトラキセートをアガロ
ースもしくはポリアクリルアミドまたは多糖体高分子物
質に結合させて用いる方法（特開昭５５−４００４０号
）、ヘパリンまたはそのアルカリ金属塩を不溶性担体に
結合させて用いる方法＜ｔｒｙ開昭５６−５９１９２）
等が知られている。しかしながら、以上の方法の中で最
も優れているアフィニティークロマトグラフィーにおい
ても、ウロキナーゼとの特異的な結合が弱く、また、ウ
ロキナーゼのみに対する選択的結合のない群特異的結合
である丸め、達成純度には眼界があり、より高純度のウ
ロキナーゼを得ることは不可能で６つ良。加えて、この
方法で嫁回収率もそれほど高くなく、満足のゆくもので
杜なかった。
、はアルギニンを不Ｓａ担体に吸着させて用いる方法（
％開閉４９−１２５５８４）、セトラキセートをアガロ
ースもしくはポリアクリルアミドまたは多糖体高分子物
質に結合させて用いる方法（特開昭５５−４００４０号
）、ヘパリンまたはそのアルカリ金属塩を不溶性担体に
結合させて用いる方法＜ｔｒｙ開昭５６−５９１９２）
等が知られている。しかしながら、以上の方法の中で最
も優れているアフィニティークロマトグラフィーにおい
ても、ウロキナーゼとの特異的な結合が弱く、また、ウ
ロキナーゼのみに対する選択的結合のない群特異的結合
である丸め、達成純度には眼界があり、より高純度のウ
ロキナーゼを得ることは不可能で６つ良。加えて、この
方法で嫁回収率もそれほど高くなく、満足のゆくもので
杜なかった。
さらに、従来、ウロキナーゼを回収する工程において、
該酵素の分子量の低下が起こシ、この低分子化ウロキナ
ーゼの大量混入、あるいは煩雑な除１ 去操作を必
要としていた。
該酵素の分子量の低下が起こシ、この低分子化ウロキナ
ーゼの大量混入、あるいは煩雑な除１ 去操作を必
要としていた。
ｆ九、従来のアフィニティークロマトグラフィーに用い
られているりガントは、はとんどが低分子物質である九
め、担体との結合が弱く、繰り返し使用すると、この結
合が切れてキャパシティが低下するなどの問題点を有し
ていた。この点を改良し友高分子物質である抗体を用い
る方法は、担体との結合が多点で行なわれているので、
繰り返し使用が可能であ〕、ウロキナーゼとの結合も特
異的で強いので、高い精製度が得られるという利点があ
った。しかしながら、従来用いられてき次抗体は、抗ウ
ロキナーゼ抗体以外の抗体も多く含む混合抗体であシ、
リガンドとして不均一なものを使用しなければなら々い
欠点があった。
られているりガントは、はとんどが低分子物質である九
め、担体との結合が弱く、繰り返し使用すると、この結
合が切れてキャパシティが低下するなどの問題点を有し
ていた。この点を改良し友高分子物質である抗体を用い
る方法は、担体との結合が多点で行なわれているので、
繰り返し使用が可能であ〕、ウロキナーゼとの結合も特
異的で強いので、高い精製度が得られるという利点があ
った。しかしながら、従来用いられてき次抗体は、抗ウ
ロキナーゼ抗体以外の抗体も多く含む混合抗体であシ、
リガンドとして不均一なものを使用しなければなら々い
欠点があった。
本発明者らは、これらの問題点を克服すべく鋭意研究を
重ね九結果、細胞融合により得られた抗ウロキナーゼ抗
体産生ハイブリドーマが産生ずる抗体線、均一な抗ウロ
キナーゼ抗体（モノクローナル抗体）でアシ、これをリ
ガンドとして利用すれば、従来の抗体アフィニティーク
ロマトグラフィーよ〕も精製ｌＩＬ％吸着容量等がさら
に優れたものが得られると考え、該酵素を回収する工程
において、ウロキナーゼを含む溶液を抗ウロキナーゼモ
ノクローナル抗体を化学的に結合している不溶性担体に
吸着、溶離することＫよシ、つνキナーゼを高純度、高
収率で回収することができることを見出し、この知見に
基づいて本発明をなすに至った。
重ね九結果、細胞融合により得られた抗ウロキナーゼ抗
体産生ハイブリドーマが産生ずる抗体線、均一な抗ウロ
キナーゼ抗体（モノクローナル抗体）でアシ、これをリ
ガンドとして利用すれば、従来の抗体アフィニティーク
ロマトグラフィーよ〕も精製ｌＩＬ％吸着容量等がさら
に優れたものが得られると考え、該酵素を回収する工程
において、ウロキナーゼを含む溶液を抗ウロキナーゼモ
ノクローナル抗体を化学的に結合している不溶性担体に
吸着、溶離することＫよシ、つνキナーゼを高純度、高
収率で回収することができることを見出し、この知見に
基づいて本発明をなすに至った。
すなわち、本発明は、ウロキナーゼを含む溶液から分子
量４５０００ないし７１８００Ｇのつｐキナーゼを回収
する工程において、モノクローナル抗体によるアフィニ
ティークロマトグラフィーを用いることを特徴とするウ
ロキナーゼの回収方法に関するものである。ことで、本
発明に適用されるウロキナーゼを含む溶液とは、人尿あ
るいは人腎細胞を培養して得られた培養液、まえ扛遺伝
子工学を用いて創出されたウロキナーゼ生産菌を培養し
て得られた培養液などである。
量４５０００ないし７１８００Ｇのつｐキナーゼを回収
する工程において、モノクローナル抗体によるアフィニ
ティークロマトグラフィーを用いることを特徴とするウ
ロキナーゼの回収方法に関するものである。ことで、本
発明に適用されるウロキナーゼを含む溶液とは、人尿あ
るいは人腎細胞を培養して得られた培養液、まえ扛遺伝
子工学を用いて創出されたウロキナーゼ生産菌を培養し
て得られた培養液などである。
本発明において用いられる人腎細胞培養液とは、通常の
方法で増殖させ九人腎細胞に炭素源、ｉ１素源および必
要に応じて無機塩ま九社有機質添加物を加えた溶液を与
え、培養して得九培養液である。
方法で増殖させ九人腎細胞に炭素源、ｉ１素源および必
要に応じて無機塩ま九社有機質添加物を加えた溶液を与
え、培養して得九培養液である。
ここで与える溶液としては、従来から動物に由来する細
胞を用いてウロキナーゼを製造するのに便用されてきた
溶液は全て使用することがてきる。
胞を用いてウロキナーゼを製造するのに便用されてきた
溶液は全て使用することがてきる。
この溶液に含まれる炭素源として妹、糖類、好まシくハ
シュークロース、マルトースまタハグルコースを用いる
。ｖｉｌ素源としては有機の窒累源が好ましく、アミノ
酸混合物ま九は／および蛋白質の加水分解物がよシ好ま
しい。用いられる蛋白質社、動物質、植物質のいずれで
あってもよいが、％にカゼイン、大豆蛋白質、ラクトア
ルブミン、および獣肉蛋白質の加水分解物が好ましい。
シュークロース、マルトースまタハグルコースを用いる
。ｖｉｌ素源としては有機の窒累源が好ましく、アミノ
酸混合物ま九は／および蛋白質の加水分解物がよシ好ま
しい。用いられる蛋白質社、動物質、植物質のいずれで
あってもよいが、％にカゼイン、大豆蛋白質、ラクトア
ルブミン、および獣肉蛋白質の加水分解物が好ましい。
これらの各種栄養源に加えて好ましい添加物としては有
機酸類が挙げられる。中でもコハク酸、リンゴ酸、フマ
ール酸、グリコール酸の中から選ばれる物質がより好ま
しい。より一層好ましいものはフマール酸である。これ
らの有機酸に代えて、ｔｆＩ−は同時にセリン、スレオ
ニン、グリシンを加えてもよい。これらの溶液のｐＨを
６ないし９に保持し、温度を１５Ｃないし４５Ｃ１よシ
好ましくは２５Ｃないし４０Ｃｌ（維持し、また溶液の
溶存酸累濃度を飽和酸嵩濃度の５０悌以上に維持するこ
とによシ、分子量４５０００ないし６８０ｕ０のウロキ
ナーゼを含む培養液が得られる。
機酸類が挙げられる。中でもコハク酸、リンゴ酸、フマ
ール酸、グリコール酸の中から選ばれる物質がより好ま
しい。より一層好ましいものはフマール酸である。これ
らの有機酸に代えて、ｔｆＩ−は同時にセリン、スレオ
ニン、グリシンを加えてもよい。これらの溶液のｐＨを
６ないし９に保持し、温度を１５Ｃないし４５Ｃ１よシ
好ましくは２５Ｃないし４０Ｃｌ（維持し、また溶液の
溶存酸累濃度を飽和酸嵩濃度の５０悌以上に維持するこ
とによシ、分子量４５０００ないし６８０ｕ０のウロキ
ナーゼを含む培養液が得られる。
次に、本発明で用いられる抗体は、例えば、マウスＢ細
胞とミエローマ細胞の融合によシ創出され九抗体産生細
胞を培養することにより得られたモノクローナル抗体で
ある。この抗体産生融合細胞社、Ｍｉｌｓｔｅ＋ｎら（
Ｎａｔｕｒｅ 、 ２５４巻、４９５−４９７頁、１９
７５都）によって最初に報告され、例えば、臨床免疫（
谷口克他、１２（４１：２８４−２８９頁、１９８０年
）記載の方法等で得ることができる。
胞とミエローマ細胞の融合によシ創出され九抗体産生細
胞を培養することにより得られたモノクローナル抗体で
ある。この抗体産生融合細胞社、Ｍｉｌｓｔｅ＋ｎら（
Ｎａｔｕｒｅ 、 ２５４巻、４９５−４９７頁、１９
７５都）によって最初に報告され、例えば、臨床免疫（
谷口克他、１２（４１：２８４−２８９頁、１９８０年
）記載の方法等で得ることができる。
すなわち、抗原として人尿また位人腎細胞培養液よシ得
られたウロキナーゼを、あらかじめ免疫しておいたマウ
スＢＡＬＢ／Ｃ♂のひ臓からのＢ細胞（ここで用いるウ
ロキナーゼは必ずしも高純度のものを用いる必要扛なく
、例えば純度１チ以上のものであれば免疫は達成される
）と、同マウス骨髄のｍｓからのミニｐ−マ細胞（例え
ｔｆ、Ｐ！１Ｕｔｘ’ ６５）ｒｇＢ）を、細胞
数１０＝１の割合にてポリエチレングリコールの存在下
で融合させ、融合し九細胞のみを選択的に生き残らせる
ように調製した１０囁牛脂児血清添加ＨＡＴ培養液に浮
遊させ。
られたウロキナーゼを、あらかじめ免疫しておいたマウ
スＢＡＬＢ／Ｃ♂のひ臓からのＢ細胞（ここで用いるウ
ロキナーゼは必ずしも高純度のものを用いる必要扛なく
、例えば純度１チ以上のものであれば免疫は達成される
）と、同マウス骨髄のｍｓからのミニｐ−マ細胞（例え
ｔｆ、Ｐ！１Ｕｔｘ’ ６５）ｒｇＢ）を、細胞
数１０＝１の割合にてポリエチレングリコールの存在下
で融合させ、融合し九細胞のみを選択的に生き残らせる
ように調製した１０囁牛脂児血清添加ＨＡＴ培養液に浮
遊させ。
９６穴デイツシユにブレーティングする。約１週間後、
ミエローマ細胞とＢ細胞との融合細胞以夕を扛はとんど
死滅しており、融合細胞のコロニーが形成されてくる。
ミエローマ細胞とＢ細胞との融合細胞以夕を扛はとんど
死滅しており、融合細胞のコロニーが形成されてくる。
次に、ａ合細胞が目的とするウロキナーゼに対する抗体
を産生じているかどうかを調べる良め、その培養上清を
用い、「酵素免疫測定法」（石川栄治他著、医学書院、
１９７ｔ＋年）記載の＠累免疫測定法にてマイクロタイ
ター７ル−トを用いて抗体産生能をチェックする。抗体
産生が（＋）の培養上清のコロニーについては、一つの
コロニーが一つの培養孔に存在するようにりｐ−ニング
し、７〜１０日間培養後、再び酵素免疫測定法にて抗体
産生をチェックする。ここでも抗ｆ産生がｆ＋１となっ
たクローンは、目的とするウロキナーゼに対して同一の
抗体を産生ずる融合細胞のコロニーであり、モノクロー
ナル抗体産生融合細胞を得ることができる。このように
して得られた融合細胞扛、無限に継代培養され、抗つロ
キナーゼモノクｐ−ナル抗体を生産し続ける。
を産生じているかどうかを調べる良め、その培養上清を
用い、「酵素免疫測定法」（石川栄治他著、医学書院、
１９７ｔ＋年）記載の＠累免疫測定法にてマイクロタイ
ター７ル−トを用いて抗体産生能をチェックする。抗体
産生が（＋）の培養上清のコロニーについては、一つの
コロニーが一つの培養孔に存在するようにりｐ−ニング
し、７〜１０日間培養後、再び酵素免疫測定法にて抗体
産生をチェックする。ここでも抗ｆ産生がｆ＋１となっ
たクローンは、目的とするウロキナーゼに対して同一の
抗体を産生ずる融合細胞のコロニーであり、モノクロー
ナル抗体産生融合細胞を得ることができる。このように
して得られた融合細胞扛、無限に継代培養され、抗つロ
キナーゼモノクｐ−ナル抗体を生産し続ける。
次に、抗つロキナーゼモノク四−ナル抗体社。
この融合細胞を大量培養することにより得られた培養液
、また扛マウス跪腔内にて増殖させて得られた腹水から
回収することができる。回収方法は通常の血清からの抗
体の回収方法に準じた方法を適用すればよい０例えば、
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ １ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂｌａ
ｅｋｖｅｌｌ Ｓｅｔ、、 Ｐｕｂ、 １９７６年）記
載のハドソンらの方法が挙けられる。
、また扛マウス跪腔内にて増殖させて得られた腹水から
回収することができる。回収方法は通常の血清からの抗
体の回収方法に準じた方法を適用すればよい０例えば、
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ １ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂｌａ
ｅｋｖｅｌｌ Ｓｅｔ、、 Ｐｕｂ、 １９７６年）記
載のハドソンらの方法が挙けられる。
以上のようにして得られ九抗ウロキナーゼモノクローナ
ル抗体を不溶性担体と化学的に結合することにより、ウ
ロキナーゼ精製に利用することができる。不溶性担体と
して蝶、水に不溶性で、かつ抗つロキナーゼモノクｐ−
ナル抗体と結合しうる官能基を持つ例えば、セファロー
ス、アガロース、セルロース、デキストランの如き高分
子多糖類、またはポリアクリルアミド、多孔性ガラス等
がある。これらの固体基質と抗ウロキナーゼモノクロー
ナル抗体との化学的結合は、シアン化ブロムを用いる方
法、エポキシドを用いる方法、過田つ葉酸を用いる方法
、架橋試薬を用いる方法などによシ達成される。
ル抗体を不溶性担体と化学的に結合することにより、ウ
ロキナーゼ精製に利用することができる。不溶性担体と
して蝶、水に不溶性で、かつ抗つロキナーゼモノクｐ−
ナル抗体と結合しうる官能基を持つ例えば、セファロー
ス、アガロース、セルロース、デキストランの如き高分
子多糖類、またはポリアクリルアミド、多孔性ガラス等
がある。これらの固体基質と抗ウロキナーゼモノクロー
ナル抗体との化学的結合は、シアン化ブロムを用いる方
法、エポキシドを用いる方法、過田つ葉酸を用いる方法
、架橋試薬を用いる方法などによシ達成される。
本発明の方法によシ、例えば、カラムに充填された該不
溶性担体と前記したウロキナーゼ溶液を接触せしめるこ
とにより、ウロキナーゼは該不溶性担体に固定されてカ
ラムに保持され、未吸着不純物質扛流出除去される。不
溶性担体に吸着されたつ四キナーゼは、電気電導度ｔ−
４５ｍΩ／ａＩｋ以上、よシ好ましくはｓａｇΩ／―以
上に保った溶離液を用いることによシ、分子量低下をす
ることなく該不溶性担体から溶離せしめられる。この方
法を行うに際して、ウロキナーゼ溶液の吸着における電
導度は、通常のイオン交換法等に比べ高い電導度でも該
不溶性担体に吸着固定される。
溶性担体と前記したウロキナーゼ溶液を接触せしめるこ
とにより、ウロキナーゼは該不溶性担体に固定されてカ
ラムに保持され、未吸着不純物質扛流出除去される。不
溶性担体に吸着されたつ四キナーゼは、電気電導度ｔ−
４５ｍΩ／ａＩｋ以上、よシ好ましくはｓａｇΩ／―以
上に保った溶離液を用いることによシ、分子量低下をす
ることなく該不溶性担体から溶離せしめられる。この方
法を行うに際して、ウロキナーゼ溶液の吸着における電
導度は、通常のイオン交換法等に比べ高い電導度でも該
不溶性担体に吸着固定される。
次に、ｐＨ５〜９好ましくはｐＨ６〜８に調節した洗浄
液にて該不溶性担体を洗浄し、未吸着不純物質を除去す
る。！ｌ！いて、該不溶性担体から吸着ウロキナーゼを
溶離せしめるのであるが、この時用いられる溶離液は、
通常アフィニティークロマトグラフィーに用いられる溶
離液ならどのようなものでも適用することができる０例
えば、リン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ２，８）１１プロ
ピオン酸、アンモニア（ｐａｌｈ）、グリシン−塩酸緩
憤液（ｐ Ｈ２，５）、カオトロピックイオン、Ｎａｐ
、ＣＮ（ｐＨ７，４）、Ｎａ１．グアニジン−塩酸（ｐ
Ｈ３ｊ ）、８Ｍ尿！Ｘ （ｐ Ｈ７，０）、工ＪＦ’
−ｖ ｙ ｙ ９ ：１７−ル（ｐＨ１１，５）などが
ある。
液にて該不溶性担体を洗浄し、未吸着不純物質を除去す
る。！ｌ！いて、該不溶性担体から吸着ウロキナーゼを
溶離せしめるのであるが、この時用いられる溶離液は、
通常アフィニティークロマトグラフィーに用いられる溶
離液ならどのようなものでも適用することができる０例
えば、リン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ２，８）１１プロ
ピオン酸、アンモニア（ｐａｌｈ）、グリシン−塩酸緩
憤液（ｐ Ｈ２，５）、カオトロピックイオン、Ｎａｐ
、ＣＮ（ｐＨ７，４）、Ｎａ１．グアニジン−塩酸（ｐ
Ｈ３ｊ ）、８Ｍ尿！Ｘ （ｐ Ｈ７，０）、工ＪＦ’
−ｖ ｙ ｙ ９ ：１７−ル（ｐＨ１１，５）などが
ある。
さらにウロキナーゼの分子量の低下を防ぐためには、洗
浄液および溶離液の電導度を４５ｒｎΩ／傷以上、より
好ましくはＳＯＷΩ／Ｓ以上に保つ必要がある。洗浄液
および溶離液の電導度を保つための方法としては、例え
ば、 ＮａＨ２ＰＯ２，Ｎａ２ＨＰＯ４、）Ｊｓ４ＰＯ
４％ＮａＣ４ＫＣｔ％ ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、
ＭｇＣ４。
浄液および溶離液の電導度を４５ｒｎΩ／傷以上、より
好ましくはＳＯＷΩ／Ｓ以上に保つ必要がある。洗浄液
および溶離液の電導度を保つための方法としては、例え
ば、 ＮａＨ２ＰＯ２，Ｎａ２ＨＰＯ４、）Ｊｓ４ＰＯ
４％ＮａＣ４ＫＣｔ％ ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、
ＭｇＣ４。
ＣａＣ／、々どの無機塩類を１ｍまたは２種以上添加す
る方法が挙げられる。
る方法が挙げられる。
本発明方法によれに１人尿あるいは人腎細胞培養液、ウ
ロキナーゼ生産菌培養液、またはそれらの粗精製ウロキ
ナーゼ溶液中に含まれる不純物質′ を容易に分離
除去することができ１分子量純度の低下を防ぐことがで
きると共に、非常に高純度（１０００００ＩＵ／Ｍ９以
上）のウロキナーゼを取得することができる。しかも、
その活性回収′４Ａは８０〜９０％、、全活性回収率は
９５％以上という非常に高い回収率である。
ロキナーゼ生産菌培養液、またはそれらの粗精製ウロキ
ナーゼ溶液中に含まれる不純物質′ を容易に分離
除去することができ１分子量純度の低下を防ぐことがで
きると共に、非常に高純度（１０００００ＩＵ／Ｍ９以
上）のウロキナーゼを取得することができる。しかも、
その活性回収′４Ａは８０〜９０％、、全活性回収率は
９５％以上という非常に高い回収率である。
まえ、該不溶性担体へのウロキナーゼの吸着は非常に速
く、メまシ接触時間に影畳されない。し九がって、他の
アフィニティークロマト処理に比べて、かなり速い流速
を用いることができ、操作時間を大巾に短縮することが
できる。しかも、該不溶性担体に対するウロキナーゼの
吸着容量扛非常に大きい（例えば、１−の不溶性担体ゲ
ルに対して５．５ ｍｇの抗ウロキナーゼモノクローナ
ル抗体を結合した場合１５００００〜２０００００１Ｕ
）ので、小さなカラムで十分である。
く、メまシ接触時間に影畳されない。し九がって、他の
アフィニティークロマト処理に比べて、かなり速い流速
を用いることができ、操作時間を大巾に短縮することが
できる。しかも、該不溶性担体に対するウロキナーゼの
吸着容量扛非常に大きい（例えば、１−の不溶性担体ゲ
ルに対して５．５ ｍｇの抗ウロキナーゼモノクローナ
ル抗体を結合した場合１５００００〜２０００００１Ｕ
）ので、小さなカラムで十分である。
さらに、該不溶性担体社ウロキナーゼを脱着せしめたの
ち、洗浄液で洗浄するだけで何回でも使用することがで
きるので、Ｑロキナーゼ精裂工程に簡便さ、を与えるこ
とができるなど、多くの利点を有し、工業的に非常に有
用である。
ち、洗浄液で洗浄するだけで何回でも使用することがで
きるので、Ｑロキナーゼ精裂工程に簡便さ、を与えるこ
とができるなど、多くの利点を有し、工業的に非常に有
用である。
次に、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１
人腎細胞を培養して得られた培養液１１ （２００ＩＵ
／ｄ）Ｋ硫安４７２ｆを加えて７〇−飽和とし、得られ
た沈澱ｔ Ｎ１ａＣ１で電導度を５０ｍΩ／俤としたＩ
Ｕ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１５ｇ１ｔに溶
かし、２００倍量の同緩衝液にて４Ｃ，−晩透析した。
／ｄ）Ｋ硫安４７２ｆを加えて７〇−飽和とし、得られ
た沈澱ｔ Ｎ１ａＣ１で電導度を５０ｍΩ／俤としたＩ
Ｕ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１５ｇ１ｔに溶
かし、２００倍量の同緩衝液にて４Ｃ，−晩透析した。
透析終了後、遠沈して得られ九粗ウロキナーゼ溶液（１
４ｗＩｔ）はＩＱ７０ＱＩＵ／−であった。
４ｗＩｔ）はＩＱ７０ＱＩＵ／−であった。
この粗ウロキナーゼ溶液１５００００１Ｕを、ＮａＣｔ
で５０ｍΩ／ｍ［調節し九洗浄用１０ ｍＭ ９ン酸緩
衝液（ｐ Ｈ７，０）で十分に洗浄した抗ウロキナーゼ
モノクローナル抗体を化学的に結合したセファロース、
ファルマシア社（抗体５．５ ｗｈｙ／−担体）のカラ
ム（０，９−φ、１ｄ）Ｋ通した。
で５０ｍΩ／ｍ［調節し九洗浄用１０ ｍＭ ９ン酸緩
衝液（ｐ Ｈ７，０）で十分に洗浄した抗ウロキナーゼ
モノクローナル抗体を化学的に結合したセファロース、
ファルマシア社（抗体５．５ ｗｈｙ／−担体）のカラ
ム（０，９−φ、１ｄ）Ｋ通した。
未吸着分画を洗浄用リン酸緩衝液で洗浄除去稜。
カラムに吸着保持されたウロキナーゼｔ ＮａＣ１で電
導度を５０畦Ｖｆ：ｌａ Ｋ した０、１Ｍグリシン−
塩酸緩衝液（ｐ Ｈ２，８）で溶出した。溶出した分画
のＯＤ２．。とウロキナーゼ活性（ＩＩ準フィブリン平
板仮性て測定）の関係を図面に示し、原料の粗ウロキナ
ーゼ溶液と溶出分画の性質を表１に示した。
導度を５０畦Ｖｆ：ｌａ Ｋ した０、１Ｍグリシン−
塩酸緩衝液（ｐ Ｈ２，８）で溶出した。溶出した分画
のＯＤ２．。とウロキナーゼ活性（ＩＩ準フィブリン平
板仮性て測定）の関係を図面に示し、原料の粗ウロキナ
ーゼ溶液と溶出分画の性質を表１に示した。
表 １
表１から、アフィニティークロマトグラフィーによｐ比
活性が一段階で約６５倍に上昇し、 １３ ＨＩＬＩ
ＬＩＩ Ｕ／ｊｌ＆という非常に高純度のウロキナーゼ
が８７％という高回収率で得られた（全活性回収率は９
８％）３゜実施例２ 採取した人尿２５ ｔ （８１Ｕ／ｍｌ）を実施例１と
１し１様に処理し、粗ウロキナーゼ溶液（３９１］０１
Ｕ／ａｄ） ｔ４０−得た。この粗ウロキナーゼ溶液１
５００００１υを、実施例１と同様のカラムにょクアフ
ィニティークロマトグラフイーを行なった。原料の粗ウ
ロキナーゼ溶液と溶出分−の性質を表２に示した、表
２ 全活性回収率は９５％ 実施例３ 実施例１と同様の方法で粗ウロキナーゼ溶液をＸｌｔし
、こ１７）１８００００ＩＵを、Ｎ息Ｃ７で電導度を５
０１ＬΩ／ａＫ調節し良洗浄用１０ ｍＭ ＩＪン酸緩
術液（ｐ Ｈ７，０）で十分に洗浄した抗ウロキナーゼ
モノクローナル抗体を化学的に結合した粒状テキストラ
ン（抗体５．５Ｗｇ／ｄ担体）のカラム（０，９伽φ％
１ｇ１ｔ） Ｋ通した。
活性が一段階で約６５倍に上昇し、 １３ ＨＩＬＩ
ＬＩＩ Ｕ／ｊｌ＆という非常に高純度のウロキナーゼ
が８７％という高回収率で得られた（全活性回収率は９
８％）３゜実施例２ 採取した人尿２５ ｔ （８１Ｕ／ｍｌ）を実施例１と
１し１様に処理し、粗ウロキナーゼ溶液（３９１］０１
Ｕ／ａｄ） ｔ４０−得た。この粗ウロキナーゼ溶液１
５００００１υを、実施例１と同様のカラムにょクアフ
ィニティークロマトグラフイーを行なった。原料の粗ウ
ロキナーゼ溶液と溶出分−の性質を表２に示した、表
２ 全活性回収率は９５％ 実施例３ 実施例１と同様の方法で粗ウロキナーゼ溶液をＸｌｔし
、こ１７）１８００００ＩＵを、Ｎ息Ｃ７で電導度を５
０１ＬΩ／ａＫ調節し良洗浄用１０ ｍＭ ＩＪン酸緩
術液（ｐ Ｈ７，０）で十分に洗浄した抗ウロキナーゼ
モノクローナル抗体を化学的に結合した粒状テキストラ
ン（抗体５．５Ｗｇ／ｄ担体）のカラム（０，９伽φ％
１ｇ１ｔ） Ｋ通した。
未吸着分画を洗浄用リン酸緩衝液で洗浄除去後。
カラムに９着保持されたつｐキナーゼヲ、ＮａＣｔで電
導度ｆ ５０ ｗｔｆ）ｊｔｓ Ｋ調部した８ｙ尿嵩（
ＰＨ７，０）で溶出し、原料の粗ウロキナーゼ溶液と溶
出分画の性質を表３に示した。
導度ｆ ５０ ｗｔｆ）ｊｔｓ Ｋ調部した８ｙ尿嵩（
ＰＨ７，０）で溶出し、原料の粗ウロキナーゼ溶液と溶
出分画の性質を表３に示した。
表 ３ ゛
全活性回収車灯１００％
実施例４
実施例１と同様の方法で粗ウロキナーゼ溶液を取得し、
この１８００００ＩＵを、Ｎａ Ｃ１で電導ｉｔ５ｏｍ
Ω／ｅに調節した洗浄用１０ｍＭＩＪン酸紗衝液（ｐ
Ｈ７，０）で十分に洗浄した抗ウロキナーゼモノクロー
ナル抗体を化学的に結合した粒状ポリアクリルアミド（
抗体３．５〜／−担体）のカラム（０，９伽φ、１−）
に通した。
この１８００００ＩＵを、Ｎａ Ｃ１で電導ｉｔ５ｏｍ
Ω／ｅに調節した洗浄用１０ｍＭＩＪン酸紗衝液（ｐ
Ｈ７，０）で十分に洗浄した抗ウロキナーゼモノクロー
ナル抗体を化学的に結合した粒状ポリアクリルアミド（
抗体３．５〜／−担体）のカラム（０，９伽φ、１−）
に通した。
未吸着分画を洗浄用リン酸緩衝液で洗浄除去後、カラム
に吸着保持されたウロキナーゼを、ＮａＣ１で電導度を
ｓｏｗΩ／傷に調節した４ 優ＮＨ４ＯＨ（ｐＨ１１）
で溶出し、原料の粗ウロキナーゼ溶液と溶出分画の性質
を！！４に示した。
に吸着保持されたウロキナーゼを、ＮａＣ１で電導度を
ｓｏｗΩ／傷に調節した４ 優ＮＨ４ＯＨ（ｐＨ１１）
で溶出し、原料の粗ウロキナーゼ溶液と溶出分画の性質
を！！４に示した。
表 ４
実施例５
実施例１と同様の方法で粗ウロキナーゼ溶液をアフィニ
ティーカラムに通し、未吸着分画を洗浄用１０ ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，０）で洗浄除去後。
ティーカラムに通し、未吸着分画を洗浄用１０ ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，０）で洗浄除去後。
カラムに吸着保持されたウロキナーゼを、各濃度のＮａ
Ｃｔを含む０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，
８）で溶出し、回収され九分子量４５０００ないし６８
０００のつｐキナーゼ区分の全活性区分に対する割合を
表５に示した。
Ｃｔを含む０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，
８）で溶出し、回収され九分子量４５０００ないし６８
０００のつｐキナーゼ区分の全活性区分に対する割合を
表５に示した。
表 ５
実施例６
実施例１と同様の方法で粗つロキナーゼ溶ｅ、をアフィ
ニティーカラムに通し、未吸着分画を種々の塩を加えた
１ ０ ｍＭ ’） ン酸緩価液（ｐ Ｈ７，（１）で
洗浄除去後、カラムに吸着保持されたウロキナーゼを各
塩濃度の０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐ Ｈ２，８
）で溶出し、回収された分子Ｊｉ４５０ＯＯないし６８
０００のつ費キナーゼ区分の全活性ト分に対する割合を
表６に示した。
ニティーカラムに通し、未吸着分画を種々の塩を加えた
１ ０ ｍＭ ’） ン酸緩価液（ｐ Ｈ７，（１）で
洗浄除去後、カラムに吸着保持されたウロキナーゼを各
塩濃度の０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐ Ｈ２，８
）で溶出し、回収された分子Ｊｉ４５０ＯＯないし６８
０００のつ費キナーゼ区分の全活性ト分に対する割合を
表６に示した。
表 ６
比較例（従来法との比較）
１１１ａ法（リジンセファロースによるウロキナーゼの
精−） 実施例１と同様の方法で粗ウロキナーゼ溶液を取得し、
この１５００００ＩＵを、５ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７
，，４）で十分洗浄し九リジンセファロースカラＡ （
２，６６ｓφＸ１１ｍ、６０ｍ）に通し、未吸着分画を
洗浄除去後、吸着したウロキナーゼを０．２５ Ｍ Ｎ
ａＣ１を含む５ ｍＭリン酸緩衝液で浴出し、溶出分画
を取得した。溶出分画のウロキナーゼ活性を測定したと
ころ、比活性９１００ＩＵ／ダ、回収率４５チであった
。
精−） 実施例１と同様の方法で粗ウロキナーゼ溶液を取得し、
この１５００００ＩＵを、５ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７
，，４）で十分洗浄し九リジンセファロースカラＡ （
２，６６ｓφＸ１１ｍ、６０ｍ）に通し、未吸着分画を
洗浄除去後、吸着したウロキナーゼを０．２５ Ｍ Ｎ
ａＣ１を含む５ ｍＭリン酸緩衝液で浴出し、溶出分画
を取得した。溶出分画のウロキナーゼ活性を測定したと
ころ、比活性９１００ＩＵ／ダ、回収率４５チであった
。
（２１ｂ法（ヘパリンセファロースによるウロキナーゼ
の精製） 畠法と同じ粗ウロキナーゼ溶液１５０００口ＩＵｉ、６
ｍΩ／ｌのリン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，４）で十分流汗し
たヘパリンナトリウム塩を結合したセファロースカラム
（２，６（Ｉｓφｘ１４０ｍ、７５ｓｄ）に通し、未吸
着分画を洗浄除去後、吸着したウロキナーゼを、０．２
５ Ｍ ＮａＣｔを含む６虞Ω１０１１のリン酸緩衝液
（ｐ Ｈ７，４）で溶出し、溶出分画を取得した。溶出
分画のウロキナーゼ活性を測定したところ、比活性４０
０００ ｘｕ／ｉＭｉ、回収率５８％であった。
の精製） 畠法と同じ粗ウロキナーゼ溶液１５０００口ＩＵｉ、６
ｍΩ／ｌのリン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，４）で十分流汗し
たヘパリンナトリウム塩を結合したセファロースカラム
（２，６（Ｉｓφｘ１４０ｍ、７５ｓｄ）に通し、未吸
着分画を洗浄除去後、吸着したウロキナーゼを、０．２
５ Ｍ ＮａＣｔを含む６虞Ω１０１１のリン酸緩衝液
（ｐ Ｈ７，４）で溶出し、溶出分画を取得した。溶出
分画のウロキナーゼ活性を測定したところ、比活性４０
０００ ｘｕ／ｉＭｉ、回収率５８％であった。
以上、従来法でめるａ、ｂ法の結果と本発明方法により
得られた結果（実施例１と同じ）をまとめて表７に示し
た。
得られた結果（実施例１と同じ）をまとめて表７に示し
た。
！！７
図面は実施例Ｉにおいて溶出した分画のＯＤ□。
とウロキナーゼ活性の関係を示す図表である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 Ｉｌｌウロキナーゼを含む溶液から分子量４５０００な
いし６８０００のウロキナーゼを回収する工程において
、モノクローナル抗体によるアフィニティークロマトグ
ラフィーを用いることを特許とするウロキナーゼの回収
方法。 （２１モノクロ一ナル抗体がマウスＢ細胞とマウスミエ
ローマ細胞との融合細胞により産生された抗体である特
許請求の範囲第１項記載の方法。 （３）モノクローナル抗体が抗つｐキナーゼ抗体である
特許請求の範囲第１項記載の方法。 （４１ウロキナーゼを含む溶液が人尿あるいは人腎細胞
を培養して得られた培養液である特許請求の範囲第１項
記載の方法、 （５）アフィニティークロマトグラフィーにおいて、洗
浄液および溶離液の電導度が４５ｍΩ／（１１１以上で
ある特許請求の範囲第１項記載の方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57003290A JPS58121793A (ja) | 1982-01-14 | 1982-01-14 | ウロキナ−ゼの回収方法 |
| EP83100190A EP0084344A3 (en) | 1982-01-14 | 1983-01-12 | Anti-urokinase monoclonal antibodies and process for preparing the same |
| KR1019830000124A KR840003288A (ko) | 1982-01-14 | 1983-01-14 | 유로키나제의 회수방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57003290A JPS58121793A (ja) | 1982-01-14 | 1982-01-14 | ウロキナ−ゼの回収方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58121793A true JPS58121793A (ja) | 1983-07-20 |
Family
ID=11553259
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57003290A Granted JPS58121793A (ja) | 1982-01-14 | 1982-01-14 | ウロキナ−ゼの回収方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58121793A (ja) |
| KR (1) | KR840003288A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01161251A (ja) * | 1987-12-18 | 1989-06-23 | Fujitsu Ltd | 電子写真感光体 |
-
1982
- 1982-01-14 JP JP57003290A patent/JPS58121793A/ja active Granted
-
1983
- 1983-01-14 KR KR1019830000124A patent/KR840003288A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01161251A (ja) * | 1987-12-18 | 1989-06-23 | Fujitsu Ltd | 電子写真感光体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR840003288A (ko) | 1984-08-20 |
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