JPS58155089A - ウロキナ−ゼの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は粗製ウロキナーゼから、抗原抗体反応の原理を
用いて夾雑蛋白を除去することにより、きわめて温和な
条件で高純度かっ高収率にウロキナーゼを取得する方法
に関する。

ウロキナーゼは、血清中に含まれるプラスミノーゲンを
活性化してフィブリン溶解能を有するプラスミンを生成
させるため、各檀血栓症の治療（二有効であるばかりか
制癌剤と併用することによりその効果を増強させること
が知られている。

従来、ウロキナーゼの精製には、各種吸着剤に接触させ
た後、吸着したウロキナーゼを溶離する方法や陰イオン
又は陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー及びゲル濾過
法、あるいは各棟すカンドな用いるアフィニティークロ
マトグラフィー等の組み合わせが行なわれている。一般
にウロキナーゼは不安定な酵素であるため、精製工程は
できるだけ短時間で、しかも、生体に存在するそのまま
の形で分離するためには、温和な条件で精製することが
必要とされる。

本発明者らは、ウロキナーゼの分離精製法について鋭意
研究した結果、粗製ウロキナーゼ中の夾雑蛋白を抗原抗
体反応によって除去することによりウロキナーゼを簡単
かつ、高収率、高純度に精製する方法を確立した。

抗原抗体反応を用いるウロキナーゼの精製法については
、Ｔでに特開昭５１−９７８２号において抗ウロキナー
ゼ抗体を固定化した免疫吸着体が用いられている。しか
しながら、一般に抗原抗体の結合は強固であり、ｑＩｋ
看したウロキナーゼを解離回収するζ＝は過酷な条件が
必要となり酵累の失活を伴う可能性が高い。

本発明は、生理的条件のｐＨ６〜８でクロキナー（を精
製できる利点を有する。

粗製クロキナ−４中の夾雑蛋白に苅する抗体は粗製クロ
キナーゼよりウロキナーゼを除去した後、適当な動物に
免疫注射を行なって作製するか、あるいは、粗製ウロキ
ナーゼを直接、免疫注射し、産生じた抗体から抗ウロキ
ナーゼ抗体を除去することにより得られるが、動物の抗
体産生能を最大限４：庄か丁には前者の方が好ましい。

また、前者の場合に、粗製ウロキナーゼよりウロキナー
ゼを除去する方法としては抗つロキナーイ抗体を固定化
した免疫吸着体が用いられる。

得られた抗夾雑蛋白抗体を用いての粗製ウロキナーゼ中
の夾雑蛋白の除去は、簡単には抗夾し、生じた抗原抗体
反応の沈殿物を遠心分離で除去することにより達成され
る。

効果的な方法としては、抗夾雑蛋白抗体を水不溶性担体
（例えば、セルロース誘導体、デキストラン電合体、寒
天ゲル、ポリアクリルアミドゲル）に同定化した免疫吸
着体によるアフィニティークロマトグラフィーが好まし
い、すなわち、この免疫吸着体と粗製ウロキナーイ溶液
を混合し、充分の抗原抗体反応を行なわせた後。

水溶液と水不溶性担体な分離する。、これによって、ウ
ロキナーゼは水溶液中直二残存し、夾雑蛋白は水不溶性
担体に吸着される。

本発明によれば２着るしく比活性の高いウロキナーゼを
回収率８０嘔以上で得ることが出来。

しかも、ウロキナーゼの低分子化はほとんど見られない
。

夾雑蛋白の吸着した免疫吸着体は、Ｉ）Ｈ２〜３又ハｐ
Ｈｌ０−１１の緩衝液、あるいは　ジオキチン。

エチレングライコール等の極性を下げる試薬。

尿素及び塩酸グアニジン等の変性剤等により洗浄後、中
性付近の緩衝液で平衡化し９次の使用に備える。

次に実施例をあげて本発明を説明する。

実施例１ 公知の方法により純粋に精製したウロキナーゼ１１１９
／２−生理食塩水とＦｒｅｕｎｄｓ　ｃｏｍｐｌｅｌｅ
　ａｄｊｕｖａｎｌ（Ｄｉｆｃｏ）２−を充分混合し、
乳剤を作製した。これを３．０〜の白色家兎の筋肉及び
皮下に５部位以上注射し、同様の乳剤を１０日後及び２
０日後に再注射して感作した。最後の感作後、　１０日
目に精製したクロキナー（約２００μ？１０．２５−生
理食塩水を静注した。１３日後、採血、血清分離し、抗
ウロキナーゼ血清を得た。

この抗血清１００−に飽和硫安溶液を４０％飽和ζ二な
るよう加え、沈殿物を遠心分離で集め、０．８６ｆｔＮ
ａｃｔを含む０．１　Ｍリン酸緩鈎液ｐＨ７，４，１１
０ｍｇに溶解した。

さらに、この溶液に飽和硫安水溶液を３３−飽和になる
よう添加し、沈殿物を遠心分離で集め。

０．１５Ｍ　）リスーリン酸緩衡液ｐｉ（ｓ、ａ、　　
６Ｂ−に溶解し、同緩衝液に対して透析した。

透析後、同一緩衝液で平衡化したＤＥＡＲ−セルロース
、５９ｍ（カラム２×１５国）に添加し。

非吸着区分を集め、　１，１００叩のＴ−グロブ９ン噛
分を抗つロキナー（抗体として得た。この抗つロキナー
（抗体は、オフタロニー法（０，０ｕｃ−ｈｔｅｒｌｏ
ｎｙ、　Ａｃｔａ、　Ｐａｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、　８ｃｗｗｉ、、　３２　２３１（１９５３）、、ｌ
により、粗製ウロキナーゼ（比活性２７．０ＯＯＵ／１
ｌｌＰ蛋萌及び単一に精製したウロキナーゼのいづれに
ついても、ただ一本の沈降線を形成した。

抗ＵＫ抗体ｉ固定化した免疫吸着体は、Ｃｕａｔ−ｒｅ
ｃａｓａｇらの方法（Ｐ、　Ｃｕａｔｒｅｃａｉａｓ、
　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

２４５、３０５９．　（１９７０月に従い作製した。す
なわち。

ｌＱＱｍの５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂを約ｉ、ｏ　ｏ
　ｏ−の精製水で洗浄した後、精製水１００−に懸濁し
た。この懸濁液に、粉砕したＢｒＣＮ、　３０　ｔを攪
拌下に加え、８分間、　　４　Ｎ　ＮａＯＨにてｐＨ１
１＃温度２０℃に保ち、その後、直ちにゲルを０．１Ｍ
炭酸ソーダ緩衝液ＰＨ９で洗浄する。次（ニゲルを、氷
水中にセットした抗りロキナーぞ抗体ＬＯＯＯｗ＆を含
む７ｏ−の同量両液に投入し、２４時間カップリング反
応を行った。

反応終了後、　　Ｏ，１５ＭＮａＣｔを含む０．０２Ｍ
　ホ”７酸緩衝液ｐＨ８Ｃ以下「緩衛液中」と略称する
〕で充分洗浄し、抗ウロキナーゼ抗体−８ｅｐＩ＋、ｒ
ｏｓｅ　４Ｂを得た。この免疫吸着体１００ｍと１００
−の粗製ウロキナーゼ溶液（比活性ｚ７．ｏｏｏＬＪ／
１１ｖ蛋白。

１．１　Ｘ　１０’単位）を４°Ｃで２４時間反応させ
、非吸着の夾雑蛋白を３２１ｖ得た。

この夾雑蛋白に対する抗血清を上述の抗ウロキナーゼ血
清の場合と同様にして作製した。ただし、使用した抗原
蛋白量は、ウロキナーゼの場合の５倍量用いた。得られ
た抗夾雑蛋白血清の１００−は、抗クロキナーゼ血清と
全く同法にテ、硫安塩析、ＤＢＡＥ−セルロースにて精
製シ。

俊 さらに緩衛Ａ（１）で平衡化した１５ｍのウロキナーゼ
−８ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ　（単一に精製したウロ
キナーゼ。

８Ｍ９をＣｕａｌｒｅｃａｓａｓの方法で１５ｗＩｔの
５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ１二固定化したもの）と４
℃で２４時間反応させ。

非吸着画分を抗夾雑蛋白抗体として１，０００　Ｉｆ蛋
白を得た。

得られた抗体は、オフタロニー法にてクロキナー（と沈
降線を形成せず、夾雑蛋白と多数の沈降線を形成した。

抗夾雑蛋白抗体２００〜をＣｕａｌｒｅｃａｓａｓの方
法に従い、　３０１ｍ１の８ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ
　ニ固定化シテ免疫吸着体を作製した。

この免疫吸着体を緩衝液（１）で平衡化後、その１５ｍ
に粗製ウロキナーゼ、　　１．２　Ｘ　１０”単位（夾
雑蛋白の分離に使ったものと同一試料）を４−の緩衝液
（１）に溶解して添加し４℃で２４時間反応させたのち
、カラムに充填し１００−の緩衝液（１）で洗浄した。

この洗浄液に含まれるウロキナーゼの比活性は、　　８
１，０ＯＯＬＪ／にν蛋白１回収率は９０−であった。

夾雑蛋白の吸着した免疫吸着体は、　　０．１７Ｍグリ
シン−塩酸緩衝液ＰＨ２，３の１００−で洗浄後、１０
チジオキサンを含む緩衝液（１）で洗浄し、再度緩衝液
（１）で平衡化して次の使用に備えた。

実施例２ 実施例１で得た抗夾雑蛋白抗体−８ｅｐｈａｒｏｓｅ　
４Ｂを緩衝液（１）で平衡化し、その３０−に対して粗
製りａキナーゼ、　　２ｅ５　ｘ　ｔｏ”単位（夾雑蛋
白の分離ζ：用いたものと同一試料、）を８−の緩ｌｌ
１ｒ液（１）に溶解して添加し、４℃で３７時間反応さ
せたのち、カラムに充填し、２００−の緩衝液（１）で
洗浄した。ウロキナーゼの比活性は８５，０００Ｕ／＃
蛋白９回収率９３−であった。この洗浄液を限外濾過で
濃縮後、　　０．３ＭＮａｃｔを含む０．１Ｍリン酸緩
衝液ｐＨ７，０の溶出液で５ｅｐｈａｄｅｘＧ−１００
Ｅヨるゲル濾過を行なった。

溶出したウロキナーゼは分子量約５４，０００の高分子
ウロキナーゼであり、低分子ウロキナーゼは、はとんど
見られなかった。

特許出願人　わかもと製薬株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 粗製ウロキナーゼ溶液からその中の夾雑蛋白を、その夾
   雑蛋白の免疫抗体又はその免疫抗体を固定化した不溶性
   担体と抗原抗体反応させて。 除去することを特徴とするクロキナーゼの精製法。