JPS5935B2 - ウロキナ−ゼの精製法 - Google Patents
ウロキナ−ゼの精製法Info
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- JPS5935B2 JPS5935B2 JP52065975A JP6597577A JPS5935B2 JP S5935 B2 JPS5935 B2 JP S5935B2 JP 52065975 A JP52065975 A JP 52065975A JP 6597577 A JP6597577 A JP 6597577A JP S5935 B2 JPS5935 B2 JP S5935B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はウロキナーゼの精製法に関する。
さらに詳しくは、予め終濃度３〜８Ｍになるよう尿素を
添加した粗ウロキナーゼ含有溶液から、特異的にウロキ
ナーゼをＮＨ４＋型に調製したスルホン酸基を有する強
酸性陽イオン交換体に吸着せしめ、収率良くかつ原料粒
ウロキナーゼの純度にかかわらず高純度に精製されたウ
ロキナーゼを回収する方法に関する。
添加した粗ウロキナーゼ含有溶液から、特異的にウロキ
ナーゼをＮＨ４＋型に調製したスルホン酸基を有する強
酸性陽イオン交換体に吸着せしめ、収率良くかつ原料粒
ウロキナーゼの純度にかかわらず高純度に精製されたウ
ロキナーゼを回収する方法に関する。
ウロキナーゼは、線溶系酵素であるプラスミンをプラス
ミノーゲンから生成せしめる酵素であり、各種血栓症に
有効であるばかりでなく、制癌剤と併用することにより
制癌剤の薬効を著しく高めることも見出されている。
ミノーゲンから生成せしめる酵素であり、各種血栓症に
有効であるばかりでなく、制癌剤と併用することにより
制癌剤の薬効を著しく高めることも見出されている。
人の尿から単離されたウロキナーゼは、抗原抗体反応な
どの副作用がなく現在広く賞月されている。
どの副作用がなく現在広く賞月されている。
従来、粗ウロキナーゼの精製には、各種弱酸性陽イオン
交換体あるいは弱塩基性陰イオン交換体さらには架橋デ
キストラン等のゲルｒ過剤等を用いてＮ製する方法が汎
用されている。
交換体あるいは弱塩基性陰イオン交換体さらには架橋デ
キストラン等のゲルｒ過剤等を用いてＮ製する方法が汎
用されている。
しかし、これらの方法はいずれも収率および得られるウ
ロキナーゼの純度の点で必ずしも優れた方法とはいい難
く、さらに有利な方法が追求されているのが現状である
。
ロキナーゼの純度の点で必ずしも優れた方法とはいい難
く、さらに有利な方法が追求されているのが現状である
。
本発明者らはウロキナーゼの有利な精製法について鋭意
研究した結果、粗ウロキナーゼ含有溶液に終濃度３〜８
Ｍとなるように尿素を添加し、次いでこれを、ＮＨ４＋
型に調整したスルホン酸基を有する強酸性陽イオン交換
体に接触させることにより、ウロキナーゼが特異的に該
イオン交換体に吸着し、次いでアルカリ性溶液、塩類溶
液等で溶離せしめれば、粗ウロキナーゼ含有溶液に上述
のごとく尿素を添加しない場合に比べ、未吸着ウロキナ
ーゼを著しく減少させることが可能でしたがってより高
回収率で、粗ウロキナーゼの純度にかかわらずほぼ一定
のより高い比活性のウロキナーゼを得ることができると
いう新規な知見を見出し、本発明を完成したのである。
研究した結果、粗ウロキナーゼ含有溶液に終濃度３〜８
Ｍとなるように尿素を添加し、次いでこれを、ＮＨ４＋
型に調整したスルホン酸基を有する強酸性陽イオン交換
体に接触させることにより、ウロキナーゼが特異的に該
イオン交換体に吸着し、次いでアルカリ性溶液、塩類溶
液等で溶離せしめれば、粗ウロキナーゼ含有溶液に上述
のごとく尿素を添加しない場合に比べ、未吸着ウロキナ
ーゼを著しく減少させることが可能でしたがってより高
回収率で、粗ウロキナーゼの純度にかかわらずほぼ一定
のより高い比活性のウロキナーゼを得ることができると
いう新規な知見を見出し、本発明を完成したのである。
粗ウロキナーゼ含有溶液に終濃度が３Ｍ未満の添加では
十分な効果は見られず、また８Ｍを越えるとウロキナー
ゼの失活が大きくなってしまう。
十分な効果は見られず、また８Ｍを越えるとウロキナー
ゼの失活が大きくなってしまう。
本発明で使用するスルホン酸基を有する強酸性陽イオン
交換体としては、三次元網目構造を持ったポリスチレン
樹脂あるいはフェノールホルマリン樹脂等にスルホン酸
基を導入したもの、たとえばダウ・ケミカル社製のダウ
エックス５０Ｗ等、ローム・アンド・バース社製のアン
バーライトＩＲ−１２０Ｂ、ＣＧ−１２０等、ダイヤモ
ンド・ジャムロック社製のデュオライトＣ−２０等、さ
らにはセルロースあるいは架橋デキストランにスルホエ
チル基あるいはスルホプロピル基を導入したもの、たと
えばセルバ社製等のＳＥ−セルロース、ファルマシア・
ファイン・ケミカルス社製のＳＰ−セファデックス等が
あり、いずれも広く市販されているものである。
交換体としては、三次元網目構造を持ったポリスチレン
樹脂あるいはフェノールホルマリン樹脂等にスルホン酸
基を導入したもの、たとえばダウ・ケミカル社製のダウ
エックス５０Ｗ等、ローム・アンド・バース社製のアン
バーライトＩＲ−１２０Ｂ、ＣＧ−１２０等、ダイヤモ
ンド・ジャムロック社製のデュオライトＣ−２０等、さ
らにはセルロースあるいは架橋デキストランにスルホエ
チル基あるいはスルホプロピル基を導入したもの、たと
えばセルバ社製等のＳＥ−セルロース、ファルマシア・
ファイン・ケミカルス社製のＳＰ−セファデックス等が
あり、いずれも広く市販されているものである。
本発明に係るウロキナーゼの精製法は次の通りである。
予めｐＨ４〜９好ましくはｐＨ６〜８に調製した粗ウロ
キナーゼ含有溶液に、終濃度３〜８Ｍとなるように尿素
を加えたものを、ＮＨ４＋型に調製したスルホン酸基を
有す乞強酸性陽イオン交換体と接触させて、ウロキナー
ゼを特異的に該イオン交換体に吸着せしめる。
キナーゼ含有溶液に、終濃度３〜８Ｍとなるように尿素
を加えたものを、ＮＨ４＋型に調製したスルホン酸基を
有す乞強酸性陽イオン交換体と接触させて、ウロキナー
ゼを特異的に該イオン交換体に吸着せしめる。
ここで該イオン交換体をＮＨ４＋型に調製するには、通
常用いられる手段、すなわち塩化アンモニウム溶液をＨ
十型の該イオン交換体に接触させて、Ｈ＋イオンがすべ
てＮＨ４＋イオンに置換されていることをＰＨ測測定よ
り確認した後、゛蒸留水で洗浄することにより行なうこ
とができる。
常用いられる手段、すなわち塩化アンモニウム溶液をＨ
十型の該イオン交換体に接触させて、Ｈ＋イオンがすべ
てＮＨ４＋イオンに置換されていることをＰＨ測測定よ
り確認した後、゛蒸留水で洗浄することにより行なうこ
とができる。
粗ウロキナーゼ含有溶液のｐＨの調製はリン酸緩衝液等
の緩衝液を用いて行なうことができる。
の緩衝液を用いて行なうことができる。
ウロキナーゼを吸着した該イオン交換体は水または低濃
度の塩類溶液で洗浄することにより、尿素をはじめウロ
キナーゼ以外の大部分の不純物が除去される。
度の塩類溶液で洗浄することにより、尿素をはじめウロ
キナーゼ以外の大部分の不純物が除去される。
次いで、該イオン交換体に吸着したウロキナーゼは、ア
ルカ’）性情→矢液または高濃度塩類溶液またはこれら
の組合せによる溶液を用いて容易に溶離させることがで
きる。
ルカ’）性情→矢液または高濃度塩類溶液またはこれら
の組合せによる溶液を用いて容易に溶離させることがで
きる。
アルカリ性溶液としては希アンモニア水あるいはｐＨ１
０〜１２の緩衝液等が、塩類溶液としては塩化アンモニ
ウム溶液等が、さらには塩化アンモニウム等の塩類を含
むｐＨ８〜１２のアルカリ性溶液等も用いることができ
る。
０〜１２の緩衝液等が、塩類溶液としては塩化アンモニ
ウム溶液等が、さらには塩化アンモニウム等の塩類を含
むｐＨ８〜１２のアルカリ性溶液等も用いることができ
る。
本発明に従い粗ウロキナーゼ含有溶液に尿素を添加した
場合と、尿素を添加しなかった場合の比較を、スルホン
酸基を有する強酸性陽イオン交換体としてたとえばダウ
エックス５０ＷＸ８を用いて、参考例として次に示す。
場合と、尿素を添加しなかった場合の比較を、スルホン
酸基を有する強酸性陽イオン交換体としてたとえばダウ
エックス５０ＷＸ８を用いて、参考例として次に示す。
ウロキナーゼ活性の測定はプロラグのフィブリン平板法
（Ｐｌｏｕｇら：Ｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｉｏｐｈｙ−Ａｃ
ｔａ、 ２４巻、２７８頁、１９５７年）により行な
った。
（Ｐｌｏｕｇら：Ｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｉｏｐｈｙ−Ａｃ
ｔａ、 ２４巻、２７８頁、１９５７年）により行な
った。
参考例
０．１Ｍの食塩を含む０．１ Ｍ ！Ｊン酸緩衝液ｐＨ
６，５に対して透析した比活性８２０国際単位（以下、
■Ｕと略す）／ｒｎ＆蛋白の粗ウロキナーゼ１１９００
ＩＵを含有する溶液４ＴＬｌに、尿素を１．２ｇおよび
２．０ｇを加えて溶解したものと尿素を加えなかったも
のを、それぞれＮＨ４＋型に調製したダウエックス５０
ＷＸ８（２００〜４００メツシユ）５ｍｌを充填したカ
ラムに流しウロキナーゼを吸着させた。
６，５に対して透析した比活性８２０国際単位（以下、
■Ｕと略す）／ｒｎ＆蛋白の粗ウロキナーゼ１１９００
ＩＵを含有する溶液４ＴＬｌに、尿素を１．２ｇおよび
２．０ｇを加えて溶解したものと尿素を加えなかったも
のを、それぞれＮＨ４＋型に調製したダウエックス５０
ＷＸ８（２００〜４００メツシユ）５ｍｌを充填したカ
ラムに流しウロキナーゼを吸着させた。
次いで蒸留水２５ｍ１で洗浄した後、４係アンモニア水
３ｍｌでウロキナーゼを溶離せしめた。
３ｍｌでウロキナーゼを溶離せしめた。
ここに得られたウロキナーゼの性状を表１に示す。
この参考例により、未吸着ウロキナーゼの減少および溶
離したウロキナーゼの比活性さらには回収率の向上とい
う点において、本発明による尿素添加の優れていること
が一層明瞭となる。
離したウロキナーゼの比活性さらには回収率の向上とい
う点において、本発明による尿素添加の優れていること
が一層明瞭となる。
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発
明がこの実施例のみに限定されるものではないことはい
うまでもない。
明がこの実施例のみに限定されるものではないことはい
うまでもない。
実施例 １
０．１Ｍの食塩を含む０．１ Ｍ ！Ｊン酸緩衝液ｐＨ
６，５に対し透析した比活性１”０８０ Ｉ Ｕ／７１
１１？蛋白の粗ウロキナーゼ３１４０００ＩＵを含有す
る溶液５４ ｍ、ｌに尿素２６．３ｇを徐々に加え溶解
したものを、ＮＨ４＋型に調製したダウエックス５０Ｗ
Ｘ８（２００〜４００メツシユ）を充填したカラム（２
，８Ｘ２５ｃｍ）に通過させ、ウロキナーゼを吸着させ
た。
６，５に対し透析した比活性１”０８０ Ｉ Ｕ／７１
１１？蛋白の粗ウロキナーゼ３１４０００ＩＵを含有す
る溶液５４ ｍ、ｌに尿素２６．３ｇを徐々に加え溶解
したものを、ＮＨ４＋型に調製したダウエックス５０Ｗ
Ｘ８（２００〜４００メツシユ）を充填したカラム（２
，８Ｘ２５ｃｍ）に通過させ、ウロキナーゼを吸着させ
た。
次いで、９００Ｔｔｌの蒸留水でカラムを洗浄した後、
１６０ｍ１の４係アンモニア水をカラムに流しウロキナ
ーゼを溶離せしめ、ウロキナーゼ活性を有する両分を分
取した。
１６０ｍ１の４係アンモニア水をカラムに流しウロキナ
ーゼを溶離せしめ、ウロキナーゼ活性を有する両分を分
取した。
ここに得られたウロキナーゼは総括性２３５０００ＩＵ
；比活性１８２００ＩＵ／１ｎｇ蛋白で粗ウロキナーゼ
に比べ１６．９倍精製されており、活性回収率は７４．
８係であった。
；比活性１８２００ＩＵ／１ｎｇ蛋白で粗ウロキナーゼ
に比べ１６．９倍精製されており、活性回収率は７４．
８係であった。
実施例 ２
実施例１と同様の比活性５６０ ＩＵ／■蛋白の粗ウロ
キナーゼ２９８０００ＩＵを含有する溶液１８０ｍ１に
尿素８７．８ｇを加え溶解したものを、ＮＨ４＋型に調
製したダウエックス５０ＷＸ ８（２００〜４００メツ
シユ）を充填したカラム（２，８Ｘ２５ｃｍ）に流し、
ウロキナーゼを吸着させた。
キナーゼ２９８０００ＩＵを含有する溶液１８０ｍ１に
尿素８７．８ｇを加え溶解したものを、ＮＨ４＋型に調
製したダウエックス５０ＷＸ ８（２００〜４００メツ
シユ）を充填したカラム（２，８Ｘ２５ｃｍ）に流し、
ウロキナーゼを吸着させた。
次いで９００ｍ１の蒸留水でカラムを洗浄し、１６０ｍ
１の４係アンモニア水でウロキナーゼを溶離せしめ、ウ
ロキナーゼ活性を有する両分を分取した。
１の４係アンモニア水でウロキナーゼを溶離せしめ、ウ
ロキナーゼ活性を有する両分を分取した。
ここに得られたウロキナーゼは総括性２３９０００ＩＵ
、比活性１７０００ＩＵ／■蛋白で粗ウロキナーゼに比
べ３０．４倍精製されており、活性回収率は８０．２％
であった。
、比活性１７０００ＩＵ／■蛋白で粗ウロキナーゼに比
べ３０．４倍精製されており、活性回収率は８０．２％
であった。
このように、実施例１に比べ約２分の１程度の比活性の
粗ウロキナーゼを用いても、実施例１と同程度の高比活
性のウロキナーゼが回収できることがわかる。
粗ウロキナーゼを用いても、実施例１と同程度の高比活
性のウロキナーゼが回収できることがわかる。
実施例 ３
実施例１と同様の比活性６６０ ＩＵ／■蛋白の粗ウロ
キナーゼ１４００００ＩＵを含む粗ウロキナーゼ含有溶
液１１０Ｔｌｌｌに尿素５３．６ ｇを加え溶解したも
のを、ＮＨ４＋型に調製したデュオライ）Ｃ−２０のカ
ラム（２，８Ｘ２５ｃｍ）に流し、ウロキナーゼを吸着
させた。
キナーゼ１４００００ＩＵを含む粗ウロキナーゼ含有溶
液１１０Ｔｌｌｌに尿素５３．６ ｇを加え溶解したも
のを、ＮＨ４＋型に調製したデュオライ）Ｃ−２０のカ
ラム（２，８Ｘ２５ｃｍ）に流し、ウロキナーゼを吸着
させた。
次いで７５０ｍ１の蒸留水でカラムを洗浄し、１５０ｍ
１の４係アンモニア水でウロキナーゼを溶離せしめ、ウ
ロキナーゼ活性を有する両分を分離した。
１の４係アンモニア水でウロキナーゼを溶離せしめ、ウ
ロキナーゼ活性を有する両分を分離した。
ここに得られたウロキナーゼは総括性９６６００ＩＵ、
比活性１３６００ＩＵ／■蛋白で粗ウロキナーゼに比べ
２０．６倍精製されており、活性回収率は６９．０ ％
であった。
比活性１３６００ＩＵ／■蛋白で粗ウロキナーゼに比べ
２０．６倍精製されており、活性回収率は６９．０ ％
であった。
Claims (1)
- １ 粗ウロキナーゼ含有溶液をＮＨ４＋型に調製したス
ルホン酸基を有する強酸性陽イオン交換体に接触させて
ウロキナーゼを吸着させ、次いで溶離するウロキナーゼ
の精製法において、予め粗ウロキナーゼ含有溶液に終濃
度３〜８Ｍとなるように尿素を加えることを特徴とする
ウロキナーゼの精製法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP52065975A JPS5935B2 (ja) | 1977-06-03 | 1977-06-03 | ウロキナ−ゼの精製法 |
| DE19782823353 DE2823353A1 (de) | 1977-06-03 | 1978-05-29 | Verfahren zum reinigen von urokinase |
| GB24852/78A GB1556652A (en) | 1977-06-03 | 1978-05-31 | Process for purifying urokinase |
| FR7816192A FR2393006A1 (fr) | 1977-06-03 | 1978-05-31 | Procede de purification de l'urokinase |
| US05/911,475 US4189350A (en) | 1977-06-03 | 1978-06-01 | Process for purifying urokinase |
| CA304,573A CA1102263A (en) | 1977-06-03 | 1978-06-01 | Process for purifying urokinase |
| DK248678A DK147266C (da) | 1977-06-03 | 1978-06-02 | Fremgangsmaade til rensning af urokinase |
| IT7849692A IT7849692A0 (it) | 1977-06-03 | 1978-06-02 | Procedimento per la purificazione di urochinasi |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP52065975A JPS5935B2 (ja) | 1977-06-03 | 1977-06-03 | ウロキナ−ゼの精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS542396A JPS542396A (en) | 1979-01-09 |
| JPS5935B2 true JPS5935B2 (ja) | 1984-01-05 |
Family
ID=13302500
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52065975A Expired JPS5935B2 (ja) | 1977-06-03 | 1977-06-03 | ウロキナ−ゼの精製法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4189350A (ja) |
| JP (1) | JPS5935B2 (ja) |
| CA (1) | CA1102263A (ja) |
| DE (1) | DE2823353A1 (ja) |
| DK (1) | DK147266C (ja) |
| FR (1) | FR2393006A1 (ja) |
| GB (1) | GB1556652A (ja) |
| IT (1) | IT7849692A0 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60183797U (ja) * | 1984-05-17 | 1985-12-05 | 三菱重工業株式会社 | フオ−クリフトの信号伝送装置 |
| JPS6186400A (ja) * | 1984-09-29 | 1986-05-01 | 新明和工業株式会社 | 高所作業車の操作情報制御装置 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2121050B (en) * | 1979-07-05 | 1986-03-26 | Genentech Inc | Preparation of functional human urokinase proteins |
| US5112755A (en) * | 1982-04-15 | 1992-05-12 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human urokinase proteins |
| DE3439980A1 (de) * | 1984-11-02 | 1986-05-07 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur reinigung sowie pasteurisierung von urokinase |
| JPS61115492A (ja) * | 1984-11-07 | 1986-06-03 | Green Cross Corp:The | ウロキナ−ゼの精製方法 |
| AU7709287A (en) * | 1986-07-16 | 1988-02-10 | Celltech Limited | Process for purifying a plasminogen activator |
| KR100419448B1 (ko) * | 2001-03-09 | 2004-02-19 | 주)녹십자 | 고정화 유로키나아제 칼럼의 재생방법 |
| US11982045B2 (en) | 2022-05-11 | 2024-05-14 | Imam Abdulrahman Bin Faisal University | System and methods for recycling heat and water in a steam press machine |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPS51123885A (en) * | 1975-04-18 | 1976-10-28 | Hitachi Chem Co Ltd | Process for purifying urokinase |
| JPS5212984A (en) * | 1975-07-22 | 1977-01-31 | Kanebo Ltd | Purification of urokinase |
-
1977
- 1977-06-03 JP JP52065975A patent/JPS5935B2/ja not_active Expired
-
1978
- 1978-05-29 DE DE19782823353 patent/DE2823353A1/de not_active Withdrawn
- 1978-05-31 GB GB24852/78A patent/GB1556652A/en not_active Expired
- 1978-05-31 FR FR7816192A patent/FR2393006A1/fr active Granted
- 1978-06-01 US US05/911,475 patent/US4189350A/en not_active Expired - Lifetime
- 1978-06-01 CA CA304,573A patent/CA1102263A/en not_active Expired
- 1978-06-02 DK DK248678A patent/DK147266C/da not_active IP Right Cessation
- 1978-06-02 IT IT7849692A patent/IT7849692A0/it unknown
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|---|---|---|---|---|
| JPS60183797U (ja) * | 1984-05-17 | 1985-12-05 | 三菱重工業株式会社 | フオ−クリフトの信号伝送装置 |
| JPS6186400A (ja) * | 1984-09-29 | 1986-05-01 | 新明和工業株式会社 | 高所作業車の操作情報制御装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| DK147266C (da) | 1984-12-10 |
| CA1102263A (en) | 1981-06-02 |
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| JPS542396A (en) | 1979-01-09 |
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